Text komplett 15zeilig Genehmigungsexemplar

Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
und dem
Landesbetrieb Hessisches Landeslabor
Abteilung II (Veterinärmedizin)
Molekularbiologische Typisierung von Streptococcus canis isoliert aus subklinisch
mastitiskranken Kühen in hessischen Milchviehbetrieben
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des
Grades eines
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
durch die Veterinärmedizinische Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von
Agnes Wescher
aus Mettmann
Leipzig, 2009
Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Dekan:
Prof. Dr. Arwid Daugschies
Betreuer:
Prof. Dr. Axel Sobiraj
Dr. Michael Zschöck
Gutachter:
Prof. Dr. Axel Sobiraj, Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik,
Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig
Dr. Michael Zschöck, Landesbetrieb des Hessischen Landeslabors,
Giessen
Prof. Dr. Christoph Lämmler, Institut für Pharmakologie und Toxikologie,
Justus-Liebig-Universität, Giessen
Doz. Dr. Peggy Braun, Institut für Lebensmittelhygiene,
Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig
Tag der Verteidigung: 27. Januar 2009
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ............................................................................................................................ 1
2
Literaturübersicht ............................................................................................................... 2
2.1
Taxonomische Stellung von Streptococcus canis ............................................................ 2
2.2
2.2.1
Morphologische und biochemische Eigenschaften ......................................................... 2
Mutmaßliche Pathogenitätsfaktoren von Streptokokken der serologischen Gruppe G .......3
2.3
2.3.1
Serologische Eigenschaften ............................................................................................... 5
Oberflächenantigene der G-Streptokokken..........................................................................5
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.4.4
Vorkommen und klinische Bedeutung von S. canis........................................................ 6
Vorkommen und Bedeutung von Streptococcus canis bei Hund und Katze .......................6
Vorkommen und Bedeutung von S. canis bei sonstigen Tieren und in Umweltproben ......8
Vorkommen und Bedeutung von S. canis beim Menschen .................................................8
Vorkommen und Bedeutung von S. canis beim Rind..........................................................9
2.5
S. canis als Mastitiserreger beim Rind........................................................................... 10
2.6
2.6.1
2.6.1.1
2.6.1.2
2.6.1.3
Die Mastitis des Rindes.................................................................................................... 16
Mastitiserreger ...................................................................................................................18
Kontagiöse Mastitiserreger ................................................................................................ 19
Umweltassoziierte Mastitiserreger..................................................................................... 22
Minor pathogene Bakterien................................................................................................ 27
3
Material und Methoden .................................................................................................... 29
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.3.1
3.1.3.2
3.1.3.3
Untersuchungsmaterial ................................................................................................... 29
Milcherzeugerbetriebe .......................................................................................................31
Probennahme......................................................................................................................31
Laboruntersuchung ............................................................................................................32
Zellzahlbestimmung........................................................................................................... 32
Kulturell-bakteriologische Untersuchung .......................................................................... 32
Differenzierung S. canis-verdächtiger Isolate.................................................................... 33
3.2
Anzüchtungsmedien und Kultivierung .......................................................................... 33
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.2.1
3.3.2.2
3.3.2.3
3.3.2.4
3.3.3
3.3.4
3.3.4.1
3.3.4.1.1
3.3.4.1.2
3.3.4.1.3
3.3.4.2
3.3.4.2.1.
3.3.4.2.2.
3.3.4.2.3.
Identifizierung .................................................................................................................. 34
Kulturmorphologie und Hämolyseformen .........................................................................34
Biochemische Eigenschaften .............................................................................................35
Abbau von Kohlenhydraten ............................................................................................... 35
Enzymnachweis mit 2-Naphtyl-konjugierten Substraten .................................................. 35
Hydrolyse von Natrium-Hippurat ...................................................................................... 36
Spaltung von Arginin ......................................................................................................... 36
Bestimmung der Lancefield-Gruppe..................................................................................36
Molekulare Identifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ............................36
Analyse des t-RNA-Gens................................................................................................... 36
Aufbereitung der bakteriellen DNA................................................................................... 37
DNA-Replikation durch die PCR ...................................................................................... 38
Elektrophorese ................................................................................................................... 38
Analyse des 16S rRNA-Gens............................................................................................. 39
Aufbereitung der bakteriellen DNA................................................................................... 39
DNA-Replikation durch die PCR ...................................................................................... 40
Elektrophorese ................................................................................................................... 41
3.4
3.4.1
3.4.1.1
3.4.1.2
3.4.2
3.4.2.1
3.4.2.2
3.4.2.3
Erstellung eines „DNA-Fingerprints“ ............................................................................42
Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-Gel-Elektrophorese ....................................... 45
Präparation und Restriktionsverdau der Gesamtzell-DNA ................................................45
Pulsfeld-Gel-Elektrophorese ..............................................................................................48
Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR .................................................. 48
Aufbereitung der DNA.......................................................................................................48
DNA-Replikation mittels PCR...........................................................................................49
Elektrophorese....................................................................................................................50
3.5
Beurteilung der Verwandtschaftsbeziehung einzelner Stämme ..................................50
3.6
Bestimmung der Differenzierungsfähigkeit...................................................................50
4
Ergebnisse..........................................................................................................................51
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
Identifizierung der Streptokokkenkulturen ..................................................................51
Kulturmorphologisches Verhalten .................................................................................... 51
Lancefield-Gruppen-Bestimmung..................................................................................... 52
Biochemische Eigenschaften ............................................................................................ 52
Spezies-Identifizierung mittels t-DNA-PCR..................................................................... 55
Spezies-Identifizierung mittels 16S-PCR ......................................................................... 56
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
Phäno- und genotypische Intra-Spezies-Charakterisierung ........................................57
Intra-Spezies-Biotypisierung durch biochemische Reaktionen ........................................ 57
Intra-Spezies-Differenzierung mittels Randomly Amplified Polymorphic DNA
Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) ....................................................................... 58
Makro-Restriktionsanalyse und Pulsfeld-Gelelektrophorese............................................ 59
4.3
Differenzierungsfähigkeit der verschiedenen Typisierungs-Methoden ......................63
4.4
4.4.1
Beurteilung der Verwandtschaftsgrade der untersuchten Stämme............................63
Grad der Verwandtschaft der untersuchten Stämme, die zum gleichen Zeitpunkt aus
einem Betrieb entnommen wurden ................................................................................... 64
Grad der Verwandtschaft der untersuchten Stämme aus verschiedenen Betrieben .......... 64
Grad der Verwandtschaft von Stämmen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus
demselben Betrieb entnommen wurden ............................................................................ 67
Verwandtschaftsgrad der Stämme in Bezug auf die geografische
Verteilung der Betriebe ..................................................................................................... 68
4.4.2
4.4.3
4.4.4
5
Diskussion..........................................................................................................................70
5.1
Prävalenz von S. canis......................................................................................................70
5.2
Morphologie von S. canis.................................................................................................71
5.3
Biochemische Reaktionen von S. canis...........................................................................72
5.4.
Serologische Reaktionen von S. canis.............................................................................74
5.5.
Molekularbiologische Untersuchungsmethoden ...........................................................75
5.6.
Epidemiologie von S. canis ..............................................................................................77
6
Zusammenfassung ............................................................................................................82
7
Summary............................................................................................................................84
8
Literaturverzeichnis ..........................................................................................................86
Abkürzungsverzeichnis
°C
µg
µl
Aqua bidest.
Aqua dest.
Bp
BSA
bzw.
ca.
CHEF
DNA
dNTP
DVG
EDTA
EGD
et al.
g
h
HCl
Ig
kb
KNS
LHL
mA
mg
MgCl
min
ml
mm
mmol
NaCl
nm
PCR
PFGE
RAPD-PCR
S.
SB
sec
TAE
TBE
TE
THB
TRIS
U/µl
U/min
UV
V
V/cm
Grad Celsius
Mikrogramm
Mikroliter
Aqua bidestillata
Aqua destillata
Basenpaare
bovines Serumalbumin
beziehungsweise
zirka
Contour Clamp Homogenous Field
Desoxyribonucleinsäure
Desoxyribonukleosidtriphosphate
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft
Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure
Eutergesundheitsdienst
et alii (und weitere)
Gramm
Stunde
Salzsäure
Immunglobulin
Kilobasen
Koagulase-negative Streptokokken
Landesbetrieb Hessisches Landeslabor
Milliampere
Milligramm
Magnesiumchlorid
Minute
Milliliter
Millimeter
Millimol
Natriumchlorid
Nanometer
Polymerase ChainReaction (Polymnerase-Kettenreaktion)
Pulsfeld-Gel-Elektrophorese
Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR
Streptokokkus, Staphylokokkus
Serumbuillon
Sekunde
Tris-Acetat
TRIS-Borat-EDTA
TRIS-EDTA
Todd-Hewitt-Broth
Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan
Units pro Mikroliter
Umdrehung pro Minute
ultraviolett
Volt
Volt pro Zentimeter
Für Jinny
1
1
Einleitung
Die subklinische Mastitis des Rindes zählt zu den wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen
in Milchkuhbetrieben (DVG 1994). Als klassische Faktorenkrankheit sind an der
Krankheitsentstehung neben tierindividuellen Faktoren sowie zahlreichen Umweltfaktoren wie
Fütterung, Haltung und Milchentzug auch Mastitiserreger beteiligt (PHILPOT und PANKEY
1975). Aufgrund der Epidemiologie unterschiedlicher Erreger subklinischer Mastitiden lassen
sich kontagiöse und konstitutionelle Mastitiserreger unterscheiden. Diese auf
epidemiologischen Befunden beruhende Einteilung ist wiederum Grundlage für das
einzusetzende Sanierungsverfahren. Klinische Erfahrungen bei der Sanierung durch
Streptococcus (S.) canis hervorgerufener subklinischer Rindermastitiden in Verbindung mit
zytobakteriologischen Befunden lassen vermuten, dass S. canis als kontagiöser Mastitiserreger
eingestuft werden muss (WATTS et al. 1984).
Unter Verwendung moderner Verfahren soll in der vorliegenden Arbeit geklärt werden,
inwieweit sich diese bisherige, ausschließlich auf kulturell-bakteriologischen und klinischen
Kriterien beruhende Einteilung auch mittels moderner molekularbiologischer Verfahren, wie
dem Makrorestriktionsverdau der Bakterien-DNA und anschließender PulsfeldGelelektrophorese (PFGE) bzw. mittels Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR
bestätigen lässt.
2
2
Literaturübersicht
2.1 Taxonomische Stellung von Streptococcus canis
Die Familie der Streptokokken mit der Gattung Streptococcus lässt sich in zahlreiche Arten
unterteilen, wobei einige als Krankheitserreger bei Mensch und Tier von Bedeutung sind. Die
traditionelle Einteilung erfolgt nach der von LANCEFIELD (1933) entwickelten serologischen
Eingruppierung auf der Grundlage von Polysaccharidantigen auf der Streptokokkenoberfläche.
Streptokokken der Serogruppe G wurden erstmalig von LANCEFIELD und HARE (1935)
beschrieben.
Eine weitere Unterteilung in Subtypen wurde von VASENIUS und NURMI (1963) aufgrund
serologischer und biochemischer Charakteristika sowie des CAMP-Phänomens vorgenommen.
Ebenso benutzten KRANTZ und DUNNE (1965) Hämolyse und Fermentation von
Kohlenhydraten zur weiteren Differenzierung von Streptokokken, wobei sie große ReaktionsUnterschiede innerhalb der gleichen serologischen Gruppe feststellten.
Vom Tier isolierte Streptokokken der serologischen Gruppe G werden innerhalb der Spezies S.
canis zusammengefasst (DEVRIESE et al. 1986). G-Streptokokken-Isolate des Menschen
werden hingegen innerhalb der Spezies Streptococcus dysgalactiae geführt, wobei hier neben S.
dysgalactiae Serogruppe G noch S. dysgalactiae Serogruppe L und S. dysgalactiae Serogruppe
C unterschieden werden können.
Eine taxonomische Zuordnung beider Spezies zu den Pyogen-Streptokokken innerhalb der
Gattung Streptococcus findet sich bei SCHLEIFER und KILPPER-BÄLZ (1987) sowie
BENTLEY et al. (1991).
Des weiteren wurden vielfach Änderungen der Nomenklatur aufgrund molekular-biologischer
Untersuchungen vorgenommen.
FARROW und COLLINS (1984) benutzten die DNA-DNA-Hybridisierung und schlugen vor,
Streptokokken der Lancefield-Gruppe G zusammen mit Streptokokken der Gruppe C und L
sowie S. dysgalactiae und Streptococcus equisimilis zu einer eigenen Spezies
zusammenzufassen.
2.2 Morphologische und biochemische Eigenschaften
Bei S. canis handelt es sich um ein grampositives, rundes oder ovoides Kugelbakterium, das
nach seiner Teilung in Paaren oder unterschiedlich langen Ketten gelagert ist. Der Durchmesser
3
wird mit 0,6-1,2µm angegeben.
Der Erreger lässt sich sowohl in flüssigen als auch in festen Nährmedien anzüchten. In
Flüssigmedien wächst S. canis unter Bildung eines flockigen Bodensatzes bei ansonsten klarem
Überstand unter Ausbildung mikroskopisch nachweisbarer typischer Ketten.
Auf festen Nährmedien beobachten DEIBEL und SEELEY (1974) bei S. canis zwei
Kolonieformen. Neben relativ großen Kolonien bilden sich auch kleine, sogenannte „minuteKolonien“.
Auf bluthaltigen Nährböden kommt es zur Ausbildung einer vollständigen (ß-) Hämolysezone.
S. canis wächst fakultativ anaerob. Durch Bebrütung in einer CO2-angereicherten Atmosphäre
(5-10%) lässt sich die Wachstumsintensität erhöhen. Der Stoffwechsel ist fermentativ, wobei
als hauptsächliches Endprodukt des Glukosestoffwechsels rechtsdrehende Milchsäure entsteht.
Das Temperaturoptimum liegt bei 37°C, wobei Wachstum prinzipiell zwischen 19°C und 45°C
möglich ist.
S. canis unterscheidet sich im Hinblick auf die biochemischen Eigenschaften von S.
dysgalactiae Serogruppe G unter anderem durch Fehlen der Hyaluronidase- und Fibrinolysinaktivität sowie durch eine positive α- und ß-Galactosidaseaktivität, außerdem fehlt das Enzym
Glucuronidase und die Fähigkeit, den Zucker Trehalose zu spalten.
2.2.1
Mutmaßliche Pathogenitätsfaktoren von Streptokokken der serologischen Gruppe G
Das Enzym DNAse spaltet Phosphoresterverbindungen zwischen den Nukleotid-Gruppen der
DNA. Gleichzeitig stimuliert es die Bildung spezifischer Antikörper. Die von GUDDING
(1979) bei einer G-Streptokokkenkultur nachgewiesene DNAse stammte von einem für Hunde
pathogenen Stamm. Sie zeigte eine Kreuzreaktion mit DNAse von Streptokokken der
Lancefield-Gruppe A und hatte bei pH 5,4 ihren isoelektrischen Punkt. CLARK et al. (1984)
gelang es, bei allen von ihnen untersuchten vom Rind stammenden G-Streptokokken DNAse
nachzuweisen.
Bei der gleichen Untersuchung konnten sie keine Streptokinase in den vom Rind untersuchten
Proben nachweisen, was durch Untersuchungen von DEVRIESE et al. (1986) bestätigt wurde.
Streptokinase wandelt nach Komplexbildung mit einem Plasminaktivator Plasminogen zu
fibrinolytisch wirkendem Plasmin um.
Das Enzym Hyaluronidase spaltet die als Kittsubstanz zwischen den Zellen der Bindegewebe
vorkommende Hyaluronsäure. Dadurch kann sie eine stärkere Ausbreitung des Erregers im
Gewebe ermöglichen. Auch die Hyaluronidase provoziert die Bildung spezifischer Antikörper,
4
wobei sich die antigenen Eigenschaften von Hyaluronidasen der Lancefield-Gruppen C und G
als identisch erwiesen haben (WENNER et al. 1951).
Die extrazellulär auftretenden Streptolysine haben eine zellschädigende Wirkung, insbesondere
bei Erythrozyten führen sie zur Hämolyse (ALOUF 1980). Streptokokken bilden die
unterschiedlichen Streptolysine O und S. Im Gegensatz zum Menschen, wo Streptolysin O die
Bildung neutralisierender Antikörper bewirkt, die im Serum nachweisbar sind (TARANTA et
al. 1960), haben vergleichbare Untersuchungen beim Tier bisher keine Aussagekraft
(LÄMMLER und HAHN 1994). Streptolysin S zerstört die osmotische Barriere der
Zellmembran ohne nachweisbare Läsionen (WANNAMAKER und SCHLIEVERT 1988) und
ist nicht antigen wirksam (ALOUF 1980).
Bakteriozine, wie z.B. antibiotisch wirksame Substanzen, Stoffwechselprodukte oder lytische
Enzyme der Bakterien, hemmen das Wachstum anderer Bakterien (TAGG et al. 1976). Bei GStreptokokken waren nach Untersuchungen von TAGG und WONG (1983) nur bei Isolaten
vom Menschen bakteriozinähnliche, trypsinempfindliche Substanzen mit einem
Molekulargewicht von ca. 18000 Dalton nachweisbar.
Einige Bakterien, wie z.B. Staphylococcus aureus (S. aureus), sind in der Lage, über Proteine
Immunglobulin G (IgG) an dessen Fc-Stück zu binden. IgG-Fc-Rezeptoren von beim Rind
isolierten Streptokokken der Lancefield-Gruppe G zeigten jedoch keine Bindung der beiden
IgG-Subklassen (IgG1 und IgG2) des Rindes und wurden als Rezeptortyp IV bezeichnet
(LÄMMLER et al. 1988).
MYHRE und KRONVALL (1980) wiesen unter anderem Bindungsstellen für Serumalbumin
bei Streptokokken der Lancefield-Gruppe G nach. Bei Streptokokken der serologischen
Gruppen A, C und G konnten aufgrund der unterschiedlichen Bindungsaktivitäten für
Albuminpräparationen verschiedener Tierarten verschiedene Rezeptortypen unterschieden
werden. Rinderpathogene Streptokokken der serologischen Gruppen G und C besaßen den
Rezeptortyp b bzw. c (WIEDEBÄCK und KRONVALL 1982, WIEDEBÄCK et al. 1983). Bei
bovinen Streptokokken der Gruppe G isolierten WIEDEBÄCK und KRONVALL (1987) einen
Albuminrezeptor mit einem Molekulatgewicht von 30000 Dalton. LÄMMLER et al. (1988)
isolierten einen Albuminrezeptor mit 51000 Dalton bei einer Streptokokkenkultur vom Hund,
dies gelang jedoch nicht bei einer Kultur vom Rind.
Untersuchungen von WHITNACK und BEACHY (1982 1983) zeigen, dass an Bakterien
gebundenes Fibrinogen diese maskieren und dadurch den Kontakt mit polymorphkernigen
Leukozyten blockieren und damit eine Phagozytose verhindern kann. Dies könnte einen
5
wichtigen Pathogenitätsfaktor darstellen. Dabei ist die Fähigkeit, Fibrinogen zu binden,
unterschiedlich stark ausgeprägt. Streptokokken der Lancefield-Gruppe G besaßen bei
Untersuchungen von LÄMMLER et al. (1983) und REUTERSWÄRD et al. (1985) zwar
deutliche Bindungsaktivitäten für humanes Fibrinogen, aber nur schwache bis mäßige
Bindungsaktivitäten für das Fibrinogen von Rind, Schaf und Pferd. Die Bedeutung dieses
Pathogenitätsmechanismus für G-Streptokokken vom Rind ist somit zweifelhaft.
Plasminogen, die inaktive Form des Plasmins, welches als Hauptvermittler der Fibrinolyse von
Bedeutung ist, kann von Streptokokken der serologischen Gruppen A, C und G ebenfalls
gebunden werden (ULLBERG et al. 1989 und 1992). Bei den Untersuchungen von ULLBERG
et al. (1992) fanden sich keine signifikanten Unterschiede bei der Plasminogen-Bindung von
bei Menschen und bei Rindern isolierten G-Streptokokken.
2.3 Serologische Eigenschaften
2.3.1
Oberflächenantigene der G-Streptokokken
S. canis und S. dysgalactiae der Serogruppe G besitzen beide das Gruppenpolysaccharidantigen G, das hauptsächlich aus Rhamnose, Galactose und N-Acetylgalactosamin mit
L-Rhamnose als determinierender Gruppe besteht (PRITCHARD et al. 1988).
Das Proteinantigen X ist ein Typenantigen. Es erwies sich als einerseits pepsinempfindlich,
andererseits aber zu einem gewissen Anteil trypsinresistent. Es ist bei Streptokokken der
Gruppen B, G und L identisch (LÄMMLER et al. 1987).
Im Tierversuch zeigten Antikörper gegen das gereinigte Proteinantigen X eine Schutzwirkung
gegenüber Infektionen mit Streptokokken der Lancefield-Gruppe B. Immunisierte Kühe zeigten
nach experimenteller Infektion einen vergleichsweise schnelleren Zellzahlanstieg in der Milch
als nicht immunisierte Tiere. Die Milch der immunisierten Kühe zeigte in vitro eine erhöhte
bakterizide Aktivität gegenüber Kulturen mit dem Proteinantigen X (RAINARD et al. 1991A).
Das Proteinantigen R verhält sich ebenfalls gegenüber Trypsin resistent und gegenüber Pepsin
empfindlich. Nach den Ergebnissen zahlreicher Untersuchungen ist es bei Streptokokken der
Gruppen B, C, G und L identisch (LANCEFIELD und PERLMANN 1952, PERCH und
OLSEN 1964, WIBABWAN und LÄMMLER 1990a).
Dem T-Protein konnte bisher keine Bedeutung als Pathogenitätsfaktor nachgewiesen werden.
Nach Untersuchungen von HAHN (1980) kann es auf der Oberfläche von Streptokokken der
serologischen Gruppen A, B, C und G nachgewiesen werden.
6
Das T-Protein zeigt hitze- und säurelabile Eigenschaften, ist aber gleichzeitig trypsinresistent.
Es wirkt immunogen und lässt beim Tier, im Gegensatz zu den G-Streptokokken humaner
Herkunft, keine weitere Typisierung zu.
2.4 Vorkommen und klinische Bedeutung von S. canis
S. canis kann bei Infektionen des Hundes, der Katze und bei Mastitiden des Rindes
nachgewiesen werden. Darüber hinaus gelang die Isolierung bei einer Reihe weiterer
Tierarten - teils auch als Zufallsbefund - sowie in Umweltproben.
2.4.1
Vorkommen und Bedeutung von Streptococcus canis bei Hund und Katze
Streptokokken der serologischen Gruppe G (S. canis) gelten als bedeutsame Krankheitserreger,
besonders beim Hund (LAUGHTON 1948), aber auch bei der Katze (TILLMAN et al. 1982).
STAFSETH et al. (1937) untersuchten insgesamt 44 pathogene Bakterienstämme
unterschiedlichen Ursprungs. 26 Stämme stammten von gesunden oder erkrankten erwachsenen
Hunden, 18 Stämme von toten oder moribunden Welpen. Dabei wurden Isolate aus der Vagina
(14), der Leber (1), aus dem Kniegelenk (1), aus Eiter (1) und aus dem Präputium (1)
verwendet. Drei Isolate stammten von an Septikämie verstorbenen Welpen, zwei von
Dobermännern mit Polyarthritis.
Bei weiblichen Tieren waren 68% dieser Stämme β-hämolysierend, bei den Welpen 39%.
Insgesamt fanden die Genannten 22 ß-hämolysierende Stämme, von denen 14 zu einer Spezies
zu gehören schienen oder sehr eng verwandte Spezies oder Varianten sein mussten.
Dabei benennen STAFSETH et al. (1937) zum ersten Mal die isolierten Streptokokken als S.
canis, obwohl es sich nach Untersuchungen, die auf ihre Anfrage von EDWARDS (pers.
Mitteilung an STAFSETH) unternommen wurden, um serologisch zur Gruppe C gehörige
Stämme handelt (STAFSETH et al. 1937).
THAL und MOBERG (1953) untersuchten 518 β-hämolysierende Streptokokken-Stämme auf
ihre biologischen Eigenschaften. Ihre Untersuchungen auf Zugehörigkeit zu den verschiedenen
Lancefield-Gruppen zeigten, dass 27 der 45 von Hunden stammenden Stämme zur
serologischen Gruppe G gehörten. Die Isolate stammten aus Septikämien (3),
Lungenentzündungen (14), Blasenentzündungen (3) sowie von Organen, an denen keine
Entzündungsanzeichen festgestellt werden konnten (7).
Von den 34935 untersuchten Streptokokken-Stämmen der Streptokokkenzentrale der
7
Bundesanstalt für Milchforschung stammten 504 (1,4%) vom Hund. 212 (42,1%) dieser
Stämme ließen sich der Gruppe G zuordnen. HAHN und TOLLE (1979) vermuten, dass das
relativ hohe Vorkommen der G-Streptokokken beim Hund durch die enge Verbindung zum
Menschen entsteht.
BIBERSTEIN et al. (1980) untersuchten Isolate von klinischen Infektionen beim Hund und
fanden bei 254 untersuchten Stämmen 206mal G-Streptokokken (81,1%). Die Isolate stammten
von der Haut (43,2%), aus dem Urogenitaltrakt (28,64%), dem Respirationstrakt (11,17%), dem
Skelettsystem (6,3%) und aus serösen Höhlen (3,4%). 7,28% der untersuchten Feldstämme
waren nicht genauer definierten Ursprungs. 154 dieser Stämme entsprachen in ihren
biologischen Eigenschaften den von STAFSETH et al. (1937) als S. canis charakterisierten
Streptokokken.
Auch LING und RUBY (1978) wiesen G-Streptokokken in Präputium und Urethra bei
gesunden Rüden (15%) und in Vaginaltupfern kastrierter (45%) und nicht kastrierter (35%)
Hündinnen nach.
Bei Untersuchungen von VIEIRA und CASTRO (1994) gehörten 86% der von Hunden
isolierten β-hämolysierenden Streptokokken zur serologischen Gruppe G; bezogen auf Isolate
aus dem Urogenitaltrakt waren es sogar 93%. G-Streptokokken konnten außerdem auf der Haut,
im Rachen und im äußeren Gehörgang nachgewiesen werden.
Ebenso fand BORNAND (1992) bei 5% der bakteriologisch untersuchten Fälle von Otitis
externa beim Hund G-Streptokokken.
In Anal- und Tonsillentupferproben gesunder Hunde war S. canis zusammen mit Streptococcus
suis der am häufigsten isolierte Erreger (DEVRIESE und DEPELSMAECKER 1987,
DEVRIESE et al. 1992). In 3% von 661 Kotproben fand WEISSER (1981) β-hämolysierende
Streptokokken, die hauptsächlich der Lancefield-Gruppe G angehörten. Die von DEVRIESE et
al. (1986) untersuchten Stämme stammten von Wundexsudaten und in zwei Fällen von
neonataler Septikämie.
THAL und MOBERG (1953) fanden bei der schon erwähnten Untersuchung sechs Stämme
β-hämolysierender Streptokokken bei Katzen, von denen fünf der Lancefield-Gruppe G
zuzuordnen waren. Ein Isolat stammte aus einer Sepsis, die anderen von Pneumonien.
TILLMAN et al. (1982) wiesen in einer geschlossenen Katzenpopulation bei 13 von 68 Tieren
S. canis nach. Elf der Tiere litten an Fieber, Lymphadenitis, Pharyngitis und submandibulären
Ödemen, während zwei Tiere symptomlos blieben.
1991 isolierten REITMEYER et al. G-Streptokokken sowohl aus Rachentupfern (15) als auch
8
aus Vaginalabstrichen einiger gesunder Katzen (16). Ebenso isolierten DEVRIESE et al. (1992)
G-Streptokokken aus Tonsillen- und Analtupfern gesunder Katzen.
2.4.2
Vorkommen und Bedeutung von S. canis bei sonstigen Tieren und in Umweltproben
BEERWERTH und KÖSER (1965) wiesen in 104 Bodenproben von Rinderweiden elf Stämme
von Streptokokken der Gruppe G nach. Sie kommen bei ihren Untersuchungen zu dem Schluss,
dass es sich bei den von ihnen untersuchten CAMP-positiven, nicht zur Lancefield-Gruppe B
gehörenden Streptokokken um ubiquitär vorkommende Erreger handelt. G-Streptokokken sind
dabei mit 2,2% die zweitgrößte Gruppe der außerhalb des Rindereuters nachweisbaren Erreger.
Auch VASENIUS und NURMI (1963) wiesen innerhalb von zwei Jahren bei der Untersuchung
von 765 Isolaten β-hämolysierender Streptokokken 58 Stämme der Lancefield-Gruppe G nach.
18 Stämme stammten von Hunden, zwei von Katzen und einer vom Dachs. Die übrigen 37
Proben wurden von Rindern isoliert.
HWANG et al. (2002) isolierten S. canis bei einer purulenten Myocarditis eines Skunks.
JEPSON et al. (2000) untersuchten 197 gestrandete Tümmler. Bei 35 Delphinen fanden sie
purulente Bronchopneumonien, die in sieben Fällen auf eine Infektion durch S. canis
zurückzuführen waren.
2.4.3
Vorkommen und Bedeutung von S. canis beim Menschen
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass S. canis als Infektionsursache beim Menschen
extrem selten vorkommt.
KHAN et al. (1975) berichten von einer Peritonitis durch S. canis bei einem zwei Jahre alten
Mädchen. Als Infektionsquelle wurde Hundeurin angenommen. Allerdings wurden die Erreger
im Hundeurin und aus der Peritonitis nicht bis auf Spezies-Ebene identifiziert, so dass eine
sichere Zuordnung zur Spezies S. canis nicht möglich war.
Zwei weitere Fälle wurden von APPELBAUM et al. (1980) berichtet. Sie beobachteten eine
neonatale Septikämie durch S. canis in Verbindung mit einem vorübergehenden neonatalen
Hyperthyreoidismus. Bei einem zweiten Fall einer durch S. canis ausgelösten neonatalen
Septikämie war auch die Mutter an einer Septikämie und Endometritis erkrankt.
In einem Fall, der von TAKEDA et al. (2001) berichtet wird, konnten die Autoren durch
Makrorestriktion und PFGE nachweisen, dass eine Wundinfektion nach Hundebissverletzung
durch S. canis ausgelöst wurde.
9
BERT und LAMBERT-ZECHOWSKI (1997) beschreiben den Fall eines 77-jährigen Mannes,
der mit einer Septikämie vorgestellt wurde. In zwei separat untersuchten Blutproben wurden GStreptokokken isoliert, die aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften und der Ergebnisse der
DNA-Makrorestriktionsanalyse zweifelsfrei als S. canis identifiziert wurden. Eintrittspforte der
Infektion waren offene Geschwüre an den Beinen des Hundebesitzers, so dass hier der Hund als
Reservoir vermutet wird.
Zwei weitere Fälle des Nachweises von S. canis beim Menschen wurden von WHATMORE et
al. (2001) berichtet. Bei einem 76-jährigen Mann wurde in zwei verschiedenen Blutproben S.
canis isoliert. Ein weiteres Isolat stammte aus dem Wundexsudat einer 50-jährigen Frau. Die S.
canis-Isolate waren Zufallsbefunde einer größeren Untersuchung von humanen GStreptokokken in Verbindung mit Infektionen beim Menschen. Die Autoren schließen, dass sie
möglicherweise als Infektionsursache beim Menschen häufiger vorkommen als bisher
angenommen, weil die Identifizierung meistens auf der Ebene der Lancefield-Gruppierung
abgeschlossen wird, eine weitere Differenzierung nicht erfolgt und eine Unterscheidung von GStreptokokken humanen und tierischen Ursprungs durch das Co-Agglutinationsverfahren nach
Lancefield nicht möglich ist.
