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Transcrição

THOMAS CARDOSO CHAGAS NETO
Caracterização microbiológica e epidemiologia molecular de Enterococcus spp.
isolados de infecções da corrente sanguínea de pacientes do Projeto SCOPE Brasil
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - Escola Paulista de Medicina para
obtenção do título de Doutor em Ciências.
São Paulo
2015
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do
título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos
Pignatari
Coorientadora:
Dra.
Mirian
Silva
do
Carmo
Rodrigues
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro
fornecido pela Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP).
São Paulo
2015
ii
CHAGAS-NETO, Thomas Cardoso
Caracterização microbiológica e epidemiologia molecular
de Enterococcus spp. isolados de isolados de infecções da
corrente sanguínea do Projeto SCOPE Brasil. Thomas Cardoso
Chagas-Neto - São Paulo, 2015.
xxv, 153.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Microbiology characterization and molecular
epidemiology of Enterococcus spp. isolated from bloodstream infections in
the Brazilian SCOPE Project.
1. Enterococcus spp., 2. Enterococcus faecalis, 3. Enterococcus
faecium, 4. ERV, 5. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos, 6.
Tipagem molecular, 7. Infecção de corrente sanguínea, 8.
Epidemiologia, 9. MALDI-TOF MS, 10. Hemocultura, 11.
Espectrometria de massa, 12. Resistência bacteriana.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Profa. Dra. Maria Tereza Zanella
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato
São Paulo
2015
iv
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari
Professor Titular e Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC),
Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São
Paulo (UNIFESP)
Titulares:
Profa Dra Ilana Lopes Baratella da Cunha Camargo
Professora Assistente, Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo
(USP)
Profa. Dra. Angela Maria Silva
Professora Associada III da Universidade Federal de Sergipe (UFS)
Dr. Guilherme Henrique Campos Furtado
Infectologista, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP)
Dra. Cecília Vieira Franco de Godoy Carvalhaes
Infectologista e Coordenadora Médica do Setor de Microbiologia do Laboratório
Central, Hospital São Paulo, Departamento de Patologia Clínica, Universidade
Federal de São Paulo (UNIFESP)
Suplentes:
Dra. Luci Correa
Infectologista, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP)
Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Professora Adjunta da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências
Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
(FCMSCSP)
v
Épígrafe
“Não sei se a vida é curta ou longa para nós, mas sei que nada do
que vivemos tem sentido, se não tocarmos o coração das pessoas.
Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço que envolve,
palavra que conforta, silencio que respeita, alegria que contagia,
lágrima que corre, olhar que acaricia, desejo que sacia, amor que
promove.
E isso não é coisa de outro mundo, é o que dá sentido à vida.
É o que faz com que ela não seja nem curta, nem longa demais,
mas que seja intensa, verdadeira, pura enquanto durar.
Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”.
Cora Coralina
vi
SUMÁRIO
Dedicatória..........................................................................................................
ix
Agradecimentos...................................................................................................
x
Lista de siglas e abreviaturas................................................................................
xvi
Lista de tabelas...................................................................................................
xviii
Lista de quadros..................................................................................................
xx
Lista de figuras....................................................................................................
xxi
Resumo..............................................................................................................
xxiv
1.
2.
3.
4.
INTRODUÇÃO..........................................................................................
REVISÃO DA LITERATURA....................................................................
2.1 Caracterização do agente etiológico..................................................
26
2.2 Epidemiologia das infecções causadas por Enterococcus spp..........
33
2.3 Histórico da resistência de Enterococcus spp. à vancomicina...........
35
2.4 Importância da tipagem molecular de Enterococcus spp. resistentes
à vancomicina...........................................................................................
OBJETIVOS..............................................................................................
3.1 Objetivo Geral...................................................................................
31
32
38
42
43
3.2 Objetivos Específicos.......................................................................
43
MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................
4.1 Desenho do estudo..........................................................................
44
4.2 Seleção das amostras......................................................................
46
4.3 Critérios de Inclusão das amostras..................................................
47
4.4 Identificação dos isolados clínicos...................................................
48
4.4.1 Avaliação da pureza e viabilidade das amostras.................................
48
4.4.2 Re-identificação bacteriana por método fenotípico..............................
48
4.4.3 Identificação por espectrometria de massa por ionização e dessorção a
laser - assistida por matriz / Matrix Associated Laser Desorption-Ionization –
Time of Flight (MALDI-TOF MS) ................................................................
4.4.3.1 Identificação das espécies de Enterococcus por Vitek MS®
(BioMérieux®).......................................................................................
4.4.3.2 Identificação das espécies de Enterococcus por Microflex LT®
MALDI-TOF BioTyper (Bruker Daltonics)..................................................
4.4.4 Identificação molecular.....................................................................
45
49
50
51
53
4.4.4.1 Multiplex PCR para identificação de espécies e genes van..............
53
4.4.4.2 Extração do DNA genômico..........................................................
53
4.4.4.3 Reação da PCR...........................................................................
54
Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos..............................
55
4.5.1Microdiluição em caldo automatizada pelo sistema Phoenix®................
56
4.5
vii
4.5.2 Etest®..............................................................................................
57
4.6 Tipagem Molecular.............................................................................
58
4.6.1 Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (Pulsed Field Gel
Electrophoresis - PFGE) ...........................................................................
4.6.2 Tipagem molecular por sequenciamento de múltiplos locus (Multilocus
Sequence Typing - MLST) ........................................................................
5.
60
4.6.2.1 Extração do DNA genômico por Qiamp DNA mini kit.......................
61
4.6.2.2 Análise do eBURST.....................................................................
65
4.6.3 Tipagem por espectrometria de massas.............................................
4.6.3.1 Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a
laser - assistida por matriz (MALDI-TOF), utilizando o equipamento Vitek
MS®.......................................................................................................
4.6.3.2 Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a
laser - assistida por matriz (MALDI-TOF), utilizando o equipamento
Microflex LT® BioTyper®..........................................................................
65
4.7 Análise estatística...............................................................................
69
RESULTADOS.........................................................................................
71
5.1 Análise bacterianas............................................................................
72
5.2 Análise dos dados epidemiológicos...................................................
72
5.3 Análise dos dados microbiológicos....................................................
75
5.3.1 Identificação dos isolados e concordância entre o Phoenix®, o Vitek
MS® e 0 Microflex LT® com a identificação molecular..................................
5.3.2 Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos pelos métodos de
microdiluição em caldo automatizado (Phoenix®) e Etest®...........................
6.
7.
8.
9.
58
65
66
75
77
5.3.3 Detecção do mecanismo de resistência à vancomicina.......................
80
5.3.4 Tipagem molecular das amostras de ERV..........................................
5.3.4.1 Gel Electrophoresis - PFGE) e sequenciamento de múltiplos loci
(Multilocus Sequence Typing - MLST)………............................................
5.3.4.2 Análise do eBURST obtido por sequenciamento de múltiplos loci
(Multilocus Sequence Typing - MLST)…….…….......................................
81
5.3.4.3 Tipagem por espectrometria de massas…………..........................
89
5.3.4.3.1 Tipagem de Enterococcus spp. por Vitek MS®……............……
89
5.3.4.3.2 Tipagem de Enterococcus spp. por Microflex LT®…..............…
91
5.4 Avaliação dos dados epidemiológicos após a caracterização
microbiológica dos isolados…………………………………….....…………
DISCUSSÃO.............................................................................................
CONCLUSÕES.........................................................................................
ANEXOS...................................................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................
viii
81
86
107
112
134
137
139
Dedicatória
À minha mãe,
Almerinda Sá, a minha fonte de inspiração, por representar para mim um
grande exemplo de vida, superação e por fazer o bem por onde anda. E
também por me mostrar que eu posso ir muito mais longe depois de pensar
que não se pode mais.
Aos meus irmãos,
Sobretudo, Adilene Sá e Ana de Lourdes Sá, que foram o grande alicerce
de mais um sonho realizado e que estiveram presentes nos momentos mais
importantes da minha vida.
À minha tia,
Ada, meu porto seguro, meu oráculo, uma das mães que Deus me deu. Por
todos os conselhos sempre bem aplicados e por estar sempre presente na
minha vida.
À minha grande amiga e sobrinha,
Anne Caroline, meu grande orgulho, por me inspirar em sorrir e me dar força
para comungar a vida.
À família mais especial de todas, a minha família Sá,
Pela minha formação moral e educacional, por acreditarem na minha vida,
mesmo quando os médicos não acreditavam mais e por fazer tudo,
exatamento tudo parecer possível, quando acreditamos Numa Força Maior.
Às meus grandes amigos e irmãos de coração,
André Coelho, Clara Fonseca, Domingos Parra, Isabella Neto, Leila
Magalhães, Rodrigo Merlin, Thaís Teles e Tony Pedroso, pela amizade,
cuidado, carinho e por compartilharem momentos decisivos na trajetória do
meu doutorado. E por segurar a minha mão no momento que minhas pernas
tremeram e me ajudarem a continuar a minha caminhada.
ix
Agradecimentos Especiais
Meu agradecimento mais profundo não poderia deixar de ser a todos os
pacientes que foram incluídos neste estudo, que nos ensinaram a diagnosticar e
com isso aliviar os sintomas das doenças. E quando a medicina não foi suficiente, a
humanização sem dúvida entrou na posologia certa para que o melhor possível
fosse feito. Sobretudo, aqueles que não resistiram a doença, que isso não tenha
sido em vão, que toda a nossa persistência em pesquisar formas de diagnósticos e
tratamentos precoces tenha sido bem explorada com essa experiência permitindo
salvar mais vidas no futuro. A todos vocês que mesmo em suas moléstias,
transformaram a nossa vida corrida, em doce rotina por fazer ciência e tentar salvar
vidas, a minha sincera gratidão.
x
Agradecimentos
Desafio maior do que elaborar esta tese, foi simplificar meus agradecimentos
em poucas páginas a todas as pessoas que fizeram parte dessa minha trajetória na
UNIFESP.
Agradeço a Deus, pela dádiva da vida, num corpo que me presenteou com
momentos de grande aprendizado, pela cura do câncer que me proporcionou o
impulso para contribuir de forma especial espalhando pelo mundo “o Amor através
da Ciência e a Alegria através do Sorriso”. E ainda por me presentear com uma
família maravilhosa e amigos que me confundem os laços de sangue com os
espirituais.
Ao Hospital do Câncer de São Paulo, ao GRAACC e a toda sua equipe e
todos Hospitais do mundo, sobretudo aqueles que tratam dos seus pacientes com
amor e com a alegria de acreditar que a vida vale a pena, em cada uma de suas
formas. Que mesmo com dificuldades, limitações, multilações, o amor tudo vence,
mesmo na ciência que cada vez mais se percebe a importância da intervenção de
um plano superior, onde “a ciência sem a espiritualidade é manca, a espiritualidade
sem a ciência é cega”.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por me aceitar no seu
laboratório, confiar no meu potencial e me permitir voar na minha imaginação
científica, além da sua disponibilidade, compreensão, atenção, pela grande
oportunidade de evolução profissional que me foi concedida para aprender
Microbiologia de ponta, com profissionais exemplares e por me mostrar o tipo de
profissional que pretendo ser.
À Profa Dra Antônia Machado, por abrir as portas da “Microbiologia”, por
acreditar em mim, sobretudo no maior desafio da minha vida (montar um laboratório
de Microbiologia em Angola), por enviar um “menino” para África, que retornou
homem e capaz de enfrentar muitas diversidades profissionais e pessoais, graças a
confiança em mim depositada durante aquele grande desafio. Obrigado também por
xi
todos os conselhos e além de tudo pela grande amizade, te-la como líder me faz
acreditar que o mundo ainda tem jeito e me dá força para lutar e enfrentar os
desafios com honestidade, determinação e prudência.
À Eliete Frigatto, a quem tenho a honra de chamar de amiga, por me receber
aos 22 anos de idade no Laboratório Central, sentando ao meu lado e me ensinando
praticamente tudo que sei sobre Microbiologia Clínica, obrigado por me ensinar tanto
sobre microbiologia e sobre a vida. E também por me ensinar o que é amor
incondicional, acredito que nunca conseguirei ser um ser humano tão evoluído assim
como você. Mas ter a sua amizade é uma graça divina. Obrigado por fazer parte da
parte mais bonita da história da mina vida, sem você nada disso teria sido possível.
À Dra Cecília Godoy, pelo grande apoio, persistência e paciência para me
ensinar o que se tornou uma grande paixão na minha vida “MALDI-TOF MS”. E
também por segurar a minha mão em momentos muito importantes da minha vida e
não me deixar cair.
À Profa Dra Ana Gales, por me acolher no seu laboratório e permitir que eu
desenvolvesse os meus experimentos, onde sempre fui recebido com muito
respeito.
À Profa Dra Miriam S. do Carmo e ao Dr André Mario Doi, por acreditarem
neste trabalho, que parecia impossível e me ajudarem a torna-lo realidade. Pela
amizade, carinho, cuidado e por todas as palavras de encorajamento nos momentos
difíceis.
Às minhas amigas Luciana Barros de Santana e Jussimara Monteiro, que
sempre me incentivaram na minha carreira acadêmica.
À Drª. Ângela Maria da Silva, responsável por despertar meu interesse em
fazer carreira acadêmica na UNIFESP.
Ao meu cunhado/irmão Adenilson Oliveira Barroso, pelo apoio oferecido na
minha chegada em São Paulo, permitindo que eu iniciasse essa aventura
microbiológica.
xii
À Lisete Liviero, que me acolheu desde o primeiro dia que me viu no
Laboratório Central como filho postiço, e que sempre me encheu de energias
positivas para vencer todos os obstáculos.
À Leila Paula de Almeida, que mesmo “desconfiada e assustada com minha
presença, conseguiu perceber que o retirante nordestino não era assaltante (nunca
irei esquecer, sorrio sempre que lembro e não poderia deixar de compartilhar isso),
abriu a porta da UNIFESP e ouviu minha longa história”.
Aos meus amigos Raquel Girardello e Rodrigo Cayô por compartilhar os
seus conhecimentos nos momentos críticos da minha tese com atenção, dedicação
e comprometimento.
À Rosana Capecce, pelo carinho e cuidado nos momentos decisivos da
minha tese, por todo apoio na burocracia desse trabalho.
Ao Henri Berghs, que na “prorrogação do segundo tempo” apareceu como
um anjo da guarda e me permitiu usar as ferramentas que fizeram uma grande
diferença no meu trabalho e provavelmente na saúde pública, sem o seu apoio esse
trabalho não teria sido tão especial.
A todos os colegas dos Laboratórios LEMC/ALERTA: Adriana Pereira de
Matos, Ana Carolina Ramos da Silva, Ana Paula Streling de Oliveira, André
Mario Doi, André Coelho, Bruno Cruz Boettger, Carlos R. V. Kiffer, Clara R. L.
Fonseca, Dandara Cassu Corsi, Elke Kreuscher Gumpl, Fernanda Matsiko
Inoue, Fernanda Rodrigues da Costa, Flávia Silva Palomo, Graziela Braun,
Jhonatha Rodrigo Cordeiro de Moura, Juliane de Mello Fonseca, Karen de
Castro Bauab, Kátia Daliria Lorenzete, Katya da Silva Patekoski, Lorena
Cristina Corrêa Fehlberg, Loren Paschoal, Lucimila Luchesi, Lygia Schandert,
Marco Antonio Zonta, Marina Francisco Visconde, Marcus Vinícius Gaspari,
Milene Quiles, Mirian Silva do Carmo, Paulo José Martins Bispo, Rafael Affini
Martins, Rodrigo Cayô da Silva, Roberta Cristina Cabral Mingrone, Talita
Trevizani Rocchetti, Talita Barone Carneiro, Thaís Freitas Teles Rezende, Thais
Avila Fernandes Catan, Vinícius Gomes de Sales Oliveira, Vinicius de Oliveira
xiii
Alves e Willames Marcos Brasileiro da Silva Martins que compartilharam comigo
toda a trajetória da minha tese, esse trabalho só foi possível graças a cada um de
vocês.
À minha família do Laboratório Central, em especial: Ana Caroline Toti,
Ana Paula Toledo, Ademir de Medeiros, Agda Vinagre, Celeste de Cássia, Cida
Gomes, Clara L. Fonseca, Clarice Yumi Matsumoto, Clayde Barquetta, Cynthea
Carolina, Daniela Anjos, Eliete Frigatto, Eloá Roventini Andrade, Elza Silva,
Erivan José P. Tavares, Euza Costa, Fernando Pereira Pinto, Flávia Silva
Palomo, Ivete, Karen Bauab, Katiane Santin, Laide Silva, Lisete Livieiro, Luiza
Reis, Márcia Pozo Pereira, Marina Falopa, Mirela Baretta, Regina Gangi, Regina
Corrêa, Sandra Ferraz Bonifácio, Sueli Maldjan, Sueli Dias, Tânia Guimarães,
Vanessa Corrêa Fanchini, Viviane Almeida Gouveia, Vivian Pereira da Mota,
Viviane Santos Amaral e a todos que mesmo não citados me apoiaram, ouviram
meus desabafos e compreenderam a minha ausência, sem vocês tudo isso teria
sido mais difícil.
Ao Departamento de Biofísica da UNIFESP, ao Prof. Dr. Luiz Juliano Neto
a
e Prof . Dra. Maria Juliano, pela colaboração e apoio aos nossos estudos. À toda
equipe, especialmente, ao Diego Magno Assis e Lilian, pelos auxílios e dedicação
a mim dispensados.
À minha amiga/cunhada Heloísa Santiago, por me adotar como filho, pelos
conselhos sempre bem aplicados e por nutir meu espírito com bastante força e
alegria.
As minhas amigas Flávia Palomo, Eloá Roventtini e Viviane Gouveia por
compreender minha ausência e me substituir sempre que precisei nas atividades do
Laboratório Central e por todas as palvras de incentivo.
Aos meus grandes amigos de todas as horas Magnus Silva e Eduardo
Interaminense, por todo o apoio nos momentos difíceis. Pelas críticas construtivas
e pela grande amizade.
xiv
À Cynthea Carolina por todas as palavras de apoio, sempre muito bem
colocadas e que me deram ainda mais alegria para continuar.
À Andrea Ramos por todo apoio oferecido durante a finalização desta tese,
pela disposição em resolver toda burocracia sempre com alegria.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a minha formação
acadêmica e me ajudaram a vencer mais uma etapa importante da minha vida.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
auxílio financeiro concedidos para a viabilização deste trabalho.
Muito obrigado!
xv
Lista de siglas e abreviaturas
adk
AM
aro
AST
ATCC
ATP
atpA
bpm
cels
CIM
CLSI
cols.
ºC
Da
ddl
DF
DNA
DO
DP
EDTA
EFM
EFMRV
EFMSV
EFS
EFSRV
EFSSV
ERV
ESV
g
gdh
gki
GMS
GO
GRAACC
gyd
HCCA
ICS
ID
IOP
IPCSL
irpm
K
Kb
kV
LEMC
LZ
Adenilato kinase
Ampicilina
Shikimato desidrogenase
Antimicrobial susceptibility testing
American Type Culture Colection
Adenosina tri-fosfato
ATP sintetase de cadeia alfa
Batimentos por minuto
Células
Concentração inibitória mínima
Clinical Laboratory Standards Institute
Colônias
Celsius
Daltons
D-alanina/D-alanina ligase
Distrito Federal
Ácido desoxiribonucleico
Densidade ótica
Daptomicina
Ácido etilenodiamino tetra- acético
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium resistente à vancomicina
Enterococcus faecium sensível à vancomicina
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis resistente à vancomicina
Enterococcus faecalis sensível à vancomicina
Enterococcus spp. resistente à vancomicina
Enterococcus spp. sensível à vancomicina
Grama
Glicose-6-fosfato-desidrogenase
Glicose kinase
Gentamicina-sinergismo
Goiás
Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer
Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase
Ácido α-ciano-4-hidroxinâmico
Infecção de corrente sanguínea
Identificação
Instituto de Oncologia Pediátrica
Infecção de corrente sanguínea primária confirmada
laboratorialmente
Incursões respiratórias em um minuto
Potássio
Kilobases
Kilovolts
Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
Linezolida
xvi
M
m/z
mA
Molar
Massa/número de carga de íons
Miliampère
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight MALDI-TOF MS
Mass Spectrometry
min
Minutos
mL
Mililitro
Multilocus Sequence Typing
MLST
mM
Milimolar
3
mm
Milímetro cúbico
MO
Medula óssea
NaCL
Cloreto de sódio
ng
Nanograma
nm
Nanômetro
NPP
Nutrição parenteral prolongada
pb
Pares de bases
Protein Chain Reaction – Reação da polimerase em cadeia
PCR
Pulsed Field Gel Electrophoresis - Gel de Eletroforese em
PFGE
Campo Pulsado
PMIC
Positive minimum inhibitory concentration
pmol
Picomole
pstS
Cassete transportador de ATP fosfato ligase
purk
Fosforibosil-aminoimazol carboxilase
rpm
Rotações por minuto
Staphylococcus coagulase Negativo
SCoN
SDQ
Somas dos quadrados dos desvios
seg
Segundos
sin
Sinergismo
SIRS
Síndrome da resposta inflamatória sistêmica
Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological
SCOPE
Importance
SP
São Paulo
Sequence typing
ST
STS
Estreptomicina-sinergismo
TBE
Tris borato EDTA
Tripticase Soy Broth = Caldo tríptico de soja
TSB
Tx
Transplante
UFC
Unidades formadoras de colônia
Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis
UHCA
Unweighted Pair-Groups Method Using Arithmetic Averages
UPGMA
UTI
Unidades de Terapia Intensiva
VC
Vancomicina
X2
Chi-quadrado
xpt
Xantina fosforibosil transferase
yiqL
Acetil-CoA acetiltransferase
µL
Microlitros
µM
Micromolar
xvii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Dados nacionais dos 10 principais patógenos isolados ICS em
estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados bacterianos
brasileiros.....................................................................................................
28
Tabela 2. Centros médicos participantes do Projeto SCOPE Brasil e que
enviaram amostras de Enterococcus spp....................................................
48
Tabela 3. Pontos de corte de sensibilidade aos antimicrobianos
estabelecidos para Enterococcus spp. pelo CLSI, documento M100-S25
segundo tabelas 2D e 3I...............................................................................
