Zellbiologie SS2006 Modul 2 Themen der Vorlesung

Themen der Vorlesung
Zellbiologie SS2006
Modul 2
Johannes A. Schmid
Zentrum f. Biomolekulare Medizin und
Pharmakologie
und
Ludwig Boltzmann Institut für Krebsforschung
Tel.: (01) 4277-64111, Fax: (01) 4277-9641
Mail: [email protected]
Internet: http://www.univie.ac.at/vascbio/schmid
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation
1
2
Kompartimentierung als Grundlage für Leben
Literatur und Weblinks
•
•
Molekulare Zellbiologie:
Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore and Darnell: 4. Auflage
(Spektrum, G. Fischer Verlag 2001, Übersetzung der 4. engl. Auflage)
http://www.whfreeman.com/lodish/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=
mcb.TOC
Molecular Biology of the Cell:
Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and
James D. Watson. 1994. Garland Publishing
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=cell.TOC&depth=2
•
•
Zellbiologie im Web: http://www.cellbio.com/
Datenbanken (Gene, Proteine, Literatur, Bücher):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/
3
Eines der wesentlichsten Charakteristika
aller bis jetzt gefundenen Lebensformen ist
ihre Abgrenzung von der Umwelt; also die
Kompartimentierung ihrer eigenen
Organisationsform.
Erst diese Abgrenzung ermöglicht das
Auftreten von elektrochemischen
Gradienten, und damit die Existenz
energetischer Potentialdifferenzen.
Die Tendenz zum Ausgleich dieser
Differenzen in Form eines
Fließgleichgewichts macht die
Aufrechterhaltung eines höheren
Ordnungszustandes innerhalb dieses
Kompartiments möglich, und somit die
temporär und räumlich begrenzte Reduktion
des Entropiegrades (Negentropie).
4
Prinzipielle Eigenschaften von Kompartimenten
•Kompartimente sind Reaktionsräume
•Diese Reaktionsräume sind normalerweise durch einen LipidBilayer vom Außenraum abgegrenzt.
•Hydophobe Substanzen und kleine ungeladene Moleküle (wie
z.B. O2) können meist durch die Lipidbarriere diffundieren.
Hydrophile oder geladene Moleküle, sowie die meisten
Makromoleküle können nicht passiv durch die Membran
diffundieren.
•In die Membran eingebette Proteine (integrale
Membranproteine) oder an die Membran assoziierte Proteine
(periphere Membranproteine) können wesentliche
Steuerungsfunktionen ausüben (wie etwa aktive
Transportprozesse durch die Membran, Aufbau
elektrochemischer Gradienten, Interaktionen mit anderen
Makromolekülen etc.).
Plasmatische und nicht-plasmatische Phasen von
Eukaryonten
•Die äußere Zellmembran trennt die cytoplasmatische Phase der
Zelle von der extracytoplasmatischen Phase der Umgebung ab.
Äquivalent dazu können die Innenräume intrazellulärer
Kompartimente, die von einem einfachen Lipid-Bilayer umgeben
sind, als nicht-plasmatische Phasen angesehen werden (ER, Golgi,
sekretorische Vesikel, Endosomen, Lysosomen etc.). Ihr Inneres
entspricht somit in gewisser Weise dem Extrazellulärraum.
•Plasmatische Phasen der Zelle sind das Cytosol, sowie das Innere
von Kompartimenten, die von einem doppelten Lipid-Bilayer
umgeben sind (Zellkern, Mitochondrien, Chloroplasten). Die
Zwischenräume zwischen den beiden Membranen dieser
Kompartimente zählen zu den nicht-plasmatischen Bereichen.
5
6
Eukaryontische Zelle
Nicht-Plasmatische Räume: Schwarz
Plasmatische Phasen: Weiß
7
8
Elektronenmikroskopie einer Eukaryontenzelle
Der Zellkern
• Funktionen: Replikation der
DNA, Transkription, Splicing
der RNA, Synthese der
ribosomalen RNA in den
Nucleoli. Stoffaustausch mit
dem Zytosol über
Kernporenkomplexe, durch
die etwa Moleküle < ca. 30
kDa diffundieren können,
während größere Moleküle
aktiv transportiert werden
müssen („nuclear import and
nuclear export)
Zellkern eines Lymphozyten
9
Das Endoplasmatische Retikulum
10
Johannes A. Schmid
Der Golgi-Apparat
•Funktionen: Modifikation
von N-Glykanketten,
proteolytische Reifung von
Proteinen, Sortierung von
sekretorischen und
lysosomalen Proteinen.
Sekretorische und
lysosomale Proteine werden
am ER synthetisiert und
spezifisch zum Golgi
transportiert. Dort erfolgt
eine Sortierung in
sekretorische Vesikel und
Transportvesikel zu
Lysosomen
•glattes ER:
Lipidsynthese, Startpunkt
des Transportweges
sezernierter und
lysosomaler Enzyme
•rauhes ER:
Ribosomen synthetisieren
Proteine mit einer
Signalsequenz cotranslational in das ERLumen), Glykosylierungen,
Proteinfaltung, Ca2+Speicher etc.
11
12
Mitochondrien
Endosomen und Lysosomen
•Funktionen:
Atmungskette (Synthese von ATP)
Steuerung zellulärer Signalprozesse (z.B. Induktion von
Apoptose durch Freisetzung con Cytochrom c)
• Funktionen: Aufnahme und
Hydrolisierung hochmolekularer
Verbindungen, Internalisation
von Rezeptoren; spezielle
Aufgaben: z.B. Phagozytose von
Fremdstoffen,
Abwehrmechanismen wie etwa
Antigen-Präsentation.
13
Die Zytoplasma-Membran
Das Zytosol und das Zytoskelett
•Kommunikation mit der Außenwelt (über Rezeptoren,
Ionenkanäle...); Kommunikation mit Nachbarzellen (z.B. über „gapjunctions“); Konzentration verschiedener Protein- und
Signalkomplexe, Verankerung mit dem Zytoskelett, Aufrechterhaltung
der Polarität spezieller Zellen (z.B. Leberparenchymzellen) über
sogenannte „tight junctions“ etc.
•Funktionen:
Verschiedene Enzymreaktionen, Signalübertragungen, Dynamik
und Stabilität der Zelle (über das Zytoskelett), Glykolyse...
Microtubuli
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Microfilamente
15
16
Beispiele für differenzierte Zellen: Haut
Der multizelluläre Organismus
Der Mensch besteht aus einer
Vielzahl unterschiedlichster Zellen,
die für ihre jeweiligen Aufgaben
spezialisiert sind. Die meisten
dieser Zelltypen können unter
geeigneten Bedingungen auch
außerhalb des Organismus
kultiviert werden.
Epidermis
(Keratinozyten)
Dermis
(Fibroblasten in
Bindegewebe)
> Der Organismus kann als
„Staatensystem“ dieser Zellen
angesehen werden.
Keratinozyt in
der Zellkultur
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18
Blutzellen
Blutgefäße
Lymphozyt
Endothelzellen
glatte Muskelzellen
Erythrozyt
Thrombozyt
adhärierender Leukozyt
neutrophiler Granoluzyt
19
20
Muskel
Knochen
Muskelzellen bilden durch Fusion mehrerer mononukleärer Zellen
ein „Synzytium“ – lange Zellen mit mehreren Zellkernen
eingelagerte Ca-Phosphate
Kollagenfasern
Osteoblast
Knochenzelle Osteon
(Osteozyt,
Osteoblast)
Haverskanal mit
Blutgefäßen
21
Nerven
22
Epithelien (Beispiel: Dünndarm)
apikale Oberfläche
tight junction
Desmosom
gap junction
Pore
myelin-isoliertes Axon
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Basalmembran
24
Leber-Zellen
Themen der Vorlesung
apikale Oberfläche
(Gallengang)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation
basolaterale Oberfläche
(Blutkreislauf)
25
26
Mikrofilamente
Das Zytoskelett
Mikrofilamente
(Aktinfilamente)
Mikrotubuli
Intermediärfilamente
Aufbau und Struktur:
aus Aktinmolekülen (im
Menschen: 6 Isoformen: α1-α4
in Muskel, β- und γ-Aktin in
Nichtmuskelzellen)
G-Aktin: globuläres Aktin:
Monomer ca. 40 kD
ADP/ATP
Mg2+
Zusammenlagerung,
Polymerisation zu
F-Aktin (Ionen-abhängig):
filamentöses Aktin
Aktingehalt in normalen Zellen:
1 – 5 % (0.5 mM), in
Muskelzellen: 10% der Proteine
7-9 nm
27
28
Polarität und Vernetzung der Aktinfilamente
Minus-Ende
Quervernetzende
Proteine:
Netzartige Verknüpfung
Polymer:
präferentiell in
ADP-Form
Aktinfilament
Filamin
Filamin
Fascin
Villin
Spectrin
α-Actinin
Dystrophin
• Stabilität der Zellen und Quervernetzung mit der ZytoplasmaMembran
• Zellbewegung: Ausbildung von Lamellipodien und Filopodien
• Übergeordnete Bewegungsvorgänge: Muskelkontraktion
• Stabilisierung von Zellausläufern (z.B. Mikrovilli im Dünndarm)
• Verbindung des Zytoskeletts mit der Extrazellulär-Matrix über
Membranproteine
Faserartige Verknüpfung
Aktinfilament
Monomer:
präferentiell in
ATP-Form
Funktionen der Mikrofilamente
Fascin
Plus-Ende
29
Zytoskelett von Erythrozyten
Plasmamembran
Filamentstrukturen: Bündel und Netzwerke
Mikrofilamente eines Thrombozyten
(Blutplättchen):
Rolle bei der Blutgerinnung:
Stabilisierung des Thrombus über
Quervernetzung des Zytoskeletts mit
dem extrazellulären Blutgerinnsel
Glykophorin
Bande 3-Protein
Ankyrin
Spectrin
Tropomyosin
Glykoprotein
Gp1b-IX
Bande 4.1Protein
Tropomodulin
Spectrin
kurzes
Aktinfilament
Fibrin-Gerinnsel
Filamin
Spectrin
Adducin
30
Aktin
Das Zytoskelett vermittelt eine flexible
Stabilität, die vor allem in den engen
Kapillaren essentiell ist.
Hauptprotein: Spektrin: ist über kurze
Aktinfilamente und Ankyrin an integrale
Membranproteine verknüpft.
31
32
Dynamik der Mikrofilamente
Keim
G-Aktin
Keim
Keim
F-Aktin
Keimbildung
Dynamik der Mikrofilamente II
MinusEnde
Gleichgewicht von
Assoziation und
Dissoziation
PlusEnde
Das Wachstum der Filamente ist am Plus-Ende ca. 5 – 10x schneller als am
Minus-Ende.