2.4.4
Vorkommen und Bedeutung von S. canis beim Rind
G-Streptokokken kommen beim Rind vorwiegend in Zusammenhang mit Mastitiden vor.
Allerdings fanden KRANTZ und DUNNE (1965) unter 369 Streptokokken-Stämmen vom
Rind, die in einem Zeitraum von drei Jahren im Pennsylvania State University Animal
Diagnostic Laboratory gesammelt worden waren, nur sieben Stämme von Streptokokken der
Lancefield-Gruppe G. Sie stammten alle aus Proben des Genitaltraktes mit dem Vorbericht
„Infertilität“.
BEERWERTH und KÖSER (1965) untersuchten unter anderem das Vorkommen von
Streptokokken außerhalb des Rindereuters und fanden G-Streptokokken bei Rindern in Nieren
und Milz (0,39%), Sperma- und Präputialspülproben (2,00%), Kotproben (0,20%), Tonsillen
(2,79%) und in Tupferproben aus dem Kopfbereich (3,98%), von der Euterhaut (5,11%), vom
Schwanz (6,25%) und von der Haut von Mastbullen (0,97%). 2,2% der in der Umgebung des
Euters gefundenen Streptokokken waren der Gruppe G zuzuordnen. Die Autoren schließen
daraus, dass es sich um einen ubiquitären Keim handelt, was es fast unmöglich mache, eine
Infektion zu verhindern.
10
2.5 S. canis als Mastitiserreger beim Rind
Untersuchungen, die sich mit der Ursache klinischer oder subklinischer Mastitiden beim Rind
befassen, weisen G-Streptokokken als Mastitiserreger unterschiedliche Bedeutung zu.
Einerseits können Berichten zufolge G-Streptokokken durchaus Verursacher von seuchenhaften
Mastitiden sein, andererseits finden Autoren bei großen Untersuchungsumfängen nur einen sehr
geringen Anteil an Streptokokken der Lancefield-Gruppe G beim Rind. Der prozentuale Anteil
von G-Streptokokken an allen Viertel- bzw. Einzelgemelkproben ist in Tabelle 2.5-1
Tab. 2.5-1: Übersicht über die Häufigkeit von G-Streptokokken in Milchviehbeständen in der
Literatur
Literatur
BARNUM & FULLER
BEERWERTH et al.
CHAFFER et al.
EBERHART & GUSS
KUNTER
LIVONI
RØMER
RØMER
RØMER
TIKOFSKY & ZADOKS
WATTS et al.
* = Einzelgemelkproben
Jahr
1953
1965
2005
1970
1968
1953
1948
1953
1959
2005
1984
Anzahl der
Prozent am
untersuchten
Anzahl isolierter
GesamtprobenViertel
G-Streptokokken
umfang
363
21
5,79
330*
3
0,91
274
55
20,07
132
39
29,55
1964*
12
0,61
5025*
14
0,28
205*
54
26,34
283*
77
27,21
4039*
48
1,19
90*
46
51,11
916
57
6,22
dargestellt.
MILLER und HEISHMAN (1940) untersuchten eine Herde mit insgesamt 44 Tieren mehrfach
nach Auftreten massiver Eutergesundheitsprobleme. Sie ermittelten eine Mastitisrate von
40,0%, wobei kulturell-bakteriologisch vornehmlich „atypische Streptokokken“ als Erreger
auftraten. Die Infektionsquelle blieb unbekannt. 19 der 44 mit Streptokokken-infizierten Kühe
(43,2%) zeigten eine klinische Mastitis-Symptomatik mit Schwellung und Rötung der
betroffenen Viertel sowie massivem Zellzahlanstieg in der Milch, 13 davon (68,4%) waren mit
G-Streptokokken infiziert. Diese Tiere zeigten zusätzlich zu einer Erhöhung der somatischen
Zellzahl anschließend Indurationen im Eutergewebe.
11
BARNUM und FULLER (1953) beschreiben das Vorkommen klinisch milder chronischer
Mastitiden in einer Herde in Kanada. Die Untersucher fanden bei 16,3% der Tiere
Streptokokken der Lancefield-Gruppe G. Über die Infektionsquelle ist auch in dieser
Untersuchung nichts bekannt. Die Autoren beobachteten Rezidive nach der Behandlung und
keine Neuinfektionen, wodurch sie zu der Schlussfolgerung kamen, die G-Streptokokken seien
resident im einmal befallenen Euter, ohne akute Mastitiden auszulösen.
EBERHART und GUSS (1970) untersuchten eine Holstein-Frisian (HF)-Herde mit 35 Kühen.
Über die Neigung zur Chronizität der Mastitiden in diesem Bestand werden ebenso wenig
Angaben gemacht wie über die Infektionsquelle. Beobachtet wurden subklinische Mastitiden
mit erhöhten Zellgehalten im California-Mastitis-Test (CMT), selten klinische Mastitiden.
Gewebeveränderungen oder Indurationen wurden nicht festgestellt. Der Zellgehalt der
Tankmilch des Betriebes war über mehrere Monate stark erhöht (>1.000.000 Zellen/ml).
Bezugnehmend auf andere Veröffentlichungen und ihre eigenen Erfahrungen schlussfolgern die
Autoren, dass Streptokokken der serologischen Gruppe G zwar selten auftreten, aber in
betroffenen Herden eine hohe Infektionsrate erreichen.
Zu ähnlichen Ergebnissen kommen auch WATTS et al. (1984). Bei 6,2% der Proben konnten
G-Streptokokken nachgewiesen werden. Der Zellzahlanstieg betroffener Kühe war von einem
durchschnittlichen Milchrückgang um 4,5 kg/d begleitet. Bei der pathologisch-histologischen
Untersuchung des Eutergewebes einer getöteten Kuh, die nachweislich auf allen Vierteln mit
Streptokokken der Gruppe G infiziert war, zeigten sich sowohl Gewebeschäden (zerrissene
Alveoli, Schwellungen des alveolären Epithels, Gewebsnekrosen und Einschmelzungen oder
Funktionsverlust des sekretorischen Parenchyms in der Zitzenzisterne) als auch
Entzündungsanzeichen (starke Leukozyteninfiltrationen mit größtenteils neutrophilen
Granulozyten und wenigen Makrophagen, vor allem im Epithel und tiefen Bindegewebe der
Zitzenzisterne und des Fürstenberg’schen Venenrings). Die beschriebenen Gewebeschäden
blieben allerdings vergleichsweise gering und beschränkt auf nahe der Zitzenzisterne gelegenes
Drüsenparenchym.
Im Gegensatz zu EBERHART und GUSS (1970) sind die therapeutischen Erfolge zunächst
gering, die Heilungsrate der ersten Therapie beträgt 24,4%. Nach Wechsel des Antibiotikums
wird eine Heilungsrate von 54,9% erreicht, die durch Therapie zum Trockenstellen auf 69,5%
gesteigert werden kann.
Hohe Infektionsraten und gute Heilungserfolge beschreiben auch CHAFFER et al. (2005) bei
einem Mastitis-Bestandsproblem in einer Herde in Israel. Die beschriebene starke Ausbreitung
der Infektion führen die Autoren auf Fehler bei der Melkhygiene zurück. Die Heilungsrate
12
durch antibiotische Behandlung während der Laktation und zum Trockenstellen sowie durch
Verbesserung der Milchhygiene betrug annäherend 100%. Anders als bei TIKOFSKY und
ZADOKS (2005) kann die Infektionsquelle nicht sicher benannt werden. Auch diese Autoren
beschreiben eine hohe Infektionsrate und ein starkes Ansteigen der Tankmilch-Zellzahlen
(TIKOFSKY und ZADOKS, 2005). Bei ihrer Untersuchung fanden sie bei der ersten
Probennahme bei 51,1% der Kühe S. canis in mindestens einem Viertel. Außerdem fanden sie
S. canis im Nasensekret einer Hofkatze mit chronischer Sinusitis und in einem Melkbecher.
PCR-Analysen mit zwei Restriktions-Enzymen (EcoRI und PvuII) ergaben für die vom Rind
(12) und von der Katze (1) stammenden Isolate identische Restriktionsmuster, woraus die
Autoren schlussfolgern, dass die Katze die ursprüngliche Infektionsquelle darstellt. Die starke
Ausbreitung des Erregers führen TIKOFSKY und ZADOKS (2005) auf Übertragung von Kuh
zu Kuh durch mangelnde Melkhygiene (gemeinsames Eutertuch, kein Zitzendippen) zurück.
WATTS et al. (1984) beobachten bei ihrer Untersuchung eine große Ähnlichkeit der
morphologischen Eigenschaften der G-Streptokokken mit Streptococcus agalactiae.
RØMER (1948) untersuchte die Bedeutung von G-Streptokokken als Erreger von
Euterentzündungen. 65,0% der mit Streptokokken der Lancefield-Gruppe G infizierten Tiere
zeigten klinische Symptome einer Euterentzündung. Die Infektionsraten der untersuchten
Herden in Bezug auf G-Streptokokken lagen zwischen 18,2% und 61,1%. RØMER erzielte gute
Behandlungserfolge mit Penicillin in „ausreichender Konzentration“, so dass er folgerte, durch
G-Streptokokken verursachte Mastitiden könnten in den betroffenen Herden erfolgreich
bekämpft werden, wenn neben einer sicheren bakteriologischen Diagnose eine korrekte
Behandlung durchgeführt wird. Fünf Jahre später berichtet er erneut über das Auftreten und die
Häufigkeit von Streptococcus zooepidemicus, L- und G-Streptokokken in Zusammenhang mit
Mastitiden (RØMER 1953). Dabei beschreibt er eine Neuinfektionsrate von 2,3%, da lediglich
bei drei von 128 Kühen aus zwei Herden Neuinfektionen mit G-Streptokokken auftraten. 57,4%
der mit G-Streptokokken infizierten Vierteln zeigten Veränderungen des Eutergewebes und des
Milchsekretes. RØMER kommt aufgrund seiner Untersuchungsergebnisse zu der Einschätzung,
dass die pathogene Wirkung der G-Streptokokken zwischen der der C-Streptokokken und der
der L-Streptokokken liegt. Er gab jedoch zu bedenken, dass sein untersuchtes Probenmaterial
für eine endgültige Aussage zu gering sei. Die Behandlung von sieben mit G-Streptokokken
infizierten Herden zeigte, wie aus der vorherigen Veröffentlichung zu erwarten war, gute
Erfolge. Bei 85,4% der infizierten Tiere waren nach der Behandlung keine G-Streptokokken
mehr nachweisbar. RØMER betont, dass neben S. agalactiae auch L- und G-Streptokokken
eine nicht unbedeutende Rolle als Mastitiserreger spielen und deshalb in die routinemäßige
13
Diagnostik mit eingebunden werden müssen.
Weitere sechs Jahre später präsentiert er eine groß angelegte Reihenuntersuchung. Dabei waren
G-Streptokokken in Tank- und Viertelgemelksproben, nur in der Tankmilch oder in
Viertelgemelksproben trotz negativer Tankmilchprobe nachzuweisen. Außerdem waren
Infektionen kurz vor oder nach Entnahme der Tankmilchprobe aufgetreten.
Bei flächendeckenden Kontrollen unter definierten Bedingungen auf der Insel Samsø
untersuchte LIVONI (1953) Milchviehherden auf ihre Eutergesundheit unter besonderer
Berücksichtigung von S. agalactiae. Dabei waren bei 28,1% aller untersuchten Tiere
euterpathogene Streptokokken nachweisbar. Streptokokken der Lancefield-Gruppe G fanden
sich in nur zwei Herden (0,28% aller untersuchten Bestände bzw. 0,41% der mit
euterpathogenen Streptokokken infizierten Herden).
KLASTRUP (1963) führte Untersuchungen im Rahmen eines flächendeckenden MastitisProgramms. Dabei wurden, wenn bei der bakteriellen Untersuchung der Tankmilch-Proben
infektiös einzustufende Erreger nachweisbar waren, Viertelgemelksproben von allen Tieren des
betroffenen Betriebes genommen. KLASTRUP unterschied dabei in ansteckende und
„berufsbedingte“, durch die hohe Milchleistung hervorgerufene, Mastitiden. Seiner Ansicht
nach ist nur „S. agalactiae euterspezifisch im Sinne des Wortes“. Mastitis-erzeugende
Streptokokken der Lancefield-Gruppen B, C, G und L kommen seiner Meinung nach aber
ebenfalls nur direkt am Tier vor und werden, da eine Bekämpfung durch Behandlung möglich
ist, somit ebenfalls zu den infektiösen Mastitiserregern gerechnet. Bei seinen Untersuchungen
wurden 25,0% aller dänischen Milchviehbestände erfasst, wobei sich bei 1,0% der untersuchten
Herden Streptokokken der Lancefield-Gruppe G fanden. In den betroffenen Betrieben waren
insgesamt 3,0% der Kühe mit G-Streptokokken infiziert. Der Autor beschrieb eine jährliche GStreptokokken-Neuinfektionsrate mit 5,0 bis 6,0 %.
BEERWERTH et al. (1965) untersuchten 428 Tankmilchproben und entdeckten dabei in 64
Beständen (15,0%) Streptokokken. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass GStreptokokken nur mit einem Anteil von 2,3% unter den isolierten Streptokokken vertreten
waren.
KUNTER (1968) untersuchte 51 Milchvieh-Bestände mit gehäuftem Streptokokken-Auftreten
in Dresden und Umgebung. Bei vier der mit G-Streptokokken infizierten Tiere zeigte sich eine
Zellzahlerhöhung in der Milch, die übrigen acht zeigten Zellgehalte im Normalbereich. Die
betroffenen Tiere stammten aus zwei Beständen; eine Infektionsquelle konnte bei keinem der
Bestände nachgewiesen werden. KUNTER konnte, im Gegensatz zu TEMPLIN (1960) bei
14
seiner Untersuchung „keine gesicherten Zusammenhänge“ zwischen dem Auftreten von
Euterinfektionen mit ß-hämolysierenden Streptokokken und den milchhygienischen
Bedingungen in den betroffenen Beständen feststellen.
Bei regelmäßigen Untersuchungen von annähernd 250 Milchviehherden im Staat New York
wiesen HAMILTON und STARK (1970) bei vier Herden (1,6%) G-Streptokokken nach.
Insgesamt isolierten sie 70 Feld-Stämme, wobei 40 der Isolate aus Vierteln mit Symptomen
einer klinischen Mastitis stammten. Bei der eingehenden Untersuchung einer Herde mit
insgesamt 123 Tieren waren 32 Kühe (26,02%) mit G-Streptokokken infiziert, 31 dieser Tiere
zeigten Mastitis-Symptome (minimale Sekretveränderungen, Flockenbildung).
McDONALD und McDONALD (1976) untersuchten 455 Streptokokken-Isolate aus 72
Beständen. G-Streptokokken traten dabei mit einer Häufigkeit von 0,70% auf. Wesentlich
häufiger fanden die Autoren S. agalactiae (1,5%), S. dysgalactiae (9,0%) und Streptococcus
uberis (56,5%).
Flächendeckende bakteriologische Untersuchungen beziehen sich hauptsächlich auf
Streptokokken im Allgemeinen, meistens werden G-Streptokokken nur als Nebenbefund
erwähnt. Der Anteil von G-Streptokokken an den isolierten Streptokokken-Stämmen ist in
Tabelle 2.5-2 aufgeführt.
Tab. 2.5-2: Häufigkeit von G-Streptokokken an aus Milchproben isolierten Streptokokken in der
Literatur
Literatur
BEERWERTH & KÖSER
BERGER-RABINOWITZ et al.
ENGBRETSEN
LORENZEN
MC DONALD & MC DONALD
MILLER & HEISHMANN
SOBIRAJ et al.
VASENIUS & NURMI
Jahr
1965
1981
1968
1968
1976
1940
1997
1963
Anzahl der
untersuchten
Anzahl dabei
Streptokokkenisolierter
Isolate
G-Streptokokken Prozent
1791
27
1,51
90
17
18,89
210
7
3,33
128
4
3,13
455
3
0,66
69
44
63,77
1448
21
1,45
648
37
5,71
15
VASENIUS und NURMI (1963) untersuchten Isolate ß-hämolysierender Streptokokken aus
den Jahren 1960 bis 1963. Dabei gehörten 5,70% der untersuchten Feldisolate zur LancefieldGruppe G. Die Untersucher leiteten aus ihren Ergebnissen eine zunehmende Häufigkeit und
Bedeutung der G-Streptokokken ab.
WEIGT und GRUNERT (1964) untersuchten 1722 Viertelgemelksproben von Kühen mit
klinischer Mastitis auf seltene Streptokokkenarten. Dabei fanden sie nur in einem Fall (0,06%)
Streptokokken der Lancefield-Gruppe G. Das infizierte Viertel und die Milch waren zunächst
unauffällig, nach fünf Tagen waren erste Flocken in der Milch zu beobachten, nach zwei
weiteren Tagen zeigten sich knotige Veränderungen im Drüsengewebe und grobsinnlich
veränderte Milch.
BEERWERTH und KÖSER (1965) versuchten, einen Überblick über die Häufigkeit von
Streptokokken unterschiedlicher Lancefield-Gruppen bei Mastitiden zu erlangen.
Die Autoren beobachteten überwiegend Einzelfälle, gelegentlich jedoch auch Stallenzootien.
60,0% der Tiere zeigten dabei keine Zellgehaltserhöhungen. Daher beurteilen BEERWERTH
und KÖSER Streptokokken der Lancefield-Gruppe G als latente Euterbesiedler, die
gegebenenfalls eine Mastitis auslösen können.
Im Untersuchungszeitraum von 1964 bis 1966 untersuchte LORENZEN (1968) 42450
Einzelproben von Vorzugsmilch und Markenmilch. Bei vier (3,1%) der dabei isolierten
Stämme handelte es sich um Streptokokken der Lancefield-Gruppe G.
ENGEBRETSEN (1968) untersuchte „atypische Streptokokken“ bei boviner Mastitis und
ordnete dabei 210 Stämme ihrer serologischen Gruppe zu. Sieben (3,33%) dieser Stämme
gehörten zur Lancefield-Gruppe G.
BERGNER-RABINOWITZ et al. (1981) untersuchten 90 Streptokokkenisolate aus
Einzelmilchproben von an Mastitis erkrankten Kühen in Israel. Die Feldstämme wurden aus
insgesamt 12 Herden isoliert. 17 Stämme (18,8%) ließen sich der Lancefield-Gruppe G
zuordnen, wobei diese von 17 Kühen aus drei verschiedenen Beständen stammten.
GEDEK et al. (1987) beschreiben nur kurz die Existenz von G-Streptokokken, die ihrer Ansicht
nach selten vorkommen, aber wenn sie auftreten, oft Herdenprobleme darstellen. Der hohen
Rezidivrate wegen seien sie schwer zu beherrschen.
SOBIRAJ et al. (1997) untersuchten bundesweit Kühe mit subklinischen Mastitiden, um
Aufschlüsse über die Erregerverteilung und die in-vitro-Resistenz zu erhalten. In den Proben
konnten zum Teil mehrere Bakterienstämme nachgewiesen werden, sodass insgesamt 1448
Erregernachweise geführt wurden. Die Autoren ermittelten für G-Streptokokken eine nicht
16
signifikante Korrelation zwischen der Erregerdichte und dem Gehalt an somatischen Zellen in
der beprobten Milch. Regionale Unterschiede in der Verteilung konnten nicht festgestellt
werden.
TEMPLIN (1960) führt den hohen Anteil an Streptokokken-Mastitiden in Mecklenburg u. a.
auf vielerorts mangelnde Stall- und Melkhygiene zurück. Allerdings findet er bei seiner drei
Jahre dauernden Untersuchung keine G-Streptokokken. Dabei sind der Probenumfang und
Untersuchungsmodus nicht bekannt.
KIELWEIN et al. (1962) untersuchten die Verbreitung des Gelben Galtes im
württembergischen Allgäu. Dabei wurden 37 ß-hämolysierende Streptokokken differenziert und
ihrer serologischen Gruppe zugeordnet. Es fanden sich keine Stämme, die zur LancefieldGruppe G gehört hätten.
2.6 Die Mastitis des Rindes
Als Mastitis wird die entzündliche Erkrankung der Milchdrüse bezeichnet. Betroffen sein
können das Drüsengewebe (Mastitis), die Zitze (Thelitis) und die Milchgänge (Galaktophoritis).
Die am häufigsten auftretende Form ist die Mischform, bei der sowohl Drüsenparenchym als
auch milchabführende Gänge betroffen sind (Galaktophoromastitis). Die Ursachen für die
Entstehung einer Mastitis sind vielfältig. Bei den nicht-infektiösen Ursachen stehen Traumen
(z.B. Stoß, Tritt) im Vordergrund, aber auch thermische (z.B. Sonnenbrand) und chemische
Einflüsse (z.B. Desinfektionsmittel) können, ebenso wie andere, unspezifische Noxen, eine
Mastitis auslösen. Infektiöse Ursachen sind Bakterien, Viren, Pilze oder Algen.
Die Einteilung der Mastitis erfolgt nach pathologisch-anatomischen oder klinischen
Gesichtspunkten. Nach der pathologisch-anatomischen Beurteilung der Gewebeveränderung
unterscheidet man katarrhalische, eitrig-abszedierende, hämorrhagisch-nekrotisierende,
granulomatöse oder interstitielle, nicht eitrige Mastitiden (WEISS 1988, SCHULZ 1994).
Der klinischen Einteilung liegen die Vorschläge der INTERNATIONAL DAIRY
FEDERATION (1967, 1971) zugrunde. Unterschieden werden normale Sekretion, latente
Infektion, unspezifische Mastitis und Mastitis.
Als normale Sekretion wird die in ihrem Zellgehalt unveränderte Milch aus gesunden,
pathologisch-anatomisch unveränderten Eutervierteln betrachtet. Pathogene Keime sind nicht
nachweisbar.
Bei einer latenten Infektion findet man bei normalem Zellgehalt pathogene Keime, ein Befund,
der so auch bei einer reinen Besiedelung des Strichkanals ohne Beteiligung des
17
Drüsenparenchyms zu beobachten ist.
Unspezifische Mastitiden sind charakterisiert durch subklinische oder klinische Symptome,
ohne dass spezifische Mastitiserreger nachweisbar sind.
Bei der Mastitis stehen Entzündungssymptome im Vordergrund, zusätzlich erfolgt der
Nachweis euterpathogener Keime. Hier unterscheidet man subklinische, klinische und
chronische Mastitiden. Subklinische Mastitiden bewirken keine äußerlich erkennbaren
Entzündungssymptome, aber eine mehr oder weniger deutliche, mit direkten oder indirekten
Verfahren nachweisbare Zellzahlerhöhung. Bei klinisch apparenten Mastitiden ist die Milch
makroskopisch verändert, von Flöckchen oder Flocken im Vorgemelk (subakute Mastitis) bis
zu blutigem oder eitrig-fibrinösem Sekret (akute Mastitis), wobei das Euter geschwollen,
gerötet und nicht selten schmerzhaft ist. Unter Umständen können Störungen des
Allgemeinbefindens mit oder ohne Erhöhung der Körpertemperatur auftreten.
Tritt längerfristig keine Heilung ein (Therapieversagen), entwickelt sich aus der subklinischen
oder akuten Mastitis eine chronische Mastitis, das betroffene Viertel kann atrophieren und es
können dauerhafte, klinisch erkennbare Veränderungen (z.B. Knoten, Verhärtungen) zurück
bleiben.
Der Zellgehalt der Milch ist ein wichtiges diagnostisches Kriterium für die Eutergesundheit
sowohl auf Bestands- als auch auf Einzeltierebene. Den größten Anteil bilden neben den
abgeschilferten Epithelzellen die polymorphkernigen Granulozyten, gefolgt von Lymphozyten,
Makrophagen, nicht differenzierbaren Zellen und Zelltrümmern. Im Allgemeinen werden
100.000 Zellen pro ml Milch als Grenzwert für das Auftreten zellulärer Abwehrmechanismen
gesehen. Höhere Zellzahlen deuten auf eine Entzündung hin, mit der das Immunsystem auf eine
Noxe reagiert. Durch Übertritt von Blutbestandteilen durch das Alveolarepithel in den
Alveolarraum kommt es zu einer relativen Zunahme polymorphkerniger Granulozyten in der
Milch (MIELKE und MICHEL 1994). Zudem ändert sich auch die stoffliche Zusammensetzung
der Milch (TOLLE et al. 1977).
Es besteht also ein direkter Zusammenhang zwischen der Höhe der Zellzahl und dem
Infektionsstatus des Euterviertels. Bei infizierten Eutervierteln ist ein signifikanter
Zellzahlanstieg sowohl innerhalb einer Laktation als auch über mehrere Laktationen zu
beobachten. Eutergesunde Kühe, die über mindestens drei Laktationen nachweislich nicht
infiziert waren, zeigen weder innerhalb der Laktation noch über mehrere Laktationen eine
signifikante Zunahme des Zellgehaltes in der Milch. Eine Ausnahme stellen die ersten zwei
Wochen nach dem Abkalben dar. Hier ist physiologischerweise ein erhöhter Zellgehalt
nachweisbar (NATZKE et al. 1972, SHELDRAKE et al. 1983, HARMON 1994). Ebenso ist
18
gegen Ende der Laktation mit rückläufiger täglicher Milchleistung ein physiologischer
Zellzahlanstieg in der Milch zu verzeichnen. Auch exogene Belastungen wie ein Transport der
Tiere oder das Umstellen innerhalb der Herde haben bei eutergesunden Vierteln kaum
Auswirkungen auf den Zellgehalt, während das Drüsengewebe bei Kühen, bei denen bereits
eine Zellzahlerhöhung vorliegt, unter solchen Bedingungen deutliche zytologische Reaktionen
zeigt (HAMANN und REICHMUTH 1990).
Definitionsgemäß (DVG, 2000) liegt eine Mastitis vor, wenn der Zellgehalt erhöht ist und
Mastitiserreger nachgewiesen werden können. Da der Zellgehalt Schwankungen unterworfen ist
und Mastitiserreger oft nur in Intervallen ausgeschieden werden, wird zur Sicherung der
Diagnose einer subklinischen Mastitis ein positiver Nachweis mit dem selben Erreger aus zwei
von drei bakteriologischen Untersuchungen im Wochenabstand gefordert (NEAVE 1975, DVG,
2000). Im Umkehrschluss sollten gesunde Viertel bei mindestens zwei von drei
bakteriologischen Untersuchungen frei von Mastitiserregern sein.
2.6.1
Mastitiserreger
Mastitiden werden am häufigsten durch Bakterien, nach ihren Eigenschaften unterteilt in
kontagiöse und umweltassoziierte Erreger, weniger oft durch Hefen, Algen oder Viren
ausgelöst. Viren verursachen nur in den seltensten Fällen direkt und ausschließlich Mastitiden.
In der Regel handelt es sich um eine Erkrankung des Gesamtorganismus mit der Mastitis als
bakterielle Sekundärinfektion. Eine Ausnahme bildet das Maul-und-Klauenseuche-Virus, das
sich in Zellen des Drüsenepithels vermehren kann und dort Gewebsnekrosen verursacht
(BLACKWELL et al. 1983). Über die Milch ausgeschieden, werden darüber hinaus nach
Untersuchungen von FUCHS (1994) und YOSHIKAWA et al. (1997) das bovine Herpesvirus
1, das bovine Leukosevirus 1 und das Parainfluenza-Virus 3.
Die weitaus häufiger auftretende bakterielle Infektion kann galaktogen, hämatogen oder
lymphogen erfolgen.
Bei der galaktogenen Infektion dringt der Erreger nach Kontakt mit der Zitzenspitze in den
Strichkanal ein, wo erregerabhängig eine mehrwöchige, symptomlose Besiedelung möglich ist
(FORBES und HEBERT 1968). Die Besiedelung des Strichkanals wird gefördert durch
Schädigungen der Schleimhaut. Mikroläsionen, verursacht durch anhaltende Feuchtigkeit,
Reizung der Schleimhaut durch Desinfektionsmittel oder durch mechanische Belastung infolge
fehlerhafter Melktechnik ermöglichen dem Erreger eine Haftung im Gewebe des Strichkanals.
Von dort aus erfolgt dann die Infektion des Drüsengewebes durch passive und aktive
19
Erregerausbreitung entlang der milchableitenden Wege (ANDERSON 1982). Die Besiedelung
des Strichkanals ist also eine wichtige Vorstufe in der Pathogenese einer Mastitis, jedoch kann
eine Infektion des Drüsengewebes auch ohne vorherige Besiedelung des Strichkanals erfolgen.
Andererseits hat nicht jede Besiedelung des Strichkanals zwangsläufig eine Mastitis zur Folge.
Hämatogene Infektionen entstehen ausgehend von Lokal- oder Allgemeininfektionen. Der
Erreger gelangt über das Blut in das Euter, wenn z.B. durch Endotoxine die Blut-EuterSchranke geschädigt ist.
Lymphogene Infektionen entstehen, wenn nach Zitzenverletzungen die Lymphgefäße
geschädigt sind und auf diesem Weg Keime in das Drüsenparenchym einwandern können
(WEIGT und DREIST 1988, FUCHS 1994). Für das Mastitisgeschehen ist die galaktogene
Infektion die eindeutig dominierende.
2.6.1.1 Kontagiöse Mastitiserreger
Neben S. canis gelten S. agalactiae, S. dysgalactiae, weitere ß-hämolysierende Streptokokken
der serologischen Gruppen C und L, S. aureus sowie Corynebacterium(C.) bovis und
verschiedenen Mykoplasmenarten als kontagiöse Mastitiserreger. Sie werden auch als kuhbzw. euterassoziierte Erreger bezeichnet. Als Reservoire kommen in erster Linie das infizierte
Viertel des Kuheuters und Verletzungen an der Zitzen- oder Euterhaut der Milchkühe in
Betracht (KLASTRUP 1963, BRAMLEY 1981, TOLLE 1982, BRAMLEY und DODD 1984,
DVG, 2000). Belebte und unbelebte Umweltfaktoren spielen als Reservoire nur eine
untergeordnete Rolle (PHILPOT 1979, TOLLE 1982, BRAMLEY und DODD 1984, FOX und
GAY 1993, ROBERSON et al. 1994, DVG 2000).
Die Verbreitung kontagiöser Mastitiserreger erfolgt primär über die Milch oder die Zitzenhaut
der betroffenen Tiere, auf der signifikant öfter und mehr Keime nachzuweisen sind, als an
anderen Körperstellen (DAVIDSON 1961). Von der Zitzenhaut können Keime durch
mechanischen Transfer an andere Körperstellen gelangen, wo sie sich vermehren. Von dort aus
können sie einerseits zurück auf die Zitzenhaut übertragen werden und so den Keimdruck
erhöhen, andererseits aber auch andere Tiere infizieren.
Die in der Milch befindlichen pathogenen Mikroorganismen gelangen über Vektoren, wie z.B.
die Hand des Melkers, Reinigungstücher oder Melkbecher auf die Zitzenhaut oder in gesunde
Viertel, wo sie eine neue Infektion auslösen können. Auch die Melktechnik spielt dabei eine
nicht zu unterschätzende Rolle. Ein Rückfluss der Milch im Melkzeug nach Lufteinbrüchen,
besonders beim Ansetzen, schleudert die ermolkene, möglicherweise erregerhaltige Milch mit
hoher Geschwindigkeit gegen die Zitzenöffnung. Auch fehlerhafte Pulsatoren oder
20
Schwankungen im Vakuum können die Besiedelung der Zitzenspitze mit Krankheitserregern
begünstigen. Neuinfektionen mit kuhassoziierten Mastitiserregern ereignen sich überwiegend
kurz vor oder während des Melkens bis einschließlich vier Stunden nach dem Melken.
