DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA DE Passiflora galbana Mast. E

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VANIA MACHADO PASSOS
DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA DE Passiflora galbana Mast. E Passiflora mucronata Lam.
ATRAVÉS DE MARCADORES MOLECULARES, DADOS MORFOMÉTRICOS E
CITOGENÉTICOS
FEIRA DE SANTANA - BAHIA
2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA
DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA DE Passiflora galbana Mast. E Passiflora mucronata Lam.
ATRAVÉS DE MARCADORES MOLECULARES, DADOS MORFOMÉTRICOS E
CITOGENÉTICOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana
como parte dos requisitos para a obtenção do título de
doutor em Botânica.
Orientadora:
Profa. Dra. Angela Pierre Vitória (UENF)
Co-orientador : Prof. Dr. Cássio van den Berg (UEFS)
FEIRA DE SANTANA – BAHIA
2007
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Ficha catalográfica: Biblioteca Central Julieta Carteado
Passos, Vania Machado
P324d Delimitação especifica de Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata
Lam. através de marcadores moleculares, dados morfométricos e citogenéticos
/ Vania Machado Passos. – Feira de Santana, 2007.
167 f. : il.
Orientadora: Angela Pierre Vitória
Co-orientador: Cássio van den Berg
Tese (Doutorado em Botânica)– Departamento de Ciências Biológicas,
Universidade Estadual de Feira de Santana, 2007.
1. Passifloraceae. 2. Passiflora mucronata. 3. Passiflora galbana. 4.
Variabilidade genética. 5. Marcadores moleculares. 6. Morfometria
geométrica. 7. Citotaxonomia. I. Vitória, Angela Pierre. II. Berg, Cássio van
den. III. Universidade Estadual de Feira de Santana. IV. Departamento de
Ciências Biológicas. V. Título.
CDU: 582.842.7
4
5
Á Deus Todo Poderoso :
“Toda
“Toda a Honra e toda a Glória
agora e para sempre”
6
AGRADECIMENTOS
Especialmente aos meus pais amados Celita e Passos, pelo amor sem limites e por
acreditar em todas as minhas conquistas;
Ao meu marido Chrystian por ser cúmplice e companheiro em todas as minhas decisões
me impulsionando sempre em busca do meu melhor;
Ao meu filho Enzo por ser o motivo do meu equilíbrio e amor incondicional;
À toda minha família que são presentes de Deus, pela constante força e incentivo em
minha vida: padrinhos, afilhados, primos, tios e também as pessoas da família de Chrystian
pelo apoio e carinho;
À minha mãe científica e muito mais que Orientadora Ângela, pelo exemplo de
profissional e pessoa, não será aqui neste plano que retribuirei tudo o que você fez por mim ...
e a sua filha por chegar para dar um novo sentido a sua vida e com certeza irá fazê-la muito
mais feliz;
Ao Jurandi pela compreensão e atenção em minha estadia no Rio e sempre que o
solicitei;
Ao Cássio pela fonte de sabedoria, compreensão e apoio em todos os momentos
solicitados;
À UEFS por proporcionar este curso de Pós-Graduação;
À FAPESB pela bolsa concedida e pelo auxílio;
À todos os professores da Pós-Graduação que tive a honra de ser aluna e que me levaram
a concluir que não conheço quase nada mas posso quase tudo, meu especial agradecimento
portanto a José Pirani, Ana Maria Giulietti, Marcelo Guerra, Eduardo Borba, Eduardo Gross,
Francisco de Assis, Lígia Funch e Alessandra Selbach (pela amizade, atenção e carinho), com
extensão para toda a pós e o seu coordenador (Luciano Paganucci);
À Margarete pelo carinho em minha estadia em Ilhéus e por sua atenção sempre que
solicitada, e pela disponibilidade dos seus estagiários;
À todos os meus colegas de curso que me permitiram transformar os momentos tensos
em prazer e alegria ... Aos mais que amigos Lea (amiga de todas as horas e para todo sempre),
Daiane, Tati Faustino, Ivanilza, Jorge, Cris, Silvana(s) pelo convívio ..... a Pati Cris, Pati Luz,
Paty Rejane, Andréa, Adilva, Elnatan e Tarcisio (pelos PCRs intermináveis);
À Lia (Maria José) pela amizade e presteza sempre de uma forma muito especial;
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Aos colegas do LAMOL especialmente a Ricardo pelo apoio técnico nas atividades
desenvolvidas naquele laboratório , sem esquecer das pessoas do LAPEM sempre solícitas em
todos os momentos necessários;
À todos os entusiastas pelas Passifloras especialmente a Teo (obrigada pela força) e ao
Bernacci pelo contato;
Aos colegas Jomar e Maria, e a Renata e Sr. Assis (motorista) pelas coletas realizadas na
Bahia;
Aos amigos do Horto Florestal: Alone, Sheila, Lia, Moema e Ana Paula pela amizade
firmada;
À toda a galera amiga do herbário;
À Sabrina pela carinhosa ajuda durante a execução de todo trabalho;
À Carla Lima pelas pranchas com o seu dom e toques mais que especiais;
Ao Roy Funch pela ajuda com os abstracts;
À Adriana e Gardênia, secretárias do Programa de Pós-Graduação pela presteza e
dedicação e a Elton pelas vezes desesperadas para o uso do telefone em busca de informações
sempre “urgentes”;
À Nádia Roque e a Ioná pela presteza na qualificação;
Ao Oberdan, figura ímpar, que conheci nas coletas do Espírito Santo;
Ao Laboratório de Genética da UESC e seu coordenador, por ceder o espaço para a
execução do trabalho de citogenética;
Ao Cristiano e a Bruno pelas “encomendas” enviadas a UESC;
À UENF especialmente ao Prof. Messias, Vitória, Fabiane, Claúdia Pombo e aos
estudantes estagiários do Laboratório de Biologia Molecular pelo apoio.
Enfim... Obrigada a todos que torceram para que eu chegasse até aqui !!!!
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RESUMO
(Delimitação específica de Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. através
de marcadores moleculares, dados morfométricos e citogenéticos.)
Passiflora
galbana
Mast.
e
Passiflora
mucronata
Lam.
são
muito
próximas
morfologicamente, apresentando caracteres florais semelhantes e morfologia foliar muito
variável. Isto gera dúvidas a respeito da delimitação destas espécies utilizando apenas
caracteres morfológicos. Desta forma, a delimitação específica e variabilidade genética de
populações de ambas as espécies foi avaliada através de marcadores moleculares (ISSR e
RAPD), morfometria geométrica foliar e citogenética. Para as análises moleculares e
morfológicas foram coletados indivíduos de ambas as espécies provenientes de dezenove
populações ao longo da costa dos estados de Bahia , Espírito Santo e Rio de Janeiro. Para as
análises citogenéticas foram utilizadas pontas de raízes de plantas crescidas em casa de
vegetação provenientes de Oliveira (MG) - P. galbana e de Ilhéus (BA) - P. mucronata.
Ambos os marcadores moleculares indicaram um agrupamento de P. galbana e P. mucronata
por distribuição geográfica e não por espécies, como era esperado. Os agrupamentos das
populações obtidos por RAPD e ISSR foram muito similares, sugerindo que ambos os
marcadores podem ser utilizados com a mesma eficácia. Para a morfometria geométrica, o
primeiro eixo canônico agrupou de maneira intra-populacional e separou os indivíduos de
acordo com a espécie. Por meio de observações em cromossomos mitóticos e análise de
cariótipos também foi realizado um estudo citotaxonômico. Os resultados confirmaram a
existência de variação cariotípica intra-específica nas espécies de Passiflora estudadas e
mostrou claramente a diferenciação cromossômica entre elas. As avaliações moleculares
cobrem uma maior porção do genoma do que a avaliação de uma característica como a
morfologia foliar. Desta forma, os dados moleculares foram importantes por sugerirem que
possa ter ocorrido ou estar ocorrendo fluxo gênico entre as duas espécies de Passiflora. Em
relação aos alelos que são responsáveis pelo formato da folha, os resultados morfológicos
sugerem que possivelmente este (ou estes) alelo (s) não tenham um fluxo tão grande entre as
populações de ambas das espécies, já que com base na morfologia foliar foi possível separar
as espécies. Os resultados sugerem também que a morfologia foliar poderá ser utilizada para a
delimitação de P. galbana e P. mucronata, principalmente quando as mesmas estiverem na
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fase vegetativa, sugerindo que os padrões encontrados sejam resultantes de um ou poucos loci
controlando estes caracteres.
Palavras chave: Passiflora mucronata, Passiflora galbana, variabilidade genética, ISSR,
RAPD, morfometria geométrica, citotaxonomia
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ABSTRACT
(The specific delimitation of Passiflora galbana Mast. and Passiflora mucronata Lam.
using molecular markers, morphometric data, and cytogenetics).
Passiflora galbana Mast. and Passiflora mucronata Lam. are morphologically very closely
related, demonstrating similar floral characteristics but with very variable foliar morphology,
which can leave doubts concerning their specific delimitation when only morphological
characteristics are considered. As such, the specific delimitation and the genetic variability of
populations of both species were evaluated using molecular markers (ISSR and RAPD),
geometric foliar morphometrics, and cytogenetics. For the molecular and morphometric
analyses, individuals of both species were collected from nineteen coastal populations from
the states of Bahia, Espírito Santo and Rio de Janeiro. The root tips of plants raised under
greenhouse conditions were then used for cytogenetic analyses, using plants collected in
Oliveira (MG) - P. galbana, and in Ilhéus (BA) - P. mucronata. Both molecular markers
indicated the grouping of P. galbana and P. mucronata by their geographical distribution and
not by species, as was expected. The population groupings obtained through ISSR and RAPD
were very similar, suggesting that both markers could be utilized with equal efficiency. In
terms of morphometrics, the first canonic axis grouped the samples in an inter-populational
manner, and separated the individuals according to their species. Cytotaxonomic studies were
performed by observing mitotic chromosomes and by karyotype analyses. The results of these
studies supported the existence of intra-specific karyotypic variations in the species of
Passiflora examined, and clearly demonstrated a chromosomal differentiation between them.
The molecular evaluations covered a larger portion of the genome than an evaluation of
characteristic like this leaf morphology. As such, the molecular data was important in that it
suggested the past occurrence (or a continuing state) of genetic flow between these two
species of Passiflora.
In order alleles
responsible for the form of the leaves the
morphological results observed here suggest that this (or those) allele(s) does (do) not exhibit
a high level of flow between the populations, as it is still possible to separate the two species
based on leave morphology. These results suggest that leaf morphology can be used to
delimit P. galbana and P. mucronata, principally when they might only be encountered in
their vegetative phase, suggesting that the joined standards are resultant of one or few loci
controlling these characters.
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Keys words: Passiflora mucronata, Passiflora galbana, genetic variability , ISSR, RAPD,
geometric morphometry , citotaxonomy
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LISTA DE TABELAS
CAPITULO 1
Tabela 1- Lista das espécies e seus respectivos pontos de coleta ao longo dos estados de
Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. (G: Passiflora galbana M: Passiflora
mucronata) N: Nº indivíduos .............................................................................. 40
Tabela 2 -Variabilidade genética em 108 bandas de ISSR e 94 de RAPD em dezenove
populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata ocorrentes nos estados
da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. Veja Tabela 1 para nomes das
populações. Nº bandas = total de fragmentos analisados em cada população
gerados a partir do somatório de todos os primers analisados; Nº bandas
exclusivas = total de fragmentos encontrados em uma única população; P =
proporção de bandas polimórficas (critério 0,95); He = heterozigosidade média
esperada (Nei, 1978; "unbiased estimate"). ......................................................... 43
Tabela 3 -Matriz de identidade genética média ("unbiased genetic identity"; Nei, 1978) em
dezenove populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata ocorrentes
na Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro, a partir de dados de RAPD (abaixo da
diagonal) e de ISSR (acima da diagonal). Ver Tabela 1 para nomes das
populações. ........................................................................................................... 44
CAPÍTULO 2
Tabela 1 -Lista das espécies e seus respectivos pontos de coleta ao longo dos estados de
Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. (G: Passiflora galbana M: Passiflora
mucronata), N: Nº de indivíduos ............................................................................ 90
Tabela 2 -Correlações entre os eixos de variáveis canônicas (VCs) com as análises de
componentes principais (PCS) de Passiflora galbana e Passiflora mucronata...98
CAPÍTULO 3
Tabela 1 -Comprimentos médios (µm) do braço curto (BC), braço longo (BL), satélite (SAT)
e comprimento absoluto (CA), comprimento relativo (CR) e razão entre braços (r)
em Passiflora mucronata e Passiflora galbana ....................................................125
Tabela 2-Fórmula cariotípica (FC); cromossomo; braço e tipo de satélite (SAT);
comprimento médio do lote haplóide em µm (CLH) e índice de assimetria (TF%)
em passifloras. ...................................................................................................... 126
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LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO GERAL
Figura 1 -Passiflora galbana (A) Ramo; (B) Detalhe da glândula do pecíolo; (C) Distância
das glândulas do pecíolo em relação à folha; (D) Flor; (E) Detalhe de uma bráctea;
(F) Fruto. ................................................................................................................. 21
Figura 2 -Passiflora mucronata (A) Ramo; (B) Detalhe da glândula do pecíolo; (C) Distância
das glândulas do pecíolo em relação à folha; (D) Flor; (E) Detalhe de uma bráctea;
(F) Fruto. ................................................................................................................. 22
Figura 3.1-Variação morfológica da folhas encontradas em ramos férteis de Passiflora
galbana (folhas em escalas de tamanhos reais) ...................................................... 23
Figura 3.2-Variação morfológica das folhas encontradas em ramos férteis de Passiflora
galbana (folhas em tamanhos reais) .................................................................. 24
CAPÍTULO 1
Figura 1 -Mapa ilustrando as 19 populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata
coletadas nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro
................................................................................................................................. 39
Figura 2 -Gel de agarose corado com brometo de etídio mostrando o padrão eletroforético de
ISSR pela amplificação com o primer JHON em populações de Passiflora galbana
e Passiflora mucronata. Aplicações 1-17: população GBA1; Aplicações 18-33:
população GBA2; Aplicações 34-40: população MBA1 ; Aplicações 6 e 15, 26 e 35
e 41: marcador de 100 pares de bases (pb) Ladder. Setas indicam bandas
polimórficas. Setas com * indicam bandas monomórficas. Ver Tabela 1 para nomes
das populações. ...................................................................................................... 45
Figura 3 -Dendrograma mostrando as relações genéticas entre dezenove populações de
Passiflora galbana e Passiflora mucronata, ocorrentes nos estados de Bahia,
Espírito Santo e Rio de Janeiro utilizando UPGMA como algoritmo de
agrupamento a partir dos dados de ISSR. Ver a Tabela 1 para nome das
populações............................................................................................................... 46
Figura 4 -Análise de Coordenadas Principais (PCO) de dezenove populações de Passiflora
galbana e Passiflora mucronata ocorrentes nos estados da Bahia, Espírito Santo e
Rio de Janeiro baseado em 108 bandas de ISSR. Ver a Tabela 1 para nome das
populações. ............................................................................................................. 47
Figura 5 -Gel de agarose corado com brometo de etídio mostrando o padrão eletroforético de
RAPD pela amplificação com o primer OPC 11 em populações de Passiflora
galbana e Passiflora mucronata. Aplicações 1-4: população MRJ6; Aplicações 5-
14
17: população MRJ7; Aplicações 18-28: população GRJ7; Aplicações 29 a 42população MES8 : Aplicação 20 e 43: marcador de 250 pares de bases (pb) Ladder.
Setas indicam bandas polimórficas. Setas com * indicam bandas monomórficas.
Ver Tabela 1 para nomes das populações................................................................ 51
Espírito Santo e Rio de Janeiro, utilizando UPGMA como algoritmo de
agrupamento a partir dos dados de RAPD. Ver a Tabela 1 para nome das
populações............................................................................................................. 52
Rio de Janeiro baseado em 94 bandas de RAPD. Ver a Tabela 1 para nome das
populações. ............................................................................................................. 53
Espírito Santo e Rio de Janeiro, utilizando UPGMA como algoritmo de
agrupamento a partir dos dados de RAPD e ISSR. Ver a Tabela 1 para nome das
populações. ............................................................................................................. 54
Rio de Janeiro baseado em 108 bandas de ISSR e 94 de RAPD. Ver a Tabela 1
para nome das populações....................................................................................... 55
CAPÍTULO 2
Figura 1 -Morfologia das flores de Passiflora galbana (A) e Passiflora mucronata (B) .... 86
coletadas nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro ........................... 89
Figura 3 -Significância dos cinco primeiros eixos de componentes principais (CP) mostrando
o indivíduo médio e o desvio padrão (+ / - 1SD e + / - 2SD) de Passiflora galbana
e Passiflora mucronata .......................................................................................... 94
Figura 4 -Escores de todos os indivíduos provenientes da análise de variáveis canônicas
entre Passiflora galbana e Passiflora mucronata considerando o primeiro e o
segundo eixos canônicos (Ver tabela 1 para o nome das populações)
.............................................................................................................................. 95
Figura 5 -Contornos médios das folhas a partir do centróide dentro de cada população
através da análise de varáveis canônicas . (Ver tabela 1 para o nome das
populações) Passiflora mucronata e Passiflora galbana. .................................. 96
15
Figura 6 -Fenograma obtido a partir da distância generalizada de Mahalanobis entre os
centróides das populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata pelo
método UPGMA, considerando as mesmas variáveis dos métodos de ordenação.
(Ver tabela 1 para o nome das populações) ............................................................ 97
CAPÍTULO 3
Figura 1 -Padrões de folhas de Passiflora galbana e Passiflora mucronata ilustrando a
variação morfológica encontrada nas espécies. A e C) Formato lanceolado em
folhas de P. galbana. B e D) Formato oblongo em folhas de Passiflora galbana. E e
F) Formato cordado em folhas de Passiflora mucronata...................................... 115
Figura 2 -Metáfase de Passiflora. galbana (a) e Passiflora mucronata (b) Barra=5 µm
............................................................................................................................... 120
Figura 3 -Cariograma de Passiflora galbana (a) e Passiflora mucronata (b)
Barra=
5
µm.
............................................................................................................................... 121
Figura 4 -Ideograma de Passiflora galbana CO: cromossomos ordenados; S: tamanho dos
cromossomos; AR: razão entre os braços cromossômicos.................................... 122
Figura 5 -Ideograma de Passiflora mucronata CO: cromossomos ordenados; S: tamanho
dos cromossomos; AR: razão entre os braços cromossômicos ............................ 123
Figura 6 -Coloração CMA-DA-DAPI de Passiflora galbana (a; b e c) e de Passiflora
mucronata (d; e; f) sobreposição das imagens de DAPI e CMA (a-d), CMA (b-e) e
DAPI (c-f). Setas indicam bandas Barra=5 µm. ................................................... 124
Apêndice a -“Primers” (seqüência, número de bandas e variação de tamanho) das 108 bandas
analisadas. Os oito primeiros foram selecionados na análise de variabilidade
e
genética baseada
em padrões de ISSR em dezenove populações de Passiflora
galbana e Passiflora mucronata ocorrentes nos estados da Bahia, Espírito Santo
e Rio de Janeiro. (pb – pares de base) ....................................... 166
Apêndice b -“Primers” (seqüência, número de bandas e variação de tamanho) das 94 bandas
analisadas. Os nove primeiros foram selecionados na análise de variabilidade
genética baseada em padrões de RAPD em dezenove populações de Passiflora
Rio de Janeiro. (pb – pares de base) .................................................................... 167
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................................... 15
CAPÍTULO 1 Estudo de delimitação específica e variabilidade genética em populações de
Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. através de RAPD e
ISSR............................................................................................................... 25
CAPÍTULO 2 Variabilidade morfológica foliar inter e intra-específica em Passiflora
galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. ................................................ 77
CAPÍTULO 3 Citotaxonomia em Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam
...................................................................................................................... 109
DISCUSSÃO GERAL.......................................................................................................... 138
CONCLUSÃO GERAL ...................................................................................................... 141
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 142
APÊNDICES
APÊNDICE a ....................................................................................................................... 166
APÊNDICE b ....................................................................................................................... 167
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INTRODUÇÃO GERAL
A família Passifloraceae atualmente integra a ordem Malphigiales perfazendo um total
de 20 gêneros com distribuição predominantemente tropical e subtropical (APG II, 2003;
Soltis et al., 2005; Souza e Lorenzi, 2005). A família ocorre principalmente nas Américas,
com áreas de menor diversidade na Ásia e Austrália e uma espécie em Madagascar
(Heywood, 1993). Killip (1938) cita que a maioria das espécies está inserida no gênero
Passiflora L., o maior da família, que possui mais de 525 espécies (MacDougal e Ulmer,
2004), sendo cerca de 400 delas descritas predominantemente como neotropicais. No Brasil
esta família é representada por quatro gêneros e mais de 200 espécies (Nunes, 2002), algumas
cultivadas devido às propriedades ornamentais, nutricionais ou medicinais.
As espécies em estudo, Passiflora galbana Mast. (Figura 1) e Passiflora mucronata
Lam. (Figura 2), foram primeiramente descritas por Masters e Lamarck , respectivamente. P.
galbana segundo Killip (1938) é uma espécie endêmica do Brasil ocorrendo na região leste do
país, da Bahia até o Rio de Janeiro. P. mucronata também apresenta o mesmo padrão de
distribuição, sendo na Bahia encontrada principalmente na faixa litorânea de Salvador até o
extremo sul do estado, em área de restinga ao nível do mar. Na Bahia, P. galbana é
encontrada em áreas de carrasco, mata estacional, campo rupestre, mata atlântica, restinga e
cerrado, em altitudes variando de 100 a 1.700 m do nível do mar (Nunes, 2002). Com este
padrão de distribuição semelhante para as duas espécies, neste trabalho, foram consideradas
as populações com potencial para fornecer informações filogeográficas sobre áreas de
restinga, do Nordeste e Sudeste em estudos futuros. Portanto as coletas se concentraram nas
restingas dos estados da Bahia , Espírito Santo e Rio de Janeiro.
A área em estudo denominada de restinga, é um terreno arenoso e salino, próximo ao
mar e coberto de plantas herbáceas características. De maneira geral, a palavra restinga é
utilizada para todos os tipos de depósitos arenosos litorâneos, de origens variadas,
caracterizados, por superfícies baixas e levemente onduladas, com suave declive rumo ao mar.
Podemos considerar como “vegetação de restinga” o conjunto de comunidades vegetais
fisionomicamente distintas, sob influência marinha e flúvio- marinha, distribuídas em
mosaico e em áreas com grande diversidade ecológica, sendo classificadas como
comunidades edáficas, por dependerem mais da natureza do solo que do clima.
As espécies estudadas são trepadeiras herbáceas, inteiramente glabras, com o caule
cilíndrico, estrias e gavinhas presentes e compartilham muitas outras estruturas com
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características em comum, tais como estípulas, flores e sementes. Segundo Nunes e Queiroz
(2006), estas espécies são bastante similares morfologicamente diferenciando-se apenas pelo
formato da folha cordado-reniforme em P. mucronata e oblongo-lanceolada em P. galbana,
pelo número de nervuras primárias na lâmina foliar e pelas glândulas do pecíolo, o que torna
difícil a delimitação destas espécies. De acordo com Souza et al. (2003a), que estudaram o
cariótipo de seis espécies coletadas no estado do Rio de Janeiro, variações morfológicas
intraespecíficas são encontradas nas duas espécies, uma vez que diferentes formas de folhas
foram observadas para P. mucronata e P. galbana, desde lanceoladas até arredondadas
(comunicação pessoal; Figuras 3.1 e 3.2). Outras observações já foram feitas dentro de
algumas populações de ambas espécies, corroborando uma grande variação morfológica das
folhas. Muschner et al. (2003) que realizaram a primeira análise filogenética do gênero
Passiflora, citam P. galbana e P. mucronata como espécies irmãs o que ratifica a necessidade
de estudos moleculares e morfométricos para a delimitação destas espécies.
Uma outra característica que diferencia estas duas espécies refere-se ao horário de
abertura da flor, que em P. galbana se inicia no começo da noite fechando na madrugada,
enquanto em P. mucronata, que também abre a noite, permanece aberta até o início da manhã
(Souza, comunicação pessoal). Segundo MacDougal e Ulmer (2004) as duas espécies são
importantes ecologicamente uma vez que são polinizadas por morcegos, sendo que a maioria
das espécies deste gênero segundo estudos realizados sobre a biologia floral, constataram a
predominância de melitofilia e ornitofilia. Contudo Souza et al. (2004) observaram que P.
mucronata mantêm as flores abertas durante um curto período da manhã favorecendo a
polinização também por insetos.
Araújo (2001) estudando a palinologia de espécies de Passifloraceae do estado da
Bahia , observou que P. galbana e P. mucronata tem mesmo tipo polínico (Tipo 1, 6sincolpado, com exina reticulada). Apesar disso nenhum trabalho citando o cruzamento entre
estas duas espécies até o momento, já foi encontrado na literatura.