Die Konzentration an monomerem Aktin im Fließgleichgewicht des Filaments
nennt man auch kritische Konzentration (Cc) = Konzentration ab der eine
spontane Polymerisation eintritt. Durch „Capping“ (Blockieren des Minus oder
des Plus-Endes) kann man die Cc für beide Enden bestimmen (in vitro):
Plus-Ende: Cc = 0.1 µM
Minus-Ende: Cc = 0.8 µM
Bei einer normalen Aktin-Konz. von 0.5 mM müsste eigentlich fast das gesamte
Aktin polymerisiert sein, tatsächlich sind aber nur etwa 60% in Form von
Filamenten vorhanden. In vivo wird die Polymerisation durch Kofaktoren
reguliert: Thymosin β4 hemmt z.B. die Polymerisation, während Profilin sie
fördert.
33
Motorproteine der Aktinfilamente: Myosine
Die Stabilität der Mikrofilamente wird auch durch Proteine beeinflusst, die zu
einer Fragmentierung führen (Gelsolin oder Cofilin), bzw. durch Proteine, die mit
den Enden assoziieren („Capping“):
Tropomodulin: blockiert die Minus-Enden
CapZ: bindet an die Plus-Enden
Der dynamische Auf- und Abbau von Aktin ist für verschiedene
Bewegungsvorgänge in der Zelle verantwortlich, z.B. für die Ausstülpung von
Membranfortsätzen.
Polymerisation von Aktin in Gegenwart von Profilin induziert z.B. die Ausbildung
des Leitsaumes (Lamellipodien) bei kriechenden Zellen und die Bildung von
Filopodien (dünner Membranfortsätze).
Lamellipodien
Filopodien
34
Aktinfilamente in quergestreiften Muskeln
Myosine sind mechanochemische
ATPasen, die die Energie von ATP in
Konformationsänderungen (Bewegung)
umwandeln.
Sie haben 3 Domänen:
Kopf: Aktin-Bindung, ATPase-Aktivität
Hals: Bindung regulatorischer leichter
Ketten
Schwanz: spezifische Bindungsstellen,
je nach Funktion.
Myosin I und Myosin V sind an der
Interaktion zwischen Aktinfilamenten
und Membranen beteiligt
(Plasmamembran oder
Membranvesikel) – und haben
Funktionen bei der Zellbewegung und
beim vesikulären Transport.
Myosin II ist verantwortlich für die
Muskelkontraktion und die Teilung von
Zellen (Cytokinese)
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vielkernige
Muskel-Zellen
Myofibrillen innerhalb
einer Zelle
Aufbau einer Myofibrille
A-Bande
Aktin-Filamente
CapZ: Stabilisierung der Plus-Enden
Myosin II - Oligomere
SchwanzDomänen
36
Tropomodulin:Stabilisierung der Minus-Enden
Regulation der Muskelkontraktion
Mechanismen der Muskelkontraktion
ATP
ATP
Kopfgruppe dissoziiert
vom Filament
Dissoziation
von ADP
Hydrolyse
Pi
Nerv
Depolarisation
Ca2+Freisetzung
aus
Retikulum
Freisetzung von Pi >
Kopfgruppe klappt zurück
(Kraftschlag)
Verschiebung des
Tropomyosins und
Freisetzen der MyosinBindungsstellen
Kopfgruppe klappt
nach vorn und
bindet erneut
37
Aufbau glatter Muskel
38
Funktionen von Aktin in Nichtmuskelzellen
Einkernige Zellen enthalten
unregelmäßig angeordnete AktinMyosin-Filamente, die über
Proteinkomplexe (dense bodies)
innerhalb der Zelle und
Adäsionsstellen an der
Zellmembran (adhesion plaques)
verankert sind.
Die Myosin-Aktin-vermittelt
Kontraktion führt über diese
Verankerungen zur
Kraftübertragung.
• Zellbewegung
• Aktin und Myosin II bilden Bündel, die der Zelladhäsion dienen
(z.B. in den Gürteldesmosomen der Epithelzellen)
• Stressfasern sind kontraktile Filamente, die über Adhäsionsstellen
(adhesion plaques) mit der Zelloberfläche verknüpft sind
• Aktin und Myosin II sind essentiell bei der physischen Trennung
der Tochterzellen im Verlauf der Zellteilung (Zytokinese)
• Transport von Vesikel entlang von Aktin-Filamenten (Myosin I
und V)
Glatte Muskel können weniger
Maximalkraft übertragen, sind aber
ausdauernder und können
Spannungszustände über längere
Zeit aufrechterhalten (bessere
Energieversorgung)
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40
Zellbewegung
Verschiedene Signalwege beeinflussen das
Aktin-System
Myosin II-Band
Aktin-Front
(enthält auch
Myosin I)
41
Mikrotubuli
... bestehen aus α-Tubulin und βTubulin-Einheiten (je ca. 55 kD),
die sehr stabile Heterodimere
bilden. An α-Tubulin ist
irreversibel GTP gebunden, an βTubulin reversibel GDP oder GTP
Protofilament
α-Tubulin
42
Das Mikrotubuli-Organisationszentrum
β-Tubulin
8 nm
24 nm
Lineare Aneinanderreihung der
Dimere führt zur Ausbildung von
Protofilamenten, die sich wieder
zu Singulet-, Doublet- oder
Triplet-Mikrotubuli anordnen
können
Das Wachstum von Mikrotubuli beginnt am Mikrotubuli-Organisationszentrum
(MTOC, microtubuli organizing center, auch Centrosom), einer Struktur etwa
in der Mitte der Zelle, in der γ-Tubulin konzentriert ist und in der in tierischen
Zellen oft ein Centriolen-Paar (aus zwei kurzen Triplett-Mikrotubuli) sitzt.
Ringkomplexe aus γ-Tubulin wirken als Keim für die weitere TubulinPolymerisation. Mikrotubuli wachsen von dort in Richtung der Zellperipherie.
Ihr wachsendes Ende wird als Plus-Ende bezeichnet, die dem Centrosom
zugewandte Seite Minus-Ende
Centriolen
43
44
Die dynamische Instabilität der Mikrotubuli
Dynamik der Mikrotubuli
Auf- und Abbau von Mikrotubuli erfolgt hauptsächlich am Plus-Ende. Wie bei
den Aktin-Filamenten kommt es ab einer kritischen Konzentration an
Monomeren zur Polymerisation.
Die Stabilität der Mikrotubuli hängt von der lokalen Konzentration an GTPTubulin ab. Dies führt oft zu einem alternierendem Auf- und Abbau.
GDP-Tubulin
GTP-Tubulin
Mikrotubulus
hohe Konzentration
an GTP-Tubulin
niedrige Konzentration
an freiem GTP-Tubulin
Dissoziation
Bildung von Protofilamenten
Zusammenlagerung zu Tubuli
Verlängerung der Tubuli
45
stabil
instabil
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Mikrotubuli-Motorproteine: Kinesine und Dyneine
Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAP´s)
Mikrotubuli-assoziierte Proteine vernetzen Mikrotubuli miteinander und mit
anderen zellulären Strukturen. Sie haben einerseits eine Mikrotubuli-bindende
Domäne und andererseits eine zweite funktionelle Domäne mit der sie
entweder Intermediärfilamente, Zellmembranen oder andere Mikrotubuli
binden können. Die Bindung von MAP´s an Mikrotubuli stabilisiert diese über
Hemmung der Tubulin-Dissoziation.
Kinesine sind Motorproteine, die über ATP-Hydrolyse in Richtung des PlusEndes wandern (und transportieren).
superspiralisierte Halsregion
mit Bindungsstelle für das
Transportgut (e.g. Vesikel)
Kopfregion mit ATPase
Aktivität
Bindung an Mikrotubuli
Dyneine sind Motorproteine, die zum Minus-Ende wandern. Sie können alleine
aber keine Substanzen transportieren - dafür müssen sie einen Komplex mit
anderen Mikrotubuli-bindenden Proteinen bilden.
47
48
Die Rolle der Mikrotubuli beim intrazellulären
Transport
Spezielle Mikrotubuli-Strukturen: Cilien und Geißeln
Bewegungen von Geißeln
entstehen durch
Gleitprozesse der äußeren
Dublett-Mikrotubuli, die von
Dynein-Molekülen initiiert
werden
49
50
Genereller Aufbau der
Intermediärfilamente
Intermediärfilamente
...sind sehr stabile Filamente, die im Durchmesser zwischen Mikrotubuli
und Mikrofilamenten liegen (d = 10 nm). Sie bestehen aus helikalen
Untereinheiten, die sich zu Filamenten zusammenlagern. Im Gegensatz zu
Aktin und Tubulin binden sie keine ATP- oder GTP-Nukleotide und es sind
auch keine Motorproteine für sie bekannt. Ihre primäre Aufgabe dürfte in
den meisten Fällen eine Stützfunktion sein.
Intermediärfilament-Proteine sind z.B. die
Keratine (in Keratinozyten der Haut und
auch in verschiedenen Epithelien), Lamine
(A, B und C), die das Filament-Netzwerk
an der Innenseite der Kernmembran
bilden, Vimentine, die Stützfilamente
bilden, sowie Neurofilamente, die die
langen Axone der Neuronen stabilisieren.
51
52
Interaktionen zwischen
Intermediär-Filamenten und
Mikrotubuli
Plektin (gelb) vernetzt Intermediärfilamente (blau) und Mikrotubuli (rot).
Verankerung der
Intermediär-Filamente an
Desmosomen und
Hemidesmosomen
Themen der Vorlesung
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation
53
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Schematische Darstellung der Zellkontakte und
allgemeine Funktionen
Zellkontakte polarisierter Zellen
apikale Oberfläche
Mikrovilli
zonula occludens
zonula adhaerens
Tight Junctions
(zonula occludens)
tight junctions
(dichte Verbindungen)
Adhäsionsgürtel
Punktdesmosom
laterale Oberfläche
Gürtel-Desmosom
(zonula adhaerens,
Adhäsionsgürtel)
Zellkontakte müssen vor allem bei
polarisierten Zellen verschiedenste
Aufgaben erfüllen:
1.
Es muss eine dichte Abgrenzung
erreicht werden zwischen dem
apikalen und dem basolateralen
Extrazellulärraum
2.
Die Polarität muss aufrecht
erhalten werden
Knopf-Desmosom
mit Keratinfilamenten
(macula adhaerens) 3.
gap-junction
(offene Verbindung)
Intermediärfilament
Hemidesmosom
basale Oberfläche
Basallamina
55
4.
Gap Junction
Der Zell-Layer muss mechanisch
stabilisiert werden
Die interzelluläre
Kommunikation muss ermöglicht
werden
56
Pankreas-Azinuszellen als Beispiel polarisierter
Zellen
Struktur und Aufbau von „Tight Junctions“ I
zentrales Kanälchen
apikale Membran
sektretorische Vesikel
web.mit.edu (Lectures)
tight junctions
basolaterale Membran
Azinuszelle: synthetisiert
Verdauungsenzyme, die sich in sekretor.