Die Bekämpfung kontagiöser Mastitiserreger basiert auf einem fünf Punkte beinhaltenden
Konzept: angemessene Melkhygiene, Zitzendippen, Behandlung klinisch kranker Kühe in der
Laktation, Antibiotikabehandlung zum Trockenstellen und Merzen chronisch kranker,
therapieresistenter Kühe. Ziel dieser Maßnahmen ist es einerseits, den Anteil infizierter
Euterviertel zu verringern und andererseits, den sanierten Bestand eutergesund zu erhalten. Die
Reduktion der Exposition gesunder Euterviertel bedingt eine Senkung der Neuinfektionsrate.
So kann der Gesamtinfektionsdruck gesenkt und die Eutergesundheit im Bestand kontinuierlich
verbessert werden.
Eine angemessene Melkhygiene verhindert die Übertragung kontagiöser Mastitiserreger von
Viertel zu Viertel bzw. von Kuh zu Kuh. Hierzu kann eine desinfizierende Feuchtreinigung mit
einem sauberen, unbenutzten Tuch für jede Kuh durchgeführt werden. Der Melker trägt
Gummihandschuhe, um eine Übertragung der Keime von der Haut des Melkers auf die
Euterhaut zu verhindern. Auch die Zwischendesinfektion oder Zwischenspülung der Melkzeuge
nach jeder Kuh und separates Melken euterkranker Kühe reduzieren den Infektionsdruck
(NEAVE et al. 1969, PHILPOT 1979). WHITE (1965) gelang es nur durch Trennung gesunder
von infizierten Tiere beim Melken und durch Merzen chronisch euterkranker Kühe, innerhalb
weniger Laktationen Bestände mit durch kontagiöse Mastitiserreger verursachten
Eutergesundheitsstörungen zu sanieren. Untersuchungen von JONES und SHANNON (1972)
zeigen, dass eine Reduktion der Neuinfektionsrate von Färsen in den ersten zwei
Laktationsmonaten von 60% auf unter 20% erreicht werden kann, indem die Färsen getrennt
von den älteren Kühen nach einer vorgeschalteten Desinfektion der Melkanlage gemolken
werden.
Die Zwischendesinfektion der Melkzeuge bewirkt eine Reduktion und Elimination der
Keimflora im Melkzeug. Dazu wird nach jeder Kuh das Melkzeug vom langen Milchschlauch
aus mit einem Desinfektionsmittel oder mit ausreichend heißem Wasser durchgespült
(backflushing). Bei kontagiösen Erregern ist die Zwischendesinfektion in Verbindung mit den
anderen genannten Maßnahmen ein geeignetes Hilfsmittel zur Reduktion des Keimdrucks. Zur
Beeinflussung von durch umweltassoziierte Mastitiserreger verursachten Bestandsproblemen ist
sie jedoch unzureichend (WHITE 1965, BRAMLEY 1981, BUSHNELL 1984, FOX und
HANCOCK 1989, McDONALD 1989, FOX et al. 1991).
21
In Abhängigkeit vom Erreger wird dem Zitzendippen aller Euterviertel nach dem Melken in der
Literatur eine reduzierende Wirkung in Bezug auf Neuinfektionen um 50 – 90%, vor allem
kontagiöse Erreger betreffend, zugesprochen (HEESCHEN und HAMANN 1987). Eine
Elimination bestehender Mastitiden wird durch das Dippen jedoch nicht erreicht (SISCHO et al.
1993), so dass sich die Infektionslage ohne weitere Maßnahmen nur langsam verbessert. DODD
et al. (1969) beschreiben einen Rückgang der Neuinfektionsrate innerhalb eines Jahres um
50%; die Verminderung der infizierten Viertel betrug im gleichen Zeitraum jedoch nur 14%.
Dabei wirken Dippmittel nach zwei verschiedenen Prinzipien. Durch die antimikrobielle
Wirkung von Jod, Chlorhexidin, Milchsäure, Peressigsäure oder Dodecylbenzolsulfonsäure,
deren Wirksamkeit wissenschaftlich belegt ist (HEESCHEN 1996, NATIONAL MASTITIS
COUNCIL 1997), wird die Keimdichte auf der Zitzenhaut signifikant vermindert (FOX 1992).
Barriere-Dippmittel verhindern durch Filmbildung den Kontakt der Bakterien mit der
Zitzenhaut und damit das Einwandern über die Strichkanalöffnung.
Ob eine Behandlung klinisch erkrankter Viertel in der Laktation sinnvoll ist, hängt zu einem
großen Teil von dem Mastitiserreger und seiner Antibiotikaempfindlichkeit ab. Die Behandlung
Penicillin-empfindlicher Keime wie S. canis oder S. agalactiae sollte in der Laktation erfolgen,
da auf diese Weise die Zeit bis zur vollständigen Erregereliminierung verkürzt und damit die
Anzahl der Neuinfektionen vermindert werden kann. Eine gruppenweise Behandlung verlängert
die Zeit, die der Erreger im Bestand verbleibt. Das Risiko einer Neu- oder Reinfektion auch bei
guter Melkhygiene ist jedoch immer gegeben. Für S. agalactiae werden Heilungsraten von bis
zu 90% durch eine Penicillintherapie während der Laktation angengeben (TYLER und
BAGGOTT 1992, WILSON et al. 1999, WOLTER et al. 1999). Damit ist die Heilungsrate nach
Antibiotikatherapie signifikant höher als die Spontanheilungsrate. Diese wird auf etwa 30%
geschätzt.
Trockenstellen unter antibiotischem Schutz wird sowohl zur Ausheilung bestehender
Mastitiden wie auch zur Verhinderung von Neuinfektionen während der Trockenstehperiode
eingesetzt. Die Heilungsrate wird, je nach Literatur, zwischen 70% und 90% (KASCHE 1995,
SOBIRAJ et al., 2000) angegeben.
Das Ausmerzen chronisch kranker Tiere erfolgt nach unterschiedlichen Gesichtspunkten. Es
kann der ersten Reduktion einer hohen Infektionsrate dienen und ist ein wichtiger Bestandteil
der Sanierung von Beständen besonders mit chronisch verlaufenden Infektionen, wie z.B. S.
aureus. Durch das Schlachten bakteriologisch positiver Tiere werden die infizierten Viertel als
Erregerreservoire eliminiert und damit die Verbreitung kontagiöser Mastitiserreger eingegrenzt.
Trotz hoher Anfangskosten erweist sich das Merzen auf lange Sicht als eine wirtschaftliche
22
Maßnahme (BRAMLEY und DODD 1984, GOODGER und FERGUSON 1987, HILLERTON
et al. 1995). Geschlachtet werden dabei therapieresistente Tiere, Tiere mit chronischen oder
wiederholt klinischen Mastitiden, Tiere mit therapieresistenten S. aureus-Infektionen auf mehr
als zwei Eutervierteln, Tiere mit Vernarbungen oder Fibrosen im Gewebe der Milchdrüse oder
Tiere, die einen deutlichen Abfall in der Milchleistung zeigen.
2.6.1.2 Umweltassoziierte Mastitiserreger
Zu den umweltassoziierten Mastitiserregern gehören vor allem einige Streptokokken-Spezies
mit geringer Kontagiosität, koagulase-negative Streptokokken (KNS), gramnegative Bakterien,
Hefen und Algen. Bei den Streptokokken stehen S. uberis, S. parauberis, S. bovis und S.
dysgalactiae sowie Fäkalstreptokokken (Enterokokken) im Vordergrund, bei den
gramnegativen Keimen Bakterienspezies wie Escherichia (E.) coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes und verschiedene Spezies der Gattungen Serratia,
Citrobacter und Proteus. Die gramnegativen Mastitiserreger werden häufig unter dem Begriff
„coliforme Keime“ zusammengefasst. Bei den Algen sind die Prototheken (Prototheca (P.)
zopfii, P. wickerhamii, P. stagnora, P. moriformis) die häufigsten Mastitiserreger (COSTA et
al. 1998, PORE 1985).
Umweltmastitiden treten gehäuft nach der erfolgreichen und dauerhaften Eliminierung
kontagiöser Erreger aus einem Bestand auf (HOGAN et al. 1989, GONZALEZ et al. 1990,
MELLENBERGER und TROYER 1994). Betroffen sind in der Regel, wenn auch nicht
ausschließlich, ältere Kühe, da mit Beginn der vierten Laktation signifikant häufiger durch
umweltassoziierte Erreger verursachte Mastitiden auftreten (SMITH et al. 1985a, GONZALES
et al. 1990, JAYARAO et al. 1999).
Diagnostisch werden die sogenannten umwelt-assoziierten Streptokokken gegenüber den
kontagiösen Streptokokken mittels Nachweis der Äskulinspaltung und dem Fehlen des CAMPPhänomens differenziert. Vereinzelt wird jedoch über das Auftreten CAMP-positiver S. uberisStämme berichtet (JAYARAO et al. 1999).
Untersuchungen zur Genotypisierung von S. uberis ergaben eine große Heterogenität
untersuchter Isolate innerhalb der Bestände. Ebenso waren auch genotypisch unterscheidbare
Isolate innerhalb weniger Tage innerhalb eines Viertels nachweisbar. Diese Untersuchungen
bestätigen die aufgrund epidemiologischer Daten vorgenommene Einordnung von S. uberis als
umweltassoziierten Mastitiserreger. Die Übertragung von Viertel zu Viertel während der
Melkzeit ist dagegen nur von geringer Bedeutung (JAYARAO et al. 1991, JAYARAO et al.
1992, JAYARAO et al. 1993, BASEGGIO et al. 1997, WANG et al. 1999).
23
Während LIPMAN et al. (1995) und LAM et al. (1997) für E. coli-Kulturen, die aus klinisch
manifesten Mastitiden isoliert worden waren, zu dem gleichen Ergebnis und vergleichbaren
Schlussfolgerungen kamen, gelang KAMARUDIN et al. (1996) mittels DNA-Fingerprinting
die Identifizierung von Einstreu als einziger Infektionsquelle für Serratia marcescens. Der
Erreger konnte weder auf der Zitzenhaut noch an den Melkzeugen nachgewiesen werden.
In diesem Zusammenhang wird S. dysgalactiae nach Literaturangaben (BRAMLEY und
DODD 1984, SMITH et al. 1985a, SMITH und HOGAN 1993, TODHUNTER et al. 1995)
widersprüchlich eingeordnet. Einerseits spricht die ebenfalls durch Genotypisierung
nachweisbare Heterogenität der Isolate innerhalb eines Bestandes für ein Umweltreservoir,
andererseits findet man ebenfalls mittels Genotypisierung hohe Homologien unterschiedlicher
Isolate. Die Genomvariabilität ist insgesamt geringer ausgeprägt als bei S. uberis, jedoch
deutlich stärker ausgeprägt als bei S. agalactiae (BASEGGIO et al. 1997, WANG et al. 1999).
Über Genotypisierung von S. aureus-Nachweisen ergibt es sich, dass es solche Isolate gibt, die
die Charakteristika von umweltassoziierten Mastitiserregern erfüllen, somit kann S. aureus
sowohl als kontagiöser, aber auch als umweltassoziierter Erreger angesehen werden
(SOMMERHÄUSER 2001, SOMMERHÄUSER et al. 2003).
Das primäre Reservoir umweltassoziierter Mastitiserreger ist die belebte und unbelebte
Umwelt. Umweltassoziierte Mikroorganismen sind ubiquitär. Ein Kontakt des Tieres mit den
Erregern ist damit überall und jederzeit möglich. Dabei ist davon auszugehen, dass jeder Faktor,
der die Besiedlungsdichte um die Strichkanalöffnung erhöht, die Infektionsrate steigert
(PHILPOT 1979, SMITH 1983, BARTLETT et al. 1992). Die Mastitiserreger finden sich vor
allem in der Einstreu und auf der äußeren Haut der Tiere, in den Tonsillen, der Vagina und dem
Darm. Auch in Zitzenverletzungen können sie sich ansiedeln und vermehren. Das infizierte
Euter ist in diesem Zusammenhang jedoch nur von untergeordneter Bedeutung (TOLLE et al.
1977, BRAMLEY 1981, DVG 1994). Vom Tier aus gelangen die Erreger in die Umwelt. Hier
können sie sich vermehren und von dort wieder andere Euter kontaminieren. In der Einstreu
vermehren sich gramnegative Bakterien besser als Streptokokken, wobei organische Einstreu
einen signifikant höheren Keimgehalt aufweist als anorganisches Material wie Sand oder
Lehmboden. Dennoch findet sich bei Stroh häufiger eine Streptokokken-Kontamination,
während im Sägemehl häufig Klebsiellen nachweisbar sind. In Beständen mit SägemehlEinstreu werden im Verhältnis häufiger Mastitiden durch coliforme Keime verursacht
(ZEHNER et al. 1986, HOGAN et al. 1989a, BARTLETT et al. 1992). Die
Vorkommenshäufigkeit von Umweltmastitiden steht in direktem Zusammenhang mit der
Kontamination der Zitzenhaut. Wird beispielsweise die Keimzahl in der Einstreu reduziert,
24
sinkt auch die Mastitisrate. Die Kontamination findet dabei überwiegend während der
Zwischenmelkzeit statt. Da eine Keimfreiheit im Stall nicht erreicht werden kann, sind eine
Verringerung der Erregerexposition sowie eine Optimierung der körpereigenen Abwehrkräfte
geeignete Gegenmaßnahmen (SMITH 1983, TODHUNTER et al. 1991, SMITH und HOGAN
1993). Der Melkhygiene und besonders der Vorbereitung des kontaminierten Euters vor dem
Melken kommt dabei eine besondere Bedeutung zu. Euter und Zitzen sollten beim Ansetzen des
Melkzeugs sauber und trocken sein, wobei sich der Einsatz einer Euterdusche nachteilig
auswirken kann (SCHUKKEN et al. 1991, BARTLETT et al. 1992). Die Reinigung erfolgt am
besten mit Wasser oder Desinfektionsmittel-Lösung. Es schließt sich eine gründliche manuelle
Trocknung der Zitzen mit einem Einmal-Tuch pro Kuh an. Dadurch erreicht man eine
Reduktion der Keimzahl sowohl auf der Zitzenhaut als auch in der ermolkenen Milch selbst.
Der Trocknung fällt eine besondere Bedeutung zu. Fehlt diese, kann zum Teil eine Zunahme
der Besiedlungsdichte auf der Zitzenhaut beobachtet werden (GALTON et al. 1982, 1984 und
1986). Durch Eintauchen der Zitzen in eine germizide Lösung vor dem Melken („Predipping“)
erreicht man eine gute Desinfektion der Zitzen und einen verbesserten Infektionsschutz in
Bezug auf umweltassoziierte Mastitiserreger. Wichtig ist dabei die gründliche Nachtrocknung
vor dem Melken, um eine Verunreinigung der Milch mit Hemmstoffen, wie z.B. Jod, zu
vermeiden. Zitzendippen vor dem Melken ist in Deutschland jedoch (noch) nicht erlaubt.
Dippen nach dem Melken bedingt hingegen keinen ausreichenden Schutz vor
umweltassoziierten Erregern, jedoch vor euterassoziierten Erregern. In einigen Beständen war
sogar eine Zunahme von durch E. coli hervorgerufene Mastitiden zu beobachten. Nachdem in
den betreffenden Milcherzeugerbetrieben die Zitzendesinfektion nach dem Melken wieder
eingestellt worden war, verringerte sich auch die Anzahl der Mastitisfälle (SCHUKKEN et al.
1989, SCHUKKEN et al. 1991, LAM et al. 1997). Bildete das Zitzendesinfektionsmittel
zusätzlich einen Film auf der Zitzenhaut, war ein signifikanter Rückgang der durch coliforme
Bakterien verursachten Mastitiden zu beobachten. Die Neuinfektionsrate von durch
umweltassoziierte Streptokokken verursachte Mastitiden hingegen wurde nicht beeinflusst
(HOGAN et al. 1995), da sie sich hauptsächlich zwischen den Melkzeiten ereignet.
Das zeitliche Auftreten durch unterschiedliche Erreger verursachter Mastitiden wird innerhalb
der Literatur unterschiedlich beurteilt. Sowohl coliforme Keime als auch umweltassoziierte
Streptokokken verursachen häufiger zu Beginn der Laktation Mastitiden. Mastitiden sind im
Sommer und Herbst häufiger als in Winter und Frühling. Begünstigend scheint hier das Klima
zu wirken, da bei hoher Luftfeuchtigkeit und Temperatur die Abwehrmechanismen der Kühe
beeinträchtigt werden. Die Vermehrung coliformer Keime in der Einstreu wird gleichzeitig
25
begünstigt. Die Erregerdichte der Streptokokken bleibt allerdings durch das Klima
unbeeinflusst (SMITH et al. 1985a, HOGAN et al. 1989a, TODHUNTER et al. 1995, COSTA
et al. 1998). Andererseits beobachteten GONZALEZ et al. (1990) eine Häufung klinischer
Umweltmastitiden in den Wintermonaten, und JAYARAO et al. (1999) beschreiben für S.
uberis die höchste Infektionsrate um den Kalbezeitpunkt und in der frühen bzw. späten
Laktationsphase, ohne einen Bezug zur Jahreszeit feststellen zu können. Die Prävalenz für
Euterinfektionen durch S. uberis liegt im Durchschnitt bei 12 – 16% pro Herde und Jahr.
Umweltmastitiden sind im Allgemeinen durch eine relativ kurze Dauer gekennzeichnet. Die
Krankheitsdauer von durch coliforme Bakterien verursachte Mastitiden beträgt im
geometrischen Mittel 9,1 Tage, die bei Streptokokken-Mastitiden 17 Tage, nach
Untersuchungen von TODHUNTER et al. (1995) bei Auftreten in der Laktation sogar nur 12
Tage. Zwei Drittel der Umweltstreptokokken-Mastitiden sind schon nach neun Tagen
ausgeheilt und nur 13% bzw. 18% dieser Mastitiden entwickeln sich zu chronischen
Euterentzündungen mit einer Verlaufsdauer von über 100 Tagen. Zudem werden 55,2% der
coliformen Keime und 38,5% der Umweltstreptokokken ohne eine Mastitis auszulösen durch
die körpereigene Abwehr des Euters eliminiert. 41% der durch gramnegative Bakterien
ausgelösten Mastitiden heilen nach Untersuchungen von TODHUNTER et al. (1991) innerhalb
von acht Tagen aus, während die mittlere Infektionsdauer nach Untersuchungen von LAM et al.
(1997) für E. coli 65,1 Tage und für S. uberis 95,1 Tage beträgt. Andererseits gelang es
FRITON et al. (1998) schon vier Wochen nach der Diagnose einer subklinischen Mastitis nicht
mehr, den ursächlichen S. uberis im betroffenen Viertel nachzuweisen. Alle anderen
Streptokokken-Spezies waren zu diesem Zeitpunkt noch nachweisbar.
Durch molekulargenetische Methoden war bei wiederholtem Nachweis von
Umweltstreptokokken einerseits ein Erregerwechsel in dem betroffenen Euterviertel,
andererseits aber auch ein Persistieren des identischen Stammes über die Trockenstehperiode
feststellbar (OLIVER et al. 1998, WANG et al. 1999).
Umwelt-Mastitiden verlaufen zum Teil klinisch. Vor allem gram-negative Erreger verursachen
nur selten subklinische Krankheitsverläufe der Euterentzündungen. Während die durch S.
uberis ausgelösten Mastitiden überwiegend subklinisch verlaufen, sind dem gegenüber die
durch coliforme Erreger verursachten Mastitiden akut bis perakut und können hohes Fieber und
schwere Allgemeinstörungen verursachen. Diese treten meistens in den ersten beiden Monaten
nach der Abkalbung auf, besonders in den ersten Tagen nach dem Kalben (SMITH et al. 1985a,
HOGAN et al. 1989, GONZALEZ et al. 1990, TODHUNTER et al. 1991, BERGMANN 1994,
COSTA et al. 1998).
26
Die Antibiotikabehandlung in der Laktation hat bei durch umweltassoziierte Erreger
verursachten Mastitiden eine bakteriologische Heilungsrate von 70% bis 80%, bei
Umweltstreptokokken sogar von 80% bis 100%. FRITON et al. (1998) untersuchten
unterschiedliche Applikationsarten von Antiinfektiva zur Mastitisbehandlung und kamen zu
den besten Erfolgen bei einer kombinierten intrazisternalen und parenteralen Behandlung. Die
Erfolge bei rein parenteraler Behandlung waren geringgradig schlechter, sanken bei S.
dysgalactiae sogar auf 40%. TYLER und BAGGOTT (1992) sind der Ansicht, dass es besser
wäre, die Behandlung auf klinische Fälle zu beschränken.
Umweltassoziierte Mastitiserreger können das Euter auch während der Trockenstehperiode
infizieren. Dabei kommt eine Infektion mit coliformen Erregern, vergleichbar mit den
Befunden während der Laktationsperiode, in den Sommermonaten häufiger vor als im
Winterhalbjahr. Ältere Kühe sind stärker betroffen als jüngere. Bei umweltassoziierten
Streptokokken sind diese jahreszeitlichen Unterschiede nicht feststellbar (SMITH et al. 1985a).
Besonders gefährdet sind die Euter zu Beginn und zum Ende der Trockenstehperiode. Nach der
Involution verfügt das Drüsengewebe über eine ausgeprägte Widerstandskraft. In den
Übergangsphasen zwischen Laktation und Trockenstehperiode jedoch ist eine erhöhte
Infektionshäufigkeit für gramnegative Bakterien nachweisbar (SMITH et al. 1985,
TODHUNTER et al. 1991). Durch die hohe Empfindlichkeit von Streptokokken gegenüber den
zum Trockenstellen verwendeten Langzeitantiinfektiva kommt der antibiotischen Behandlung
eine große Bedeutung in der Trockenstehphase zu. Mit antibiotischen Langzeitpräparaten
trockengestellte Kühe erkranken signifikant weniger häufig als unbehandelt trockengestellte,
wobei sich der Schutz besonders auf die ersten vier Wochen der Trockenstehphase auswirkt.
Über die Hälfte der Erreger jedoch persistieren über das Ende der Trockenstehphase hinaus im
Euter, werden aber zum großen Teil bakterienspezies-unabhängig innerhalb der ersten
Laktationswoche spontan eliminiert. Nur ein kleiner Teil der Mastitiserreger besiedelt über die
ersten 30 Tage hinaus das Euter. Durch experimentelle Infektionen mit E. coli konnten
McDONALD und ANDERSON (1981) zeigen, dass in der frühen Trockenstehphase infizierte
Euter den Erreger vor Eintritt in die Laktation eliminieren, während bei Kühen bei einem
späteren Infektionszeitpunkt (4 Wochen vor dem Abkalben) ein geringer Teil der Erreger
persistieren konnte und zu Beginn der Laktation eine perakute Mastitis verursachte. SMITH et
al. (1985) beobachteten hingegen, dass Infektionen auch in der ersten Hälfte der
Trockenstehphase häufig einen chronischen Verlauf nehmen. Dabei sind klinische Verläufe
häufig anzutreffen.
27
2.6.1.3 Minorpathogene Bakterien
Neben der Einteilung in kontagiöse und umweltassoziierte Mastitiserreger wird zwischen
minor- und majorpathogenen Bakterien unterschieden. Als majorpathogen werden die bereits
beschrieben Mastitiserreger bezeichnet. Die Bedeutung der Minorpathogenen als
Mastitiserreger ist umstritten, da sie das Euter zwar infizieren und auch eine
Entzündungsreaktion provozieren können, aber meistens nur milde, subklinische Mastitiden mit
einer geringgradigen Zellzahlerhöhung auslösen (RÖDER 1985). Zu ihnen gehören alle
koagulase-negativen Staphylokokken (KNS), C. bovis und verschiedene Micrococcus-Spezies.
C. bovis ist nach seinem epidemiologischen Verhalten als kuhassoziierter Mastitiserreger
einzustufen, während die KNS nach ihrer epidemiologischen Charakteristik den
umweltassoziierten Erregern zuzuordnen sind (BRAMLEY und DODD 1984, SCHUKKEN et
al. 1988).
Kontrovers diskutiert wird die Bedeutung der minorpathogenen Bakterien als Auslöser eines
möglichen Schutzeffektes gegenüber Infektionen durch Majorpathogene. Bei verschiedenen
experimentellen Studien und Beobachtungen in bezüglich der Eutergesundheit unauffälligen
Milcherzeugerbetrieben konnte durch C. bovis und KNS eine gewisse Schutzwirkung
gegenüber Infektionen durch S. aureus oder andere Mastitiserreger beobachtet werden. Lagen
hohe Infektionsraten mit Minorpathogenen vor, waren weniger klinische Mastitiden feststellbar
(POUTREL und LERONDELLE 1980, RAINARD und POUTREL 1988, SCHUKKEN et al.
1989, MATTHEWS et al. 1991, SCHUKKEN et al. 1999). Auch RÖDER (1985) fand bei
Mischinfektionen mit Minor- und Majorpathogenen signifikant niedrigere Zellzahlen in der
Milch gegenüber Monoinfektionen mit Majorpathogenen.
Weitere Untersuchungen ergaben eine Korrelation zwischen der S. aureus-Infektionsrate und
der Höhe des Zellgehaltes. Mit steigender Zellzahl durch Infektion mit minorpathogenen
Bakterien sank die S. aureus-Infektionsrate, bis bei einem Zellgehalt von 500.000 Zellen pro ml
ein vollständiger Schutz gegen S. aureus auftrat (POUTREL und LERONDELLE 1980,
MATTHEWS et al. 1991). Dieser Schutz wird durch den erhöhten Zellgehalt in der Milch
erklärt, der eine bessere und schnellere Eliminierung der eingedrungenen Erreger ermöglichen
soll.
Die Untersuchungen von HOGAN et al. (1988) hingegen ergaben, dass die Anwesenheit von
Minorpathogenen im Euter Infektionen mit Umwelt-Streptokokken begünstigt. Während durch
C. bovis und KNS gegenüber coliformen Keimen protektive Effekte auftraten, verzeichneten
die Autoren eine signifikant höhere Infektionsanfälligkeit gegenüber Umwelt-Streptokokken.
Nach BEAUDEAU et al. (1998) steigt mit steigendem Zellgehalt das Risiko einer klinischen
28
Mastitis an, während Viertel mit einem Zellgehalt von weniger als 100.000 Zellen pro ml Milch
keine Tendenz zu einer erhöhten Infektionsrate zeigen. Ihrer Ansicht nach ist ein durch eine
Infektion mit minorpathogenen Bakterien erhöhter Zellgehalt nicht geeignet, vor Infektionen
durch Majorpathogene zu schützen. Durch die negativen Effekte auf das infizierte Euter, wie
Entzündung und Milchrückgang erscheint ein „prophylaktischer“ Einsatz von Minorpathogenen
deshalb ungeeignet (HOGAN et al. 1988, RAINARD und POUTREL 1988).
29
3
Material und Methoden
3.1 Untersuchungsmaterial
Insgesamt wurden 115 S. canis-Isolate von Viertelgemelksproben aus 16 hessischen
Milcherzeugerbetrieben (s. Tab. 3.1.1-1) in die Untersuchung einbezogen. Es handelte sich bei
diesen um Milcherzeuger, die durch die Milchhygieneüberwachung bereits als S. canisProblembetriebe ermittelt wurden. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Untersuchung
erneut während der Melkzeit aufgesucht, es wurden Viertelgemelksproben von allen
laktierenden Tieren genommen (s. 3.1.2) und diese der Untersuchung (s. 3.1.3) zugeführt.
Wurden bei diesen Untersuchungen S. canis-Isolate gefunden, wurden sie in die
Stammsammlung aufgenommen.
73 der 115 Isolate stammten aus der Erstuntersuchung, 35 der 115 Feldisolate stammten aus der
ersten Nachuntersuchung und 4 Isolate stammten aus der zweiten Nachuntersuchung.
Außerdem wurde bei drei Betrieben S. canis in der Tankmilch festgestellt. Diese Isolate wurden
ebenfalls in die vorliegende Untersuchung mit einbezogen.
Zur Sanierung des Bestandes wurde mit dem Landwirt ein Konzept, bestehend aus
Verbesserung der Melkhygiene, Antibiotika-Behandlung nach Antibiogramm und Merzen
chronisch kranker Kühe, erstellt. In den Betrieben wurden in größer werdenden Abständen
(erste Nachuntersuchung nach ca. 8 Wochen, zweite Nachuntersuchung ca. 6 Monaten nach der
ersten NU und dritte Nachuntersuchung ca. 12 Monaten nach der zweiten NU) alle laktierenden
Kühe so lange beprobt, bis in den Viertelgemelksproben kein S. canis mehr festgestellt werden
konnte. Dies war meistens schon bei der ersten, spätestens aber bei der dritten
Nachuntersuchung der Fall.
Die Anzahl der S. canis-Isolate betrug ein bis 24 Isolate pro Bestand, wobei aus diesem
Bestand nur 12 willkürlich ausgewählte Isolate weiter untersucht (s. 3.8 ff) wurden.
30
Twistetal
Frankenberg
Sontra
Wohratal
Kirchhain
Schwalmstadt
Schröck
Niederaula
Amöneburg
Lahnau
Weinbach
Nidda
Münzenberg
Biblis
Rimbach
Mossautal
Abb.3.1.1-1: Geographische Lage der in die Untersuchung
einbezogenen Milcherzeugerbetriebe innerhalb Hessens
31
3.1.1
Milcherzeugerbetriebe
Tab.3.1.1-1: Herkunft der untersuchten S. canis-Kulturen
Bes tand
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
Ges amt
3.1.2
Gemeinde
Nidda
Twis tetal
Frankenberg
Lahnau
W ohratal
M os s autal
Schröck
Kirchhain
Rimbach
M ünzenberg
A möneburg
Schwalms tadt
Niederaula
W einbach
Sontra
Biblis
Landk reis
W etterau
W aldeck-Frankenberg
W aldeck-Frankenberg
Lahn-Dill-Kreis
M arburg-Biedenkopf
Odenwaldkreis
M arburg-Biedenkopf
M arburg-Biedenkopf
Bergs traße
W etterau
M arburg-Biedenkopf
Schwalm-Eder-Kreis
Hers feld-Rotenburg
Limburg-W eilburg
W erra-M eißner-Kreis
Bergs traße
Anzahl der Proben
144
100
28
48
296
196
112
356
72
1
244
172
48
96
496
52
2461
Probennahme
Die Probennahmen erfolgten gemäß den Leitlinien „Entnahme von Milchproben unter
antiseptischen Bedingungen“ (DVG, 2000).
Dazu wurden Milchröhrchen (Greiner, Frickenhausen) verwendet. Ein Konservierungsmittel
wurde nicht eingesetzt, da die Proben noch am Tag der Entnahme im Labor bearbeitet
wurden.
Die Desinfektion der Zitzenkuppe wurde mit 98%igem Ethanol (Merck, Darmstadt) aus einer
Spritzflasche durchgeführt. Für die zur Reinigung benötigten Tupfer wurde Zellstoff
verwendet, der mit dem Alkohol aus der Spritzflasche getränkt war. Für jede Zitzenkuppe
wurde ein neuer Tupfer verwendet.