Com o surgimento de novas metodologias em bioquímica e biologia molecular, novas
técnicas para estudos de taxonomia e variabilidade foram desenvolvidas, tais como os estudos
protéicos, imunológicos, aloenzimáticos e, mais recentemente, de polimorfismos de DNA.
Desta forma, inúmeras técnicas têm sido usadas na detecção de variabilidade genética ou
polimorfismo genético em organismos (Araújo et al., 2003).
Estudos de variabilidade genética e morfológica representam instrumentos importantes
para a compreensão dos padrões de distribuição das espécies e contribuem para o
entendimento dos processos evolutivos e biogeográficos. Estas abordagens têm sido utilizadas
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satisfatoriamente para estudos de populações pertencentes a outras espécies (Farinaci, 2001;
Borba et al., 2001, 2002; Garris et al., 2005; Lambert et al., 2006a; Lambert, et al.b; Meloni
et al., 2006; Azevedo et al., 2007). Os estudos dos padrões de variabilidade genética e
morfológica também podem fornecer informações relevantes para a promoção de ações de
manejo e propagação das espécies, garantindo assim sua conservação.
No caso de espécies de difícil delimitação morfológica, como P. galbana e P.
mucronata, estudos moleculares podem contribuir de maneira significativa para a delimitação
interespecífica. Recentemente a técnica de ISSR (Inter Single Sequence Repeats - Zietkiewicz
et al., 1994) tem sido usada na detecção da diversidade genética em muitas espécies
(Robinson et al., 1997; Wolfe et al., 1998a, b; Esselmann et al., 1999; Qian et al., 2001;
Sheng et al., 2005) e outras aplicações (Ratnaparkhe et al., 1998; Bornet et al., 2001;
Pharmawati et al., 2005).
Variabilidade é uma característica do gênero Passiflora, uma vez que a maioria das
espécies são alógamas, auto-incompatíveis e se cruzam com facilidade (Viana et al. 2003). A
diversidade genética de algumas espécies de maracujazeiro foi avaliada por meio de
marcadores genéticos RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA- Williams et al., 1990)
por alguns autores (Vieira, 1997; Fajardo et al., 1998; Cassiano et al., 1998; Carneiro et al.,
2002; Viana et al., 2003; Crochemore et al., 2003).
Além de avaliar a diversidade genética entre genótipos de maracujazeiro amarelo por
meio de marcadores RAPD, Viana et al. (2003) estimaram a diversidade entre a espécie
cultivada (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) e outras espécies relacionadas no gênero. Para
o estudo dos acessos de maracujá amarelo não foi verificada expressiva diversidade genética;
as populações se distribuíram conforme sua origem, sendo que os indivíduos coletados em
São Francisco do Itabapoana (RJ) apresentaram uma maior consistência no seu agrupamento.
Fajardo et al. (1998), também utilizando marcadores RAPD, observaram uma grande
variação intraespecífica em P. ligularis e P. adenopoda, enquanto que em P. edulis e P.
maliformis houve pouca variação intraespecífica. Através desses marcadores, foram obtidos
resultados que diferiram das classificações baseadas nos caracteres morfológicos. Além disso,
eles concluíram que há uma elevada similaridade genética entre P. vitifolia, P. spinosa e P.
coriacea e entre P. rosea e P. cumbalensis, P. pinnatitistipula e P. antioquiensis. Estudos
como estes serviram de base para estabelecimentos de estratégias de melhoramento em
espécies do gênero Passiflora.
Cassiano et al. (1998) analisaram as espécies P. edulis, P. edulis f. flavicarpa, P.
amethystina, P. caerulea, P. cincinnata, P. coccinea, P. serrato-digitata, P. foetida, P.
18
maliformis, P. alata, P. gibertii, P. laurifolia, P. macrocarpa, P. nitida, P. setacea, P.
suberosa, P. ligularis, P. capsularis e P. coriacea. Esses autores conseguiram caracterizar as
espécies e relacionar a similaridade entre as mesmas. Os marcadores geraram informações
sobre a diversidade genética e as relações filogenéticas no germoplasma usado, além de
confirmarem a possibilidade da caracterização de híbridos.
Vieira et al. (1997), pesquisando a variabilidade intraespecífica em Passifloraceae,
encontraram bandas do tipo gênero-específicas e espécie-específicas. Foi obtida a freqüência
de locos polimórficos e estimada a diversidade genética média com base em freqüências
alélicas.
Outras abordagens moleculares foram utilizadas por Muschner et al. (1998), que
caracterizaram duas formas morfológicas de P. suberosa (normal e roxa) através de
seqüências ITS1 e ITS2 (‘Internal Transcribed Spacers’) do DNA ribossomal, sendo que os
resultados revelaram a existência de grande variabilidade dentro da própria espécie, sugerindo
uma tendência de agrupamento preferencial de indivíduos de uma mesma forma morfológica.
Dos indivíduos estudados, três da forma normal não se relacionaram com nenhum dos grupos
formados, não tendo sido detectados agrupamentos preferenciais por origem geográfica.
Outra ferramenta que auxilia na delimitação específica é o estudo morfológico. Neste
sentido, a morfologia da folha apresenta um importante grupo de caracteres vegetativos que
são usados em estudos taxonômicos e ecológicos. Sendo assim, diferentes métodos têm sido
usados para analisar a arquitetura da folha (Premoli, 1996). Os dados morfométricos são
usados para obter evidências de similaridades entre táxons e podem testar novas hipóteses
relativas à ecologia, sistemática e história evolutiva (Rohlf, 1990; Rolhf e Marcus, 1993),
além de poderem ser usados com sucesso na inferência da variabilidade genética de espécies
vegetais (Loos, 1993; Brysting e Elven, 2000).
Embora as medidas lineares constituam a base da morfometria convencional que
fundamentou diversos trabalhos na taxonomia, nos últimos 25 anos estão sendo observadas
mudanças na análise das formas biológicas que passaram a ser focalizadas por novos métodos
apoiados em morfometria geométrica: o estudo da biometria da forma (Bookstein, 1991). A
morfometria geométrica utiliza a forma geométrica ou o contorno de um objeto não sendo
considerados seu tamanho ou orientação no espaço. Através de análises multivariadas são
analisadas simultaneamente mais de duas variáveis resultando na medida da variação da
forma de um determinado objeto.
Como foi dito acima, entre P. mucronata e P. galbana, algumas características
morfológicas da folha, como o formato, são consideradas cruciais na determinação da
19
diferenciação das espécies. Desta forma, estudos envolvendo morfometria entre estas espécies
são de grande contribuição para a delimitação específica e pouco divulgados até o momento.
Além da biologia molecular e da morfometria, a utilização de dados citogenéticos na
sistemática vegetal é admitida pela maioria dos autores como um dos mais importantes
instrumentos para a compreensão das relações de parentesco e dos mecanismos de evolução,
tanto dentro de táxons inferiores quanto em níveis superiores (Guerra, 1990). A caracterização
precisa do cariótipo tem importância fundamental quando o objetivo é comparar
cariologicamente espécies diferentes ou analisar a variação entre indivíduos da mesma
espécie. O número cromossômico é um dos parâmetros mais utilizados para a caracterização
citológica de uma espécie (Pedrosa et al., 1999).
Outros caracteres citológicos também auxiliam no entendimento das alterações
genéticas envolvidas na evolução de um grupo, bem como na delimitação taxonômica das
espécies. Um caráter citológico importante no estudo cromossômico com similaridade
morfológica é o bandeamento fluorescente, em que o fluorocromo se liga de forma específica
em algumas regiões do cromossomo (Hizume, 1991). A coloração fluorescente permitiu a
Miranda et al. (1997), Guerra (1993) e Yamamoto e Tominaga (2003) identificar padrões
característicos de bandas fluorescentes em espécies do gênero Citrus que apresentam
cromossomos pequenos e morfologicamente semelhantes, demonstrando um elevado nível de
diversidade e heterozigosidade entre os mesmos. Da mesma forma, Yamamoto e Tominaga
(2004) classificaram os nove cromossomos do conjunto haplóide de Citrus clementina hort. ex
Tanaka, com base no padrão de bandeamento fluorescente, intensidade relativa das bandas e
comprimento dos cromossomos obtido com uma seqüência de coloração utilizando
Giemsa/CMA/DAPI (Befu et al., 2002). Os autores separaram e classificaram os
cromossomos que exibiram o mesmo padrão de bandas fluorescentes utilizando o tamanho
relativo das bandas como índices.
A caracterização dos cromossomos foi por muito tempo fundamentada unicamente em
parâmetros morfológicos, a exemplo do tamanho dos braços, posição dos centrômeros e
localização das constrições secundárias. Com a introdução das técnicas de bandeamento,
possibilitando a visualização de blocos de coloração diferenciada (bandas), houve um avanço
significativo na caracterização dos cromossomos (Brasileiro-Vidal e Guerra, 2002). No
entanto, muitas espécies apresentam cariótipo com cromossomos de tamanho e padrão de
bandas uniforme. Nestes casos, o desenvolvimento de outras técnicas mais avançadas como a
hibridização in situ tem possibilitado a identificação de cromossomos individuais, com base
na localização de seqüências de DNA associada a outras características cromossômicas.
20
O gênero Passiflora, assim como os demais da família, tem sido pouco estudado
citologicamente, sendo que a maioria dos trabalhos tem se limitado à contagem de
cromossomos (Killip, 1938; Storey, 1950; Snow e Macdougal, 1993) ou são conduzidos
abordando detalhes sobre o cariótipo ou mecanismos de evolução cariotípica (Souza et al.,
1996; Mayeda, 1997; Soares-Scott, 1999; Soares-Scott et al., 2003; Souza et al., 2003a;
Souza et al., 2003b; Vieira et al., 2004; Souza et al., 2007). Além dos estudos com coloração
convencional e bandeamento com fluorocromos (Melo et al., 2001) e hibridização in situ
(Melo e Guerra, 2003).
Considerando-se espécie como um conjunto de uma ou mais populações que partilham
o mesmo fundo genético e se podem cruzar em condições naturais, estando isolados
reprodutivamente dos indivíduos de outras espécies, e portanto para que haja o aparecimento
de novas espécies é necessário que haja isolamento reprodutivo entre populações. A hipótese
levantada neste estudo, parte do princípio de que P. galbana e P. mucronata pertençam a
categorias taxonômicas distintas,ou seja, representem espécies diferentes.
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a variabilidade genética e fenotípica
e auxiliar na promoção da delimitação específica utilizando ferramentas moleculares,
morfométricas e citogenéticas entre e dentro de populações de P. galbana e P. mucronata, a
fim de testar a delimitação entre estas duas espécies e avaliar caracteres morfológicos
diagnósticos.
21
5 mm
1 mm
1 mm
C
2 cm
B
D
5 mm
5 cm
E
F
A
Figura 1 -Passiflora galbana Mast. (A) Ramo; (B) Detalhe da glândula do pecíolo; (C)
Distância das glândulas do pecíolo em relação à folha; (D) Flor; (E) Detalhe de uma bráctea;
(F) Fruto.
22
E
5 mm
D
2 cm
5 mm
5 cm
C
1 mm
A
B
F
Figura 2 -Passiflora mucronata Lam. (A) Ramo; (B) Detalhe da glândula do pecíolo; (C)
Distância das glândulas do pecíolo em relação à folha; (D) Flor; (E) Detalhe de uma bráctea;
(F) Fruto.
23
2 cm
Figura 3.1 -Variação morfológica das folhas encontradas em ramos férteis de Passiflora
galbana Mast. (folhas em escalas de tamanhos reais) .
24
2 cm
Figura 3.2 -Variação morfológica das folhas encontradas em ramos férteis de Passiflora
galbana Mast. (folhas em tamanhos reais) .
25
CAPÍTULO 1
Estudo de delimitação específica e variabilidade
genética em populações de Passiflora galbana
Mast. e Passiflora mucronata Lam. através de
RAPD e ISSR.
PASSOS, V. M.1; LAMBERT, S. M. 2; VITÓRIA, A . P. 3 ; DEN BERG, C. V. 1
1
Programa de Pós-Graduação em Botânica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Feira de Santana (UEFS) [email protected]
2
Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas, Departamento de Ciências Biológicas,
Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).
3
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual
Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF).
26
RESUMO
(Estudo de delimitação específica e variabilidade genética em populações de Passiflora
galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. através de RAPD e ISSR).
A delimitação específica e a variabilidade genética de dezenove populações de Passiflora
(P.galbana Mast. e P. mucronata Lam.) coletadas nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio
de Janeiro foi avaliada através de marcadores ISSR e RAPD. Para ISSR o tamanho dos
fragmentos obtidos variou de 100 a 2000 pb aproximadamente. Das 108 bandas, 29,92%
foram polimórficas, e o número de fragmentos gerados por “primer” variou de 9 a 18 com
uma média de 13,5 bandas por “primer”. Para RAPD o tamanho dos fragmentos variou de
200 a 2250 pb aproximadamente. As 94 bandas obtiveram uma média de 34,16% de bandas
polimórficas, e o número de fragmentos gerados por “primer” variou de 6 a 14 com uma
média de 10,4 bandas por “primer”. O teste de Mantel indicou que há uma correlação positiva
entre as distâncias genéticas a partir dos dois marcadores utilizados. Não houve diferença de
resultado entre os dois marcadores utilizados, sugerindo que ambos tenham a mesma
eficiência no estabelecimento das diferenciações específicas e avaliação da variabilidade
genética nestas espécies. Ambos marcadores, separadamente e em combinado, indicaram um
agrupamento de P. galbana e P. mucronata por distribuição geográfica e não por espécies, o
que sugere que possa ter ocorrido, ou estar ocorrendo, fluxo gênico entre as espécies.
Palavras chave: Passiflora mucronata, Passiflora galbana, ISSR, RAPD, variabilidade
genética, distribuição geográfica.
27
ABSTRACT
(An examination of the specific delimitation and genetic variability among populations
of Passiflora galbana Mast. and Passiflora mucronata Lam. using RAPD and ISSR).
The specific delimitation and genetic variability of nineteen populations of Passiflora (P.
galbana Mast. and P. mucronata Lam.) collected in the states of BA, ES, and RJ were
evaluated using the markers ISSR and RAPD. For the ISSR marker, fragment sizes obtained
ranged between approximately 100 and 2000 bp.
Of the 108 bands, 29.92% were
polymorphic, and the numbers of fragments generated per primer varied from 9 to 18, with an
average of 13.5 bands per primer. For the RAPD marker, the fragment sizes obtained ranged
between approximately 200 and 2250 bp. Of the 94 bands, an average of 34.16% were
polymorphic, and the numbers of fragments generated per primer varied from 6 to 14, with an
average of 10.4 bands per primer.
The Mantel test indicated that there was a positive
correlation between the genetic distances of the two markers utilized. No differences were
observed between the results of the two markers employed, suggesting that both have the
same efficiency in establishing specific differentiations and for evaluating the genetic
variability of these two species.
Both markers, separately and combined, indicated the
grouping of P. galbana and P. mucronata by their geographical distribution and not by
species, which suggests that there was, or still exists, genetic flow between the two species.
Key-Words: Passiflora mucronata, Passiflora galbana, ISSR, RAPD, genetic variability,
geografic distribuition.
28
1. INTRODUÇÃO
O gênero Passiflora L. possui mais de 525 espécies (Nunes, 2002; Macdougal e
Ulmer, 2004), com distribuição Pantropical, a maioria nas Américas, sendo o Brasil e a
Colômbia os países com o maior número de espécies (Nunes e Queiroz, 2006). Cerca de 200
espécies do gênero são nativas do Brasil.
Nas espécies de Passiflora de importância agronômica, o uso de marcadores
moleculares na caracterização da diversidade genética pode permitir além da discriminação
dos genótipos, a análise da variabilidade intraespecífica, a identificação de acessos em
duplicatas, a identificação precoce de linhas comerciais de interesse e ainda pode ser útil
como suporte legal tendo em vista a proteção de cultivares (Crochemore, 2002). Alguns
trabalhos empregando marcadores moleculares já foram desenvolvidos dentro do gênero
Passiflora (Vieira et al., 1997; Cassiano et al., 1998; Fajardo et al., 1998; Sánchez et al.,
1999; Carneiro et al., 2001; Carneiro et al., 2002; Aukar et al., 2002; Crochemore et al.,
2003; Viana et al., 2003). No caso de espécies de difícil delimitação morfológica, como
Passiflora galbana Masters e Passiflora mucronata Lamarck, estudos moleculares podem
contribuir de maneira significativa para a delimitação interespecífica e avaliação da
variabilidade genética.
Estudos de variabilidade genética representam um instrumento importante para a
compreensão dos padrões de distribuição da espécie estudada e podem contribuir para o
entendimento dos processos evolutivos e biogeográficos. Esta abordagem tem sido utilizada
satisfatoriamente para estudos de populações pertencentes a várias espécies (Borba et al.,
2001, 2002; Farinaci, 2001; Meloni et al., 2006; Azevedo et al., 2007).
1- MARCADORES MOLECULARES
Inúmeras técnicas têm sido usadas na detecção de variabilidade genética ou
polimorfismo genético em organismos (Araújo et al., 2003). A utilização de métodos
moleculares como ferramenta para a solução de problemas taxonômicos é relativamente
recente. Marcadores de DNA têm sido utilizados para análise de divergência genética
(Cattaneo, 2001; Gotmisky, 1999); identificação de cultivares (Baum et al., 2000),
mapeamento genético (Rafalski, 2002), filogenia (Gehrig et al., 1997); melhoramento
genético visando resistência a doenças (Santos, 2000) e “fingerprints” (Baum et al., 2001;
Vitória et al., 2004).
29
Com objetivos filogenéticos Muschner et al. (2003) realizaram uma análise
filogenética do gênero Passiflora ressaltando as relações evolutivas entre as espécies,
contribuindo desta forma, com a taxonomia do gênero a partir de seqüências de DNA. Os
autores citam P. galbana e P. mucronata como espécies irmãs o que ratifica a necessidade de
estudos moleculares e morfométricos para a delimitação destas espécies. Outras análises
filogenéticas foram realizadas com o gênero Passiflora até o momento (Muschner et al.,
1998; Yockteng e Nadot, 2004; Krosnick e Freudenstein, 2005; Lorenz-Lemke et al., 2005;
Finkler et al., 2005; Hansen et al., 2006; Hansen et al., 2007; Zamberlan , 2007).
Diversas técnicas moleculares são utilizadas rotineiramente, tanto com marcadores
codominantes (polimorfismos de isoenzimas, microssatélites) quanto dominantes (ISSR,
RAPD, AFLP). Quanto à sua obtenção no laboratório, estes marcadores moleculares podem
ser classificados em dois grupos, a depender da metodologia utilizada para identificá-los: 1)
hibridização de DNA (RFLP e minissatélites) ou 2) amplificação de DNA (RAPD, ISSR,
SCAR, microssatélite ou SSR, AFLP). Para cada tipo de marcador de DNA existem
vantagens e limitações (Ferreira e Grattapaglia, 1998).
1.1- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - Williams et al., 1990)
As análises de RAPD estão baseadas no fato de que cada iniciador arbitrário dirige a
síntese de vários segmentos de DNA simultaneamente em diversos pontos do genoma,
resultando assim em várias bandas com pesos moleculares diferentes, a depender do tamanho
do segmento do DNA amplificado. A utilização de RAPD se baseia na amplificação do DNA,
o que resulta em várias vantagens práticas, que podem ser resumidas em simplicidade e
rapidez. Também é adequado para a construção de mapas genéticos ao nível intraespecífico
reunindo a simplicidade da visualização direta dos marcadores de DNA tornando-se uma
tecnologia bastante acessível. Carneiro (2001) através de marcadores RAPD, construíram
mapas de ligação de Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg, confeccionando o primeiro
mapa de ligação do gênero. Duas limitações dos marcadores RAPD são mencionadas na
literatura (Karp et al., 1996). A primeira é o baixo conteúdo de informação genética por locus.
Apenas um alelo é detectado, o segmento que é amplificado, enquanto que as demais
variações alélicas são classificadas conjuntamente como um alelo nulo. Genótipos
heterozigotos não podem ser diretamente discriminados dos homozigotos por RAPD, sendo
limitação comumente descrita como “dominância” dos marcadores. Uma segunda limitação,
mais grave, se refere à repetibilidade dos marcadores entre diferentes reações, que exige que
30
os experimentos sejam realizados com padronização de equipamentos, reagentes e muita
cautela, sendo necessárias repetições para aumentar a confiabilidade dos resultados.
Uma vez estabelecido o padrão de bandas do genótipo em questão, várias informações
podem ser inferidas, o que pode ser comprovado pela ampla utilização da técnica para estudos
em microrganismos, plantas e animais (Sharon et al., 1995; Oakley et al., 1998; Urasaki et al.,
2002; Singh e Roy, 2001). Através da comparação dos “fingerprints” de genótipos dentro de
populações é possível detectar padrões de variação entre e dentro de espécies ou pares de
espécies próximas. A técnica também tem sido usada para o estabelecimento de relações
filogenéticas e diferenciação de espécies próximas (Arnold et al., 1991; Linfante e
Aguinagalde, 1996; Wolff e Morgan-Richards, 1998), para estudos de origem de poliplóides
(Brochmann et al., 1998) bem como para a detecção de híbridos (Daehler e Strong, 1997; De
Greef e Triest, 1999; Kuehn et al., 1999; Benedetti et al., 2000). Por produzir um grande
número de bandas, a técnica de RAPD permite encontrar algumas bandas específicas de
gêneros, espécies, subespécies ou raças, tornando a técnica interessante para o
estabelecimento de relações taxonômicas (Hadrys et al., 1992; Aagaard et al., 1995).
Com base em “fingerprints” de RAPD, Huang et al. (2001) puderam observar a
manutenção da variabilidade genética em quatro populações isoladas de Hygrophila
pogonocalyx, uma espécie vegetal aquática em extinção em Taiwan devido a atividades
antropogênicas. Esta ferramenta molecular tornou-se uma utilíssima complementação para os
métodos taxonômicos já existentes. Outro exemplo são os dados obtidos por Gehrig et al.
(1997) para filogenia e ecofisiologia de 30 espécies de Kalanchoe, um gênero sabidamente
CAM. Os autores comprovaram, com respaldo molecular, três subdivisões no gênero quanto
ao
seu comportamento fotossintético e
caracteres
morfológicos
já
estabelecidos
taxonomicamente. Os resultados também corroboram a suposição de que as plantas CAM
evoluíram das plantas C3 e sugerem que o centro de origem de Kalanchoe esteja localizado
nas regiões úmidas da África.
Com o objetivo de avaliar as variações genéticas através de marcadores moleculares
RAPD em dezessete espécies de maracujá Aukar et al. (2002) utilizaram 21 "primers" que
produziram um total de 270 bandas polimórficas. Os autores verificaram que houve uma
média de similaridade de 17,3% entre as espécies, e entre Passiflora edulis Sims (roxa) e sua
variedade Passiflora edulis Sims flavicarpa (amarela) de 34,35%. Portanto, foi percebido que
o valor de similaridade dentro da espécie P. edulis é baixo, ilustrando a grande variação entre
a forma amarela e a roxa de P. edulis.
31
1.2- ISSR (Inter Single Sequence Repeats - Zietkiewicz et al., 1994)
Outro marcador dominante, o ISSR apresenta vantagens sobre o RAPD, a saber
elevada reprodutibilidade de seus padrões, superior ao RAPD, além de combinar a
simplicidade da técnica com alto índice de polimorfismo.
ISSRs são marcadores semiarbitrários, amplificados por PCR em presença de um
oligonucleotídeo complementar para um microssatélite designado. Como um marcador com
base em PCR, o ISSR tem algumas vantagens quando comparado aos outros marcadores
(Souza et al., 2005). A amplificação não requer informações de sucessão do genoma e de
padrões altamente polimórficos (Zietkiewicz et al., 1994). Cada faixa corresponde a uma
seqüência de DNA delimitada por dois microssatélites. Também, as seqüências-alvo dos
ISSRs são abundantes ao longo do genoma de eucariontes (Fang e Roose, 1997; Esselman et
al., 1999). ISSRs têm provado serem úteis dentro de estudos genéticos de populações,
especialmente em detecção clonal, diversidade e detecção de indivíduos proximamente
relacionados (Gupta et al., 1994; Salimath et al., 1995; Oliveira et al., 1996; Robinson et al.,
1997; Ratnaparkhe et al., 1998; Wolfe e Liston, 1998; Wolfe et al., 1998b; Esselman et al.,
1999; Meekins et al., 2001; Mengistu e Messersmith, 2002; Ash et al., 2003; Aga et al., 2005;
Xiao et al., 2004; Pharmawati et al., 2005; Slotta et al., 2006).