57
Tabela 4. Intervalo das concentrações utilizadas por cada metodologia de
teste de sensibilidade aos antimicrobiano e pontos de corte esperados
para cepas padrão ATCC de acordo com o documento M100-S25, CLSI
2015..............................................................................................................
59
Tabela 5. Critérios de concordância segundo os valores Kappa.................
69
Tabela 6. Dados demográficos dos pacientes e dos principais fatores de
risco geralmente associados ao desenvolvimento de ICS por
Enterococcus spp. apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto
SCOPE Brasil...............................................................................................
75
Tabela 7. Concordância entre as identificações dos isolados de E.
faecalis e E. faecium, incluídas no Projeto SCOPE Brasil, obtidas pelos
métodos Phoenix®, Vitek MS®, Microflex LT® com relação ao método de
referência (PCR)...........................................................................................
76
Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, obtido pelo sistema
Phoenix®, dos 144 isolados de Enterococcus spp. incluídas no Projeto
SCOPE Brasil...............................................................................................
78
Tabela 9. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados de E.
faecalis e E. faecium, incluídos no Projeto SCOPE Brasil, e que
apresentaram resistência à vancomicina pelas metodologias, Phoenix® e
Etest®............................................................................................................
78
Tabela 10. Teste do X2 para verificar a relação do desenvolvimento de
ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV com as principais doenças
de base e fatores geralmente associados a ICS e que foram
apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil..............
108
ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV de acordo com o sexo dos
pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil..............................................
109
xviii
ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV de acordo com a idade dos
pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil..............................................
109
Tabela 13. Relação dos isolados de EFSRV, EFSSV. EFMRV e EFMSV
em relação ao desfecho clínico nos episódios de ICS dos pacientes do
Projeto SCOPE Brasil...................................................................................
109
Tabela 14. Incongruências nas identificações dos isolados de
Enterococcus spp., incluídos no Projeto SCOPE Brasil, pelos sistemas
Phoenix e Vitek MS® em relação a PCR, e a sensibilidade à ampicilina e
vancomicina..................................................................................................
138
xix
Lista de Quadros
Quadro 1. Correlação do valor do score com a confiança na identificação
de gênero e espécie, segundo recomendações do manual do programa
BioTyper MALDI 3.0.....................................................................................
54
Quadro 2. Oligonucleotídeos utilizados para determinação dos genes van
e confirmação da identificação de E. faecalis e E. faecium adaptado de
Dutka-Malen et al. (1995).............................................................................
54
Quadro 3. Oligonucleotídeos utilizados para realização de MLST de E.
faecalis e E. faecium....................................................................................
63
Quadro 4. Condições de ciclagem para a reação de MLST para E.
faecalis e E. faecium....................................................................................
64
Quadro 5. Distribuição das amostras de Enterococcus spp. isoladas de
ICS de pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil de acordo com o
centro médico e região geográfica onde foram isoladas..............................
73
xx
Lista de Figuras
Figura 1. Etapa da transpeptidação: formação das ligações cruzadas nas
cadeias peptídicas.................................................................................
37
Figura 2. Ligação entre a vancomicina e a porção terminal D-Ala-D-Ala
do peptidoglicano..........................................................................................
38
Figura 3. Fluxograma dos ensaios laboratoriais realizados com os
isolados de Enterococcus spp. incluídos no Projeto SCOPE Brasil.............
47
Figura 4. Distribuição das espécies de Enterococcus isolados de ICS do
Projeto SCOPE e identificadas por PCR e MALDI-TOF MS........................
76
Figura 5. Regressão linear das CIMs de linezolida (A) e daptomicina (B),
para os 35 isolados de EFSRV e EFMRV, obtidas por Etest® e
microdiluição em caldo sistema Phoenix®. As áreas azuis indicam as
CIMs dentro da categoria Sensível, de acordo com os pontos de corte
estabelecido pelo CLSI M100-S25...............................................................
80
Figura 6. Distribuição dos 144 isolados de Enterococcus spp., incluídos
no Projeto SCOPE Brasil, de acordo com a espécie e a resistência à
vancomicina..................................................................................................
81
Figura 7. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5
após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFSRV, contendo
o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos.......................................
83
Figura 8. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5
após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFMRV, contendo
o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos.......................................
85
Figura 9. eBURST de E. faecalis baseado nos STs totais representados
pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecalis MLST,
incluíndo os STs dos isolados de EFSRV do Projeto SCOPE Brasil
submetidos à técnica de MLST (http://efaecalis.mlst.net )...........................
87
Figura 10. eBURST de E. faecium baseado nos STs representados pelos
isolados contidos no banco de dados on-line E. faecium MLST, incluíndo
os STs dos isolados de EFMRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à
técnica de MLST(http://efaecium.mlst.net)...................................................
88
Figura 11. Dendrograma dos espectros de massas dos 35 ERV, obtido
pelo Vitek MS®, incluindo a tipagem por PFGE e MLST (A- E. faecalis e
B- E. faecium)...............................................................................................
90
Figura 12. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster
Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV
obtidos através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com
10 picos e tipagem por PFGE e MLST.........................................................
92
xxi
Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV
50 picos picos e tipagem por PFGE e MLST................................................
93
Figura 14. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de
EFSRV, obtidos pelo programa BioTyper 3.1 OC........................................
94
Analysis (UHCA) do espectro de massas dos 20 isolados de EFMRV
obtido através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com
96
Analysis (UHCA) do espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV
97
Figura 17. “Pseudogel” dos espectro de massas dos 20 isolados de
EFMRV, obtidos pelo programa BioTyper 3.1 OC........................................
98
Figura 18. Dendrograma do tipo UPGMA obtido através do programa
BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV
analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®......................................................
100
Figura 19. Dendrograma UPGMA obtido através do programa
BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV
101
Figura 20. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa
BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV
102
Figura 21. “Pseudogel” dos espectro de massas analisados no MALDITOFMicroflex LT® dos 15 isolados de EFSRV, obtidos pelo programa
BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de
massas pode ser evidenciado com os através da intensidade na cor verde
de cada massa..............................................................................................
103
BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV
104
EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®, obtidos pelo programa
BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de
massas pode ser evidenciado com os através da intensidade na cor verde
de cada massa..............................................................................................
105
xxii
BioNumerics 7.5 baseado apenas nos espectros de massas dos 15
isolados de EFSRV e dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDITOFMicroflex.................................................................................................
106
EFSRV e dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex
LT®, obtido pelo programa BioNumerics 7.5.................................................
107
Figura 26. Distribuição geográfica do número de isolados de EFSRV e
EFMRV enviados de acordo com o Centro médico participante..................
110
Figura 27. Distribuição geográfica dos STs de EFSRV e EFMRV
encontrados no estudo de acordo com o Centro médico participante..........
111
xxiii
Resumo
Introdução: Infecções de corrente sanguínea (ICS) por Enterococcus spp.,
especialmente quando relacionadas com isolados resistentes à vancomicina,
apresentam altas taxas de morbidade e terapia antimicrobiana limitada. Objetivos:
Caracterizar o perfil epidemiológico e molecular de Enterococcus spp. isolados de
hemoculturas de pacientes com ICS participantes do programa SCOPE Brasil.
Material e Métodos: Entre junho de 2007 e dezembro de 2011, 144 cepas de
Enterococcus spp. foram isoladas a partir do primeiro episódio de ICS hospitalar de
pacientes de 12 centros médicos de quatro regiões brasileiras. Todas as 144
amostras foram re-identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® e a
identificação final das espécies foi confirmada por espectrometria de massa por
ionização e dessorção a laser - assistida por matriz - matrix associated laser
desorption-ionization - time of flight (MALDI-TOF MS) (Bruker Microflex, Vitek MS®
BMX) e reação da polimerase em cadeia (PCR) (oligonucleotídeos, ddlE.faecalis,
ddlE.faecium). Além disso, os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade aos
antimicrobianos pelo sistema Phoenix® e para aqueles que apresentaram resistência
à vancomicina, foram submetidos ao Etest® para confirmação das CIMs de
daptomicina, linezolida, teicoplanina e vancomicina. O mecanismo de resistência a
vancomicina foi confirmado por PCR para os genes vanA e vanB e a tipagem por gel
de eletroforese em campo pulsado - pulsed field gel electrophoresis (PFGE) foram
feitas para os isolados resistentes à vancomicina. A tipagem pela técnica de
sequenciamento de múltiplos loci - multilocus sequence typing MLST foi realizada
para 22 isolados selecionados com base nos perfis de PFGE. Avaliou-se a
aplicabilidade da técnica de MALDI-TOF MS para tipagem de Enterococcuss spp.
comparando os dendrogramas do tipo UHCA e UPGMA com o algoritimo de Ward.
Resultados: A espécie mais prevalente foi o E. faecalis com 110 isolados, seguidos
por E. faecium com 33 isolados e apenas um E. durans. Todos os 35 isolados
resistentes à vancomicina apresentaram o gene vanA, dos quais 15 da espécies E.
faecalis (EFSRV) e 20 da E. faecium (EFMRV). De acordo com a PFGE foram
encontrados dois padrões (B e C), que prevalecem entre EFSRV entre EFMRV foi
observado um maior polimorfismo e três grupos, sendo padrão A, o predominante.
MLST evidenciou em E. faecalis os STs 9; 103; 525 e 526. Enquanto em E. faecium
STs encontrados foram 18, 412, 478 e 896. Conclusões: E. faecalis foi a espécie
mais prevalente. Neoplasias foram as doenças de base mais encontradas. ST526 foi
o mais encontrado entre os EFSRV e o ST412 o mais prevalente entre os EFMRV. A
tipagem com os espectros produzidos no Microflex LT® e analisados no BioNumerics
7.5 apresentou uma boa concordância com o MLST para E. faecalis, quando
utilizado o algoritmo de Ward desconsiderando a intensidade dos espectros. Mesmo
utilizando Ward para E. faecium não houve boa correlação com o MLST.
xxiv
Abstract
Introduction: Bloodstream infection (BSI) caused by Enterococcus spp. particulally
related to vancomycin-resistant isolates, present high rates of morbi-mortality and
limited antimicrobial therapy. Objective: To characterize the epidemiological and
molecular profile of Enterococcus spp. isolates from patients of SCOPE Brazilian
program followed with BSI from June 2007 to December 2011. Methods: we enrolled
144 strains of Enterococcus spp. isolated from the first hospital episode of BSI of
patients admited to 12 hospital from four Brazillian regions . All these 144 isolates
were reviewed by the automated system BD PhoenixTM and their final species
identification was confirmed by Matrix Associated Laser Desorption-Ionization – Time
of Flight (MALDI-TOF) (Bruker Microflex, VitekMS BMX) and PCR (ddlE.faecalis,
ddlE.faecium). In addition, the isolates were submited to antimicrobial susceptibility
testing by PhoenixBD. Those isolates resistant to vancomycin were also examined
using EtestTM to confirm the minimum inhibitory concentration (MIC) for daptomycin,
linezolid, vancomycin and teicoplanin. The mechanism of resistance to vancomycin
was confirmed by using vanA and vanB gene PCR
and pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) was used to typing. We performed multilocus sequence
typing (MLST) in 22 isolates that were selected based on PFGE profiles. We further
evaluated the applicability of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-ofFlight (MALDI-TOF) technology for Enterococcus spp. typing comparing the
dendrograms obtained by UHCA, UPGMA and Ward algoritm. Results: The most
prevalent species was E. faecalis (110 isolates), followed by E. faecium (33 isolates)
and only one E. durans. All 35 vancomycin resistant isolates (15 E. faecalis, EFSRV
and 20 E. faecium, EFMRV) carried vanA gene. According with PFGE analysis, we
found the patterns B and C as more prevalent in EFSRV. Among the EFMRV
isolates we observed a greater polymorphism (patterns A, B, and C) among all three
groups, being predominant the pattern A. We evidenced by MLST the sequence
types (STs) 9; 103; 525, and 526 in E. faecalis, whereas 18, 412, 478 and 896 in E.
faecium. Conclusions: E. faecalis was the most prevalent specie. Cancer was the
most frequent underlying disease on the course of BSI. ST526 and ST412 were the
most frequent among EFSRV and EFMRV isolates respectively. EFSRV typing by
using Microflex LTTM and BioNumerics 7.5 program correlated with MLST results
when Ward's algorithm was applied not taking into account the intensity of the
spectra. However, we do not observe the same correlation among EFMRV isolates.
xxv
Introdução
1. INTRODUÇÃO
26
Introdução
Infecção da corrente sanguínea (ICS) é uma das principais causas de
mortalidade sobretudo em pacientes hospitalizados, frequentemente está associada
a um aumento na taxa de morbi-mortalidade. Além disso, representa uma das mais
significativas complicações durante o processo infeccioso, o que torna a
hemocultura um exame de importante valor preditivo de infecção (Araújo, 2012).
Atualmente, apesar do grande avanço tecnológico ocorrido nos últimos anos,
o procedimento mais utilizado para o diagnóstico etiológico de ICS requer a cultura
em meio líquido, continuamente monitorizada, seguida da pesquisa direta pela
coloração de Gram e subcultivo para a realização de testes fenotípicos de
identificação, automatizados, ou não, seguido do teste de sensibilidade aos
antimicrobianos. Esse processo geralmente necessita de 3 a 5 dias (Bizzini et al.,
2011).
O gênero Enterococcus tem emergido como um dos mais importantes
microrganismos multirresistentes nosocomiais, podendo ocasionar uma grande
variedade de infecções incluindo as ICSs. Estudos multicêntricos internacionais
apontam Enterococcus spp. variando entre o segundo e o oitavo agente mais
isolado de ICS (Magil et al., 2014; Billington et al., 2014; Biavasco et al., 2007;
Martínez-Ordriozola et al., 2007; Tsai et al. 2005; Wisplinghoff et al., 2004). Em
estudos nacionais Enterococcus spp. foi o oitavo microrganismo mais prevalente nas
ICS (ANVISA 2014; Gales et al., 2012; Marra et al., 2011) (Tabela 1).
27
Introdução
Tabela 1. Dados nacionais dos 10 principais patógenos isolados de ICS em estudos de vigilância
epidemiológica que incluem isolados bacterianos brasileiros.
Estudo de Vigilância
Referência
Período
Critério
Nº de centros médicos
UF participantes
Total de isolados
10 principais patógenos
S. aureus
SCoN
Klebsiella spp.
E. coli
Acinetobacter spp.
P. aeruginosa
Enterobacter spp.
Candida spp.
Enterococcus spp.
Serratia spp.
S. maltophilia
Proteus spp.
Brazilian SCOPE
Marra et al., 2011
Jun/2007- Mar/2010
1º episódio de ICS
confirmado
16
8
2.447
15,4
13,8
13,2
12,5
8,9
6,1
5,6
4,5 (8º)
3,5
1,6
SENTRY
Gales et al., 2012
2005-2008
20 primeiros isolados
consecutivos do mês
1 único isolado por paciente
4
4
3.807
% (posição)
20,2
14,5
12,1
12
9,1
8,7
6,1
5 (8º)
3,3
1,9
-
ANVISA
ANVISA, 2014
Jan a Dez/2012
ICS em UTI
908
27
19.009
16,5
19,9
12,4
5,9
11,4
8,9
4,9
6,3
5,8 (8º)
2,9
-
Embora não sejam considerados patógenos primários, o sucesso de
Enterococcus spp. em sobrepujar os mecanismos de defesa do hospedeiro e
ocasionar ICS pode ser explicado devido a sua grande versatilidade na aquisição de
elementos genéticos codificadores de fatores de virulência incluindo mecanismos de
resistência aos antimicrobianos (Higuita & Huycke, 2014; Leavis et al., 2007).
Entre os principais mecanismos de resistência em Enterococcus destacam-se
os genes vanA/B localizados em plasmídeos, resposávies por mutações no alvo da
vancomicina, resultado na resistência aos glicopeptídios (Short et al. 2014; Whang et
al. 2013). Esse fato representa um grande problema de saúde pública em todo
mundo em virtude da limitação terapêutica, proporcionando o aumento da taxa de
morbi-mortalidade (Short et al. 2014; Whang et al. 2013).
A identificação precoce da espécie de Enterococcus causadora da ICS é de
fundamental importância, uma vez que esses patógenos apresentam peculiaridades
de virulência, e sobretudo em relação ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos,
impondo a necessidade de uma antibioticoterapia direcionada (Arias & Murray,
2012). A antibioticoterapia empírica administrada para pacientes apresentando
sintomas de ICS e com fatores de riscos para Cocos Gram-positivos, sobretudo em
hospitais com altos índices de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina, pode
28
Introdução
utilizar uma combinação de antimicrobianos incluindo usualmente a vancomicina (Liu
et al., 2011).
O aumento frequente de isolados de Enterococcus spp. resistentes à
vancomicina (ERV), tem chamando a atenção em várias casuísticas por todo o
mundo, levando a falha terapêutica empírica (Billington et al., 2014; Arias & Murray,
2012). Deste modo, a detecção precoce de Enterococcus faecalis e Enterococcus
faecium, sobretudo aqueles apresentando resistência à vancomicina é crucial para o
melhor manejo do paciente e controle do uso de antimicrobianos, permitindo
direcionamento no tratamento e consequentemente maiores chances de sucesso
terapêutico, diminuindo morbi-mortalidade, além da implementação de barreiras para
controle da disseminação dos isolados resistentes à vancomicina no ambiente
hospitalar (Billington et al., 2014; Sood, et al., 2008; Martínez-Ordriozola et al., 2007;
DiazGranados & Jernigan, 2005).
Além disso, a confirmação da concentração inibitória mínima (CIM) da
vancomicina e confirmação do mecanismo de resistência, geralmente vanA e menos
frequentemente vanB, é de fundamental importância, considerando que esses
mecanismos são plasmidiais e apresentam transferência horizontal (d’Azevedo et
al., 2009; Arias et al., 2009; Toye et al., 1997).
As infecções por Enterococcus eram consideradas de fonte endógena da
microbiota normal do paciente e sem destaque entre as infecções graves em
humanos. Essa perspectiva se modificou de forma significativa, quando os
Enterococcus spp. passaram a ser considerados como um dos principais
microrganismos isolados de infeções hospitalares. Além disso, a emergência e a
disseminação de isolados de Enterococcus spp. multirresistentes e as evidências de
aquisição desse microrganismo por fonte exógena tem gerado a necessidade de
tipagem
dos
isolados
para
auxiliar
no
controle
de
infecção
e
estudos
epidemiológicos em várias instituições médicas (Teixeira & Melquior, 2013).
Os métodos utilizados para a investigação epidemiológica dos ERV devem
ser capazes de subsidiar informações para o controle da disseminação desses
microrganismos em diferentes ambientes e entre pacientes (Teixeira & Melquior,
2013; d’Azevedo et al., 2009; Arias et al., 2009; Toye et al., 1997).
A utilização de ferramentas moleculares para laboratórios clínicos, sobretudo
29
Introdução
no Brasil, ainda parece distante, isso porque as técnicas envolvendo a análise do
DNA, mesmo a PCR convencional exigem infraestrutura adequada, necessitanto de
equipamentos específicos e material de consumo de alto custo. As técnicas de
tipagem molecular mais utilizadas para epidemiologia de isolados multirresistentes
são gel de eletroforese em campo pulsado-pulsed field gel electrophoresis (PFGE) e
sequenciamento de múltiplos loci - multilocus sequence typing (MLST). A primeira é
bastante laboriosa e demorada, necessitando de pelo menos cinco a sete dias para
liberação do resultado (Bedendo & Pignatari, 2000; Tenover et al., 1997; Tenover et
al., 1995). O segundo requer um sequenciador e a utilização de reagentes também
de alto custo, impossibilitando a implantação nos laboratórios de rotina, limitando-se
aos laboratórios de pesquisa (Ruiz-Garbajosa et al., 2006; Homan et al., 2002).
Uma possível alternativa mais barata seria a utilização da espectrometria de
massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDITOF-MS). Essa
representaria um grande avanço, sobretudo pela possibilidade de diagnóstico
precoce da espécie de Enterococcus spp. e de vários outros microrganismos,
podendo até mesmo identificar o microrganismo diretamente do frasco de
hemocultura positivo (Chen et al., 2013).
Entretanto, a utilização dessa ferramenta para tipagem de microrganismos
ainda não está bem estabelecida (Lash et al., 2014). A padronização de um
protocolo utilizando a técnica de MALDI-TOF MS poderia otimizar de forma
significativa o diagnóstico do agente infeccioso pela tipagem do mesmo, em tempo
reduzido e realizado num mesmo ensaio laboratorial. Uma vez com estrutura
montada, os equipamentos de MALDI-TOF MS disponíveis no mercado necessitam
apenas de reagentes rotineiros utilizados para realização do ensaio, passando a ser
de baixo custo, inclusive, podendo ser produzidos in house (Patel et al., 2015; Lash
et al., 2014; Carbonnelle et al., 2011).
Existem poucas informações disponíveis sobre as características das ICSs
por Enterococcus spp. nos hospitais brasileiros. Deste modo, um estudo
multicêntrico incluindo isolados de diferentes regiões do Brasil é de grande
importância, identificando as espécies mais prevalentes, bem como suas
peculiaridades de sensibilidade aos antimicrobianos e a disseminação clonal dos
isolados resistentes à vancomicina.
30
Revisão da Literatura
2. REVISÃO DA LITERATURA
31
2.1 Caracterização do agente etiológico
Espécies de Enterococcus estão amplamente distribuídas na natureza,
podendo ser encontradas no solo, plantas, água, alimentos e em animais, incluindo
mamíferos, aves, insetos e répteis. Em humanos habitam predominantemente o
trato gastrointestinal (Lebreton, Willems & Gilmore, 2014). Esses microrganismos
são cocos Gram-positivos podendo se apresentar de forma isolada, aos pares ou em
cadeias curtas. Esses não apresentam catalase e costumam crescer em
temperaturas entre 10 a 45ºC. São anaeróbios facultativos e a maioria das espécies
cresce em meios de cultura líquidos contendo 6,5% de NaCl, sendo também são
capazes de hidrolisar esculina em presença de 40% de sais biliares, além de
produzirem pirrolidonil arilaminidase (Teixeira et al., 2007).