Vesikeln anreichern
57
58
Molekulare Struktur und Aufgaben der „Tight
Junctions“
Struktur und Aufbau von „Tight Junctions“ II
•
•
web.mit.edu (Lectures)
Occludin und Claudin
•
•
59
Tight Junctions werden von
Membranprotein-Komplexen
gebildet (Occludin und Claudin),
die benachbarte Zellen direkt
miteinander verbinden
Dadurch entsteht ein
undurchlässiger Verschluss, der
den Transport zwischen den
Zellen hindurch (parazellulären
Transport) verhindert.
Membranproteine und Lipide
werden an dieser Barriere
ebenfalls aufgehalten und können
nicht zum anderen Zellpol
diffundieren
Dadurch wird die funktionelle und
strukturelle Polarität
aufrechterhalten
60
Gap Junctions (Verbindungskanäle)
Struktur der Gap Junctions
... sind Verbindungsporen zwischen den
Zellen, die aus Proteinkomplexen
bestehen. Moleküle bis zu einem
Durchmesser von 1.2 nm (etwa 2 kd)
können durch diese Poren in Nachbarzellen
diffundieren. Dazu zählen Ionen,
Botenstoffe (second messenger wie Ca2+
oder cAMP), sowie Metabolite.
: ca. 2 –3 nm
Gap Junctions werden von Kanälen aus
Transmembranproteinen (ConnexinProteinen) gebildet, die als Hexamer
eine Pore durch die Membran bilden
(Connexon) – zwei dieser Connexone
benachbarter Zellen bilden einen Kanal
zwischen den Zellen (aus insgesamt 12
Connexinen). Bisher wurden 12 Gene
der Connexinfamilie identifiziert. HeteroOligomere aus verschiedenen Vertretern
können unterschiedliche
Transporteigenschaften haben.
61
Beeinflussung der Gap Junctions durch die
Ca2+-Konzentration
Funktionen der Gap Junctions
•
Stoffwechselkopplung (Metabolit-Transfer): z.B. von Nukleotiden
•
Interzelluläre Kommunikation über Botenstoffe: cAMP, Ca2+ etc: die
Freisetzung dieses „Second Messenger“ in einer Zelle führt zur
Stimulierung der Nachbarzellen: z.B. Erhöhung der Ca2+-Konzentration
in Muskelzellen führt zur Stimulierung von Nachbarzellen und zur
Synchronisation der Kontraktion.
•
•
62
elektrische Kopplung der Neuronen (elektrische Synapsen:
Übertragungsgeschwindigkeit: wenige µsec; im Gegensatz dazu:
chemischen Synapsen über Neurotransmitter: etwa 0.5 msec)
Modulierbarkeit der Funktion: Die Öffnung und Durchlässigkeit der Gap
Junctions kann durch die Calcium-Konzentration in der Zelle beeinfusst
werden.
63
Außerhalb der Zellen ist eine relativ hohe Calcium-Konzentration (1 – 2 mM),
in den Zellen ist sie unter 1 µM. Bei Verletzungen eines Epithels und
Einfließen extrazellulären Calciums schließen sich die Gap Junctions, um
Nachbarzellen abzuschotten.
In ähnlicher Weise können Änderungen der intrazellulären CalciumKonzentration auch im physiologischen Bereich, die Durchlässigkeit der
Kanäle modulieren.
Ca2+
Modell der Ca2+-abhängigen
Konformationsänderung der
Gap Junctions
64
Funktion der „Gap Junctions“ in elektrischen Synapsen
elektrische
Kopplung
verbundener
Neuronen
Adhäsionsgürtel
... sind Bereiche der lateralen Zellmembran (meist knapp unterhalb der tight
junctions), wo die Zellen über ein Band quervernetzter Proteine (Cadherine)
stabilisiert werden. Über Adapterproteine (Catenine, Vinculine) sind diese
Bänder mit dem Aktin-Filamentnetzwerk verknüpft.
Cadherine
Adapterproteine
(α- und β-Catenin)
65
66
Elektronenmikroskopie von Desmosomem
Desmosomen
Detailbild des Desmosoms mit den
Intermediärfilamenten
... sind Haftstellen benachbarter Zellen (15 – 20 nm dick), wo TransmembranProteine der Cadherin-Familie (Desmoglein und Desmocollin) mit knopfförmigen
Proteinkomplexen aus Plakoglobin (dem β-Catenin verwandt) verknüpft sind.
Diese wiederum sind mit den Intermediärfilamenten (Keratinfilamenten)
verbunden und bilden funktionell ein suprazelluläres Netzwerk.
zahlreiche Desmosomen im stratum
spinosum der Epidermis zur Stabilierung
der äußersten Hautschicht.
Schema eines Knopf-Desmosoms:
Keratinfilamente
cytoplasmatisches
Plaque (Plakoglobin)
Cadherine
(Desmoglein)
67
web.mit.edu (Lectures)
from: Mol. Biol. of the Cell, 1995
Zellmembranen
benachbarter Zellen
68
Spezifische, temporäre Zell-Zellkontakte
Hemi-Desmosomen
„Halb-Desmosomen“, an denen die Intermediärfilamente der Zellen nicht mit
Nachbarzellen, sondern mit einer Basalschicht (der Basal-Lamina) verknüpft
sind.
In einigen Fällen treten temporäre Zellkontakte auf, wie z.B. bei der
Bindung der Transmigration von Leukozyten durch das Endothel (beim
Übertritt vom Blut ins Gewebe):
69
70
Integrine
Zelladhäsionsmoleküle
... sind dimere TransmembranProteine, die aus α- und βKetten bestehen. Es gibt etwa
17 verschiedene α-Ketten und 8
unterschiedliche β-Ketten und
22 bekannte Kombinationen von
Heterodimeren. Diese erkennen
unterschiedliche extrazelluläre
Liganden (wie etwa Kollagene,
Laminine, Fibronectine sowie
spezifische Adhäsionsmoleküle
wie etwa ICAM-1 oder VCAM-1).
(Cell Adhesion Molecules, CAM´s)
Integrine und ihre Liganden
zeigen eher eine schwache
Wechselwirkung (KD ca. 10-6),
wodurch eine gute
Feinregulation (über die Zahl der
Bindungsstellen) und Flexibilität
ermöglicht wird.
71
72
Integrine vermitteln den Kontakt von Zellen mit
der Extrazellulärmatrix
Fokalkontakte: Stellen
an denen Aktinfilamente
über Integrine mit
extrazellulärem
Fibronektin verknüpft
sind.
Fokalkontakte am Ende von Stressfasern
Hemidesmosomen:
Stellen an denen
Intermediärfilamente
aus Keratinen über
Integrine (α6β4)mit
Laminin in der
Basallamina verknüpft
sind.
73
74
Extrazelluläre Matrix
Struktur des Kollagens
Im Gewebe sind viele Struktur- und Stützkomponenten außerhalb der Zellen;
diese Strukturkomponenten sind einerseits multimere, faserartige ProteinVerbindungen (wie etwa Kollagen), oder auch Proteoglykane mit hohem
Glykan-Anteil.
Kollagene: 16 verschiedene Typen; Typ I, II und III bilden lange
Fibrillen, Typ IV bildet Netzstrukturen; Kollagene werden hauptsächlich
von Fibroblasten (Bindegewebszellen) gebildet, aber auch von
bestimmten Epithelzellen.
OH
OH
1.5 nm
OH
OH
Triplehelix (300 nm lang)
aus α-Ketten
Gal
Glc
Quervernetzte Triplehelices
(um je 67 nm versetzt)
Jede α-Kette besteht aus
1050 Aminosäuren mit
hohem Anteil an Glycin,
Prolin und Hydroxyprolin.
75
76
Synthese, Sekretion und Zusammenbau des
Kollagens
Animierte Darstellung der Kollagensynthese
Synthese und Glykosylierung
im ER als Prokollagen mit
endständigen Propeptiden
Fibrillenbildung erst
außerhalb der Zelle nach
Abspaltung der Propeptide
Quervernetzung
77
Fibronectine
78
Proteoglykane
... lösliche Multiadhäsionsproteine in der extrazellulären Matrix, die an Integrine
Binden und der Anheftung von Zellen an Kollagenfibrillen (Typ I, II, III und V),
sowie Fibrin (Bestandteil der Blutgerinnsel) dienen. Fibronectine sind Dimere; jede
Kette besteht aus etwa 2500 Aminosäuren. Durch alternatives Spleißen existieren
viele Variationen. Fibronectine haben auch eine wichtige Funktion bei der
Wanderung und Differenzierung von Zellen.
... sind stark glykosylierte Proteine mit
einem Polypeptide-Kern, der von zahlreichen
Glykanen umgeben ist. Die Zuckerreste sind
hauptsächlich Glykosaminoglykane (GAG´s)
und Uronsäuren, häufig mit Sulfatresten.
Dadurch entsteht eine stark negative
Ladung und Hydrophilität. Proteoglykane
sind sowohl an Zelloberflächen (z.B.
Syndecan), als auch in der Extrazellulären
Matrix, wo sie z.B. Bestandteil der
Knorpelmasse sind (als Aggrecan).
Integrin-bindende
RGD-Schleife
....
....
79
80
Proteoglykane in der extrazellulären Matrix
Proteoglykane an der Zelloberfläche
In Knorpeln oder ähnlichen
Strukturen sind ProteoglykanMonomere (aus dem Polypeptidkern
und vielen Oligosaccharidketten) über
Hyaluronsäure (einem langen
Oligosaccharid aus Glucuronsäure und
N-Acetylglykosaminresten)
miteinander vernetzt.
Bei ZelloberflächenProteoglykanen weist der
Polypeptid-Kern eine
Transmembranregion auf,
sowie eine zytosolische
Domäne, die meist mit dem
Zytoskelett (Aktinfilamenten)
oder Signalmolekülen wie PKC
interagieren kann. Der stark
glykosylierte Extrazellulärteil
bindet meist an Komponenten
der extrazellulären Matrix.
Proteoglykan-Monomer
Hyaluoronsäure
n bis zu 50 000
81
82
Die Basallamina
Proteoglykane als Bindungsstellen von
Wachstumsfaktoren
Proteoglykane (extrazelluläre
oder membranständige) können
auch meist Wachstumsfaktoren
(wie etwa FGF, fibroblast growth
factor, oder TGFβ, transforming
growth factor-β) binden. Bei
manchen Faktoren ist diese
Bindung nötig, damit der Faktor
auf dem korrespondierenden
Rezeptor ein Signal induzieren
kann („Präsentation des
Wachstumsfaktors“). Außerdem
stellen die gebundenen Faktoren
einen Vorrat an
Wachstumsfaktoren dar, weil sie
in der gebunden Form nicht so
rasch abgebaut werden.