2- APLICAÇÕES DOS MARCADORES MOLECULARES
Lacerda et al. (2001) identificaram marcadores RAPD específicos para Plathymenia
reticulata Benth. e P. foliolosa Benth., duas espécies arbóreas que, por sua grande
similaridade morfológica, são de difícil identificação a partir de coleções de herbário
(Heringer e Ferreira, 1973). O estudo indicou ainda uma possível ocorrência de fluxo gênico
entre as duas espécies, uma vez que uma das populações analisadas de P. foliolosa apresentou
marcadores característicos de P. reticulata. Ainda em relação a estas espécies, outros estudos
deverão ser feitos para comprovar se esta população pode ser apontada como parte de uma
zona híbrida entre P. reticulata e P. foliolosa. Os marcadores espécie-específicos encontrados
poderão servir como futura referência para a identificação de indivíduos destas duas espécies
arbóreas.
Wadt (2001) com o objetivo de avaliar a estrutura genética de treze populações
naturais de Piper hispidinervum do Vale do Acre e avaliar a diversidade genética representada
na coleção de germoplasma de pimenta longa da Embrapa Acre, por meio de marcadores
RAPD, observou que o agrupamento das distâncias genéticas entre populações, em função de
Fst (índice de divergência genética) resultou na formação de dois grupos distintos de
32
populações, os quais correspondem às duas regiões geográficas do Vale do Acre: o Alto Acre
e o Baixo Acre. O dendrograma construído pelo método UPGMA mostrou uma tendência das
populações a se agruparem de acordo com sua localização geográfica, evidenciando uma
estruturação da variabilidade genética das populações no espaço.
Ribeiro (2006) analisando a variabilidade genética e morfológica intra e
interpopulacional no complexo Bulbophyllum exaltatum (Orchidaceae) ocorrentes nos campos
rupestres brasileiros, observou através da análise isoenzimática que nenhuma das espécies
formou um grupo distinto envolvendo todas as populações co-específicas, não permitindo
uma delimitação taxonômica clara das espécies deste complexo. As espécies foram agrupadas
com base em sua região de ocorrência por estados.
Meloni et al. (2006) utilizaram três “primers” que geraram 45 bandas através de
ISSR. Eles avaliaram a variação genética em cinco populações mediterrâneas de Juniperus
phoenicea . Os resultados indicaram que o isolamento geográfico tem representado a maior
barreira para o fluxo gênico na espécie. Este trabalho constitui o primeiro passo para a
caracterização de fluxo genético das coníferas do mediterrâneo, o que contribuirá para um
plano futuro de estratégias de conservação.
A variabilidade genética foi avaliada, através do ISSR, em quatro espécies de
samambaias pertencentes ao gênero Adiantum L. do Sul da Índia. As populações
apresentaram um nível considerável de variação genética, os índices da diversidade variaram
de 0.284 a 0.464. Somente 12% das bandas de ISSR encontrados foram restritos a apenas uma
espécie, e 54% foram detectados em todas as quatro espécies. A análise da variância
molecular revelou que 71,1% da variação estava dentro das populações, e apesar do baixo
nível de diferenciação intragenérica, as análises de distâncias genéticas indicaram que as
quatro espécies de Adiantum são geneticamente distintas (Korpelainen et al., 2005).
Masumbuko et al. (2006) também utilizaram o marcador ISSR para avaliar o nível de
similaridade genética entre acessos de Coffea arabica L. da Tanzânia e para estimar a
similaridade genética entre C. arabica e as espécies diplóides de Coffea. Seis “primers” foram
usados e geraram um total de 82 bandas. O valor de dissimilaridade entre as espécies foi
maior que dentro das espécies e a análise de agrupamento baseada na distância genética de
Nei mostrou um agrupamento baseado por origem geográfica. Os resultados com ISSR foram
similares aos resultados encontrados previamente com RAPD.
Outros marcadores moleculares, a exemplo do AFLP foram utilizados para estimar a
diversidade genética entre 36 acessos de maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa
Deg.) coletados em 18 estados do Brasil (Ganga et al., 2004). Os resultados obtidos
33
permitiram concluir que os marcadores AFLP se mostraram consistentes na avaliação da
variabilidade genética, detectando e quantificando a ampla divergência genética entre os 36
acessos analisados, bem como a não-formação de estruturação geográfica. Tais resultados
puderam auxiliar na definição de estratégias mais eficientes a serem utilizadas em programas
de melhoramento de maracujá-amarelo.
Há alguns anos pesquisas com marcadores moleculares em Euterpe edulis Mart. e
Caesalpinia echinata Mart. são desenvolvidas pelo Jardim Botânico do Rio de Janeiro com o
objetivo de estudar a variabilidade genética das populações remanescentes, sistema de
cruzamento e fluxo gênico destas espécies ameaçadas de extinção devido a sua exploração
comercial, restringindo o seu tamanho populacional. Cardoso et al. (1998) puderam
identificar áreas de máxima diversidade entre cinco populações naturais (uma população da
Bahia, uma do Espírito Santo, e três do Rio de Janeiro) de Caesalpinia echinata usando
RAPD. Do total da variabilidade genética, 28,5% foi atribuída a diferença entre os grupos
geográficos, 29,6% de diferenças das populações dentro dos grupos e 42% de diferenças
individuais dentro das populações. Os resultados sugerem que a espécie sofreu um processo
de endogamia e que o marcador RAPD foi hábil na detecção de uma clara correlação entre
distância geográfica e distância genética. Também foram identificadas áreas de máxima
diversidade genética. A recomendação dada pelos autores, baseada na diversidade e na
estrutura genética das populações analisadas, é que plantas de diferentes populações e de
diferentes regiões deveriam ser usadas em um programa de recuperação. Cardoso et al.
(2000), utilizaram 429 bandas AFLP para analisar 150 plantas representando onze populações
de Euterpe edulis e verificaram haver maior variação genética dentro das populações (57,4%).
Como discutido acima, estudos moleculares são úteis no estabelecimento de relações
filogenéticas, variabilidade genética, entre outros. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a variabilidade genética intra e inter populacional de Passiflora galbana e Passiflora
mucronata através de marcadores RAPD e ISSR, assim como avaliar indiretamente a
possibilidade de fluxo gênico entre as espécies auxiliando, desta forma, na delimitação entre
elas.
34
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. MATERIAL VEGETAL
Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. foram coletadas entre abril de
2004 e junho de 2005 nos Estados da Bahia (BA), Espírito Santo (ES) e Rio de Janeiro (RJ)
(Figura 1 e Tabela 1) e foram identificadas taxonomicamente segundo caracteres
morfológicos descritos por Nunes (2002). Folhas jovens (pouco rígidas e sem necrose ou
predação) destas espécies foram coletadas em sílica gel, totalizando 242 indivíduos
distribuídos em 19 populações de ambas as espécies. As amostras populacionais variaram de
7 a 16 indivíduos em Passiflora galbana e de 10 a 22 indivíduos em Passiflora mucronata.
Os “vouchers” encontram-se depositados no herbário da Universidade Estadual de Feira de
Santana (HUEFS). As folhas foram trazidas para o Laboratório de Sistemática Molecular de
Plantas da UEFS, congeladas em N líquido, maceradas e o pó resultante foi mantido em
biofreezer a –80ºC para posterior extração de DNA.
2.2. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE DNA
O DNA de cada amostra foi extraído de folhas jovens de cada indivíduo conforme
protocolo modificado de Doyle e Doyle (1987). Quinhentos mg de cada amostra macerada
foram acrescidos de 1 ml de tampão pré-aquecido a 65ºC contendo 1% CTAB, 1,4M de
NaCl, 20mM 7EDTA, 100mM Tris-HCl (pH 8,0), 1% PVP e 0,1% de β–mercaptoetanol.
Após agitação por 30 segundos, as amostras foram incubadas durante 30 minutos a 65°C. O
material foi centrifugado por 5 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante submetido a três
extrações sucessivas com volume igual de clorofórmio: álcool (24:1). Ao final da última
extração foi acrescido ao sobrenadante isopropanol gelado e após inversão suave a mistura foi
acondicionada em geladeira por 2 horas para precipitação do DNA. Após centrifugação, o
DNA foi ressuspenso em tampão Tris-EDTA (10mM Tris, 1mMEDTA, pH 8,0) e incubado
com RNAse (SIGMA-ALDRICH) –concentração final de 40 µg/ml a 37ºC por 30 minutos.
As concentrações de DNA das amostras foram estimadas através de eletroforese em gel de
agarose 1% com o marcador Lambda Hind III em concentração conhecida (200ng) e tampão
Sódio-borato (pH 8.0 e 200 mM de hidróxido de sódio - Brody e Kern, 2004) corado com
brometo de etídio (0,5 mg/µl) e posteriormente fotodocumentado com sistema Kodak 1D 3.6.
O DNA total de cada indivíduo foi diluído para a concentração final de 10 ng /3 µl.
35
2.3. OBTENÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES
2.3.1. Amplificação de ISSR (Inter Single Sequence Repeats)
Para o emprego do ISSR o DNA genômico foi usado para amplificação através da
reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR). A amplificação de todos
os fragmentos foi realizada em um volume final de 19 µl para cada reação contendo, 2µl
Tampão 10X (500mM KCI, 100mM Tris-HCI pH 8,4, 1% Triton X-100) (PHONEUTRIA),
1µl de 25mM MgCl2, 3,2µl de 0,2mM dNTPs, 0,6µl de 0,5mM de “primer” (INTEGRATED
DNA TECHNOLOGIES INC), 1,0 U de Taq DNA polimerase (INVITROGEN) e 3,33 ηg
DNA genômico diluído, complementando o volume final com água ultrapura. Um controle
negativo com a omissão de DNA foi incluído em cada corrida para verificar a ausência de
contaminação. As reações de amplificação foram realizadas em termocicladores: Perkin
Elmer GeneAmp 9700, Master Cycler Eppendorf e PxE 0,2 Thermo Hybaid, padronizando-se
o mesmo termociclador para cada “primer” analisado. A amplificação dos fragmentos
começou com um ciclo de desnaturação inicial de 94º C por 4 min, seguido de 37 ciclos de
amplificação de 94º C por 1 min (desnaturação), 46-48º por 2 min (anelamento), 72º C por 2
min (extensão), e uma extensão no último ciclo de 72º C por 7 min. Vinte “primers” foram
testados, tendo sido oito escolhidos para a análise dentre os mais polimórficos: GOOFY,
MANNY, MAO, UBC 814, UBC 844, UBC 843, UBC 902 E JHON (Apêndice a).
2.3.2. Amplificação de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Para RAPD, as reações de amplificação do DNA foram realizadas conforme Williams
et al. (1990). As amplificações foram conduzidas em volume final de 20µl para cada reação
com 10ηg de DNA genômico, 2,82µl Tampão 10X (PHONEUTRIA) 0,85µl MgCl2 50mM,
0,51µl DNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 10mM, 1,13µl “primer” (OPERON
TECHNOLOGIES, USA), 1,15U de Taq DNA polimerase (PHONEUTRIA), e os aditivos:
5,60µl de betaína 5M, e 0,56µl de DMSO, complementando o volume final com água
ultrapura. Adicionou-se uma gota de óleo mineral para evitar a evaporação em cada amostra.
Um controle negativo com a omissão de DNA foi incluído em cada corrida para verificar a
ausência de contaminação. O mesmo termociclador foi utilizado para todas as amplificações
de RAPD, bem como um único lote de Taq e soluções necessárias, para aumentar a
36
repetibilidade. As amplificações foram feitas com um ciclo de 95°C a um minuto para
desnaturação inicial, seguido de 45 ciclos de 94°C, para desnaturação, um minuto a 36°C para
o anelamento dos “primers” e dois minutos a 72°C para a extensão dos “primers”. Finalmente
um ciclo de sete minutos a 72°C para a extensão final. Um número fixo de amostras (20% do
total) aleatoriamente escolhidas foi repetido entre diferentes lotes de amplificação, para
verificar a repetibilidade. “Primers” da OPERON TECHNOLOGIES INC (Kits A, C e F )
foram testados, tendo sido selecionados nove dentre os mais polimórficos : OPA-01, OPA-04,
OPA-07, OPA-10, OPA-12, OPA-13, OPC-05, OPC-11, e OPC-16 (Apêndice b)
2.3.3. Eletroforese ISSR
Após as amplificações foram aplicados 14µl do volume final da PCR e 6µl de corante
“blue juice” 6X (TAE 10X 0,5 ml; EDTA 0,5M 0,4ml; SDS – 10% 0,2 ml; azul de
bromofenol 0,2ml; glicerol 7,0ml; água estéril 1,7ml) em gel de agarose 1,5% em cuba
horizontal por duas horas com voltagem de 60V e com tampão SÓDIO-BORATO (pH 8.0 e
200 mM de hidróxido de sódio - Brody e Kern, 2004). O marcador Ladder de 100 pares de
bases foi utilizado para determinação do tamanho dos fragmentos gerados. O gel foi corado
com brometo de etídio (0,5mg/µl) e posteriormente fotodocumentados com sistema Kodak 1D
3.6.
2.3.4. Eletroforese RAPD
Após as amplificações foram aplicados 10µl do volume final da PCR e 5µl de corante
“blue juice” 6X (TAE 10X 0,5 ml; EDTA 0,5M 0,4ml; SDS – 10% 0,2 ml; azul de
bromofenol 0,2ml; glicerol 7,0ml; água estéril 1,7ml) em gel de agarose a 1,2% em cuba de
eletroforese horizontal por duas horas com voltagem de 100V e com tampão SÓDIOBORATO (pH 8.0 e 200 mM de hidróxido de sódio- Brody e Kern, 2004). O marcador
Ladder de 250 pares de bases foi utilizado para determinação do tamanho dos fragmentos
gerados. O gel foi corado com brometo de etídio (0,5mg/µl) e posteriormente visualizado e
foto-documentado em programa Kodak 1D 3.6.
37
2.3.5. Análise dos resultados
Para ambos marcadores e para todos os “primers”, o perfil genético de todos os
indivíduos de cada população foi determinado através da análise comparativa das imagens dos
géis. Este perfil foi convertido em uma matriz de presença (1), ausência (0) e “não
amplificação” dos “primers” (-1) (no caso de indivíduos cujas bandas não foram amplificadas
por algum problema metodológico). A caracterização do tamanho (pb) de cada banda
amplificada foi feita por comparação com o marcador presente no gel. A variabilidade
genética para todas as populações foi estimada pelos seguintes parâmetros: número de bandas,
número de bandas exclusivas, proporção de bandas polimórficas (P; critério 0,95),
heterozigosidade média esperada (He).
Para cada população foram feitas matrizes de distância genética (“genetic distance”Nei, 1978) e de identidade genética ("unbiased genetic identity" - Nei, 1978), Análise de
Coordenadas Principais (PCO) e uma Análise Molecular de Variância (AMOVA) com
número de permutações igual a 999. O programa utilizado para estas análises foi o GenAlex 6
(Peakall
e
Smouse,
2006)
disponível
no
site
http://www.blackwell-
synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1471-8286.2005.01155.x. O fluxo gênico foi avaliado através
do
programa
Popgene
version
1.32
(Yeh
et
al,
1999)
disponível
no
site
http://www.ualberta.ca/~fyeh/download.htm.
A partir da matriz de distância genética das populações foi realizada uma análise de
agrupamento utilizando o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic
Average), no programa STATISTICA 6.1 (StatSoft, 2003). Os resultados são apresentados
em dendogramas e através de gráficos gerados a partir de PCO (Análise de Coordenadas
Principais). A matriz de distância genética de Nei foi comparada com a matriz de distância
geográfica entre populações, usando o teste de Mantel com o método de aleatorização (Monte
Carlo; 1000 aleatorizações) no programa PCORD 4.10 (McCune e Mefford, 1999), para testar
correlação entre distância genética e geográfica. A distância geográfica entre pares de
populações foi calculada em quilômetros com base nas coordenadas GPS para cada população
no
sistema
elipsóide
WGS84
utilizando
o
programa
disponível
no
site:
http://www.waypoint.org/gps1-calc.html. A correlação cofenética da distância entre as
populações obtida a partir dos dados de ISSR, RAPD e distância geográfica foram calculadas
através do programa FITOPAC 1 (Shepherd, 1995).
Uma análise de agrupamento por indivíduos utilizando-se o índice de Jaccard com
1000 replicações de bootstrap foi feita no programa Past (Hammer et al., 2001) para ambos
38
marcadores moleculares.
A análise de correlação de Spearman (critério p < 0,05) entre dados genéticos de ISSR
e RAPD (He) foi realizado utilizando o pacote STATISTICA 6.1 (StatSoft, 2003).
39
coletadas nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro.
40
Tabela 1 -Lista das espécies e seus respectivos pontos de coleta ao longo dos estados de Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. (G: Passiflora
galbana M: Passiflora mucronata) N: Nº indivíduos
População Espécie
N
Local de coleta
Georeferências S
Georeferências W
Nº da exsicata
GBA 1
GBA 2
GBA 3
GBA 4
GBA 5
GRJ 6
GES 7
MBA1
MBA2
MBA 3
MBA 4
MBA 5
MRJ 6
MRJ 7
MES 8
MES 9
MES 10
MES 11
MRJ 12
15
15
10
14
7
12
13
12
9
22
10
13
10
10
13
16
10
11
20
São João do Paraíso – BA
Prado – BA
Ituberá – BA
Belmonte/ Cabrália – BA
Porto Seguro / Santa Cruz Cabrália – BA
Rio das Ostras –RJ
Guarapari- ES
Mucuri - BA
Porto Seguro / Santa Cruz Cabrália -BA
Ituberá – BA
Canavieiras – BA
Ilhéus - BA
São Francisco de Itabapoana –RJ
Serra- ES
Guarapari-- ES
Manguinhos- ES
Vila Velha - ES
Grussaí - RJ
15º 36' 14.0"
17º 18' 50.9"
13º 42' 27.2"
16º 10' 22.6"
16º 21' 57.3"
22º 16' 99.0"
20º 54' 00.0"
18º 05' 52.0"
16º 24' 27.1"
13º 43' 05.5"
15º 38' 05.1"
14º 49' 07.6"
21º 43' 25.0"
22º 16' 99.0"
20º 24' 22.0"
20º 54' 00.0"
20º 51' 42.0"
20º 41' 13.0"
21º 44' 00.0"
39º 25' 45.9"
39º 13' 33.3"
39º 00' 53.8"
38º 56' 16.6"
39º 00' 37.4"
41º 48' 61.0"
40º 47' 08.0"
39º 53' 36.0"
39º 02' 50.4"
38º 59' 22.8"
38º 56' 20.3"
39º 01' 31.1"
41º 11' 74.0"
41º 48' 61.0"
40º 19' 22.0"
40º 47' 08.0"
40º 36' 52.0"
40º 33' 73.0"
41º 02' 00.0"
HUEFS 110016
HUEFS 110017
HUEFS 110025
HUEFS 110021
HUEFS 110020
HUEFS 110029
HUEFS 110034
HUEFS 110018
HUEFS 110019
HUEFS 110026
HUEFS 110027
HUEFS 110024
HUEFS 118122
HUEFS 110030
HUEFS 118124
HUEFS 118125
HUEFS 110032
HUEFS 110031
HUEFS 118123
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora mucronata
41
3. RESULTADOS
3.1- ISSR
Os oito “primers” utilizados produziram 108 bandas com boa resolução (Figura 2). O
tamanho dos fragmentos obtidos por PCR variou de 100 a 2000 pares de bases (pb),
aproximadamente. Para as duas espécies, das 108 bandas obtidas, 32 foram polimórficas o
que corresponde a uma média de 29,92% e 76 bandas foram monomórficas e o que
corresponde a uma média de 70,08%. O número de fragmentos gerados por “primer” utilizado
neste estudo variou de 9 a 18 com uma média de 13,5 bandas por “primer” (Apêndice a).
A análise de variância (AMOVA) indicou uma variabilidade intrapopulacional de
37%. Isso pode estar associado a: presença de poucas bandas exclusivas em cada população
e/ou ausência de fragmentos específicos em apenas uma ou poucas populações. O valor da
estruturação genética calculada pelo Gst (valor correspondente ao Fst) foi de 0,5772 enquanto
que o fluxo gênico calculado a partir dessa estruturação (Nm) foi de 0,3663 em Passiflora
mucronata. Para Passiflora galbana, o Gst foi de 0,4725 e o Nm de 0,5580, confirmando
fluxo gênico moderado intra populacional para ambas as espécies. Quando calculados com as
duas espécies juntas, o valor da estruturação genética pelo Gst foi de 0,5574 enquanto que o
fluxo gênico calculado a partir dessa estruturação (Nm) foi de 0,3970 indicando também
presença de fluxo gênico moderado interpopulacional.
Em P. galbana foram encontradas de uma (populações GBA2, GBA3, GBA5 e GRJ6)
a oito (população GBA1) bandas específicas nas populações e em P. mucronata apenas uma
banda específica (populações MBA1, MBA2, MBA4, MRJ6 e MES10). Porém, todos estes
fragmentos não ocorreram em alta frequência nos indivíduos de cada população, não sendo
considerados bons marcadores para estas populações. A proporção de bandas polimórficas
variou de 36,11% (populações GBA1 e GES7) a 21,30% (população GBA5) em P. galbana e
de 33,33% (população MES11) a 14,81% (população MES9) em P. mucronata.
Em P. galbana, a população GES7 apresentou o maior valor de heterozigosidade
média esperada (0,126) e a população GBA5 o menor valor (0,074), já em P. mucronata, a
população MRJ12 apresentou o maior valor de heterozigosidade média esperada (0,127) e a
população MES9 o menor (0,046) (Tabela 2).
A menor identidade genética ocorreu entre as populações GBA2 E MRJ12 (0,732) e a
maior entre MES8 e MES9 (0,974) (Tabela 3).
42
No dendograma obtido a partir da distância genética de Nei (1978) através do ISSR, as
dezenove populações apresentaram uma tendência ao agrupamento em função da proximidade
geográfica e não em função da espécie a que pertenciam (Figura 3), sendo um grupo formado
pelas populações da Bahia, com exceção da população GBA5, e os outros constituindo-se
pelas populações do Rio de Janeiro e do Espírito Santo.
A análise de agrupamento por indivíduos utilizando o índice de Jaccard com 1000
replicações de “bootstrap”, mostrou no dendograma feito com ISSR, agrupamentos dos
indivíduos
por
população, confirmando a tendência apresentada acima (dados não
apresentados).
Na análise de coordenadas principais (PCO), os três primeiros eixos explicam 72,59%
da variabilidade da análise em porcentagem. O primeiro eixo explica 33,27% da variabilidade
e separa as populações da Bahia das populações do Espírito Santo e uma do Rio de Janeiro
(MRJ12) sendo que as demais do Rio de Janeiro ficam intermediárias entre os dois grupos. O
segundo eixo explica 22,67% da variabilidade e separa as populações GBA1 e GBA 2 das
demais (Figura 4).
43
Tabela 2 -Variabilidade genética em 108 bandas de ISSR e 94 de RAPD em dezenove populações de Passiflora galbana e Passiflora
mucronata ocorrentes nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. Veja Tabela 1 para nomes das populações. Nº bandas = total de
fragmentos analisados em cada população gerados a partir do somatório de todos os “primers” analisados; Nº bandas exclusivas = total de
fragmentos encontrados em uma única população; P = proporção de bandas polimórficas (critério 0,95); He = heterozigosidade média esperada
(Nei, 1978; "unbiased estimate").
ISSR
Pop.
GBA1
GBA2
GBA3
GBA4
GBA5
GRJ6
GES7
MBA1
MBA2
MBA3
MBA4
MBA5
MRJ6
MRJ7
MES8
MES9
MES10
MES11
MRJ12
Nº bandas
45
43
41
39
40
39
47
32
33
38
37
32
37
38
30
30
39
36
43
RAPD
Nº bandas
exclusivas
8
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
2
2
P
36,11%
31,48%
26,85%
29,63%
21,30%
25,93%
36,11%
20,37%
18,52%
26,85%
20,37%
24,07%
23,15%
23,15%
16,67%
14,81%
29,63%
33,33%
25,34%
He
0,108
0,110
0,103
0,121
0,074
0,087
0,126
0,086
0,060
0,086
0,065
0,075
0,089
0,077
0,066
0,046
0,096
0,090
0,127
Pop.
GBA1
GBA2
GBA3
GBA4
GBA5
GRJ6
GES7
MBA1
MBA2
MBA3
MBA4
MBA5
MRJ6
MRJ7
MES8
MES9
MES10
MES11
MRJ12
Nº bandas
45
46
38
42
46
42
49
30
44
38
46
42
42
48
42
41
42
40
46
Nº bandas
exclusivas
0
2
1
2
1
0
2
1
1
0
2
1
1
0
1
0
1
0
1
P
35,71%
31,25%
20,54%
26,79%
19,64%
21,43%
36,61%
12,50%
26,79%
21,43%
29,46%
25,00%
22,32%
35,71%
23,21%
23,21%
30,36%
19,64%
33,93%
He
0,122
0,144
0,070
0,097
0,061
0,076
0,130
0,046
0,095
0,079
0,096
0,083
0,073
0,126
0,089
0,084
0,103
0,070
0,106
44
Tabela 3 -Matriz de identidade genética média ("unbiased genetic identity"; Nei, 1978) em dezenove populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata
ocorrentes na Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro, a partir de dados de RAPD (abaixo da diagonal) e de ISSR (acima da diagonal). Ver Tabela 1 para nomes
das populações.