Die Proben wurden jeweils zur Melkzeit als Viertelanfangsgemelke entnommen.
Dazu wurden zunächst die ersten Milchstrahlen jeder Zitze im Vormelkbecher auf sinnfällige
Veränderungen geprüft. Anschließend wurde das Euter sorgfältig gereinigt, bei starker
Verschmutzung gegebenenfalls auch mittels Leitungswasser und anschließend gründlich mit
Einmalpapier getrocknet. Darauf folgte die Desinfektion der Zitzenkuppen und der
Strichkanalöffnungen, wobei die abgewandten Zitzen zuerst, die dem Probennehmer nahen
Zitzen zuletzt gereinigt wurden. Die Probennahme selbst erfolgte in umgekehrter Reihenfolge,
wobei die ersten Milchstrahlen erneut verworfen und die folgenden in jeweils eines der
32
vorbereiteten Röhrchen gemolken wurden. Die Öffnung der Röhrchen erfolgte erst
unmittelbar vor den Probennahmen; sofort anschließend wurden sie wieder verschlossen. Der
Verschlussstopfen wurde vor Kontamination geschützt, indem er in der Hand mit der
Innenseite nach unten gehalten wurde, ohne die Innenseite zu berühren. Um weitere
Kontaminationsgefahren zu minimieren, wurden die geöffneten Röhrchen während der
gesamten Probennahme möglichst horizontal gehalten.
Tankmilchproben wurden mit einem sterilisierten Schöpflöffel direkt aus dem
Milchsammelbehälter entnommen. Ca. 200 ml der Tankmilch wurden in eine sterile
Probenflasche mit 500 ml Fassungsvermögen (Schott, Mainz) überführt.
Nach Beendigung der Probennahme wurden die Proben unverzüglich bei +4 bis +8°C gekühlt.
3.1.3
Laboruntersuchung
Sämtliche Proben wurden unmittelbar nach dem Eintreffen im Labor gemäß den Leitlinien zur
Isolierung und Identifizierung von Mastitiserregern (DVG, 2000) zytobakteriologisch
untersucht.
3.1.3.1 Zellzahlbestimmung
Die Zellzahlbestimmung erfolgte mittels Fossomatic® 360 (Foss Electric A/S, Dänemark).
Dazu wurde die Probe zunächst im Wasserbad (Lauda, Lauda-Königshofen) auf 16° bis 18°C
erwärmt. Da sich die Zellen üblicherweise in der abgesetzten Rahmschicht befinden, wurden
die Proben vor dem Einsetzen in das Zellzählgerät durch mehrfaches Stürzen über Kopf
durchmischt. Nach dem Einsetzen in das Zellzählgerät wurde die Probe dann nochmals
automatisch aufgerührt. Die Entnahme einer definierten Milchmenge von 2 ml erfolgte
maschinell. Die DNA der Zellkerne enthaltenden Zellen wurden mittels Ethidiumbromid
(Sigma, Steinheim) gefärbt und anschließend elektronisch ausgezählt.
3.1.3.2 Kulturell-bakteriologische Untersuchung
Die kulturell-bakteriologische Untersuchung der Milchproben erfolgte in Anlehnung an die
Leitlinien „Isolierung und Identifizierung von Mastitiserregern“ (DVG, 2000). Dazu wurden die
Milchproben auf Nähragar (Merck, Darmstadt) mit einem Zusatz von 10% Rinderblut (Fiebig,
Idstein/Taunus) und 0,1% Äskulin (Äskulin-Blutagar; Merck, Darmstadt) ausgestrichen. Die
Beimpfung der Kulturmedien erfolgte mit einem Glasstab, wobei ein Tropfen jeder
Viertelgemelksprobe (ca. 10 µl) auf einem Viertel der Äskulin-Blutagar-Platte ausgestrichen
33
wurde. Die beimpften Äskulin-Blutagar-Platten wurden bei 37°C bebrütet und nach 24 und 48
Stunden beurteilt.
3.1.3.3 Differenzierung S. canis-verdächtiger Isolate
Morphologisch verdächtige Kolonien mit Bildung einer vollständigen β-Hämolyse auf ÄskulinBlutagar wurden anschließend auf Äskulin-Blutagar subkultiviert. Der Äskulin-Blutagar setzte
sich wie folgt zusammen:
Columbia-Agar-Basis (Merck, Darmstadt)
Spezial-Nährsubstrat
42,0 g
23,0 g
Stärke
1,0 g
NaCl
5,0 g
Agar-Agar
Äskulin
bestehend aus
13,0 g
2,5 g
Rinderblut
71,4 ml
Aqua dest.
ad 1000 ml
Zur weitergehenden Differenzierung wurde zunächst eine Bestimmung der Lancefield-Gruppe
(s. 3.3.2.) durchgeführt. Anschließend erfolgte die Beurteilung der biochemischen
Eigenschaften. Zudem wurde eine Speziesbestimmung mittels t-DNA-PCR durchgeführt.
3.2 Anzüchtungsmedien und Kultivierung
Die Fortzüchtung der Bakterienkulturen erfolgte auf Columbia-Schafblut-Agar. Das Medium
setzt sich wie folgt zusammen:
Columbia-Agar-Basis (Oxoid, Wesel):
Pepton
23,0 g
Stärke
1,0 g
NaCl
5,0 g
Agar
10,0 g
Aqua dest
ad 1000,0 ml
pH: 7,3 ± 0,2
Der Columbia-Agar wurde nach dem Autoklavieren (121°C für 15 min) auf 45 – 50°C
abgekühlt. Danach wurde 5% steril entnommenes, defibrilliertes Schafblut (Fiebig,
Idstein/Taunus) zugesetzt.
34
Die Kultivierung im Flüssigmedium erfolgte entweder in Serumbouillon (SB; Standard-IBouillon, Merck, Darmstadt) mit Zusatz von Rinderserum (Fiebig, Idstein/Taunus) oder in
Todd-Hewitt-Broth (THB, Oxoid, Wesel).
Die Zusammensetzung der Medien ist nachfolgend zusammengestellt:
Serum-Bouillon (Rezept LHL):
Peptone
15,0 g
Hefeextrakt
3,0 g
NaCl
6,0 g
D-Glukose
1,0 g
Aqua dest.
ad 1000,0 ml
Todd-Hewitt-Broth (Oxoid, Wesel):
Fleischinfusion (aus 450g fettfreiem Rinderhackfleisch)10,0 g
Caseinpepton
20,0 g
Glukose
2,0 g
Natriumbicarbonat (NaHCO3)
2,0 g
NaCl
2,0 g
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 2 H2O)
0,4 g
Aqua dest.
ad 1000,0 ml
pH: 7,8 ± 0,2
Beide Medien wurden in Portionen zu je 5 ml in Reagenzgläsern abgefüllt, mit Gummistopfen
verschlossen und bei 121°C für 15 min (SB) bzw. 115°C für 10 min (THB) autoklaviert.
Die Anzüchtung erfolgte bei 37°C für 24 bis 48 Stunden unter aeroben Bedingungen.
Die im Laufe der Untersuchung isolierten S. canis-Isolate wurden zur Aufbewahrung in
Rinderserum, das 6% Glukose enthielt, suspendiert, in Eppendorf-Gefäße (Eppendorf AG,
Hamburg) abgefüllt und bei –70°C bis zum Beginn weitergehender Untersuchungen
aufbewahrt.
3.3 Identifizierung
3.3.1
Kulturmorphologie und Hämolyseformen
Die Wiederanzüchtung der Bakterienkulturen erfolgte auf Columbia-Schafblut-Agar (s. 3.2).
Die Agarplatten wurden mittels fraktioniertem Ausstrich beimpft und für 24 bzw. 72 Stunden
35
bei 37°C aerob bebrütet. Die gewachsenen Kulturen wurden zunächst nach der Koloniegröße
und der Erscheinungsform der Hämolyse beurteilt.
3.3.2
Biochemische Eigenschaften
Zur Untersuchung der biochemischen Eigenschaften isolierter Streptokokkenkulturen wurde
das Api 20 Strep System (BioMerieux, Nürtingen) verwendet. Der Test wurde den
Herstellerangaben entsprechend durchgeführt. Dabei wurden die im Folgenden aufgeführten
Eigenschaften der Streptokokkenkulturen untersucht.
3.3.2.1 Abbau von Kohlenhydraten
Als Grundmedium dient beim Api 20 Strep System ein Substrat aus Cystin (0,50g), Trypton
(20,00g), Natriumchlorid (5,00g), Natriumsulfit (0,50g), Phenolrot (0,17g) und
demineralisiertem Wasser (ad 1000ml), dem Ribose, L-Arabinose, Mannitol, Sorbitol, Laktose,
Trehalose, Inulin, Raffinose, Stärke und Glykogen beigegeben wurde. Bei positiver
Abbaureaktion zeigt sich nach aerober Inkubation im Brutschrank (24h, 37°C) ein
Farbumschlag des Indikators Phenolrot von rot nach gelb.
3.3.2.2 Enzymnachweis mit 2-Naphtyl-konjugierten Substraten
Zum Nachweis bakterieller Enzymaktivität dienten verschiedene 2-Naphtyl-konjugierte
Substrate. Durch Abspaltung des Naphtyl-Komplexes erfolgt ein Farbumschlag.
Enzyme und enzymabhängige Substrate sowie die zu erwartende Farbreaktion sind in Tabelle
3.3.1-1 zusammengestellt.
Tab. 3.3.1-1: Enzyme, Substrate und die dabei zu erwartende Farbreaktion
Farbreaktion
biochem. Parameter
Substrat
von
nach
Pyrolidon-Arylamidase
Pyrrolidonyl-2-Naphtylamid
farblos orange
a-Galactosidase
6-Bromo-2-Naphtyl-a-D-Galactopyranosid
farblos violett
ß-Glucuronidase
Naphtol-AS-BI-ß-D-Glucoronat
farblos blau
ß-Galactosidase
2-Naphtyl-ß-Galactopyranosid
farblos (hell) violett
Leucin-Arylamidase
L-Leucin-2-Naphtylamid
farblos orange
36
Der Farbumschlag erfolgt bei den genannten Reaktionen bereits nach vierstündiger Bebrütung
bei 37°C und Zugabe der Reagenzien Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan (25g), HCl
37% (11 ml), Laurylsulfat (10 g) und demineralisiertem Wasser (ad 100 ml) bzw. Fast Blue BB
(0,35 g) und 2-Methoxy-Ethanol (ad 100 ml). Der Farbumschlag wurde nach Zugabe der
Reagenzien und Inkubation für 10 min bei Zimmertemperatur beurteilt.
3.3.2.3 Hydrolyse von Natrium-Hippurat
Die Fähigkeit, Natrium-Hippurat zu hydrolysieren, wurde durch die Reaktion mit Nin-Reagenz
(Ninhydrin 7g, 2-Methoxy-Ethanol ad 100 ml) nachgewiesen. Dazu wurde Natrium-Hippurat
mit einer Bakteriensuspension versetzt und 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Danach wurde NinReagenz hinzugegeben, welches beim Vorliegen hydrolytischer Spaltprodukte nach höchstens
10 min eine blaue Farbe annimmt.
3.3.2.4 Spaltung von Arginin
Zum Nachweis der Arginindihydrolase wurde die Bakteriensuspension mit Arginin versetzt.
Verfügen die Bakterien über Arginindihydrolase, erfolgt durch Bildung von Spaltprodukten
nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C ein Farbumschlag von gelb nach rot.
3.3.3
Bestimmung der Lancefield-Gruppe
Der Nachweis der Lancefield-Gruppe wurde mittels Objektträgeragglutination unter
Verwendung von an S. aureus (Cowan I) gebundenen spezifischen Antikörpern (CoAgglutination) gegen das Lancefield-Gruppenantigen G durchgeführt (Oxoid, Wesel). Als
Kontrollreagenz wurden an S. aureus gebundene Antikörper ohne Spezifität verwendet. Zur
Testdurchführung wurde etwas Koloniematerial einer Reinkultur der auf Äskulin-Blutagar
gezüchteten, zu untersuchenden Streptokokkenkultur mittels Platinöse sowohl in einem
Tropfen des Testreagenz als auch in einem Tropfen des Kontrollreagenz auf einem vom
Hersteller mitgelieferten Reaktionsträger verrieben. Positiv gewertet wurde eine deutlich
sichtbare Agglutination im Test bei fehlender Reaktion im Kontrollansatz.
37
3.3.4
Molekulare Identifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.3.4.1 Analyse des t-RNA-Gens
Die Identifizierung mittels t-DNA-PCR wurde nach der Methode von MCCLELLAND et al.
(1992) durchgeführt. Dabei wurde von jeder Bestandsprobennahme ein willkürlich
ausgesuchter Bakterienstamm mit dem Streptococcus-canis-Referenzstamm S. canis ATCC 43
496 verglichen und gegen eine Negativkontrolle (Aqua dest.) geprüft.
3.3.4.1.1
Aufbereitung der bakteriellen DNA
Von den Feldisolaten wurden Reinkulturen auf Columbia-Schafblut-Agar ausgestrichen und
bei 37°C für 24 h aerob bebrütet. 2 Ösen Koloniematerial der zu untersuchenden
Streptokokkenkultur wurden in ein vorher gekennzeichnetes Eppendorf-Gefäß (Eppendorf
GmbH, Hamburg) mit 50 µl TE-Puffer und 1 µl Lysostaphin (Sigma, Steinheim)
suspendiert, für 15 min im Wasserbad gekocht und bei 10.000 U/min 5 min abzentrifugiert
(Eppendorf GmbH, Hamburg). Der TE-Puffer setzte sich wie folgt zusammen:
Tris-HCl (10 mmol/l)
1,21 g
EDTA (1 mo/l)
372,50 mg
Aqua dest.
1000,00 ml
pH: 7,5
Unter sterilen Bedingungen wurde der Mastermix nach dem folgenden, für jeweils einen
Reaktionsansatz geltenden Protokoll pipettiert:
Aqua dest
14,75 µl
10x Polymerasepuffer (Sigma, Steinheim)
2,00 µl
dNTP-Mix (Perkin-Elmer, Crailsheim)
0,40 µl
Primer T3 (MWG-Biotech, Ebersberg)
0,80 µl
Primer T5 (MWG-Biotech, Ebersberg)
0,80 µl
Polymerase (Promega, Mannheim)
0,25 µl
Tab. 3.3.4.1-1: Sequenzen der verwendeten Primer
Primer
Sequenz
T3
5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG -3'
T5
5'-CGTTGCCTTGACCACTTTC -3'
38
Bei mehreren Reaktionsansätzen wurden die angegebenen Mengen mit der Anzahl der
Reaktionsansätze multipliziert und der Mastermix in Portionen von je 19,0 µl in
nummerierte Reaktionsgefäße pipettiert. Je 1,0 µl der entsprechenden Proben in TE-Puffer
wurden in die Reaktionsgefäße überführt, bei geschlossenem Deckel gut durchmischt und
anschließend zentrifugiert (30 sec., 13.000 U/min).
Alle Reaktionen wurden in dünnwandigen, sterilen 0,2 ml-Reaktionsgefäßen (Eppendorf
GmbH, Hamburg) durchgeführt und zur Vermeidung unspezifischer Reaktionen auf Eis
pipettiert.
3.3.4.1.2
DNA-Replikation durch die PCR
Die Amplifikation selbst wurde in einem DNA-Thermal-Cycler (Perkin-Elmer Gene Amp 2400
PCR System, Darmstadt-Weiterstadt) durchgeführt.
Nach einer 5-minütigen Denaturierungsphase bei 94° C wurden folgende Reaktionsschritte 40
mal wiederholt:
Denaturierung:
30 sec bei
94° C
Annealing:
30 sec bei
50° C
Extension:
120 sec bei
72° C
Nach Ablauf des letzten Zyklus erfolgte eine 7-minütige Extensionsphase bei 72° C.
Anschließend wurden die Proben bis zur Entnahme auf 4° C im Thermocycler heruntergekühlt.
3.3.4.1.3
Elektrophorese
0,7 g Agarose (Biorad, München) wurde mit 35 ml 1x TBE-Puffer bis zur Klärung der Lösung
erhitzt. Als Ausgangspuffer diente 10x TBE-Puffer, der wie folgt zusammengesetzt war:
EDTA (50 mmol/l)
40 ml
Borsäure
55 g
Tris-Basis
108 g
Aqua dest. ad
1000 ml
pH: 8,0
Die abgekühlte Agaroselösung wurde in eine vorbereitete Elektrophoresekammer (Biorad,
München) mit eingesetztem Kamm gegossen, Luftbläschen wurden vorsichtig entfernt. Nach
dem vollständigen Erkalten des Gels wurde der Kamm entfernt, so dass Slots zum Einfüllen des
Probenmaterials entstanden. Das Gel wurde dann 0,5 cm mit 1x TBE-Lösung als Laufpuffer
überschichtet. Die aufbereiteten Proben wurden 10%ig mit Ethidiumbromid angefärbt. Pro Slot
39
wurden mindestens 8 µl Probenmaterial bzw. Marker eingefüllt.
Nach Durchführung der 60-minütigen Elektrophorese bei 100 V wurde das Gel in einer
Ethidiumbromid-Lösung (2,5 µl Ethidiumbromid (Sigma, Steinheim), 50 ml steriles
demineralisiertes Wasser) für 20 min unter leichtem Schwenken eingefärbt und gewaschen. Die
Auswertung des Gels erfolgte mittels der UV-Kammer (Biorad, München).
3.3.4.2 Analyse des 16S rRNA-Gens
Für die Identifizierung mittels der PCR-Analyse des 16S rRNA-Gens wurden die für die
Untersuchung mittels t-RNA-PCR untersuchten Stämme der verschiedenen Bestandsproben
nach der von HASSAN et al. (2003) beschriebenen Methode mit dem Streptococcus-canisReferenzstamm S. canis ATCC 43 496 verglichen.
3.3.4.2.1. Aufbereitung der bakteriellen DNA
Zur Aufbereitung der „template“-DNA wurde die von BENTLEY et al. (1993) beschriebene
und durch ABDULMAWJOOD und LÄMMLER (1999) modifizierte Methode angewandt.
Von den Feldisolaten wurden Reinkulturen auf Columbia-Schafblut-Agar ausgestrichen und
bei 37°C für 24 h aerob bebrütet. Fünf bis zehn Kulturen der zu untersuchenden
Streptokokkenstämme wurden in ein mit 100 µl TE-Puffer beschicktes, vorher
gekennzeichnetes Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht) mit einem Fassungsvermögen von
1,5 ml suspendiert. Der TE-Puffer setzte sich wie folgt zusammen:
Tris-HCl (10 mmol/l)
EDTA (1 mo/l)
Aqua dest. ad
1,21 g
372,50 mg
1000,00 ml
pH: 8,0
Durch die Zugabe von 5µl Mutanolysin (10 U/µl; Sigma, Deisenhofen) zu der jeweiligen
Suspension und die anschließende Inkubation für 60 min bei 37°C im Wasserbad wurde die
Lysis der Bakterienzellwand erreicht. Die Deproteinisierung erfolgte durch Zugabe von 10µl
Proteinase K (14,8 mg/ml; Boehringer, Mannheim) und Inkubation im Wasserbad bei 56°C
für 120 min, durch Kochen der Probe für zehn Minuten wurde anschließend die Proteinase K
inaktiviert. Danach wurde die Probe für 15 s bei 10000 U/min zentrifugiert (Zentrifuge 3200,
Netheler & Hinz GmbH, Eppendorf) und 2,5 µl des Überstandes als „template“ in die PCR
eingesetzt.
40
Unter sterilen Bedingungen wurde der Mastermix nach dem folgenden, für jeweils einen
Reaktionsansatz geltenden Protokoll pipettiert:
Aqua bidest.
19,9 µl
Inkubationspuffer (10x Buffer; Promega, Mannheim)
3,0 µl
MgCl2 (25 mmol/l; Promega, Mannheim)
1,8 µl
dNTP-Mix (10 mmol/l; MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
0,6 µl
Primer can I (MWG-Biotech, Ebersberg)
1,0 µl
Primer can II (MWG-Biotech, Ebersberg)
1,0 µl
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl; Promega, Mannheim)
0,2 µl
Tab. 3.3.4.2-1: Sequenzen der verwendeten Primer
Primer
Sequenz
can I
5'-AGTGCTTAACACATGTTAAGAA-3'
can II
5'-GATAGATGATTGGGGTGAAG-3'
Bei mehreren Reaktionsansätzen wurden die angegebenen Mengen mit der Anzahl der
Reaktionsansätze multipliziert und der Mastermix in Portionen von je 27,5 µl in
nummerierte 0,2 ml-Reaktionsgefäße (Sarstedt, Nümbrecht) pipettiert. Diese Einzelportionen
wurden mit jeweils 2,5 µl der nach 3.3.4.2.1 präparierten DNA versetzt und gut durchmischt.
3.3.4.2.2. DNA-Replikation durch die PCR
Die Amplifikation selbst wurde in einem Thermo-Cycler (Techne-Progene, Thermodux,
Wertheim) durchgeführt.
Nach einer 4-minütigen Denaturierungsphase bei 94 °C wurden folgende Reaktionsschritte
30 mal wiederholt:
Denaturierung:
60 s bei
94 °C
Primeranlagerung:
90 s bei
58 °C
Polymerisierung:
90 s bei
72 °C
Nach Ablauf des letzten Zyklus erfolgte eine 5-minütige Renaturierungsphase bei 72° C.
Anschließend wurden die Proben bis zur Entnahme auf 4 °C im Thermocycler
heruntergekühlt.
41
3.3.4.2.3. Elektrophorese
2,2 g Agarose (Roth, Karlsruhe) wurde mit 110 ml 1x Tris-Acetat-Puffer (TAE) bis zur
Klärung der Lösung erhitzt. Als Ausgangspuffer diente 50x TAE-Puffer, der wie folgt
zusammengesetzt war:
Tris-Basis (40 mmol/l; Roth, Karlsruhe)
Eisessig (1,14 mol/l)
EDTA (0,5 mol/l)
Aqua dest. ad
242,0 g
57,1 ml
100,0 ml
1000,0 ml
pH: 7,8
Die auf 56 °C abgekühlte Agaroselösung wurde in eine vorbereitete Elektrophoresekammer
(Biorad, München) mit eingesetztem Kamm gegossen, Luftbläschen wurden vorsichtig
entfernt. Nach dem vollständigen Erstarren des Gels bei Raumtemperatur wurde der Kamm
entfernt, so dass Slots zum Einfüllen des Probenmaterials entstanden. Je 12 µl des PCRGemisches wurden mit 3 µl einer 6x „Loading Solution“ (MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
vermischt, in die einzelnen Gelkammern pipettiert und bei 120 mA für 2,5 h in einer
Elektrophoresekammer aufgetrennt. Dabei diente 1x TAE-Puffer als Laufpuffer, als
Längenstandard für die Bestimmung der Größe des PCR-Produkts wurde eine 100 Bp DNA
Ladder (Gibco BLR, Eggenstein) verwandt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einer Ethidiumbromid-Lösung (5 µg/ml; Sigma,
Steinheim) für 5 min angefärbt. Das überschüssige Ethidiumbromid wurde durch 20minütiges Schwenken bei Raumtemperatur entfernt, danach wurde das Gel in der UVKammer (Biorad, München) ausgewertet.
42
3.4 Erstellung eines „DNA-Fingerprints“
Epidemiologisch verwandte Bakterienstämme aus einem gemeinsamen Vorläuferstamm haben
gemeinsame, genetisch codierte Eigenschaften, die nicht verwandten Bakterienstämmen fehlen.
In der Diagnostik verwendbar werden diese Eigenschaften, wenn sie eine große Stabilität im
entsprechenden Bakterienstamm, aber gleichzeitig eine ausreichende Diversität in der Spezies
aufweisen. Diese Diversität entsteht durch zufällige, nicht letale Mutationen. Außerdem müssen
diese Mutationen an Stellen auftreten, die mit heutigen Nachweismethoden erfasst werden
können, um sie für die epidemiologische Diagnostik einsetzen zu können (MASLOW et al.
1993)
RÖMLING und TUMMLER (1994) sowie RÖMLING et al. (1995) geben einen umfassenden
Überblick über die Makrorestriktionsanalyse und die PFGE zum Nachweis epidemiologischer
Zusammenhänge bei bakteriologischen Krankheitserregern. Zu untersuchende Bakterien werden
zunächst in ein Gel eingebettet und anschließend lysiert. Dadurch ist das Genom vor Scherbruch
geschützt und kann anschließend mittels selten schneidender Restriktionsenzyme in zumeist 7
bis 20 Fragmente aufgespalten werden. Bezüglich der Restriktionsenzym-Auswahl eignen sich
laut GÖRING (1998) für GC-reiche Sequenzen Enzyme, die Hexanucleotide aus A und T
erkennen. Umgekehrt sollten für AT-reiche Genome Enzyme eingesetzt werden, die hexamere
Sequenzen aus G und C erkennen. Als Beispiele seien aufgeführt: Sma I (CCC↓GGG), Apa I
(GGGCC↓C), Sof I (GCCC↓GGGC) sowie Sal I (G↓TCGAC). Dabei sollten idealer Weise 720 Fragmente entstehen. Zur Sicherung der Interpretation der Fragmentmuster und zur sicheren
epidemiologischen Zuordnung wird die simultane Verwendung von drei unterschiedlichen
Restriktionsenzymen empfohlen (GÖRING 1998). Die aufgrund ihres Phosphatgerüsts negativ
geladenen DNA-Fragmente bewegen sich im elektrischen Feld in Richtung der positiven
Elektrode (Kathode). Dabei strecken sich die Moleküle in Richtung des Stromflusses und
wandern in dem Gel. Je größer die Moleküle sind, desto langsamer bewegen sie sich in dem
elektrischen Feld (GARDINER 1991). Größere Moleküle richten ihre Längsachse parallel zu
den elektrischen Feldlinien aus, da sie ansonsten nicht durch die kleinen Poren des Gels passen.
Sie bewegen sich in Schlangenlinien in gleicher Geschwindigkeit durch das Gel, was dazu
führt, dass eine Auftrennung und Größendifferenzierung nicht mehr möglich ist, da sie nur eine
Bande darstellen. In einem statischen elektrischen Feld können deshalb nur Fragmente mit einer
Größe von maximal 50 kb aufgetrennt werden.
Bei der von SCHWARTZ und CANTOR (1984) entwickelten PFGE jedoch wird das
elektrische Feld in festgelegten Zeitintervallen (Pulszeiten) in definierten Winkeln geändert, so
43
dass die Richtung des Stromflusses wechselt und sich die Feldlinien dem entsprechend ändern.
Dabei sind die Kathoden so zueinander angeordnet, dass das elektrische Feld eine
kontinuierliche Bewegung der DNA-Fragmente zu dem den eingesetzten Proben
entgegengesetzten Ende des Gels bewirkt. Dadurch entsteht ein Zickzack-Kurs, der in seiner
Ausrichtung auf das untere Ende des Gels gerichtet ist. Durch die wechselnde Richtung des
elektrischen Feldes müssen die DNA-Moleküle ihre Konformation ständig ändern und sich in
die neue Richtung orientieren, bevor eine weitere Wanderung im elektrischen Feld möglich ist .
Größere Fragmente benötigen für diese Umorientierung länger als kleine Fragmente, so dass
weniger Zeit für die Wanderung im Gel bleibt. Kleine Fragmente können sich schneller
umorientieren, so dass sie im Gel schneller wandern. Diese von der Größe der Moleküle
abhängige Migrationsgeschwindigkeit führt dazu, dass eine Auftrennung der linearen DNAFragmente nach dem Molekulargewicht zu beobachten ist (GARDINER 1991). Mit dieser
Methode können Moleküle in einer Größenordnung von 50 – 6000 Kb aufgetrennt werden. Zur
Erzeugung dieser alternierenden elektrischen Felder wurden zahlreiche, sich in Form, Anzahl
und Stellung der Elektroden sowie im geometrischen Aufbau der Elektrophoresekammer
unterscheidende Geräte eingesetzt. Bei dem in der vorliegenden Untersuchung für die PFGE
genutzte „contour clamp homogeneous electric field“ (CHEF)-Gerät sind 24 Punktelektroden in
einem Hexagon mit einer Winkelung von 120° fest angeordnet. Während die Pulszeit und
Stärke des elektrischen Feldes variieren können, müssen die Spezifikation, Zusammensetzung,
Konzentration und Temperatur des Gels sowie Puffertemperatur und Pufferzusammensetzung
konstant bleiben. Eine konstant niedrige Puffertemperatur (4 – 15°C) verhindert eine zu
schnelle Bewegung der Moleküle durch das Gel. Der Molekularbereich, in dem die
Auftrennung der Fragmente stattfindet, wird über die Pulszeiten und Feldstärken festgelegt.
DNA-Fragmente mit 10 – 1000 kb werden üblicherweise mit Feldstärken von 4-7 V/cm
aufgetrennt. Für die Auftrennung von DNA-Molekülen im Megabasenpaarbereich werden
Stärken von weniger als 2 V/cm angelegt. Bei zu langen Pulszeiten laufen die DNA-Moleküle
ohne Auftrennung als langgestreckte Bande durch das Gel, deshalb wird zur weiteren
Auftrennung kleinerer Fragmente die Pulszeit verkürzt.
Zum Vergleich der durch die PFGE gewonnen Fragmente ist eine reproduzierbare und kolineare
Auftrennung aller Spuren im Gel notwendig. Nach RÖMLING et al. (1995) ist für eine Analyse
aller Stämme auf einem Gel der visuelle Vergleich völlig ausreichend. Werden jedoch
verschiedene Gele miteinander verglichen, ist eine sorgfältige Kontrolle aller Parameter
erforderlich. Alle Gele müssen unter standardisierten Bedingungen hergestellt worden sein und
Marker an den beiden Seiten sowie in der Mitte sollen mögliche Inhomogenitäten im
44
elektrischen Feld erfassen. Partialverdau, Methylierung der Schnittstellen, unzureichende
Auflösung oder Signalintensität sowie der Verlust kleiner DNA-Fragmente (<20 kb) führen zu
Qualitätsabweichungen. Die Fehlinterpretation von Doppel- oder Mehrfachbanden stellt eine
weitere mögliche Fehlerquelle dar.
Bei der Interpretation der Fragmentmuster muss man die unterschiedlichen möglichen
genetischen Ereignisse (engl. „events“) berücksichtigen. Dabei sind Insertion, Deletion und
Rearrangement zu unterscheiden. Insertion ist die Einfügung eines DNA-Fragments von
außerhalb des bakterieneigenen Genoms (Fremd-DNA) in die Bakterien-DNA, Deletion ist der
ersatzlose Verlust eines DNA-Fragments und Rearrangement stellt den Austausch zweier gleich
großer Bakterien-DNA-Fragmente dar (Lokalisationswechsel). Diese Veränderungen können
mit oder ohne Einflussnahme auf die Schnittstellen der Restriktionsenzyme stattfinden. Wird
die Schnittstelle mit beeinflusst, findet man bei Deletion und Insertion drei, bei einem
Rearrangement vier Bandenunterschiede zum Referenzstamm. Werden die Schnittstellen bei
den „Events“ nicht beeinflusst, ändert sich bei einem Rearrangement das Restriktionsmuster
nicht, während bei Insertion oder Deletion zwei Bandeunterschiede zu bemerken sind
(GÖRING 1998).