O gênero Enterococcus pertencente a família Enterococcaceae onde são
conhecidas atualmente 44 espécies (Higuita & Huycke, 2014; Ludwig, Schleifer, &
Whitman, 2009). As espécies mais frequentemente associadas às infecções em
humanos são E. faecalis e E. faecium. Outras espécies, tais como E. casseliflavus,
E. durans, E. hirae e E. gallinarum são também encontradas em amostras clínicas,
no entanto, em menor frequência (Higuita & Huycke, 2014; Hidron et al., 2008;
Biviasco et al., 2007; Teixeira et al., 2007).
A resistência a vancomicina entre isolados de Enterococcus spp. é um grande
problema também no laboratório clínico, uma vez que espécies raramente
associadas com infecções em humanos como, E. casseliflavus, E. gallinarum e E.
flavescens podem apresentar resistência aos glicopepitídios, devido a presença dos
genes vanC1/C2 e C3. Entretanto, esses genes estão localizados no cromossomo e
não apresentam um grande impacto epidemiológico na dispersão da resistência no
ambiente hospitalar (Fard et al., 2014; Clark et al., 1998, Dutka-Malen et al., 1995).
Diferentemente dos gêneros Streptococcus spp. e Staphylococcus spp., os
Enterococcus spp.
não produzem um conjunto de toxinas pró-inflamatórias
potentes, entretanto, apresentam uma grande versatilidade em adquirir genes,
muitas vezes codificadores de fatores de virulência, incluindo resistência aos
antimicrobianos. Entre os principais fatores de virulência encontrados em
Enterococcus spp. estão:
adesina, substância de agregação, superóxido
extracelular, metaloendopeptidase, citolisina, hialuronidade e proteína de superfície
32
de Enterococcus, que contribui na formação do biofilme e colonização de cateter
(Arias & Murray, 2012; Top, Willems & Bonten, 2008; Leavis et al., 2006; Willems et
al., 2005). Todos esses fatores associados proporcionam um cenário favorável na
adaptação desse microrganismo no ambiente hospitalar (Top, Willems & Bonten,
2008).
Deste modo, embora não sejam considerados patógenos primários,
eventualmente, estas bactérias conseguem sobrepujar os mecanismos de defesa do
hospedeiro, podendo ocasionar uma grande variedade de infecções em humanos,
incluindo as ICSs (Park et al. 2009; Singh et al. 2009).
Enterococcus
spp.
resistente
à
vancomicina
(ERV)
tem
crescido
consideravelmente como causa de infecção invasiva em pacientes hospitalizados,
sobretudo em unidades de tratamento intensivo (UTI) e em pacientes oncológicos
(Reale et al., 2009; Teixeira & Facklam 2003; Franz et al., 1999) diminuindo às
opções terapêuticas disponíveis e, consequentemente, contribuindo para aumento
da morbi-mortalidade. Deste modo, a detecção precoce de pacientes infectados por
ERV é fundamental para adequado manejo do paciente infectado, bem como para o
controle da disseminação desse patógeno no ambiente hospitalar (Deplano et al.
2007; Reale et al., 2009).
2.2
Epidemiologia das infecções causadas por Enterococcus spp.
Embora saibamos que Enterococcus spp. pode causar infecção humana na
comunidade e no hospital, esses microrganismos somente começaram a ser
reconhecidos como causas comuns de infecções hospitalares no final de 1970,
passando então de simples bactérias de baixa patogenicidade para serem
consideradas a segunda ou terceira causa mais comum de infecção nosocomial.
Essa evolução adaptativa impôs um dos principais desafios terapêuticos da
atualidade, especialmente quando associados com ICS (Biavasco et al., 2007; Tsai
et al., 2005; Wisplinghoff et al., 2004).
Estudos internacionais mais recentes apontam que Enterococcus spp. esteve
entre o terceiro e quinto isolado mais frequente entre as ICS (Billington et al., 2014;
Magil et al., 2014). Já os estudos brasileiros apontam Enterococcus spp. como o
oitavo microrganismo mais isolado das ICS (ANVISA, 2014; Gales et l., 2012; Marra
33
et al., 2011).
Ao longo dos anos, a proporção de infecções enterocócicas provocadas pela
espécie E. faecalis em relação às demais chega aproximadamente a 10:1 (Teixeira
et al, 2007). Entretanto, nos últimos anos, o que se percebe é um declínio nessa
taxa para 3:1 (Higuita & Huycke, 2014; Mundi et al. 2000). Embora E. faecalis
continue sendo a espécie mais predominante em infecções clínicas, isolados de E.
faecium vêm aumentando gradativamente, provavelmente devido ao maior número
de fatores de virulência e aos maiores índices de resistência aos antibióticos
ampicilina, gentamicina e estreptomicina e principalmente a resistência à
vancomicina, mais comuns nessa espécie (Billström et al., 2007; Edwards, 2000).
O espectro de infecções que podem ser causadas por Enterococcus spp.
inclui as infecções do trato urinário, infecções de feridas, principalmente as
cirúrgicas, assim como as úlceras de decúbito, infecções de pele em queimados, e
ICS (Tan, et al., 2010; Carvalho, et al., 2008; Malani et al. 2002). Também podem
causar endocardite, infecções pélvicas e
intra-abdominais e, mais raramente,
infecções no trato respiratório, sistema nervoso central, otite, sinusite, artrite séptica
e endoftalmite (Werner, et al., 2008; Teixeira et al., 2007).
A patogênese das infecções enterocócicas ainda é pouco compreendida. No
entanto, estudos epidemiológicos demonstram a existência da relação entre alguns
clones específicos com a ocorrência de surtos hospitalares, sugerindo também um
subconjunto de linhagens virulentas como responsáveis por infecções de proporções
epidêmicas (Ochoa et al., 2013; Damani et al., 2010; Panesso et al., 2010; Leavis et
al., 2006).
Entre os principais fatores associados aquisição de ICS por Enterococcus
spp. os mais relatados são: pacientes imunocomprometidos, neoplasias, pacientes
internados com tempo de hospitalização prolongado, uso de cateter venoso em
posição central, presença de cateter vesical e utilização de antibioticoterapia de
amplo espectro (Billington et al. 2014; Gudiol et al., 2013; Ghanem et al. 2007;
Martínez-Odriozola et al. 2007; Wisplinghoff et al. 2004).
Apesar de alguns estudos multicêntricos revelarem controvérsias quanto a
resistência de Enterococcus spp. à vancomicina ser um preditor de mortalidade em
ICS, a grande maioria desses estudos relatam que o prognóstico é reservado,
sobretudo, devido as limitações terapêuticas podendo dificultar a evolução clínica do
paciente, e aumentar o índice de mortalidade. No entanto, essa relação pode variar
34
de acordo com a população de pacientes estudada e está diretamente condicionada
a condição de base do paciente (Billington et al. 2014; Hayakawa et al., 2014). De
acordo com dados do CDC, entre os 20.000 casos de infecções por ERV
nosocomiais, houve 1.300 mortes atribuídas somente no ano de 2013, esses dados
não incluem apenas ICS.
De acordo com a literatura, a resistência à vancomicina pode variar de acordo
com a espécie. Considerando as duas espécies mais associadas à infecções em
humanos, E. faecium destaca-se com maior índice de resistência à vancomicina,
chegando até 78% de resistência, de acordo com os dados reportados por Adam e
colabordores (2011), podendo variar conforme a região geográfica e os critérios de
cada estudo. Dados do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) apontam
que 77% dos E. faecium foram resistentes à vancomicina (EFMRV) no ano de 2013
nos Estados Unidos/ Já no estudo de Mira e colaboradores (2014), na Sérvia, essa
resistência ocorreu em cerca de 54% dos E. faecium. Dados nacionais baseados no
Boletim informativo da ANVISA (2014) 48,9% foram EFMRV. Entre os E. faecalis
resistentes à vancomicina (EFSRV) os índices são menores.
2.3
Histórico da resistência de Enterococcus spp. à vancomicina
A vancomicina é um antimicrobiano bactericida que foi isolado pelo grupo de
Eli Lilly em 1956, a partir da fermentação do fungo Amycolatopsis orientalis
(relacionado à Nocardia) encontrado em amostras de solo coletado no interior das
selvas de Bornéu (Levine, 2006).
Com o nome de origem inglesa “to vanquish” (aniquilar, destruir, vencer),
vancomicina tornou-se quase uma lenda devido ao seu excelente desempenho
frente a cepas de S. aureus resistentes à oxacilina. Possui atividade contra cocos
Gram-positivos, C. difficile e Corynebacterium spp., contudo, não possui atividade
contra bactérias Gram-negativas e micobactérias (Silveira et al., 2006).
Sua disponibilidade para uso clínico ocorreu em 1958, após aprovação pelo
Food and Drug Administration (FDA). Nessa mesma época, outros agentes antiestafilococos (tetraciclinas, cefalosporinas, eritromicina e meticilina) passaram a
serem utilizados, recebendo maior aceitação do que a vancomicina devido a sua
nefrotoxicidade e ototoxicidade, levando a vancomicina a ser relegado para a
posição de uma droga de última instância (Silveira et al., 2006; Griffith, 1981).
35
A vancomicina age impedindo a síntese da parede celular bacteriana, através
da ligação na porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em
precursores de peptidoglicano, interferindo na etapa de transpeptidação (Silveira et
al., 2006; Eggert et al., 2011) (Figura 1).
Fonte: Eggert et al. (2011).
Figura 1. Etapa da transpeptidação: formação das ligações cruzadas nas cadeias peptídicas.
O peptidoglicano (heteropolissacarídeo, tendo na sua constituição os
monossacarídeos ácido N-acetilmurâmico - NAM e N-acetilglucosamina - NAG) é
responsável pela rigidez e forma da parede celular bacteriana (Eggert et al., 2011).
Especificamente, a vancomicina impede a incorporação do ácido N-acetilmurâmico e
do N-acetilglucosamina, que são subunidades constituintes da
matriz do
peptidoglicano, principal componente estrutural da parede celular das bactérias
Gram-positivas (McComas et al., 2003).
Com a sua característica hidrofílica, a molécula de vancomicina forma
ligações através de seus átomos de hidrogênio com as interações do terminal D-AlaD-Ala ligadas aos peptídeos NAM e NAG. Esses pontos de ligação formados (cinco)
previnem a junção entre as subunidades do peptidoglicano (Figura 2) (Silveira et al.,
2006; McComas et al., 2003).
36
Fonte: Silveira et al, (2006).
Figura 2. Ligação entre a vancomicina e a porção terminal D-Ala-D-Ala do peptidoglicano.
A consolidação da vancomicina como um antimicrobiano importante frente a
bactérias Gram-positivas multirresistentes, trouxe um período de certa tranqüilidade
nos
programas
de
investigação
e
desenvolvimento
de
novos
agentes
antimicrobianos pelas empresas farmacêuticas. Entretanto, com o surgimento das
primeiras cepas de ERV na década de 1970 e a emergência da sua disseminação
no ambiente hospitalar, lançou desafios para o tratamento de infecções causadas
por esses microrganismos nos últimos anos, levando a necessidade da busca de
novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno multirresistente (Silveira et
al., 2006).
Entre os antimicrobianos lançados nos últimos anos pelas indústrias
farmacêuticas para o combate de microrganismos multiresistentes, alguns já foram
aprovados pelo FDA como opção terapêutica para os enterococos multiresistentes.
Entre os recentes antimicrobianos introduzidos na prática clínica nos últimos anos
estão: linezolida (oxazolidinonas); daptomicina (lipopeptídeos cíclicos) e tigeciclina
(glicilciclinas). Apesar dos altos custos, podem ser alternativas terapêuticas diante
de ERV. Entretanto, esses medicamentos apresentam certas limitações para o uso e
a resistência em alguns já foi relatada, por exemplo, E. faecalis são intrinsecamente
resistentes a Quinupristina/dalfopristina (Werner et al., 2008).
37
2.4
Importância da tipagem
resistentes à vancomicina
molecular
de
Enterococcus
spp.
A tipagem molecular de ERV é uma ferramenta importante para vigilância
epidemiológica, caracterização de surtos, diagnóstico, tratamento e manuseio dos
pacientes
que
apresentam
infecções
por
microrganismos
multirresistentes,
sobretudo quando relacionadas à infecções nosocomiais em pacientes debilitados
(Arias & Murray 2012).
O emprego de métodos moleculares nos últimos anos tem substituído
progressivamente ensaios fenotípicos para tipagem de estirpes bacterianas.
Entretanto,
a tipagem de ERV geralmente é uma ferramenta subutilizada, isso
porque a grande maioria dos centros que apresentam ERV como patógeno
problema no hospital não apresentam infraestrutura suficiente como salas
adequadas, equipamentos e insumos para realização dessas técnicas e ensaios
moleculares, geralmente ficando restrito aos laboratórios de pesquisa.
Entre as técnicas moleculares de tipagem utilizada na análise de surtos de
infecções e na avaliação da disseminação de cepas multirresistentes no ambiente
hospitalar, ou mesmo entre diferentes hospitais, utiliza-se principalmente a técnica
de PFGE, ainda considerada “padrão ouro” para análise desse tipo de estudo. MLST
é técnica mais utilizada para estudos epidemiológicos globais (D’Azevedo et al.,
2008; Titze-de-Almeida et al., 2004).
PFGE é uma técnica em que as moléculas de DNA são digeridas por
endonucleases de restrição (Barbier et al., 1996; Gordillo et al., 1993) gerando
produtos de ácidos nucleicos de tamanhos diversos. O polimorfismo do tamanho dos
fragmentos de restrição é então usado para discriminar estirpes bacterianas,
podendo trazer respostas importantes quanto ao grau de similaridade entre os
isolados avaliados (Jayarão, Dore & Oliver, 1992; Miranda, et al., 1991).
Embora PFGE seja considerado o "padrão ouro" para tipagem de
Enterococcus spp. (Morrison et al., 1997, Olive & Bean, 1999), seu uso é limitado
por ser demorado e laborioso (da Silva, et al. 2012; Bebendo & Pignatari, 2002;
Miranda, et al., 1991). Além disso, a técnica de PFGE apresenta algumas limitações
consideráveis, como por exemplo: o padrão de macrorrestrição encontrado pode
variar de acordo com a diferença no tempo de isolamento das amostras analisadas,
do tipo de enzima de restrição utilizada no ensaio e também do tipo de análise
38
interpretativa dos resultados, requer um técnico treinado e podendo não discriminar
isolados bacterianos não relacionados (Vitali, Gherardi & Petrelli, 2015; Hedberg et
al., 2001).
Sabe-se também que os resultados do padrão de macrorrestrição podem
apresentar variação de leitura interobservador.
Algumas bandas de mesmo
tamanho podem se sobrepor e dificultar a análise. A mudança em um sítio de
restrição pode significar mais do que uma mutação e algumas cepas podem não ser
adequadamente discriminadas por essa técnica. Todos esses fatos dificultam a
construção de um banco de dados com o padrão de bandas obtidas pela
macrorrestrição, o que é praticamente inviável e não parece ser uma proposta do
método seguro. Sugere-se que a técnica de PFGE seja utilizada como uma triagem
na avaliação de surtos, porém não devendo ser utilizada para análise filogenética
(Vitali, Gherardi & Petrelli, 2015; CDC 2013,Hedberg et al., 2001).
Mesmo com todas essas limitações, a tipagem por PFGE pode trazer
respostas importantes e caracterizar isolados clonais num ambiente hospitalar,
sobretudo para análises pontuais, análises de surtos e em número limitado de
isolados. Além disso, pode-se também classificar como clonais, isolados
considerados pertencentes a grupos moleculares diferentes pela técnica de MLST,
assim como classificar como diferentes, espécimes pertencentes ao mesmo
Sequence Typing (ST) obtido por MLST (da Silva et al. 2012; Bebendo & Pignatari,
2002).
Outra técnica utilizada para tipagem de Enterococcus spp. é a MLST que
realiza o sequenciamento de genes conservados (HouseKeeping genes) - avaliando
as mutações ocorridas nas sequências dos nucleotídeos (Top, Willems & Bonten,
2008). A técnica de MLST é baseada em diferenças alélicas em sete genes
conservados e é a análise atualmente preferida para avaliação de relação clonal
podendo ser aplicada para microrganismos de vários gêneros. Entretanto, para o
gênero Enterococcus, o método está padronizado apenas para as espécies E.
faecalis e E. faecium (Arias & Murray, 2012; Top, Willems & Bonten, 2008).
O objetivo dessa técnica é proporcionar um sistema de tipagem preciso e
altamente
discriminativo
que
pode
ser
utilizado
para
diferenciar
vários
microrganismos, sobretudo isolados multirresistentes (Arias & Murray, 2012; Willems
et al., 2012; Top, Willems & Bonten, 2008; Willems et al., 2005).
Essa técnica necessita da utilização de um sequenciador e também requer
39
uma infraestrutura especializada. A análise dos dados deve ser realizada em um
programa de análise de sequencias de nucleotídeos, por um profissional habilitado,
frente as sequencias consensos submetidas no site www.mlst.net, que contem o
banco de dados das sequencias depositadas dos sete alelos dos microrganismos
em questão. Esse método de bioinformática permite gerar um número para cada
alelo e, em seguida, um conjunto com o número dos sete alelos são submetidos no
mesmo site para verificar o número do Sequence Typing/Número da sequencia (ST)
(Top, Willems & Bonten, 2008).
Também é possível a construção de uma árvore filogenética com relação aos
números de loci variantes a partir do primeiro isolado padrão depositado nesse
banco de dados, essa análise se chama e-Burst, posicionando o ST encontrado em
comparação com todos os STs depositados mundialmente no banco, permitindo
avaliar a origem clonal (Top, Willems & Bonten, 2008).
A maioria dos STs encontrados entre isolados E. faecalis, de origem
hospitalar, estão normalmente relacionados aos dois complexos clonais mais
importantes nessa espécie, CC2 e CC9 (van Schaik & Willems, 2010; RuizGarbajosa et al., 2006). O aumento da frequência de isolamento de E. faecium em
todo o mundo é devido à presença de uma subpopulação policlonal (geralmente
pertencentes ao complexo clonal 17 (CC17) (Willems & van Schaik, 2009; Willems,
2005). Alguns autores sugerem que isolados de origem hospitalar geralmente estão
associados aos STs supracitados (Galloway-Pena et al., 2012; van Schaik et al.,
2010; Willems et al., 2009).
As linhagens de E. faecium, derivadas do CC17, são caracterizadas por
apresentar resistência à ampicilina e quinolonas, e à presença dos genes esp
(enterococcal surface protein), que confere facilidade de adesão em superfícies,
como cateter, e gene hyl (hialuronidase) por exemplo (da Silva et al., 2012; Freitas et
al., 2010; Willems et al., 2001).
No Brasil, estudos de tipagem de ERV por MLST de diferentes amostras
clínicas humanas evidenciam a presença dos STs 525 e 526 entre isolados de E.
faecalis resistentes à vancomicina (EFSRV) (De Almeida, et al. 2014) e ST 103,
encontrado por Merlo et al. (2015). Outros estudos envolvendo tipagem de
E.
faecium resistentes à vancomicina (EFMRV) apresentam predominantemente os
STs 412 e 478, que são derivados do CC17 (Merlo et. al., 2015; da Silva et al., 2012;
Palazzo et al., 2011).
40
A utilização de sequenciamento do genoma microbiano total tem sido descrita
como uma ferramenta completa, por informar além das mutações ocorridas em
genes conservados, a presença de assinaturas moleculares presentes nos
microrganismos, como fatores de virulência e mecanismos de resistência.
Entretanto, a utilização dessa ferramenta para os laboratórios clínicos ainda
representa uma perspectiva de longo prazo, já que os equipamentos que realizam o
sequenciamento total são de alto custo, dificultando a utilização do método para uso
rotineiro. Além disso, a maior dificuldade na metodologia pode está relacionada com
a análise e interpretação dos resultados devido ao grande número de informações
geradas (MacLean, Jones & Studholme 2009).
A tipagem molecular pode fornecer informações importantes sobre a
variabilidade fenotípica de ERV, como distribuição geográfica, a patogenicidade, e
mecanismos de virulência incluindo resistência aos antimicrobianos. A tipagem de
ERV tem uma aplicação direta no estudo da dinâmica desses e sua dispersão no
ambiente hospitalar. Essa metodologia pode fornecer subsídios para compreender o
comportamento das infecções causadas por esses microrganismos, incluindo o
aumento da virulência e transmissibilidade dos isolados, a resistência a múltiplos
antimicrobianos e o melhor gerenciamento de controle do uso racional de
antimicrobianos. Além disso, essas informações permitem também adequar a
padronização dos protocolos de tratamento empíricos, sobretudo nas ICSs, através
do manejo mais individualizado dos pacientes portadores de EFSRV e ou/ EFMRV,
como a implantação de barreiras para conter a disseminação do patógeno, evitandose a transmissão para outros pacientes e para o ambiente hospitalar (Ochoa et al.,
2013; d'Azevedo, et al., 2009; Furtado, et al., 2005).
41
Objetivos
3. OBJETIVOS
42
Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar o perfil epidemiológico e molecular de Enterococcus spp.
isolados de hemoculturas de pacientes com ICS participantes do programa SCOPE
Brasil.
3.2 Objetivos Específicos

Verificar a prevalência das espécies de Enterococcus isoladas do primeiro
episódio de ICS em pacientes pertencentes ao estudo SCOPE Brasil;

Verificar a prevalência das doenças de bases e fatores associados ao
desenvolvimento de ICS E. faecium e E. faecalis, de acordo com as fichas
clínicas.

Verificar a acurácia entre os métodos de identificação fenotípica e os métodos
moleculares;

Avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os isolados de
Enterococcus spp. e a prevalência dos genes van entre os isolados de
EFSRV e EFMRV de acordo com a região geográfica;

Avaliar a tipagem molecular dos isolados de EFSRV e EFMRV pelos métodos
de PFGE e MLST;

Verificar a aplicabilidade da técnica MALDI-TOF MS para a tipagem molecular
de ERV.
43
Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOS
44
Material e Métodos
4.1
Desenho do estudo
Este estudo é um seguimento do projeto SCOPE Brasil, que por sua vez é
uma extensão de um estudo realizado na Virginia Commonwealth University, nos
Estados Unidos, denominado de SCOPE (Surveillance and Control of Pathogens of
Epidemiological Importance). O estudo foi coordenado pelos Doutores Richard P.