GBA1
GBA2
GBA3
GBA4
GBA5
GRJ6
GRJ7
MBA1
MBA2
MBA3
MBA4
MBA5
MRJ6
MRJ7
MÊS8
MES9
MES10
MES11
MRJ12
GBA1
0,904
0,885
0,889
0,851
0,857
0,832
0,892
0,839
0,869
0,808
0,773
0,824
0,803
0,812
0,786
0,788
0,747
0,833
GBA2
0,920
0,834
0,838
0,805
0,800
0,760
0,862
0,769
0,807
0,744
0,718
0,784
0,773
0,767
0,704
0,709
0,662
0,735
GBA3
0,819
0,789
0,938
0,825
0,831
0,811
0,829
0,806
0,830
0,804
0,780
0,805
0,776
0,801
0,766
0,777
0,737
0,792
GBA4
0,807
0,811
0,959
0,900
0,856
0,868
0,857
0,818
0,864
0,850
0,830
0,842
0,810
0,823
0,801
0,802
0,766
0,808
GBA5
0,781
0,800
0,899
0,947
0,921
0,875
0,821
0,789
0,826
0,888
0,866
0,889
0,864
0,874
0,832
0,830
0,801
0,832
GRJ6
0,792
0,811
0,843
0,873
0,915
0,912
0,806
0,792
0,826
0,829
0,791
0,838
0,838
0,919
0,898
0,882
0,856
0,891
GRJ7
0,856
0,861
0,878
0,887
0,861
0,871
0,848
0,796
0,847
0,854
0,809
0,820
0,816
0,862
0,880
0,879
0,856
0,850
MBA1
0,802
0,794
0,861
0,865
0,834
0,829
0,909
0,889
0,894
0,821
0,775
0,824
0,803
0,782
0,759
0,777
0,736
0,766
MBA2
0,831
0,819
0,876
0,905
0,870
0,842
0,921
0,900
0,869
0,796
0,751
0,805
0,796
0,778
0,749
0,752
0,712
0,732
MBA3
0,810
0,785
0,855
0,882
0,879
0,819
0,891
0,837
0,933
0,862
0,811
0,853
0,822
0,833
0,806
0,823
0,790
0,786
MBA4
0,816
0,806
0,832
0,856
0,874
0,839
0,905
0,828
0,898
0,945
0,979
0,906
0,872
0,848
0,806
0,840
0,783
0,791
MBA5
0,840
0,812
0,894
0,926
0,934
0,882
0,892
0,852
0,914
0,928
0,932
0,891
0,840
0,802
0,756
0,797
0,726
0,750
MRJ6
0,803
0,770
0,839
0,896
0,928
0,876
0,854
0,833
0,884
0,877
0,862
0,933
0,925
0,895
0,846
0,829
0,791
0,818
MRJ7
0,822
0,788
0,837
0,867
0,905
0,875
0,869
0,845
0,872
0,883
0,880
0,916
0,962
0,911
0,842
0,853
0,823
0,827
MES8
0,818
0,785
0,822
0,852
0,897
0,888
0,877
0,834
0,848
0,877
0,890
0,908
0,919
0,938
0,949
0,919
0,890
0,888
MES9 MES10 MES11 MRJ12
0,786 0,806 0,774 0,752
0,764 0,772 0,766 0,732
0,783 0,789 0,794 0,773
0,825 0,793 0,814 0,784
0,876 0,842 0,847 0,829
0,875 0,897 0,881 0,861
0,844 0,816 0,817 0,800
0,804 0,807 0,791 0,775
0,811 0,791 0,766 0,756
0,828 0,761 0,748 0,761
0,847 0,773 0,741 0,748
0,882 0,823 0,809 0,805
0,891 0,831 0,800 0,797
0,891 0,833 0,800 0,792
0,974 0,863 0,860 0,853
0,850 0,856 0,839
0,916
0,914 0,894
0,892 0,941
0,941
0,887 0,895 0,895
-
45
GBA2
GBA1
1
2
3
4
5
6 7
8 9
10 11 12 13
14
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
MBA1
30 31 32 33 34 35
36 37 38 39 40 41
2000pb
1900pb
1800pb
*
1600pb
1500pb
1400pb
1300pb
1200pb
1100pb
1000pb
900pb
800pb
700pb
600pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
Figura 2 -Gel de agarose corado com brometo de etídio mostrando o padrão eletroforético de ISSR pela amplificação com o “primer” JHON em
populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata. Aplicações 1-17: população GBA1; Aplicações 18-33: população GBA2; Aplicações 3440: população MBA1 ; Aplicações 6 e 15, 26 e 35 e 41: marcador de 100 pares de bases (pb) Ladder. Setas indicam bandas polimórficas. Setas
com * indicam bandas monomórficas. Ver Tabela 1 para nomes das populações.
46
UPGMA Distância de Nei (1978)
GBA 1
GBA 2
MBA 1
MBA 2
MBA 3
MBA 4
MBA 5
GBA 3
GBA 4
GBA 5
MRJ 6
MRJ 7
GRJ 6
MES 8
MES 9
GES 7
MES 10
MES 11
MRJ 12
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Linkage Distance
Passiflora galbana e Passiflora mucronata, ocorrentes nos estados de Bahia, Espírito Santo e
Rio de Janeiro utilizando UPGMA como algoritmo de agrupamento a partir dos dados de
ISSR. Ver a Tabela 1 para nome das populações
47
Principal Coordinates
GBA 2
Coord. 2
GBA 1
MES 11
MES 10
MRJ 12
GES 7
GRJ 6
MBA1
MBA2
GBA 3
GBA 4
MBA 3
MBA 5
MES 8
MES 9
GBA 5
MBA 4
MRJ 6 MRJ 7
Coord. 1
galbana e Passiflora mucronata ocorrentes nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de
Janeiro baseado em 108 bandas de ISSR. Ver a Tabela 1 para nome das populações.
48
3.2- RAPD
Assim como foi observado com o ISSR, os resultados com RAPD indicam que há um
agrupamento baseado na localização geográfica e não por espécies.
Os nove “primers” utilizados produziram 94 bandas com boa resolução (Figura 5).
Para a confecção da matriz foram consideradas apenas as bandas cuja visualização era
satisfatória. O tamanho dos fragmentos obtidos por PCR variou de 200 a 2250 pb,
aproximadamente. Das 94 bandas obtidas, 26 foram polimórficas o que correspondeu a uma
média de 27,21% e 68 bandas foram monomórficas (72,09%). O número de fragmentos
gerados por “primer” utilizado neste estudo variou de 6 a 14 com uma média de 10,4 bandas
por “primer” (Apêndice b).
Os valores encontrados em relação à análise de variança (AMOVA) assim como os
resultados de ISSR, demonstraram uma variação dentro das populações de 37%. Isso também
pode estar associado à presença de poucas bandas exclusivas em cada população e/ou a
ausência de fragmentos específicos em apenas uma ou poucas populações. O valor da
estruturação genética calculada pelo Gst (valor correspondente ao Fst) foi de 0,6035 enquanto
que o fluxo gênico calculado a partir dessa estruturação (Nm) foi de 0,3285 em Passiflora
mucronata e o Gst de 0,5599 e Nm de 0,3930 para Passiflora galbana, confirmando a
presença de fluxo gênico intra populacional a partir deste marcador. Quando calculados para
as duas espécies, o Gst foi de 0,6139 e Nm de 0,3144 para o marcador RAPD, confirmando a
presença de fluxo gênico interpopulacional a partir deste marcador.
Nas populações de P. galbana encontrou-se de uma (populações GBA3 e GBA5) a
duas (populações GBA2, GBA4, e GES7) bandas específicas nas populações e em P.
mucronata uma (populações MBA1, MBA2, MBA5, MRJ6, MES8, MES10 e MRJ12) a
duas (população MBA4) bandas específicas. A proporção de bandas polimórficas variou de
36,61% (população GES7) a 19,64% (população GBA5) em P. galbana e em P. mucronata
variou de 35,71% (população MRJ7) a 12,50% (população MBA1). A população GBA2
apresentou o maior valor de heterozigosidade média esperada (0,144) e a população GBA5
apresentou o menor valor (0,061) em P. galbana, já em P. mucronata a população MRJ7
apresentou a maior heterozigosidade média esperada (0,126) e a população MBA1 o menor
valor (0,046) (Tabela 2).
A menor identidade genética ocorreu entre as populações GBA2 e MES11 (0,662) e a
maior entre as populações MBA4 e MBA5 (0,979) (Tabela 3).
49
No dendograma obtido por RAPD, as dezenove populações foram subdivididas em
dois grupos. O primeiro grupo foi constituído pelas populações da Bahia, com a exclusão das
populações MBA5 e GBA5, que se agruparam com as demais populações do Espírito Santo e
do Rio de Janeiro, formando o segundo agrupamento. Portanto, assim como em ISSR é
evidente que as espécies têm uma tendência a se agruparem em função da proximidade
geográfica e não em função da espécie a que pertenciam (Figura 6).
Em relação à análise de agrupamento por indivíduos utilizando o índice de Jaccard
com 1000 replicações de “bootstrap”, assim como ISSR, o dendograma apresentou
agrupamentos dos indivíduos por população confirmando a tendência apresentada quando se
utilizou os marcadores ISSR (dados não apresentados).
Na análise de coordenadas principais (PCO), os três primeiros eixos explicam 69,17%
da variabilidade da análise em porcentagem. O primeiro eixo explica 37,82% da variabilidade
e separa as populações da Bahia das demais e o segundo eixo explica 17,43% da variabilidade
não sendo suficiente para a separação das espécies (Figura 7).
3.3 - Análise combinada e relação entre os marcadores utilizados
O dendograma obtido pela análise combinada dos marcadores RAPD e ISSR mostrou
que as dezenove populações foram subdivididas em dois grupos principais: um grupo
constituído pela populações da Bahia e outro grupo com as demais populações do Espírito
Santo e do Rio de Janeiro. As análises feitas separadamente mostraram a tendência dos
agrupamentos por distrinuição geográfica e na análise combinada é evidente que as espécies
ficaram agrupadas, em dois grupos geográficos, diferentes
em função da proximidade
geográfica e não em função da espécie a que pertenciam confirmando a tendência observada
pelos marcadores separadamente (Figura 8).
Na análise de coordenadas principais (PCO), os três primeiros eixos explicam 71,42 %
da variabilidade. O primeiro eixo explica 36,89% da variabilidade separando as populações da
Bahia das demais e o segundo eixo explica 19,91% da variabilidade porém, não são
suficientes para a separação das espécies (Figura 9), como observado nas análises
separadamente.
O teste de Mantel indicou haver correlação entre as distâncias genéticas obtidas a
partir dos dois marcadores moleculares, RAPD e ISSR (r = 0,4719; p = 0,0002). Também foi
encontrada correlação entre o marcador RAPD e a distância geográfica (r = 0,2901 e p =
50
0,0038) e não há correlação entre o marcador ISSR e a distância geográfica (r = 0,0639 e p =
0,1930).
A análise de correlação de Spearman entre variabilidade genética (He) baseada em
RAPD e ISSR demonstrou ausência de correlação entre as variabilidades genéticas (He RAPD
e ISSR: r = 0,156 e p = 0,5232) utilizadas nesse estudo.
51
MRJ6
MRJ7
GRJ7
MES8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17181920 2122232425 262728 29 30 3132 33 3435 36 37 38 3940414243
2750pb
2500pb
2250pb
2000pb
1750pb
1500pb
1250pb
1000pb
750pb
500pb
*
250pb
Figura 5 -Gel de agarose corado com brometo de etídio mostrando o padrão eletroforético de RAPD pela amplificação com o “primer” OPC 11
em populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata. Aplicações 1-4: população MRJ6; Aplicações 5-17: população MRJ7; Aplicações
18-28: população GRJ7; Aplicações 29 a 42-população MES8 : Aplicação 20 e 43: marcador de 250 pares de bases (pb) Ladder. Setas indicam
bandas polimórficas. Setas com * indicam bandas monomórficas. Ver Tabela 1 para nomes das populações
52
UPGMA Ditância de Nei (1978)
GBA 1
GBA 2
MBA 1
GBA 3
GBA 4
MBA 2
MBA 3
MBA 4
GBA 5
MBA 5
MRJ 6
MRJ 7
GRJ 6
MES 8
MES 9
MES 10
MES 11
MRJ 12
GES 7
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Linkage Distance
Rio de Janeiro, utilizando UPGMA como algoritmo de agrupamento a partir dos dados de
RAPD. Ver a Tabela 1 para nome das populações
53
MBA 5
GBA 5
MRJ 6
Coord. 2
MRJ 7
MBA 4
MES 8
MES 11
MES 10
MES 9
MBA 3
MBA2
GES 7
MBA1
GBA 2
GRJ 6
MRJ 12
GBA 3
GBA 1
GBA 4
Coord. 1
Janeiro baseado em 94 bandas de RAPD. Ver a Tabela 1 para nome das populações.
54
UPGMA Distância de Nei (1978)
GBA 1
GBA 2
MBA 1
MBA 2
MBA 3
MBA 4
MBA 5
GBA 3
GBA 4
GBA 5
MRJ 6
MRJ 7
GRJ 6
MES 8
MES 9
GES 7
MES 10
MES 11
MRJ 12
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Linkage Distance
Rio de Janeiro, utilizando UPGMA como algoritmo de agrupamento a partir dos dados de
RAPD e ISSR. Ver a Tabela 1 para nome das populações.
55
C o o rd . 2
MRJ 6
MES 8
MES 9
MRJ 7
GRJ 6
MBA 3
MBA2
GBA 4
GBA 3
MBA1
GES 7
MES 11
MBA 5
GBA 5
MBA 4
MES 10
MRJ 12
GBA 1 GBA 2
Coord. 1
Janeiro baseado em 108 bandas de ISSR e 94 de RAPD. Ver a Tabela 1 para nome das
populações.
56
4. DISCUSSÃO
A estrutura genética de uma espécie pode ser definida como a distribuição da
variabilidade genética entre e dentro de populações. Em populações naturais, a distribuição da
variabilidade genética é influenciada pelo modo de reprodução, sistema de cruzamento,
tamanho da população, distribuição geográfica e fluxo gênico (Hamrick, 1986), além de ser
estruturada no tempo e no espaço. Outros fatores que interferem nesta estrutura são mutação,
migração, seleção e deriva genética, as quais definem a distribuição da variabilidade genética
nas populações (Wadt, 2001).
Um dos parâmetros mais utilizados para quantificar a variabilidade genética são as
proporções de bandas polimórficas dentro de espécies e dentro de populações (Hamrick,
1994b). No caso das espécies de Passiflora aqui estudadas, a média de bandas polimórficas a
partir do ISSR foi de 29,92%. Resultados semelhantes foram encontrados por Ge e Sun
(1999) em Aegiceras corniculatum (16,18%), Ge et al. (2005a) em Ammopiptanthus
mongolicus e A. nanus (39,39% e 25, 89%, respectivamente) e valores um pouco maiores
foram encontrados por Xie et al. (2005) em Monimopetalum chinense (50,94%). Contudo,
outros estudos demonstram índices de polimorfismo superiores para diferentes grupos de
plantas, tais como Zietkiewicz et al., 1994; Gupta et al., 1994; Ge et al., 2005b; Liu e
Wendel, 2001; Hassel e Gunnarsson, 2003; Ye et al., 2005; Sheng et al., 2005 e Sica et al.,
2005.
A distribuição da variabilidade dentro e entre populações pode ser estimada pelas
estatísticas F de Wright ou Gst de Nei. No presente estudo com o marcador ISSR, o valor da
estruturação genética calculada pelo Gst foi de 0,5772 em P. mucronata e de 0,4725 em P.
galbana. Quando calculados com as duas espécies juntas, o valor da estruturação genética
pelo Gst foi de 0,5574. Valores semelhantes foram encontrados com o marcador RAPD (Gst
= 0,6035 em P. mucronata e 0,5599 em P. galbana). Quando calculados com as duas espécies
juntas, o valor da estruturação genética pelo Gst foi de 0,6139 o que significa um alto índice
de estruturação genética tanto intra quanto interpopulacional. Estes valores semelhantes, para
o Gst que foram encontrados nas análises combinadas e nas espécies separadamente, sugerem
que as populações possam pertencer a um mesmo táxon, uma vez que valores superiores de
estruturação genética seriam esperados numa análise combinada entre duas espécies distintas.
De maneira geral, a maior parte da variabilidade genética é mantida dentro de
populações e não entre elas (Hamrick, 1994 a,b). Hamrick (1994b), usando isoenzimas
avaliou dez espécies arbóreas tropicais e verificou que a variação genética entre populações
57
foi muito baixa (Gst = 0,05). Em outro estudo, Cecropia obtusifolia e Acacia mexicanum
também apresentaram baixos níveis de variação entre populações, com valores de Fst iguais a
0,029 e 0,040, respectivamente (Alvarez-Buylla e Garay, 1994; Eguiarte et al., 1992).
Moraes (1993)
estudando a variabilidade genética de duas populações de aroeira
(Myracrodruon urundeuva) verificou, para as duas populações, uma baixa taxa de fecundação
cruzada, ocasionando expressiva taxa de endogamia (homozigose).
As populações GBA2 e MRJ12 que apresentaram os menores valores de identidade
genética segundo o marcador ISSR, estão distantes geograficamente por 524,1 km. Já as
populações MES8 e MES9 que apresentaram os maiores valores de identidade genética, se
localizam mais próximas geograficamente por apenas 55 km. Do mesmo modo, para o
marcador RAPD, as populações GBA2 e MES11 que apresentaram os menores valores de
indentidade genética, estão distantes 398,8 km e as populações MBA4 e MBA5 que
apresentaram os maiores valores estão distantes geograficamente por 90,7 km. Portanto, a
identidade genética foi inversamente proporcional a distância geográfica em ambos
marcadores moleculares. Isto foi corroborado pelos resultados utilizando-se o teste de Mantel
que demonstrou correlação entre dados genéticos utilizando o marcador RAPD e dados
geográficos, isto é, as populações que se apresentam mais distantes geneticamente são
também as que se apresentam mais distantes geograficamente. Já os dados relacionados ao
marcador ISSR não apresentaram correlação com a distância geográfica.
Várias disjunções afetando a distribuição geográfica têm sido freqüentemente
associadas à diferenciação genética de populações em diversos grupos de plantas (Berge et
al., 1998; Borba et al., 2001; Jesus et al., 2001; Machado, 2004; Lambert et al., 2006a,
Lambert et al., 2006b; Pereira, 2006; Ribeiro, 2006), embora nenhuma correlação também
tenha sido encontrada em outras plantas (Fischer e Matthies, 1998; Li et al., 2004).
Eventos estocásticos, tais como a deriva genética e o “efeito gargalo”, além da
diminuição ou interrupção do fluxo gênico podem fazer com que populações isoladas
geograficamente apresentem variabilidade genética reduzida. A população de Prado/BA
(GBA2) possivelmente teve sua variabilidade reduzida devido à intensa ação antrópica, uma
vez que a população coletada localizava-se à beira de uma rodovia, favorecendo a sua
exploração e o seu isolamento geográfico com as outras populações. Algumas populações
com diversidade genética reduzida devido ao “pool” gênico dos seus fundadores (efeito
fundador) também podem apresentar baixa variabilidade (Tremblay e Ackerman, 2001;
Lambert et al., 2006a, Lambert et al., 2006b; Ribeiro, 2006). O reduzido tamanho efetivo da
população também parece ter contribuído para a baixa variabilidade, pois a redução
58
populacional pode reduzir a diversidade genética.
Os resultados encontrados para a proporção de bandas polimórficas dentro das
espécies variou de 14,81% a 36,11% com o marcador ISSR e de 12,50% a 36,61% com o
RAPD, o que significa um número baixo de bandas polimórficas comparado com outras
espécies (Xu et al., 1995; Gauer e Cavalli-Molina, 2000; Lima et al., 2002; Cansian, 2003;
Souframanien et al., 2004, Vicini et al., 2004; Xavier et al., 2005; Cavallari et al., 2006) e
com estudos realizados dentro do gênero Passiflora (Vieira et al., 1997; Cassiano et al., 1998;
Crochemore et al., 2003; Viana et al., 2003). No entanto, podemos observar que não houve
muita variação entre os números quando comparamos os dois marcadores, sugerindo que a
eficiência de ambos na geração de bandas polimórficas seja similar.
Em outros trabalhos a exemplo de um estudo realizado com populações de Eichornia
crassipes do Sul da China (Li et al., 2006), usando 25 “primers” de RAPD e 18 de ISSR, os
autores encontraram 172 bandas de RAPD e 145 de ISSR respectivamente, mas nenhuma
banda polimórfica foi detectada dentro da população ou entre populações para ambos
marcadores. Isto indica que a diversidade genética dentro da espécie é extremamente baixa
sugerindo que algum outro fator à exceção da diversidade genética, seja responsável pela
rápida expansão de Eichornia na região. Este estudo sugeriu que as populações poderiam
consistir de um mesmo genótipo e por isso a baixíssima diversidade revelada. A reprodução
desta espécie ocorre sexuadamente, entretanto, o brotamento lateral é amplamente utilizado
para a colonização rápida de áreas onde esta planta se instala (Souza e Lorenzi, 2005).
De acordo com o marcador ISSR, a população GBA1 foi a que apresentou o maior
número de alelos exclusivos (oito), um número considerado alto comparado com as demais
populações, que apresentaram no máximo dois alelos exclusivos. Esta população se apresenta
às margens de uma rodovia e possivelmente tenha apresentado na sua origem, grande
tamanho populacional e alta diversidade genética, e talvez por isso, apesar da ação antrópica,
sua diversidade ainda foi maior que a das demais populações. A alta variabilidade genética
desta população também pode estar relacionada a características ecológicas exclusivas, como
respostas adaptativas à ocupação de diferentes nichos levando a seleção de uma diversidade
alélica maior. A presença de bandas exclusivas de determinadas populações evidencia a
importância da manutenção de populações naturais para que não haja perda de alelos e
conseqüente redução do nível de variabilidade genética. A variabilidade genética, de forma
geral, também pode estar relacionada com a diferença de tempo transcorrido entre a extinção
das populações intermediárias, possivelmente levando à redução (embora não à extinção) do
fluxo gênico entre algumas populações e, conseqüentemente, sua diferenciação.
59
Como já mostrado anteriormente, os valores encontrados para o grau de estruturação
das populações são considerados altos e os testes de fluxo gênico realizados a partir de ambos
marcadores demonstraram que ainda ocorre fluxo gênico, ou ocorreu em um passado recente,
entre as populações amostradas dentro da mesma espécie e entre as espécies. De acordo com
Wright (1951) valores de Nm menores que 1 indicam isolamento genético, já Govindajaru
(1989) classificou o fluxo gênico em alto (Nm>1), intermediário (Nm entre 0,25 E 0,99) e
baixo (Nm<0,25). Devido aos valores de fluxo gênico encontrado entre as populações das
duas espécies, a manutenção desse
fluxo possivelmente pode ter contribuído para a
similaridade genética entre as populações estudadas, sem a nítida separação das espécies.
O fluxo gênico (dispersão de pólen e sementes) entre populações estabelecidas reduz a
diferenciação genética entre elas, sendo um dos mecanismos responsáveis pela introdução de
novas variações genéticas na população receptora (Wright, 1931). A taxa de fluxo gênico
pode ser medida em termos do número equivalente de migrantes que se move de uma
população a outra (Silvertown e Doust, 1993). Existem quatro modelos propostos para
explicar o fluxo gênico entre populações: 1) o modelo continente-ilha, em que o fluxo de
alelos ocorre em uma única direção, partindo de uma população grande para uma população
menor e isolada; 2) o modelo de ilhas, onde o movimento de alelos se dá ao acaso, em
qualquer direção, entre um grupo de pequenas populações; 3) o modelo “stepping stone”,
onde o fluxo gênico ocorre apenas entre populações vizinhas; e 4) o modelo de isolamento por
distância, o qual considera uma população contínua onde o fluxo de alelos ocorre entre
vizinhos próximos (Perecin, 2000). O recrutamento de novos indivíduos em populações com
intenso fluxo gênico é dependente das características das populações envolvidas. Assim, as
populações podem ser consideradas como uma única população, evidenciando que o fluxo
gênico não só influencia a estrutura genética como também define os limites das próprias
populações (Nason et al., 1996). No presente estudo, as populações não se agruparam por
espécies indicando haver fluxo gênico tanto interpopulacional quanto interespecífico e
conseqüentemente não permitindo limites entre as espécies.