83
... etwa 60 – 100 nm dickes Netzwerk aus Kollagen Typ IV, das über
Laminin (einem kreuzförmigen trimeren Proteinkomplex mit 820 kDa),
sowie Entactin und dem Proteoglykan Perlecan quervernetzt ist. Laminin
bindet auch an sulfatierte Lipide, und gemeinsam mit Typ IV-Kollagen an
Integrine in der Zytoplasmamembran. Die Basallamina hat wichtige Stützund Regulatorfunktionen.
Zelllayer
Basallamina
Bindegewebe
Perlecan
Typ IVLaminin Kollagen
Entactin
84
Video-Darstellung des Zellzyklus
Themen der Vorlesung
(Drosophila-Embryonen; Mikrotubuli grün und DNA blau gefärbt)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation
85
Grundlagen der Zellteilung
86
Schematische Darstellung des Zellzyklus
Säugetier-Zellen teilen sich etwa 1x in 24 h (Hefezellen ca. 1x in 90 min) durch
eine genau regulierte Aufeinanderfolge von Teilprozessen, die in ihrer Gesamtheit
als Zellzyklus bezeichnet werden. Die wichtigsten Phasen dieses Zyklus und ihre
ungefähre Dauer in Säugerzellen sind:
1.
G1-Phase (Gap 1, 9 h): Unterbrechungsphase zwischen der physischen
Teilung der Zelle und dem Beginn der nächsten DNA-Replikation
2.
S-Phase (Synthesephase, 10 h): DNA-Synthese, Replikation der
Chromosomen
M-Phase: Mitose
G2-Phase:
Vorbereitung
der Mitose
3.
G2-Phase (Gap 2, 4.5 h): Unterbrechungsphase zwischen der DNA-Synthese
und der Phase der physischen Trennung der Chromosomen und der Zellen.
4.
M-Phase (Mitose-Phase, 30 min): wird in folgende Stadien unterteilt:
4.1. Prophase: Kondensation der Chromosomen (durch Verdrillung)
4.2. Metaphase: Ausrichtung der Chromosomen in der Zellmitte
4.3. Anaphase: Trennung der Schwesterchromatiden zu den gegenüberliegenden Polen des Spindelapparates
4.4. Telophase: Teilung der Zellen (Cytokinese)
S-Phase: DNASynthese
87
ChromosomenKondensation
und Trennung
Cytokinese
(Zellteilung)
Tochterzellen
G0-Phase:
dauerhaftes
Ruhestadium
ohne Zellteilung
G1-Phase:
Vorbereitung der
S-Phase
88
Chronologie der Zellzyklus-Erforschung:
1. Biochemische Untersuchungen an Froscheiern
Oocyten des Frosches Xenopus laevis verharren in ihrer Entwicklung 8 Monate
lang in der G2-Phase und wachsen dabei stetig. Normalerweise wird die
weitere Zellteilung durch Progesteron-Ausschüttung induziert. Wenn man
jedoch das Cytosol von Eiern, die in der Metaphase sind (im Stadium der 2.
Meiose), in G2-arretierte Zellen injiziert kommt es zur Induktion der Zellteilung
(durch Übertragung eines maturation promoting factors, oder mitosis
promoting factors MPF – dieser enthält Cyclin B/Cdk) – damit konnte erstmals
ein für die Zellteilung essentieller Faktor nachgewiesen werden.
Mikroinjektion
Cytosol von MPhase Zelle
Die Menge an Cyclin B und die Aktivität des
Cyclin B/Cdk-Komplexes schwanken im
Rhythmus des Zellzyklus
Weitere biochemische Experimente zeigten, dass der Cyclin B-Spiegel vor der
Mitose ansteigt und in der Mitte der Mitosephase plötzlich abfällt. Dabei werden
zuerst Poly-Ubiquitin Ketten kovalent an Cyclin B angefügt und dieses dann in
großen Protease-Komplexen (den Proteasomen) abgebaut.
MPF
G2-arretierte
Zelle
Zellteilung
89
90
SCF-Komplexe als E3-Ligasen der
Ubiquitinylierung
Ubiquitinylierung mitotischer Cycline
„Destruction box“ einiger Cycline
Eine Ubiquitin-Einheit: 76 AS
• Substrat-Spezifität
erfolgt über das F-Box
Protein
Arg-(Thr,Ala)-(Val,Ala)-Leu-Gly-X-Ile-Gly
• Die E3-Ligase Aktivität
erfolgt über das RING-box
Protein Rbx1 (RING finger
Domäne, Zn-bindend)
Anaphase Promoting Complex
Proteasom
E3 (APC)
E2
E1
n-Zyklen
zu Peptiden
abgebautes Cyclin
E2
• andere E3-Ligasen:
HECT Proteine
n
Ubiquitin
• RING finger Proteine
können auch außerhalb
von SCF Komplexen
auftreten
Poly-Ubiquitinkette
91
92
Abbau durch Proteasomen
Ubiquitinylierte Proteine werden spezifisch durch Proteasomen abgebaut.
Proteasomen bestehen aus einem zentralen Zylinder (20S-Partikel) mit sehr kleinen
Öffnungen an den Enden und Protease-Aktivitäten im Inneren. An den Enden
befinden sich Proteasom-Aktivator-Komplexe: PA700 oder 19S-Aktivator, bzw. PA28
oder 11S-Aktivator (bei Interferon-induzierten Proteasomen).
Der PA700-Aktivator erkennt spezifisch ubiquitinylierte Proteine. Durch ATPaseEinheiten des Aktivators wird das Substratprotein entfaltet und durch die enge
Öffnung des zentralen Zylinders geschleust, wo es abgebaut wird.
α7 β7 β7 α7
15 nm
Raumstruktur eines
Proteasoms mit einem
11S-Aktivator nach
RöntgenstrukturAnalyse
ATPasen Ubiquitin-Bindung
20S_PA26 Trypanosome 1FNT.pdb
12 nm
1.3 nm
Öffnung
Raummodell des
20S-Zylinders
26S Proteasom
Protease Aktivität
93
94
2. Genetische Untersuchungen mit S. pombe
Autoregulatorischer Abbau des Cyclin B
hohe Cyclin B-Spiegel und
somit MPF-Aktivität (in der
Metaphase) aktivieren
durch Phosphorylierung die
Ubiquitinylierungsaktivität
der E3-Ligase (des APCKomplexes) und führen
somit zum Abbau von
Cyclin B. Die ProteinkinaseEinheit (cyclin-dpendent
kinase, Cdk) verliert
dadurch ihre Aktivität bis
wieder neues Cyclin B in
der Interphase
synthetisiert wird.
95
Die Identifizierung der
katalytischen Einheit des
MPF (der cyclin-abhängigen
Kinase) gelang durch
genetische Untersuchungen
an S. pombe. Temperatursensitive Mutanten wurden
generiert, die abnorme
Längen aufwiesen. Durch
Komplementierung mit
Wildtyp-cDNA´s konnten
entscheidende Faktoren
identifiziert werden.
Die Kinase-Einheit des MPF
wurde Cdc2 genannt, das zu
Cyclin B homologe Protein
Cdc13. In Säugerzellen hat
die Kinase-Einheit den
Namen Cdk1
96
3. Genetische Untersuchungen an S. cerevisae
Bäckerhefe teilt sich durch
Knospung. Die Knospen entstehen
in der G1-Phase. Zum
Restriktionszeitpunkt (in der Hefe:
START genannt) wird der
irreversible Übergang zur S-Phase
eingeleitet. Nach der DNASynthese kommt es in der G2Phase zur Kernwanderung in die
Teilungszone, und in der M-Phase
zur Ausbildung des
Spindelapparates (innerhalb des
Kerns, ohne Auflösung der
Kernmembran), Trennung der
Chromosomen und Cytokinese.
Komplementierungsstudien führten zur
Identifizierung der G1-Cycline
Temperatursensitive Cdc28-Mutanten weisen oft eine reduzierte Affinität
der Cdc28 Kinase zu seinem Cyclin-Bindungspartner auf. Durch
Überexpression von Cyclin-Genen kann diese reduzierte Affinität
kompensiert werden. Auf diese Weise wurden die G1-Cycline in der Hefe
identifiziert: CLN1, CLN2 und CLN3.
Der Komplex aus Cdc28 und G1-Cyclinen induziert den Übergang in die SPhase, indem er einen S-Phase-Inhibitor (Sic1) phosphoryliert, was zu
dessen Ubiquitinylierung führt (über Cdc34 als E2-Enzym und einem SCFKomplex als E3-Ligase) und seinen Abbau induziert.
Genetische Untersuchungen
zeigten, dass das S. cerevisiaeGen cdc28 die gleiche Aufgabe
erfüllt, wie cdc2 in S. pombe.
Während cdc2 in der Spalthefe vor allem für den Übergang von G2 in die
M-Phase wichtig ist, ist cdc28 vor allem für den G1-S Übergang essentiell
97
Raumstruktur eines Cyclin/Cdk-Komplexes
aktives Zentrum
98
Abbau der Kernhülle in der frühen Mitose-Phase
Mitotische Cyclin B/Cdk Komplexe führen zur Phosphorylierung der
Lamine (Intermediärfilamente) der Kernmembran und somit zu ihrer
Depolymerisation
Threoninrest, der phosphor. wird
Cyclin B/Cdk
Cyclin A
P
P
P P
P
P
P
P
Cdk2 ohne Cyclin A
quervernetzte Lamin-Filamente
Cdk ohne Cyclin: aktives Zentrum durch eine Peptidschleife
blockiert.
Änderung der Raumstruktur der Cdk durch Bindung an Cyclin,
weitere Änderung durch Phosphorylierung (durch Cdkaktivierende Kinasen, CAK) > Zunahme der Cdk-Aktivität.
Depolymerisation und Dissoziation
99
100
2 nm
Kondensation der
Chromosomen in der
Prophase der Mitose
... durch einen Proteinkomplex
namens Condensin: führt zur
Superspiralisierung der DNA unter
Hydrolyse von ATP.
11 nm
30 nm
Wirkungen des Anaphase-fördernden Komplexes
(APC)
Der Cyclin B/Cdk-Komplex aktiviert den APC; dieser ubiquitinyliert den AnaphaseInhibitor, der die Trennung der Schwesterchromatiden blockiert. Nach Abbau
dieses Inhibitors wir die Anaphase und die Chromosomentrennung induziert;
danach führt der APC zur Ubiquitinylierung und zum Abbau von Cyclin B.
300 nm
700 nm
1400 nm
101
Zusammenbau der Kernhülle in der Telophase
102
Säugerzellen
Subporenkomplexe
teilw. dekondensiertes Chromosom
Vesikel der Kernhülle
Anheftung der Vesikel ans Chromosom
Fusion der Vesikel und Bildung der Kernporen
Viele Zellen höherer Organismen unterbrechen
den Zellzyklus in der G1-Phase und treten in
einen dauerhaften Ruhezustand, die G0-Phase.