Wenzel e Michael B. Edmond (Wisplinghoff et al. 2004), que mostraram dados
epidemiológicos sobre mais de 24.000 ICSs em 49 hospitais americanos durante um
período de sete anos.
O SCOPE Brasil foi realizado entre os anos de 2006 e 2012, com a
participação de 16 centros hospitalares pertencentes as cinco regiões brasileiras
(Norte, Nordeste, Sul, Sudeste e Centro-Oeste). Apenas 12 centros médicos
enviaram amostras de Enterococcus spp. entre os anos de 2007 e 2011, que foram
submetidas a caracterização microbiológica e molecular, cujo fluxograma dos
ensaios desenvolvidos estão demonstrados na Figura 3.
As amostras de Enterococcus spp. foram submetidas à caracterização
fenotípica, à análise macro e micromorfológica e à identificação bioquímica pelo
sistema automatizado Phoenix®. A identificação foi confirmada através da técnica de
MALDI-TOF e PCR.
O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de
microdiluição utilizando o sistema automatizado Phoenix®. As amostras resistentes à
vancomicina foram submetidas ao E-test® e PCR para detecção dos genes vanA e
vanB.
Também foi realizada nesses isolados tipagem molecular pelas técnicas de
PFGE e MLST. Também avaliamos a aplicabilidade da técnica de espectrometria de
massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDITOF-MS) para
tipagem de Enterococcus spp. O fluxograma dos ensaios realizados pode ser
visualizado na Figura 3.
45
Material e Métodos
ERV= Enterococcus spp. resistentes à vancomicina; ESV= Enterococcus spp. sensíveis à vancomicina;
DP= daptomicina; LZ= linezolida; TC=teicoplanina;VC= vancomicina ID= identificação das espécies.
Figura 3. Fluxograma dos ensaios laboratoriais realizados com os isolados de
Enterococcus spp. incluídos no Projeto SCOPE Brasil.
4.2
Seleção das amostras
Foram incluídas 144 amostras de Enterococcus spp. isoladas de ICS e
coletadas entre os anos de 2007 e 2011. As amostras clínicas incluídas no estudo
foram oriundas de 12 centros médicos brasileiros, pertencentes ao programa
SCOPE (Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance),
conforme descrito na (Tabela 2).
46
Material e Métodos
Tabela 2. Centros médicos participantes do Projeto SCOPE Brasil e que enviaram
amostras de Enterococcus spp.
Nº Centros*
Centro Médico
Cidade/UF
1
Hospital São Paulo
São Paulo/SP
2
Hospital do Rim e Hipertensão
São Paulo/SP
3
Hospital Estadual de Diadema
Diadema/SP
4
Instituto de Oncologia Pediátrica IOP/GRAAC
São Paulo/SP
5
Hospital Nove de Julho
São Paulo/SP
6
Hospital Israelita Albert Einstein
São Paulo/SP
7
Santa Casa de Porto Alegre
Porto Alegre/RS
9
Hospital Universitário Walter Cantídio
Fortaleza/CE
10
Hospital Santa Casa do Pará
Belém/PA
12
Hospital das Clínicas de Goiânia
Goiânia/GO
13
Hospital de Base de Brasília
Brasília/DF
15
Hospital Espanhol de Salvador
Salvador/BA
*Os centros de Nº 8, 11, 14 e 16 não enviaram amostras de Enterococcus spp.
4.3
Critérios de inclusão das amostras
As ICSs hospitalares foram definidas pelo isolamento de uma ou mais
amostras de hemoculturas positivas após pelo menos 48 horas da admissão do
paciente no hospital. Foi incluída no estudo apenas uma amostra de cada
paciente, sendo esta a primeira amostra positiva caracterizada como de origem
hospitalar.
Para a inclusão no estudo, alguns critérios de síndrome da resposta
inflamatória sistêmica (SIRS) foram considerados, tais como:
 Febre com temperatura corporal acima de 38 oC ou hipotermia com
temperatura corporal abaixo de 36 oC;
 Taquicardia com frequência cardíaca acima de 90 bpm;
 Taquipnéia com frequência respiratória acima de 20 irpm, ou
hipocapnéia (pressão parcial de CO 2 < 32 mmHg);
 Leucocitose ou leucopenia com leucócitos acima de 12.000 cels/mm 3
ou abaixo de 4.000 cels/mm 3, ou presença de mais de 10% de formas
jovens (bastões).
Além dos isolados clínicos, as cepas padrão American Type Culture
Collection (ATCC) de S. aureus 29213 e E. faecalis 29212, foram utilizadas para o
controle de qualidade dos ensaios laboratoriais, sobretudo, em relação aos testes de
47
Material e Métodos
sensibilidade aos antimicrobianos, conforme as recomendações do documento
M100-S25 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015).
4.4
Identificação dos isolados clínicos
4.4.1 Avaliação da pureza e viabilidade das amostras
As amostras foram recebidas em swab contendo meio de Amies com carvão
ativado, a fim de manter a viabilidade dos microrganismos durante o transporte dos
mesmos até o Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), onde as
amostras foram semeadas em ágar sangue e, em seguida subcultivadas e
incubadas a 35 ± 1 °C durante 24 horas. As amostras consideradas puras foram
armazenadas em Tripticase Soy Broth - caldo tríptico de soja (TSB) contendo 20%
de glicerol a -70°C, até serem submetidas aos testes laboratoriais. Antes de cada
ensaio laboratorial, os isolados foram submetidos a dois repiques sucessivos em
ágar sangue.
4.4.2 Re-identificação bacteriana por método fenotípico
Todos os microrganismos recebidos vieram previamente identificados pelo
centro de origem. Entretanto, todos os isolados bacterianos incluídos no estudo
foram re-identificados, para uniformizar a plataforma de identificação bioquímica de
Enterococcus spp.
Deste modo, a identificação inicial do microrganismo foi baseada nas
características macromorfológicas em ágar sangue (colônias geralmente  ou α
hemolíticas; apesar da literatura relatar que algumas amostras podem apresentar
hemólise β, nenhum dos isolados incluídos neste estudo apresentaram esse tipo de
hemólise). Em seguida, com a colônia suspeita foi realizado esfregaço em lâmina
que foi corado pelo método de Gram, para avaliação das características
morfotintoriais. Todos os isolados foram submetidos à identificação bioquímica e
teste de sensibilidade através do sistema automatizado Phoenix® (Becton Dickinson
Microbiology Systems, Coceysville, Md) utilizando o painel PMIC/ID105.
Os
painéis
combinados
do
sistema
Phoenix
permitem
realizar
simultaneamente testes de identificação e sensibilidade aos antimicrobianos. O
painel combinado compõe-se de dois lados: um lado para identificação do
microrganismo, chamado ID, com substratos desidratados para a identificação e um
48
Material e Métodos
lado para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, chamado AST, com diversas
concentrações de agentes antimicrobianos, controles de crescimento e de
fluorescência, para determinar a sensibilidade das bactérias.
O lado ID do painel PMIC/ID 105 apresenta 51 cavidades contendo diversos
testes bioquímicos convencionais, cromogênicos e fluorogênicos para determinar a
identificação do organismo. O princípio do método está relacionado à utilização e
degradação de substratos específicos como carboidratos e compostos aminados, e
consequente alteração do pH que é detectada por diversos indicadores
colorimétricos e fluorimétricos. Além disso, existem outros testes que detectam a
capacidade
do
microrganismo
de
hidrolisar,
degradar,
reduzir
ou
utilizar
determinados substratos.
Entre os substratos presentes no PMIC/ID 105, utilizados para identificação
da espécie, estão: 4mu-bd-celobiosidio, L-alanina-amc, 4mu-bd-glucosidio, L-prolinaamc, ácido-amc L-piroglutâmico, L-fenilalanina-amc, L-triptofano-amc, 4mu-fosfato,
metionina-amc, 4mu-ad-glucosidio, arginina-amc, Glicina-prolina-amc, 4mu-bdglucuronidio, L-leucina-amc, 4mu-n-acetil-bdglucosaminidio, L-arginina-amc, 4mufosfato (com trealose), L-histidina-amc, L-isoleucina-amc, 4mu-bd-galactosidio,
colistina, polimixina B, ácido D-glucônico, ácido 3-metil glutárico, D-fructose, ácido
iminodiacético, ácido alfa-cetoglutárico, D-manitol, 3-metiladipico, timidina, alaninaalanina-pna, L-prolina-pna, valina-alanina-pna, pnp-ad-glucosidío, pnp-fosfato, betagentiobiose, d-sucrose, maltotriose, N-acetil-glucosamina, D-trealose, D-tagatose,
maltose, dextrose, uréia, esculina, nitrocefin, metyl-alfa-dglucopiranosidio.
4.4.3 Identificação por espectrometria de massa por ionização e dessorção
a laser - assistida por matriz / Matrix Associated Laser DesorptionIonization – Time of Flight (MALDI-TOF MS)
A identificação do microrganismo se baseia na análise dos perfis de proteínas
detectados diretamente da colônia bacteriana (Vitek MS® BMX) ou após uma
extração prévia das proteínas ribossomais totais (Microflex LT®) que são aplicadas
num suporte de metal. Após a colônia diretamente inoculada ou o extrato proteico
secar no suporte, uma matriz específica (o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico - HCCA)
é aplicada sobre o mesmo, após secagem da matriz, a mistura é irradiada com laser.
A matriz absorve a luz do laser e ocorre a dessorção, juntamente com as
moléculas das proteínas, no processo de ganho de carga elétrica (ionização). Os
49
Material e Métodos
campos elétricos conduzem os íons para o tubo do espectrômetro de massa (tempo
de voo), que os separa de acordo com a sua relação massa/carga (m/z), e por fim, a
quantidade de cada íon é medida. A detecção é efetuada no fim do tubo de vácuo.
Os perfis de massas/carga obtidos são comparados com espectros de referência
contidos nos bancos de dados, através da criação de diversos algoritmos
pertencentes a cada sistema (Keys et al., 2004; Fenselau & Demirev, 2001; Demirev
et al., 1999 Krishnamurthy & Ross, 1996; Karas & Hillenkamp, 1988; Tanaka et al.,
1988).
O equipamento Microflex LT® MALDI-TOF adquire os espectros e o programa
BioTyper analisa no máximo 96 amostras por corrida e disponibiliza placas de metal
reutilizáveis, já o VITEK MS® analisa quatro placas descartáveis de 48 amostras
cada (172 amostras em uma única corrida), porém, devem ser analisadas de 16 em
16 ou os spots remanescentes serão inutilizados (Patel, 2013).
4.4.3.1
Identificação
(BioMérieux)
das
espécies
de
Enterococcus
por
Vitek
MS®
O sistema VITEK MS® recomenda a análise dos padrões de proteínas
detectados diretamente dos microrganismos, por isso, não foi realizada a extração
de proteínas conforme descrito anteriormente. apesar da possibilidade de analisar
até 172 amostras em uma única corrida, em cada dia do ensaio, foram analisadas
apenas 48 amostras em duplicata.
Deste modo, algumas colônias de cada microrganismo foram cuidadosamente
inoculadas diretamente no suporte descartável a fim de preencher toda a superfície
do spot, além disso, entre cada grupo de 16 amostras, foi inoculada também uma
cepa controle E. coli ATCC 25922 como calibrante. Após a secagem das amostras
e do calibrante à temperatura ambiente, adicionou-se 1 µL da matriz ácido α-ciano-4hidroxinâmico (HCCA 10mg/mL) (BioMérieux) sobre cada amostra. Os espectros de
massa gerados de acordo com o perfil proteico de cada amostra foram comparados
com uma série de espectros depositados no programa Saramis® (v.4.1.2) (Spectral
Archiving and Microbial Identification System, AnagnosTec, Postdam-Golm,
Alemanha, www.anagnostec.eu).
Para identificação das espécies, optamos pelo programa Saramis® que
permite identificação dos microrganismos, bem como avaliação de similaridade por
perfil proteico, diferentemente do programa Myla®, que apenas realiza a
50
Material e Métodos
identificação. Portanto, a identificação foi baseada na similaridade do espectro do
microrganismo testado com aquele de referência no banco de dados, denominado
de superespectro, que representa o espectro de picos conservados derivados de
múltiplos isolados de uma espécie ou grupo em particular. O superespectro exige
que pelo menos 75% dos picos correspondentes de uma amostra sejam
semelhantes em relação ao seu banco de dados para gerar um resultado de
identificação. O valor atribuído relaciona-se à especificidade destes para a espécie
ou gênero em questão. Estes valores de confiança variam de 0 a 100% (Patel,
2015).
Resultados acima de 90.1% são considerados confiáveis para a identificação
do gênero e da espécie; entre 80.1 – 90.0 identificação confiável para o gênero
bacteriano e, provavelmente, para a espécie; entre 75.0 e 80.0, identificação
provável somente do gênero. Os espectros foram analisados em um intervalo de
2.000 a 20.000 m/z, onde m representa a massa e z representa o número da carga
de íons Como controle da extração e da leitura das proteínas foi utilizada a cepa E.
coli DH5α como calibrante, conforme recomendação do fabricante. Além disso,
foram utilizadas como controles externos de identificação as cepas de E. faecalis
ATCC 29212, E. faecalis ATCC 51299 e E. faecium ATCC 700221 (Manual do
usuário VitekMS®; Patel et al., 2015).
4.4.3.2
Identificação das espécies de Enterococcus por Microflex LT®
MALDI-TOF BioTyper (Bruker Daltonics)
Para a leitura das massas das amostras bacterianas pelo equipamento
Microflex LT®, foi realizada a extração das proteínas ribossomais pelo método de
ácido fórmico/acetonitrila conforme recomendações do manual do equipamento.
Foram selecionadas de cinco a sete colônias bacterianas, as quais foram
ressuspensas em 300 μL de água destilada estéril em tubo de polipropileno de 1,5
mL. A esta mistura, foi adicionado 900 μL de etanol absoluto (Carlo Erba, Rodano,
Milão, Itália) e centrifugado por 2 minutos a 13.000 rotações por minuto (rpm). Após
a centrifugação, todo o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em
50 μL de ácido fórmico 70% (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Após vigorosa
agitação, 50 μL de acetonitrila pura (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) foram
adicionados e a solução foi novamente centrifugada por 2 minutos a 13.000 rpm
51
Material e Métodos
(Marko et. al, 2012). Em seguida, 1 µL do sobrenadante foi adicionado em placa de
aço inoxidável, própria para uso no equipamento.
Após a extração das proteínas ribossomais, cada amostra foi inoculada em
triplicata para a avaliação da reprodutibilidade da identificação bacteriana. Após a
secagem das amostras e do calibrante à temperatura ambiente, adicionou-se 1 µL
da matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA 10mg/mL) (Sigma Aldrich, St.
Louis, Missouri, EUA) sobre cada amostra.
O Microflex LT® MALDI-TOF BioTyper analisa no máximo 96 amostras por
corrida e disponibiliza placas de metal reutilizáveis. Deste modo, cada placa
continha 31 amostras em triplicata além do calibrante (em um spot). Posteriormente,
a placa foi introduzida no espectrômetro de massas Microflex LT® MALDI-TOF
BioTyper (Bruker Daltonics, Alemanha). Esse equipamento encontra-se alocado no
Departamento de Biofísica da UNIFESP. Os espectros de massa gerados de acordo
com o perfil proteico de cada amostra foram obtidos através do programa
FlexControl versão 3.3 em seguida os dados foram importados e comparados com
uma série de espectros depositados no banco de dados do programa BioTyper
MALDI OC 3.1 (Bruker Daltonics, Alemanha) para que a identificação da espécie
bacteriana fosse realizada.
Os critérios de identificação bacteriana utilizados são aqueles especificados
pelo próprio fabricante: scores ≥ 2.3 foram considerados confiáveis para a
identificação do gênero e da espécie; entre 2.0 e 2.2, identificação confiável para o
gênero bacteriano e, provavelmente, para a espécie; entre 1.7 e 1.9, identificação
provável somente do gênero, enquanto scores de identificação abaixo de 1,7 foram
considerados como não confiáveis (Quadro 1). Nesse estudo os scores ≥ a 2.0 foram
considerados confiáveis para identificação de espécie (Maldi BioTyper 3.1 OC, User
Manual). Os espectros foram analisados em um intervalo de 2.000 a 20.000 m/z.
Como controle da extração e da leitura das proteínas foram utilizadas as cepas E.
faecalis ATCC 29212 e E. coli ATCC 25922.
52
Material e Métodos
Quadro 1. Correlação do valor do score com a confiança na identificação de gênero e
espécie, segundo recomendações do manual do programa BioTyper MALDI 3.0.
Variação
do Score
2.300 – 3.000
Alta confiabilidade na identificação de espécie
2.000 – 2.299
Identificação do gênero confiável, identificação da espécie provável
1.700 – 1.999
Provável identificação do gênero
0.000 – 1.699
Identificação não realizada
Descrição
4.4.4 Identificação molecular
4.4.4.1
Multiplex PCR para identificação de espécie e genes van
Para confirmação da identificação das espécies e dos genes van (para
amostras que apresentaram resistência para pelo menos um dos glicopeptídeos
testados), foram realizados ensaios de PCR multiplex com o DNA genômico de
todas as amostras com posterior amplificação dos genes vanA, vanB, vanC1,
vanC2-C3, ddlE.faecalis e ddlE.faecium, segundo Dutka-Malen et al. (1995) com algumas
modificações: incluímos a pesquisa do gene 16S como controle de extração. A
pesquisa dos genes vanC1 e vanC2/C3 foi realizada apenas quando a PCR não
amplificou bandas para E. faecalis ou E. faecium. Os oligonucleotídeos utilizados
estão descritos no (Quadro 2).
Quadro 2. Oligonucleotídeos utilizados para determinação dos genes van e confirmação da
identificação de E. faecalis e E. faecium adaptado de Dutka-Malen et al. (1995).
Gene
Tamanho do
fragmento
16S
(8F/1493R)
1485
produto
de PCR
ddlE. faecalis
941
ddlE. faecium
550
vanA
732
vanB
635
vanC-1
822
vanC-2/C-3
439
Sequências (+ 5` - 3`)
Posição
+ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
- ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT
+ ATC AAG TAC AGT TAG TCT
- ACG ATT CAA AGC TAA CTG
+ TAG AGA CAT TGA ATA TGC C
- TCG AAT GTG CTA CAA TC
+ GGG AAA ACG ACA ATT GC
- GTA CAA TGC GGC CGT TA
+ ATG GGA AGC CGA TAG TC
- GAT TTC GTT CCT CGA CC
+ GGT ATC AAG GAA ACC TC
- CTT CCG CCA TCA TAG CT
+ CTC CTA CGA TTC TCT TG
- CGA GCA AGA CCT TTA AG
8 - 27
1493 - 1473
98 – 116
1038 – 1021
----175 – 191
907 – 891
173 – 189
807 – 791
246 – 272
1067 – 1051
455 – 486
885 – 869
Conteúdo
GC (%)
50
48
38
39
37
39
53
53
53
53
53
50
47
47
53
Material e Métodos
4.4.4.2
Extração do DNA genômico
O DNA genômico foi obtido pelo método de extração do fenol-clorofórmio,
utilizando Brazol® (LGC Biotecnologia Ltda.). Para tanto, 500µL do inóculo
bacteriano (ajustado à escala 1 de McFarland: cerca de 3 x 108 UFC/mL) foi
adicionado a um microtubo de 1,5mL e acrescido de 500µL de Brazol. A solução foi
homogeneizada por 5 segundos no agitador mecânico e em seguida, foram
adicionadas esferas de vidro de 0.5 mm de diâmetro. O conjunto foi submetido à
agitação por 10 minutos no desruptor de células Genie® (Scientific Industries, Inc EUA). Uma alíquota foi transferida para um novo tubo ao qual foram acrescentados
180 µL de clorofórmio gelado e a mistura homogeneizada por 5 segundos no
agitador. A solução foi centrifugada a 20.000 g por 12 minutos a 8oC. O
sobrenadante foi retirado, transferido para outro tubo contendo 500 µL de etanol
gelado, agitado por cerca de 5 segundos e centrifugado a 20.000g por 12 min a 8 oC.
Desta vez o sobrenadante foi desprezado e ao material precipitado foram
adicionados 500 µL de etanol gelado. O tubo foi novamente centrifugado a 20.000g
por 12 min a 8oC. O sobrenadante foi desprezado e o DNA precipitado foi deixado a
secar em temperatura ambiente até que todo etanol evaporasse. Posteriormente
foram adicionados 50 µL de água ultra pura (Invitrogen ®, Thermo Fisher Scientific
Inc.) e o tubo colocado a 65ºC por 30 minutos para eluição completa do DNA.
O DNA extraído, foi quantificado em espectrofotômetro (GeneQuantpro,
Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, Inglaterra) por verificação da absorbância
da Densidade Óptica (DO) em 260nm. Segundo Sambrook et al. (1989) a absorbância
igual a 1 contém uma concentração de 50 µg/mL de DNA de fita dupla. Também foi
medida a absorbância da DO em 280nm para detectar a presença de proteínas e
calcular a pureza do DNA. A razão entre as leituras DO260nm/DO280nm permite uma
estimativa da pureza do DNA, cujo ideal encontra-se entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de
1,6 indica grande quantidade de proteínas e contaminantes, e na sua ocorrência, a
extração foi realizada novamente.
4.4.4.3
Reação da PCR
Para cada reação da PCR foram adicionados em microtubos de 0,2 mL os
seguintes componentes: 10 µL da PCR Master Mix GoTaq® Green 2X (Promega,
54
Material e Métodos
Madison, WI, EUA): [Taq DNA polimerase 50 µg/mL em tampão com pH 8.5,
deoxinucleotídeos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 400 µM cada) e 3mM de MgCl2]; 0,5
µL de cada oligonucleotídeo a 20 µM (vanA F/R; vanB F/R; ddlE.
faecium
faecalis
F/R e ddlE.
F/R); 1 µL do DNA extraído [1pmoL] e 5 µL de água MiliQ estéril, obtendo um
volume final de 20 µL.
As amplificações foram realizadas em um termociclador MasterCycler
gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), sob as seguintes condições: Ciclo de
desnaturação inicial de 95°C por 10 minutos, seguido de 35 ciclos a 95°C 1 minuto
(desnaturação); 50°C 1 minuto (hibridização); 72°C 1 minuto (extensão). Para o
ciclo de extensão final, foi utilizada a temperatura de 72°C por 10 minutos. O
termociclador foi programado para manter as reações a 4°C até a sua retirada do
aparelho.