O grau em que uma população pode ser delimitada de outras, depende do nível de
fluxo gênico entre elas (Futuyma, 1997) e alterações nesse fluxo gênico podem ser
ocasionadas por alterações nas barreiras naturais. Freqüentemente, técnicas de biologia
molecular, como os marcadores moleculares RAPD e ISSR, podem ser empregados como
ferramentas para obtenção de informações no campo da ecologia. De modo geral, eles são
utilizados para acessar o genoma de uma ou mais espécies e quantificar a variabilidade e
60
determinar a estrutura genética das populações. Esta é uma abordagem recente, mas tem se
mostrado eficiente em inferências e respostas para importantes questões ecológicas.
No que diz respeito à partição da variabilidade genética encontrada a partir da análise
de variância houve uma menor variação dentro das populações e maior divergência entre as
populações para ambos marcadores utilizados. Estudando um gênero de Taxaceae Ge et al.
(2005b) encontraram que as análises de AMOVA revelaram as diferenças entre espécies e
explicaram somente 27,38% da variação total, visto que as diferenças entre populações e
dentro das populações eram 57,70 e 14,92%, respectivamente. Os níveis baixos da variação
genética intrapopulacional e de divergência eram atribuídas aos “efeitos gargalo” durante ou
após as glaciações do Pleistoceno.
A análise fenética baseada na distância de Nei (1978) obtida a partir de dados
genéticos revelou que há um agrupamento biogeográfico para a distribuição da similaridade
genética das populações. As populações amostradas estão distribuídas em agrupamentos de
acordo com a distância geográfica, uma vez que populações mais próximas apresentam maior
similaridade genética. De acordo com ISSR e com o RAPD, as populações mais próximas
(MES8 e MES9), que estão distantes apenas 55 km, apresentaram pequena distância genética.
O RAPD também apontou as populações MES10 e MES11, distantes apenas 19,5 km, como
apresentando pequena distância genética.
De forma geral, podemos afirmar que as populações da Bahia são mais semelhantes
entre si do que com as demais. Embora com o marcador ISSR a população GBA5 tenha se
agrupado com as espécies do Rio de Janeiro, esta população permaneceu no mesmo grupo da
Bahia quando analisadas com marcador RAPD.
Nos dados obtidos para ambos os marcadores as populações do Rio de Janeiro
apresentaram-se mais próximas da Bahia do que as populações do Espírito Santo, resultado
considerado surpreendente, uma vez que estas populações encontram-se mais distantes
geograficamente. Uma explicação possível para esta situação é que os agrupamentos
formados podem refletir a adaptação a diferentes condições ecológicas, pois apesar da
distância geográfica, muitas populações do Rio de Janeiro podem ser encontradas em
condições semelhantes às populações da Bahia. Além disso, populações próximas, como no
caso das populações da Bahia e do Espírito Santo, mas que se encontram sob diferentes
pressões seletivas, podem divergir geneticamente apesar do fluxo gênico.
A estrutura genética populacional das plantas está diretamente relacionada a fatores
como o sistema de reprodução e os mecanismos de dispersão do pólen e das sementes
(Hamrick and Godt, 1990; 1996), o tamanho efetivo da população, e a sua habilidade de
61
colonização (Sun, 1996; 1997). Estes fatores aliados a condições ecológicas podem estar
atuando diretamente para contribuir com o padrão biogeográfico encontrado neste estudo com
as duas espécies de Passiflora.
Variabilidade genética x marcador utilizado
A variabilidade genética, além de ser importante para a evolução, pode ser usada como
ferramenta de investigação por ecólogos e sistematas em diversos ramos da Ciência como, por
exemplo, para verificar as afinidades e limites entres as espécies; detectar modos de
reprodução e estrutura familiar; estimar níveis de dispersão nas populações, entre outros
(Avise, 1994). As ferramentas básicas para esse tipo de estudo são os chamados marcadores
moleculares que são biomoléculas relacionadas a algum traço genético e que apresentam
alguma variabilidade relacionada ao problema a ser estudado.
Essa variabilidade nos permite comparar indivíduos, populações ou até mesmo
espécies diferentes. Além disso, variação genética fornece o material básico para a evolução
de todas as espécies (Solé-Cava, 2001). Diversos fatores, entre os quais mutação, deriva
genética, modo de reprodução, fluxo gênico, seleção natural, distribuição geográfica das
populações, número de populações estudadas, e o tipo de marcador usado podem influenciar
os padrões de variabilidade genética entre e dentro das populações (Slatkin, 1987).
No presente estudo foram utilizados dois marcadores distintos para avaliação dos
padrões de diversidade em P. galbana e P. mucronata. A heterozigosidade média esperada
conforme os marcadores ISSR variou de 0,127 a 0,257, enquanto a heterozigosidade média
esperada pelos marcadores RAPD variou entre 0,164 e 0,185. Estes valores, entretanto, foram
diferentes daqueles esperados conforme a literatura. Marcadores baseados em polimorfismos
de DNA podem detectar um número maior de eventos mutacionais, em regiões codificantes e
não codificantes, cobrindo todo o genoma e possibilitando a análise de um número quase
infinito de bandas.
Relação entre os marcadores utilizados
O teste de Mantel demonstrou haver correlação entre dados genéticos estimados por
ambos marcadores. Estes dois marcadores genéticos também foram utilizados para verificar o
nível de diversidade genética em sete populações de Monochoria vaginalis do sul da China e
62
assim como os resultados encontrados neste trabalho o teste de Mantel sugeriu correlação
entre os dois marcadores (r = 0.16) (Li et al., 2005).
Ambos os marcadores moleculares utilizados, ISSR e RAPD, foram úteis em mensurar
a variabilidade genética das populações. Porém, demonstraram resultados diferentes em
relação à significância dos dados quando comparados com os resultados encontrados em
relação às distâncias geográficas. Isto pode ser devido ao fato de que as duas classes dos
marcadores exploram, ao menos em parte, parcelas diferentes dos genomas uma vez que o
RAPD tem como característica amplificar regiões ao acaso e os ISSR amplificam regiões
mais específicas do genoma, entre 2 microssatélites.
De acordo com os resultados obtidos para ambos marcadores separadamente e
combinados, podemos observar que a tendência de agrupamento por distribuição geográfica e
não por espécies, não reflete as diferenças morfológicas que podem ser detectadas para a
separação de Passiflora galbana e P. mucronata (Capítulo 2). Correlações entre dados
genéticos e morfológicos tem sido observadas com pouca freqüência em plantas (Mitton,
1978; Gilles, 1984; Elisens et al., 1992; Avise, 1994; Borba et al., 2001; Lambert et al., 2006
a,b; Conceição, 2006). Isso porque mudanças ocorridas em nível genético nem sempre
correspondem a alterações morfológicas, uma vez que as mutações podem ser sinônimas (ou
seja, não alteram o aminoácido codificado). Estas mutações podem ocorrer em diferentes
regiões do genoma, codificantes ou não, e nem sempre as regiões amostradas através de
marcadores de polimorfismos de DNA correspondem a regiões relacionadas com a expressão
de caracteres morfológicos. Isto poderia justificar os resultados encontrados neste estudo que
sugerem que apenas um alelo seja responsável pelo formato da folha, caractere que é utilizado
para a separação das espécies P. galbana e P. mucronata através de outras ferramentas como
a morfometria.
Os marcadores moleculares RAPD e ISSR são utilizados em diversos trabalhos e
analisados comparativamente quanto a sua habilidade para a detecção da variabilidade
genética. Alguns autores concluíram que os marcadores ISSR são mais eficientes quanto à
detecção de bandas polimórficas (Quian et al., 2001; Galvan et al., 2003; Souframanien et al.,
2004; Li et al., 2005). Por outro lado, alguns autores mencionam que ambos marcadores são
igualmente eficientes na detecção desta variabilidade em outras espécies vegetais (Tanyolac,
2003) e como encontrado com as espécies de Passiflora deste estudo.
Awasthi et al. (2004) estudando a diversidade genética e as relações em amora
através de marcadores RAPD e ISSR, revelaram que estes marcadores são úteis para a análise
de diversidade genética e caracterização de germoplasma no gênero Morus e que possíveis
63
marcadores espécie-específicos poderão ser convertidos a SCARs (Regiões Amplificadas de
Sequências Caracterizadas - Paran e Michelmore, 1993) em estudos adicionais. O uso de
outras técnicas moleculares podem ser úteis para esclarecer se, de fato, como revelaram os
resultados encontrados neste trabalho para ambos marcadores, esteja realmente havendo fluxo
gênico entre as espécies P. galbana e P. mucronata, e comprovar se de fato elas representam
grupos populacionais que pertencem a um mesmo táxon.
Resultados como os encontrados neste trabalho permitem inferir que as estratégias de
conservação requeridas para as espécies devem obedecer a diferentes mecanismos de
manutenção da diversidade, uma vez que as espécies possuem uma forte ligação entre as
populações através do seu fluxo gênico interpopulacional. Portanto, a perda de uma dessas
populações para qualquer uma das espécies aqui estudadas poderia implicar na perda de
diversidade genética das mesmas.
64
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CAPÍTULO 2
Variabilidade morfológica foliar inter e
intra-específica em Passiflora galbana Mast.
e Passiflora mucronata Lam.
PASSOS, V. M.1; VAN DEN BERG, C. 1; VITÓRIA, A . P. 2
1
Programa de Pós-Graduação em Botânica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de
Feira de Santana (UEFS) [email protected]
2
78
RESUMO
(Variabilidade morfológica foliar inter e intra-específica em Passiflora galbana Mast. e
Passiflora mucronata Lam.)
Com o objetivo de estudar a variabilidade morfométrica inter e intra-específica em P. galbana
e P. mucronata foram avaliados os contornos de folhas de dezenove populações coletadas na
Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro através da morfometria geométrica foliar. Os dados
foram coletados pela detecção dos contornos a partir de imagens digitalizadas e foi utilizada a
Análise Elíptica de Fourier (EFA) que produziu 77 variáveis a partir de 20 harmônicos. Após
redução dimensional destas variáveis através de Análise de Componentes Principais (ACP),
foram empregados outros métodos estatísticos multivariados: Análise de Variáveis Canônicas
(AVC) e análise de agrupamento a partir de distância de Mahalanobis. As Análises de
Variáveis Canônicas mostraram significância em três dos eixos, embora já os dois primeiros
eixos, retendo 92,99% de toda a variação permitiu a separação das populações de P.
mucronata de P. galbana com exceção de uma população de P. mucronata da Bahia. Sendo
assim, o primeiro eixo canônico separou razoavelmente as duas espécies, revelando que a
morfometria geométrica pode ser utilizada como uma ferramenta auxiliar na taxonomia para a
delimitação destas Passifloras, agrupando as populações de cada espécie entre si,
independente da distribuição geográfica, sugerindo que os padrões encontrados sejam
resultantes de um ou poucos loci controlando estes caracteres.
PALAVRAS-CHAVE: Passiflora mucronata, Passiflora galbana, morfometria, análise
multivariada , Análise Elíptica de Fourier
79
ABSTRACT
(Inter- and intra-specific leaf morphologic variability in Passiflora galbana Mast. and
Passiflora mucronata Lam).
With the objective of examining the inter- and intra-specific morphometric variability of the
leaf geometry of P. galbana and P. mucronata, nineteen populations from the states of Bahia,
Espírito Santo and Rio de Janeiro were collected and examined. Data were obtained by
analyzing the outlines of digitalized images of the leaves of these species, using a Fourier
Elliptical Analysis (FEA) that produced 77 variables from 20 harmonics. After a dimensional
reduction of these variables by Principal Components Analyses (PCA), multivariate statistical
analyses, Canonical Variate Analyses (CVA), and grouping analyses by Mahalanobis
distances were used. The Canonic Analyses demonstrated significance in three axes, although
the first two axes already retained 92.99% of the total variation, permitting the separation of
all of the populations of P. mucronata from those of P. galbana (with the exception of a
single population of P. mucronata from Bahia). As such, the first canonic axis separated the
two species reasonably well, indicating that geomorphic morphometrics can be used as an
auxiliary taxonomic tool in the delimitation of these species of Passiflora, grouping the
populations of each species among themselves, independent of their geographic origin,
suggesting that the joined standards are resultant of one or few loci controlling these
characters.
KEY-WORDS: Passiflora mucronata, Passiflora galbana, morphometry, multivariate
analysis, Elliptic Fourier Analysis.
80
1. INTRODUÇÃO
A variação morfológica observada para o gênero Passiflora L. é bastante ampla,
indicando a ocorrência de variabilidade genética inclusive nas espécies cultivadas (Viana,
2003).
Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. são lianas herbáceas,
inteiramente glabras, com o caule cilíndrico, estrias e gavinhas presentes e apresentam muitas
estruturas com características comuns, tais como estípulas, flores e sementes. Segundo Nunes
(2002), estas espécies são bastante similares morfologicamente diferenciando-se apenas pelo
número de nervuras primárias na lâmina foliar (três a cinco em P. mucronata e uma em P.
galbana), pelas glândulas do pecíolo (duas a três estipitadas em P. galbana e duas sésseis em
P. mucronata), sendo que o limite destas características dentro de cada uma é muito tênue o
que torna difícil a delimitação específica. Além disso, as flores destas espécies são muito
semelhantes dificultando ainda mais a identificação e a delimitação taxonômica baseado
apenas em caracteres morfológicos florais (Figura 1).
A morfologia da folha representa um importante grupo de caracteres vegetativos que
são usados em estudos taxonômicos e ecológicos. Sendo assim, diferentes métodos têm sido
usados para analisar a arquitetura da folha (Premoli, 1996). Os dados morfométricos têm sido
usados para obter evidências de similaridades entre táxons e podem testar novas hipóteses
relativas à ecologia, sistemática e história evolutiva (Rohlf e Slice, 1990; Rolhf e Marcus,
1993).
Embora as medidas lineares constituam a base da morfometria convencional que
fundamentou diversos trabalhos na taxonomia, nos últimos 25 anos estão sendo observadas
mudanças na análise das formas biológicas, que passaram a ser focalizadas por novos métodos
apoiados em morfometria geométrica: o estudo da biometria da forma (Bookstein, 1991). A
metodologia utilizada na morfometria tradicional não informa sobre a natureza dos caracteres,
sendo todas as variáveis consideradas igualmente em análises canônicas e técnicas de
agrupamento. Para Bookstein (1994) medidas lineares simples, como a distância entre dois
marcos anatômicos e medidas angulares não podem ser consideradas para representar
características homólogas. Desta forma, o relacionamento morfométrico entre um grupo de
objetos só poderá ser realizado pela análise simultânea de um conjunto de marcos anatômicos.
Assim, torna-se de suma importância a definição dos marcos anatômicos em uma análise
morfométrica (Bookstein, 1991).
81
Um fator limitante para o uso dos marcos anatômicos é a dificuldade em identificá-los
em um grupo de espécimes vegetais. Para Jensen (1990), pelo menos dois marcos podem ser
definidos em uma folha, sendo um deles o encontro do limbo com o pecíolo, no caso da
existência de um pecíolo bem definido e o outro é a extremidade do limbo, desde quando
exista uma nervura central bem definida. No entanto, diante da limitação na identificação dos
marcos anatômicos, Ray (1992) utilizou a combinação de marcos com os dados gerados pela
definição dos contornos do limbo, sendo que os marcos anatômicos neste caso tiveram a
importância de definir contornos homólogos.
Monteiro e Reis (1999) acrescentam que nos casos onde as estruturas biológicas não
apresentam um número suficiente de marcos anatômicos identificáveis, a forma pode ser
descrita em termos de coordenadas cartesianas de uma seqüência de pontos ao longo do
contorno da estrutura ou do organismo em estudo, sem haver correspondência biológica, ou
seja, sem homologia entre espécimes. No caso de se utilizar contornos fechados, onde o
último ponto em posição é igual ao primeiro, é suficiente a identificação de um marco
anatômico ao longo do mesmo, para que ele seja o primeiro ponto a ser descrito em todas as
curvas. Um exemplo da aplicação da decomposição dos contornos nos diversos órgãos é
através da Análise Elíptica de Fourier (a partir daqui referida como EFA), método adequado
para a descrição quantitativa de formas fechadas, a exemplo do contorno de uma folha (Kuhl
e Giardina, 1982). Este método tem sido usado com sucesso em plantas (Furuta et al., 1995;
Iwata et al., 1998; McLellan, 1993; Ohsawa et al., 1998; White et al., 1988; Yoshioka et al.,
2004).
As elipses são definidas por quatro coeficientes para cada harmônica, que correspondem
à série de Fourier das curvas de seno e co-seno que vão sendo somadas à função para
descrever a forma do contorno. As primeiras harmônicas descrevem o contorno em linhas
gerais, enquanto que os detalhes, inclusive erros na digitalização são descritos pelas últimas
(Monteiro e Reis, 1999; Rumpunen e Bartish, 2002). Na prática, considera-se que 10-40
harmônicas são suficientes (Mclellan e Endler, 1998; Olsson et al., 2000; Persson e
Gustavsson, 2001), embora muitas vezes as últimas harmônicas possam ser ignoradas sem
grande perda de informação biológica (Monteiro e Reis, 1999). Os coeficientes obtidos
constituem o novo conjunto de dados a ser utilizado nos diversos tipos de análise multivariada
para exame das causas que levaram à variação da forma.
A morfometria geométrica utiliza a forma geométrica ou o contorno de um objeto, não
sendo considerados seu tamanho ou orientação no espaço. Através de análises multivariadas
82
são analisadas simultaneamente diversas variáveis resultando na medida da variação da forma
de um determinado objeto.
Métodos morfométricos podem ser usados com sucesso na inferência da variabilidade
fenotípica de espécies vegetais. Loss (1993) avaliando as relações das espécies de Lilium
(Poaceae) através da variação morfológica reconheceu dois grupos dentro do gênero, uma vez
que um grupo contendo as espécies L. temulentum and L. persicum, foi claramente distinto
das outras espécies que formaram outro grupo. Brysting e Elven (2000) investigando o
complexo de Cerastium alpinum - C. arcticum (Caryophyllaceae)
através de análises
numéricas da variação morfológica e fazendo uma revisão taxonômica, concluíram que a
divisão atual é imprópria e não cobre todos os níveis de variações dentro do complexo.
Dentre os métodos morfométricos, citam-se à captura da imagem, digitalização e
análise dos resultados. As Análises de Componentes Principais e Análises de Variáveis
Canônicas, a partir daqui referidos respectivamente como ACP e AVC, são melhor tratados
como “métodos de estatística multivariada” ou simplesmente “métodos multivariados”, já que
têm outras aplicações. A escolha do método mais adequado tem sido determinada pela
precisão desejada pelo pesquisador, pela facilidade da análise e pela forma como os dados
foram obtidos (Cruz e Regazzi, 1997). Para muitos tipos de dados biológicos existem
correlações entre variáveis, sendo que informações providas por análises univariadas isoladas
podem ser incompletas. Assim, técnicas de análise multivariada combinam, simultaneamente,
informações múltiplas provenientes de uma unidade experimental, que não podem ser obtidas
com o uso da análise univariada.
A técnica de ACP consiste em maximizar a variação total, ou seja, o novo conjunto
de variáveis, em ordem de estimação, retém o máximo de informação em termos de variação
total. Já a AVC maximiza a variância entre os centróides dos grupos, ou seja, maximiza a
separação dos grupos, expressos pelos seus centróides. Essas variáveis explicarão tanto
melhor a variabilidade manifestada entre os indivíduos avaliados quanto menor for o número
de variáveis que acumulem pelo menos 70% da variação total (Cruz, 1990) ou 80%. Ao
determinar o número de variáveis canônicas que acumulam um mínimo de 80% da variância
total disponível, estimam-se os escores de cada variável canônica que podem ser plotados em
gráficos bi ou tridimensionais, sendo as variáveis canônicas usadas como eixos de referência,
em que podem ser visualizadas as distâncias gráficas que representam as similaridades e
dissimilaridades entre genótipos (Piassi, 1994).
A análise de agrupamento tem por finalidade reunir, por algum critério de
classificação, os indivíduos em vários grupos, de tal forma que exista homogeneidade dentro
83
do grupo e heterogeneidade entre grupos. Através da análise de discriminantes Premoli (1996)
avaliou a arquitetura da folha de algumas espécies de Nothofagus da América do Sul
(Nothofagaceae) e verificou que havia diferenças entre N. dombeyi, N. betuloides em relação
a N. nitida confirmando as informações obtidas em outros estudos com dados alozímicos.
Alternativamente, as técnicas de análise de agrupamento têm por objetivo dividir um grupo
original de observações em vários grupos, segundo algum critério de similaridade ou
dissimilaridade entre os indivíduos, e a segunda etapa envolve a adoção de uma técnica de
agrupamento para formação dos grupos (Cruz e Regazzi, 1997). Diversos
estudos
têm
mostrado a utilidade do emprego de métodos multivariados em plantas (Dupuy et al., 1985;
Resende, 1991; Dufrêne et al., 1991; Van Den Berg, 1996; Premoli, 1996; ZizumboVillarreal, e Piñero 1998; Brysting e Elven, 2000; Knyasev et al., 2000; Borba et al., 2002;
Carlini-Garcia et al., 2002; Iwata et al., 2002; Rumpunen e Bartish, 2002; Widén et al., 2003;
Iwata et al., 2004; Goldman et al., 2004; Yoshioka et al., 2004; Yoshioka et al., 2005;
Yoshioka et al., 2006; Yoshioka et al., 2007).
A combinação de caracteres florais e vegetativos foi utilizada por Borba et al. (2002)
para realizar uma análise morfométrica em 21 populações de cinco espécies de Pleurothalis
(Orchidaceae) em vegetação de campo rupestre, agrupadas anteriormente com base nos
espaçadores transcritos internos (ITS-1 e ITS-2), sendo tais grupos concordantes com um
prévio estudo taxonômico e análise de aloenzimas. A morfometria revelou que a formação de
grupos envolvendo as espécies, utilizando apenas caracteres vegetativos é concordante com os
resultados obtidos previamente com aloenzimas, de forma contrária ao agrupamento
produzido pelos caracteres florais, reforçando a hipótese de que as similaridades florais são
resultantes de convergência dirigida por mecanismos similares na polinização de tal forma que
o aspecto da flor pode não ser um bom indicativo para o estudo de relações filogenéticas neste
grupo.
Descrições quantitativas da forma das folhas podem ser importantes nos casos onde se
pretende fazer comparações entre e dentro de espécies. Neste caso, a metodologia se
fundamenta nas relações entre variáveis que representam dimensões de partes homólogas,
obtidas na forma de medidas lineares simples, a exemplo de comprimento e largura (Jensen et
al., 1993; Bolstad e Salvesen, 1999; Rumpunen e Bartish, 2002; Goldman et al., 2004). Vale
ressaltar que homologia neste caso representa a correspondência biológica de posição, como é
enfatizado por Sneath e Sokal (1973), sendo diferente do conceito evolutivo, em que a
homologia é referida como similaridade em função de ancestralidade comum.
84
Knyasev et al. (2000), com base em análises morfométricas de peças florais,
demonstraram que Cypripedium ventricosum Sw. é intermediária entre C. calceolus L. e C.
macranthos Sw. Esses resultados foram concordantes com os obtidos a partir de análises
isoenzimáticas. Dupuy et al. (1985) propuseram que Cymbidium wilsonii Rolfe e C.
schroederi Rolfe tenham se originado por hibridação e ainda classificaram C. iansonii Rolfe
como variedade de C. lowianum Rchb.f. Dufrêne et al. (1991) analisaram características
quantitativas em trinta e cinco populações de Dactylorhiza maculata (L.). Uma combinação de
métodos moleculares (RAPD) e morfométricos (medidas morfológicas clássicas e coeficientes
das elipses de Fourier) foram utilizados por Rumpunen e Bartish (2002) para diferenciação
interespecífica no gênero Chaenomeles (Rosaceae), verificando que os coeficientes das elipses
de Fourier apresentaram maior capacidade de discriminação à medida que aumentou o número
de harmônicas avaliadas, sendo que com 20 harmônicas 98-99% das plantas foram realinhadas
em seus grupos corretos. Além disto, os coeficientes das elipses de Fourier apresentaram
maior capacidade de separação dos grupos em todos os níveis hierárquicos quando comparado
com as medidas morfológicas tradicionais, sendo que a diferença foi maior ao nível de família
e menor para as comparações interespecíficas.
Jensen et al. (1993) testaram a hipótese de hibridização em Quercus (Fagaceae),
envolvendo as espécies Q. ellipsoidalis Hill e Q. rubra L., através de estudos quantitativos
com base na morfologia foliar, embora evidências de hibridização também apareçam em
outros caracteres. Os autores estabeleceram 17 marcos anatômicos nas folhas dos parentais e
das plantas consideradas híbridas e concluíram que a variação morfométrica é consistente com
a hipótese de hibridização entre as duas espécies, mas seguindo um processo de introgressão
de Q. ellipsoidalis em Q. rubra.