GROTHUES und TÜMMLER (1991) beschreiben die PFGE als eine Methode,
Infektionsquellen und Übertragungswege bakterieller Erreger zu identifizieren und die
Diversität und klonale Strukturen der Bakterienpopulationen aufzuklären. Wie genau die
Ergebnisse der Differenzierung mittels Makrorestriktion und PFGE sind, zeigen die
Untersuchungen von DOUGLAS et al. (2000), bei denen 342 Isolate von S. uberis aus
Milchproben von Kühen mit klinischer oder subklinischer Mastitis untersucht wurden. Die
Proben stammten aus 15 verschiedenen Regionen Neuseelands, wurden von unterschiedlichen
Untersuchern in einem Zeitraum von zwei Jahren gesammelt und zeigten 330 verschiedene
Restriktionsmuster. Ebenso zeigen die Untersuchungen von KHAN et al. (2003) die große
Differenzierungsfähigkeit der PFGE. Bei der molekularbiologischen Analyse von 69 S. uberisIsolaten aus 26 Betrieben mit dem Restriktionsenzym SmaI fanden sie 55 verschiedene
Restriktionsmuster.
Große Homologien in den Restriktionsmustern lassen deshalb im Umkehrschluss auf enge
verwandtschaftliche Beziehungen schließen und ermöglichen so die Aufklärung
epidemiologischer Zusammenhänge. So konnten verschiedene Autoren durch
Makrorestriktionsanalyse und anschließender PFGE enge verwandtschaftliche Beziehungen
zwischen den S. agalactiae-Isolaten aus jeweils einem Milcherzeugerbetrieb und das Fehlen
45
epidemiologischer Zusammenhänge zwischen den verschiedenen untersuchten betroffenen
Betrieben nachweisen (MERL et al., 2003, DUARTE et al. 2004). Bei der
molekularbiologischen Untersuchung von S. aureus bei Milchkühen hingegen zeigte sich, dass
sich einerseits die durch Restriktionsmuster bestimmten Typen in den Betrieben auf wenige
beschränken, andererseits diese Typen auch in anderen Betrieben anzutreffen sind
(ANNEMÜLLER et al. 1999, AKINEDEN et al., 2001). MØRK et al. (2004) führen
vergleichbare Beobachtungen bei flächendeckenden Untersuchung von S. aureus bei
Milchschafen in Norwegen auf eine unterschiedlich starke Fähigkeit zur Ausbreitung zurück.
Sie fanden bei der Untersuchung von 384 S. aureus-Isolaten von 332 Milchschafen aus fast
ganz Norwegen (10 von 13 Distrikten) 64 verschiedene Restriktionsmuster, die regional
unterschiedlich stark vertreten waren.
In anderen Untersuchungen gelang mittels PFGE der Nachweis von klonalen Beziehungen
zwischen Penicillin-resistenten S. pneumoniae-Stämmen in Frankreich und anderen Ländern
(LEFÈVRE et al. 1994, CARVALPHO et al. 1996). SOEDARMANTO et al. (1996) konnten
aufgrund identischer Fragmentmuster nachweisen, dass eine verwandtschaftliche Beziehung
bestand zwischen Stämmen von S. equi subsp. zooepidemicus die sich seuchenhaft bei
Schweinen und Affen in Indonesien verbreitet hatten.
3.4.1
Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-Gel-Elektrophorese
3.4.1.1 Präparation und Restriktionsverdau der Gesamtzell-DNA
Die Streptokokkenkulturen wurden zunächst bei 37°C für 48 h im Brutschrank (Heraeus,
Osterode) in Serumbouillon aerob inkubiert und anschließend bei 6.000 U/min für 10 min
abzentrifugiert, zwei Mal mit 5 ml TE-Puffer gewaschen und dann in 250µl TE-Puffer
aufgenommen. In Anlehnung an die McFarland-Skala wurde mittels Photometer (Lange,
Düsseldorf) bei einer Wellenlänge von 620 nm eine Dichte von etwa 2x109 Bakterien/ml
eingestellt. Zu dieser Bakteriensuspension wurde die gleiche Menge 1,5%iger Agarose (lowmelting In-Cert-Agarose, Biorad, München) pipettiert, zu je vier Portionen von je 100µl in
Gießkammern überführt und für 15 min auf Eis gekühlt. Nach dem Erstarren der Agarose
wurden die so erhaltenen Agarblöckchen - getrennt nach Ausgangskulturen - in Reagenzgläsern
aufbewahrt. Unter Zugabe einer Mischung aus 4 mg Lysozym (Merck) in 800 µl Lysispuffer
wurde der Ansatz über Nacht bei 37°C inkubiert.
46
Der Lysispuffer hatte die folgende Zusammensetzung:
Tris-Basis (6 mmol/l, pH 7,6; Merck, Darmstadt)
363,00 mg
NaCl (1 mol/l)
29,30 g
EDTA (100 mmol/l, pH 7,6; Sigma, Steinheim)
18,61 g
Polyoxyethylene-10-Cetyl-Ether (Brij-58; Sigma)
2,50 g
Desoxycholic Acid (Sigma)
1,00 g
N-Lauroylsarcosine (Sigma)
2,50 g
Aqua dest. ad
500,00 ml
Nach der Auflösung der Bakterienzellwände durch das Lysozym wurde zu jedem Probenansatz
zwecks Deproteinisierung 20 µl Proteinase K (18,6 mg/ml; Sigma, Steinheim) in die 800 µl
Lysispuffer gegeben, so dass im Ansatz eine Proteinase-K-Endkonzentration von 0,5 µl/ml
erreicht wurde. Danach wurden die Proben über Nacht bei 56°C erneut inkubiert.
Die Inaktivierung der Proteinase K erfolgte nach zweimaligem Waschen mit TE-Puffer durch
Zusatz von Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF, Sigma, Steinheim) in einer
Endkonzentration von 1,0 mM und einer Inkubationszeit des Ansatzes für 2 mal 1h bei 56°C.
Nach zweimaligem Waschen mit TE-Puffer bei Raumtemperatur (30 min) waren die Proben für
die Restriktionsenzymbehandlung vorbereitet.
Für die Restriktion wurden Sma I (TaKaRa, Japan), Apa I (New England BioLabs, Frankfurt)
und Cla I (Boehringer, Mannheim) verwendet. Für den Restriktionsansatz wurde Sma I (10U/µl
Stammlösung) mit 10x Universalpuffer (Promega, Mannheim), bovinem Serumalbumin (BSA,
TaKaRa, Japan) und sterilem, demineralisierten Wasser angesetzt. Die Mischungsverhältnisse
sind in Tab. 3.4.1-1 zusammengestellt. Jeweils vier Blöckchen aus einem Kulturansatz wurden
in einem Reagenzglas mit 800 µl dieser Lösung versetzt und im Wasserbad bei 25°C für 5
Stunden inkubiert. Die Restriktion mit ApaI und ClaI erfolgte analog.
47
Tab. 3.4.1-1: Zusammensetzung der eingesetzten Restriktionsansätze
1. Verdau mit dem Restriktionsenzym Sma I
10x Universalpuffer
20 µl
BSA
10 µl
Sma I (CCC↓GGG)
2 µl
Aqua dest.
178 µl
DNA (1 Blöckchen)
ca. 1 µg
2. Verdau mit dem Restriktionsenzym Apa I
10x Universalpuffer
20 µl
BSA
10 µl
Apa I (GGGCC↓C)
2 µl
Aqua dest.
178 µl
DNA (1 Blöckchen)
ca. 1 µg
3. Verdau mit dem Restriktionsenzym Cla I
10x Universalpuffer
20 µl
BSA
10 µl
Cla I (AT↓CGAT)
2 µl
Aqua dest.
178 µl
DNA (1 Blöckchen)
ca. 1 µg
48
3.4.1.2 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese
Für die Elektrophorese wurden 110 ml einer 1%igen Agarose-Lösung (In-Cert-Agarose,
Biorad, München) hergestellt und in einen Gießblock (Biorad, München) mit einem Kamm
für Aussparungen entsprechend der Blöckchengröße gegossen. Nach dem Erkalten wurde der
Kamm entfernt, die vorbereiteten Blöckchen in die Slots gegeben und anschließend mit
1%iger Agarose überschichtet. Die Elektrophorese wurde im CHEF-DR II „Pulsed Field
Electrophoresis System“ (Biorad, München) bei einer Puffertemperatur von 14°C
durchgeführt. Als Laufpuffer wurde 0,5%iger TE-Puffer verwendet. Die Gesamtlaufzeit
betrug 25 h. Das verwendete Laufprogramm ist in Tabelle 3.4.1-2 dargestellt.
Tab. 3.4.1-2: Laufprogramm der PFGE
Block I
Block II
initial switch time
0,1 sec
9,0 sec
final switch time
11,0 sec
40,0 sec
Volt
5V
6V
Time
8h
17 h
Als Längenstandard wurde „Lambda“-Ladder DNA (Biorad, München) verwendet.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel 20 min mit einer wässrigen Ethidiumbromid-Lösung
(0,05 µl/ml sterilisiertes demineralisiertes Wasser) unter leichtem Schwenken eingefärbt,
gewaschen und ausgewertet (UV-Licht-Kammer, Biorad, München).
3.4.2
Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR
3.4.2.1 Aufbereitung der DNA
Die Probenaufbereitung der DNA wurde wie in Punkt 3.3.3.1. beschrieben durchgeführt. Das
Protokoll für den Mastermix ist in Tabelle 3.4.2-1 zusammengestellt.
49
Tab. 3.4.2-1: Zusammenstellung des Mastermix für die RAPD-PCR
Mastermix
µl/Probe
Aqua dest.
18,3
10x TBE-Puffer
2,5
dNTP-Mix (10 mM)
0,5
kay3-Primer 1 (20 pmol)
1,0
Polymerase (1,0 U)
0,2
Mastermix-Volumen
22,5
DNA-Probe
2,5
Gesamtvolumen
25,0
Tab. 3.4.2-2: Sequenz des Promers kay3 für die RAPD-PCR
Primer
kay3
Sequenz
CTg gCg ACT g - 3´ (10-mer, YOUNG et al. 1994)
3.4.2.2 DNA-Replikation mittels PCR
Die Amplifikation der DNA wurde wie unter 3.3.3.2. beschrieben durchgeführt. Nach einer
Denaturierungsphase von 5 min bei 94°C wurde das unten angegebene Cycler-Programm mit
35-maliger Wiederholung durchgeführt.
Denaturierung:
45 s bei
94° C
Annealing:
45 s bei
50° C
Extension:
120 s bei
72° C
Es schloß sich eine 7-minütige Extensionsphase bei 72°C an. Danach wurden die Proben auf
4°C gekühlt und weiter verarbeitet.
50
3.4.2.3 Elektrophorese
Es wurde wie unter 3.3.4.1.3 beschrieben ein Laufblock aus 2%iger Agarose hergestellt, in
den die angefärbten Proben pipettiert wurden. Die Elektrophorese wurde für zwei Stunden
bei einer Spannung von 100 V durchgeführt. Die Anfärbung und Dokumentation erfolgte
wie in 3.3.4.1.3 beschrieben.
3.5 Beurteilung der Verwandtschaftsbeziehung einzelner Stämme
Zur Beurteilung der Verwandtschaftsbeziehung der verschiedenen untersuchten Isolate wurden
die Bandenmuster der untersuchten Kulturen, wie sie sich nach der Pulsfeld-Gel-Elektrophorese
darstellten, mit dem Programm GelCompar (Applied Maths, Kortrijk, Belgien) ausgewertet.
Für die Erstellung eines Dendrogramms wurde mindestens je ein Isolat aus jedem in die
Untersuchung einbezogenen Milcherzeugerbetrieb und jeder Probennahme ausgewertet.
3.6 Bestimmung der Differenzierungsfähigkeit
Zur Bestimmung der Differenzierungsfähigkeit der einzelnen Methoden wird der
diskriminatorische Index (D) nach einer Formel von GASTON und HUNTER (1989)
berechnet, die sich wie folgt darstellt:
D = 1−
s
1
ni (ni − 1)
∑
N ( N − 1) i =1
D = diskriminatorischer Index
S = Anzahl der Typen
ni = Anzahl der Isolate, die zu Typ i gehören
N = Anzahl der getesteten Isolate
51
4
Ergebnisse
4.1 Identifizierung der Streptokokkenkulturen
Aus den insgesamt 2461 untersuchten Viertelgemelksproben der 16 beprobten Bestände und
den drei Tankmilchproben wurde in 173 Fällen S. canis isoliert. 115 dieser Isolate wurden
weitergehend untersucht. Die Herkunft der Isolate bzw. die geografische Lage der
Herkunftsbestände ist in Abbildung 3.1.1-1 dargestellt. Danach liegt eine weitgehend
homogene Verteilung S. canis-positiver Milchviehherden über das Landesgebiet Hessens vor.
Zur Identifizierung der Streptokokken wurde neben kulturmorphologischen Kriterien, der
Lancefield-Gruppenbestimmung (G) mittels Objektträgeragglutination und den üblichen
biochemischen Methoden die t-RNA-PCR und die 16S-PCR durchgeführt.
Tab. 4.1-1: Häufigkeit von S. canis in den untersuchten Betrieben
Be stand
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
Gesamt
Anzahl de r mit
S. canis
infizierte n Vie rte l
20
17
3
5
22
17
12
11
6
Tankmilch
5
12
2
1
24
16
173
Anzahl de r
we ite rführe nd
unte rsuchte n
Isolate
3
15
2
5
15
16
12
10
4
1
2
9
2
1
15
3
115
Prävale nz de r
S. canis- Infektione n
in de r He rde (%)
13,89
17,00
10,71
10,42
7,43
8,67
10,71
3,09
8,33
2,05
6,98
4,17
1,04
4,84
30,77
7,03
52
4.1.1
Kulturmorphologisches Verhalten
Alle 115 Feldisolate wuchsen auf Columbia-Schafblut-Agar in runden Kolonien von 1-2 mm
Durchmesser, die sich konkav über die Blutagaroberfläche erhoben. Die zunächst grauen
Kolonien zeigten bei längerer Bebrütung (> 72h) eine vom Zentrum der Kolonie ausgehende,
mittelbraune Verfärbung. Die Ränder der Kolonien waren scharf von der Umgebung
abgegrenzt. Alle Kulturen wiesen bei Anzüchtung auf Columbia-Schafblut-Agar deutliche
Zonen vollständiger β-Hämolyse von bis zu 3 mm Durchmesser auf. In flüssigem Medium,
hier Todd-Hewitt-Broth oder Serumbouillon, zeigte sich nach Bebrütung für 24 Stunden bei
37°C ein Sediment von weiß-grauer Färbung mit klarem Überstand.
4.1.2
Lancefield-Gruppen-Bestimmung
Alle 115 Kulturen reagierten im Co-Agglutinationstest mit Gruppe-G-spezifischem Antiserum
positiv. 54 Isolate erwiesen sich im Co-Agglutinationstest mit Gruppe-C-spezifischem
Antiserum ebenfalls schwach positiv. Die Reaktion war jedoch in ihrem zeitlichen Ablauf
sowie in ihrer Intensität deutlich von der spezifischen Reaktion im Co-Agglutinationstest
mittels Gruppe-G-Antiserum unterscheidbar.
4.1.3
Biochemische Eigenschaften
Die biochemischen Eigenschaften der 115 in die Untersuchung einbezogenen Stämme sind in
Abbildung 4.1.3.-1 dargestellt.
Bei allen 115 Kulturen war übereinstimmend alkalische Phosphatase-, Leucinarylamidaseund Arginindihydrolaseaktivität nachweisbar. Außerdem fermentierten alle 115 Feldisolate
Ribose und Stärke.
Übereinstimmend negativ verliefen bei allen 115 Stämmen der Nachweis von βGlucuronidasebildung sowie die Fermentation von L-Arabinose, Inulin und Glykogen. Alle
übrigen biochemischen Reaktionen verliefen uneinheitlich.
114 (99,1%) Isolate waren β-Galactosidase-positiv, 109 (96,2%) der untersuchten Stämme
bildeten Pyrrolidonylarylamidase und 98 (85,2%) α-Galactosidase. 65 (56,5%) Kulturen
zeigten Abbau von Äskulin durch β-Glucosidasebildung. 109 Stämme (94,7%) waren in der
Lage, Lactose zu fermentieren.
53
B ioche mis che R e ak tion
Voges P ros kauer
H ip p urat -Sp alt un g
Ä s kulin-H y droly s e
P y rrolidon y lary lamidas e-B ildung
120
100
Anzahl de r
pos itive n
S tämme
80
a-G alact os idas e-B ildung
ß-G lucuronidase-B ildung
ß-G alact os idas e-B ildung
A lkalis che P hos p hat as e-B ildung
Leucinary lam idas e-B ildung
A rginindihy drolas e-B ildung
F erm ent at ion von R ibos e
60
F erm ent at ion von A rabinos e
F erm ent at ion von M annit ol
40
F erm ent at ion von Sorbit ol
F erm ent at ion von Lact os e
20
F erm ent at ion von T rehalos e
F erm ent at ion von Inulin
0
F erm ent at ion von R affinos e
F erm ent at ion von St ärke
F erm ent at ion von G ly kogen
ß-H ämoly s e
Abb. 4.1.3-1: Ergebnisse der biochemischen Identifizierung von 115 S. canis-Kulturen
mittels ApiStrep 20
Bei 20 (17,4%) von 115 Isolaten verlief die Voges-Proskauer-Reaktion positiv, nur 4 Kulturen
(3,5%) hydrolysierten Hippurat, und 24 (20,9%) Isolate verstoffwechselten Trehalose.
Nur zwei Isolate (1,7%) fermentierten Sorbit, während jeweils ein Isolat (0,9%) in der Lage
war, Mannit bzw. Raffinose abzubauen.
Somit ergaben sich bei der biochemischen Untersuchung insgesamt 24 unterschiedliche
Reaktionsmuster (a-x), die in Tabelle 4.1.3.-1 zusammengestellt sind.
54
Alkalische Phosphatase
Leucinarylamidase
Arginindihydrolase
Ribose
Arabinose
Mannit
Sorbit
Lactose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+ + + + +
+ + + +
+ + + + - +
+ +
- +
+ +
+ + +/+ - +
+ - +
+ +
+ +
+ +
in Prozent
ß-Galactosidase
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Anzahlder Isolate
ß-Glucuronidase
-
ß-Hämolyse
a-Galactosidase
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Glycogen
Pyrrolidonylarylamidase
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Stärke
Äskulin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Raffinose
Hippurat
- + - - + - - +/- - +
- - +/- - - +/- - - - - - - - - +
+ -
Inulin
Voges-Proskauer
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
m
n
o
p
q
r
s
t
u
v
w
x
Trehalose
Reaktionsmuster
Tab. 4.1.3.-1: Reaktionsmuster (n=24) nach biochemischen Untersuchungen von 115 S.
canis-Feldisolaten
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
38
12
13
7
7
6
5
4
3
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
33,0
10,4
11,3
6,1
6,1
5,2
4,3
3,5
2,6
1,7
1,7
1,7
1,7
1,7
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
55
Die Auswertung der unterschiedlichen biochemischen Reaktionsmuster mittels Api-LabSoftware® ergab folgende Nachweiswahrscheinlichkeiten für S. canis:
Anzahl der Isolate
Nachweiswahrscheinlichkeit
für S. canis
Gesamt:
105 (91,30%)
99,9%
7 (6,08%)
98,9%
1 (0,87%)
99,0%
1 (0,87%)
98,8%
1 (0,87%)
91,5%
115 (100,00%)
Zur genotypischen Speziesdiagnostik wurden jeweils ein Isolat des betreffenden biochemischen
Reaktionsmusters mittels zweier PCR-Verfahren untersucht.
4.1.4
Spezies-Identifizierung mittels t-DNA-PCR
Die Ergebnisse der Untersuchung von 24 S. canis-Kulturen (a bis x) mittels t-DNA-PCR sind
in Abbildung 4.1.4-1 dargestellt. Alle 24 untersuchten Feldisolate zeigten ein mit dem
Referenzstamm S. canis ATCC 43 496 übereinstimmendes Bandenmuster von 3 Banden mit
einer Größe von 115, 180 und 270 Basenpaaren (bp).
250 bp
150 bp
100 bp
Abb. 4.1.4-1: Beispiel für t-DNA-PCR zur genotypischen Speziesidentifizierung von 24 in
der biologischen Identifikation unterschiedlich reagierenden S. canis-Isolaten
M = Marker, A = Aqua dest., R = Referenzstamm S. canis (ATCC 43 496),
1-8 = S. canis-Feldstämme
56
4.1.5
Spezies-Identifizierung mittels 16S-PCR
Auch mittels 16S-PCR konnten die biochemisch unterschiedlich reagierenden Isolate
eindeutig der Spezies S. canis zugeordnet werden. Die Größe der Amplifikate des S. canisspezifischen Abschnittes der 16S rRNA-Gens wiesen bei dem Referenzstamm sowie bei allen
Feldisolaten eine Größe von 1320 bp auf (Abb. 4.1.5-1).
1500 bp
1000 bp
500 bp
Abb. 4.1.5-1: 16S rRNA-PCR zur genotypischen Speziesidentifizierung von 24 in der
biologischen Identifikation unterschiedlich reagierenden S. canis-Isolaten
M = Marker, A = Aqua dest., R = Referenzstamm S .canis (ATCC 43 496), 1-24 = S. canisFeldstämme
57
4.2 Phäno- und genotypische Intra-Spezies-Charakterisierung
4.2.1
Intra-Spezies-Biotypisierung durch biochemische Reaktionen
Bei der Untersuchung der Stoffwechselleistung der 115 Stämme zeigten sich Unterschiede in
der Fähigkeit, unterschiedliche Substrate abzubauen (siehe Abb. 4.1.3-1)
Es waren insgesamt 24 Reaktionsmuster unterscheidbar (siehe Tab. 4.1.3-1). Isolate
unterschiedlicher Betriebe zeigten voneinander abweichende Reaktionsmuster. Aber auch
innerhalb der einzelnen Betriebe waren unterschiedliche Reaktionsmuster nachweisbar.
Tab. 4.2.1-1: Beziehung zwischen Herkunft und biochemischem Reaktionsmuster
untersuchter S. canis-Isolate
Anzahl der
Bestand untersuchten Isolate
I
3
II
15
III
2
IV
5
V
15
VI
16
VII
12
VIII
10
IX
4
X
1
XI
2
XII
9
XIII
2
XIV
1
XV
15
XVI
3
Gesamt
115
Anzahl unterschiedlicher
biochemischer
Reaktionsmuster
3
6
1
4
4
4
6
3
3
1
1
7
1
1
5
1
Bezeichnung der
Reaktionsmuster
vgl. 4.1.3-2
a, c, p
a, c, e, f, k, r
i
a, f, v
a, e, f, k
a, b, c, m
a, b, f, q, t, w
a, c, g
c, i, j
d
d
b, d, l, n, s, u, x
a
c
a, c, d, h, o
a
Diese Unterschiede betrafen die Acetoin-Produktion, die Hydrolyse von Natrium-Hippurat, die
Synthese von β-Glucosidase, Pyrrolidonarylamidase, α-Galactosidase und β-Galactosidase,
sowie die Spaltung von Sorbit, Trehalose, Inulin und Raffinose.
58
4.2.2
Intra-Spezies-Differenzierung mittels Randomly Amplified Polymorphic DNA Polymerase
Chain Reaction (RAPD-PCR)
Die mittels t-DNA-PCR und 16S rRNA-PCR identifizierten S. canis-Feldstämme wurden
zusätzlich mittels RAPD-PCR untersucht. Im Ergebnis ließen sich sieben unterschiedliche
Bandenmuster (RAPD-Typ 1-7) darstellen (Abb. 4.2.2-1).
12 der 24 S. canis-Isolate ließen sich dem Bandenmuster 1 zuordnen. Das RAPD-PCRBandenmuster 2 bzw. 3 war jeweils bei drei Feldstämmen vorhanden. Den Mustern 5 und 6
ließen sich jeweils zwei biochemisch unterscheidbare Feldisolate zuordnen. Jeweils nur ein
Isolat fand sich in den Bandenmustern 4 und 7 (s. Tab. 4.2.2-1).
1000 bp
500 bp
100 bp
Abb. 4.2.2-1: Auftrennung der mit RAPD-PCR fragmentierten chromosomalen
DNA mit Elektrophorese
M = Marker, A = A. dest., 1-24 = S. canis-Feldstämme
Die Reproduzierbarkeit des Untersuchungsverfahrens wurde durch zweimalige Untersuchung
jeden Isolates an unterschiedlichen Tagen geprüft. Dabei ergaben sich bei identischen
Feldstämmen in beiden Versuchsläufen identische Restriktionsmuster. Die mittels RAPD-PCR
ermittelten Bandenmuster und deren Vorkommen in den verschiedenen in die Untersuchung
einbezogenen Milcherzeugerbetrieben ist der Tabelle 4.2.2-2 zu entnehmen.
59
Tab. 4.2.2-1: Typen und Anzahl der unterschiedlichen Bandenmuster der Feldstämme
bei Differenzierung mittels RAPD-PCR
Bandenmuster
RAPD-Typ 1
RAPD-Typ 2
RAPD-Typ 3
RAPD-Typ 4
RAPD-Typ 5
RAPD-Typ 6
RAPD-Typ 7
Anzahl der Isolate
12
3
3
1
2
2
1
Tab.4.2.2-2: Beziehung zwischen Herkunftsbetrieb und Typ des RAPD-PCRBandenmusters untersuchter S. canis-Isolate
Anzahl der
Bestand untersuchten Isolate
I
3
II
15
III
2
IV
5
V
15
VI
16
VII
12
VIII
10
IX
4
X
1
XI
2
XII
9
XIII
2
XIV
1
XV
15
XVI
3
Gesamt
115
4.2.3
RAPD-PCR
BandenmusterTyp
1
1
2
2
5;6
1; 3; 4
1
1
1
5
7
1; 6
1
3
2; 3
1
Anzahl unterschiedlicher
Bandenmuster
1
1
1
1
2
3
1
1
1
1
1
2
1
1
2
1
Makro-Restriktionsanalyse und Pulsfeld-Gelelektrophorese
Alle 115 S. canis-Feldstämme wurden nach Makrorestriktion mit dem Enzym Sma I mittels
Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) untersucht. Nach Verdau mit der Restriktionsendonuclease
Sma I und anschließender Auftrennung der Fragmente mittels PFGE wurden bei allen 115
untersuchten S. canis-Feldstämmen Restriktionsmuster erhalten. Diese unterschieden sich zum
Teil erheblich. Alle Kulturen wurden in der Makrorestriktionsanalyse an unterschiedlichen
60
Tagen wiederholt untersucht. Die Resultate der Erstuntersuchung ließen sich in allen Fällen
reproduzieren. Die unterschiedlichen Restriktionsmuster waren durch 8 bis 23 eindeutig
voneinander unterscheidbaren Banden im Größenbereich von unter 50 kb bis 825 kb
charakterisiert. Insgesamt ließen sich 21 Bandenmuster (1-21) unterscheiden.
In Abbildung 4.2.3-1 sind die SmaI-Restriktionsmuster von sieben der insgesamt 21
unterscheidbaren Muster beispielhaft dargestellt.
Die Makrorestriktionsanalyse der chromosomalen DNA wurde unter Zugrundelegung der 21 im
Restriktionsverdau mittels Sma I unterscheidbaren S. canis-Typen unter Verwendung der
Restriktionsendonucleasen Apa I und Cla I wiederholt. Dabei wurden die gleichen Stämme
verwendet, die zur Erstellung des Dendrogramms herangezogen worden waren.
774 kb
291 kb
Zuordnung der
verschiedenen im
Dendrogramm
aufgeführten Typen:
101 = Typ 14
120 = Typ 15
127 = Typ 4
137 = Typ 8
143 = Typ 8
150 = Typ 19
152 = Typ 20
155 = Typ 6
48,5 kb
Abb. 4.2.3-1: Beispiel einer Fragmentauftrennung mittels PFGE nach Makrorestriktion
der chromosomalen DNA mit dem Restriktionsenzym Sma I
M = Marker; 101 – 155 = S. canis-Feldstämme
61
Bei Cla I unterschieden sich die Restriktionsmuster nur wenig voneinander, es waren sieben
verschiedene Typen feststellbar (Abb. 4.2.3-2).
Die Restriktion und Fragmentauftrennung der chromosomalen DNA der 21 Feldisolate mittels
der Restriktionsendonuclease Apa I ergaben zwar gegenüber der des Enzyms Cla I eine bessere
Unterscheidbarkeit, jedoch ließen sich insgesamt ebenfalls weniger unterscheidbare
Restriktionsmuster feststellen als bei der Untersuchung mittels Sma I.
Acht der insgesamt 14 nach Apa I-Verdau unterscheidbaren Bandenmuster sind in Abbildung
4.2.3-3 dargestellt.
Abb. 4.2.3-2: Beispiel einer Fragmentauftrennung mittels PFGE nach Makrorestriktion der
chromosomalen DNA mit dem Restriktionsenzym Cla I
M = Marker; 101 – 155 = S. canis-Feldstämme
Die mittels Makrorestriktionsanalyse unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen Sma I
erhaltenen Bandenmuster und deren Vorkommen in den verschiedenen Milcherzeugerbetrieben
sind in Tabelle 4.2.3-1 dargestellt.
62
Abb. 4.2.3-3: Fragmentauftrennung mit PFGE nach Makrorestriktion der chromosomalen
DNA mit dem Restriktionsenzym Apa I
M = Marker; 3-56 = S. canis-Feldstämme
63
Tab. 4.2.3-1: Verteilung der mittels PFGE nach Restriktionsverdau mit dem Enzym Sma I
erhaltenen Bandenmuster und deren Vorkommen in den verschiedenen
Milcherzeugerbetrieben
Bestand
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
Gesamt
Anzahl der
untersuchten Isolate
3
15
2
5
15
16
12
10
4
1
2
9
2
1
15
3
115
PFGEBandenmuster
nach Sma I -Restriktion
14
9; 12; 13
17
10
1; 11
3; 4
10
2
16
18
6
19; 20; 21
7
5
8
15
Anzahl unterschiedlicher
PFGEBandenmuster
1
3
1
1
2
2
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
4.3 Differenzierungsfähigkeit der verschiedenen Typisierungs-Methoden
Die für die Beurteilung der Differenzierungsfähigkeit errechneten Werte des
diskriminatorischen Index liegen zwischen 0 und 0,97. Die beste Differenzierung gelingt
demnach mit der Makrorestriktion unter Verwendung des Enzyms Sma I (0,97), gefolgt von der
Differenzierung mittels der PFGE und Apa I (0,95), der Diskriminierung mittels biochemischer
Reaktionsmuster (0,86) und der RAPD-PCR (0,73). Die geringste Differenzierungsfähigkeit
wies die Makrorestriktionsanalyse mittels des Enzyms Cla I (0,69) auf.
4.4 Beurteilung der Verwandtschaftsgrade der untersuchten Stämme
Die Ergebnisse der Analyse der Verwandtschaftsgrade untersuchter Feldstämme mit Hilfe des
Programms Gel Compar der Firma Applied Math sind in Abbildung 4.4.-1 dargestellt. Das
Dendrogramm zeigt sowohl absolute Übereinstimmungen bei Stämmen aus einer
Bestandsprobennahme zu einem Zeitpunkt, als auch die Unterschiede der DNA bei
64
verschiedenen Bestandsproben. Die Verwandtschaftsgrade der Isolate sind in Tabelle 4.4.3-1
dargestellt.
4.4.1
Grad der Verwandtschaft der untersuchten Stämme, die zum gleichen Zeitpunkt aus einem
Betrieb entnommen wurden
S. canis-Kulturen, die anlässlich eines Probennahmetermins innerhalb eines Bestandes isoliert
werden konnten, zeigten in der Makrorestriktionsanalyse mittels Sma I überwiegend ein
identisches Bandenmuster (Übereinstimmung 100%, s. Abb. 4.4.1-1). Dabei ließ sich in allen
Fällen die zuvor durchgeführte visuelle Beurteilung der Restriktionsmuster auch mittels EDVunterstützter Auswertung (Gel-Compar-Software) bestätigen.