O perfil dos amplicons foi analisado por separação eletroforética em gel de
agarose (Ultra Pure Agarose-Invitrogen) na concentração de 1,0% (w/v). Um grama
de agarose foi dissolvido em 100 mL da solução tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) [90
mM Tris base; 90 mM ácido bórico; 2 mM EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético
bisódico)] 0,5X, fundido em microondas e acrescido de 4 µL de brometo de etídio 0,5
µg/mL (USB Corporation, Cleveland, EUA). A separação eletroforética foi realizada
com o gel imerso no tampão de corrida (TBE 0,5X), a 120 voltz x 90 mA durante 40
minutos. Foram adicionados 10 µL de cada produto de PCR nos orifícios do gel e
para estimativa do tamanho das bandas do produto amplificado (amplicom) utilizouse 6 µL do marcador de peso molecular de 100 pares de base (pb) (Invitrogen,
Carlsbad, Califórnia, EUA), corridos paralelamente às amostras.
O sistema de transiluminador de luz ultravioleta associado a uma câmera
fotográfica (UVP – BioDoc – it TM System) foi utilizado para captura das imagens que
foram utilizadas para análise dos fragmentos amplificados.
4.5
Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos
A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelo método de
microdiluição em caldo utilizando o sistema automatizado Phoenix® conforme
recomendações do documento M100-S25 do CLSI, além disso, a metodologia de
teste elipsométrico, Etest®, foi utilizada para avaliação das concentrações inibitórias
mínimas (CIM) de daptomicina, linezolida, teicoplanina e vancomicina, apenas para
55
Material e Métodos
os isolados que apresentaram resistência parcial ou total a quaisquer dos seguintes
antimicrobianos: glicopepitídio, linezolida e/ou daptomicina, pelo método Phoenix®.
Para controle da qualidade e confiabilidade dos resultados obtidos pelos testes de
sensibilidade, foram incluídas duas cepas conhecidas, E. faecalis ATCC 29212 e S.
aureus ATCC 25923 como microrganismos-controle, e os pontos de corte de
sensibilidade aos antimicrobianos utilizados conforme as orientações estabelecidas
pelo documento CLSI M100-S25, 2015 (Tabela 3).
Tabela 3. Pontos de corte de sensibilidade aos antimicrobianos
estabelecidos para Enterococcus spp. pelo CLSI, documento M100-S25
segundo tabelas 2D e 3I.
Antimicrobianos
Ampicilina
Daptomicina
Linezolida
Teicoplanina
Vancomicina
Categoria de sensibilidade (µg/mL)
Sensível
Intermediário
Resistente
≤8
--≥ 16
≤4
----≤ 500
--> 500
≤2
4
≥8
≤ 500
--≥ 1000
≤8
16
≥ 32
≤4
8 - 16
≥ 32
Para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos, foram avaliadas a
porcentagem de sensibilidade, e as concentrações inibitórias mínimas capazes de
inibir 50% e 90% da amostragem, respectivamente CIM50 e CIM90.
4.5.1 Microdiluição em caldo automatizada pelo sistema Phoenix®
O método Phoenix AST (Antimicrobial Susceptibility Test - teste de
sensibilidade) consiste em um teste de microdiluição em caldo. O sistema apresenta
85
cavidades
contendo
antimicrobianos
liofilizados
em
um
gradiente
de
concentração seriada. Para realizar a determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) utilizou-se um indicador de redox (resazurina, fornecido no kit) para
detectar o crescimento bacteriano na presença de um agente antimicrobiano. Para
determinar o crescimento bacteriano, utilizaram-se contínuas medições das
mudanças ocorridas no indicador, assim como a turbidez gerada pelo crescimento
do microrganismo.
O inóculo foi obtido através de solução salina (caldo ID Phoenix®) e ajustado
à escala 0,5 de McFarland. A inoculação é realizada com o painel inclinado e os
orifícios de inoculação (ID e AST) localizados na parte superior e os inóculos
56
Material e Métodos
específicos adicionados manualmente. O inóculo fluiu para baixo em forma de
espiral e preenche as cavidades do painel à medida que o líquido passa para a
almofada, onde o excesso é absorvido. As tampas são colocadas manualmente nos
orifícios de inoculação. Na linha divisória da tampa do painel existe uma abertura
que permite a entrada de ar, para garantir suficiente tensão de oxigênio no painel
durante a realização do teste.
Entre os antimicrobianos disponíveis no painel PMIC/ID105, avaliamos a
sensibilidade
frente
aos
seguintes:
ampicilina
(AM),
daptomicina
(DP),
estreptomicina sinergismo (STS), gentamicina Sinergismo (GMS), linezolida (LZ) e
vancomicina (VC), os intervalos das concentrações dos antimicrobianos podem ser
visualizados na Tabela 4.
4.5.2 Etest®
O inóculo foi preparado em solução salina e ajustado à escala 0,5 de
McFarland. As placas de Müeller-Hinton cátion-ajustado foram mantidas à
temperatura ambiente por 30 minutos antes do início do ensaio. Um volume de 100
µL referente a cada inóculo foi dispensado sobre a superfície do ágar e distribuído
de forma homogênea, em quatro direções diferentes, com auxílio de zaragatoa
alginatada. A seguir, as placas foram deixadas abertas, em fluxo laminar, por 15
minutos ao menos, para absorção do inóculo pelo ágar.
As fitas de Etest® de daptomicina (suplementada com cálcio diretamente
peloo fabricante), linezolida, teicoplanina e vancomicina (com gradiente de
concentração entre 0,016 a 256 µg/mL, Tabela 4), foram aplicadas no ágar
inoculado conforme orientações do fabricante (Etest® Guide, BioMérieux, EUA). As
placas foram incubadas em estufa a 35  2º C por 24 horas. A interpretação da CIM
foi realizada considerando a intersecção entre a fita de Etest® e a zona elíptica de
inibição de crescimento bacteriano. Quando a intersecção localizou-se entre duas
numerações, foi considerada a concentração acima da intersecção.
As CIMs de daptomicina e linezolida obtidas por Etest® foram comparadas
com aquelas obtidas pelo Phoenix®, apenas para os isolados que apresentaram-se
resistentes à vancomicina pelo Phoenix®.
57
Material e Métodos
Tabela 4. Intervalo das concentrações utilizadas por cada metodologia de teste de sensibilidade
aos antimicrobianos e pontos de corte esperados para cepas padrão ATCC de acordo com o
documento M100-S25, CLSI 2015.
Antimicrobianos/Metodologia
Phoenix
®
Ampicilina
Daptomicina
Linezolida
Vancomicina
E-test
®
Daptomicina
Linezolida
Teicoplanina
Vancomicina
4.6
Sigla
AM
DP
GMS
LZ
STS
VA
Sigla
DP
LZ
TC
VC
Intervalo
(µg/mL)
0.125 – 16
0.25 – 4
500
0.5 – 4
1000
0.5 – 32
Intervalo
(µg/mL)
0.016 - 256
0.016 - 256
0.016 - 256
0.016 - 256
Valor esperado da CIM (µg/mL)
S. aureus
ATCC – 29213
E. faecalis
ATCC – 29212
0.5 – 2
0.25 – 1
--1–4
--≤ 0.5 – 2
S. aureus
ATCC – 29213
0.25 - 1
1–4
0.25 - 1
≤ 0.5 – 2
0.5 – 2
1–4
≤ 500
1–4
≤ 1000
1–4
E. faecalis
ATCC – 29212
1-4
1–4
0.25 - 1
1–4
Tipagem molecular
Todos os 35 isolados ERVs, que apresentaram o gene vanA confirmado, foram
selecionados para realização da tipagem molecular pela técnica de PFGE como
triagem para a análise pelo MLST. Além disso, todos os 35 isolados também foram
submetidos à tipagem por espectrometria de massas de acordo com o perfil proteico
obtido pelos equipamentos Vitek MS® e Microflex LT®.
4.6.1 Gel de eletroforese em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis
- PFGE)
A análise do DNA cromossômico dos isolados de E. faecium e E. faecalis
resistentes à vancomicina foi realizada pela técnica de PFGE, que é amplamente
utilizada como método de tipagem epidemiológica, permitindo a análise de todo o
genoma da bactéria, possibilitando uma diferenciação das linhagens, muito aplicada
para análise de surtos (Homan et al. 2002).
Deste modo, o DNA cromossomal das amostras foi preparado em blocos de
agarose e clivados com a enzima endonuclease SmaI pelo método de Bannerman e
colaboradores (1995), e posteriormente submetidos à eletroforese em campo
pulsado. Tais etapas foram realizadas como se segue.
As amostras bacterianas foram subcultivadas em ágar sangue para a
obtenção de colônias puras e isoladas. Em seguida, cerca de quatro colônias de
cada amostra foram transferidas para um tubo contendo 4 mL de TSB, e incubadas
58
Material e Métodos
a 35ºC entre 18 e 24 horas até fase final de crescimento exponencial, determinado
pela DO de 0,7-0,9 em 620nm (CELM, E210D).
O caldo contendo as bactérias crescidas foi centrifugado a 15.000 rpm por 15
minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento resuspenso em 1 mL de
solução salina. A solução com as bactérias foi transferida para tubo de
microcentrífuga de 1,5 mL com peso previamente conhecido. O material foi
centrifugado a 15.000 rpm por aproximadamente 30 segundos e o sobrenadante
cuidadosamente aspirado e desprezado.
Para determinar a quantidade de bactérias o tubo contendo as bactérias
precipitadas foi pesado novamente. As bactérias foram ressuspensas em solução
salina na proporção de 1:1 (peso/volume). Em novo tubo, contendo 10µL da solução
1:1 da suspensão bacteriana foram adicionados 15µL de lisostafina diluída e 300µL
de solução tampão TEM (Tris 0,1M, pH 7,5, EDTA 0,1M, NaCl 0,1M). Essa solução
foi homogeneizada e misturada com 340µL de gel de agarose de baixo ponto de
fusão a 2%. Cerca de 100µL da solução resultante foi aplicada em formas para
formação de pequenos blocos. Após gelificar, os blocos de agarose, contendo o
DNA cromossomal, foram incubados por no mínimo cinco horas em solução EC (Tris
6mM, ph 7,5; NaCl 1M; EDTA 0,01M; Brij 58 0,5%; sarcosil 0,5%; desoxicolato 0,2%
e água destilada, contendo 200µL de lisozima) à 37oC e posteriormente, incubados
em 2mL de solução ES (EDTA 0,4M, pH 9,3, Sarcosil 1%) contendo 100µL de
proteinase K (20mg/mL, Sigma - P4914) por 12 horas.
Os blocos foram lavados várias vezes em solução tampão CHEF-TE (Tris
0,1M, pH 7,5, EDTA 0,1 M, pH 7,5) e armazenados nessa solução contendo 10U da
enzima de restrição Smal para cada amostra, permitindo a digestão do cromossomo
bacteriano. A digestão foi realizada entre 12 e 18 horas a uma temperatura de 25ºC.
Após a digestão, foi realizada a eletroforese em gel de agarose a 1,2% no sistema
CHEF-DR III (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). Como padrão de peso molecular
utilizou-se DNA concatenado do bacteriófago I (New England Biolabs, Beverly,
EUA).
A eletroforese foi realizada com corrente alternada de 5 a 60 segundos,
voltagem de 6 V/cm a 13oC por 23 horas. Os géis foram corados com brometo de
etídio (0,08 µL/mL) por uma hora, descorados em água bidestilada por mais uma
hora e fotografados sob luz ultravioleta.
59
Material e Métodos
Os perfis migratórios obtidos após a fotografia do gel foram analisados
visualmente seguindo os critérios de Tenover et al. (1995), onde amostras são
consideradas idênticas (mesmo clone) quando apresentam todas as bandas iguais;
amostras com até seis bandas devem ser consideradas um subtipo de um mesmo
clone, e amostras que apresentam sete ou mais bandas discordantes serão
consideradas amostras não relacionadas epidemiologicamente (Tenover et al., 1997,
Tenover et al.,1995).
Além da análise visual, os perfis de PFGE das amostras foram submetidos ao
programa de análise de géis BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) versão
7.5. Em todas as imagens, a definição de bandas foi realizada automaticamente pelo
programa e depois conferida visualmente. O coeficiente de similaridade de Dice foi
utilizado, e os dendrogramas foram construídos utilizando o algoritmo de análise
filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method Using Arithmetic Averages)
(Sader, Hollis & Pfaller, 1995; Sneath & Sokal, 1973). Os valores de otimização e
tolerância utilizados para o conjunto de isolados foram de 0,8 e 1,0%,
respectivamente. Isolados apresentando similaridade acima de 80% entre si foram
considerados pertencentes ao mesmo grupo (Strüelens et al., 1993; McDougal et al.,
2003).
4.6.2 Tipagem molecular por sequenciamento de múltiplos loci (Multilocus
Sequence Typing - MLST)
Entre os isolados de E. faecium e E. faecalis resistentes à vancomicina e
submetidos à análise do perfil eletroforético por PFGE, foram selecionadas amostras
representantes de cada perfil para tipagem molecular por MLST, em que, foi
selecionado um isolado de cada padrão de bandas diferentes, para isolados
pertencentes ao mesmo cluster, foi selecionado um isolado para clusters contendo
até quatro isolados. Para clusters
apresentando cinco ou mais isolados, foram
selecionados dois isolados, considerando o maior tempo de isolamento e centros
diferentes entre os isolados.
MLST é uma técnica altamente discriminatória na caracterização de isolados
bacterianos, com base em perfis alélicos gerados pela determinação da sequência
interna de fragmentos de sete genes conservados. Para cada fragmento de gene, as
diferentes sequências são designadas como alelos distintos, e cada isolado é
definido pelo conjunto dos sete alelos, criando, assim, o perfil alélico ou tipo de
60
Material e Métodos
sequência (sequence typing - ST). Uma vez que existem muitos alelos para cada um
dos sete loci, é improvável que tenham perfis idênticos alélicos por acaso, e isolados
com o mesmo perfil de alelos podem ser considerados membros de um mesmo
clone. As principais vantagens do MLST são a capacidade de comparar os
resultados obtidos em diferentes estudos via bases de dados informatizadas na
Internet permitindo o estudo de surtos hospitalares locais, bem como comparações
globais de microrganismos, além de epidemiologia a longo prazo entre diferentes
laboratórios em todo o mundo (Andrei & Zervos, 2006).
Cada um dos sete genes sequenciados foi comparado com o banco de dados
disponível em: http://efaecalis.mlst.net/ e http://efaecium.mlst.net/, conforme a
espécie, recebendo então um número correspondente a cada alelo (gene), gerando
um total de sete números. Com base nos sete números alélicas, cada isolado foi
atribuído a um ST específico também disponível no site.
4.6.2.1
Extração do DNA genômico por Qiamp DNA mini Kit
Para ter um DNA com a pureza desejada para a realização das reações de
MLST o DNA genômico das amostras bacterianas crescidas em ágar Columbia
contendo sangue de carneiro a 5% foi extraído utilizando-se o kit Qiamp DNA minikit (QIAGEN- Hamburg, Germany), conforme especificações do fabricante: em um
microtubo de 1,5mL contendo 50µL de proteinase K foram adicionados 500 µL do
inóculo bacteriano (escala 1 de McFarland, cerca de 3 x 108 UFC/mL). O material foi
homogeneizado em vórtex por cerca de 10 segundos, acrescido de 200µL do Buffer
AL, novamente homogeneizado em vórtex por 15 segundos e em seguida incubado
a 56ºC por 10 minutos, para possibilitar a ação da Proteinase K, para quebra da
parede de peptidoglicano. Após a incubação foram adicionados 500µL de etanol (96
- 100%) ao microtubo e o material foi homogeneizado no vórtex por 15 segundos.
Toda a solução foi transferida para uma coluna acoplada a um microtubo de 2 mL o
conjunto foi centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto. O material precipitado foi
descartado e a coluna, transferida para um tubo limpo, recebeu 750 µL do Buffer
AW. O conjunto foi centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto, o precipitado foi
descartado e a coluna transferida para novo microtubo limpo recebeu 750 µL do
Buffer AW2. O conjunto foi novamente centrifugado 8.000 x g por 3 minutos, o
precipitado descartado e a coluna transferida para outro microtubo limpo recebeu
61
Material e Métodos
50µL do Buffer AE para eluição do DNA. O tubo foi incubado a temperatura
ambiente 15 - 25ºC por 5 minutos, após esse tempo, o tubo foi centrifugado a 6.000
x g por 1 minuto e o DNA coletado.
O DNA extraído teve sua concentração definida por dosagem no
espectrofotômetro Nanodrop (Texas, EUA) sendo utilizado para cada reação apenas
20 ng/µL de DNA.
A tipagem molecular por MLST baseia-se no sequenciamento de sete genes
constitutivos (housekeeping) segundo os procedimentos descritos para E. faecalis
por Ruiz-Garbajosa
et
al.
(2006).
Para
E.
faecium foram
utilizadas as
recomendações de Homan, et al. (2002). A escolha dos genes conservados
utilizados no esquema de MLST está disponível no site: http://www.mlst.net/ e os
oligonucleotídeos utilizados para amplificação por PCR dos respectivos genes de
acordo com cada espécie podem ser visualizados no Quadro 3.
62
Material e Métodos
Quadro 3. Oligonucleotídeos utilizados para realização de MLST de E. faecalis e E. faecium.
Oligonucleotídeo
Sequencia (5’ – 3’)
Produto (pb)
gdh-1
GGCGCACTAAAAGATATGGT
530
gdh-2
CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA
gyd-1
CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC
395
gyd-2
CATTTCGTTGTCATACCAAGC
pstS-1
CGGAACAGGACTTTCGC
Cassete transportador de ATP fosfato
583
ligase
pstS-2
ATTTACATCACGTTCTACTTGC
gki-1
GATTTTGTGGGAATTGGTATGG
Glicose kinase
438
gki-2
ACCATTAAAGCAAAATGATCGC
aroE-1
TGGAAAACTTTACGGAGACAGC
Shikimato desidrogenase
459
aroE-2
GTCCTGTCCATTGTTCAAAAGC
xpt-1
AAAATGATGGCCGTGTATTAGG
Xantina fosforibosil transferase
456
xpt-2
AACGTCACCGTTCCTTCACTTA
yiqL-1
CAGCTTAAGTCAAGTAAGTGCCG
Acetil-CoA acetiltransferase
436
yiqL-2
GAATATCCCTTCTGCTTGTGCT
Enzima/Gene/E.faecium
Oligonucleotídeo*
Sequencia (5’ – 3’)
Produto (pb)
adk-1
TATGAACCTCATTTTAATGGG
437
adk-2
GTTGACTGCCAAACGATTTT
Adenilato kinase
adk-1n
GAACCTCATTTTAATGGGG
395
adk-2n
TGATGTTGATAGCCAGACG
atpA-1
CGGTTCATACGGAATGGCACA
556
atpA-2
AAGTTCACGATAAGCCACGG
ATP sintetase de cadeia alfa
atpA-1n
TTCAAATGGCTCATACGG
438
atpA-1n
AGTTCACGATAAGCAACAGC
ddl-1
GAGACATTGAATATGCCTTATG
D-alanina/D-alanina ligase
465
ddl-2
AAAAAGAAATCGCACCG
gdh-1
GGCGCACTAAAAGATATGGT
530
gdh-2
CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA
gyd-1
CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC
395
gyd-2
CATTTCGTTGTCATACCAAGC
purK-1
GCAGATTGGCACATTGAAAGT
purK-2
TACATAAATCCCGCCTGTTTC
Fosforibosil-aminoimazol carboxilase
492
purK-1n*
CAGATTGGCACATTGAAAG
purK-2n*
TTCATTCACATATAGCCCG
pstS-1
TTGAGCCAAGTCGAAGCTGGAG
Cassete transportador de ATP fosfato
pstS-2
CGTGATCACGTTCTACTTCC
583
ligase
pstS-1n*
TTGAGCCAAGTCGAAGC
*n=oligonucleotídeos alternativos, para otimizar a reação; Fonte: http://efaecium.mlst.net; http://efaecalis.mlst.net
Enzima/Gene/E.faecalis
As reações de PCR foram realizadas em volume final de 25µL contendo 12,5
µL de Master Mix 2X, 0,5 µL dos oligonucleotídeos senso e antisenso (10pmol/µL),
0,5 µL do DNA genômico (20 ng), e 10 µL de água miliQ autoclavada. As
amplificações foram realizadas em um termociclador MasterCycler Gradient
(Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), conforme as recomendações descritas no site
www.mlst.net. As condições de ciclagem estão descritas no Quadro 4.
63
Material e Métodos
Quadro 4. Condições de ciclagem para a reação de MLST para E. faecalis e E. faecium.
Etapas
E. faecalis
E. faecium
Temperatura ºC
Tempo
Temperatura ºC
Desnaturação inicial
94
5 min
95
Desnaturação
94
30 seg
94
35
Anelamento
52
30 seg
50
ciclos
Extensão
72
1 min
72
Extensão final
72
7 min
72
*min= minutos; seg= segundos. Fonte: http://efaecium.mlst.net; http://efaecalis.mlst.net
Tempo *
15 min
30 seg
30 seg
30 seg
5 min
A análise do produto de PCR para confirmação da qualidade dos amplicons
foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, preparado em TBE. Um
marcador de peso molecular de 1 Kb (Fermentas, EUA) foi utilizado como controle
do padrão de bandas. Os géis foram corados com brometo de etídio (0,08µL/mL) e
fotografados sob luz ultravioleta.
O produto de PCR foi diluído 1:10 em água destilada e as sequencias foram
determinadas utilizando o kit “ABI PRISM Big Dye Cycle Sequencing Ready
Reaction” (Perkin-Elmer, Applyed BioSystems), contendo os terminais fluorescentes
de BigDye e os oligonucleotídeos usados inicialmente na amplificação por PCR. As
reações foram realizadas utilizando-se 5 µL do produto de PCR diluído, 5 µL do
tampão de reação 5X, 1 µL de oligonucleotídeo senso ou antisenso (3,2 pmol/ µL) e
H2O destilada e autoclavada em quantidade suficiente para 20 µL. A mistura foi
submetida a uma ciclagem de 94C por 2 minutos seguida por 25 ciclos de: 96C por
10 segundos; 50C por 30 segundos e 60C por 4 minutos. Após o término da
ciclagem, o produto amplificado foi
precipitado com 80μL de isopropanol 75%
(temperatura ambiente), secado a 95ºC por 30 segundos, ressuspenso em 20µL de
formamida e aplicados em sequenciador ABI 3100 (Perkin-Elmer, Applyed
Biosystem).