A relação entre as espécies Acer rubrum, Acer saccharinum (Aceraceae) e seus híbridos
foi avaliada por Jensen et al. (2002) através de análise morfométrica de folhas com base em
medidas morfológicas tradicionais e os coeficientes das elipses de Fourier para os contornos
foliares, concluindo que os dados produzidos pelos diferentes métodos revelaram padrões
similares para as duas espécies e que os híbridos apresentaram características intermediárias
entre as espécies parentais.
Uma combinação de 40 caracteres vegetativos e florais serviu de base para Goldman
et al. (2004) realizarem a circunscrição do gênero Calopogon (Orchidaceae), sendo possível
por análise discriminante, identificar vários caracteres que permitiram distinguir a maior parte
dos grupos, destacando-se C. tuberosus var. latifolius H. St. John por apresentar maior
diferenciação, sendo o único táxon não reconhecido neste gênero.
85
Plotze et al. (2005), propuseram um novo método para a avaliação das características
morfométricas das estruturas de folhas em dez espécies do gênero Passiflora. A função de
multiescala da dimensão fractal de Minkowski foi aplicada às imagens digitais das folhas para
gerar medidas da complexidade interna (nervuras) e externa das folhas (contorno). O método
foi útil em analisar diferenças entre as espécies e um número pequeno das folhas por espécies
foi suficiente para estabelecer um teste padrão característico para cada uma delas, o que
constituiu uma vantagem importante do método de reconhecimento e classificação destas
espécies.
Dentro da família Passifloraceae há uma variação extrema na morfologia das folhas
sendo as mais elevadas entre todas as angiospermas (MacDougal, 1994). Até o momento a
base genética da morfometria foliar destas duas espécies de Passiflora não é conhecida, por
isso avaliou-se o caráter morfológico da folha uma vez que a morfologia floral entre as duas é
muito semelhante como discutido por Nunes (2002) e Cervi (1997). A morfologia das folhas
sempre desempenhou papel importante na sistemática vegetal como um todo, particularmente
para caracterizar e identificar taxa onde a variação nas estruturas florais não é informativa
(Stace 1989). Existe uma enorme diversidade na forma das folhas das populações de P.
galbana e P. mucronata e esta variação pode ser utilizada como uma ferramenta auxiliar na
taxonomia, em vista da importância da forma das folhas, reconhecida pelos taxonomistas em
alguns grupos vegetais, e especialmente em Passifloraceae. Sendo assim, o objetivo deste
trabalho foi estudar a variabilidade morfológica em folhas de 19 populações de Passiflora
galbana e P. mucronata através dos seus contornos geométricos, visando fornecer dados para
a delimitação específica das mesmas.
86
A
B
2 cm
Figura 1 -Morfologia das flores de Passiflora galbana (A) e Passiflora mucronata (B)
87
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
178 indivíduos de P. galbana e 172 indivíduos de P. mucronata foram coletados nas
regiões da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro (Figura 2 e Tabela 1), perfazendo um total
de 19 populações. As espécies foram classificadas de acordo com os caracteres morfométricos
descritos por Nunes (2002).
Para as análises descritas abaixo, de cada planta amostrada foi coletada a quarta folha
a partir do ápice do ramo, completamente expandida, sendo estas lâminas foliares prensadas,
colocadas em estufa com circulação forçada de ar a 60°C por 72 horas. Os “vouchers”
encontram-se depositados no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana.
Coleta de dados morfológicos
A face abaxial das folhas foi escaneada através do programa Adobe Photoshop 5.0
Limited Edition. Para a detecção dos contornos utilizou-se o TPS Dig versão 1.31 onde as
coordenadas foram escritas em arquivo de texto. Este programa registra as coordenadas
cartesianas de todos os “pixels” que participam do contorno da folha numa imagem digital.
Foi inserido apenas um
“landmark” por folha, sempre uniformemente nos indivíduos
padronizando-se a posição referente à inserção do pecíolo da folha . Posteriormente a análise
de Fourier e a visualização dos contornos foram feitas utilizando-se o “software” Morpheus et
al. (Slice, 1998).
A análise de Fourier foi feita com um número de 10, 20 e 30 harmônicos sendo
escolhido para a análise o referente a 20 harmônicos. Para a edição da matriz utilizou–se o
Programa Microsoft Excel 2003.
Análises multivariadas
As análises multivariadas de ordenação (análise de discriminantes, análise de
correlações canônicas e análise de componentes principais) e análises de agrupamento
(UPGMA) foram feitas utilizando-se o “software” R Package (versão 2.5.2) bem como os
88
indivíduos médios para cada população. A Distância Generalizada de Mahalanobis (D2) foi
calculada entre pares de populações. Esta distância foi escolhida por considerar a variação
intra-específica e as correlações entre as variáveis. Com base nestas distâncias foram obtidos
os fenogramas entre as populações.
A análise discriminante canônica foi empregada para verificar como as populações
relacionam-se entre si. Esta análise foi utilizada por considerar as correlações residuais
existentes entre as médias das observações, o que se traduz numa vantagem em relação aos
componentes principais. Na análise de variáveis canônicas, o princípio de conglomeração
baseia-se na distância de Mahalanobis. Outra vantagem do método é que, mesmo que o
número de variáveis não seja menor que o número de indivíduos dentro de cada população, a
análise discriminante canônica pode ser aplicada de maneira exploratória, produzindo
resultados gráficos bastante úteis (Manly, 1994; Cardim et al., 2001).
Os padrões de similaridade/diferença morfológica foram analisados por métodos
estatísticos multivariados e foram realizadas AVC e análise de discriminantes para cálculo de
parâmetros de variabilidade e estruturação morfológica. Foram utilizados os dados do ACP
para concentrar a variância dos coeficientes das elipses e a partir dos componentes do ACP
foi feita a AVC com o objetivo de explorar a partição dos grupos pelos principais eixos
canônicos e de identificar os caracteres que mais contribuem para o padrão observado a partir
da correlação entre variáveis e os eixos canônicos. A partir da matriz de Distância
Generalizada de Mahalanobis entre os pares de centróides das dezenove populações foi
também realizada uma análise de agrupamento utilizando o algoritmo UPGMA.
89
coletadas nos Estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro .
90
Tabela 1 -Lista das espécies e seus respectivos pontos de coleta ao longo dos estados de Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. (G: Passiflora
galbana M: Passiflora mucronata), N: Nº de indivíduos.
População
GBA 1
GBA 2
GBA 3
GBA 4
GBA 5
GBA 6
GBA7
GES 8
GES 9
MBA 1
MBA 2
MBA 3
MBA 4
MBA 5
MRJ 6
MRJ 7
MRJ 8
MES 9
MES 10
Espécie
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
Passiflora galbana
N
12
24
13
22
26
24
29
14
24
9
19
25
21
12
14
7
7
29
19
Local de coleta
São João do Paraíso – BA
Prado – BA
Porto Seguro – BA
Belmonte – BA
Una- BA
Ituberá – BA
Salvador – BA
Guarapari- ES
Vitória- ES
Mucuri - BA
Porto Seguro -BA
Canavieiras – BA
Ilhéus – BA
Ituberá-Ba
Grussaí-RJ
São Francisco de Itabapoana –RJ
Manguinhos- ES
Vila Velha—ES
Georeferências S
15º 36' 14. 0 "
17º 18' 50.9"
16º 21' 57.3"
16º 10' 22.6"
15º 11' 01.3"
13º 42' 27.2"
12º 00' 56. 0"
20º 27' 27. 0"
20º 54' 00. 0"
18º 05' 52.0"
16º 24' 27.1"
15º 38' 05.1"
14º 49' 07.6"
13º 43' 05.5"
21º 44' 00.0"
21º 43' 25. 0"
22º 16' 99. 0"
20º 12' 17. 0"
20º 27' 27. 0"
Georeferências W
39º 25' 45.9"
39º 13' 33.3"
39º 00' 37.4"
38º 56' 16.6"
39º 00'59. 6"
39º 00' 53.8"
38º 00'21.0"
40º 27'71.1"
40º 47'08.0"
39º 53' 36.0"
39º 02' 50.4"
38º 56' 20.3"
39º 01' 31.1"
38º 59'22.8"
41º 02' 00.0"
41º 11' 74.0"
41º 48' 61.0"
40º 11' 47.0"
40º 27' 71.0"
Nº da exsicata
HUEFS 110016
HUEFS 110017
HUEFS 110020
HUEFS 110021
HUEFS 110023
HUEFS 110025
HUEFS 110028
HUEFS 110034
HUEFS 110033
HUEFS 110018
HUEFS 110019
HUEFS 110027
HUEFS 110024
HUEFS 110026
HUEFS 118123
HUEFS 118122
HUEFS 110030
HUEFS 110032
HUEFS 110031
91
3. RESULTADOS
De forma a descrever em suficiente detalhe a forma dos contornos, foram utilizados
20 harmônicos que geraram 77 variáveis a partir dos coeficientes das elipses.
As ACPs a partir destas variáveis produziram 5 componentes com variância
superior ao acaso, baseado em comparação com o modelo de broken-stick, indicado para
escolha do número de variáveis significantes em ACP (Jackson, 1993).
O significado morfológico do primeiro componente principal (CP1) reflete variação
na relação comprimento e largura, que se apresentaram de elípticas a oblongas. Há uma
variação bastante acentuada tanto para o comprimento quanto para a largura das folhas
oscilando de oblonga no desvio padrão positivo a lanceolada no desvio padrão negativo.
Nos outros componentes não há variação na relação comprimento e largura. O segundo
componente principal (CP2) mede uma variação simétrica contrastando folhas em que a
base é projetada para fora (evoluta), ou projetada para dentro (involuta). No terceiro e
quarto componente principal (CP3) e (CP4) os padrões indicados refletem variações de
forma assimétricas em cada lado da base das folhas. O quinto componente (CP5) reflete
uma variação simétrica bastante sutil na base da folha, muito similar à do CP2
conjuntamente com leve variação no ápice entre uma tendência mais aguda para mais
obtusa (Figura 3).
Na AVC, a porcentagem do total da variância explicada entre os centróides de
acordo com os cinco primeiros eixos foram, respectivamente: 77,69%, 14,30%, 6,68%,
0,96%, e 0,37%, com nível de significância de p< 0,001**; 0,001**; 0,001**; 0,378 n.s. e
0,831 n.s. Após análise dos três primeiros eixos significativos, só foi encontrado
significado biológico para os dois primeiros eixos, que são mostrados na Figura 4 e 5.
Portanto, as análises de AVC mostraram significância (p<0,005) em três dos eixos, embora
já os dois primeiros eixos, retendo 92,99% de toda a variação permitiu a separação das
populações de P. mucronata de P. galbana com exceção da população MBA1. Pela análise
de variáveis canônicas verificou-se que o primeiro eixo canônico (que representa 77,69%
do total da variância explicada entre os centróides da variação) separou as populações de P.
galbana e P. mucronata .
Com relação aos resultados demonstrados pela correlação dos CPs com as AVCs
(Tabela2) é possível observar a separação encontrada no eixo canônico 1 (VC1) tem alta
correlação negativa com CP1 (64,7%) e depois com o CP2 (27,1%). Os eixos CP3, CP4 e
CP5 tem correlações desprezíveis com VC1. O eixo canônico 2 (VC2) apresentou
92
correlações de 58,8%. 57,7% e 51,1% respectivamente com os CP1, CP2 e CP3. Esta
influência dos CPs 1 e 2 pode ser observada na figura 3 onde a relação de comprimento e
largura já mencionado anteriormente, é mais evidente que nos outros CPs. Os dois eixos
VC1 e VC2 são os eixos que mais influenciam para a separação das espécies e foram
utilizados nas figuras 4 e 5.
A figura 4 mostra o grau de dispersão e sobreposição de cada população em ambas
as espécies utilizando as variáveis canônicas 1 e 2. De acordo com o eixo das variáveis
canônicas 1 (VC1), há uma clara separação das espécies embora seja perceptível que os
indivíduos de P. mucronata encontram-se mais dispersos que os indivíduos de P. galbana
sendo que é possível até considerar que alguns indivíduos, como por exemplo da
população MBA1, estejam enquadrados juntamente com as populações de P. galbana.
A figura 5 ilustra os centróides e o formato médio das folhas de cada população
mostra o grau de dispersão dentro de cada espécie. A figura ressalta os dois morfotipos de
folhas que separam as espécies, indicando que as populações de P. galbana apresentam
folhas oblongo-ovadas e P. mucronata ovado-cordadas ou ovado-mucronadas, ou seja
embora a relação comprimento e largura não tenha tanta influência no padrão morfológico
das folhas há uma sutil diferença em relação à base destas folhas em ambas as espécies.
Observa-se que existe um padrão biogeográfico na disposição intrapopulacional
das
espécies, ou seja, a disposição dos centróides das populações do Rio de Janeiro estão mais
próximas da Bahia do que das populações do Espírito Santo.
Embora ocorra uma nítida separação das espécies, as populações MBA1 e GBA1
se apresentam bem próximas no gráfico pois as suas folhas têm formatos bem semelhantes.
Este agrupamento entre as populações, a separação das espécies bem como a semelhança
entre MBA1 e GBA1 podem ser confirmadas pelo fenograma apresentado na figura 6.
Dos 350 indivíduos somente 56 apresentaram classificação incorreta de acordo com
os escores canônicos não-estandardizados. Estas classificações erradas ocorreram somente
no nível populacional específico, o que não interfere na separação das espécies.
Os resultados separaram as duas espécies e indicaram que os grupos das populações
são bem definidos. Em função disso, apenas foi apresentado o fenograma resultante da
análise de agrupamento realizada de acordo com o método UPGMA. A análise de
agrupamento dos centróides dos grupos utilizando a distância de Mahalanobis revelou a
formação de dois grupos principais (Figura 6), um grupo formado por populações de P.
galbana e a população MBA1 e o outro grupo formado pelas populações de P. mucronata.
93
Em todos os resultados das análises, as folhas da população MBA1 encontram-se mais
próximas morfologicamente da espécie P. galbana que da espécie P. mucronata.
94
-2SD
PC1
-1SD
Médio
+1SD
+2SD
Y
X
PC2
PC3
PC4
PC5
Figura 3 –Significância dos cinco primeiros eixos de componentes principais (CP)
mostrando o indivíduo médio e o desvio padrão (+ / - 1SD e + / - 2SD) de Passiflora
galbana e Passiflora mucronata.
95
GBA1
GBA6
MBA5
MRJ6
GBA7
MRJ7
MRJ8
MES9
MES10
GES8
GES9
GBA2
MBA1
MBA2
GBA3
GBA4
MBA3
GBA5
MBA4
4
CV2
2
0
-2
-4
-4
-2
0
2
4
CV1
Figura 4 -Escores de todos os indivíduos provenientes da Análise de Variáveis Canônicas
entre Passiflora galbana e Passiflora mucronata considerando o primeiro e o segundo
eixos canônicos (Ver tabela 1 para o nome das populações) .
96
0 ,5
0 ,5
2,0
MES9
1 ,0
1 ,0
MBA4
0 ,0
0 ,0
-0 ,5
-0 ,5
-1 ,0
-1 ,0
-1,0
-0, 5
0, 0
0, 5
-1 ,0
1 ,0
-0 ,5
0,0
0,5
1, 0
MRJ6
GBA3
GBA4
1 ,0
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,5
1,5
GBA2
0 ,2
0 ,0
0 ,0
-0 ,2
-0 ,5
-0 ,4
-1 ,0
-0 ,6
-1,5
-1 ,0
-0,5
0, 0
0,5
-0 ,8
1,0
-1,0
-1,5
-1 ,0
-0, 5
0 ,0
0,5
-0, 5
0, 0
0, 5
1 ,0
GES9
1,0
1,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,5
0,0
0,5
1, 0
0,6
0,4
GBA6
0,2
0,0
-1, 0
MBA3
-0 ,5
0, 0
0 ,5
MES10
-0,2
1 ,0
-0,4
-0,6
0,0
0 ,6
0 ,4
CV2
0 ,2
0 ,0
1 ,0
-0 ,2
0 ,8
0 ,6
GES8
-0 ,4
0 ,4
-0 ,6
0 ,2
-0,5
0 ,0
MBA5
-0 ,2
-0 ,4
-0 ,6
-0 ,8
-1 ,0
-1,5
-1 ,0
-0,5
0, 0
0,5
1,0
0 ,6
-1,0
MRJ7
0 ,4
-1,5
-1 ,0
-0,5
0,0
0 ,5
1,0
GBA5
0 ,2
1 ,0
0 ,0
0 ,8
0 ,6
-0 ,2
0 ,4
-0 ,4
0 ,2
-0 ,6
0 ,0
-0 ,2
-1,5
-1 ,0
-0, 5
0,0
0 ,5
-0 ,4
1 ,0
GBA7
-0 ,6
-1,5
-0 ,8
-1 ,0
-1,5
MRJ8
-1 ,0
-0,5
0, 0
0,5
GBA1
1,0
1 ,0
0 ,8
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,6
0 ,2
0 ,4
0 ,0
0 ,2
-0 ,2
-2,0
-1,5
MBA2
0 ,0
-0 ,4
-1 ,0
-0 ,2
-0 ,6
-0 ,4
-0, 5
0 ,0
0,5
1,0
MBA1
-0 ,8
-0 ,6
-1 ,0
-0 ,8
-1 ,5
-1,0
-0,5
0, 0
0 ,5
1,0
-1,5
-4
-3
-2
-1
0
1
-1,0
-0 ,5
0 ,0
0,5
1,0
2
3
CV1
Figura 5 –Contornos médios das folhas a partir do centróide dentro de cada população
através da Análise de Variáveis Canônicas (Ver tabela 1 para o nome das populações) .
Passiflora mucronata e
Passiflora galbana.
97
UPGMA
GBA1
MBA1
GBA2
GES9
GBA6
GBA3
GBA4
GBA5
GBA7
GES8
MBA2
MRJ7
MRJ8
MBA3
MBA5
MRJ6
MBA4
MES9
MES10
0
5
10
15
20
25
Distância de Mahalanobis
Figura 6 -Fenograma obtido a partir da distância generalizada de Mahalanobis entre os
centróides das populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata pelo método
UPGMA, considerando as mesmas variáveis dos métodos de ordenação. (Ver tabela 1 para
o nome das populações).
98
Tabela 2 -Correlações entre os eixos de variáveis canônicas (VCs) com as análises de componentes principais (CPS) em Passiflora galbana e
Passiflora mucronata.
VC1
VC2
VC3
VC4
VC5
CP1
-0,647836
0,588557
0,468150
0,115009
0,038951
CP2
0,271588
0,577915
0,712048
-0,045682
-0,288366
CP3
-0,050598
-0,511936
0,659682
-0,539144
0,097487
CP4
-0,014428
-0,265873
0,245267
0,837377
-0,409569
CP5
0,050699
0,017955
0,164914
0,376440
0,910057
99
4. DISCUSSÃO
Assim como em Passiflora a morfometria geométrica utilizada em folhas de
Nothofagus também foi uma ferramenta capaz de diferenciar as espécies, entretanto, estudos
com morfometria geométrica são bastante escassos na literatura. Porém, em outros grupos
taxonômicos, a morfometria tradicional também tem sido útil na delimitação de espécies a
partir de morfologia, como por exemplo, em espécies do gênero Hedera (Ackerfield e Wen,
2002) e em três espécies estritamente relacionadas de Hordeum (Baum e Bailey, 1992). Com
a abordagem geométrica, a EFA tem sido usada em algumas áreas biológicas também com
fins taxonômicos (Rohlf e Archie 1984; Ferson et al. 1985; Mclellan 1993; Canon e Manos
2001; Rumpunen e Bartish 2002; Jensen et al. 2002; Tatsuta et al. 2004; Yoshioka et al.
2004; Raveloson et al. 2005). Com base exclusivamente em padrões foliares detectados por
EFA no presente estudo, as espécies P. galbana e P. mucronata podem ser separadas.
McLellan e Endler (1998), que fizeram um estudo comparativo entre os métodos utilizando
medidas lineares e contornos nas folhas de Acer (Aceraceae), encontraram melhor resolução
com morfometria geométrica. De forma semelhante, Rumpunen e Bartish (2002) compararam
medidas lineares, contornos e dados moleculares, concluindo que a morfometria tradicional
foi menos eficiente na separação dos taxa e atribuíram estes resultados à menor precisão na
obtenção das medidas lineares quando comparados com a eficiência das ferramentas que
capturam imagens e que podem demonstrar de forma mais precisa a variabilidade.
O procedimento de Fourier decompõe o contorno da forma da folha em diversas
variáveis de maneiras diferentes. Este método juntamente com a ACP tem duas vantagens.
Primeiramente, podem detectar variações pequenas da forma sem os quais não seria possível
se observar e segundo EFA e ACP podem avaliar as formas dos objetos independentemente
do tamanho. Portanto, constituem ferramentas de grande utilidade taxonômica. No presente
estudo, estes métodos sugerem que as espécies possam realmente representar entidades
biológicas distintas com base na separação nítida de dois diferentes padrões morfológicos das
folhas das populações estudadas. Isto seria congruente com o tratamento taxonômico de
Nunes (2002), que baseada em caracteres morfológicos das folhas separou as duas espécies.
As características foliares também podem ser utilizadas em estudos evolutivos, sendo
consideradas tão úteis quanto características florais, morfologia do pólen e a maioria das
características anatômicas utilizadas tradicionalmente na sistemática (Hickey e Taylor 1991).
Porém, a avaliação de apenas uma característica morfológica (forma da folha) pode ser pouco
100
representativa para o genoma inteiro. Isto equivale a dizer que o significado biológico dos
padrões encontrados estão sujeitos a uma quantificação subjetiva por parte do pesquisador.
O método utilizado com base na EFA foi eficaz para a detecção de padrões de
variação da forma da folha e sua quantificação dentro e entre as populações estudadas.
Yoshioka et al. (2004), analisando os efeitos ambientais e genotípicos na morfologia das
pétalas de Prímula observou que a variação da forma da pétala pode ser dividida em parcelas
simétricas e assimétricas, relatando diferenças nos componentes principais em relação a forma
e a área dos contornos. No presente estudo, apesar de ter havido variância significativa nos
CP1, CP2 e CP3, apenas o CP1 e CP2 representaram variação notadamente simétrica,
correspondendo a variação genotípica, enquanto os CP3 e CP4 mostraram padrões de variação
assimétricos e possivelmente tenham variação fenotípica. Os dois componentes simétricos,
por sua vez, foram importantes para separação das supostas espécies na VC1, o que sugere
claro componente de variância genética associado a estes dois componentes principais.
Iwata et al. (1998) e Iwata et al. (2000) conduziram uma análise dialélica da forma das
raízes de rabanete japonês (Raphanus sativus L.) e em outro trabalho também avaliando a
interação dos tipos de solos e os efeitos genéticos (Iwata et al., 2004). Formas das folhas de
Citrus também foram avaliadas através de análises genéticas quantitativas utilizando este
método (Iwata et al., 2002). Os autores detectaram que as variações relacionadas aos
componentes principais assimétricos tinham efeitos principalmente ambientais, reportando
que a herdabilidade da variação simétrica era baixa. Contudo outras análises demonstram que
existe uma influencia genotípica no grau de assimetria de folhas de tabaco, Sakai e
Shimamoto (1965).
O mesmo pode ter ocorrido com o grau de assimetria em pétalas de Primula
(Yoshioka et al, 2004), ou seja, pode haver um ou mais genes relacionados a resposta
ambiental nestas plantas. Yoshioka et al. (2004) argumentaram que mudanças na forma
simétrica tem base genética mais clara que a assimétrica. As folhas das duas espécies exibem
formas diferentes, provavelmente, devido expressão de um ou mais locos. Tal achado
concorda com Parkhurst e Loucks (1972) que afirmam ser o tamanho e a forma das folhas
controlados pela hereditariedade, fato demonstrado em seus estudos pela alta variação de tipos
que ocorre entre diferentes espécies que coexistem num determinado ambiente.
A forma de um órgão é resultado da coordenação da divisão e expansão celular e
vários genes que podem alterar este processo. Em folhas de Arabidopsis por exemplo, genes
que controlam o crescimento bidimensional estão sendo identificados (Tsukaya, 1995; Tsuge
et al., 1996; Kim et al., 1998). Outros estudos foram desenvolvidos na tentativa de identificar
101
genes ou loci que possivelmente estejam envolvidos nesta variação da forma dos órgãos
vegetais. Desta maneira, em Primula sieboldii um sistema genético similar pode estar
regulando o comprimento e a largura das suas pétalas (Yoshioka et al., 2004).
