3 Experimental realization and data analysis

3 Experimental
realization and data
analysis
3.1 Fluorescent labels
• synthetic dyes
• fluorescent proteins
Rhodamines
• High quantum yield
• photo stable
• low intersystem crossing rate
Rhodamin 6G
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.1 Label
Fluorescein
Alexa Fluor® 488
Cyanines
• High quantum yield
• photo stable
• low intersystem crossing
rate
• but: photo isomerization
leading to a dark state
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.1 Label
NH coupling
• Typically with NHS-Ester
• unspecific labelling (terminal and side chain NH)
http://media.wiley.com/CurrentProtocols/MB/mb1023/mb1023-fig-0002-1-full.gif
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.1 Label
SH coupling
• typically with maleimide
• specific labelling of cysteine residues
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.1 Label
3.2 Immobilized molecules
• Long observation times: all dynamics time scales
• Immobilisierung kann Artefakte verursachen
• Detektion Konfokal oder Weitfeld / TIRF
KAPITEL 5. EINZELMOLEKÜL-FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
Gel immobilization
• Entrapment of molecules in gel pores (agarose, PAA)
• Small molecules (e.g. substrates) can still diffuse
Single-Molecule Enzymatic Dynamics
H. Peter Lu, Luying Xun, and X. Sunney Xie (4 December 1998)
Science 282 (5395), 1877.
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
Immobilization in liposomes
• Entrapment in liposomes smaller than focus size (typ.
50-100 nm)
• Chemical milieu is fixed
• immobilization of membrane proteins
http://www.weizmann.ac.il/chemphys/cfharan/protein.html
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
Immobilization at surfaces
•
• Surface modification:
• Silanisation (e.g. with Ni-chelator for His-Tag)
His-Tag, Strep-Tag
PITEL 6. MESSSYSTEM
Wert von 8,0 [78] eine Raumbindung zwischen den Nickelionen und den deprotonierten Carbox
ppen sowie Stickstoffatomen aufgebaut (siehe Abb. 6.12). Zum Schluss wurden die Deckgläser erne
fältig gespült und getrocknet.
Abbildung
6.12:
-Tri-Essigsäure (schwarz) gebunden an die GlasoberTeil I SM Fluo,
Kap. 3N-((3-trimethoxysilyl)propyl)ethylendiamin
Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
Immobilization at surfaces
• His-Tag, Strep-Tag
• Surface modification:
• Biotin-labelled PEG or BSA for strep tag
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
Raw data (e.g. 2 colors)
dynamics
Photonenstrom (1/Zeiteinheit)
80
photo bleach
KAPITEL 5. EINZELMOLEKÜL-FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
60
40
background
20
(a) diffundierende Moleküle
0
(b) immobilisierte Moleküle
Abbildung 5.1: Schematische Darstellung der Experimente an diffundierenden Molekülen in Lösung (a, ob
auf dem Deckglas
immobilisierten Molekülen800
(b, oben). Die dargestellten1000
Moleküle sind m
0
200
400
600
Donor (grün) und einem Akzeptor (rot) markiert. Die zugehörigen Zeitspuren (unten) ze
Zeit (Zeiteinheit)
Photonenbursts (a) bzw. die Fluoreszenz bis zum Photobleichen der Farbstoffe (b). Das k
Prinzip ermöglicht sehr kleine Anregungs- und Detektionsvolumina, so dass die Fluoresz
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
einzelnen im Laserfokus befindlichen Fluorophoren detektiert werden kann.
3.2.1 State analysis
• Defining threshold(s)
70
Photonenstrom (1/Zeiteinheit)
60
50
40
30
20
10
No state change here
0
0
200
400
600
Zeit (Zeiteinheit)
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
800
1000
Counting histogram
Photonenstrom (1/Zeiteinheit)
0
20
40
60
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
0
200
400
600
Zeit (Zeiteinheit)
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
800
1000
Dwell times
Photonenstrom (1/Zeiteinheit)
„Off“ – times
0
20
40
60
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
„On“ – times
0
0
0
200
400
600
Zeit (Zeiteinheit)
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
800
1000
Dwell - times
1000
"Off" - time
800
600
400
200
0
0
2000
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
4000
6000
Nr. der "Off" - time
8000
10000
Dwell-time histogram
0
"Off" - time (Zeiteinheit)
1000
Coefficient values ± one standard deviation
y0
=0.76471 ± 1.8
A
=1828.6 ± 7.41
invTau
=0.010141 ± 7.36e-05
1500
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0
0
2000
4000
6000
Nr. der "Off" - time
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
8000
10000
Kinetics
• Transition rate is the reciprocal of the dwell time
1500
Häufigkeit
kon = 1/⌧of f
1000
kof f = 1/⌧on
500
0
0
200
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
400
600
"Off" - time
800
Correlation analysis
• Correlation function
hIA (t) · IB (t + ⌧ )it
g(⌧ ) =
hIA (t)i · hIB (t)it
• If I and I are identical: auto correlation
• otherwise: cross correlation
A
B
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
Correlation analysis
hIA (t) · IB (t + ⌧ )it
g(⌧ ) =
hIA (t)i · hIB (t)it
τ
1500
1000
500
0
Count rate
40
30
20
10
0
0
2
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
4
6
Time (s)
8
-3
10x10
Product I(t)*I(t+τ)
average
2000
Correlation function
g(t) = 1 + Ae
kof f /kon
Korrelationsfunktion
kof f /kon
10
invT au·
Coefficient values ± one standard deviation
y0
=0.9547 ± 0.0156
A
=10.002 ± 0.0646
invTau =12396 ± 141
8
kon + kof f
6
4
2
0
0.0
0.2
1/(kon + kof f )
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
0.4
0.6
Zeit τ (s)
0.8
-3
1.0x10
Cross correlation
0
Kreuzkorrelationsfunktion
-20
50
40
-40
30
20
-60
10
0
6
4.2002
-80x10
0.0
0.2
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle
4.2004
4.2006
4.2008
0.4
0.6
-3
Zeit (10 s)
4.2010
4.2012
0.8
4.2014
4.2016
1.0
4.2018
Comparison
• Correlation function does not need threshold
• Interpretation of correlation function requires model
• State analysis is easier to understand
Teil I SM Fluo, Kap. 3 Experiment, 3.2 Immobilisierte Moleküle