As sequencias resultantes da amplificação dos sete genes conservados, de
cada clone inserido na pesquisa, foram analisadas utilizando as ferramentas de
alinhamento do programa DNAStar e comparadas com aquelas depositadas no
banco de dados do site MLST de E. faecalis (http://efaecalis.mlst.net) e E. faecium
(http://efaecium.mlst.net) a fim de se obter um conjunto de sete números, um para
cada gene estudado, e este conjunto de números foi representado por outro código
(também numérico) que se chama Tipo de Sequência (Sequence Type ou ST).
Desta forma, os alelos em cada um dos sete loci definiram o perfil alélico
correspondente, para cada isolado.
64
Material e Métodos
4.6.2.2
Análise do eBURST
A análise do eBurst permite verificar a distribuição dos STs e as origens e
relações dos complexos clonais e outros grupos.
O algoritmo eBURST identifica mutuamente os grupos exclusivos de
genótipos relacionados na amostragem [normalmente um tipo de sequencia múltipla
no banco de dados - MLST e em seguida identifica o genótipo (ST)] relacionando
com cada grupo fundador. O algoritmo então prevê a descendência do genótipo
fundador previsto para os outros genótipos do grupo, demonstrando o resultado
como um diagrama radial, onde o genótipo fundador fica localizado no centro do
diagrama. Esse procedimento foi desenvolvido para utilização com os dados
produzidos por MLST (ST e seus perfis alélicos). Para verificar a relação dos STs
encontrados neste estudo, utilizamos o programa eBurst v.3 E. faecalis Database e
eBurst v.3 E. faecium, disponível em: http://eburst.mlst.net. O eBurst utiliza os
seguintes critérios: sete loci por isolado; pelo menos seis loci idênticos para
definição do grupo, pelo menos três variações de loci para definição de subgrupo.
4.6.3 Tipagem por espectrometria de massas
Para avaliação da similaridade conforme o perfil de proteínas foi realizada
uma calibração externa em ambos os equipamentos, Vitek MS® e Microflex LT®,
utilizando a amostra padrão E. coli DH5α que apresenta os valores das suas massas
moleculares de proteínas ribossomais bem definidos, a saber: 4365,4; 5096,8;
5381,4; 6241,4; 6255,4; 6316,2; 6411,6; 6856,1; 7158,8; 7274,5; 7872,1; 9742,0 e
12227,3 Da.
4.6.3.1
Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a
laser - assistida por matriz (MALDI-TOF MS),
utilizando o
®
equipamento Vitek MS
Os espectros foram adquiridos no modo linear, com um retardamento de 104
ns e uma voltagem de aceleramento de +20 kV. Os espectros finais foram obtidos
pela soma de 20 tiros de laser acumulados por cada espectro parcial e 50 espectros
parciais produzidos por amostra, levando a um total de 1000 tiros por cada espectro
65
Material e Métodos
final. As listas dos picos foram comparadas no banco de dados Saramis®, gerando
um agrupamento estatístico baseado nas similaridades espectrais, para realização
de um dendrograma do tipo Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
(UPGMA), que evidencia o número de massas idênticas pelo Saramis.
O algoritmo UPGMA é um método de construção de árvore filogenética
baseado num agrupamento por aglomeração simples, que reflete a estrutura
presente em uma matriz de similaridade de pares (ou uma matriz de dissimilaridade).
Em cada passo, os dois aglomerados mais próximos são combinadas em um grupo.
A distância entre quaisquer dois grupos A e B é tomado como sendo a média de
todas as distâncias entre pares dos objetos " x " em A e de "y " em B , ou seja, a
distância média entre os elementos de cada conjunto (Sokal & Michener, 1958).
Os critérios utilizados foram: 0.08% de tolerância, intensidade absoluta ≥ 0,
intensidade relativa ≥ 0, 50 picos e massas entre 2.000 e 12.500 Da.
4.6.3.2
Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a
laser - assistida por matriz (MALDI-TOF), utilizando o equipamento
Microflex LT® BioTyper®
Os espectros gerados pelo Microflex LT® foram analisados no programa
BioTyper 3.1 OC e adquiridos no modo linear, com um retardamento de 200 ns e
uma voltagem de aceleramento de +20 kV. Os espectros finais foram obtidos pela
soma de 20 tiros de laser acumulados por cada espectro parcial e 50 espectros
parciais foram produzidos por amostra, levando a um total de 1000 tiros por cada
espectro final. As listas dos picos foram comparadas no banco de dados do
BioTyper Bruker 3.1 OC, gerando um agrupamento estatístico baseado nas
similaridades espectrais.
A tipagem através do perfil proteico foi realizada por dois programas
diferentes: BioTyper 3.1 OC e BioNumerics 7.5. Para o primeiro foram avaliadas as
seguintes condições: intensidade máxima 1 (influência 1) e intensidade mínima 0,05
(influência 0,5) e o número de picos (3, 5, 10, 30 e 50 picos). Além disso, o
dendrograma obtido pelo BioTyper 3.1 OC é do tipo Unsupervised Hierarchical
Cluster Analysis (UHCA), que utiliza como estratégia para o agrupamento
hierárquico aglomerativo ou divisório além da presença e ausência do pico a
intensidade dos mesmos, demonstrando o nível de distância entre os diferentes
perfis de massas encontrados.
66
Material e Métodos
O programa BioNumerics 7.5, foi utilizado para possibilitar a comparação do
padrão de similaridade obtido pela análise dos perfis proteicos gerados pelo
Microflex LT® com o método de PFGE, devido à possibilidade de construção de
dendrograma por porcentagem de similaridade. Deste modo, os perfis proteicos
também foram analisados a partir da construção de um dendrograma utilizando o
algoritmos UPGMA e método da variância de Ward (Ward, 1963) com o objetivo de
melhor agrupar os isolados semelhantes. Para tanto, o padrão de picos obtidos no
BioTyper 3.1 OC foi convertido em txt e importados para BioNumerics 7.5.
Para ambos os algoritmos, UPGMA e Ward, foram utilizados os parâmetros
padrão do programa, onde o valor de tolerância constante foi de 0,5 e tolerância
linear de 300ppm. Além disso, utilizou-se o coeficiente de similaridade de Dice (para
otimizar a comparação com o dendrograma obtido pelo PFGE). Um coeficiente de
similaridade acima de 80% foi selecionado para definição cada grupo de isolados.
Como os dendrogramas construídos a partir dos espectros obtidos pelo método de
MALDI-TOF MS com o algoritmo UPGMA considerando a intensidade dos picos, que
é uma variável inconstante, optou-se por realizar outro tipo de algoritmo a partir dos
mesmos perfis proteicos, o algoritmo de Ward.
Esse algoritmo realiza uma análise binária verificando apenas a presença ou
ausência dos principais picos, porém não leva em consideração a intensidade dos
mesmos. Isso elimina a interferência dessa variável no agrupamento dos isolados
uma vez que ocorre interferência significativa de acordo com o inóculo bacteriano,
concentração e volume da matriz utilizada e distribuição heterogênea desses nos
spots presentes nas placas de inox.
O método de Ward (1963) apresenta bons resultados tanto para distâncias
Euclidianas quanto para outras distâncias e procura por partições que miniminizem
a perda associada a cada agrupamento. Essa perda é quantificada pela diferença
entre a soma dos erros quadráticos de cada padrão e a média da partição em que
está contido.
O agrupamento pelo método de Ward foi feito a partir das somas de
quadrados dos desvios dos espectros das massas encontradas de cada isolados e a
partir do quadrado da distância euclidiana entre todos os espectros analizados,
considerando a equação:
67
Material e Métodos
p
SQDiiꞌ =
1
2
d2iiꞌ, em que:
SQDiiꞌ =
SQDj
iiꞌ
i
sendo SDQj(ii’), a soma dos quadrados dos desvios para a j-ésima variável
considerando os acessos i e i’. E,
p
d2iiꞌ
Yij − Yiꞌj
2
j=1
em que:
dii’2: quadrado da distância euclidiana entre os acessos i e i’;
p: número de caracteres avaliados;
Yij: a distância média entre caractere j para o caractere i.
A soma dos quadrados dos desvios total foi dada por:
1
g
i<
SQDTotal = g
g 2
iiꞌ diiꞌ ,
sendo g o número de isolados.
Nessa análise de agrupamento, identificou-se na matriz de quadrados das
distâncias euclidianas – dii’2 (ou na matriz de somas dos quadrados dos desvios –
SQDii’) o par de isolados que proporcionou menor soma dos desvios. Com esses
isolados agrupados, uma nova matriz de similaridade de dimensão inferior, foi
recalculada, considerando que:
SQD (ijklm) = 1/k d2 (ijklm)
onde k é o número de espectros dos grupos estudados, que variou em cada grupo
EFSRV/EFSSV/EFMRV e EFMSV.
d2(ijklm...) = d2ij + d2ik + d2il + d2im+ d2jk + d2jl + d2jm + d2kl ...
Como o Método de Ward (1963) baseia-se originalmente na distância
euclidiana:
𝑎−𝑏
2
=
𝑎𝑖 − 𝑏𝑖
2
𝑖
68
Material e Métodos
Neste estudo, utilizamos o algoritmo de Ward, no entanto, a similaridade entre
os isolados foi quantificada pelo coeficiente de Dice. Todos os cálculos foram
realizados automaticamente pelo programa BioNumerics 7.5.
Deste modo, avaliou-se a similaridade pelo padrão proteico dos isolados de
EFSRV, o mesmo foi realizado com os isolados de EFMRV. Foi gerado também um
dendrograma considerando apenas o padrão proteico produzido pelo MALDI-TOFe
um “pseudogel” referente ao padrão proteico respectivo entre os isolados de EFMRV
e EFSR. O BioNumerics 7.5 permite a construção de dendrograma considerando
mais de um método de tipagem ao mesmo tempo. Assim, foi construído um
dendrograma considerando o padrão dos espectros dos isolados de EFSRV e
EFMRV pelo MALDI-TOFe o padrão de bandas respectivo obtido no PFGE.
4.7
Análise estatística
O teste de Kappa foi utilizado para avaliar a concordância dos métodos
Phoenix®, Vitek MS® e Microflex LT® Bruker BioTyper com o método padrão (PCR),
na identificação das espécies dos isolados incluídos no estudo.
O teste de Kappa é um teste de concordância para 2 amostras de natureza
qualitativa (categorizadas) e deseja-se saber o grau de concordância ou
equivalência entre as 2 classificações (Pereira, 1995). Quanto maior o valor de K e
mais próximo de um melhor a concordância. O valor zero indica grau de
concordância igual ao acaso (Tabela 5).
Tabela 5. Critérios de concordância segundo os valores Kappa.
Critério
Concordância
<0,001
Ruim
0,001 a 0,20
Fraca
0,21 a 0,40
Sofrível
0,41 a 0,60
Regular
0,61 a 0,80
Boa
0,81 a 0,99
Ótima
1,00
Perfeita
Para verificar a relação entre os principais fatores associados à aquisição de
ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV ou EFMSV entre os pacientes incluídos no estudo
69
Material e Métodos
e a relação das espécies de Enterococcus spp. e a resistência desses à
vancomicina com a condição na alta foi utilizado o teste de Chi-quadrado (X2).
O teste de X2 é indicado para verificar as diferenças nas distribuições de uma
característica categorizada (2 ou mais categorias) em função de outra também
categorizada. Esse teste mede o grau de relacionamento entre as duas
características, em amostras independentes. Em alguns casos o teste de X 2 não
pode ser aplicado em função da baixa frequência observada em algumas
classificações (Siegel, 2006).
O teste de X2 deve ser utilizado quando o número de células (cruzamentos)
com frequência inferior a 5 não exceder a 20% do total de células. No caso
específico de tabelas 2 x 2, deve-se considerar o número de casos: para casuísticas
maiores ou iguais a 20 deve-se utilizar o teste X2 com correção de continuidade de
Yates. E para frequências menores que 20 deve-se utilizar o teste de Fisher (Siegel,
2006).
Quanto à relação entre os grupos EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV com a
idade dos pacientes incluídos no estudo, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis. Tratase de um teste não paramétrico e é indicado quando se quer comparar 3 ou mais
grupos de informações quantitativas de amostras independentes e não se deseja
assumir suposições acerca da distribuição das amostras analisadas. A interpretação
do valor de p é a mesma de outros testes estatísticos, ou seja, quando o valor de p
for ≤ 0,05, infere-se que há diferença significativa entre os grupos, para valores >
0,05 não existe relação significante (Siegel, 2006).
70
Resultados
5. RESULTADOS
71
Resultados
5.1
Amostras bacterianas
Durante o período de Junho de 2007 e Dezembro de 2011, foram incluídas
neste estudo 144 amostras de Enterococcus spp. Essas amostras foram enviadas
por 12 dos 16 centros médicos participantes do SCOPE ao centro coordenador, o
(LEMC) (Quadro 5).
Em 2008 foram enviadas o maior número de amostras n= 69, e os centros
que mais apresentaram infecções por Enterococcus spp. foram o centro 13 (34
casos), e os centos 1 e 7 (cada um com 31 casos). Duas amostras foram excluídas
deste estudo, por serem encaminhadas como sendo Enterococcus spp. entretanto,
após re-identificação, tratavam-se de outros gêneros (identificados pelo Phoenix® e
por MALDI-TOF MS, Microflex® LT e VitekMS).
5.2
Análise dos dados epidemiológicos
Quanto à distribuição de casos de infecções por Enterococcus spp. de acordo
com as regiões brasileiras, a região Sudeste apresentou o maior número de casos,
(n=68; 47,2%), seguido das regiões Centro-Oeste (n=36; 25%), Sul (n=31; 21,5%),
Nordeste (n=6; 4,2%) e Norte (n=3; 2,1%) (Quadro 5). Esse fato pode estar
relacionado com o maior número de Centros participantes do estudo estarem
localizados na região Sudeste.
72
Resultados
Quadro 5. Distribuição das amostras de Enterococcus spp. isoladas de ICS de pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil de acordo com o centro médico
e região geográfica onde foram isoladas.
Anos/Espécies
Centro
2007
2008
2009
2010
EFS
EFM
EFS
EFM
EFS
EFM
1
2
3
12
5
7
2
1
1
4
1
3
2
4
1
5
2
1
6
1
3
7
10
11
3
1
10
3
1
1
9
3
15
2
Total
19
5
24
EFS
Total
EFM
10
31
1
5
3
8*
9
1
10
Sudeste
3
4
7
(68) 47,2%
3
0
3
7
1
8
26
5
31
1
1
4
1
1
11
1
3
1
2
3
3
1
1
53
16
69
31
7
38*
(n) %
21
1
5
isolados
2
2
1
Região
EFM
1
1
Total de
EFS
1
12
12
EFM
3
1
13
EFS
2011
6
4
10
1
1
2
EFS = Enterococcus faecalis
EFM = Enterococcus faecium
* = + 1 isolado, que foi identificado como E. durans = único isolado dessa espécie no estudo foi enviado em 2009 pelo Centro 2
73
3
Sul
(31) 21,5%
Norte
(3) 2,1%
1
1
2
Centro-Oeste
26
8
34
(36) 25%
3
3
Nordeste
3
3
(6) 4,2%
110
33
143
144
144*
Resultados
Entre os 144 casos de ICS por Enterococcus spp., foi possível avaliar 118
fichas clínicas, já que 26 amostras foram enviadas sem os dados clínicos. Dessas
118 fichas clínicas analisadas, pode-se observar que a mediana de idade foi de 58
anos, houve um predomínio do sexo masculino 63/118 (53,4% dos casos).
Entre as doenças de bases mais frequentemente informadas nas fichas
clínicas dos pacientes portadores de ICS pelos Enterococcus spp. incluídos no
estudo, podem-se destacar: neoplasias (25,4%), doenças renais (26%), respiratórias
(15%) e cardiovasculares (13%). Quanto aos fatores associados a ICS, os mais
encontrados foram cateter venoso em posição central (78%), cateter vesical (56%),
ventilação mecânica (52%) e diálise peritoneal (20%).
Quanto à fonte da bacteremia, a grande maioria, 92/118 pacientes (78%), foi
proveniente de infecção primária associada à utilização de cateter venoso central,
seguido por trato respiratório inferior com 16/118 casos (13,5%) e trato urinário
10/118 casos (8,5%). Sobre os fatores de risco avaliados nas fichas clínicas, o mais
frequente foi cateter venoso central que ocorreu em 92/118 pacientes (78%),
seguido de internação em UTI, 62/118 pacientes (52,5%), cateter vesical em 56/118
(47,5%), e ventilação mecânica em 52/118 (44%) dos pacientes. Quanto à
mortalidade, houve 62/118 (52,5%) óbitos , dos quais 63% (n=39) dos pacientes que
estavam internados na UTI foram a óbito, contra 41,1% (n=23) que não estavam
internados na UTI (Tabela 6).
74
Resultados
Tabela 6. Dados demográficos dos pacientes e dos principais fatores de risco geralmente
associados ao desenvolvimento de ICS por Enterococcus spp. apresentados pelos pacientes
incluídos no Projeto SCOPE Brasil.
Parâmetros
Nº
(%)
Dados demográficos dos pacientes
Idade (mediana)
58
---
Masculino
63
53,4
Internação em UTI
62
52,5
Infecção monomicrobiana
109
92,4
Doença de base
Neoplasias
30
25,4
Renal
26
22
Respiratória
15
12,7
Cardiovascular
13
11
Trauma
11
9,3
Neurológica
10
8,5
Gastrintestinal
7
5,9
Potenciais fatores associados
Cateter venoso central
92
78
Cateter vesical
56
47,4
Ventilação mecânica
52
44,1
Diálise peritoneal
20
16,9
NPP
7
5,9
Acesso arterial
5
4,2
Neutrófilos <1000
3
2,5
Fonte de bacteremia primária
92
78
Mortalidade
UTI
39
63
Não-UTI
23
41,1
Mortalidade geral
62
52,5
5.3
Análise dos dados microbiológicos
5.3.1 Identificação dos isolados e concordância entre o Phoenix®, o Vitek MS®
e o Microflex LT® com a identificação molecular
Todas os 144 isolados encaminhados foram re-identificados pelo sistema
automatizado Phoenix®, com auxílio do Painel PMIC/ID 105. Além disso, foram
utilizadas duas plataformas de identificação por Espectrometria de Massas (MALDITOF MS) como o VITEK MS® e o Microflex LT®. Todas as metodologias foram
capazes de identificar todas as amostras incluídas no estudo. Entretanto, vale
ressaltar que a identificação final foi baseada na PCR. Deste modo, analisando as
identificações obtidas pela técnica de PCR com oligonucleotídeos específicos, E.
75
Resultados
faecalis foi a espécie mais prevalente 110 amostras (76,2%) seguido de E. faecium
com 33 amostras (23,1%) e apenas uma amostra foi identificada como E. durans
(0,7%) (Figura 4). A identificação do E. durans foi obtida através do sistema
Phoenix® e confirmada pela técnica de MALDI-TOF MS.
1
(0,7%)
33
(22,9%)
E. faecalis
110
E. faecium
(76,4%)
E. durans
Figura 4. Distribuição das espécies de Enterococcus isolados de ICS do Projeto SCOPE e
identificadas por PCR e MALDI-TOF MS.
As identificações fenotípica (Phoenix®) e por espectrometria de massas (Vitek
MS® e Microflex LT®) foram comparadas com a genotípica (PCR) para as espécies
E. faecalis e E. faecium (Tabela 7). Vale lembrar que a única espécie de E. durans
incluída no estudo foi identificada pelo Phoenix® e por MALDI-TOF MS, onde todas
as metodologias foram consistentes.
Tabela 7. Concordância entre as identificações dos isolados de E. faecalis e E. faecium, incluídas no
®
®
®
Projeto SCOPE Brasil, obtidas pelos métodos Phoenix , Vitek MS , Microflex LT com relação ao
método de referência (PCR).
PCR
Metodologias
Phoenix®
Vitek MS
®
Microflex LT®
E. faecalis
%
N
E. faecium
N
%
Total
N
%
E. faecalis
E. faecium
109
76,2
3
2,1
112
78,3
1
0,7
30
21,0
31
21,7
Total
110
76,9
33
23,1
143
100,0
E. faecalis
108
75,5
2
1,4
110
76,9
E. faecium
2
1,4
31
21,7
33
23,1
Total
110
76,9
33
23,1
143
100,0
E. faecalis
110
76,9
0
0,0
110
76,9
E. faecium
0
0,0
33
23,1
33
23,1
110
76,9
33
23,1
143
100,0
Total
Teste de Kappa
[K] ; (p)
[0,920] ; <0.001
[0,921] ; <0.001
[1,000] ; <0.001
Resultado
Concordantes
Concordantes
Concordantes
76
Resultados
Considerando o valor de k, todos os métodos de identificação demonstraram
ótimo nível de concordância. Entretanto, o método Microflex LT® apresentou-se
superior aos outros, com uma concordância perfeita (K=1,000), onde todos os
isolados identificados apresentaram score ≥ 2.0, dos quais, 123 (85,4%) isolados
apresentaram score superior a 2.3 e apenas 21 (14,6%) isolados apresentaram
score entre 2.0 e 2.29. Entretanto, mesmo os isolados com score inferior a 2.3, a
concordância foi de 100% com a identificação molecular. Enquanto que, Phoenix® e
Vitek MS® foram considerados equivalentes e apresentaram uma concordância
ótima, com valores de k respectivamente 0,920 e 0,921.
Todos os quatro isolados que apresnetaram incongruência na identificação
pelo Phoenix® comparando com a identificação molecular pela PCR apresentaram
valores de confiança de 99%. Entre os quatro isolados com erro da identificação da
espécie identificados pelo Vitek MS®, um apresentou 88,7% e os outros três
apresentaram 99,9% de confiança. Sendo que os isolados com incongruência na
identificação por esses dois métodos (Phoenix® e Vitek MS®) tratavam-se de
isolados diferentes.