No nosso caso, estudos realizados com base em dados moleculares como os
desenvolvidos neste trabalho em Passiflora, também são importantes por serem
correlacionados com a quantidade de fluxo gênico entre as duas espécies. Em relação aos
alelos que podem ser os responsáveis pelo formato da folha, os resultados morfológicos
encontrados aqui, sugerem que possivelmente estes alelos tenham fluxo restrito entre os dois
grupos principais de populações (equivalentes aqui às supostas espécies), já que a morfologia
foliar foi hábil na separação de dois grupos. Levando em conta a não separação encontrada
através de dados genéticos populacionais (Capítulo 1), a clara incongruência com os padrões
obtidos por métodos morfométricos sugere que talvez os padrões de forma de folha
encontrados sejam resultantes de um ou poucos locos controlando estes caracteres. Os
resultados moleculares são ainda congruentes com a grande similaridade floral observada por
alguns taxonomistas, que por sua vez pode ser causal no controle dos padrões de fluxo gênico,
enquanto as características foliares são apenas resultantes.
Em alguns casos, a separação não foi tão clara, como por exemplo, da população
MBA1 (Passiflora mucronata), que se encontra mais próxima das populações de Passiflora
galbana. Esta similaridade pode ser devida a eventos de hibridação e introgressão entre as
duas espécies, em se tratando de espécies distintas. Vale ressaltar que esta população
encontra-se mais ao interior do estado da Bahia se distanciando um pouco do ambiente de
restinga característico na coleta das outras populações.
As folhas de P. galbana têm uma tendência a serem oblongo-lanceoladas e em P.
mucronata a serem ovado-cordadas. Existe ainda um padrão biogeográfico observado na
disposição intraspecífica, em que os centróides das populações do Rio de Janeiro estão mais
próximas das populações da Bahia do que das populações do Espírito Santo. Estes padrões
concordam com alguns resultados moleculares também encontrados nestes estudos (Capítulo
1).
A caracterização da arquitetura das folhas de dicotiledôneas e algumas
monocotiledôneas, no que diz respeito à forma e outros elementos ligados à expressão da
estrutura foliar como a venação, tem se desenvolvido, e a incorporação deste sistema na
corrente sistemática representou grande avanço nas possibilidades de classificação e
diferenciação de grupos problemáticos (Leaf Architecture 1999). Um exemplo de trabalhos no
gênero Passiflora com este objetivo, é o de Plotze et al. (2005) que propuseram um método
102
para extração de características morfométricas de órgãos foliares vegetais baseado na função
multiescala da dimensão fractal de Minkowsky.
Devido à grande complexidade floral e foliar no gênero Passiflora, a sua classificação
taxonômica é dificultada e como afirmam Killip (1938) e MacDougal (1994) nenhum outro
grupo de Angiospermas apresenta tal diversidade foliar. Com observações em campo das
populações destas duas espécies verificou-se a existência de uma grande variação morfológica
foliar dentro das populações, principalmente em P. galbana, porém, os resultados das análises
de agrupamento sugerem que é possível separar as espécies através da morfometria
geométrica como foi evidente nos resultados das análises de componentes principais e de
variáveis canônicas. Portanto, este estudo demonstrou que a forma de contorno da folha foi
suficiente como marcador taxonômico para separar as duas espécies, agrupando as populações
de cada espécie independente da distribuição geográfica.
Entretanto, os padrões encontrados com a morfometria geométrica foliar não
representam de maneira significativa o genoma inteiro da planta e não concordam com os
resultados encontrados neste trabalho com marcadores moleculares. Portanto, estudos futuros
devem se concentrar em fazer cruzamentos entre genótipos das duas supostas espécies, para
verificar a herança e herdabilidade dos caracteres de morfologia foliar.
103
5. REFERÊNCIAS
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109
CAPÍTULO 3
Citotaxonomia em Passiflora galbana Mast. e
Passiflora mucronata Lam.
PASSOS, V. M.1; SOUZA, M.M. DE 2; DEN BERG, C. V. 1; VITÓRIA, A . P. 3
1
Departamento de Ciências Biológicas;Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS)
2
Departamento de Ciências Biológicas;Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC).
Para correspondência: Departamento de Ciências Biológicas Universidade Estadual de Feira de Santana
(Programa de Pós-Graduação em Botânica) Av. Universitária; s/n - Km 03 da BR 116- Campus Universitário
CEP: 44031-460 Feira de Santana - BA – Brasil Tel: 75 32248169 Fax: 75 3224 8033 ([email protected])
3
110
RESUMO
(Citotaxonomia em Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam.)
Por meio de observações em cromossomos mitóticos e análise de cariótipos foi realizado um
estudo citotaxonômico em Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. Para o
estudo do cariótipo, os indivíduos foram provenientes de Oliveira (MG) - P. galbana e de
Ilhéus (BA) - P. mucronata. Pontas de raízes de três indivíduos de cada espécie foram
analisadas separadamente. A coloração foi feita segundo o método de Feulgen e duas
metáfases de cada indivíduo foram selecionadas totalizando seis metáfases por espécie. As
medidas dos cromossomos foram realizadas em imagens ampliadas utilizando-se paquímetro
digital para a construção dos ideogramas incluindo: relação de braços (braço longo/ braço
curto), comprimento do lote haplóide (CLH) e índice de simetria (TF%). Os cromossomos
metafásicos também foram corados com CMA-DA-DAPI. Foram encontrados satélites nos
braços curtos dos cromossomos 3 e 8 para P. galbana e nos braços longos dos cromossomos
1, 3 e 6 para P. mucronata. A coloração com fluorocromos em P. mucronata apresentou
bandas DAPI- e com CMA apresentou CMA+ (5 bandas) e CMA- . O fluorocromo CMA em
P. galbana revelou CMA+ (4 bandas). Os resultados confirmaram a existência de variação
cariotípica inter-específica nas espécies de Passiflora.
PALAVRAS-CHAVE: Passiflora mucronata; Passiflora galbana ; cariótipo; citotaxonomia;
variabilidade genética.
111
ABSTRACT
(Cytotaxonomy of Passiflora galbana Mast. and Passiflora mucronata Lam).
Cytotaxonomic studies of Passiflora galbana Mast. and Passiflora mucronata Lam. were
performed by observations of mitotic chromosomes and by analyses of their karyotypes. For
the karyotype studies, individuals were used that came from Oliveira (MG) - P. galbana and
from Ilhéus (BA) - P. mucronata. The root tips from three individuals of each species were
analyzed separately. Staining was performed using the Feulgen method, and two metaphase
examples from each individual were selected, totaling six metaphase groups per species.
Chromosomal dimensions were determined in extended images using a digital pachimeter and
used for the construction of ideograms, including: chromosomal arm relations (long arm /
short arm), length of the haploid lot (HLL), and the symmetry index (TF%). The metaphase
chromosomes were also stained with CMA-DA-DAPI. Satellites were observed on the short
arms of chromosomes 3 and 8 in P. galbana, and on the long arms of chromosomes 1, 3, and
6 in P. mucronata. Staining P. mucronata with fluorochromes demonstrated DAPI- bands,
and staining with CMA demonstrated CMA+ (5 bands) and CMA- . Staining P. galbana with
the fluorochrome CMA revealed CMA+ (4 bands). These results confirmed the existence of
inter-specific karyotype variations in the species of Passiflora examined.
KEY WORDS: Passiflora mucronata; Passiflora galbana ; karyotype; cytotaxonomy;
genetic variability.
112
1. INTRODUÇÃO
A família Passifloraceae tem cerca de 20 gêneros e distribuição predominantemente
tropical e subtropical. A maioria das espécies está inserida no gênero Passiflora L., o maior
da família, que possui mais de 525 espécies (MacDougal e Ulmer, 2004); sendo cerca de 400
delas descritas predominantemente como neotropicais. A variação morfológica estudada para
o gênero é bastante ampla, indicando a ocorrência de variabilidade genética inclusive nas
espécies cultivadas (Viana et al., 2003). Por outro lado, as espécies silvestres têm sido usadas
como fonte de genes para resistências a doenças e pragas, bem como para outras
características ausentes nas espécies cultivadas (Souza, 2002).
Passiflora galbana Mast. e Passiflora mucronata Lam. apresentam muitas estruturas
com características em comum, tais como estípulas, flores e sementes. Estas espécies bastante
similares morfologicamente, diferenciam-se por alguns caracteres morfológicos como formato
da folha, número de nervuras primárias na lâmina foliar, glândulas do pecíolo (Nunes, 2002;
Cervi, 1997) o que torna sutil a delimitação. Outra característica que diferencia estas duas
espécies, refere-se ao horário de abertura da flor, que se inicia em P. galbana no começo da
noite fechando na madrugada, enquanto P. mucronata permanece aberta até o início da
manhã. Segundo MacDougal e Ulmer (2004) as duas espécies são importantes
ecologicamente uma vez que são polinizadas por morcegos, Contudo P. mucronata mantêm
as flores abertas durante um curto período da manhã favorecendo a polinização também por
insetos (Souza et al., 2003b).
Estudos citogenéticos desenvolveram-se principalmente a partir do início do século
passado, e seu progresso acompanhou o aprimoramento de técnicas e equipamentos de
microscopia. A citogenética é a ciência que estuda os constituintes celulares portadores da
informação genética, cromossomos (Soares- Scott, 2005). Estudos cromossômicos têm sido
utilizados na determinação das relações filogenéticas e evolutivas entre grupos de plantas
(Raven, 1975).
A utilização de dados citogenéticos na sistemática vegetal é admitida pela maioria dos
autores como um dos mais importantes instrumentos para a compreensão das relações de
parentesco e dos mecanismos de evolução (Guerra, 1990). No entanto, o gênero Passiflora,
assim como os demais da família, tem sido pouco estudado citologicamente.
113
Entre os trabalhos de maior expressão realizados com a família Passifloraceae
destacam-se Bowden (1945), Storey (1950), Beal (1969a,b; 1973b), Guerra (1988), Snow e
MacDougal (1994), Mayeda e Vieira (1995), Barbosa e Vieira (1997), Soares-Scott et al.
(1998), Soares-Scott et al. (1999), Passos (1999), Melo et al. (2001), Souza et al. (2003a,b),
Souza et al. (2004), Melo et al. (2003), Soares-Scott et al. (2005), Hansen et al. (2006), Souza
et al. (2007). Porém, uma parte dos trabalhos tem se limitado à contagem de cromossomos
(Killip, 1938; Storey, 1950; Snow e MacDougal 1993; Vieira et al. 1997), alguns deles
abordando detalhes sobre o cariótipo ou mecanismos de evolução cariotípica (Souza et al.
2003a, Melo et al. 2003). De acordo com Souza et al. (2003a), que estudaram o cariótipo de
seis espécies coletadas no estado do Rio de Janeiro, variações morfológicas intra-específicas
foram encontradas nas duas espécies, uma vez que diferentes formas de folhas foram
observadas para P. mucronata e P. galbana, desde lanceoladas até arredondadas
(comunicação pessoal; Figura 1). Outras observações em campo já foram feitas por vários
taxonomistas da família dentro de algumas populações corroborando uma grande variação
morfológica das folhas.
Análises citotaxonômicas contribuem para o estudo da evolução pelo fato do material
genético estar contido nos cromossomos. Portanto, alterações dessa natureza são quase
sempre significativas para poder inferir o rumo evolutivo das espécies. Os dados citogenéticos
mais utilizados na citotaxonomia são o número cromossômico, a morfologia dos
cromossomos e o padrão de bandas, bem como a quantidade, a posição e o heteromorfismo
das RONs (Regiões Organizadoras do Nucléolo) e o comportamento meiótico dos
cromossomos (Guerra, 1988).
A determinação do cariótipo pode representar um importante papel na reorganização
da taxonomia vegetal, principalmente na caracterização dos diferentes táxons. O estudo
morfológico dos cromossomos permite comparações entre categorias taxonômicas
relacionadas com o mesmo número cromossômico e possibilita detectar possíveis variações
existentes (Mayeda, 1997).
Greilhuber (1984) já considerava que, além do número e morfologia dos cromossomos
que podem ser determinados por métodos convencionais, técnicas de bandeamentos
cromossômicos, localização de RONs, identificação de DNAs satélites no genoma e sua
relação com bandas heterocromáticas através de hibridização in situ podem contribuir para
um melhor entendimento entre diferentes níveis taxonômicos.
A técnica de bandeamento CMA/DAPI é um procedimento de dupla coloração
fluorescente que permite localizar seqüências de DNA altamente repetitivo dispersas ao longo
114
do genoma. Os corantes utilizados, cromomicina e DAPI, ligam-se preferencialmente a
regiões heterocromáticas ricas em CG e AT, respectivamente.
Cada cromossomo, ou par de cromossomos, representa um papel decisivo no
desenvolvimento de um indivíduo. Por isso, o número de cromossomos e as variantes que
cada um deles apresenta, dentro de uma espécie, são dados importantes para a determinação
da posição filogenética e taxonômica das espécies (Covas e Schnack, 1946; Guerra, 1988;
Singh, 1993).
Sendo assim, este trabalho propõe um estudo citogenético das espécies P. galbana e P.
mucronata, que foram escolhidas como modelo para um estudo de delimitação de espécies em
Passiflora por serem morfologicamente muito similares e taxonomicamente próximas.
115
A
C
B
D
E
F
Figura 1 -Padrões de folhas de Passiflora galbana e Passiflora mucronata ilustrando a
variação morfológica encontrada nas espécies. A e C) Formato lanceolado em folhas de P.
galbana. B e D) Formato oblongo em folhas de P. galbana. E e F) Formato cordado em
folhas de P. mucronata.
116
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Material Vegetal e Pré-tratamento
Plantas de P. galbana e P. mucronata foram mantidas em casa de vegetação no
Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). P. galbana foi proveniente de
sementes coletadas em Oliveira (MG) e P. mucronata foi obtida de estacas coletadas em
Ilhéus (BA) cujos “vouchers” estão depositados no herbário do Instituto Agronômico de
Campinas (IAC).
Pontas de raízes de três indivíduos de cada espécie foram analisadas. Os ápices jovens
de raízes foram coletados de estacas mantidas em areia lavada. Após sua retirada, as pontas de
raízes foram lavadas em água destilada e pré-tratadas com 8-Hidroxiquinoleína 0,002M por
uma hora em temperatura ambiente e por 22 h a aproximadamente 6°C. Após o prétratamento, o material foi lavado em água destilada duas vezes por 5 min, fixado em Carnoy
(etanol-ácido acético, na proporção 3:1), por 3 h em temperatura ambiente e estocado a -20°C.
Cariótipos
Para estudo do cariótipo e inicialmente para o preparo da lâmina, as raízes foram
lavadas em água destilada, hidrolizadas em ácido clorídrico 5N por 20 min, secas em papel de
filtro e transferidas para o reativo de Schiff por 1 hora e meia no escuro. As lâminas foram
preparadas pela técnica do esmagamento, utilizando-se carmim acético a 2% como contracorante. Foram selecionadas duas metáfases de cada indivíduo, totalizando seis metáfases por
espécie. As posições das metáfases foram marcadas utilizando-se lâminas guias. As lâminas
de interesse foram transformadas em permanentes imergindo-as em ácido acético 20% até a
liberação da lamínula, logo após em etanol 80% e 100%, por 10 segundos em cada, e secas ao
ar. As lâminas foram montadas com lamínula utilizando-se o meio de montagem Entellan.
As metáfases foram observadas e fotografadas em microscópio de luz (Leica) em
campo claro. Os comprimentos absolutos dos cromossomos e respectivos braços foram
mensurados em imagens ampliadas utilizando-se paquímetro digital, para o cálculo da relação
entre braços (r = braço longo/braço curto), comprimento do lote haplóide (CLH = somatório
117
dos comprimentos absolutos dos cromossomos metafásicos), comprimento relativo dos
cromossomos, índice centromérico (Levan et al., 1964) e índice de assimetria (TF% =
somatório dos braços curtos do lote haplóide em relação ao comprimento do mesmo;
Huziuwara, 1962). Os homólogos foram determinados com base na posição do centrômero,
tamanho absoluto de cada cromossomo e relação de braços. Os cariótipos foram arranjados de
acordo com o comprimento dos cromossomos, em ordem decrescente, e com a posição do
centrômero (Guerra, 1986): metacêntrico = m (r 1,00-1,49), submetacêntrico = sm (r 1,502,99), acrocêntrico = a (r 3,00-∞) e telocêntrico = t (r ∞). Os satélites foram classificados
segundo Battaglia (1955).
Os cariogramas foram confeccionados com base nas ampliações fotográficas e os
ideogramas foram montados utilizando-se o programa computacional Microsoft Office Word.
Na mensuração dos cromossomos com satélites, o comprimento destes não foi adicionado ao
braço cromossômico correspondente, mas sim ao comprimento do cromossomo. Análises
estatísticas (ANOVA) foram realizadas com auxílio do programa computacional Genes (Cruz,
2004).
Bandeamento CMA-DA-DAPI
O procedimento para bandeamento com fluorocromo seguiu o protocolo de Guerra et
al. (2002). Pontas de raízes pré-tratadas em 8-HQ (8-hidroxiquinoleína) e fixadas em Carnoy
foram imersas duas vezes em água destilada por 5 minutos cada, secas ligeiramente em papel
de filtro e digeridas com enzima Pectinex, previamente aquecida em banho-maria a 37ºC,
por cerca de 30 minutos. As lâminas foram preparadas pela técnica de esmagamento em uma
gota de ácido acético a 45% e transformadas em permanentes após imersão em nitrogênio
líquido por 5 min para retirada da lamínula com auxílio de estilete. Após secas ao ar, as
lâminas foram armazenadas por três dias em temperatura ambiente para envelhecimento e
evaporação do fixador (Guerra, 2002). A coloração foi feita inicialmente com uma gota de
cromomicina A3 (CMA) (0,5 mg/ml). A lâmina foi coberta com lamínula e mantida em caixa
escura por 1 hora. A lamínula e o excesso de corante foram retirados com um jato de água
destilada e a lâmina foi seca com bomba de ar. Em seguida a lâmina foi contra-corada com
uma gota de distamicina A (DA) (0,1 mg/ml), coberta com uma lamínula e mantida em caixa
escura por meia hora. A lamínula e o excesso de corante foram retirados com um jato de água
destilada e a lâmina foi seca com bomba de ar. Para a coloração com DAPI foi acrescentada
118
uma gota do fluorocromo 4’-6’ diamidino-2-fenilindol (DAPI) (2 µg/ml) e repetido o
procedimento anterior. Logo após, adicionou-se uma gota de meio de montagem
(glicerol/McIlvaine/ MgCl2 ) sobre as células. A lâmina foi coberta com lamínula, pressionada
levemente entre duas folhas de papel para retirar o excesso de meio de montagem e
armazenada por um dia. As observações e o registro das imagens foram feitos em microscópio
de epifluorescência Leica, utilizando-se filtros de 340 a 380 nm para DAPI e 390 a 490 nm
para CMA.
119
3. RESULTADOS
Os dados cariomorfológicos dos taxa estudados evidenciaram que, embora ambas as
espécies tenham apresentado 2n = 18 (Figura 2), Passiflora galbana e P. mucronata
apresentaram diferenças entre seus cariótipos (Figura 3). Os comprimentos médios dos
cromossomos são apresentados na Tabela 1, e foram utilizados para a obtenção dos
respectivos ideogramas (Figuras 4-5). Os comprimentos absolutos dos cromossomos de P.
galbana diferiram significativamente de acordo com a ANOVA (P<0,05%, teste F), já em P.
mucronata a diferença entre os cromossomos não foi significativa. Os comprimentos relativos
que cada cromossomo apresentou em relação ao CLH foram praticamente os mesmos em
ambas as espécies.
A igualdade entre os comprimentos do maior e do menor cromossomo foi de 43% em
P. galbana e de 34% em P. mucronata. As fórmulas cariotípicas, tipo e posição de satélites,
média do comprimento do lote haplóide e o índice de assimetria variaram para as duas
espécies (Tabela 2). Embora P. galbana tenha apresentado menor número de satélites e
cariótipo metacêntrico, o índice de assimetria foi maior para essa espécie.
A coloração com fluorocromos em P. mucronata revelou bandas DAPI- e com CMA
apresentou CMA+ (5 bandas) e CMA- . O fluorocromo CMA em P. galbana revelou CMA+ (4
bandas), (Figura 6).
120
a
b
Figura 2 -Metáfase de Passiflora galbana (a) e Passiflora mucronata (b) Barra=5 µm
121
a
1
2
1
3
2
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
Figura 3 -Cariograma de Passiflora galbana (a) e Passiflora mucronata (b) Barra= 5 µm
b
122
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
Comp. Cromossomo (µm)
CO
S
AR
3,58 3,17 3,09 2,86 2,78 2,69 2,47 2,46 2,05
1,38 1,32 1,12 1,30 1,35 1,22 1,26
1,22 1,45
Figura 4 -Ideograma de Passiflora galbana CO: cromossomos ordenados; S: tamanho dos
cromossomos (µm); AR: razão entre os braços cromossômicos.
123
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
Comp. Cromossomo (µm)
CO
S
AR
4,82 4,24 4,23 4,19 4,01 3,80 3,38 3,37 3,16
1,47 1,45 1,27 1,54
1,51 1,33 1,30 1,28 1,30
Figura 5 -Ideograma de Passiflora mucronata CO: cromossomos ordenados; S: tamanho
dos cromossomos(µm); AR: razão entre os braços cromossômicos.
124
a
b
c
a
a
d
e
f
Figura 6- Coloração CMA-DA-DAPI de Passiflora galbana (a; b e c) e de Passiflora
mucronata (d; e; f) sobreposição das imagens de DAPI e CMA (a-d), CMA (b-e) e DAPI (c-f).
Setas indicam bandas Barra=5 µm.
e
125
Tabela 1 - Comprimentos médios (µm) do braço curto (BC), braço longo (BL), satélite (SAT) e comprimento absoluto (CA), comprimento
relativo (CR) e razão entre braços (r) em Passiflora mucronata e Passiflora galbana. Desvio padrão (+) .
Cromossomos: Média + Desvio Padrão
Espécies
P. galbana
P. mucronata
1
2
3
4
5
6
7
8
9
BC
1,39 + 0,36 1,36 + 0,29 1,34 + 0,28 1,24 + 0,24 1,18 + 0,27 1,21 + 0,24 1,09 + 0,23 1,10 + 0,22 0,83 + 0,23
BL
1,92 + 0,32 1,80 + 0,43 1,51 + 0,42 1,62 + 0,43 1,60 + 0,32 1,48 + 0,34 1,38 + 0,29 1,35 + 0,30 1,21 + 0,23
SAT
0,79 + 0,48
CA
3,31 + 0,90 3,16 + 0,70 2,85 + 0,70 2,86 + 0,61 2,78 + 0,57 2,69 + 0,56 2,47 + 0,50 2,45 + 0,52 2,04 + 0,39
-
0,45 + 0,17
-
-
-
-
-
-
CR
14,2 %
12,6 %
12,3 %
11,4 %
11,1 %
10,7 %
9,8 %
9, 8 %
8, 1 %
r
1,38 m
1,32 m
1,12 m
1,30 m
1,35 m
1,22 m
1,26 m
1,22 m
1,45 m
BC
1,79 + 1,06 1,53 + 0,66 1,86 + 1,12 1,64 + 0,73 1,66 + 0,62 1,54 + 0,72 1,46 + 0,48 1,47 + 0,59 1,37 + 0,62
BL
2,64 + 1,04 2,22 + 1,09 2,37 + 1,18 2,54 + 1,16 2,51 + 0,66 2,05 + 0,99 1,91 + 0,81 1,89 + 0,79 1,79 + 0,74
SAT
0,57 + 0,17 0,72 + 0,35
CA
4,43 + 2,14 3,75 + 1,60 4,23 + 2,30 4,18 + 1,87 4,17 + 1,12 3,59 + 1,53 3,37 + 1,27 3,36 + 1,38 3,16 + 1,33
-
-
-
0,41 + 0,11
-
-
-
CR
13,70 %
12,05 %
12,02 %
11,90 %
11,39 %
10,79 %
9,60 %
9,57 %
8,98 %
r
1,47 m
1,45 m
1,27 m
1,54 sm
1,51 sm
1,33 m
1,30 m
1,28 m
1,30 m
m = metacêntrico; sm = submetacêntrico.
126
Tabela 2- Fórmula cariotípica (FC); cromossomo; braço e tipo de satélite (SAT); comprimento médio do lote haplóide em µm (CLH) e índice
de assimetria (TF%) em espécies de Passiflora.
Espécies
FC
SAT
CLH
TF%
P. galbana
18 m
1 BC e 3 BC micro
25,15 µm
42,68 %
P. mucronata
14 m + 4 sm
1 BC; 2 BL e 6 BC micro
35,20 µm
40,77%
BC = braço curto; BL = braço longo; micro = microssatélites (Battaglia; 1955).