Zugabe bestimmter Wachstumsfaktoren lässt sie
wieder in den Zellzyklus eintreten, indem die
Expression zweier Genklassen induziert wird:
1. Gene der schnellen Reaktion (early response
genes): Expression durch bereits vorhandene
Transkriptionsfaktoren – kann nicht durch
Proteinsynthese-Inhibitoren blockiert werden
(z.B. Expression von c-Fos und c-Jun)
2. Gene der verzögerten Reaktion (delayed
response genes): werden durch
Transkriptionsfaktoren induziert, die in der
schnellen Reaktion gebildet wurden.
Kernpore
Karyomer
(Minikern)
Zu diesen Genen gehören z.B. Cyclin D und E, Cdk2, -4 und –6,
sowie der Transkriptionsfaktor E2F, der viele essentielle Proteine
des Zellzyklus induziert.
Fusion der Karyomere
Neubildung der Kernlamina
103
104
Signalwege zur Initiierung des Zellzyklus in
Säugerzellen
Die Signalübertragung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen
auf die GTPase Ras
Die Expression von Genen der schnellen und der verzögerten Reaktion wird
durch komplexe Signalwege induziert, die durch Zelloberflächen-Rezeptoren
initiiert werden.
Rezeptor-Tyrosin Kinasen (RTK´s): binden
Wachstumsfaktoren wie FGF oder EGF
Bindung des Liganden an den Rezeptor induziert
dessen Dimerisierung und autokatalytische
Tyrosin-Phosphorylierung.
Phosphotyrosin-Reste sind eine Bindungsstelle
für Adapterproteine mit sogenannten SH2Domänen (z.B. GRB2) – diese können das Signal
über andere Bindungsregion weiterleiten, z.B.
über eine SH3-Domäne an das nächste Molekül:
Sos. Dieses wiederum ist ein GuaninAustauschfaktor (guanine nucleotide exchange
factor, GEF) für die GTPase Ras. Dadurch wird
Ras in den aktiven GTP-Zustand übergeführt,
was die Aktivierung weiterer Signalwege
induziert.
105
Übertragung des Signals von Ras auf Mitogenaktivierte Protein Kinasen (MAPK)
aktives Ras bindet und aktiviert die Serin-Kinase Raf, wird selbst wieder in inaktives
GDP-Ras überführt, während Raf wieder eine Kinase aktiviert (MEK).
GDP
inaktives Ras
aktives Ras
Dimerisierung, Autophosphorylierung der RTK
> Bindung von GRB2 und Sos
> Rekrutierung und Aktivierung von Ras
aktives Ras aktiviert weitere Signalwege:
MAPK-Weg (Mitogen activated Protein Kinase)
106
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren über den
RTK-Ras-MAPK-Signalweg
Raf
Ras
MEK
aktive MEK
MAPK
Aktive MEK phosphoryliert und
aktiviert wiederum eine MAPK, die in
den Zellkern wandert und dort
Transkriptionsfaktoren aktiviert, die für
den Zellzyklus essentiell sind.
generelles Schema:
aktive MAPK
MAPKKK (MEKK)
MAPKK (MEK)
MAPK
107
108
Überschreiten des Restriktionspunktes
(G1/S-Übergang) in Säugerzellen durch
Cyclin D/Cdk4 (6)-vermittelte Aktivierung von E2F
Cyclin/Cdk-Komplexe im Zellzyklus von
Säugerzellen
Cdk1/Cyclin B
Cdk1/Cyclin A
G2
S
Cdk2/Cyclin A
Der Transkriptionsfaktor E2F ist essentiell für die Expression verschiedener
Zellzyklus-Proteine (wie etwa Cyclin A und E, sowie Cdk2 usw.). E2F ist
normalerweise durch Bindung an Retinoblastoma-Proteine (Rb, p107, p130)
inaktiviert. Cyclin D/Cdk-Komplexe führen zu einer Phosphorylierung von Rb,
einem Abdissoziieren des Inhibitors und Aktivierung von E2F. Die von E2F
induzierten Proteine Cdk2 und Cyclin E phosphorylieren ebenfalls Rb, was zu
einer weiteren Verstärkung der E2F-Aktivierung führt. Rb bleibt bis zum Ende
des Zellzyklus phosphoryliert, bis es dann in der nächsten G0/G1-Phase durch
die geringe Menge Cyclin/Cdk dephosphoryliert wird und wieder E2F hemmt.
G0
M
G1
Restriktionspunkt
Cdk4/Cyclin D
Cdk6/Cyclin D
Cdk2/Cyclin E
109
Weitere wichtige Cyclin/Cdk Komplexe
110
Cyclin-Kinase Inhibitoren steuern die Aktivität
der Cdk´s in Säugerzellen
• Cyclin A/Cdk2 induziert die DNA-Synthese
> Einleitung der DNA-Replikation an den in der frühen G1-Phase
gebildeten Präreplikationskomplexen und Hemmung der Bildung
neuer Präreplikationskomplexe (um sicherzustellen, dass die DNA
nur einmal repliziert wird).
Es gibt 2 Klassen von Cdk-Inhibitoren
1. Familie der CIP-Proteine (Cdk-Inhibitor Proteine), die alle Cyclin/CdkKomplexe hemmen (p21, p27, p57).
2. INK4-Proteine (Inhibitoren der Kinase 4- Proteine, z.B. p16, p19): hemmen
spezifisch Cyclin D/Cdk4 und Cyclin D/Cdk6.
• Cyclin A (B)/Cdk1 reguliert den Übergang zur M-Phase
(G2/M-Transition)
Diese Proteine hemmen die Phosphorylierung von Rb und somit die
Aktivierung von E2F. Deshalb werden sie auch als Tumorsuppressor-Gene
angesehen. Außerdem haben sie wichtige Funktionen bei der
Embryonalentwicklung und bei der Steuerung der Differenzierung von Zellen.
111
112
Zellzyklus-Kontrollpunkte
Das Tumorsuppressor-Gen p53
Um Fehler im Zellzyklus zu vermeiden gibt es viele Regulationsmechanismen:
1.
Nicht replizierte DNA verhindert den Beginn der Mitose
2.
Fehler im Aufbau des Spindelapparates halten den Zellzyklus in der
Anaphase an.
3.
DNA-Schäden führen zur Expression von Tumorsuppressor-Genen und
dem Anhalten des Zellzyklus in der G1- oder der G2-Phase
DNA-Schäden führen zur Stabilisierung eines Proteins, das normalerweise
nur in geringer Menge vorhanden ist: p53. Dieses Protein ist ein
Transkriptionsfaktor, der die Expression der Cdk-Inhibitoren p21 und p27
induziert und zu einem G1- oder G2-Arrest führt. Dadurch hat die Zelle
Zeit den Schaden wieder zu reparieren – gelingt dies, kann der Zellzyklus
fortgesetzt werden, wenn es nicht gelingt, wird in vielen Fällen der
programmierte Zelltod (Apoptose) induziert.
Die Menge von p53 wird durch komplexe Regulationsmechanismen mittels
Ubiquitinylierung (über das Protein Mdm2) und proteasomalen Abbau
gesteuert. Mutationen von p53 sind bei den meisten Krebsarten
vorzufinden.
113
114
9
1.
Entstehen von DNA-Präreplikationskomplexen
2.
G1-Cyclin/CdK inaktiviert den APC (Anaphase-Promoting Complex)
3.
G1-Cyclin/CdK aktiviert die Transkription von S/CdK-Komponenten
4.
G1-Cyclin/CdK phosphoryliert den S/CdK-Inhibitor und markiert ihn zum Abbau
5.
Ubiquitinylierung des S-Cyclin/CdK-Inhibitors über den Cdc34-Weg und Abbau
durch Proteasomen
Aktivierung der DNA-Präreplikationskomplexe durch S-Cyclin/CdK
7.
M-Cyclin/CdK aktiviert die Chromosomenkondensation, den Zerfall der Kernhülle
und den Aufbau des Spindelapparates. Gleichzeitig Zerfall von ER und Golgi in
kleine Vesikel.
9.
Ubiquitinylierung und Abbau
der M-Cycline (APC-Weg)
Ubiquitinylierung des
Anaphase-Inhibitors
über den APC-Weg
und Abbau durch
Proteasomen
Telophase und Cytokinese
1
Anaphase
2
G1
M
8
G1/CdK
Metaphase
3
G2
M/CdK
6.
8.
Aktuelles Modell
des Zellzyklus
10
Die wichtigsten Teilprozesse des Zellzyklus
S
7
Restriktionspunkt
S/CdK
4
Inhibit.
5
Aktivierung des APC durch M-Cyclin/CdK
Ubiquitinylierung und Abbau des Anaphase-Inhibitors durch Proteasomen (APCWeg)
10. Ubiquitinylierung und Abbau der M-Cycline Auf dem APC-Weg
115
S/CdK
Komplex aus Cyclin und
Cyclin-abhängiger Kinase
(CdK, Cyclin-dependent
Kinase) der entsprechenden
Zellzyklus-Phase (G1, S, M)
6
DNA-Replikation
Ubiquitinylierung über den
Cdc34-Weg und Abbau
durch Proteasomen
116
Der Spindelapparat in Säugerzellen
Mikrotubuli in der M-Phase des Zellzyklus
Funktion: Exakte Trennung der Schwesterchromatiden und Verteilung
auf die Tochterzellen
Struktur:
117
1)
Zentraler Spindelapparat:
a) Pol-Mikrotubuli: vom Centrosom in die Mitte (überlappend)
b) Kinetochor-Mikrotubuli: vom Centrosom zu den Chromosomen
2)
Asteren: Astralmikrotubuli: vom Centrosom zum Cortex
118
Übergang von der Metaphase in die Anaphase
durch Inaktivierung der Cohesine
Rolle der Mikrotubuli
1.
Die Polmikrotubuli: übertragen Druckkräfte nach außen zum
Auseinanderdrücken der Pole
2.
Die Kinetochor-Mikrotubuli binden an die Chromosomen und halten
sie am Centromer
3.
Die Astralmikrotubuli vermitteln Zugkräfte nach außen und dienen zur
Positionierung des Spindelapparates und zur Festlegung der
Trennebene zwischen den Zellen
Der Anaphase-Inhibitor wird
ubiquitinyliert und in Proteasomen
abgebaut, dadurch wird der
Cohesin-Komplex, der die
Schwesterchromatiden
zusammenhält aufgelöst und die
Chromatiden können
auseinandergezogen werden
119
120
Duplikation und Wanderung der Centrosomen
Die Centrosomen beginnen bereits in der G1-Phase mir der
Verdopplung; die volle Länge erreichen die Centriolen in der G2-Phase
(sie sind jedoch immer noch in einem Centrosom). Danach trennen sie
sich und wandern auf gegenüberliegende Seiten der Zelle (in der frühen
M-Phase). Diese Trennung wird über Motorproteine (Kinesin Related
Proteins, KRP´s) vollzogen.