5.3.2 Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos pelos métodos de
microdiluição em caldo automatizado (Phoenix®) e Etest®
O teste de sensibilidade quantitativo foi realizado pelo sistema Phoenix® para
todos as amostras de Enterococcus spp. (n=144) e interpretados conforme os
pontos de corte estabelecidos pelo CLSI, documento M100-S25. Assim, é possível
observar na Tabela 8 abaixo, o perfil de sensibilidade, a CIM50 e CIM90 das amostras
em geral, e também distribuídas conforme as duas espécies mais prevalentes, E.
faecalis e E. faecium.
Deste modo, 100% das amostras foram sensíveis à daptomicina, como
esperado, 98,2% dos E. faecalis foram sensíveis a ampicilina, contra 6,1% dos E.
faecium. Quanto aos aminoglicosídeos, gentamicina-sinergismo e estreptomicinasinergismo, foi possível observar maior sensibilidade de E. faecium à gentamicinasin (90%) contra 57,6% de sensibilidade para os E. faecalis, enquanto que E.
faecalis apresentou maior sensibilidade à estreptomicina-sin 58,3% quando
comparado com E. faecium com 27,3 % de sensibilidade.
Em
relação
à
linezolida,
quatro
amostras
apresentaram
resistência
intermediária pelo método Phoenix®, com CIM de 4µg/mL, sendo três E.faecalis e
77
Resultados
um E. faecium, ou seja, as sensibilidades à linezolida de E. faecalis e E. faecium
foram respectivamente de 98,2% e 97%. Apenas 39,4% (n = 13) dos E. faecium e
86,4% (n = 95) dos E. faecalis foram sensíveis à vancomicina (Tabela 8).
®
Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, obtido pelo sistema Phoenix , dos 144 isolados
de Enterococcus spp. incluídas no Projeto SCOPE Brasil.
Enterococcus spp. (n=144)*
Antimicrobianos
(Phoenix®)
CIM (µg/mL)
a
CIM50
CIM90
2
>16
Estreptomicina SIN
<500
Gentamicina SIN
E. faecalis (n= 110)
a
S (%)b
CIM (µg/mL)
CIM50
CIM90
77,1
2
4
>500
58,3
≤1000
<500
>500
57,6
Daptomicina
2
4
Linezolida**
2
Vancomicina
1
Ampicilina
S (%)b
E. faecium (n=33)
CIM (µg/mL)a
S (%)b
CIM50
CIM90
98,2
>16
>16
6,1
>1000
66,4
>1000
>1000
27,3
>500
>500
47,3
≤500
≤500
90
100
2
4
100
2
4
100
2
97,9
2
2
98,2
2
2
97
>32
75,7
1
>32
86,4
>32
>32
39,4
* Inclui 1 isolado de E. durans. a) CIM = concentração inibitória mínima (CIM50 e CIM90, é aquela capaz de inibir,
respectivamente 50 e 90% da amostragem); b) S = porcentagem de sensibilidade. **Antes da confirmação da CIM, realizada
por Etest®.
Foi realizada a confirmação da CIM para linezolida dos quatro isolados que
apresentaram resistência intermediária com CIM de 4µg/mL pelo Phoenix®. A CIM
de linezolida obtida utilizando o Etest® foi de 2µg/mL para as quatro amostras, sendo
consideradas sensíveis. Todas as amostras que apresentaram resistência à
Vancomicina foram submetidas ao Etest® para daptomicina, linezolida, teicoplanina
e vancomicina. A Tabela 9 demonstra o perfil de sensibilidade das amostras de E.
faecalis e E. faecium que apresentaram resistência à vancomicina pelo método
Phoenix®.
78
Resultados
Tabela 9. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados de E. faecalis e E.
faecium, incluídos no Projeto SCOPE Brasil, e que apresentaram resistência à
®
®
vancomicina pelas metodologias, Phoenix e Etest .
EFSRV* (n= 15)
Antimicrobianos
CIM (µg/mL)a
CIM50
EFMRV** (n=20)
S (%)b
CIM90
CIM (µg/mL)a
CIM50
CIM90
S (%)b
Phoenix®
Daptomicina
2
2
100
2
4
100
Linezolida
1
2
100
2
2
100
>32
>32
0
>32
>32
0
Vancomicina
®
Etest
Daptomicina
0,25
0,38
100
1,5
2
100
Linezolida
1,5
2
100
2
2
100
Teicoplanina
48
>256
0
64
>256
0
Vancomicina
>256
>256
0
>256
>256
0
* EFSRV = E. faecalis resistente à vancomicina; ** EFMRV= E. faecium resistente à vancomicina; a)
CIM = concentração inibitória mínima (CIM50 e CIM90, é aquela capaz de inibir, respectivamente 50 e
90% da amostragem); b) S = porcentagem de sensibilidade.
Todas as 35 amostras de Enterococcus spp. (15 E. faecalis e 20 E. faecium)
que foram resistentes à vancomicina tiveram sua resistência confirmada pelo Etest®
com CIM > 256 µg/mL para vancomicina acima de 32 µg/mL para teicoplanina.
Todas as amostras foram sensíveis a daptomicina e linezolida pelo Etest®. Entre os
ERV, E. faecalis apresentou apenas 6,7% de sensibilidade à gentamicina-sin contra
100% de sensibilidade para os E. faecium. Devido a algumas discrepâncias entre as
CIMs obtidas para linezolida entre os métodos Phoenix® e Etest® o que levou a
mudança de categoria de sensibilidade de intermediário utilizando o sistema
Phoenix®, para sensível segundo o Etest®, e para verificar comparar as CIMs obtidas
para daptomicina, optou-se por avaliar a concordância entre ambos os métodos
frente a esses dois antimicrobianos. De acordo os resultados demonstrados na
Figura 5, é possível observar baixa concordância entre ambos os métodos para
ambos antimicrobianos, com diferenças de até duas diluições.
79
Resultados
Linezolida
Daptomicina
Figura 5. Regressão linear das CIMs de linezolida (A) e daptomicina (B), para os 35
®
isolados de EFSRV e EFMRV, obtidas por Etest e microdiluição em caldo sistema
®
Phoenix . As áreas azuis indicam as CIMs dentro da categoria Sensível, de acordo com os
pontos de corte estabelecido pelo CLSI M100-S25.
5.3.3 Detecção do mecanismo de resistência à Vancomicina
Todos os 35 isolados de ERV com CIMs confirmadas por Etest®,
apresentaram o gene vanA positivo pela técnica de PCR convencional. Ou seja,
24,3% dos isolados incluídos no estudo apresentaram o gene vanA. Dos quais,
15/110 (13,6%) foram E. faecalis e 20/33 (60,6%) foram E. faecium (Figura 6). Todas
essas amostras positivas para o gene vanA foram submetidas à tipagem molecular.
80
Resultados
(9,1%)
(57,1%)
(24,5%)
(42,9%)
EFSSV = Enterococcus faecalis sensível à vancomicina; EFMSV = Enterococcus faecium sensível à vancomicina; EFMRV =
Enterococcus faecium resistente à vancomicina; EFSRV = Enterococcus faecalis resistente à vancomicina.
Figura 6. Distribuição dos 144 isolados de Enterococcus spp., incluídos no Projeto SCOPE Brasil, de
acordo com a espécie e a resistência à vancomicina.
5.3.4 Tipagem Molecular das Amostras de ERV
5.3.4.1
Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (Pulsed Field Gel
Electrophoresis - PFGE) e Sequenciamento de Múltiplos Locus
(Multilocus Sequence Typing - MLST)
Foi possível realizar a tipagem de todos os 35 isolados de ERV, dos quais 15
eram E. faecalis e 20 eram E. faecium. E a análise do perfil de bandas obtido foi
realizada conforme os critérios de Tenover et al. (1995) e pelo programa
BioNumerics versão 7.5 (Applied Maths Kortrijk, Belgium).

E. faecalis. A Figura 7 demonstra o dendrograma obtido por PFGE para os
15 EFSRV após análise no BioNumerics 7.5, onde é possível observar dois
diferentes grupos, um com 94,2% de similaridade contendo sete isolados, todos
pertencentes ao centro 01. E o outro com 93,9% de similaridade contendo quatro
isolados pertencentes aos centros: 01, 02 e 03, todos localizados no estado de São
Paulo. Também é possível observar os padrões eletroforéticos analisados
81
Resultados
visualmente segundo os critérios de Tenover et al., 1995, onde foram encontrados
cinco padrões: A, B,C,D e E. O padrão C foi o mais frequente contendo sete isolados
todos pertencentes ao centro 1 e classificados como sendo do mesmo grupo pela
análise feita no BioNumerics 7.5, onde a similaridade entre todas as amostras desse
grupo foi de 94,2%, além disso, as duas amostras desse grupo que foram
submetidas ao MLST apresentaram mesmo ST (526), evidenciando uma
similaridade genética pelas duas metodologias PFGE (tanto pela análise do
BioNumerics 7.5, quanto pela análise visual segundo Tenover et al. (1995) quanto
pela técnica de MLST). Seguido do padrão B contendo quatro isolados, o padrão D
apresentou dois subtipos D1 (um isolado) e D2 (um isolado) o padrão A foi
observado em apenas um isolado.
Após a análise da técnica de PFGE, sete isolados foram selecionados para
pesquisa do ST pela técnica de MLST. Os STs encontrados foram: 09, 103, 525 e
526. É possível observar que o ST 526 foi encontrado entre isolados pertencentes a
diferentes grupos do PFGE, onde dois deles apresentaram similaridade de 43,9%
(amostras: A35797 e A51376).
82
Resultados
Figura 7. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5 após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFSRV, contendo o ST e
perfil de sensibilidade aos antimicrobianos.
83
Resultados

E. faecium. A Figura 8 demonstra o dendrograma obtido da mesma forma
que foi realizado para E. faecalis. O padrão de PFGE analisada pelo BioNumerics
7.5 gerou três diferentes grupos, o maior contendo 10 isolados com 82,4% de
similaridade, o segundo com quatro isolados com 83,4% e o terceiro grupo
composto por apenas dois isolados com 86,7% de similaridade. Quatro isolados não
foram agrupados em nenhum grupo. Entre os isolados de E. faecium houve uma
maior variedade no padrão de bandas na maioria dos isolados, com apenas dois
isolados com padrão de bandas idênticos (34632 e 36611). Os centros médicos que
enviaram isolados de EFMRV estão localizados em SP, GO, RS e também DF.
Quanto aos padrões eletroforéticos, foram encontrados seis padrões: A, B, C,
D, E e F. O padrão mais frequente foi o A, contendo 10 isolados e 10 subtipos,
presentes no mesmo grupo do dendrograma obtido pela análise no BioNumerics 7.5,
com 82,4% de similaridade dentro desse grupo. O padrão D foi o segundo mais
frequente com 6 isolados e 5 subtipos diferentes, já os padrões B,C, E e F foram
representados por apenas um isolado cada.
Após a análise da técnica de PFGE, 15 isolados foram selecionados para
pesquisa do ST pela técnica de MLST. E os STs encontrados foram: 18, 412, 478, e
896. Sendo o ST 412 o mais frequentemente encontrado (11 isolados, presentes nos
grupos A, D, E e F) pertencentes aos três diferentes grupos obtido pela análise no
BioNumerics 7.5 e presentes nos centros 1, 6, 7, 12 e 13. Assim como ocorrido para
E. faecalis, foi possível observar que o ST 412 foi encontrado entre isolados
pertencentes a diferentes grupos do PFGE, onde dois deles apresentaram
similaridade de 56,2% (amostras: A36790 e A46.755, p.ex.).
84
Resultados
Figura 8. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5 após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFMRV,
contendo o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
85
Resultados
5.3.4.2
Análise do eBURST obtido por Sequenciamento de Múltiplos Loci
(Multilocus Sequence Typing - MLST)
Os isolados de EFSRV submetidos à técnica de MLST apresentaram quatro
diferentes STs: 9, 103, 525 e 526. O ST526 foi o mais encontrado no nosso estudo,
representado por três isolados, esse ST trata-se de um subgrupo do complexo clonal
(CC) 6. O segundo ST mais encontrado no nosso estudo foi o ST103 (presente em
dois isolados). Os STs 9 e 525 foram encontrados em apenas um isolado cada.
Entretanto, o ST9 é um complexo clonal fundador, apresentando oito (08)
subgrupos, enquanto que o ST525 é um singleton, ou seja, apresenta uma variação
muito grande quando comparados com todos os outros STs e ainda não foi
vinculado a nenhum complexo clonal, devido ao seu grau de variação nos loci (RuizGarbajosa et al., 2006). O eBURST, que contém todos os STs de E. faecalis e os
STs encontrados nesse estudo podem ser visualizados na Figura 9.
Quantos aos EFMRV, observamos também a presença de quatro STs: 18,
412, 478 e 896. No entanto, o ST412 foi o mais encontrado, presente em 11
isolados, esse ST é um subgrupo fundador derivado do maior complexo clonal de E.
faecium o CC17. O ST478 foi observado em dois isolados do nosso estudo, esse ST
é derivado do subgrupo 412. O ST18 e o ST896 foram encontrados em apenas um
isolado cada. O ST18 é um grande subgrupo fundador, contendo mais de 500 STs
derivados dele. Enquanto que ST896 é um singleton e foi classificado muito
recentemente, por isso ainda não é possível localizá-lo no eBURST contendo os STs
totais. O eBURST dos E. faecium do nosso estudo pode ser visualizado na Figura 10
abaixo.
86
Resultados
Figura 9. eBURST de E. faecalis baseado nos STs totais representados pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecalis MLST, incluíndo os
STs dos isolados de EFSRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à técnica de MLST (http://efaecalis.mlst.net).
87
Resultados
478 412
18
Figura 10. eBURST de E. faecium baseado nos STs representados pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecium MLST, incluíndo os STs
dos isolados de EFMRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à técnica de MLST (http://efaecium.mlst.net).
88
Resultados
5.3.4.3
Tipagem por Espectrometria de Massas
Neste estudo investigamos a acurácia dos equipamentos de Espectrometria
de Massas Vitek MS® e Microflex LT® para realizar a tipagem de EFSRV (n=15) e
EFMRV (n=20) e correlacionamos com a tipagem obtida pelas técnicas de PFGE e
MLST. Além disso, avaliamos a acurácia do Microflex LT ® para diferenciação entre
os EFSSV de EFSRV e EFMSV de EFMRV.
5.3.4.3.1 Tipagem de Enterococcus spp. por Vitek MS®
O dendrograma obtido após análise no software Saramis® é do tipo UPGMA e
analisa o número de massas idênticas. No entanto, não foi possível realizar nenhum
correlação com os dados da similaridade obtida pela técnica de PFGE, tanto com
relação aos critérios de Tenover et al., (1995) quanto em relação aos dados obtidos
pelo BioNumerics 7.5, também não foi possível observar uma correlação com os
STs obtidos pela técnica de MLST. O perfil de similaridade de acordo com o número
de massas idênticas de EFSRV pode ser visualizado na Figura 11A, onde é possível
observar dois diferentes grupos, um contendo 11 isolados (onde cinco apresentaram
mais que 80 massas idênticas) e outro contendo quatro isolados com mais de 50
massas idênticas em cada grupo.
O dendrograma obtido com relação as massas idênticas de EFMRV não
evidencia a separação em grupos, onde todos os isolados apresentaram acima de
40 massas idênticas, apenas 9 isolados apresentaram acima de 80 massas
idênticas, como demonstrado na Figura 11B.
89
Resultados
A
B
®
Figura 11. Dendrograma dos espectros de massas dos 35 ERV, obtido pelo Vitek MS ,
incluindo a tipagem por PFGE e MLST (A- E. faecalis e B- E. faecium).
90
Resultados
5.3.4.3.2 Tipagem de Enterococcus spp. por Microflex LT®
A tipagem através do perfil proteico obtido pelo Microflex LT® foi realizada por
dois programa diferentes: BioTyper 3.1 OC e BioNumerics 7.5.

BioTyper 3.1 OC
Os dendrograma UHCA obtido com auxílio do programa BioTyper 3.1 OC
demonstram o nível de distância entre os perfis proteicos encontrados entre os
isolados de EFSRV (Figura 12A, 12B, 13A e 113B) e EFMRV avaliados (Figura 15A,
15B, 16A e 16B). Além disso, o programa permitiu gerar um “pseudogel” contendo
perfis proteicos apresentados em bandas, conforme as Figuras 14 e 17,
respectivamente EFSRV e EFMRV.
Para E. faecalis, é possível observar que nos quatro dendrogramas,
considerando 5, 10, 30 e 50 picos (Figuras 12A, 12B, 13A e 13B respectivamente),
as amostras foram separadas em dois diferentes grupos maiores um com distância
espectral de 0.8 e outro com 1.0 em todos os quatro dendrogramas. No entanto,
houve uma migração dos isolados de acordo com os picos, gerando padrões de
similaridade completamente diferentes, mesmo para os isolados pertencentes a
padrões idênticos de PFGE e mesmo ST. Além disso, alguns
isolados foram
migrados para grupos diferentes de acordo com o número de picos, p. ex.: 34501
(pertencente ao grupo identificado em azul, no dendrograma considerando 5 picos,
Figura 12A, passou para o grupo em vermelho quando foram considerados os 10
principais
picos,
Figura
12B),
modificando
o
padrão
de
similaridade
consideravelmente. Assim, não foi possível observar uma concordância significativa
entre a similaridade obtida com os diferentes picos com a similaridade obtida pelo
PFGE (Figura 7).
Quanto ao “pseudogel” (Figura 14), é possível observar uma diferença na
intensidade dos picos encontrados (representados em bandas), com algumas
características semelhantes entre alguns isolados, como um pico de cerca de
4.200Da presente em todos os isolados. Também é possível observar que os
isolados 34812 e 34501 apresentam um pico de pouco menos de 4.800 Da (com
diferença na intensidade).
91
Resultados
A
B
Figura 12. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV obtido
através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com 10 picos de proteínas e tipagem por PFGE e MLST.
92
Resultados
A
B
Figura 13. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV obtido
através do programa BioTyper 3.1 OC dos isolados de EFSRV. A – com 30 picos e B com 50 picos e tipagem por PFGE e MLST.
93
Resultados
Figura 14. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV, obtido pelo programa BioTyper 3.1 OC.
94
Resultados
Entre os isolados de E. faecium, é possível observar que nos quatro
dendrogramas, considerando 5, 10, 30 e 50 picos (Figuras 15A, 15B, 16A e 16B
respectivamente), as amostras também foram separadas em dois diferentes grupos
maiores, ambos com distância espectral acima de 1.0. É possível observar também
que o isolado 34.632 migrou de grupo de similaridade quando comparado o
dendrograma
considerando
5
picos
(Figura
15A)
com
os
dendrogramas
considerando 10, 30 e 50 picos (Figuras 15B, 16A e 16B respectivamente). Também
foi possível observar uma maior consistência entre as similaridades avaliadas com
10, 30 e 50 picos, mesmo existindo algumas diferenças na distância espectral de
alguns isolados quando houve a mudança do número de picos. Entretanto, assim
como os isolados de EFSRV, não é possível estabelecer uma correlação segura
com o padrão de similaridade obtido por PFGE (Figura 8). Esse resultado concorda
com a literatura em que demonstraram que o MALDI-TOF MS não é uma boa
ferramenta para se analisar similaridade genética, utilizando a análise por
dendrograma UHCA (Lash et al., 2014).
Quanto ao “pseudogel” (Figura 17), é possível observar uma grande
diversidade no padrão de picos (dispostos em bandas) também com diferença na
intensidade dos mesmos.
95
Resultados
A
B
Figura 15. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV
obtido através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com 10 picos e tipagem por PFGE e MLST.
96
Resultados
A
B
Figura 16. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV obtido
através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 30 picos e B com 50 picos e tipagem por PFGE e MLST.
97
Resultados
Figura 17. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV, obtido pelo programa BioTyper 3.1 OC.
98
Resultados

BioNumerics 7.5
Inicialmente, analisou-se o espectros dos isolados de EFSRV (Figura 18) e
EFMRV (Figura 19) utilizando o algoritmo UPGMA. No entanto, é possível observar
que isolados apresentando padrões espectrais diferentes foram considerados
idênticos. Deste modo, modificou-se o algoritmo para construção do dendrograma,
para Variação Mínima de Ward, que desconsidera a intensidade dos picos.
Para cada análise construindo dendrograma com auxílio do BioNumerics 7.5,
foi gerado um “pseudogel” de pré-processamento, evidenciando o padrão espectral
disposto em bandas, onde a intensidade das massas pode ser correlacionada com a
intensidade das bandas. Assim, foram realizadas as seguintes análises:
Avaliou-se a similaridade entre os isolados de ERV, em que, a Figura 20
demonstra o padrão de similaridade entre os isolados de EFSRV: onde é possível
observar que os isolados de nº 34501; 35797; 36525; 37072; 37292; 37660; 37792;
39453 e 51376 apresentaram mesmo padrão espectral e consequentemente 100%
de similaridade. Além disso, é possível observar que a partir dos espectros do
MALDI-TOF MS, encontramos uma boa concordância com a técnica de MLST, uma
vez que os isolados que apresentaram o mesmo ST apresentaram maior
similaridade entre si.
Os dois isolados que apresentaram ST 103 apresentaram similaridade de
80%, e todos os isolados pertencentes ao ST 526 apresentaram 100% de
similaridade, como só tivemos um isolado pertencente ao ST 9 e um pertencente ao
ST 525, não foi possível avaliar o agrupamento de outros isolados pertencentes a
esses STs. No entanto, isolados pertencentes ao padrão de PFGE B e C foram
agrupados como sendo 100% semelhantes segundo a técnica de MALDI-TOF MS.
O “pseudogel” referente aos espectros dos isolados de EFSRV pode ser visualizado
na Figura 21.
Para EFMRV (Figura 22) é possível observar que, os isolados 36611 e 37080;
32738 e 41093; 37207 e 39935; 37802 e 43274 apresentaram mesmo padrão
espectral entre si e o “pseudogel” respectivo pode ser observado na Figura 23. Vale
lembrar que, as Figuras 18, 19, 20 , 22 e 25 incluem o padrão de bandas de PFGE,
apenas para permitir uma melhor comparação entre os métodos, no entanto, apenas
os espectros de massas foram utilizados como critérios para a construção dos
dendrogramas.