127
4. DISCUSSÃO
Variações morfológicas intra-específicas são encontradas em P. mucronata e P. galbana
(Figura 1). Alguns autores analisaram determinadas espécies de Passiflora e detectaram uma
grande variabilidade fenotípica, o que implica em diversidade genética (Crochemore et al., 2003;
Souza et al., 2004). Tal fato ratifica a necessidade de estudos em diferentes populações das duas
espécies utilizando-se diversas ferramentas, como por exemplo a citogenética, para uma análise
mais detalhada da variabilidade.
O número de cromossomos é a característica mais amplamente utilizada em citogenética
(Guerra, 2000) e juntamente com outras características citológicas auxilia não só no
entendimento de variações genéticas envolvidas na evolução de um grupo, como também na
delimitação taxonômica de espécies (Pedrosa et al., 1999). Menos de 30 % das espécies de
Passiflora tem o seu número cromossômico conhecido (Soares-Scott et al., 2005), e das 200
espécies que são nativas do Brasil, somente poucas delas foram estudadas citogeneticamente
(Souza et al. 2007).
De acordo com as análises de cromossomos metafásicos (Figura 2), as espécies em
estudo (P. galbana e P. mucronata) têm 2n = 18 cromossomos. Estudos citogenéticos têm
revelado que as espécies de Passiflora apresentam o número cromossômico dividido em quatro
grupos, representados por x = 6, x = 9, x = 10 e x = 12. A maioria das espécies é diplóide com 2n
= 12, 2n = 18 ou 2n = 20, sendo registradas algumas tetraplóides, hexaplóides e octoplóides
(Snow e MacDougal, 1993; Melo et al., 2001).
Neste trabalho foram localizados satélites nos braços curtos dos cromossomos 1 e 3 em P.
galbana e em P. mucronata nos cromossomos 1 e 6; e no braço longo do cromossomo 2 (Figura
3). Estes resultados foram divergentes dos estudos anteriores feitos em outras populações por
outros autores, como demonstraram Souza et al. (2003a) em populações do Rio de Janeiro (RJ).
No trabalho de Souza et al. (2003a) seis espécies (P. alata, P. malacophylla, P. edmundoi, P.
mucronata, P. galbana e P. quadrangularis) foram estudadas e foram encontrados satélites nos
braços longos dos cromossomos 2 e 4 de P. galbana e nos braços curtos dos cromossomos 5 e 6
de P. mucronata. Em outros estudos, alguns cromossomos com satélite foram identificados,
como por exemplo, por Mayeda e Vieira (1995) no par 8 das espécies P. edulis, P. amethystina,
P. alata e P. giberti. Soares-Scott (1998) identificou satélites em P. edulis (4 e 7) e em P.
128
incarnata, e três pares em P. setacea (4, 7 e 8). Melo et al. (2001) identificaram satélites em P.
capsularis, P. misera, P. morifolia, P. coccinea e P. nitida. Foram encontradas divergências em
relação ao número de satélites e à sua posição. Em P. edulis, Mayeda e Vieira (1995) apontam
dois satélites, enquanto Soares-Scott et al. (1999) observaram três. Em P. alata há divergências
na localização dos cromossomos com satélite. Melo et al. (2001) observaram satélites nos dois
pares menores, Soares-Scott et al. (1998, 1999) concordaram quanto ao par 7, mas indicaram
também o par 4 e Souza et al. (2003a) observaram nos pares 1 e 2. Estas diferenças podem
ocorrer devido à qualidade da preparação, ao grau de compactação dos cromossomos ou em razão
da variabilidade em diferentes populações dentro das espécies. Outras divergências já tinham sido
detectadas quanto ao número e a posição de satélites em outras espécies de Passiflora (Mayeda et
al. 1995; Oliveira e Coleman, 1996; Soares-Scott et al. 1999; Melo et al. 2001; Souza et al.
2003a). Por outro lado, rearranjos estruturais podem ser detectados por meio destas diferenças no
tamanho relativo, posição de centrômero e número, tamanho e posição de satélites.
Alguns trabalhos a exemplo de Vieira (1997), demonstraram que aos satélites
identificados pela coloração Feulgen em algumas espécies de Passiflora correspondem as bandas
evidenciadas por prata. Estas bandas, também chamadas de bandas NOR (Região Organizadora
do Nucléolo), evidenciam regiões responsáveis pela síntese de RNAr, o qual se acumula no
nucléolo. No caso específico de Passiflora, sugere-se que as localizações dos genes ribossômicos
devem estar associadas aos mecanismos de evolução cariotípica, de tal forma que ao lado de
outras evidências poderão servir para o entendimento da filogenia do gênero e relações
taxonômicas. Sendo assim, esta técnica poderá ser empregada futuramente em P. galbana e P.
mucronata para tais análises.
A técnica de bandeamento CMA/DAPI é um procedimento de dupla coloração
fluorescente que permite localizar seqüências de DNA altamente repetitivo dispersas ao longo do
genoma. O CMA liga-se preferencialmente a regiões heterocromáticas ricas em CG e o DAPI a
regiões ricas em AT, permitindo a identificação de regiões heterocromáticas quanto a composição
de pares de bases, possibilitando uma análise cariotípica mais detalhada. Os resultados podem
gerar uma maior compreensão de como os genomas estão organizados e com isso, fazer
inferências sobre as relações filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos. Esta técnica tem
sido usada com sucesso em diferentes espécies vegetais (Guerra, 1993; Tagashira e Kondo, 1999;
Guerra 2000; Jacobs et al., 2000; Marcon et al., 2003). Em P. mucronata os cromossomos
129
apresentaram bandas DAPI- e com CMA apresentaram CMA+ (5 bandas) e CMA-. O fluorocromo
CMA em P. galbana revelou CMA+ (4 bandas) e nemhumA DAPI. Em P. mucronata, estudos
anteriores detectaram seis bandas CMA+ para a mesma espécie (Melo et al., 2001).
Vários trabalhos tem sido feitos com CMA/ DAPI com outras espécies de plantas como
intuito de localizar seqüências de DNA altamente repetitivo dispersas ao longo do genoma.
Porém com estas 2 espécies de Passiflora, os resultados encontrados no trabalho mais recente na
literatura são divergentes quanto ao número de bandas como citado anteriormente.
Outra técnica utilizada em citogenética é a FISH (hibridização fluorescente in situ). Melo
et al. (2003) analisaram 20 espécies de Passiflora através da técnica de FISH, utilizando sondas
45S e 5S de rDNA com intuito de verificar as relações entre os diferentes complementos
haplóides existentes no gênero e identificar o provável ancestral haplóide do mesmo. Em P.
galbana foram encontrados 2 sítios principais 45S nos pares 2 e 4 e um sítio menor no par 5. Já
em P. mucronata, os cromossomos 1, 3 e 8 apresentaram, cada um, sítio 45S ressaltando ainda
que em geral, o número e a posição dos sítios 45S detectados por FISH coincidem com as bandas
CMA e com as constrições secundárias observadas no cariótipo de Passiflora (Melo et al., 2001).
Como demonstrado através dos fluorocromos (CMA /DAPI), as espécies analisadas no presente
estudo, diferem no número e localização das bandas CMA de acordo com a literatura.
Uma situação semelhante, na qual a diferenciação cariotípica é mais evidente com bandas
heterocromáticas que com outras características morfométricas, é conhecida em vários outros
gêneros. Em milho, os cromossomos de algumas raças podem ser reconhecidos no híbrido pelos
seus distintos padrões de bandas (Aguiar-Perecin e Vosa, 1985). Em Citrus, as diferentes espécies
e híbridos interespecíficos são geralmente distinguíveis pelo padrão de bandas CMA, mas não por
outros parâmetros cariológicos (Cornélio et al., 2003; Guerra, 1993; Carvalho et al., 2005), e
todos os acessos de origem reconhecidamente híbrida possuem pares cromossômicos
heteromórficos para os padrões de bandas, enquanto as espécies silvestres, não híbridas, são
homomórficas ou mostram apenas um pequeno heteromorfismo.
A diferença de tamanho de bandas obtidas por diferentes métodos de coloração
(bandeamentos e fluorocromos) em indivíduos e entre indivíduos de uma mesma espécie, pode
ser explicada principalmente pelas diferentes concentrações de DNA satélite localizados na
heterocromatina constitutiva. Atualmente, sabe-se que este tipo de DNA é altamente polimórfico,
variando muito entre indivíduos de diferentes populações ou de uma mesma população (Sousa,
130
2006). Guerra (2000) cita que entre indivíduos de uma mesma espécie, polimorfismos para o
número e tamanho das bandas heterocromáticas podem ser muito freqüentes. De acordo com
Sumner (2003), este tipo de cromatina pode sofrer grandes mudanças em pouquíssimo tempo e
diferentes metodologias podem revelar suas diferentes frações. Bandas cromossômicas, ou
regiões heterocromáticas, são muito úteis porque geralmente variam entre espécies. Sendo assim,
outros estudos com bandeamentos poderiam elucidar as questões que neste trabalho são
levantadas a respeito da variabilidade inter-específica encontrada nas espécies de Passiflora
estudadas.
Associado a isso, vários trabalhos, como o de Popov et al. (2001), mostram que, de acordo
com o tamanho dos cromossomos, porções de heterocromatina, por exemplo, podem não ser
visualizadas devido ao grau de condensação. Além disso, a presença de proteínas em
determinadas regiões dos cromossomos pode prejudicar a visualização da real extensão dos
blocos heterocromáticos, de acordo com a técnica utilizada. Essas regiões cromossômicas são
reveladas usualmente pelas técnicas de bandeamento C ou pela coloração com fluorocromos que
reagem preferencialmente com o DNA rico em AT ou em GC. Em Hordeum, por exemplo,
diferentes espécies foram caracterizadas por diferentes padrões de bandas C (Konishi e LindeLaursen, 1988), enquanto em Citrus essas diferenças foram mais facilmente detectadas com os
fluorocromos cromomicina A3 (CMA) e 4’-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Guerra, 1993).
Em nosso trabalho, apenas cromossomos metacêntricos foram encontrados na espécie P.
galbana. Em P. mucronata foram encontrados cromossomos metacêntricos e submetacêntricos
(Tabela 2). As espécies deste gênero apresentam basicamente cromossomos metacêntricos e
submetacêntricos, com cariótipo simétrico variável (Beal, 1973a, b; Oliveira e Coleman, 1996;
Barbosa e Vieira, 1997a,b; Soares-Scott et al., 1999; Melo et al., 2001).
P. galbana apresentou menor número de satélites e cariótipos constituídos por
cromossomos exclusivamente metacêntricos. Porém, o índice de assimetria foi maior para essa
espécie, uma vez que cariótipos que são constituídos por cromossomos de tamanho mais
heterogêneo são assimétricos. Variações quanto ao número, posição e tamanho de satélites e
constrições secundárias são frequentemente observadas em vegetais sendo úteis como
marcadores uma vez que estes podem ser incorporados ou suprimidos ao longo do processo
evolutivo (Mayeda, 1997).
131
Em diversos grupos de plantas do Brasil, os seus estudos cariológicos passaram a abordar
os aspectos da evolução (Melo et al., 1997; Guerra e Nogueira 2001). Porém, em relação às
frutíferas nativas, ainda são poucos os estudos cariológicos abordando aspectos de sua
variabilidade cromossômica, características bastante úteis na taxonomia de alguns grupos. Em
Genipa americana, por exemplo, a ocorrência de 2n = 22 para populações de Recife-PE, e de 2n
= 20 para populações de Campinas-SP, indicaram claramente a ocorrência de duas espécies
distintas (Pierozzi e Cruz; 1998).
Subpopulações naturais de uma determinada espécie podem apresentar cariótipos
diferentes quanto ao número e ou estrutura dos cromossomos. Os diferentes cariótipos são
chamados citótipos. Tais citótipos podem vir a contribuir para o estabelecimento de barreiras
reprodutivas fazendo com que sejam fixados na população, por exemplo por uma vantagem
seletiva do homozigoto, podendo levar à especiação. Estudos citogenéticos com algumas espécies
revelam estas variações cromossômicas que apontam sua divisão em várias espécies diferentes
(Palomino e Martinez, 1994; Palomino e Martinez, 1997; Marcon et al., 2003).
Algumas espécies de Passiflora apresentam citótipos em relação ao número de
cromossomos (2n = 12, 24, 36 na mesma espécie, mas em populações diferentes
geograficamente). Assim, as diferenças encontradas neste estudo em relação à posição e número
de satélites quando comparados a outros estudos realizados com populações de outras regiões
geográficas justificam que P. galbana e P. mucronata sejam realmente espécies diferentes.
Além da determinação do número e morfologia dos cromossomos por métodos
convencionais, outras informações foram obtidas analisando-se o conteúdo de DNA das espécies
por citometria de fluxo para as espécies estudadas. Segundo Souza et al. (2001), P. mucronata
apresentou conteúdo de DNA nuclear de 3,41 pg, enquanto P. galbana apresentou 3,52 pg (Souza
et al., 2003c). As medidas de quantidades de DNA têm sido úteis na estimativa das diferenças
taxonômicas entre gêneros, espécies a e até intra-específicas, como também em estudos de
evolução e de interação do genoma com fatores ambientais (Poggio, 1998, Narayan, 1998, Leitch
e Bennett, 1998) . Estas variações segundo Guerra (1998) são geralmente devidas a um aumento
ou diminuição mais ou menos eqüitativos da quantidade de DNA em todos os cromossomos do
cariótipo.
Os resultados deste trabalho confirmaram que existe uma variação cariotípica intraespecífica nas espécies de P. galbana e P. mucronata. Estudos adicionais são necessários, pois
132
além da distribuição e quantidade de heterocromatina constitutiva por técnicas de bandeamento
cromossômico, a identificação de DNAs satélites no genoma e sua relação com bandas
heterocromáticas através da hibridação in situ são bastante informativas. Dessa forma pode-se
contribuir para um melhor entendimento da taxonomia nos seus diferentes níveis, especialmente
entre espécies de difícil delimitação, como no caso de P. galbana e P. mucronata.
133
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138
DISCUSSÃO GERAL
Os estudos de genética eram conduzidos com genes associados a caracteres morfológicos,
em geral fenótipos de fácil identificação visual. Com o surgimento e avanços das técnicas da
biologia molecular surgiram diversos métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente
no DNA, mesmo nas porções não expressas (Ferreira e Grattaplaglia, 1998). Atualmente, os
marcadores morfológicos aliam-se a novas ferramentas da biologia molecular permitindo uma
visão bem mais ampla da diversidade genética.
Estudos que envolvem a caracterização da variabilidade genética como este, realizados
com as duas espécies de Passiflora muito similares morfologicamente , tem sido importantes pois
esta variabilidade é uma condição fundamental para que haja evolução, e sua caracterização
auxilia na compreensão deste processo evolutivo. A seleção natural atua entre as variações que
ocorrem dentro das populações em função da adaptação ao ambiente, convergindo esta variação
para a população e consequentemente entre espécies.
De acordo com os resultados obtidos para ambos marcadores moleculares (ISSR e
RAPD), é possível observar que a tendência de agrupamento por distribuição geográfica, e não
por espécies como era esperado, não reflete as diferenças morfológicas que puderam ser
detectadas para a separação de P. galbana e P. mucronata com base na morfologia geométrica
das folhas. As alterações genéticas ocorridas na sequência de DNA nem sempre correspondem a
alterações morfológicas, uma vez que as mutações podem ser sinônimas e ou podem ocorrer em
regiões não codificantes do genoma.
Estudos utilizando estas duas técnicas tem sido feitos com outras espécies para detecção
da variabilidade genética dentre tantas outras finalidades (Esselman et al.,1999; Khadari et
al.,2001; Quian et al.,2001; Mattioni et al., 2002; Tanyolac, 2003; Awasthi et al., 2004; Gemas et
al., 2004; Souframanien et al., 2004; Wu et al., 2004; Zhang et al., 2005; Levi et al., 2005; Li et
al., 2005; Li et al., 2006).
As avaliações moleculares cobrem uma maior porção do genoma do que a avaliação de
características como a morfologia foliar. Os dados moleculares encontrados foram importantes
por sugerirem que possa ter ocorrido ou estar ocorrendo fluxo gênico entre as duas espécies de
Passiflora. Se poucos alelos são responsáveis pelo formato da folha, os resultados morfológicos
sugerem que possivelmente este (ou estes) alelo (s) não tenham um fluxo tão grande entre as
139
populações de ambas das espécies, já que com base na morfologia foliar foi possível separar as
espécies. Entretanto parece que as demais porções do genoma são mais compartilhadas entre as
populações de ambas as espécies, haja visto o agrupamento geográfico resultante da avaliação
molecular.
Faz-se necessário uma revisão dos caracteres de classificação infra-subgenérica em
Passiflora, pois a mesma é centrada em caracteres morfológicos foliares que são altamente
variáveis e sujeitos a influências ambientais no gênero como um todo (Benson et al., 1976;
Macdougal, 1994; Barp et al., 2006). Feuillet e MacDougal (2003) sugeriram o agrupamento das
espécies de Passiflora em quatro subgêneros: Astrophea (DC.), Deidamioides (Harms) Killip,
Decaloba (DC.) Rchb. e Passiflora L. Estas proposições são baseadas exclusivamente em
caracteres morfológicos e ecológicos. Trabalhos recentes de sistemática filogenética utilizando
marcadores moleculares corroboraram total ou parcialmente a nova classificação infragenérica do
gênero (Muschner et al., 2003; Yockteng e Nadot, 2004; Muschner et al., 2005; Hansen et al.,
2006).
Os estudos moleculares são de extrema importância nestas classificações e estão sendo
utilizados em uma gama de avaliações taxonômicas em espécies da família Passifloraceae. De
acordo com estudos recentes (Vitta e Bernarci, 2004), outras espécies de Passiflora a exemplo de
P. contracta e P. ovalis são indistinguíveis através de caracteres vegetativos, as diferenças entre
ambas residem na estrutura da inflorescência e no indumento, além da distribuição disjunta.
Entretanto, estas duas espécies foram sinonimizadas por Cervi (2006) e estudos moleculares que
estão em andamento (Dutra et al., 2006) poderão elucidar sobre a estrutura populacional de P.
ovalis e sobre a validade taxonômica de P. contracta. Outros estudos moleculares com as
espécies P. caerulea e P. tenuifilia, também pertencentes ao subgênero Passiflora tem
demonstrado que a análise de marcadores populacionais, sequências de ITS1 e ITS2, sugerem um
alto fluxo gênico nestas espécies. Estas espécies são facilmente reconhecidas por seus caracteres
vegetativos quando adultas mas praticamente indistintas nos estágios iniciais do seu
desenvolvimento, e estudos filogenéticos tem revelado um alto grau de similaridade entre estas
espécies (93,7%) contra uma média geral de 86,5% em 41 espécies do gênero.
Por meio de observações em cromossomos mitóticos e análise de cariótipos também foi
realizado um estudo citotaxonômico. Os resultados confirmaram a existência de variação
140
cariotípica intra-específica nas espécies de Passiflora estudadas e mostrou claramente a
diferenciação cromossômica entre elas.
Através da análise Elíptica de Fourier foi possível a transformação do contorno foliar , um
caráter qualitativo, em variáveis quantitativas mais poderosas. Os resultados sugerem também,
que o uso da morfologia foliar poderá ser utilizado para a delimitação de P. galbana e P.
mucronata, corroborando estudos taxonômicos anteriores que utilizaram apenas caracteres
morfológicos para a delimitação destas espécies. Porém, os padrões encontrados com a
morfometria geométrica foliar não representem de maneira significativa o genoma inteiro da
planta e não concordam com os resultados encontrados neste trabalho com marcadores
moleculares. Estudos futuros devem se concentrar em fazer cruzamentos entre genótipos das duas
supostas espécies, para verificar a herança e herdabilidade dos caracteres de morfologia foliar.
Portanto, para que se tenha segurança em relação a delimitação destas duas espécies são
necessários estudos de cruzamentos e testes de progênies na tentativa de promover um híbrido
que tenha sementes viáveis, para que se possa ratificar ou não, a hipótese de que sejam espécies
realmente distintas.
141
CONCLUSÃO GERAL
Ambos os marcadores moleculares (RAPD e ISSR) indicaram o agrupamento de
Passiflora galbana e Passiflora mucronata por distribuição geográfica e não por espécies;
Os agrupamentos das populações obtidos por RAPD e ISSR foram muito similares;
Dados moleculares foram importantes por sugerirem que possa ter ocorrido ou estar
ocorrendo fluxo gênico entre as duas espécies de Passiflora ;
A morfologia foliar poderá ser utilizada, segundo os resultados encontrados, para a
delimitação entre P. galbana e P. mucronata embora, os padrões encontrados com a
morfometria geométrica foliar não representem de maneira significativa o genoma inteiro
da planta e não concordam com os resultados encontrados com marcadores moleculares;
O estudo citotaxonômico confirmou a existência de variação cariotípica intra-específica
nas espécies de Passiflora estudadas e mostrou claramente a diferenciação cromossômica
entre elas;
Para a delimitação destas duas espécies são necessários estudos de cruzamentos e testes
de progênies na tentativa de promover um híbrido com sementes viáveis, para que se
possa ratificar ou não, a hipótese de que sejam espécies realmente distintas.
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166
Apêndice a -“Primers” (seqüência, número de bandas e variação de tamanho) das 108 bandas
analisadas. Os oito primeiros foram selecionados na análise de variabilidade genética baseada em
padrões de ISSR em dezenove populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata ocorrentes
nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. (pb – pares de base).
“Primer” (seqüência)
Nº bandas
Tamanho das bandas (pb)
UBC 902 (5’-GTG TGT GTG TGT AY-3’)
12
200-1400
JHON (5’-AGA GAG AGA GAG AGY G-3’)
16
300-1600
GOOFY (5’-GTG TGT GTG TGT GTY G-3’)
09
300-1200
UBC 843 (5’-CTC TCT CTC TCT CTC TRA-3’)
14
300-2000
UBC 844 (5’-CTC TCT CTC TCT CTC TRC-3’)
14
200-2000
MANNY (5’-CAC CAC CAC CAC RC-3’)
11
350-1400
MAO (5’-CTC CTC CTC CTC RC-3’)
18
200-2000
UBC 814 (5’-CTC TCT CTC TCT CTC TTG-3’)
14
100-1900
DAT (5’-GAG AGA GAG AGA GAR G-3’)
3
não caracterizado
CHRIS (5’-CAC ACA CAC ACA CAY G-3’)
4
não caracterizado
R7 (5’-CTC TCT CTC TCT CTC TRG-3’)
5
não caracterizado
TERRY (5’-GTG GTG GTG GGT GRC-3’)
4
não caracterizado
OMAR (5’-GAG GAG GAG GAG RC-3’)
4
não caracterizado
M1 (5’-CAC GAG AGA GAG A-3’)
3
não caracterizado
M2 (5’-GGG CGA GAG AGA GAG AGA GA-3’)
3
não caracterizado
BECKY (5’-CAC ACA CAC ACA CA YC-3’)
2
não caracterizado
UBC 901 (5’-GTG TGT GTG TGT YR-3’)
2
não caracterizado
UBC 899 (5’-CAC ACA CAC ACA RG-3’)
2
não caracterizado
UBC 898 (5’-CAC ACA CAC ACA RY-3’)
2
não caracterizado
167
Apêndice b-“Primers” (seqüência, número de bandas e variação de tamanho) das 94 bandas
analisadas. Os nove primeiros foram selecionados na análise de variabilidade genética baseada em
padrões de RAPD em dezenove populações de Passiflora galbana e Passiflora mucronata ocorrentes
nos estados da Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro. (pb – pares de base).
“Primers” selecionados (seqüência)
Nº bandas
Tamanho das bandas (pb)
OPA 01 (CAGGCCCTTC)
11
300-2250
OPA 04 (AATCGGGGCTG)
12
200-1750
OPA 07 (GAAAACGGGGTG)
08
300-1500
OPA 10 (GTGATCGCAG)
07
300-1500
OPA 12 (TCGGCGATAG)
14
300-1650
OPA 13 (CAGCACCCAC)
06
600-1400
OPC 05 (GATGACCGCC)
14
250-1750
OPC 11 (AAAGCTGCGG)
11
200-1500
OPC 16 (CACACTCCAG)
11
300-1750
OPA 02 (TGCCGAGCTG)
4
não caracterizado
OPA 08 (GTGACGTAGG)
2
não caracterizado
OPA 09 (GGGTAACGCC)
3
não caracterizado
OPA 19 (CAAACGTCGG)
3
não caracterizado
OPA 20 (GTTGCATCC)
4
não caracterizado
OPF O4 (GGTGATCAGG)
5
não caracterizado
OPF 03 (CCTGATCACC)
4
não caracterizado
OPF 05 (CCGAATTCCC)
3
não caracterizado
OPF 09 (CCAAGCTTCC)
2
não caracterizado
OPF 11 (TTGGTACCCC)
2
não caracterizado

DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA DE Passiflora galbana Mast. E

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