Reproduktionstechniken beim Rind

Besenfelder Urban
Institut für Tierzucht und Genetik, der Veterinärmedizinischen Universität Wien,
Veterinärplatz 1, A-1210 Wien
IFA-Tulln
VU-Wien
Reproduktionstechniken beim Rind
Künstliche Besamung
Superovulation
In vitro Produktion
Semen Sorting
Embryo Sexing
Klonierung
Embryo Splitting
Transgentechnologie
Reproduktionstechniken beim Rind
Prä-Implantationsbereich
Implantationsbereich
Eizelle+Samenzelle=Embryo
1 Zelle
10 Zellen
Stunden/Tage
Diagnostik + Selektion
100 Zellen
>1,000,000,000,000 Zellen
9 Monate ….
Diagnostik
Erste Generation: Künstliche Besamung
> 110 Mio. pro Jahr (seit 1945)
Zweite Generation: Embryotransfer
½ Mio. pro Jahr (seit 1975)
Dritte Generation: Embryo sexing/IVP/Klonierung
~ X 103/Jahr
1990
1992
Vierte Generation: Transgenesis
Ab 2000 N= ?
1995
Samengewinnung/Künstliche Besamung/Befruchtung beim Rind
Öffentlichkeit:
„Gegen künstliche Besamung – Tabu-Thema“
„KB führt zu abnormalen Kälbern“
„Handel mit Bullen war gefährdet…“
Test von Bullen
Merkmalserhebung
Selektion
Fortschritt
110.000.000 Besamungen
>600 Besamungsstationen
>40.000 Bullen
Veterinärhygienische Kontrolle
Betriebsmanagement
>60 Jahre im Einsatz
Kombination mit „neueren Biotechniken“
Künstliche Besamung
Kryokonservierung
Superovulation
In vitro-Fertilisation
ICSI
Semen Sorting
Samengewinnung/Künstliche Besamung/Befruchtung beim Rind
Weibl.
Tiere
tion
duk
Betrieb
Pr o
Samen
Leistungssteigerung
Betriebsanpassung
Reproduktion
Konzeption
Remontierung
Nutzungsdauer
Gewinnung und Transfer von Embryonen
Berücksichtigung der männlichen und weiblichen Gameten
Superovulation: Gewinnung von Embryonen eines Tieres über
hormonelle Induktion
Embryotransfer: Embryoübertragung auf Empfänger, deren
Ovarzyklus dem Alter des Embryonalstadiums entspricht
Embryo: die früheste Form der genetischen Vollständigkeit
Overall Activity of In Vivo-Derived Bovine Embryos in 2004
(*) Those European data are derived from the statistics of AETE, 2005.
(**) One country did not split the figures between fresh and frozen (Total 5,000). By convention, they were all included in
the frozen column so as to take them into account in the gross total.
(***) Due to lack of responses from many ET teams from this continent, this line is highly underestimated.
Michèle Thibier, 2005
Embryogewinnung I:
ÆSuperovulation
Follikelstimulierendes Hormon - FSH
aus Hypophysen von Schwein und Schaf
kurze Halbwertszeit, 8 Injektionen [12 h]
Pregnant mares serum gonadotropin von der Stute (PMSG, eCG)
lange Halbwertszeit, einmalige Injektion
exogenes FSH
endogenes FSH
Zyklus
Embryogewinnung II:
Follikelstimulation
Ovulation
Eileitereintritt
Fertilisation
Wanderung („Migrationsphase“)
Übertritt in die Gebärmutter
Spülung ~ Tag 7, Morula- oder Blastozystenstadium
5 – 8 (12) Embryonen guter Qualität
Aber:
nur 1/3 aller Spender mit guter Reaktion
rs e
Vo
n
tio
l ek
Æ mit wenige Embryonen
Æ nur Eizellen
Æ nur sprungreife Follikel
Æ keine Reaktion am Eierstock
z.T. unerwünschte Auswirkung auf das Exterieur
2/3
Embryotransfer:
ÆEmpfängersynchronisation
1) Spontanbrunst, Nutzung des aktuellen Zyklus
2) Abbruch des Zyklus im Di-Östrus Æ „Neustart“
3) Verlängerung des Zyklus im Di-Östrus Æ „Neustart“