Lediglich ein S. canis-Isolat des Betriebes II (Nr. 18) erreichte gegenüber den Feldstämmen
Nr. 17, 20 und 22 nur eine Übereinstimmung von 98%. Visuell ist der Verlust einer Bande
von ca 170 bp erkennbar.
Abb. 4.4.1-1: 9 Isolate von einer Probennahme aus dem Betrieb V nach
Makrorestriktionsanalyse mit Sma I
4.4.2
Grad der Verwandtschaft der untersuchten Stämme aus verschiedenen Betrieben
S. canis-Feldstämme, die in unterschiedlichen Herden isoliert worden waren, zeigten sowohl
bei der visuellen Beurteilung als auch bei der EDV-unterstützten Auswertung erhebliche
Unterschiede mit bis zu sechs verschiedenen Banden (s. Abb 4.4.2-1). Der Grad der
Übereinstimmung lag hier bei unter 80% (51 – 77%). Zwei Feldstämme (Stamm 25; Betrieb IV
und Stamm 31; Betrieb VII) zeigten jedoch eine vollständige Übereinstimmung (100%),
65
obwohl sie von unterschiedlichen Betrieben, die 70 km voneinander entfernt liegen, isoliert
wurden. Zwei weitere Feldstämme (Stamm 155; Betrieb XI und Stamm 58; Betrieb XII),
ebenfalls aus zwei unterschiedlichen Betrieben, zeigten eine visuell beurteilbare Abweichung
von nur einer Bande. Die mit Gel-Compar ermittelte Übereinstimmung betrug 96%. Auch die
Makrorestriktionsmuster der Isolate 127 (Betrieb XI) und 83 (Betrieb XIV) waren in nur zwei
Banden, entsprechend einem Grad der Übereinstimmung von 82,5%, unterschiedlich.
In Tabelle 4.2.3-1 sind die zu unterscheidenden Restriktionsmuster und deren Zuordnung zu
den unterschiedlichen Betrieben zusammengestellt.
66
Untersuchungsnr.
des S. canisFeldstammes
Grad der Übereinstimmung der
verschiedenen Bandenmustern (in Prozent)
60
70
80
90
100
2
Typ 1
3 Typ 1
4 Typ 1
5
Typ 1
66 Typ 2
87 Typ 2
71 Typ 3
78 Typ 3
127 Typ 4
83 Typ 5
155 Typ 6
58 Typ 7
137 Typ 8
143 Typ 8
44 Typ 9
25 Typ 10
37 Typ 10
16 Typ 11
17 Typ 12
20 Typ 12
22 Typ 12
18 Typ 13
101 Typ 14
120 Typ 15
55 Typ 16
Typen der
mittels PFGE
nach
Restriktionsverdau mit
dem Enzym
Sma I
erhaltenen
Bandenmuster
89 Typ 17
52 Typ 18
150 Typ 19
152 Typ 20
59 Typ 21
Abb. 4.4-1: Dendrogramm zur Darstellung der Verwandtschaftsverhältnisse der
untersuchten S. canis-Kulturen nach Makrorestriktionsanalyse mittels PFGE
unter Verwendung des Restriktionsenzys Sma I
67
Abb. 4.4.2-1: Fragmentauftrennung von Isolaten aus verschiedenen Beständen mit PFGE nach
Makrorestriktion der chromosomalen DNA mit dem Restriktionsenzym Sma I
4.4.3
Grad der Verwandtschaft von Stämmen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus
demselben Betrieb entnommen wurden
In insgesamt sechs Milcherzeugerbetrieben konnten zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwei
bzw. drei Beprobungen, bei denen S. canis gefunden wurde, durchgeführt werden. Die Anzahl
der Probenzeitpunkte waren:
2 Beprobungen
Betrieb II, V, VIII, XV
3 Beprobungen
Betrieb VI, XII
In Betrieb XII fand elf Monate nach der ersten Probennahme der zweite Bestandsbesuch statt,
bei dem S. canis isoliert werden konnte. Eine Nachuntersuchung ca. 8 Wochen nach der
Erstuntersuchung verlief negativ. Die dritte Probennahme erfolgte fünf Wochen nach dem
zweiten Besuch. Die S. canis-Isolate zeigten unabhängig vom Probenzeitpunkt visuell einen
hohen Grad an Übereinstimmung der Restriktionsmuster. Der von Gel-Compar ermittelte
Grad der Übereinstimmung liegt bei 96,1%. Lediglich ein Isolat (Nr. 59) zeigte eine starke
Abweichung, die einem Grad der Übereinstimmung von 84,5% entsprach. Dieser Feldstamm
wurde anlässlich des ersten Bestandsbesuchs isoliert.
Auch in Betrieb VI zeigten sich visuell vollständig übereinstimmende Restriktionsmuster
(Grad der Übereinstimmung 100%) aller S. canis-Isolate der ersten und zweiten
Bestandsuntersuchung. Bestandsisolate des dritten Bestandsbesuches fünf Monate später
68
zeigten jedoch visuell und im Dendrogramm deutlich differierende Restriktionsmuster. Der
Grad der Übereinstimmung betrug hier 86,5%.
Tab. 4.4.3-1: Verwandschaftsgrad der innerhalb eines Milcherzeugerbetriebes isolierten S. canisKulturen
Betriebe
(n=16)
10
2
2
2
16
Anzahl
Bestandsuntersuchungen
1
2
2
3
Verwandschaftsgrade der Isolate
(identischer Milcherzeugerbetrieb)
Isolate
35
25
30
25
115
100%
35 (100%)
25 (100%)
17 (56,7%)
17 (68%)
94 (81,7% )
> 80%
< 80%
13 (43,3%)
8 (32%)
8 (7% )
13 (11,3% )
Bei Betrieb VIII und Betrieb XV, bei denen insgesamt zweimal S. canis nachgewiesen
wurden, fanden sich visuell und im Dendrogeamm vollständig identische Restriktionsmuster
(Übereinstimmung 100%) bei allen Kulturen der ersten und zweiten Probennahme. Der
zeitliche Abstand zwischen den Untersuchungen, bei denen S. canis isoliert werden konnte,
betrug hier bei Betrieb VIII vier Monate und bei Betrieb XV vier Wochen.
Die Betriebe II und VIII hingegen zeigten sowohl visuell als auch im Dendrogramm deutlich
unterscheidbare Restriktionsmuster untersuchter Bestandisolate der ersten und zweiten
Untersuchung. Die Übereinstimmung betrug 63% (Betrieb V, Intervall 2 Monate) bzw. 61,5%
(Betrieb II, Intervall 2 Monate).
Die Verwandtschaftsgrade der innerhalb eines Betriebes isolierten S. canis-Kulturen sind
zusammenfassend in Tabelle 4.2.3-1 dargestellt.
4.4.4
Verwandtschaftsgrad der Stämme in Bezug auf die geografische Verteilung der Betriebe
Neben der Bestimmung von Verwandtschaftsgraden innerhalb eines Milcherzeugerbetriebes
wurden auch die verwandtschaftlichen Beziehungn zwischen Isolaten aus unterschiedlichen
Milcherzeugerbetrieben untersucht. Der Grad der Übereinstimmung im Dendrogramm
zwischen Feldisolaten aus drei Betrieben aus dem nördlichen Mittelhessen betrug 66,2
(Probennr. 66 und 87 zu 155) bzw. 63,1% (Probennr. 66, 87 und 155 zu 37). Zwei weitere
69
Betriebe aus der Region zeigten im Dendrogramm mit einer Übereinstimmung von 51%
(Probennr. 2-5 zu 150, 152 & 59) die geringste Ähnlichkeit zwischen den untersuchten
Isolaten.
Eine ebenfalls geringe Übereinstimmung im Restriktionsmuster zeigte sich mit 52,5% bei den
Kulturen aus den Betrieben VI, IX und XVI aus dem südlichen Hessen.
Der höchste Grad an Übereinstimmung isolierter S. canis-Kulturen wurde zwischen zwei
Betrieben nachgewiesen, die etwa 70 km voneinander entfernt liegen. Die Übereinstimmung
zwischen diesen Betrieben (XI und XIII) betrug 96%.
70
5
Diskussion
5.1 Prävalenz von S. canis
Bezüglich des Auftretens von S. canis als Mastitiserreger beim Rind lässt sich die Prävalenz in
der Gesamtpopulation und die Herden-Prävalenz unterscheiden.
Die Häufigkeit, mit der S. canis in der Rinderpopulation auftritt, liegt deutlich unter der
Auftretenshäufigkeit in betroffenen Herden. EBERHART und GUSS (1970) beispielsweise
benennen S. canis einerseits als einen nur „gelegentlich“ auftretenden Mastitiserreger, berichten
aber andererseits, auch mit Hinweis auf Ergebnisse anderer Autoren (MILLER und
HEISHMAN 1940, RØMER 1948, BARNUM und FULLER 1953, HAMILTON und STARK
1970) über durch S. canis ausgelöste Bestandsprobleme mit Herden-Prävalenzen zwischen 18%
und 74%. Auch WATTS et al. (1984) beschreiben die Diskrepanz zwischen dem mit 0,7%
seltenen Auftreten von S. canis im Vergleich zu anderen Mastitis-Streptokokken in der
Rinderpopulation und den Ausbrüchen von Mastitiden in einzelnen Herden, die z.T. Formen
einer Epizootie annehmen können. Literaturangaben bezüglich des Auftretens von S. canis in
der Rinder-Gesamtpopulation schwanken zwischen 0,28% (LIVONI 1953) und 26,3%
(RØMER 1948). Bei der zahlenmäßig umfangreichsten Untersuchung mit insgesamt 4500
ausgewerteten Betrieben (KLASTRUP 1963) erreichte S. canis lediglich eine Prävalenz von
1,0%. Möglicherweise aufgrund der hohen Empfindlichkeit von S. canis auf eine antiinfektive
Therapie (insbesondere Penicillin G) scheint sich die Nachweisrate innerhalb der
Gesamtpopulation weiter zu verringern. Da neuere Untersuchungen zur Prävalenz des Erregers
unter Einbeziehung großer Bestandszahlen fehlen, kann diese Aussage lediglich mittels Daten
des Eutergesundheitsdienstes (EGD) Hessen belegt werden. Bei Untersuchungen von
Tankmilch- und Viertelgemelksproben am LHL wurde im Untersuchungszeitraum von 1996 bis
1998 bei einer Gesamtprobenzahl von 205676 Viertelanfangsgemelksproben nur 221-mal
(0,12%) S. canis nachgewiesen (1996: 88252 Viertelanfangsgemelksproben, davon 137 (0,16%)
S. canis; 1997: 57936 Viertelanfangsgemelksproben, davon 42 (0,07%) S. canis; 1998: 59488
Viertelgemelksproben, davon 42 (0,07%) S. canis) (JAHRESBERICHTE EGD 1996, 1997,
1998, unveröffentlicht).
Bei verschiedenen Untersuchungen von Mastitis-Problembetrieben wird die Prävalenz des
Erregers in den betroffenen Herden zwischen 18,2 und 61,4% (RØMER 1948, RØMER 1953,
HAMILTON und STARK 1970) angegeben. MILLER und HEISHMANN beschreiben bereits
1940 die hohe Kontagiosität des Erregers. Die Autoren isolieren wiederholt von verschiedenen
71
Tieren morphologisch gleiche Stämme und stellen eine vermehrte Neuinfektionsrate fest.
In der vorliegenden Untersuchung wurden S. canis-Herdenprävalenzen in den untersuchten
Betrieben zwischen 1,04% und 30,77% nachgewiesen, die durchschnittliche Prävalenz von S.
canis in den betroffenen Herden betrug 7,03%. Die großen Schwankungen erklären sich
möglicherweise aus der Vorgehensweise bei der Studienentwicklung. So sind in den mehrfach
beprobten Betrieben zwischen den Bestandsuntersuchungen Behandlungen der erkrankten Tiere
vorgenommen und die Melkhygiene optimiert worden, wodurch die Häufigkeit von S. canisInfektionen in den betroffenen Beständen dementsprechend gesenkt werden konnte. Bei von
Landwirten oder den behandelnden Tierärzten eingesandten Proben besteht zudem die
Möglichkeit, dass nur ein Teilbestand untersucht worden ist.
Die Häufigkeit von S. canis im Verhältnis zu anderen Mastitis-Erregern wird von den
verschiedenen Autoren mit 0,06% (WEIGT und GRUNERT 1964) bis 18,8% (BERGERRABINOWITZ et al. 1981) angegeben. Neuere Untersuchungen von SOBIRAIJ et al. (1997)
beziffern sie auf 1,45%. Dabei muss jeweils beachtet werden, ob S. canis nur als MastitisErreger in die Berechungen einfloss, wenn er in Reinkultur nachgewiesen werden konnte, oder
ob auch Misch-Infektionen berücksichtigt wurden.
5.2 Morphologie von S. canis
Die 115 Feldisolate der eigenen Untersuchung zeigten ausnahmslos eine deutliche β-Hämolyse
mit einem Durchmesser von bis zu 3,0 mm. Auch hier hatten die Kolonien einen deutlich
gekennzeichneten Rand und konnten als trocken und kompakt bezeichnet werden. Sie wuchsen
auf Columbia-Schafblut-Agar konvex mit einem Durchmesser von 1,0 bis 2,0 mm und in
Flüssigmedium (Todd-Hewitt-Broth, Oxoid, Wesel) als grau-weißes Sediment mit klarem
Überstand. Die Farbe der Kolonien war zunächst ebenfalls grau-weiß, nach längerer Bebrütung
(über 72h) bei 37°C oder Lagerung bei 5°C zeigte sich jedoch die von WEIGT und GRUNERT
(1964) beschriebene, bräunliche Pigmentierung, die sich vom Zentrum der Kolonien ausgehend
bis 0,1 mm vor den Kolonienrand ausbreitete.
Die morphologischen Eigenschaften entsprachen somit im Wesentlichen den Angaben von
STAFSETH et al. (1937), EBERHART und GUSS (1970) sowie DEVRIESE et al. (1986).
Die von KRANTZ und DUNNE (1965) ebenso wie von WATTS (1988), MYHRE et al. (1979)
und FOSTADT (1958) beschriebene α- bzw. γ-Hämolyse konnte hingegen bei keinem der
untersuchten Isolate beobachtet werden.
72
5.3 Biochemische Reaktionen von S. canis
Alle 115 Feldisolate der vorliegenden Untersuchung ließen sich aufgrund ihrer biochemischen
Reaktionen mittels Api 20-Strep eindeutig als S. canis identifizieren. Dabei lag die mittels APIATB-Software berechnete Nachweiswahrscheinlichkeit bei 105 (91,3%) der Stämme bei 99,9%.
Lediglich 10 Isolate zeigten eine niedrigere Nachweiswahrscheinlichkeit, wobei diese nie
geringer als 91,5% war. Bei Vergleichsstudien zur Zuverlässigkeit verschiedener
Untersuchungen zur Eingruppierung von ß-hämolysierenden Streptokokken mit 161 Feld- und
sieben Referenzstämmen (LOGERING 1981) erwies sich das API-Strep-System mit nur einer
falschen Identifizierung als sehr zuverlässig (korrekte Eingruppierung: 99,38%) zur
Identifizierung von S. canis.
Alle Isolate der vorliegenden Untersuchung zeigten Aktivitäten von alkalischer Phosphatase,
Leucinarylamidase und Arginindihydrolase und waren in der Lage, Ribose und Stärke zu
verstoffwechseln. Dies entspricht den Angaben von DEVRIESE et al. (1986) ebenso, wie das
Fehlen der Fähigkeit zur Fermentierung von Arabinose und Inulin. Anders als bei DEVRIESE
et al. (1986) waren die untersuchten Stämme jedoch nicht in der Lage, Glycogen zu
verstoffwechseln und wiesen ebenfalls keine β-Glucuronidase-Aktivität auf, die auch bei
einigen Stämmen in Untersuchungen von CLARK et al. (1984) und SOEDARMANTO und
LÄMMLER (1996) beschrieben wird. Nur einige wenige Stämme der vorliegenden Studie
zeigten die Fähigkeit, Na-Hippurat zu hydrolysieren (3,5%) sowie Sorbitol (1,7%), Mannitol
(0,9%) und Raffinose (0,9%) zu verstoffwechseln. Diese Aktivität war bei den von DEVRIESE
et al. (1986) untersuchten Isolaten überhaupt nicht nachweisbar. Hingegen zeigten 25% der von
WATTS et al. (1984) untersuchten G-Streptokokken vom Rind Fermentationsaktivität
gegenüber Raffinose. Ebenfalls abweichend von der Beschreibung von DEVRIESE et al. (1986)
bildeten fast alle Stämme der vorliegenden Untersuchung (96,2%) Pyrrolidonylarylamidase,
und zusätzlich verlief bei 17,4% der Isolate der Voges-Proskauer-Test, im Gegensatz zur
Beschreibung anderer Autoren (CLARK et al. 1984) positiv. Bei 85,2% der Isolate in der
vorliegenden Arbeit konnte die Aktivität von α-Galactosidase nachgewiesen werden, was in
etwa den Beobachtungen von DEVRIESE et al. (1986) entspricht, die bei 74,0% der von ihnen
untersuchten Isolate α-Galactosidase nachweisen konnten. Auch der Anteil von Isolaten, die βGalactosidase verstoffwechseln können, entsprach mit 99,0% in der vorliegenden Untersuchung
den Befunden anderer Autoren. Von den von DEVRIESE et al. (1986) untersuchten Stämmen
wiesen 90% β-Galactosidase-Aktivität auf, bei den Untersuchungen von CLARK et al. (1984)
waren 98% der vom Hund stammenden Isolate und 100% der vom Rind stammenden Isolate in
73
der Lage, Galactose mit Hilfe von β-Galactosidase zu spalten. Nach WHATMORE et al. (2001)
ist durch die Fähigkeit zur Bildung von α-Galactosidase und β-Galactosidase eine
Unterscheidung zwischen human- und tierpathogenen Isolaten möglich. Der Nachweis von αGalactosidase und β-Galactosidase kann also als diagnostisches Kriterium eingesetzt werden,
um z.B. Aussagen über die Infektionsquelle zu machen.
Die Fermentation von Lactose konnte bei 94,7% der untersuchten Isolate nachgewiesen werden.
Auch SOEDARMANTO und LÄMMLER (1996) berichten über eine ähnliche Rate (94,0%),
wogegen bei den Untersuchungen von CLARK et al. (1984) und WATTS (1988) nur zwischen
32% und 43% der untersuchten Isolate Lactose abbauen konnten. Auch bei der
Verstoffwechselung von Trehalose entsprechen die vorliegenden Befunde mit 21% denen von
SOEDARMANTO und LÄMMLER (1996). Nur bei den von CLARK et al. (1984)
untersuchten Kulturen waren 99% der von Hunden stammenden Isolate in der Lage, Trehalose
zu verwerten. Den von MCDONALD und MCDONALD (1976) aus entzündeten Eutern
isolierten G-Streptokokken fehlt vollständig die Fähigkeit, Stärke zu spalten, die hingegen die in
der vorliegenden Untersuchung beobachteten Isolate ausnahmslos alle aufweisen. Den von
WATTS (1988) untersuchten Stämme fehlte die Fähigkeit, Ribose zu fermentieren vollständig.
Von den in der vorliegenden Untersuchung analysierten Isolaten waren hingegen alle in der
Lage, Ribose zu fermentieren.
Die von KUNTER (1968) bei sechs der neun untersuchten Stämme beobachtete Fähigkeit,
Arabinose zu spalten, fehlt den hier untersuchten Stämmen vollständig. Von allen genannten
Autoren übereinstimmend bewertet wird die negative Inulin-Fermentation und eine
überwiegend negative Na-Hippurat-Hydrolyse sowie Sorbitol-, Raffinose- und MannitolVerstoffwechselung. HASSAN et al. (2005) beschreiben in ihren Untersuchungen eine variable
Äskulin-Spaltung. Während in einer ersten Untersuchung keines der 31 Isolate Äskulin spalten
konnte, zeigten alle Isolate nach der zweiten Subkultur eine positive Reaktion. Die Fähigkeit
zur Äskulin-Spaltung ist also als ein Kriterium zur biochemischen Charakterisierung
ungeeignet. Auch andere Autoren (BARNUM und FULLER 1953, WATTS 1988) geben die
Wahrscheinlichkeit einer positiven Äskulin-Reaktion mit 50% bis 62% an. Die Möglichkeit,
dass sich biochemische Eigenschaften der Isolate, wie z.B. die Äskulinspaltung, im Rahmen der
Subkultivierung ändern können, stellt eine mögliche Fehlerquelle im Hinblick auf die
phänotypische Typisierung mittels biochemischer Muster dar. Die beschriebenen
biochemischen Unterschiede sind dabei das Ergebnis einer unterschiedlichen Enzymausstattung
verschiedener S. canis-Isolate. Diese Variabilität kann unter anderem durch Mutationen wie den
Erwerb oder Verlust eines Plasmid-Ringes oder durch Deletion, Insertion oder Rearrangement
74
(Austausch einer oder mehrerer Basen in einer entsprechenden Gensequenz) entstehen. Die
dabei entstandenen Veränderungen im Genom müssen nicht unbedingt in der PFGE zu
erkennen sein, da dort nur die Größe, nicht aber die Funktion der einzelnen DNA-Sequenzen
differenziert werden.
Viele der zitierten Untersuchungen führten nur einen Teil der hier aufgeführten biochemischen
Nachweismethoden durch, so dass ein Vergleich möglicher Biotypisierung nicht durchführbar
war. Bei der großen Variabilität der beobachteten biochemischen Reaktionen erstaunt es nicht,
dass sich, anders als bei CHAFFER et al. (2005), deren 18 untersuchte Isolate aus einem
Bestand identische biochemische Eigenschaften aufwiesen, bei den hier untersuchten 115
Feldisolaten 24 verschiedene biochemische Reaktionsmuster unterscheiden ließen, die sich
jedoch als nicht betriebsspezifisch erwiesen.
5.4. Serologische Reaktionen von S. canis
Die serologischen Eigenschaften von S. canis werden bestimmt durch ein gemeinsames
Gruppenpolysaccharid-Antigen mit S. dysgalactiae Serovar G, das PRITCHARD et al. (1988)
als ein Glycoprotein aus Rhamnose, Galactose und N-Acetylgalactosamin mit L-Rhamnose als
determinierender Gruppe beschreiben. WIBAWAN und LÄMMLER (1990) wiesen zusätzlich
die Proteinantigene X und R nach. Außerdem verfügt S. canis über IgG-Fc-Rezeptoren vom
Typ IV als Bindungsstellen für IgG (MYHRE und KRONVALL 1980).
In der hier vorliegenden Untersuchung wurde lediglich die Lancefield-Gruppe mittels CoAgglutination mit den Lancefield-Gruppenantigenen-Antiseren B, C, D und G durchgeführt.
Dabei reagierten alle 115 Isolate stark positiv mit dem für die Lancefield-Gruppe G spezifischen
Antiserum. 54 Isolate (46,96%) zeigten jedoch zusätzlich eine deutlich weniger starke Reaktion
mit dem Antiserum der Lancefield-Gruppe C, wobei eine Verbindung zwischen den
beobachteten Agglutinations-Reaktionen und der Herkunft der Isolate nicht festgestellt werden
konnte. Weitere Kreuzreaktionen mit den übrigen hier eingesetzten Lancefield-GruppenAntiseren waren nicht nachweisbar.
Die von STAFSETH et al. (1937) erstmals beschriebenen S. canis-Kulturen wurden zunächst
als „Lancefield C, animal pathogens“ eingeordnet.
EBERHART und GUSS (1970) sowie BARNUM und FULLER (1953) konnten keine
Kreuzreaktionen mit Antiseren anderer Lancefield-Gruppen nachweisen. MILLER und
HEISHMAN (1940) untersuchten 44 G-Streptokokken-Stämme, wobei zwei Kulturen weder
mit dem Lancefield-Gruppen-Antiserum G noch mit Antiseren einer anderen Lancefield-Gruppe
reagierten. DEVRIESE et al. (1986) stellten bei insgesamt 31 untersuchten Stämmen eine starke
75
Co-Agglutination mit Gruppe-G-Antiserum fest. Außerdem zeigten 15 ihrer Isolate
Kreuzreaktionen mit Antiserum der Gruppe B der Firma Wellcome, aber keine Kreuzreaktion
mit Gruppe-G-Antiserum der Firma Oxoid.
LAUGHTON und DAVIES (1957) beschreiben schwache Kreuzreaktionen mit Antiseren der
Gruppen A und L, seltener mit B und C bei einigen der untersuchten Stämme. Als Ursache
vermuten sie ein gemeinsames Nucleo-Protein-Antigen aller Streptokokken-Arten oder eine
zufällige Ausprägung gleicher Oberflächen-Antigene einiger individueller Isolate. Außerdem
können ihrer Ansicht nach falsch positive Reaktionen durch nicht Typ-spezifische oder
Kohlenhydrat-Antikörper oder Protein-Antigene entstehen. Die Zuverlässigkeit der
Untersuchung ist daher abhängig von der Qualität des verwendeten Antiserums. Deshalb
vertreten sie den Standpunkt, dass negative Reaktionen aussagekräftiger sind als positive. Heute
gehört die Objektträger-Agglutination zu den Routineverfahren in der Mikrobiologie, und die
Standardisierung der Produktionsverfahren, Qualitätskontrollen und ständig zunehmendes
Wissen über die Proteinstrukturen geben den Untersuchungen ein großes Maß an
Zuverlässigkeit.
Die in der eigenen Untersuchung beobachteten Kreuzreaktionen sind evtl. durch die oben
erwähnten Faktoren bedingt.
5.5. Molekularbiologische Untersuchungsmethoden
Durch molekulare Analyse bestimmter Abschnitte des bakteriellen Genoms ist eine PCRvermittelte Identifizierung einer Bakterienspezies möglich.
Nach BENTLEY et al. (1991) stellt sich die ribosomale RNA als funktioneller und struktureller
Baustein der Ribosomen, die durch DNA-Transkription entsteht, als geeignet dar. Die 16S
rRNA als bedeutender Anteil der ribosomalen RNA enthält sowohl konstante als auch variable
Abschnitte. Daraus ergeben sich bezüglich der Analyse des 16S rRNA-Gens prinzipiell zwei
Strategien. Mit so genannten universellen Primern werden die konstanten Genabschnitte
aufgesucht. Die dazwischen liegenden variablen Regionen werden amplifiziert. Die eigentliche
Speziesidentifikation erfolgt durch den Restriktionsverdau der Amplifikate
(ABDULMAWJOOD et al. 1998, LÄMMLER et al. 1998). Eine Alternative zum oben
genannten Vorgehen besteht in einer direkten Nutzung von spezifischen Primern für den
variablen Bereich. Nach BENTLEY und LEIGH (1995) sind diese variablen Genabschnitte im
Laufe der Evolution jedoch Mutationen unterworfen. Dennoch scheinen sie in ihrer Variabilität
gering und ausreichend stabil zu sein. Die Amplifizierung eines Genabschnittes definierter
Größe ermöglicht somit eine Identifizierung der betroffenen Bakterien-Spezies
76
(ABDULMAWJOOD und LÄMMLER 1999, WHATMORE et al. 2001, KAWATA et al. 2004,
HASSAN et al. 2005).
Als weiteres Verfahren wurde in der vorliegenden Arbeit die tDNA-PCR eingesetzt. Auch die
tRNA enthält konstante und variable Abschnitte. Die stabilen tRNA-Gene ermöglichen die
Entwicklung von spezies-spezifischen Oligonukleotid-Primern, die die Amplifikation der
Zwischensequenzen phylogenetisch verwandter Gruppen erlauben. Dabei ist weniger die Anoder Abwesenheit dieser Amplifikate, sondern vielmehr deren Größe das charakteristische
Merkmal. Die Stabilität der Reihenfolge, mit der tRNA-Gene innerhalb eines Cistrons
gebündelt sind, ist spezies-spezifisch, so dass ein genaues Profil der Größe der
Zwischensequenzen (intergenic length polymorphism; ILP) erstellt werden und einer Spezies
zugeordnet werden kann. Primer der die entsprechende Zwischenregion flankierenden tRNAGene können dann zur Amplifikation der Zwischensequenzen aller hinreichend verwandten
Mikroorganismen verwandt werden. Bei Bakterien umfasst diese Verwandtschaft die Genusebene.
Beide angewandten Untersuchungsmethoden identifizierten die 24 Isolate aus den
verschiedenen Betrieben als S. canis.
Im Gegensatz zu den zu rein diagnostischen Fragestellungen entwickelten
molekularbiologischen Untersuchungsverfahren werden Ribotyping (HUET et al. 1993, RIVAS
et al. 1997), die „Restriction Endonuclease Analysis“ (DENNING et al. 1989), die „DNA
Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis“ (BLUMBERG et al. 1992, JAYARAO
et al. 1992, HAUGE et al. 1996) und die „Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis“
(CHATTELIER et al. 1997, GILLESPIE et al. 1997, MARTINEZ et al. 2000) für Fragen der
Infektionsepidemiologie, deren Aufgabe die Ermittlung von Infektionsquellen und
Übertragungswegen für pathogene Krankheitserreger ist, angewandt.
Mit der Makrorestriktionsanalyse der chromosomalen DNA in Verbindung mit der anschließend
durchgeführten PFGE steht seit einigen Jahren ein Verfahren zur Verfügung, das eine
Auftrennung bakterieller DNA in der Größenordnung von 50 bis 6000 kb ermöglicht
(GARDINER 1991). Diese, oftmals im Vergleich zu den übrigen oben angeführten Verfahren
als „Goldstandard“ bezeichnete Technik ermöglicht gewissermaßen einen „genetischen
Fingerabdruck“ (DNA-Fingerprint) und lässt sich zur Intraspezies-Typisierung mit dem Ziel der
Aufklärung epidemiologischer Zusammenhänge einsetzen.
Bei der vorliegenden Untersuchung von 115 Isolaten konnten nach Makrorestriktion mit Sma I
und anschließender PFGE lediglich 21 Restriktionsmuster unterschieden werden. Alle zum
77
identischen Zeitpunkt aus einem Betrieb gewonnenen Isolate zeigten dabei ein identisches
Restriktionsmuster. Der visuelle Vergleich der Bandenmuster wurde wie bei RÖMLING et al.
(1995) beschrieben durchgeführt. Für den Vergleich unterschiedlicher Fragmentmuster wurde
zusätzlich das Programm GelCompar (Applied Maths, Kortrijk, Belgien) herangezogen.
5.6. Epidemiologie von S. canis
Zur Analyse der PFGE-Fragmentmuster waren nach TENOVER et al. (1995) keine
standardisierten Kriterien gegeben. Stämme ohne Unterschiede in den Bandenmustern müssen
als identisch angesehen werden (MASLOW 1993, TENOVER 1995). In bis zu drei
Bandenpositionen differenzierbare Isolate können aus einem einzigen genetischen „event“
entstanden sein (TENOVER 1995, GÖRING 1998). Solche Kulturen stellen möglicherweise
epidemiologisch eng verwandte Subtypen desselben Stammes dar. TENOVER (1995) führt an,
dass Isolate mit mehr als drei unterschiedlichen Banden im Restriktionsmuster als miteinander
verwandt angesehen werden müssen, die verwandtschaftlichen Beziehungen der entsprechenden
Kulturen aber als nicht so eng zu bezeichnen sind. Eine epidemiologische Verwandtschaft bei
vier bis sechs unterschiedlichen Banden ist zwar noch möglich, aber nicht mehr als
wahrscheinlich anzusehen. Unterscheiden sich mehr als sieben Banden vom Referenzstamm, ist
eine Verwandtschaft und damit eine ursächliche Beteiligung an einer Infektion praktisch
ausgeschlossen.