Der mitotische Spindelapparat ist viel
dynamischer als Interphase-Mikrotubuli
Interphase-Mikrotubuli sind rel.
lang und stabil (mittlere
Lebensdauer: 10 min); die in der
Mitose gebildeten Spindel- und
Asterenmikrotubuli sind deutlich
kürzer und instabiler
(Lebensdauer in der Spindel:
etwa 30 sec !). Diese dynamische
Instabilität dient dem
„Einfangen“ der Chromosomen
und dem dynamischen Aufbau
des Spindelapparates
121
Dynamik der Kinetochor-Mikrotubuli
122
Anaphase A
Wenn die Kinetochor-Mikrotubuli die
Chromosomen nicht mit dem Ende zuerst
kontaktieren, transportieren Motorproteine des
Kinetochors das Chromosom zum Ende des
Mikrotubulus – dort stabilisiert der KinetochorKomplex das Mikrotubulus-Ende
In der Anaphase A verkürzen sich die Kinetochor-Mikrotubuli durch
Depolymerisation an den Plus-Enden, während die Chromosomen entlang der
Mikrotubuli polwärts wandern
... dies kann experimentell durch Ausbleichen fluoreszenz-markierter
Mikrotubuli des Spindelapparates und Untersuchung des Fluoreszenzverlaufs
gezeigt werden.
Durch dynamische Verlängerung und Verkürzung
der Mikrotubuli, sowie Motorproteine am
Kinetochor werden die Chromosomen im ZellÄquator ausgerichtet (in der Prometaphase)
123
124
Anaphase B
In der Anaphase B verlängern sich die
Pol-Mikrotubuli durch Polymerisation
an den Plus-Enden und Kinesinähnliche Motorproteine drücken die
Pole auseinander.
Gleichzeitig kann von den
Astralmikrotubuli aus eine Zugkraft
ausgeübt werden (über Minusgerichtete Motor-Proteine, die am
Cortex liegen).
Themen der Vorlesung
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation
125
126
Nekrose
Apoptose und Nekrose
Nekrose kann durch Toxine entstehen oder auch durch eine mangelnde
Versorgung mit Nährstoffen. In vielen Fällen wird dadurch der Energiehaushalt der
Zellen unterbunden, es kommt zum Zusammenbruch der Mitochondrienfunktion,
zum Verlust von ATP und zum Sinken des cytosolischen pH-Wertes. ATPabhängige Ionenpumpen arbeiten nicht mehr, es kommt zur Änderungen des
osmotischen Drucks, zum Einströmen von Wasser (Anschwellen der Zellen) und
zum Platzen von Lysosomen. Dadurch geraten verschiedene Enzyme und
Hydrolasen in den Extrazellulärraum und es kommt zu entzündlichen Prozessen
und zur unkontrollierten Autolyse.
Apoptose (programmierter Zelltod): Membran bleibt intakt
Änderung der Eigenschaften von:
Im Körper gibt es 2 Hauptformen von Nekrose: 1. die koagulative Nekrose:
durch Abschneiden bestimmter Gewebebereich von der Blutversorgung aufgrund
von Blutgerinnseln (z.B. Herzinfarkt, Schlaganfall...). In diesem Fall bleibt die
Gewebe- und Zellarchitektur großteils erhalten
2. Die lytische Nekrose: Auflösung der Zellen durch Autolyse, wenn größere
Mengen lytischer Enzyme freiwerden; z.B. bei der Abwehr bakterieller Infektionen
durch neutrophile Granulzyten (Phagozyten), die lytische Enzyme freisetzen (Eiter:
abgestorbene Granulozyten und Hydrolasen).
Membran
Mitochondrien
Kern
Cytoplasma
Gangräne: Kombinationen von koagulativen und lytischen Nekrosen (trocken:
mehr koagulativ, feuchte Gangrän: mehr lytisch)
Nekrose: Membran wird undicht
127
128
Beispiele nekrotischer Veränderungen
koagulative Nekrose des Herzens
Morphologie der Apoptose I
lytische Nekrose im Gehirn
Gangrän von Zehen
apoptotische HeLa Zellen
(nach TNFα-Behandlung)
129
130
Die Rolle der Apoptose bei der Entwicklung:
Genetische Untersuchungen an C. elegans
Morphologie der Apoptose II
abgestorbene Zellen (in einer Larve, bei
der die Phagozytose blockiert wurde)
Schrumpfung der Zelle; Änderung der
Membranzusammensetzung (Umklappen von
Phosphatidylserin-Resten auf die Außenseite);
Verdichtung und Trennung des Chromatins
Fragmentierung des Zellkerns, Bildung von Blasen an der
Zelloberfläche („membrane blebbing“), Fragmentierung
der Zelle
Der Wurm Caenorhabditis elegans
wurde als Modellorganismus gewählt,
weil er eine klar definierte Entwicklung
hat: im Verlauf dieser werden genau
1090 Körperzellen gebildet, von denen
131 durch Apoptose absterben. Durch
Mutationen konnte man dafür
essentielle Gene identifizieren:
Ced-3 und Ced-4: notwenig für die
Apoptose (Säuger-Homologe: Caspasen
und Apaf-1)
Phagozytose durch Makrophagen oder Granulozyten
Ced-9: Regulator, der die Apoptose
hemmt (Säuger-Homolog: Bcl-2)
„apoptotisches Körperchen“ (apoptotic body)
Phagozyt
131
132
Caspasen
Caspasen 1-12 in Säugerzellen
Cystein-Proteasen, die nach Aspartat-Resten in bestimmten Sequenzen
spalten: sind meist als inaktive Proformen in der Zelle.
Initiator-Caspasen: aktivieren sich autokatalytisch (autoproteolytisch) nach
best. Signalen, die Substrate dieser Caspasen sind die:
Effektor-Caspasen: werden von Initiator-Caspasen aktiviert und spalten
dann bestimmte Substrate
inaktives Pro-Enzym
Spaltung bei Caspase Spaltstellen
aktive Caspase (Tetramer aus
2 großen und 2 kleinen Untereinheiten)
133
Substrate der Effektor-Caspasen
134
Zusammenbruch des Cytoskeletts bei der
Apoptose
•Signalproteine der Überlebensmechanismen
(z.B. NF-κB und dessen Regulatoren)
•Proteine, die für die Funktionalität der Mitochondrien und der Atmungskette
wichtig sind
•DNA-Reparatur-Mechanismen (z.B. PARP: Poly-ADP-Ribose Polymerase, die
DNA-Strangbrüche markiert)
Intermediärfilamente (Cytokeratine)
bei normalen Zellen
bei apoptotischen Zellen
•Kernlamina: zur Fragmentierung des Kerns
•Cytoskelett-Komponenten
•Enzyme, die nach Caspase-vermittelter Aktivierung DNA spalten (DNAFragmentierung genau zwischen den Histonen > Leiter-Effekt in der
Elektrophorese)
Endonuclease-Spaltung
Carla Fiorentini et al.
135
136
Regulation der Mitochondrien-vermittelten Apoptose
Induktion der Apoptose über Mitochondrien
Verschiedene zelluläre Stress-Situationen können zu einer Veränderung der
Permeabilität der äußeren Mitochondrien-Membran führen. Dadurch wird
Cytochrom c aus dem Intermembranraum ins Cytosol freigesetzt, das
gemeinsam mit Apaf-1 (Apoptosis Protease Activating Factor 1) an
Procaspase 9 bindet und dessen autokatalytische Aktivierung induziert.
Caspase 9 führt dann zur Aktivierung von Effektor-Caspasen, wie Caspase 3.
Parallel dazu bricht die mitochondriale Atmungskette
zusammen und das mitochondriale Membranpotential
bcl-xL
ATP
Bcl-2 und Bcl-xL wirken anti-apoptotisch; Bax, Bcl-XS oder Bad pro-apototisch
Bcl-2
P
Bad
14-3-3: bindet an PhosphoSerinreste von Bad und hält es im
Cytosol
Dephosphorylierung von Bad > Bindung an Bcl-2 und Inaktivierung
von Bcl-2
Procaspase 9
Apaf1
Mitglieder der Bcl-2 Protein-Familie können pro- oder anti-apoptotisch wirken. Es
wird vermutet, dass sie durch Di- oder Oligomerisierung Poren bilden können und
durch Heterodimerisierung sich gegenseitig regulieren können.
Caspase 9
Caspase 3
Diablo/Smac: binden und inaktivieren Caspase-Inhibitoren
Bax
Caspase-Inhibitoren
(IAP´s inhibitors of apoptosis)
Cytochrom c
Cytochrom C/Apaf1
Caspase 9 Aktivierung
„permeability transition pore“
137
138
Regulation der Apoptose II
Abwesenheit von Überlebensfaktoren
ApoptoseInduktion
über DNASchäden
und p53
Anwesenheit von Überlebensfaktoren
trophischer Faktor
NGF
Rezeptor
Procaspase3
Caspase 3
PI-3 Kinase
14-3-3
Caspase 9
Akt
Bad
Cytochrom c
139
Ionen
140
Induktion der Apoptose durch Rezeptoren an der
Zelloberfläche und Vernetzung mit dem
mitochondrialen Weg
TNFα
TNFα
TNFR1
TNFR1
TNFR1
TNFR1
Balance zwischen Apoptose und Überlebenssignalen
FADD
FADD
TRADD
TRAF2
Procaspase 8
TNFR...
FADD...
TRADD ...
TRAF...
Tumor necrosis factor receptor
Fas associated death domain protein
TNFR associated death domain protein
TNFR associated factor
Überlebenssignale
Caspase 3, 6, 7
Apoptose
Bid
Apoptose
TNFR...
FADD...
TRADD ...
TRAF...
NEMO...
MEKK1...
NIK...
IKK...
IκB...
NF-κB...
prozessiertes Bid
geht an die MitochondrienMembran und induziert die
Freisetzung von
Cytochrom c
141
Induktion der Apoptose durch cytotoxische
T-Zellen
Fas
MHC Molekül
T-Zellrezeptor
FasL
cytotoxische T-Zelle
JNK
MEKK1
TNFR2
TRAF2
TRADD
TRAF2
Procaspase 8
Caspase 8
Caspase 8
TNFR2
MEKK1
TRAF1
NIK
NIK
PKC
P
P
IKK1 IKK2
TAK1/TAB1
PKR XIAP
TRAF6-med. ubiquitination
Caspase 3, 6, 7
NEMO
Caspase 3, 6, 7
Tumor necrosis factor receptor
Fas associated death domain protein
IκB P
ubiquitination
Abbau
TNFR associated death domain protein
in Proteasomen
TNFR associated factor
Caspase 3, 6, 7
NF-κB p50 p65
NF-κB essential modulator
MAPK/ERK kinase kinase 1
Caspase Inhibitoren (IAP´s)
NF-κB inducing kinase
anti-apoptotische Gene
IκB kinase
Transkription
Proliferationsfaktoren
Inhibitor of NF-κB
AP-1
p50
p65
Nuclear transcription factor κB
(Cycline)
142
Fas-mediierte
Apoptose
Zellen, die „entartet“ sind
(Tumorzellen oder Virusbefallene Zellen) werden durch
cytotoxische T-Zellen zur
Apoptose „gezwungen“ durch
Bindung des Fas-Liganden an
den Fas-Rezeptor in Verbindung
mit T-Zell-Rezeptor und einem
Molekül das fremdartige Antigene
präsentiert (MHC... major
histocompatibility complex)
T-Zellen werden in den Lymphknoten darauf geschult, normale Zellen
nicht anzugreifen. T-Zellen, die statt entarteter Zellen gesunde
Körperzellen erkennen würden, werden dort zur Apoptose gezwungen.