Transfer eines Embryos Æ Gebärmutterhornseite mit Gelbkörper
Tolerierte Asynchronität zwischen Empfänger und Embryo: ±36 h
Trächtigkeitsraten: zwischen 50 und 70 %
chirurgisch ≥ unblutig
(selten)
(Routine)
Konstante Ergebnisse in den letzten > 20 Jahre
In vitro-Produktion von Rinderembryonen
IVF
IVM
IVK
In vitro-Produktion - IVP
Voraussetzung: Follikeldynamik am Ovar
Eizellgewinnung:
Kalb
geschlechtsreife Tiere,
zuchtreife Tiere,
Tiere, für die Trächtigkeit unzumutbar wäre
während der Gravidität
Problemtiere
post mortem
Eizellgewinnung
beim Rind
Einmalige Punktion
Mehrmalige Punktion
-1x/Woche
-2x/Woche
Ohne/mit hormoneller Stimulation
Endoskopie
Ultraschall
ET
OPU
Lagerung
d-1
d0
IVM
d1
IVF
d7
IVK
In vitro-Produktion von Rinderembryonen
Ex vivo-Gewinnung
5 bis 15 Eizellen (60%) Æ 90 % Maturation Æ 80-90% Fertilisation
20 bis 30 % Blastozystenrate Æ 40 bis 50 % Trächtigkeitsrate
CAVE: Tiefgefrierkonservierung, Aborte, Geburt
Verwendung von Standardverfahren, aber…
In vitro-Gewinnung
Punktion
„Dissection“ (Follikel an der Eierstocksoberfläche)
“Slicing” (gesamter Eierstock)
Follikelpräparation
Effizienz:
Eizellen (Eierstöcke nach Schlachtung) >> Eizellen (ex vivo)
Endoskopie > Ultraschall
Fleischrassen >> Milchrassen >> Kälber
Anzahl in vitro-produzierter, transferierter Rinderembryonen 2004
Michèle Thibier, 2005
In vivo
Unterschied:
In vitro
in vivo –gewonnene vs. in vitro-produzierte Embryonen
Perivitelliner Raum
Kompaktierung
Dichte (>1.3 vs. 1.14 g/ml)
Zellzahl
Innere Zellmasse (ICM)
Größe
Mixoploidie, Methylierung, Genomaktivität..
Entwicklungsraten
Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Temperaturen
Implantation
Trächtigkeit
Geburt
Vitalität
Problem:
Problem:
Quantität
Qualität
In vivo
In vitro
1992 –2001
Rassen:
Spender:
tiefgefroren:
Ex vivo
In vivo-Kultur von Rinderembryonen
im Schafeileiter
5
5240
17519
9,1 Oozyten/Donor
69,4 % Teilungsrate
24,7 % transferierte Embryonen
79,9 % tauglich zur Kryokonserv.
Galli et al., 2003
Eileiter
Gebärmutter
Ovulation
D7 Embryogewinnung
In vivo-Kultur im Rindereileiter
Entwicklungsprofil
Expressionsprofil
Elektronenmikroskopie
Raster-Elektronenmikroskopie
Tiefgefrierkonservierung
Embryotransfer
-methodische Entwicklung
-Zucht im Innland
und Ausland
Geschlechtsbestimmung
Gene: ZFX7ZFY, Amelogenin
Mikrosatelliten
DNA-Menge (Y<X)
Größe (Y<X, 34.5 µm2)
Motilität
Immunseparation
Gelelektrophorese
Embryo sexing
Semen Sorting
Unterschied im DNA-Gehalt:
Mensch 2,8 %
Kaninchen 3,0 %
Maus
3,2 %
Schwein 3,6 %
Pferd
3,7 %
Rind
3,8 %
Hund
3,9 %
Schaf
4,2 %
Chinchilla 7,5 %
XY
XX
Y
X
Geschlechtsbestimmung I:
Aspiration
Mikrosektion
Blastomerenentnahme:
Genauigkeit:
1-4% ohne Ergebnis
>99%
Aber:
Embryomanipulation
½ aller Embryonen verwertbar
Æ große Nachfrage!
Geschlechtsbestimmung II:
Durchflußzytometrie
Semen Sorting
20 Mio gesortete Spermien/h
2 – 2.5 Mio/straw
-DNA-Färbung
-Kryokonservierung
(Johnson and Welch, 2000))
Samenprobe
90
kt
e
t
e
°D
-Motilität
-Lebenszeit
-DNA Fragmente…
or
Computersignal
Argon-Laser
Trenngenauigkeit:
Verwendung ab > 90 %
0° Detektor
-
-+ + - +
+
+
-
-
Y
+
ermi
en
XSp
X
Spannung
+
-
„Abfall“
1 mm
Y-Sp
erm
ien
-
-
90 km/h
-
- ++
Männl-Kälber: 88 %
Weibl. Kälber: 92 %
„Verpackung“
Oberflächenbeladung
Laser
Klonierung
Was sind Klone?