Bis auf eine Kultur zeigten alle zeitgleich in den unterschiedlichen Betrieben gewonnenen S.
canis-Isolate ein zu 100% identisches Fragmentmuster nach Makrorestriktion mittels Sma I in
der PFGE. Die bei einer Kultur nachweisbare Abweichung vom Fragmentmuster in zwei Banden
ist möglicherweise auf eine spontane Mutation zurückzuführen oder das Ergebnis mehrfacher
Subkultivierung (TENOVER 1995).
Vergleichbare Resultate werden auch von anderen Autoren in Bezug auf die Untersuchungen von
S. agalactiae berichtet. MERL et al. (2003) untersuchten 79 Stämme aus sieben Betrieben, wobei
die Restriktionsmuster der PFGE innerhalb der Betriebe identisch oder nahezu identisch waren
(Homologie bei Restriktion mit ApaI: 89% - 95%). Die Muster der Feldstämme aus
verschiedenen Beständen unterschieden sich deutlich (Homologie 30% - 60%) und wiesen auf
keine epidemiologische Beziehung hin. Auch bei der von DUARTE et al. (2004) durchgeführten
Untersuchung von 85 S. agalactiae-Stämmen waren die Restriktionsmuster innerhalb der Herden
fast immer identisch (Homologie 82% - 100%), während diese bei Isolaten aus verschiedenen
Herden signifikante Unterschiede aufwiesen (Homologie 40% - 70%). Dabei wiesen die
78
Dendrogramme der RAPD-PCR und der PFGE fast immer die gleichen Verwandtschaftsgrade
der Stämme untereinander auf. Auch die von AKINEDEN et al. (2001) untersuchten Isolate von
S. aureus zeigten bezüglich ihrer Restriktionsprofile innerhalb der Bestände eine große
Übereinstimmung. In drei der sieben untersuchten Betriebe waren alle untersuchten Isolate im
Restriktionsmuster identisch, in drei weiteren waren zwei und nur in einem Bestand drei
unterschiedliche Typen nachweisbar. Auch hier unterschieden sich die Restriktionsmuster der
verschiedenen Herden deutlich von einander. Ähnliche Beobachtungen beschreiben auch
ANNEMÜLLER et al. (1999). Bei ihren Untersuchungen von 25 S. aureus-Stämmen aus sechs
Betrieben waren in einem Betrieb die Restriktionsmuster der Isolate identisch. In vier anderen
Betrieben konnten bis zu zwei, bei einem Betrieb drei verschiedene Restriktionsmuster
unterschieden werden. Zwei der Restriktionmuster konnten nur in jeweils einem Betrieb
nachgewiesen werden, die anderen Restriktionsmuster waren jeweils bei drei oder vier Betrieben
nachweisbar.
Demgegenüber zeigen die Untersuchungen von DOUGLAS et al. (2000), BASEGGIO et al.
(1997) oder KHAN et al. (2003) die große Diversität von S. dysgalactiae oder S. uberis innerhalb
einer Milchviehherde. So finden DOUGLAS et al. (2000) bei 342 Isolaten von S. uberis aus
Milchproben von Kühen mit klinischer oder subklinischer Mastitis nach
Makrorestriktionsanalyse und PFGE 330 verschiedene Restriktionsmuster. Die Proben stammten
aus 15 verschiedenen Regionen Neuseelands und wurden von unterschiedlichen Untersuchern in
einem Zeitraum von zwei Jahren gesammelt.
Die Autoren finden mittels Makrorestriktionsanalyse und PFGE nur wenige übereinstimmende
Restriktionsmuster, die entweder von Isolaten aus verschiedenen Vierteln einer Kuh oder von
verschiedenen Kühen eines Betriebes stammten. Die große Anzahl unterschiedlicher
Restriktionsmuster sowie die meist unterschiedliche Herkunft der wenigen (11) identischen
Muster bestätigen die klinischen Beobachtungen nach Ansicht der Autoren (DOUGLAS et al.,
2000), dass es sich bei S. uberis um einen in der Umwelt der Tiere vorkommenden Keim handelt,
der nur äußerst selten von Viertel zu Viertel oder von Kuh zu Kuh übertragen wird.
Infektionsquellen sind verschiedene Reservoire in der Umgebung der Kühe.
Verglichen mit den oben aufgeführten Befunden mit unterschiedlichern Mastitiserregern anderer
Autoren sprechen die Befunde der hier vorliegenden Untersuchung für das Vorliegen eines
kontagiösen Infektionsgeschehens bei der durch S. canis bedingten subklinischen Mastitis des
Rindes.
TENOVER et al. (1995) gehen bei visuell bewertbaren Abweichungen von bis zu drei Banden
(Homologie 84,5% und 96,1%) von mutationsbedingten Veränderungen aufgrund eines
79
genetischen „Events“ aus. Erst bei Abweichungen von vier oder mehr Banden (Homologie unter
83%) muss bei der Beurteilung der verwandtschaftlichen Beziehungen der epidemiologische
Hintergrund mit in Betracht gezogen werden. Eine genetische und damit epidemiologische
Verwandtschaft trotz größerer genetischer Variation kann beobachtet werden bei Isolaten, die
entweder über einen längeren Zeitraum (≥ 6 Monate) oder bei großen Probenaufkommen im
Rahmen eines ausgedehnten Krankheitsausbruchs gesammelt wurden. Sind diese
Vorraussetzungen nicht gegeben, ist von Isolaten unterschiedlicher klonaler Herkunft
auszugehen und eine Neuinfektion durch einen anderen Stamm wahrscheinlich.
Wie bereits oben angesprochen, beeinflusst die Länge des Probennahmeintervalls das Auftreten
von S. canis-Isolaten mit unterschiedlichen Makrorestriktionsmustern der genomischen DNA. In
der vorliegenden Arbeit konnten die Restriktionsmuster-Typen in zwei Beständen (VI und XII)
nach drei zeitlich versetzten Probennahmen beurteilt werden. In dem Betrieb VI fanden sich bei
zwei Probennahmen im Abstand von etwa zwei Monaten identische Restriktionsmuster bei den
S. canis-Isolaten. Eine weitere Untersuchung im Abstand von fünf Monaten jedoch ergab im
visuellen Vergleich Abweichungen vom Restriktionsmuster des Ursprungisolates von zwei
Banden. Die computergestützte Dendrogrammerstellung ergab hierbei eine Homologie von
86,5%. Vergleichbare Ergebnisse konnten im Betrieb XII erhalten werden. Während nach einem
Untersuchungsintervall von vier Wochen visuell beurteilbare Abweichungen in Form von nur
einer Bande auftraten, unterschied sich das Restriktionsmuster der S. canis-Kultur aus einer
bereits elf Monate zuvor entnommenen Probe ebenfalls deutlich (Homologie 84%) von dem
Restriktionsmuster der Vergleichskultur.
Die Befunde der Betriebe, die insgesamt an zwei Untersuchungszeitpunkten beprobt werden
konnten, bestätigen im Wesentlichen die obigen Beobachtungen. Trotz eines relativ langen
Intervalls von vier Monaten konnten im Restriktionsprofil identische S. canis-Isolate
nachgewiesen werden (Betrieb VIII). Auch bei Betrieb XV (Untersuchungsintervall vier
Wochen) wurden identische Restriktionsmuster erhalten. Gemäß der Angaben von TENOVER et
al. (1995) ist somit bei den beobachteten Veränderungen in den Restriktionsmustern der S. canisIsolate von mutationsbedingten Veränderungen auszugehen.
Muster, die sich in zwei Fragmenten voneinander unterscheiden, können nach GÖRING (1998)
durch Insertion bzw. Deletion eines DNA-Sequenzabschnittes außerhalb der Sma I-Schnittstelle
hervorgerufen worden sein. Unterschiede in drei Banden erklärt GÖRING (1998) mit einer
Insertion bzw. Deletion im Schnittstellenbereich des betroffenen Genoms. Unterschiede nur eines
Fragmentes sind laut GÖRING zwar theoretisch möglich, treten jedoch äußerst selten auf. So
könnte die Deletion eines DNA-Fragmentes mit beiden flankierenden Schnittstellen zum Verlust
80
eines einzelnen Fragmentes im PFGE-Muster führen. Da solche genetischen „Events“ eher selten
sind, ist zu vermuten, dass es sich bei der Mehrzahl der dokumentierten
Einzelfragmentdifferenzen um echte Zweifragmentunterschiede handelt. Das zweite gleich große
Fragment ist hinter dem ersten versteckt, da es in der Elektrophorese koimigriert.
Eine Ausnahme stellen die Befunde in Betrieb V dar. Trotz relativ kurzen Abstandes zwischen
den Probennahmen (2 Monate) ergaben sich hier Unterschiede im visuellen Vergleich der
Restriktionsmuster von 6 Banden (Homologie 63%), so dass im vorliegenden Fall von einer
Neuinfektion ausgegangen werden kann.
Auch die übrigen in den vorgenannten Milcherzeugerbetrieben erhobenen mikrobiologischen
Daten sowie die dort vorgefundene hygienische Gesamtsituation unterstützen diese Theorie.
Neben S. canis ließen sich auch S. aureus sowie verschiedene umweltassoziierte
Mikroorganismen (Äskulin-positive Streptokokken, Koagulase-negative Staphylokokken)
nachweisen. Ebenso wurden Hefen aus verschiedenen Eutervierteln isoliert. Die hygienischen
Rahmenbedingungen machen somit eine S. canis-Neuinfektion wahrscheinlich.
In einem weiteren Betrieb betrug das Intervall zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten
ebenfalls zwei Monate. Die Makrorestriktionsmuster der S. canis-Isolate unterschieden sich auch
hier deutlich. Die Homologie im Dendrogramm betrug lediglich 61,5%, so dass auch in diesem
Fall der Theorie der Neuinfektion klar der Vorzug gegeben werden muss.
Der Vergleich von Makrorestriktionsmustern von S. canis-Kulturen aus unterschiedlichen
Milcherzeugerbetrieben ergab keine Hinweise auf klonale Zusammenhänge. Die mittels
Dendrogrammanalyse ermittelten Homologien lagen bei den meisten Isolaten unter 75%.
Einzelne Feldstämme unterschieden sich nicht (Homologie 100%), andere lediglich in drei
Banden (Homologie 83% bzw. 82,5%). Ein geographischer Zusammenhang ließ sich allerdings
nicht feststellen. Die Entfernung zwischen den betroffenen Betrieben lag zwischen 35 km und
125 km. Dennoch ist vorstellbar, dass durch den Handel mit Milchkühen hier eine Infektion des
einen oder anderen Bestandes erfolgte. Anamnestisch ließ sich diese These jedoch nicht
bestätigen.
Alternativ wäre hier an eine zufällige Ähnlichkeit der Restriktionsmuster zu denken, wie sie auch
von DOUGLAS et al. (2000) bei der Untersuchung von S. uberis-Kulturen beschrieben wurde.
Trotz identischer Bandenmuster können die Sequenzen innerhalb der DNA-Bruchstücke
unterschiedlich sein. Lediglich eine Sequenzierung des Bakteriengenoms könnte hier Klarheit
bringen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen deutlich, dass die Eutergesundheitsstörungen der
untersuchten Milcherzeugerbetriebe durch jeweils einen S. canis-Stamm bzw. durch wenige, eng
81
verwandte Stämme hervorgerufen werden. Diese Befunde konnten durch
Makrorestriktionsanalyse der betreffenden Isolate erhoben werden. Bestätigt wurde dies durch
Anwendung der RAPD-PCR. Auch die in unterschiedlichen Intervallen innerhalb eines
Bestandes erhaltenen S. canis-Isolate zeigten überwiegend identische bzw. nur in wenigen
Banden abweichende Restriktionsmuster.
Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass S. canis eindeutig zu den kontagiösen
Mastitiserregern zu rechnen ist. Somit werden überwiegend auf klinischen Beobachtungen
beruhende Befunde älterer Untersuchungen (RØMER 1948, 1953, 1959, EBERHART und
GUSS 1970, GEDEK et al. 1983, WATTS et al. 1984) mittels moderner molekularbiologischer
Techniken bestätigt. Der Nachweis identischer bzw. eng verwandter Isolate Wochen bis Monate
nach Sanierungsbeginn deutet darauf hin, dass die im Falle kontagiöser Mastitiserreger zu
ergreifenden Maßnahmen (Verwendung eines Vormelkbechers, ein Reinigungstuch pro Kuh zur
Euterreinigung, Zitzendippen mit einem von der DVG empfohlenen Dippmittel, Behandlung
nach Antibiogramm) nicht oder nur unvollständig durchgeführt wurden. Damit wird auch
deutlich, dass nur durch konsequente Empfehlung und Umsetzung dieser Sanierungsmaßnahmen
eine vollständige Eradikation des Erregers zu erreichen ist.
82
6
Zusammenfassung
Agnes Wescher
Molekularbiologische Typisierung von Streptococcus canis isoliert aus subklinisch
mastitiskranken Kühen in hessischen Milchviehbetrieben
Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der
Universität Leipzig
und
Landesbetrieb Hessisches Landeslabor, Abteilung II (Veterinärmedizin)
Eingereicht im Juli 2008
(85 S., 11 Abb., 17 Tab., 213 Lit.)
Schlüsselwörter: Milchkuh, Mastitis, S. canis, DNA-Fingerprint, Makrorestriktions-Analyse,
Pulsfeld-Gelelektrophorese, Kontagosität, PCR, morphologische Eigenschaften, biochemische,
molekularbiologische Eigenschaften
Die Prävalenz von S. canis in der gesamten Rinderpopulation ist mit ungefähr 1% sehr niedrig.
In betroffenen Beständen werden allerdings Prävalenzen von bis zu 74% beschrieben.
In der vorliegenden Arbeit wurden 2460 Viertelgemelksproben aus 16 hessischen
Milcherzeugerbetrieben untersucht. 115 S. canis-Isolate konnten gefunden und auf ihre
morphologischen, biochemischen und bei molekularbiologischen Eigenschaften untersucht
werden. Die Isolate stammten von Viertelgemelksproben bzw. Tankproben, die zu einem oder
mehreren Zeitpunkten in den Betrieben genommen wurden.
Die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften erbrachte 24 verschiedene
Reaktionsmuster. Der Vergleich dieser 24 Biotypen mit einem S. canis-Referenzstamm mittels
tDNA-PCR und 16S-RNA-PCR ergab eine völlige Übereinstimmung (100%) und damit eine
sichere Spezies-Identifizierung.
Zur Aufklärung epidemiologischer Zusammenhänge und zur Intra-Spezies-Identifizierung
wurde von allen 115 Isolaten mittels PFGE nach Makrorestriktionsverdau mit SmaI ein DNAFingerprint erstellt. Dabei ergaben sich 21 verschiedene Restriktionsmuster. Von den 21 nach
Makrorestriktion mit Sma I und anschließender PFGE unterscheidbaren Restriktionsmustern
wurde je ein Isolat zur Bestimmung der Differenzierungsfähigkeit der Restriktionsenzyme Cla I
und Apa I sowie der RAPD-PCR weitergehend untersucht. Dabei erbrachte die PFGE nach
Makrorestriktion mit Cla I die wenigsten unterscheidbaren Restriktionsmuster. Die
Diskriminierung durch die RAPD-PCR war differenzierter, wurde aber noch übertroffen von
83
der Anzahl der durch die PFGE nach Makrorestriktion mittels Apa I entstandenen
Restriktionsmuster. Für die Beurteilung epidemiologischer Zusammenhänge bei S. canis ist die
PFGE nach Makrorestriktion mittels Sma I also die differenzierteste Variante.
Die mittels PFGE nach Makrorestriktionsverdau mit Sma I durchgeführten Untersuchungen der
115 Isolate zeigten, dass zu einem Probennahme-Termin gewonnene Isolate identisch waren;
vom gleichen Betrieb zu unterschiedlichen Zeiten entnommene Proben zeigten z.T. deutliche
Unterschiede, und bei Isolaten von verschiedenen Betrieben konnten keine
Verwandtschaftsbeziehungen nachgewiesen werden. Die Übereinstimmung der
Restriktionsmuster weiter entfernt liegender Betriebe kann als eine zufällige Ähnlichkeit
beurteilt werden. Aufgrund dieser genotypischen Eigenschaften der Kulturen konnte gezeigt
werden, dass es sich bei durch S. canis verursachte Mastitiden um ein infektiöses
Bestandsproblem handelt, bei dem der Erreger von Viertel zu Viertel und von Kuh zu Kuh
übertragen wird.
84
7
Summary
Agnes Wescher
Molecular biological typing of S. canis isolated from cows with subclinical mastitis in dairy
farms in Hesse
Large Animal Clinic for Theriogenology and Ambulatory Services, Faculty of Veterinary
Medicine, Universitiy of Leipzig
and
Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes Hessisches Landeslabor, Gießen
Submitted in July 2008
(85 pages, 11 figures, 17 tables, 213 lit.)
Keywords: dairy cow, mastitis, S. canis, DNA-fingerprint, macro-restriction analysis, pulsedfield gel electrophoresis, contagious, PCR, morphological properties, bio-chemical properties,
molecular biological properties
The prevalence of S. canis in cow population is about 1% and has accordingly to be estimated
rather small. The prevalence of S. canis in affected dairy herds on the other hand is reported to
go up to 74%.
In the present investigation, 2460 quartermilksamples were taken from 16 dairy farms in Hesse,
Germany. 115 cultures of S. canis were found and subsequently investigated for their
morphological, bio-chemical and molecular biological properties. The cultures were isolated
from quarter-milk-samples and bulk-milk-samples taken at various different times from the
above mentioned dairy farms.
The investigation of the bio-chemical properties revealed 24 different reaction patterns. The
results of the comparison of these 24 biochemical patterns to a S. canis reference strain by
tDNA-PCR and 16S-RNA-PCR showed a total match (100%), and consequently a reliable
species identification.
Macro-restriction analysis of the chromosomal DNA, by pulsed-field gel electrophoresis using
Sma I as the restriction enzyme, was executed on all 115 isolates to clarify epidemiological
relations and for intra-species-identification. The preparation of the DNA fingerprint yielded 21
different restriction profiles. For each profile one isolate was chosen for further examination of
the discriminating ability of RAPD-PCR as well as the restriction enzymes Cla I and Apa I.
PFGE after macro-restriction with Cla I yielded the smallest amount of restriction profiles.
RAPD-PCR showed a higher discriminating ability. The best discriminating ability among the
85
three methods was shown by PFGE following macro-restriction using the restriction enzyme
Apa I. Therefore the most differentiating method for the investigation of epidemiological
relations of S. canis is PFGE following macro-restriction using Sma I.
Examination of all 115 isolates by PFGE, following macro-restriction-digestion using Sma I,
revealed that isolates of samples taken at one time at one farm showed identical restriction
profiles. Isolates from one farm taken at different times, showed partially distinctly different
profiles and no relations could be shown in isolates from different farms. Occurring homology
between restriction profiles of isolates gathered from different farms, separated by distance,
should be taken as merely coincidental.
Due to the genetic properties of the examined S. canis cultures, it can be shown that the mastitis
caused by S. canis has to be referred to as a contagious herd problem with quarter-to-quarter
and cow-to-cow transmission.
86
8
Literaturverzeichnis
Abdulmawjood A, Lämmler C. Amplification of 16S ribosomal RNA gene sequences for the
identification of streptococci of Lancefield group B. Res Vet Sci. 1999; 67: 159-62.
Abdulmawjood A, Weiss R, Lämmler C. Species identification of Streptococcus porcinus by
restriction fragment length polymorphism analysis of 16S ribosomal DNA. Res Vet Sci. 1998;
65: 85-86.
Akineden Ö, Annemüller C, Hassan AA, Lämmler C, Wolter W, Zschöck M. Toxin Genes and Other
Characteristics of Staphylococcus aureus Isolates from Milk of Cows with Mastitis Clin Diagn
Lab Immunol. 2001; 8: 959-964.
Alouf, JE. Streptococcal toxins (streptolysin O, streptolysin S, erythrogenic toxin). Pharmacol Ther.
1980; 11: 661-717.
Anderson, JC. Progressive pathology of staphylococcal mastitis with a note on control, immunisation
and therapy. Vet Rec. 1982; 110: 372-376.
Annemüller C, Lämmler C, Zschöck M. Genotyping of Staphylococcus aureus isolated from bovine
mastitis. Vet Microbiol. 1999; 69: 217-224.
Appelbaum PC, Friedman Z, Fairbrother PF, Hellmann J, Hallgren EJ. Neonatal sepsis due to group
G streptococci. Acta Paediatr Scand 1980; 69: 559-562.
Barnum DA, Fuller DS. Report on an outbreak of chronic mastits in cattle caused by a Streptococcus
of Lancefield Group G. Can J Comp Med. 1953; 17: 465-472.
Bartlett PC, Miller GY, Lance SE, Heider LE. Managerial determinants of intramammary coliform
and environmental streptococci infections in Ohio dairy herds. J Dairy Sci. 1992; 75: 1241-252.
Baseggio N, Mansell PD, Browning JW, Browning FG. Strain differentiation of isolates of
streptococci from bovine mastitis by pulsed-field gel electrophoresis. Mol Cell Probes. 1997; 11:
349-354.
Beaudeau F, Seegers H, Fourichon C, Hortet P. Association between milk somatic cell counts up to
400,000 cells/ml and clinical mastitis in French Holstein cows. Vet Rec. 1998; 143: 685-687.
Beerwerth W, Köser A, Brühn A. Die kulturelle Nachweisbarkeit von pathogenen Streptokokken der
Milch und ihre Beziehungen zum Auftreten vermehrten Zellgehaltes. Milchwissenschaft 1965;
20: 519-524.
Beerwerth W, Köser A. Streptokokken verschiedener serologischen Gruppen als Mastitiserreger und
ihre Vorkommen außerhalb des Rindereuters. Milchwissenschaft 1965; 20: 590-593.
Bentley RW, Leigh JA, Collins MD. Development and use of species-specific oligonucleotide probes
for differentation of Streptococcus uberis and Streptococcus parauberis. J Clin Microbiol. 1993;
31: 57-60.
87
Bentley RW, Leigh JA, Collins MD. Intrageneric structure of Streptococcus based on comparative
analysis of small-subunit rRNA sequences. Int J Syst Bacteriol. 1991; 41: 487-494.
Bentley RW, Leigh JA. Development of PCR-based hybridization protocol for identification of
streptococcal species. J Clin Microbiol. 1995; 33: 1296-1301.
Bergmann A. Escherichia coli-, Klebsiella- und Enterobacter-Mastitiden. In: WENDT K, BOSTEDT
H, MIELKE H, FUCHS H-W (Hrsg.): Euter- und Gesäugekrankheiten, G. Fischer Verl.,
Jena/Stuttgart, 1994; 359-371.
Bergner-Rabinowitz S, Ferne M, Fleiderman S, Ziv G, Saran A., Winkler M. Group G type X: a new
antigenic combination in streptococci isolated from cases of bovine mastitis in Israel. Vet.
Microbiol. 1981; 6, 383-387.
Bert F, Lambert-Zechovsky N. Septicemia caused by Streptococcus canis in a Human. J. Clin.
Microbiol. 1997; 35: 777-779.
Biberstein EL, Brown C, Smith T. Serogroups and biotypes among beta haemolytic streptococci of
canine origin. J. Clin. Microbiol. 1980; 11: 558-561.
Blackwell JH, McKercher PD, Kosikowski FV, Carmichael LE, Gorewit RC. Histological and
histochemical characterisation of mammary gland tissue of cows infected with foot-and-mouth
disease by contact exposure. Res Vet Sci. 1983; 35: 106-113.
Blumberg HM, Stephens DS, Licitra C, Pigott N, Facklam R, Swaminathan B, et al. Molecular
epidemiology of group B streptococcal infections: use of restriction endonuclease analysis of
chromosomal DNA and DNA restriction fragment length polymorphisms of ribosomal RNA
genes (ribotyping). J Infect Dis. 1992; 166: 574-579.
Bornand V. Bacteriology and mycology of otitis externa in dogs. Schweiz Arch Tierheilkd. 1992;
134: 341-348.
Bramley AJ and FH Dodd. Reviews of the progress of dairy science: mastitis control - progress and
prospects. J Dairy Res. 1984; 51: 481-512.
Bramley AJ. The role of hygiene in preventing intramammary infection. Techn. Bull. Natl. Inst. Res.
Dairying, Shinfield, 1981; 4: 53-66.
Bushnell RB. The importance of hygienic procedures in controlling mastitis. Vet Clin North Am
Large Anim Pract. 1984; 6: 361-370.
Carvalpho C, Gelsin P, Vaz Pato MV. Pulsed-field gel electrophoresis in Streptococcus pneumoniae
isolated in France and Portugal. Path. Biol. 1996; 44: 430-434.
Chaffer M, Friedman S, Saran A, Younis A. An outbreak of Streptococcus canis mastitis in a dairy
herd in Israel. N Z Vet J. 2005; 53: 261-264.
Chatellier S, Ramanantsoa C, Harriau P, Rolland K, Rosenau A, Quentin R. Characterization of
Streptococcus agalactiae strains by randomly amplified polymorphic DNA analysis. J Clin
Microbiol. 1997; 35: 2573-2579.
88
Clark RB, Berrafati JF, Janda JM, Bottone EJ. Biotyping and exoenzyme profiling as an aid in the
differentiation of human from bovine group G-streptococci. Microbios. 1984; 77: 19-27.
Costa EO, Ribeiro AR, Watanabe ET, Melville PA. Infectious bovine mastitis caused by
environmental organisms. Zentralbl Veterinarmed B. 1998; 45: 65-67.
Davidson I. Observation on the pathogenic staphylococci in a dairy herd during a period of six years.
Res. Vet. Sci., 1961; 2: 22-40.
Deibel RM, W Seeley H. Streptococcaceae. In BUCHANAN, R E, and E GIBBONS (eds.): Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology, 8th. Baltimore. Williams and Willkins. 1974: 490-509.
Denning DW, Baker CJ, Troup NJ, Tompkins LS. Restriction endonuclease analysis of human and
bovine group B streptococci for epidemiologic study. J Clin Microbiol. 1989; 27: 1352-1356.
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft. Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als
Herdenproblem. Sachverständigenausschuss: „Subklinische Mastitis“ der Deutschen
Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V; 2002, DVG, Gießen.
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft. Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als
Bestandsproblem. (Fachgruppe Milchhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen
Gesellschaft e.V., 1994; 3. Aufl. DVG Gießen)
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft. Leitlinien zur Entnahme von Milchproben unter
antiseptischen Bedingungen und Leitlinien zur Isolierung und Identifizierung von
Mastitiserreger. Zschöck, M (ed.): Sachverständigenausschuss Subklinische Mastitis des
Arbeitskreises Eutergesundheit der Fachgruppe „Milchhygiene“ des Arbeitsgebietes
Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V., 2000; DVG
Gießen.
Devriese LA, Cruz Colque JI, De Herdt P, Haesebrouck F. Identification and composition of the
tonsillar and anal enterococcal and streptococcal flora of dogs and cats. J Appl Bacteriol. 1992;
73: 421-425.
Devriese LA, De Pelsmaecker K. The anal region as a main carrier site of Staphylococcus
intermedius and Streptococcus canis in dogs. Vet Rec. 1987; 121: 302-303.
Devriese,LA, Hommerz J, Kilpper-Bälz R, Schleifer KH. Streptococcus canis sp. Nov.: A species of
group G streptococci from animals. Int J. Syst. Bacteriol. 1986; 36: 422-425.
Dodd FH, Westgarth DR, Neave FK, Kingwill RG. Mastitis - the strategy of control. J Dairy Sci.
1969; 52: 689-695.
Douglas VL, Fenwick SG, Pfeiffer DU, Williamson NB, Colin CW. Genomic typing of
Streptococcus uberis isolates from cases of mastitis, in New Zealand dairy cows, using pulsedfield gel electrophoresis. Vet Microbiol (Netherlands). 2000; 75: 27-41.
Duarte RS, Miranda OP, Bellei BC, Brito MA, Teixeira LM. Phenotypic and molecular
characteristics of Streptococcus agalactiae isolates recovered from milk of dairy cows in Brazil.
J Clin Microbiol. 2004; 42 (9): 4214-4222
89
Eberhart RJ, Guss SB. Group G streptococci in the udders of a Pennsylvania dairy herd. J Am Vet
Med Assoc. 1970; 157: 1159-99.
Engebretsen O.. An approach to identification of „atypical streptococci“ from bovine mastitis
serological classification and resistance determinations. Nord Veterinaermed. 1968; 20: 557-561.
Farrow JAE, Collins MD. Taxonomic Studies on Streptococci of Serological Groups C, G and L and
Possibly Related Taxa. System Appl Microbiol. 1984; 5: 483-493.
Forbes D, Hebert CN. Studies in the pathogenesis of staphylococcal mastitis. Vet Rec. 1968; 82: 6973.
Fostadt VFH. Mastitis caused by CAMP positive α-hemolytic group G-streptococci. Nord
Veterinaermed. 1958; 10: 431-6.
Fox LK, Gay JM. Contagious mastitis. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 1993; 9: 475-487.
Fox LK, Gershmann M, Hancock DD, Hutton CT. Fomites and reservoirs of Staphylococcus aureus
causing intramammary infections as determined by phage typing: the effect of milking time
hygiene practices. Corn Vet. 1991; 81: 183-193.
Fox LK, Hancock DD. Effect of segregation on prevention of intramammary infectiona by
Staphylococcus aureus. J Dairy Sci. 1989; 72: 540-545.
Fox LK. Colonization by Staphylococcus aureus on chapped teat skin: effect of iodine and
chlorhexidine postmilking disinfectants. J Dairy Sci. 1992; 72: 66-71.
Friton GM, Sobiraj A, Richter A. Effects of various antibiotic treatments of lactating cows with
subclinical mastitis. Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere, 1998; 26: 254-260.
Fuchs HW. Virusinfektionen. In: WENDT K, BOSTEDT H, MIELKE H, FUCHS H-W (Hrsg.):
Euter- und Gesäugekrankheiten, G. Fischer Verl., Jena/Stuttgart, 1994; 422-425.
Galton DM, Adkinson RW, Thomas CV, Smith TW. Effects of remilking udder preparation on
environmental bacterial contamination of milk. J Dairy Sci. 1982; 65: 1540-1543.
Galton DM, Petersson LG, Erb HN. Milk iodine residues in herds practicing iodophor premilking teat
disinfection. J Dairy Sci. 1986; 69: 267-271.
Galton DM, Petersson LG, Merrill WG, Bandler DK, Shuster DE. Effects of premilking udder
preparation on bacterial population, sediment, and iodine residue in milk. J Dairy Sci. 1984; 67:
2580-2589.
Gardiner K. Pulsed field gel electrophoresis. Analyt Chem. 1991; 63: 658-665.
Gaston MA, Hunter PR. Efficient selection of tests for bacteriological typing schemes. J Clin Pathol.
1989; 42: 763-766.
Gedek W, Kleinschroth E, Deneke J. Subklinische Mastitis. Empfehlungen für die Therapie der
subklinischen Mastitis des Rindes (Teil 1). Vet 1987; 2: 6-8.