143
144
Cytotoxische T-Zellen haben auch andere Wege
um Zellen zur Apoptose zu zwingen
Sekretion von
Granzyme B und
Perforin führt zur
„Durchlöcherung“
der Zielzelle und
der Aktivierung
der Apoptosewege, indem
Granzyme B die
Procaspasen
spaltet und
aktiviert.
145
146
Signalübertragung über Botenstoffe
Themen der Vorlesung
1.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation
2.
3.
4.
5.
6.
147
Synthese des Botenstoffes: lipophile meist im Cytoplasma,
Peptidhormone und hydrophile Botenstoffe meist im ER
Freisetzung (Sekretion): lipophile durch Diffusion durch die
Cytoplasma-Membran, hydrophile durch sekretorische Granula
Transport zur Zielzelle: a) über den Blutkreislauf
b) durch Diffusion
Bindung an spezifische Rezeptoren: a) an der Zelloberfläche
b) intrazellulär (z.B. Transkriptionsfaktoren)
Aktivierung eines intrazellulären Signals: oft über Adapterproteine,
sekundäre Botenstoffe, Signalkaskaden
Ausschalten des Signals (und Entfernung des Botenstoffes):
a) Endozytose und Abbau von Rezeptor und/oder Ligand
b) Enzymatische Inaktivierung des Botenstoffs oder Deaktivierung von
Signalmolekülen (z.B. Dephosphorylierung, Spaltung von GTP bei GProteinen...)
148
Botenstoffe I: Hormone
Formen der Signalübertragung
•
•
endokrin: Der Signalstoff wird von
endokrinen Organen (z.B. Drüsen)
freigesetzt, die nicht direkt neben
den Zielzellen liegen (Übertragung
meist über den Blutkreislauf)
•
Blutgefäß
Progesteron
endokrine Drüse
sezernierende Zelle
autokrin: Der Signalstoff wirkt auf
die Zelle, die ihn sezerniert hat.
•
Retinsäure
Zielzellen
parakrin: Der Signalstoff wirkt auf
benachbarte Zellen (Übertragung
meist über Diffusion)
•
lipophile Hormone: z.B. Steroide wie Progesteron (durchdringen die Zellmembran
durch Diffusion und binden an intrazelluläre „Rezeptoren“ z.B.
Transkriptionsfaktoren)
benachbarte Zielzelle
•
hydrophile Peptid-Hormone: können nicht durch die Membran diffundieren und
binden an Zelloberflächen-Rezeptoren: z.B. Insulin, Glucagon, Wachstumsfaktoren:
werden oft aus einer inaktiven Proform gebildet
Zielorte auf der
gleichen Zelle
direkter Zellkontakt: Der
Signalstoff ist membrangebunden
und bindet an einen Rezeptor einer
anderen Zelle (z.B. immunologische
Synapse).
signalisierende Zelle
empfangende Zelle
149
150
Weitere Hormone
•
kleine hydrophile Hormone: z.B. Adrenalin, Serotonin, Histamin
Serotonin
(5-Hydroxytryptamin)
•
Überblick über Rezeptoren
•
Histamin
G-Protein gekoppelte Rezeptoren
(z.B. Adrenalin- oder SerotoninRezeptoren)
Rezeptor
G-Protein
lipophile Hormone mit zelloberflächen-Rezeptoren: z.B. Prostaglandine,
Thromboxane und Leukotriene.
151
•
Ionenkanalrezeptoren
(z.B. Acetylcholinrezeptor)
•
Tyrosin-Kinase gekoppelte Rezeptoren
(z.B. Interferon-Rezeptoren): aktivieren
intrazelluläre Tyrosin-Kinasen
•
Rezeptoren mit eigener Enzymaktivität:
z.B. Rezeptor-Tyrosinkinasen
152
GTPasen als „Schaltproteine“
Sekundäre Botenstoffe (Second Messenger)
1. trimere G-Proteine
werden meist intrazellulär gebildet oder freigesetzt, wenn bestimmte
Botenstoffe entsprechende Rezeptoren und Signalwege aktivieren.
Übertragen oder verstärken das Signal intrazellulär:
•
•
•
•
•
binden an G-Protein gekoppelte
Rezeptoren und übertragen das
Signal an Effektorproteine (z.B.
Adenylatzyklasen)
cAMP: cyclisches Adenosin-3‘,5‘ monophosphat
cGMP: cyclisches Guanosin-3‘,5‘ monophosphat
DAG: 1,2-Diacylglycerin
IP3: Inositol-1,4,5-triphosphat
Ca2+ ....
2. Kleine GTPasen (Ras-ähnlich)
6 Familien: Ras, Rho, Rab, Ran, ARF und RGK:
aktive Form: GTP-gebunden, inaktive: GDP
GEF: guanine nucleotide exchange factors:
tauschen GDP gegen GTP
GAP: GTPase Aktivierende Proteine
blau: α
cyan: β
grün: γ
gelb: GDP
153
Adapterproteine
154
Bindung von Botenstoffen an Rezeptormoleküle
... haben keine eigene Enzymaktivität, können
aber an Rezeptoren oder Signalenzyme (z.B.
Kinasen) binden und dadurch das Signal
weiterleiten oder regulieren.
folgt den normalen Gleichgewichtsgesetzen: R + H
(R ... Rezeptor, H... Hormon).
... haben meist Interaktionsdomänen: z.B.:
SH2-oder PTB-Domänen (binden an
phosphorylierte Tyrosinreste), SH3- und WWDomänen (binden an prolinreiche Sequenzen),
PH-Domänen binden an Phosphoinoside....
Meist ist die Hormonkonzentration im Blut im Bereich der Dissoziationskonstanten >
kleine Konzentrationsänderungen führen zu deutlichen Änderungen der
Rezeptorbindung.
RH
KD entspricht der Konzentration des Liganden bei Halbsättigung des Rezeptors.
Die Kombination von Adapterdomänen mit
Enzymaktivitäten (z.B. Kinasedomänen) bietet
eine sehr hohe Flexibilität der
Signalübertragung.
SH2-Domäne
von Grb-2
P-Tyrosin-Peptid
Prolin-reiche
Sequenz
SH3-Domäne
155
156
Signalübertragung über G-Proteine I
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR)
Ligand (z.B. Hormon)
GPCR
(Rezeptor)
Membranproteine mit 7 TransmembranRegionen. Liganden: meist kleine
hydrophile Botenstoffe (binden zwischen
den Helices). Intrazelluläre
Bindungspartner: trimere G-Proteine
(binden an C3, C2-Schleifen und CTerminus). Funktionen: GlucoseMetabolismus (durch Adrenalin etc.
geregelt), schnelle Signalübertragungen
(Muskelkontraktion, Herzfrequenz..
beta-subunit
alphasubunit
GDP bzw. GTP liegen in einer
„Tasche“ zwischen den
einzelnen Einheiten des
trimeren G-Proteins. Bindung
an den Rezeptor (GPCR)
induziert die Dissoziation von
GDP und die Bindung von
GTP (das in der Zelle in
höherer Konzentration
vorliegt). Diese Bindung
induziert eíne deutliche
Strukturänderung und die
Dissoziation der α-Kette von
Gβγ
GDP/GTP
157
158
Signalübertragung über G-Proteine III
Signalübertragung über G-Proteine II
Oft sind Effektorenzyme ebenso wie G-Protein gekoppelte Rezeptoren
Membranproteine mit mehreren Transmembranregionen. Da die GProteine selbst über Lipidketten in der Membran verankert sind, sind die
Diffusionsstrecken zwischen GPCR und dem Effektorenzym gering.
Gγ G
β
Gsα Effektor
enzym
Schematische Darstellung der Adenylatzyklase
1. Hormonbindung induziert
eine Konformationsänderung
des Rezeptors
2. G-Protein bindet über Gsα an
den Rezeptor
Durch die enzymatische Aktivität und die
Bildung vieler sekundärer Botenstoffe
(cAMP-Moleküle) kommt es zu einer
deutlichen Signalverstärkung
Es gibt stimulatorische und inhibitorische G-Protein (Gs und Gi)
5. das Hormon dissoziiert
vom Rezeptor, durch GTPHydrolyse löst sich Gsα vom
Effektorenzym und bindet
wieder an Gβγ
4. Gsα bindet an das
Effektorenzym
(Adenylatzyklase) und
aktiviert es (zur cAMPSynthese)
3. durch die Bindung an den
Rezeptor ändert sich die
Struktur des Gsα und GDP
wird durch GTP ersetzt, Gsα
dissoziiert von Gβγ ab.
159
160
Serin/Threonin-Kinasen (MAP-Kinasen)
Rezeptor-Tyrosinkinasen
... dimerisieren nach Bindung des
Liganden (z.B. einem
Wachstumshormon), wodurch es
zur gegenseitigen Phosphorylierung
von Tyrosinresten auf der
cytoplasmatischen Domäne kommt
und zur Bindung von
Adapterproteinen an die P-TyrReste über SH2-Domänen (Grb2 –
Sos). Dadurch werden weitere
Signalmoleküle aktiviert (GTPase
Ras) und das Signal wird an
weitere Signalwege weitergeleitet
(MAPK-Kaskade)
161
Effekte sekundärer Botenstoffe: cAMP
Verstärkung des Eingangssignals
durch eine Signalkaskade
ERK/MAPK-Weg
(Proliferation)
JNK-Weg
p38-Weg
(Stress Response)
RTK‘s
Grb2/Sos
GTPase
Ras
Rac/Cdc42
PAK‘s
MAPKKK
Raf
MEKK1-3
TAK1
MAPKK
MEK1
MEK2
MEK4
MEK7
MEK3
MEK5
MAPK
ERK1
ERK2
JNK/SAPK
p38
„Scaffold proteins“
(„Gerüst-Proteine“)
bringen die
verschiedenen
Kinasen in
räumliche Nähe
zueinander
162
Sekundäre Botenstoffe: Phosphatidylinosit-Derivate
Aktivierung cAMP-abhängiger Kinasen
(PKA, Protein Kinase A): im
Ruhezustand als Tetramer inaktiv
(2 regulatorische, 2 katalytische
Einheiten), Bindung von cAMP
(kooperativ) an die regulatorischen
Einheiten führt zur Dissoziation und
Aktivierung der katalytischen Einheiten
cytosol. Seite der
ZytoplasmaMembran
163
Membranständige PI-Kinasen bilden die PI-Derivate PIP und PIP2, Spaltung von
PIP2 durch das Signalenzym Phopholipase C (PLC) führt zur Bildung der second
messenger IP3 (Inositol 1,4,5-Triphosphat) und DAG (Diacylgyzerin)
164
Calcium/Calmodulin
Wirkung von IP3 auf den Calcium-Spiegel
Rekrutierung von PKC
an die Zellmembran
PLC kann durch HormonBindung an GPCR über
trimere G-Proteine aktiviert
werden. Dies führt zur
Freisetzung von IP3 ins
Cytosol und Bindung von
IP3 an Calciumkanäle des
ER, die dadurch geöffnet
werden. Das ausströmende
Calcium fördert wiederum
das Öffnen von
Calciumkanälen an der
Zelloberfläche
(Verstärkungseffekt). Die
Erhöhung der
intrazellulären CalciumKonzentration führt zur
Fixierung Ca-abhängiger
Proteinkinase C-Formen
(PKC) an die Zellmembran,
wo es durch DAG aktiviert
wird und Rezeptoren oder
andere Substrate 165
phosphoryliert.