Eine Gruppe von zwei oder mehreren
genetisch identischen Individuen,
die ungeschlechtlich aus einem
Mutterorganismus
entstanden sind.
Prinzipien der Klonierung
„Embryo Splitting“
Polkörperchen
Metaphasenplatte
Eizelle
Morula
Enukleation
ICM
Fötus
Kerntransfer
Embryotransfer
Aktivierung
Tier
Sind KLONE wirklich genetisch identisch?
1. Ursprung –“Kopie“
2. Entwicklung
Der Genotyp entsteht durch Zusammenwirken von
Kern-DNA und mitochondrialer (mt) DNA.
Bei der Embryonen- und Individuen-Klonierung werden
i.d.R. verschiedene Oozyten als Nukleus-Empfänger
verwendet.
Unterschiedliche mt-DNA Genotypen
- Mutation
- Translokation
- Rearrangement
- Diminution
- Gene-Amplifikation
-„Alterung“-Prozess der Chromosomen/DNA
wie z.B. Telomerenverkürzung
Sind KLONE phänotypisch identisch?
Phänotyp = Genotyp + Umwelt
Klone haben:
Embryonalphase
•eine unterschiedliche zytoplasmatische Umgebung
Fötalphase
•eine unterschiedliche uterine Umgebung
Adultphase
•eine unterschiedliche postnatale Entwicklung
Probleme: Transfer von „rekonstruierten“ Embryonen
Embryonaler Tod
Pränatal:
Fötaler Tod
•niedrige Trächtigkeitsrate
Tod des Kalbes
•fetaler Tod (70% während des ersten
Anomalien des Kalbes
Trächtigkeitstrimesters)
•fetale Anomalien, Eihautwassersucht
Postnatal:
•erhöhtes Geburtsgewicht
•neonataler Tod
•phänotypische Anomalien (Nierenversagen, vask.
Anomalien inkl. Cardiomyopathien, Leberfibrose,
Osteopetrose, Immundefizit,... )
Darstellung von Trächtigkeitsprofilen in Abhängigkeit
der transferierten Embryonen (IVP und Klonierung)
J. L. Edwards1 et al, (2003), AJRI, 50,113–123.
Y. HEYMAN (2005), Reprod Nutr Dev. 45,353–361.
Verhältnis von lebenden Nachkommen zu
Transferierte Embryonen [%]
Effizienz der Klonierung
Rind
Schaf
Ziege
Schwein
Maus
Kaninchen
Katze
Techniken zur Erzeugung von
transgenen Tieren
¾
Vorkerninjektion (≤1 % tg Nachkommen)
¾
Erzeugung von Chimären (ES-Zellen, PGCs)
¾
Virale Vektoren
¾
Spermien – vermittelter Gentransfer
¾ Kerntransfer (100 % tg Nachkommen)
Anwendung der Klonierung bei
landwirtschaftlichen Nutztieren
¾
Medizinische Modelle
¾
Bereitstellung von Organe/Geweben
¾
Krankheitsresistenz
¾
Verbesserung von wirtschaftlichen Faktoren
¾
Erzeugung von Pharmazeutika (“gene
pharming”) oder anderen Proteinen
Zeit...
Kostenaufwand
• Zellkultur aus Zellen von Säugetieren
(Myeloma-Zell-Fermenter)
• Bakterien
• Hefen, Insekten und andere Eukaryonten
• Transgene Pflanzen
• Transgene (geklonte) Tiere
(Kaninchen, Ziegen, Schafe, Hühner, Rinder)
Syntheseleistung
Produktion von Antikörpern
Reproduktionstechniken beim Rind
1) ...Potentielle Anwendung in der Zucht
Sehr komplex Æ Zusammenwirken verschiedener Faktoren
bedeutend für das zukünftige Betriebsmanagement
2) ...Vereinzelte Anwendung
Aufwand relativ hoch
3) ...Wissenschaftliches Interesse:
Steigt mit der genetischen Entschlüsselung
... Funktionelle Genomanalyse
„Studium der Entwicklungsbiologie“