90
Gillespie BE, Jayarao BM, Oliver SP. Identification of Streptococcus species by randomly amplified
polymorphic deoxyribonucleic acid fingerprinting. J Dairy Sci, 1997; 80: 471-6.
Goering RV. The molecular epidemiology of nosocomial infections. An overview of principles,
applications and interpretation. In: SPENCER et al.: Rapid detection of infectious agents, Plenum
Press, New York, 1998; 131-157.
Gonzalez RN, Jasper DE, Kronlund NC, Farver TB, Cullor JS, RB Bushnell, et al. Clinical mastitis in
two California dairy herds participating in contagious mastitis control programs. J Dairy Sci.
1990; 73: 648-660.
Goodger WJ, Ferguson G. Benefits and costs of a control program for an epizootic of Staphylococcus
aureus mastitis. J Am Vet Med Assoc. 1987; 190: 1284-1287.
Grothues D and B Tümmler. New approaches in genome analysis by pulsed-field gel electrophoresis
application to the analysis of Pseudomonas species. Mol Microbiol. 1991; 5: 2763-2776.
Gudding R. The demonstration and characterization of deoxyribonucleases of streptococci group A,
B, C, G and L. Acta Vet Scand. 1979; 20: 102-121.
Hahn G, Tolle A. Ergebnisse aus der Streptokokken-Zentrale in Kiel von 1965 bis 1977: Ein
Überblick. Zbl Bakt Hyg. I. Abt. Orig A. 1979; 244: 427-438.
Hahn G. Streptokokken. In BLOBEL, H, und T SCHLISSER (eds.): Handbuch der bakteriellen
Infektionen bei Tieren, Bd. II VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1980; 161-278.
Hamann J, Reichmuth J. Exogene Einflüsse auf den Zellgehalt der Milch unter Berücksichtigung des
Gesundheitszustandes der Milchdrüse. Milchwissenschaft 1990; 45: 286-290.
Hamilton CA, Stark DM. Occurrence and characterization of Lancefield group G streptococci in
bovine mastitis. Am J Vet Res. 1970; 31: 397-398.
Harmon RJ. Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts. J Dairy Sci. 1994; 77:
2103-2112.
Hassan AA, Akineden O, Usleber E. Identification of Streptococcus canis isolated from milk of dairy
cows with subclinical mastitis. J Clin Microbiol. 2005; 43: 1234-1238.
Hassan AA, Khan IU, Abdulmawjood A, Lämmler C. Development of PCR assays for detection of
Streptococcus canis. FEMS Microbiol Lett. 2003; 219: 209–214.
Hauge M, Jespersgaard C, Poulsen K, Kilian M. Population structure of Streptococcus agalactiae
reveals an association between specific evolutionary lineages and putative virulence factors but
not disease. Infect Immun. 1996; 64: 919-925.
Heeschen W, Hamann J. Die Bedeutung der Zitzendesinfektion im Rahmen der Mastitisbekämpfung.
Tieräztl Umschau 1987; 42: 362-369.
91
Heeschen W. Zur Stellung der Zitzendesinfektion und –pflege in der Prävention der Mastitis. In:
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft: Tagung der Fachgruppe „Milchhygiene“,
Arbeitskreis „Eutergesundheit“, Grub, 27.-28.9.1996, DVG, Gießen, 1996; 26-36.
Hillerton JE, Bramley AJ, Staker RT, McKinnon CH. Patterns of intramammary infection and clinical
mastitis over a 5 year period in a closely monitored herd applying mastitis control measures. J
Dairy Res. 1995; 62: 39-50.
Hogan JS, Smith KL, Hoblet KH, Schoenberger PS, Todhunter DA, Hueston WD, et al. Field survey
of clinical mastitis in low somatic cell count herds. J Dairy Sci. 1989; 72: 1547-1556.
Hogan JS, Smith KL, Hoblet KH, Todhunter DA, Schoenberger PS, Hueston WD, et al. Bacterial
counts in bedding materials used on nine commercial dairies. J Dairy Sci. 1989a; 72: 250-258.
Hogan JS, Smith KL, Todhunter DA, Schoenberger PS. Efficacy of a barrier teat dip containing .55%
chlorhexidine for prevention of bovine mastitis. J Dairy Sci. 1995; 78: 2502-2506.
Hogan JS, Smith KL, Todhunter DA, Schoenberger PS. Rate of environmental mastitis in quarters
infected with Corynebacterium bovis and Staphylococcus species. J Dairy Sci. 1988; 71: 25202525.
Huet H, Martin C, Geslin P, Grimont F, Quentin R. Ribotyping of Streptococcus agalactiae strains
isolated from vaginas of asymptomatic women. Res Microbiol. 1993; 144: 457-465.
Hwang YT, Wobeser G, Lariviere S, Messier F. Streptococcus equisimilis infection in striped skunks
(Mephitis mephitis) in Saskatchewan. J Wildl Dis. 2002; 38: 641-643.
Jayarao BM, Bassam BJ, Caetano-Anolles G, Gresshoff PM, Oliver SP. Subtyping of Streptococcus
uberis by DNA amplification fingerprinting. J Clin Microbiol. 1992; 30: 1347-1350.
Jayarao BM, Dore JJ Jr and Oliver SP. Restriction fragment length polymorphism analysis of 16S
ribosomal DNA of Streptococcus and Enterococcus species of bovine origin. J Clin Microbiol.
1992; 30: 2235-2240.
Jayarao BM, Gillespie BE, Lewis MJ, Dowlen HH, Oliver SP. Epidemiology of Streptococcus uberis
intramammary infections in a dairy herd. Zentralbl Veterinarmed B. 1999; 46: 433-442.
Jayarao BM, Oliver SP, Tagg JR, Matthews KR. Genotypic and phenotypic analysis of Streptococcus
uberis isolated from bovine mammary secretions. Epidemiol Infect. 1991; 107: 543-555.
Jayarao BM, Schilling EE, Oliver SP. Genomic deoxyribonucleic acid restriction fragment length
polymorphism of Streptococcus uberis: evidence of clonal diversity. J Dairy Sci. 1993; 76: 468474.
Jepson PD, Baker JR, Kuiken T, Simpson VR, Kennedy S, Bennett PM. Pulmonary pathology of
harbour porpoises (Phocoena phocoena) stranded in England and Wales between 1990 and 1996.
Vet Rec. 2000; 46: 721-728.
Jones MA, Shannon AD. The control of the level of staphylococcal contamination of the bovine
udder by shed management. N Z Vet J. 1972; 20: 179-182.
92
Kamarudin MI, Fox LK, Gaskins CT, Gay JM. Environmental reservoirs for Serratia marcescens
intramammary infections in dairy cows. J Am Vet Med Assoc. 1996; 208: 555-558.
Kasche S. Pathogenese und Therapie der Staphylokokkenmastitis des Rindes. Eine
Literaturstudie.[Dissertation] Hannover: Tierärztl. Hochschule; 1995.
Kawata K, Anzai T, Senna K, Kikuchi N, Ezawa A, Takahashi T. Simple and rapid PCR method for
identification of streptococcal species relevant to animal infections based on 23S rDNA
sequence. FEMS Microbiol Lett., 2004; 237: 57-64.
Khan AJ, Evans HE, Macabuhay MR, Lee Y, Werner R. Primary peritonitis due to group G
Streptococcus: A case report. Pediatrics. 1975; 56: 1078-1079.
Kielwein G, Harr M, Reißhauer G. Ein Beitrag zu aktuellen Fragen der durch betahaemolytische
Streptokokken und Galtstreptokokken verursachten Mastitiden. Tierärztl Umsch. 1962; 17: 415419.
Klastrup, O. Mastitis Control in Denmark Procedures and Experiences. Bull Off Int Épiz., 1963; 60:
501-511.
Krantz GE, Dunne HW. An attempt to classify streptococci isolated from domestic animals. Am J
Vet Res. 1965; 26: 951-959.
Kunter E. Gehäuftes Auftreten von Infektionen des Rindereuters durch β-hämolyzsche Streptokokken
der Gruppen C, G, und L. Monatsh Veterinaermed. 1968; 23: 174-178.
Lam TJ, van Vliet JH, Schukken YH, Grommers FJ, van Velden-Russcher A, Barkema HW, et al.
The effect of discontinuation of postmilking teat disinfection in low somatic cell count herds. II.
Dynamics of intramammary infections. Vet Q. 1997; 19: 47-53.
Lämmler C, Abdulmajwood A, Hassan AA, Estoepangestie S, Annemüller C. Identifikation von
Erregern boviner Mastitiden durch Beurteilung speziesspezifischer Genabschnitte der
ribosomalen RNA. In: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft: 39. Arbeitstagung des
Arbeitskreises Lebensmittelhygiene, Garmisch-Partenkirchen; 1998.
Lämmler C, Chhatwal GS, Blobel H. Binding of human fibrinogen and its polypeptide chains to
group B streptococci. Med Microbiol Immunol. 1983; 172: 149-53.
Lämmler C, Frede C, Gürtürk K, Hildebrand A, Blobel H. Binding activity of Streptococcus canis for
albumin and other plasma proteins. J Gen Microbiol. 1988; 134: 2317-2323.
Lämmler C, Gürtürk K, Blobel H. Streptococcal group B type antigen X in group L streptococci. J
Clin Microbiol. 1987; 25: 1803-1804.
Lämmler C, Hahn G. Streptokokken. In BLOBEL H, SCHLIESSER T. (eds.): Handbuch der
bakteriellen Infektionen bei Tieren, Bd. II/2: Streptokokkeninfektionen und Rotlauf. 2. Auflage
G. Fischer Verlag, Jena/Stuttgart, 1994.
93
Lämmler C, Schaufuss P, Frede C, blobel H. Binding of plasma proteins to streptococci of serological
group L with special reference to their immunoglobulin G Fc receptor activity. Can J Microbiol.
1988a; 34: 1-5.
Lancefield RC, Hare R. The serological differentation of pathogenic and non-pathogenic strains of
hemolytic streptococci from parturient women. J Exp Med. 1935; 61: 335-349.
Lancefield RC, Perlman GE. Preparation and properties of a protein (R antigen) occurring in
streptococci of group A type 28 and in certain streptococci of serological groups. J Exp Med.
1952; 96: 83-97.
Lancefield RC. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J
Exp Med. 1933; 57: 571-595.
Laughton N, Davies J. Animal Strains of Group G Streptococci and their Serological Typing. J gen
Microbiol. 1957; 17: 750-757.
Laughton N. Canine beta haemolytic streptococci. J Pathol Bacteriol. 1948; 60: 471-476.
Levèvre JC, Gasc AM, Lemozy J, Sicard AM, Faucon G. Pulsed-field gel electrophoresis for
molecular epidemiology of penicillin resistant Streptococcus pneumoniae strains. Path Biol,
1994; 42: 547-552.
Ling GV, Ruby AL. Aerobic bacterial flora of the prepuce, urethra, and vagina of normal adult dogs.
Am J Vet Res. 1978; 39: 695-698.
Lipman LJ, de Nijs A, Lam TJ, Gaastra W. Identification of Escherichia coli strains from cows with
clinical mastitis by serotyping and DNA polymorphism patterns with REP and ERIC primers.
Vet Microbiol. 1995; 43: 13-19.
Livoni P. Continued Experiments in collective Action with a view to the Eradication of Mastitis
caused by Streptococci. Intern Vet Congr Stockholm, Proc Part I, 1953; 2: 852-60.
Logering HJ. Comparative study of five different methods for grouping beta-haemolytic streptococci.
Zentralbl Bakteriol. A. 1981; 248: 437-445.
Lorenzen P. Zum Vorkommen von Streptokokken verschiedener serologischer Gruppen als
Mastitiserreger unter besonderer Berücksichtigung der Gruppe L. Arch Lebensmittelhyg. 1968;
19:, 57-60.
Martinez G, Harel J, Higgins R, Lacouture S, Daignault D, Gottschalk M. Characterization of
Streptococcus agalactiae isolates of bovine and human origin by randomly amplified
polymorphic DNA analysis. J Clin Microbiol. 2000; 38: 71-78.
Maslow JN, Slutsky AM, Arbeit RD. Application of pulsedfield gel electrophoresis to molecular
epidemiology. In: PERSING DH, SMITH TF, TENOVER FC, WHITE TJ (ed.) Diagnostic
molecular microbiology: principles and applications. American Society for Microbiology,
Washington, D.C., 1993; 563 – 572.
94
Matthews KR, Harmon RJ, Langlois BE. Effect of naturally occurring coagulase-negative
staphylococci infections on new infections by mastitis pathogens in the bovine. J Dairy Sci.
1991; 74: 1855-1859.
McClelland M, Petersen C, Welsh J. Length polymorphisms in tRNA intergenic spacers detected by
using the polymerase chain reaction can distinguish streptococcal strains and species. J Clin
Microbiol. 1992; 30: 1499-1504.
McDonald JS, Anderson AJ. Experimental intramammary infection of the dairy cow with
Escherichia coli during the nonlactating period. Am J Vet Res. 1981; 42: 229-231.
McDonald JS. Investigation and resolution on herd mastitis due to Staphylococcus aureus. Ann Meet
Natl Mastitis Council 1989; 28: 98-111.
McDonald, TJ, McDonald JS. Streptococci isolated from bovine intramammary infections. Am J Vet
Res. 1976; 37: 377-381.
Mellenberger RW, Troyer B. Control of Staphylococcus aureus through herd segregation. Ann Meet
Natl Mastitis Council 1994; 33: 364-365.
Merl K, Abdulmawjood A, Lämmler C, Zschöck M. Determination of epidemiological relationships
of Streptococcus agalactiae isolated from bovine mastitis. Microbiol Lett. 2003; 226(1):87-92.
Mielke H, Michel G. Schutz und Abwehrmechanismen (Immunologie) des Rindereuters In: WENDT
K, BOSTEDT H, MIELKE H, FUCHS H-W (Hrsg.): Euter- und Gesäugekrankheiten, G. Fischer
Verl., Jena/Stuttgart, 1994; 94-105.
Miller W, Heishman JO. Bovine Mastitis caused by Unusual Types of Streptococci. Cornell Vet.
1940; 30: 310-318.
Mork T, Tollersrud T, Kvitle B, Jorgensen HJ, Waage S. Genetic diversity of Staphylococcus aureus
isolated from ovine intramammary infections in Norway. Vet Microbiol. 2005; 106: 265-273
Myhre E B, Kronvall G. Demonstration of specific binding sites for human serum albumin in group C
and G streptococci. Infect Immun. 1980; 27: 6-14.
Myhre EB, Holmberg O, Kronvall G. Immunglobuline-binding structure on bovine group G
streptococci different from type III Fc receptors on human group G streptococci. Infect Immun.
1979; 23: 1-7.
National Mastitis Council. Summary of peer-reviewed publications on efficacy of premilking and
postmilking teat disinfectants published since 1980. Ann Meet Natl Mastitis Council 1997; 36:
276-287.
Natzke RP, Everett RW, Postle DS. Normal somatic cell counts. J Milk Food Techn. 1972; 35: 261263.
Neave FK, Dodd FH, Kingwill RG, Westgarth DR. Control of mastitis in the dairy herd by hygiene
and management. J Dairy Sci. 1969; 52: 696-707.
95
Neave FK. Diagnosis of mastitis by bacteriological methods alone. In: DODD, FH (ed.), International
Dairy Federation: Proc Of the IDF seminar on mastitis control, Reading, England, 7-11 April
1975, IDF Bruxelles, 1975; 19-36.
Oliver SP, Gillespie BE, Jayarao BM. Detection of new and persistent Streptococcus uberis and
Streptococcus dysgalactiae intramammary infections by polymerase chain reaction-based DNA
fingerprinting. FEMS Microbiol Lett. 1998; 160: 69-73.
Perch B, Olsen SJ. Studies on the type antigens of group L haemolytic streptococci. Nord
Veterinaermed. 1964; 16: 241-263.
Philpot WN, Pankey WJ. Review of microorganisms that reportedly cause mastitis. In: Dairy research
report, Hill farm research station, Homer, LA, 1975; 118-120.
Philpot WN. Control of mastitis by hygiene and therapy. J Dairy Sci. 1979; 62: 168-176.
Pore RS. Prototheca taxonomy Mycopathologia, 1985; 90: 129-139.
Poutrel B, Lerondelle C. Protective effect in the lactating bovine mammary gland induced by
coagulase-negative staphylococci against experimental Staphylococcus aureus infections. Ann
Rech Vet. 1980; 11: 327-332.
Pritchard DG, Rener BP, Furner RL, Huang DH, Krishna NR. Structure of the group G streptococcal.
Carbohydr Res. 1988; 173: 255-262.
Rainard P, Lautrou Y, Sarradin P, Coulibaly A, Poutrel P. The kinetics of inflammation and
phagocytosis during bovine mastitis induced by Streptococcus agalactiae bearing the protein X.
Vet Res Comm. 1991a; 15: 163-176.
Rainard P, Poutrel B. Effect of naturally occurring intramammary infections by minor pathogens on
new infections by major pathogens in cattle. Am J Vet Res. 1988; 49: 327-329.
Reitmeyer JC, Guthrie RK, Steele JH. Biochemical properties of group G streptococci isolated from
cats and man. J Med Microbiol. 1991; 35: 148-151.
Reuterswärd A, Miorner H, Wagner M, Kronvall G. Variations in binding of mammalian fibrinogens
to streptococci groups A, B, C, E, G and to Staphylococcus aureus. Acta Pathol Microbiol
Immunol Scand Sect B. 1985; 93: 77-82.
Rivas AL, Gonzalez RN, Wiedmann M, Bruce JL, Cole EM, Bennett GJ, et al.. Diversity of
Streptococcus agalactiae and Staphylococcus aureus ribotypes recovered from New York dairy
herds. Am J Vet Res. 1997; 58: 482-487.
Roberson JR, Fox LK, Hancock DD, Gay JM, Besser TE. Ecology of Staphylococcus aureus isolated
from various sites on dairy farms. J Dairy Sci. 1994; 77: 3354-3364.
Röder R. Beziehung zwischen Zellgehalt und bakteriologischen Befund von Viertelgemelksproben
beim deutschen Fleckvieh. [Dissertation] München: Ludwig-Maximilian-Universität; 1985.
96
Rømer O. Control of Udder Infection with Group B-, C-, G- and L-Streptococci Diary Herds. Proc
XV Internat Dairy Congress, London, 1959; 1: 99-105.
Rømer O. On the role of C, G and L streptococci in bovine mastitis. Intern Vet Congr Stockholm,
Proc Part I, 1953; 2: 841.
Rømer O. The Significance of Group G Streptococci in Inflammation of the Udder in Cows. Biol
Abstr. 1948; 22: 2519.
Römling U, Fislage R, Tümmler B. Theorie und Anwendung der Makrorestriktionsanalyse für die
klonale Analyse von Erregern. Immun Infekt. 1995; 23: 4-8.
Römling U, Tummler B. Bacterial genome mapping. J Biotechnol., 1994; 35: 155-164.
Schleifer KH, Kilpper-Bälz R. Molecular and chemotaxonomic approaches to the classification of
streptococci, enterococci and lactococci: A review. Syst Appl Microbiol. 1987; 10: 1-19.
Schukken YH, Erb HN, Sears PM, Smith RD. Ecologic study of the risk factors for environmental
mastitis in cows. Am J Vet Res. 1988; 49: 766-769.
Schukken YH, Grommers FJ, van de Geer D, Erb HN, Brand A. Risk factors for clinical mastitis in
herds with a low bulk milk somatic cell count. 2. Risk factors for Escherichia coli and
Staphylococcus aureus. J Dairy Sci. 1991; 74: 826-832.
Schukken YH, Leslie KE, Barnum DA, Mallard BA, Lumsden JH, Dick PC, et al.. Experimental
Staphylococcus aureus intramammary challenge in late lactation dairy cows: quarter and cow
effects determining the probability of infection. J Dairy Sci. 1999; 82: 2393-2401.
Schukken YH, Van de Geer D, Grommers FJ, Smit JA, Brand A. Intramammary infections and risk
factors for clinical mastitis in herds with low somatic cell counts in bulk milk. Vet Rec. 1989;
125: 393-396.
Schulz J. Erkrankungen der Milchdrüse des Rindes. Grundsätze. In: WENDT K, BOSTEDT H,
MIELKE H, FUCHS H-W (Hrsg.): Euter- und Gesäugekrankheiten, G. Fischer Verl.,
Jena/Stuttgart, 1994; 226-238.
Schwartz DC, Cantor CR. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel
electrophoresis. Cell. 1984 May; 37(1): 67–75.
Sheldrake RF, Hoare RJ, McGregor GD. Lactation stage, parity, and infection affecting somatic cells,
electrical conductivity, and serum albumin in milk. J Dairy Sci. 1983; 66: 542-547.
Sischo WM, Heider LE, Miller GY, Moore DA. Prevalence of contagious pathogens of bovine
mastitis and use of mastitis control practices. J Am Vet Med Assoc. 1993; 202: 595-600.
Smith KL, Hogan JS. Environmental mastitis. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 1993; 9: 489498.
Smith KL, Todhunter DA, Schoenberger PS. Environmental mastitis: cause, prevalence, prevention. J
Dairy Sci. 1985a; 68: 1531-1553.
97
Smith KL. Mastitis control: a discussion. J Dairy Sci. 1983; 66: 1790-1794.
Sobiraj A, Illing C, Friebel H, Bartel K, Richter A. Heilungsrate bei Kühen mit subklinischer und
unspezifischer Mastitis durch den einsatz von antibiotikahaltigen Langzeitpräparaten zum
Zeitpunkt des Trockenstellens, gleichzeitig eine Vergleichsstudie. Tieräztl Umschau 2000; 55:
315-320.
Sobiraj A, Kron A, Schollmeyer U, Failing K. Bundesweite Untersuchung zur Erregerverteilung und
In-vitro-Resistenz euterpathogener Bakterien in der Milch von Kühen mit subklinischer Mastitis.
Tierarztl Prax. 1997; 25: 108-115.
Soedarmanto I, Lämmler C. Comparative Studies on Streptococci of Serological Group G Isolated
from Various Origins. J Vet Med. 1996; 43: 513-523.
Soedarmanto I, Pasaribu FH, Wibawan IWT, Lämmler C. Identification and molecular
characterisation of serological group C Streptococci isolated from diseased pigs and monkeys in
Indonesia. J Clin Microbiol. 1996; 34: 2201-2204.
Sommerhäuser J, Kloppert B, Wolter W, Zschöck M, Sobiraj A, Failing K. The epidemiology of
Staphylococcus aureus infections from subclinical mastitis in dairy cows during a control
programme. Vet Microbiol. 2003; 96: 91-102.
Sommerhäuser J. Untersuchungen mittels Geno- und Phänotypisierung zur Epidemiologie von
Staphylokokkus aureus als Erreger subklinischer Mastitiden in hessischen
Milcherzeugerbetrieben im Zuge von Bestandssanierungsmaßnahmen. [Dissertation vet. med.],
Leipzig: Universität Leipzig; 2001
Stafseth HJ, Thompson WW, Neu L. Streptococcic Infection in Dogs. I. “Acid milk,” Arthritis and
Post-Vaccination Abscesses. J Am Vet Med Assoc. 1937; 90: 769-781.
Tagg JR, Dajani AS, Wannamaker LW. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 1976;
40: 722-56.
Tagg JR, Wong HK. Inhibitor production by group-G streptococci of human and of animal origin. J
Med Microbiol. 1983; 16: 409-415.
Takeda N, Kikuchi K, Asano R, Harada T, Totsuka K, Sumiyoshi T, et al.. Recurrent septicemia
caused by Streptococcus canis after a dog bite. Scand J Infect Dis. 2001; 33: 927-928.
Taranta A, Wood HF, Feinstein AR, Simpson R, Kleinberg E. Rheumatic fever recurrence rate and
antibody response to streptococcal infection. Clin Res. 1960; 8: 225.
Templin G. Über die Rolle ß-hämolysierender Streptokokken bei Mastitiden bei Rindern. Monatsh
Veterinärmed. 1960; 15: 588-590.
Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, D H Persing, et al.. Interpreting
chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed field gel electrophoresis: criteria for
bacterial strain typing. J Clin Microbiol. 1995; 33: 2233-2239.
98
Thal E, Moberg K. Serologische Gruppenbestimmung der bei Tieren vorkommenden ßhämolytischen Streptokokken. Nord Veterinaermed. 1953; 5: 835-46.
Tikofsky LL, Zadoks RN. Cross-infection between cats and cows: origin and control of Streptococcus
canis mastitis in a dairy herd. J Dairy Sci. 2005; 88: 2707-2713.
Tillman PC, Dodson ND, Indiveri M. Group G streptococcal epizootic in a closed cat colony. J Clin
Microbiol. 1982; 16: 1057-1060.
Todhunter DA, Smith KL, Hogan JS, Schoenberger PS. Gram-negative bacterial infections of the
mammary gland in cows. Am J Vet Res. 1991; 52: 184-188.
Todhunter DA, Smith KL, Hogan JS. Environmental streptococcal intramammary infections of the
bovine mammary gland. J Dairy Sci. 1995; 78: 2366-2374.
Tolle A, Heeschen W, Hamann J. Grundlagen einer systematischen Bekämpfung der subklinischen
Mastitis des Rindes. Kieler Milchwirtsch Forschungsber. 1977; 29: 3-103.
Tolle A. Die subklinische Kokkenmastitis des Rindes. Zbl Vet Med. B 1982; 29: 329-358.
Tyler JW, Bagott JDL. Antimicrobial therapy of mastitis. In: ANDREWS AH (ed.): Bovine
medicine: diseases and husbandry of cattle. Blackwell Sci Publ London, 1992; 836-842.
Ullberg M, Karlsson I, Wiman B, Kronvall G. Two types of receptors for human plasminogen on
group G streptococci. APMIS. 1992; 100: 21-28.
Ullberg M, Kronvall G, Wiman B. New receptor for human plasminogen on gram positive cocci.
APMIS. 1989; 97: 996-1002.
Vasenius H, Nurmi EV. The serological groups of hemolytic streptococci isolated from different
species of animals in Finland during the period 1960-1962. Nord Verterinaermed. 1963; 15: 424429.
Vieira VV, Castro AC. Biochemical properties and whole-cell protein profiles of group G
streptococci isolated from dogs. J Appl Bacteriol. 1994; 77: 408-411.
Wang, S M, Deighton MA, Capstick JA, Gerraty N. Epidemiological typing of bovine streptococci by
pulsed-field gel electrophoresis. Epidemiol Infect, 1999; 123: 317-324.
Wannamaker LW, Schlievert PM. Exotoxins of group A streptococci. In: HARDGREE, MC, and AT
TU (eds.): Bacterial toxins. Handbook of Natural Toxins. Marcel Dekker, New York, 1988; 267295.
Watts JL, Nickerson SC, Pankey JW. A case study of streptococcus group G infection in dairy herd.
Vet Microbiol. 1984; 9: 571-579.
Watts JL. Characterisation and Identification of Streptococci Isolated from Bovine Mammary Glands.
J Dairy Sci. 1988; 71: 1616-1624.
Weigt U, Dreist M. Gastrointestinale Störungen des Rindes als Wegbereiter der hämatogen bedingten
Kolimastitis. in: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft: Tagung der Fachgruppe
99
Bakteriologie, Rauischolzhausen, 8.-10.6.1988, DVG Gießen, 177-185.
Weigt U, Grunert E. Durch seltenen Streptokokkengruppen verursachte Mastitiden und deren
klinisches Bild. Dtsch Tierärztl Wochenschr. 1964; 71: 1-5.
Weiss E. Geschlechtsorgane. In: DAHME, E und E WEISS (Hrsg.): Grundriss der speziellen
pathologischen Anatomie der Haustiere. Enke Verl. Stuttgart, 1988; 270-313.
Weisser W. Beobachtungen über die fäkale Streptokokkenflora bei fleischfressenden Haustieren. Zbl
Bakt Hyg Abt Orig. A. 1981; 248: 455-462.
Wenner HA, Gibson DM, Jaques R. Specificities of hyaluronidase formed by several groups of
streptococci. Proc Soc Exp Biol Med. 1951; 76: 585-588.
Whatmore AM, Engler KH, Gudmundsdottir G, Efstratiou A. Identification of Isolates of
Streptococcus canis Infecting Humans. J Clin Microbiol. 2001; 39: 4196-4199.
White G. An attempt to control the spread of staphylococcal mastitis in two herds by segregation and
culling. Vet Rec. 1965; 77: 1384-1386.
Whitnack E, Beachey EH. Antiopsonic activity of fibrinogen bound to M protein on the surface of
group A streptococci. J Clin Invest. 1982; 69: 1042-1045.
Whitnack E, Beachey EH. Inhibition of complement-mediated opsonization and phagocytosis of
Streptococcus pyogenes by D fragments of fibrinogen and fibrin bound to cell surface M protein.
J Exp Med. 1983; 162: 1983-1997.
Wibawan IWT, Lämmler C. Distribution of B streptococcal antigens among streptococci of
serological groups B, G and L. Zbl Bakt. 1990a; 273: 471-477.
Widebäck K, Havlicek J, Kronvall G. Demonstration of a receptor for mouse and human serum
albumin in Streptococcus pyogenes. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand Sect B. 1983; 91:
373-382.
Widebäck K, Kronvall G. Isolation of a specific albumin receptor from a group G streptococcal
strain. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand Sect. B, 1987; 95: 203-210.
Widebäck K, Kronvall G. Surface receptors for serum albumin in group C and G streptococci show
three different types of albumin specificity. Infect Immun. 1982; 38: 1154-1163.
Wilson DJ, Gonzalez RN, Case KL, Garrison LL, Grohn YT. Comparison of seven antibiotic
treatments with no treatment for bacteriological efficacy against bovine mastitis pathogens. J
Dairy Sci. 1999; 82: 1664-1670.
Wolter W, Kloppert B, Zschöck M. Verbreitung und Bekämpfung von S. agalactiae in Hessen. In:
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft: 40. Arbeitstagung des Arbeitskreises
Lebensmittelhygiene, Garmisch-Partenkirchen, 29.9.-1.10.1999, DVG, Gießen, 640-648.
Yoshikawa H, Xie B, Oyamada T, Hiraga A, Yoshikawa T. Detection of bovine leukemia viruses
(BLV) in mammary tissues of BLV antibody-positive cows affected by subclinical mastitis. J Vet
100
Med Sci. 1997; 59: 301-302.
Young K., Power E, Dryden M, Phillips I. RAPD typing of clinical isolates of Staphylococcus
haemolyticus. Lett. Appl. Microbiol. 1994; 18: 86-89.
Zehner MM, Farnsworth RJ, Appleman RD, Larntz K, Springer JA. Growth of environmental
mastitis pathogens in various bedding materials. J Dairy Sci. 1986; 69: 1932-1941.
Für Ihren Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit möchte ich mich herzlich bedanken bei:
Prof. Dr. Axel Sobiraj für die Überlassung des Themas und die Betreuung der Arbeit
Dr. Michael Zschöck für die Betreuung und Korrektur der Arbeit und für seine Ermutigungen, seinen
Durchhaltewillen und seine endlose Geduld
Dr. Bärbel Kloppert und Dr. Wilfried Wolter für praktische Tips, gute Ratschläge, fruchtbare
Diskussionen und aufmunternde Worte
Hans-Peter Jung, Silke Zimmermann und Annabella Janise für die Einarbeitung in die verschiedenen
Untersuchungsmethoden am Landesbetrieb Hessisches Landeslabor, Giessen
den an den Untersuchungen beteiligten Landwirten für die geopferte Zeit und Mühe
meinen Eltern und Freunden für Zeit, Geduld und manche Tasse Tee