NO (Stickstoffmonoxid) und cGMP
als sekundäre Botenstoffe
Calmodulin ist ein kleines Ca2+-bindendes
Protein (16.7 kD) mit 4 Bindungstellen für
Calcium. Wenn alle Bindungsstellen besetzt sind
nimmt es eine gestreckte helikale Konformation
ein, bei niedrigeren Konzentrationen oder
gebunden an andere Proteine, kann es eine
globuläre Form einnehmen.
Calmodulin bei
voller CalciumBeladung
Calmodulin
gebunden an
eine Peptidhelix
166
Signalübertragung von der Zellmembran in den
Zellkern: PKA/CREB-Weg
Acetylcholine führt in Endothelzellen über Ca/Calmodulin zur Bildung von NO
(aus Arginin). Dieses diffundiert zu benachbarten glatten Muskelzellen des
Blutgefäßes, wo es an der Membran eine Guanylatzyklase aktiviert. Der
Anstieg des cGMP in den Zellen führt zu einer Muskelrelaxation und
Erweiterung der Blutgefäße.
Guanylatzyklase: NO bindet an die
Hämgruppe und aktiviert das Enzym
167
... die katalytischen Einheiten der aktivierten PKA wandern in den Kern und
phosphorylieren, bzw. aktivieren den Transkriptionsfaktor CREB (cAMPresponsive element binding protein), der gemeinsam mit einem Kofaktor
(CBP, CREB binding protein) and Promoterelemente bindet (CRE, cAMP
responsive elements) und die Transkription bestimmter Gene induziert.
168
Signalübertragung von der Zellmembran in den
Zellkern II: RTK-Ras-MAPK-Weg
... aktivierte MAP-Kinasen wandern als Dimere in den Kern und aktivieren
dort durch Phosphorylierung verschiedene Transkriptionsfaktoren (Jun, Fos,
ATF-2, TCF, SRF...)
Signalübertragung von der Zellmembran in den
Zellkern III: NF-κB Signalweg
Phosphorylierung des Inhibitors IκB
über Signalkinasen führt zu dessen
Ubiquitinylierung und Abbau. Der
Transkriptionsfaktor NF-κB wird
dadurch freigesetzt und kann an
entsprechende Promoterregionen
binden
169
Themen der Vorlesung
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
170
Beispiele interzellulärer Kommunikation
Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus
Das Zytoskelett
Zellkontakte und Zelladhäsion
Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus)
Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose)
Mechanismen der Signaltransduktion
Interzelluläre Kommunikation und Nervenreizleitung
• Kommunikation über Zellverbindungen – z.B. in Epithelien
• Kommunikation über Adhäsionsmoleküle: z.B. Bindung von
Leukozyten an das Endothel und Transmigration
• Kommunikation über Rezeptoren – z.B. Immunologische Synapse
• Zell-Zell Interaktionen bei Entwicklungsvorgängen
• Kommunikation über Membranpotential-Änderungen oder
chemische Transmitter: Nervenreizleitung
171
172
Kommunikation über Zellverbindungen:
Ausbildung von Adhäsionsgürteln
Kommunikation über Zellverbindungen
(Gap Junctions)
Gegenseitige Berührung von Zellen im Verlauf von Proliferation und Wachstum induziert
bestimmte Signalwege, die zum Abschalten des Zellzyklus führen, sowie zur Ausbildung
spezifischer Zellverbindungen und bei bestimmten Zellen zur Polarisierung in apikale und
basolaterale Bereiche
Sekundäre Botenstoffe (second messenger) wie Ca2+
oder cAMP können über offene Zellverbindungen in
Nachbarzellen diffundieren und dort das zelluläre
Signal weiterleiten. Allerdings wird das Signal durch die
Verdünnung abgeschwächt und wirkt deshalb oft nur in
einem begrenzten Areal.
Video: adhesion junction
Video: Calcium-Signalübertragung
173
Komunikation über Adhäsionsmoleküle
Beispiel: Leukozytenbindung und Transmigration
P-Selectin auf der EndothelzellMembran, das durch die Aktivierung der
Endothelzellen (EC) exprimiert wurde,
bindet an Glykane an der Oberfläche
von Leukozyten und es kommt zur losen
Assoziation („leukocyte rolling“), die
Bindung wird durch PAF (platelet
activating factor – auf EC) und PAFRezeptor (auf den Leukozyten) verstärkt
und durch Interaktion von Integrinen
der Leukozyten mit ICAM-1 auf den EC
kommt es zur festen Bindung, sowie zur
Transmigration
174
Kommunikation durch Chemotaxis
Bakterielle Moleküle (wie z.B. bestimmte Peptide: formyl-Met-Leu-Phe)
wirken als chemische Lockstoffe für Leukozyten, binden an spezifische
Rezeptoren und induzieren eine gerichtete Zellbewegung (über
Lamellipodien und Aktinfilamente) in Richtung des chemischen
Gradienten.
Pipette mit Chemoattractant
neutrophiler Granulozyt
Bakterien
neutrophiler Granulozyt
Video: leukocyte rolling
Video: lymphocyte homing
175
Videos: neutrophil chemotaxis 1 and 2
176
Kommunikation über Rezeptoren
Beispiel: Immunologische Synapse
Mechanismen der Nervenreizleitung
Unterschiedliche Neuronen-Typen:
Bei der Immunantwort kommt es zur spezifischen Kommunikation zwischen
Antigen-präsentierenden Zellen (z.B. dendritischen Zellen) und Lymphozyten
(z.B. T-Zellen). Dabei wird das Antigen über den MHC-Komplex präsentiert und
vom T-Zellrezeptor erkannt, wobei andere Membranproteine wesentliche
akzessorische Rollen spielen. Der T-Zellklon, dessen Rezeptor das Antigen
erkennt wird aktiviert und zur klonalen Expansion stimuliert.
DC-SIGN
ICAM-1
dendritische
Zelle
MHC
CD83/CD86
LFA-1
a)
Multipolare Interneuronen
b)
Motorneuronen
c)
Sensorische Neuronen
ICAM-3
LFA-1
TCR
CD28
CD2
T-Zelle
177
Elektrische Signalübertragung
178
Arten von Neuronen-Ionenkanälen
Ein Nervenimpuls (Aktionspotential) entsteht durch eine kurze Depolarisation
der Zellmembran, gefolgt von einer Repolarisation auf das Ruhepotential.
Das Signal bewegt sich mit etwa 100 m/sec am Axon entlang. An dessen
Ende induziert es an der Verbindung zum nächsten Neuron (der Synapse)
entweder die Freisetzung von Neurotransmittern oder die Weiterleitung des
elektrischen Signals über gap junctions.
a) ruhende K+-Kanäle erzeugen das Ruhepotential, b) Spannungsgesteuerte Na+-Kanäle
leiten das Aktionspotential weiter, c) Neurotransmitter-gesteuerte Kanäle öffnen nach
Bindung des Transmitters, d) G-Protein gesteuerte Kanäle öffnen nach Aktivierung durch
trimere G-Proteine, die ihrerseits von Neurotransmitter-Rezeptoren aktiviert werden.
179
180
Die passive Ausbreitung der Depolarisation
hängt vom Durchmesser und der „Isolierung“
der Axone ab
Modell der Wirkungsweise
spannungsgesteuerter Na+-Kanäle
Aufgrund des K+-Flusses durch
die ruhenden K+-Kanäle nimmt
die Depolarisation mit
zunehmender Entfernung vom
Depolarisationsort ab. Diese
Abnahme ist geringer, wenn
das Axon durch vielschichtige
Myelinscheiden isoliert ist.
181
Bildung der isolierenden Myelinscheiden durch
Schwann´sche Zellen
182
Ranvier´sche Schnürringe unterbrechen die
isolierenden Myelinscheiden und leiten das
Aktionspotential weiter
Schwannsche Zellen wickeln ihre Cytoplasmamembran mehrmals um ein oder
mehrere Axone; das Cytoplasma wird zwischen den Membranen
herausgedrückt und die Membranschichten werden reißverschlussartig
miteinander verknüpft
Weiterleitung des Aktionspotentials sprunghaft von
einem Schnürring zum nächsten
183
184
Chemische Synapsen:
Übertragung durch Neurotransmitter
Elektrische Synapsen
Übertragung des elektrischen
Impulses von einem Axon zum
nächsten Neuron über
gap junctions
Neurotransmitter sind in sekretorischen Granula gespeichert, die von der
Depolarisation zur Fusion mit der Zytoplasma-Membran angeregt werden. Der
freigesetzte Neurotransmitter diffundiert durch den synaptischen Spalt zur
Zielzelle und induziert dort ein Aktionspotential (oder ein anderes Signal)
185
186
Zyklus der Neurotransmitter-Freisetzung
Die wichtigsten Neurotransmitter
187
188
Übertragung der Signale von Motorneuronen
auf Muskelzellen
die Ankunft eines Aktionspotentials am Ende
eines Motorneurons induziert die Öffnung
von Calcium-Kanälen (1) und dadurch die
Sekretion von Acetylcholin. Der freigesetzte
Transmitter induziert die Öffnung von
Acetylcholin-gesteuerten Na+-Kanälen (2)
und die resultierende lokale Depolarisation
induziert das Öffnen spannungsgesteuerter
Na+-Kanäle (3). Durch die nun verstärkte
Depolarisation öffnen sich
spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle des ER,
es kommt zur Freisetzung von Calcium aus
dem ER und zur Muskelkontraktion (durch
Verschiebung des Tropomyosins und
Freigabe der Aktin-Myosin-Bindungsstellen)
189