99
Resultados
Range de Massas: m/z 2.000 a 12.500
Análise da matriz de distância: Euclidiana
Método de agrupamento: UPGMA
Tolerância constante: 0,5
Tolerância linear: 300ppm
Figura18. Dendrograma do tipo UPGMA obtidos através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de
®
massas dos 15 isolados de EFSRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT .
100
Resultados
Análise da matriz de distância:
Euclidiana
Método de agrupamento: UPGMA
Figura 19. Dendrograma UPGMA obtido através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de massas dos 20 isolados de
®
EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT .
101
Resultados
MALDITOF
Análise da matrix de distância: Euclidiana
Método de clusterização: Ward
PFGE – EFMRV x EFSRV
Nº
Centro
Padrão
ST
Figura 20. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de massas dos 15 isolados de
EFSRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®.
102
Resultados
®
Figura 21. “Pseudogel” dos espectros de massas analisados no MALDI-TOFMicroflex LT dos 15 isolados de EFSRV, obtido pelo programa
BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de massas pode ser evidenciada através da intensidade na cor verde de cada massa.
103
Resultados
Método de agrupamento: Ward
Figura 22. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de massas dos 20 isolados de
®
EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT .
104
Resultados
Nº
®
Figura 23. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT ,
obtido pelo programa BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de massas pode ser evidenciado
com os através da intensidade na cor verde de cada massa.
105
Resultados
Com relação a acurácia do MALDI-TOF em diferenciar os isolados EFSRV de
EFMRV analisados no mesmo dendrograma construído com base no algoritmo de
Ward considerando apenas o padrão espectral, é possível observar a migração
entre os isolados de mesma espécie, com exceção de dois isolados, ambos EFMRV
(amostras: 30578 e 47347) que não apresentaram a massa de 7311.41 KDa, que
está presente em todos os outros 18 isolados de EFMRV (Figura 24). O “pseudogel”
referente aos espectros dos isolados de EFMRV e EFSRV pode ser visualizado na
Figura 25.
Método de agrupamento: Ward
EFMRV
EFSRV
Figura 24. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 baseado apenas
nos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 isolados de EFMRV analisados no
MALDI-TOFMicroflex.
106
Resultados
EFSRV
EFMRV
EFSRV
EFMRV
Figura 25. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 isolados
®
de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT , obtido pelo programa BioNumerics 7.5.
5.4
Avaliação dos dados epidemiológicos após a caracterização
microbiológica dos isolados
Após a realização dos ensaios laboratoriais, foi possível analisar os dados
dos pacientes das 118 fichas clínicas enviadas e avaliar alguns dados
epidemiológicos associados a espécie de Enterococcus e a sensibilidade à
vancomicina, ou seja, entre os principais fatores associados a infecções pelo
107
Resultados
microrganismo estudado, aparentemente, apenas cateter vesical apresentou um p =
0,032, que foi significativo para E. faecalis (tanto para os resistentes à vancomicina
quanto para os sensíveis). Quanto aos isolados de E. faecium observou-se o mesmo
diante de neoplasias com p = 0,048 (Tabela 10).
2
Tabela 10. Teste do X para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV,
EFMRV e EFMSV com as principais doenças de base e fatores geralmente associados a ICS e que
foram apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.
Grupo
Fatores associados
Doenças de base
Doenças de base/
Grupo
Teste de
Teste de
Fatores associados
EFSRV
EFSSV
χ2 (p)
EFMRV
EFMSV
χ2 (p)
Diabetes mellitus
0 (0,0%)
3 (4,2%)
1
1 (5,6%)
2 (16,7%)
0,709
Gastrointestinal
0 (0,0%)
2 (2,8%)
1
4 (22,2%)
1 (8,3%)
0,617
Neoplasia
4 (28,6%)
16 (22,2%)
0,866
9 (50,0%)
1 (8,3%)
0,048*
Neurológico
2 (14,3%)
8 (11,1%)
1
0 (0,0%)
0 (0,0%)
1
Trauma
0 (0,0%)
10 (13,9%)
0,304
0 (0,0%)
1 (8,3%)
0,836
Acesso arterial
0 (0,0%)
4 (5,6%)
0,834
0 (0,0%)
1 (8,3%)
0,836
Cateter periférico
3 (21,4%)
11 (15,3%)
0,861
4 (22,2%)
2 (16,7%)
1
Cateter venoso central
13 (92,9%)
55 (76,4%)
0,304
13 (72,2%)
11 (91,7%)
0,402
Cateter vesical
11 (78,6%)
31 (43,1%)
0,032*
8 (44,4%)
6 (50,0%)
1
Diálise peritoneal
0 (0,0%)
3 (4,2%)
1
0 (0,0%)
1 (8,3%)
0,836
Hemodiálise
3 (21,4%)
9 (12,5%)
0,645
2 (11,1%)
2 (16,7%)
1
Neutrófilos < 1000
0 (0,0%)
2 (2,8%)
1
2 (11,1%)
0 (0,0%)
0,654
NPP*
0 (0,0%)
5 (6,9%)
0,695
1 (5,6%)
1 (8,3%)
1
Tx MO*
0 (0,0%)
1 (1,4%)
1
0 (0,0%)
0 (0,0%)
1
Tx Sólido*
0 (0,0%)
3 (4,2%)
1
0 (0,0%)
2 (16,7%)
0,296
UTI*
10 (71,4%)
36 (53,7%)
0,358
8 (47,1%)
6 (54,5%)
1
Ventilação mecânica
9 (64,3%)
27 (37,5%)
0,118
8 (44,4%)
8 (66,7%)
0,411
*NPP= nutrição parenteral prolongada; Tx= transplante; MO= medula óssea; UTI=unidade de tratamento intensivo
Nas fichas clínicas enviadas pelos centros médicos não apresentavam os
dados relacionados a tempo de internação e uso prévio de antimicrobianos, por isso,
não foi possível avaliar a relação desses fatores com nenhum dos grupos.
Para verificar se existiu relação entre os grupos (EFSRV, EFSSV, EFMRV,
EFMSV) com o sexo utilizou-se o teste de Chi-quadrado. Onde não houve relação
significante entre os sexos com nenhum grupo (Tabela 11). Além disso, não foi
observada relação significante entre a condição na alta ou óbito entre os grupos de
pacientes que apresentaram infecção por: EFSRV, ESFSV, EFMRV e EFMSV
108
Resultados
(Tabela 12). Também não houve relação significante entre os grupos e a distribuição
da idade (Tabela 13).
2
Tabela 11. Teste do X para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV,
EFMRV e EFMSV de acordo com o sexo dos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.
EFMRV
Sexo
EFMSV
EFSRV
EFSSV
Total
Teste de
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
F
8
40,0
5
35,7
10
66,7
40
42,1
63
43,8
M
12
60,0
9
64,3
5
33,3
55
57,9
81
56,3
20
100,0
14
100,0
15
100,0
95
100,0
144
100,0
Total
χ2 (p)
0,285
Resultado
Não
diferentes
2
Tabela 12. Teste do X para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV,
EFSSV, EFMRV e EFMSV de acordo com a idade dos pacientes incluídos no Projeto SCOPE
Brasil.
GRUPO
Teste de
EFMRV
EFMSV
EFSRV
EFSSV
Total
Média
48,93
43,45
62,93
53,01
52,57
Mediana
61,00
45,50
63,00
59,50
58,50
Desvio-padrão
27,09
26,16
15,87
24,45
24,45
19
14
15
94
142
N
Resultado
Kruskal-Wallis (p)
0,238
Iguais
Tabela 13. Relação dos isolados de EFSRV, EFSSV. EFMRV e EFMSV em relação ao desfecho
clínico nos episódios de ICS dos pacientes do Projeto SCOPE Brasil.
EFMRV
Grupos/
Condição
EFMSV
EFSRV
EFSSV
Total
Teste de
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
Alta
6
35,3%
5
41,7%
5
35,7%
31
50,0%
47
44,8%
Óbito
11
64,7%
7
58,3%
9
64,3%
31
50,0%
58
55,2%
17
100,0%
12
100,0%
14
100,0%
62
100,0%
105
100,0%
Total
χ2 (p)
0,612
Resultado
Iguais
A Figura 26 demonstra a distribuição geográfica, dos isolados de
Enterococcus
spp.
enviados
pelos
centros
médicos
incluídos
no
estudo,
evidenciando o número de isolados de EFSRV e EFMRV. Deste modo, é possível
observar no mapa, os estados apresentados em cor laranja representam aqueles
que enviaram amostras de ERV, sendo E. faecalis representado em verde e E.
faecium em azul. Assim, somente os centros 1,2 e 3 enviaram isolados de EFSRV. E
os centros 1,3, 4, 6, 7, 12 e 13 enviaram isolados de EFMRV. Apenas os centros 1
e 3 enviaram tanto EFSRV quanto EFMRV. Sendo que o centro 1 enviou o maior
109
Resultados
número de isolados resistentes à vancomicina, com 18 isolados dos quais 11 foram
EFSRV e 7 EFMRV. E o centro 2 enviou apenas 2 isolados de EFMRV.
1
5
11
7
10
2
9
15
13
Centros participantes
Envio de ESV
12
Envio de ERV
61 2
5
4 3
1
EFMRV (1,3,4,6,7,12,13)
EFSRV (1,2,3)
3
7
2
1
2
Figura 26. Distribuição geográfica do número de isolados de EFSRV e EFMRV enviados de acordo
com o Centro médico participante.
A distribuição geográfica dos STs encontrados entre os isolados de EFSRV e
EFMRV submetidos a MLST pode ser visualizada na Figura 27. Onde foram
analisados ERV enviados pelos centros 1, 2, 3, 4, 6, 7, 12 e 13. Os STs encontrados
de EFSRV foram o 9, 103, 525 e 526. O Centro 1 apresentou os STs 9, 103 e 526. O
Centro 2 apenas o ST 103 e o Centro 3 apresentou os STs 525 e 526. Quanto aos
EFMRV, os STS encontrados forma 18, 412, 478 e 896. Sendo o ST 412 o mais
frequente, presente em 6 centros pertencentes a estados diferentes, 3 centros no
estado de SP (centros 1, 4 e 6), o centro 7 (RS), o centro 12 (GO) e o centro 13
(DF). O ST 478 foi encontrado apenas em dois centros: 1 e 13. O ST 18 e ST 898
apenas nos centros 4 e 3 respectivamente.
110
Resultados
10
9
15
13
12
61 2
543
7
Figura 27. Distribuição geográfica dos STs de EFSRV e EFMRV encontrados no estudo de acordo
com o Centro médico participante.
111
Discussão
6. DISCUSSÃO
112
Discussão
A grande maioria dos Enterococcus spp., incluindo espécies que são
importantes agentes de infecção hospitalar, são membros da microbiota do trato
gastrointestinal de humanos e animais, inclusive insetos. No entanto, ao longo dos
anos, sobretudo nas duas últimas décadas, Enterococcus spp. tem emergido como
um
dos principais causadores
de
infecções hospitalares.
Vários
estudos
evidenciaram que Enterococcus spp. está entre as espécies mais prevalentes
causadoras de ICSs (Magil et al., 2014; Lebreton, Willems & Gilmore, 2014; ANVISA,
2014; Marra et al., 2011; Chowdhury et al. 2009; Hidron et al. 2008; Olivier et al.
2008; Murdoch et al., 2009; Wisplinghoff et al. 2004).
Esse fato está provavelmente relacionado a alguns fatores, tais como: a maior
ocorrência de doenças degenerativas e neoplásicas, o grande número de
transplantes
de
órgãos
realizados,
a
maior
utilização
de
terapias
imunossupressoras, quimioterapia e uso de antimicrobianos de amplo espectro, bem
como a realização de maior número de procedimentos médicos invasivos,
proporcionando a translocação desses microrganismos. É importante destacar que,
geralmente, as ICSs por Enterococcus spp. estão associadas com alta mortalidade e
prognóstico reservado, sobretudo quando causadas por isolados resistentes à
vancomicina (Short et al. 2014; Whang et al. 2013).
Diante dessa problemática, estudos epidemiológicos sobre infecções
nosocomiais são ferramentas fundamentais na elucidação de questões específicas,
relacionadas a distribuição dos microrganismos mais frequentemente encontrados,
suas características de virulência e peculiaridades com relação ao perfil de
sensibilidade e os mecanismos de resistência aos antimicrobianos, além de tipagem
molecular.
Este trabalho consiste na maior casuística de ICSs por espécies de
Enterococcus num estudo multicêntrico realizado no Brasil.
Neste estudo a
correlação entre o agente etiológico como causa da infecção foi muito bem
estabelecida com critérios clínicos e laboratoriais rigorosos e padronizados, evitando
a valorização de colonizantes e contaminantes. Deste modo, pudemos observar
dados consistentes e realistas sobre o panorama dessas infecções em alguns
centros brasileiros. Consequentemente, este estudo permitiu a caracterização
epidemiológica das espécies de Enterococcus spp. causadoras de ICS em 12
centros médicos brasileiros, contribuindo com a compreensão sobre: (i) distribuição
das espécies mais prevalentes e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos; (ii)
113
Discussão
confirmação da presença do gene vanA entre os isolados resistentes à vancomicina;
(iii) caracterização molecular dos isolados apresentando gene vanA por três
diferentes métodos, PFGE, MLST e MALDI-TOF MS.
Estudos semelhantes já foram realizados em outros países, onde as
conclusões obtidas e a melhor compreensão dessa problemática mundial,
proporcionaram condutas clínicas e laboratoriais mais adequadas (Warren et al.
2001; Wisplingghoff et al. 2004; Martínez-Odriozola et al. 2007; Vicent et al. 2009;
Marra et al. 2011).
Dados Epidemiológicos:
O presente estudo é uma extensão do projeto SCOPE Brasil, que foi
conduzido por Marra et. al. (2011), onde foram avaliados 2.668 casos de ICSs,
dentro os quais 104 isolados foram do gênero Enterococcus. Na casuística de nosso
trabalho,
além
dos
104
Enterococcus
spp.
incluídos
no
estudo
acima,
acrescentaram-se mais 40 isolados de Enterococcus spp. que foram enviados pelos
diversos centros após a finalização do SCOPE Brasil. No estudo SCOPE Brasil,
Enterococcus spp. foi o oitavo microrganismo mais frequentemente isolado entre os
2.688 casos de ICS estudados. Outros dados nacionais, como o de Gales et al.
2012) (estudo SENTRY) e o boletim informativo da ANVISA (2014) concordam com
os achados por Marra et al. (2011) (que incluem as amostras do presente estudo),
onde Enterococcus spp. foi também o oitavo microrganismo mais isolado de ICS.
Nossos dados (Marra et al. 2011) nacionais da epidemiologia dos principais
microrganismos causadores de ICS são divergentes dos encontrados nos estudos
internacionais (Biavasco et al., 2007; Tsai et al., 2005), onde Enterococcus spp.
foram a segunda causa mais comum de ICS nos Estados Unidos, enquanto que os
relatos de Billington et al. (2014) no Canadá e Wisplinghoff et al. (2004) no Estados
Unidos, apontaram Enterococcus spp. como terceiro microrganismo mais isolado
das ICS avaliadas. Já no estudo espanhol conduzido por Martínez-Odriozola et al.
(2007), Enterococcus spp. foi o quinto isolado mais frequente causador de ICS. Esse
fato pode ser melhor compreendido se considerarmos que o Brasil é um país de
clima tropical e que apresenta temperaturas mais elevadas, o que pode contribuir
com o isolamento de bacilos Gram-negativos com mais frequência, modificando a
epidemiologia dos microrganismos mais isolados quando comparado com países de
114
Discussão
clima frio (Marra et al., 2011).
Recentemente, Magill et al. (2014) realizaram um estudo multicêntrico
americano incluindo 183 centros médicos e constataram que o Enterococcus spp. foi
o quinto agente mais prevalente de ICS.
Com relação aos dados demográficos dos pacientes estudados, observamos
que a mediana de idade foi de 58 anos, sendo que 53,4% dos pacientes pertenciam
ao sexo masculino e que 92,4% das hemoculturas dos pacientes que apresentaram
ficha clínica disponível (118 fichas clínicas) foram monomicrobianas. Observamos
também que 21 pacientes tinham menos que 16 anos de idade. Esses dados
diferem discretamente dos encontrados por Billington et al. 2014, onde a mediana de
idade foi de 68 anos, 66% do sexo masculino e 74% dos hemoculturas
monomicrobianas e no estudo de Martínez-Odriozola et al. 2007 no qual verificou-se
que 62,3% dos pacientes foram do sexo masculino e 80% do total de hemoculturas
foram monomicrobianas. Quanto à idade dos pacientes, nesse estudo não foi
calculada a mediana e separou-se por faixa etária, onde 38,7% dos pacientes
apresentavam entre 56 e 75 anos de idade e 34,8% apresentavam acima de 75
anos.
Com relação as doenças de base e fatores associados a ICS por
Enterococcus spp. nossos achados são muito similares aos encontrados em outros
estudos (Billington et al., 2014; Ghanem et al., 2007; Martínez-Odriozola et al., 2007;
Wisplinghoff et al., 2004). Alguns dados foram diferentes dos encontrados no nosso
estudo, como algumas doenças de bases que apresentaram uma prevalência maior
entre pacientes portadores de ICS por Enterococcus spp., por exemplo, síndrome da
imunodeficiência humana (Martínez-Odriozola et al. 2007). Provavelmente, as
divergências encontradas entre o nosso estudo com os dados descritos na literatura
podem estar relacionadas com os critérios de inclusão dos pacientes entre os
diversos estudos.
Dados microbiológicos:
No presente estudo, entre os 144 isolados de Enterococcus spp., a espécie E.
faecalis foi a mais prevalente com 76,4% (n=110), seguido de E. faecium 22,9%
(n=33) e apenas 0,7% de E. durans (apenas1 isolado).
115
Discussão
Nossos dados são semelhantes aos publicados no Boletim Informativo
(ANVISA, 2014), em que, das 662 espécies de Enterococcus identificadas, 71,9%
(476) eram E. faecalis e 28,1% (186) eram E. faecium. Prevalências semelhantes
foram encontradas por Billintong et al. (2014) num estudo canadense onde n=467,
70% eram das espécies E. faecalis e n=169, 25,4% eram E. faecium e 4,6% (n=31)
eram pertencentes a outras espécies. No estudo realizado na Sérvia E. faecalis foi
responsável por 55.05% (n=49) e E. faecium por 41.57% (n=37) das ICS (Mira et al.,
2014), em outro estudo europeu (Espanha), por Martínez-Odriozola et al. (2007), E.
faecalis e E. faecium apresentaram uma prevalência de 69,9% (n=127) e 21,9%
(n=40), respectivamente, outras espécies apresentaram 8,2% (n=15).
Em outras casuísticas, E. faecium foi mais prevalente que E. faecalis, como
por exemplo, no estudo espanhol conduzido por Gudiol et al. (2013), no qual 51,4%
(n=54) contra 36,2% (n=38), respectivamente. Entretanto, esse estudo foi realizado
em um centro de referência em câncer, o que pode ter contribuído com a mudança
na prevalência das espécies, já que aparentemente existe uma maior prevalência de
infecções por E. faecium nesse grupo de pacientes.
Quanto às plataformas utilizadas para identificação dos isolados incluídos
neste estudo, todas as três (Phoenix®, Vitek MS® e Microflex LT®) demonstraram
resultados concordantes com a técnica de PCR. Todas as metodologias
apresentaram 100% de concordância com a identificação do gênero Enterococcus.
Entretanto, apenas o Microflex LT® Bruker® que utiliza a técnica de espectrometria
de massas demonstrou-se 100% concordante com valor de k =1,000 e p < 0,001
para ambas espécies E. faecalis e E. faecium.
O Vitek MS® BMX identificou corretamente 97,2% (n=140) dos isolados em
nível de espécie, apresentando incongruências na identificação de quatro isolados,
onde identificou dois E. faecalis (identificado como E. faecalis pela técnica de PCR)
como sendo E. faecium (com porcentagem de confiança de 99,9% para ambos) e
identificou como sendo de E. faecalis dois isolados de E. faecium (com porcentagem
de confiança de 99,9% e o outro com 88,7%), apresentando o valor de k = 0,921 e p
< 0,001. O equipamento Phoenix® também apresentou 97,2% de concordância em
relação a identificação molecular, onde houve erro na identificação de um isolado de
E. faecalis identificado como E. faecium e três isolados de E. faecium, identificados
como E. faecalis. Todos os quatro isolados com erro na identificação pelo Phoenix®
apresentaram acima de 97% de confiança, sendo que o manual do equipamento
116
Discussão
considera que a espécie deve ser confiável com valores acima de 94% (valor de
confiança mínimo para espécie, estabelecido pelo manual do fabricante).
Na prática laboratorial, usualmente, espécies de E. faecalis são sensíveis a
ampicilina e isolados de E. faecium tendem a ser resistentes. Deste modo, todos os
isolados que apresentaram identificação incongruente pelo sistema Phoenix ou pelo
Vitek MS® apresentaram o perfil esperado frente à ampicilina, ou seja, os E. faecalis
foram sensíveis e os E. faecium resistentes à ampicilina (Merlo et al., 2015; Arias &
Murray et al., 2012) e todos os quatro isolados com inconsistência na identificação
pelo Vitek MS® apresentaram resistência à vancomicina com CIM > 256 µg/mL
(Anexo 2).
Para o único isolado de E. durans, não foi possível realizar a confirmação da
espécie através da técnica de PCR, no entanto, esse isolado teve sua identificação
concordante entre as três metodologias: Phoenix®, Vitek MS® e Microflex LT®
Bruker®.
Todos as identificações incongruentes foram repetidas no mesmo dia com a
mesma colônia, no entanto, mantiveram-se os mesmos erros de identificação.
Quanto ao Phoenix®, os erros podem ter sido gerados devido a espécimes com
variações no metabolismo enzimático de carboidratos ou aminoácidos, gerando o
biótipo inconsistente com os dados moleculares. Já o Vitek MS® recomenda realizar
o ensaio de espectrometria de massas utilizando o microrganismo direto da colônia
sem extração de proteínas, isso pode ter influenciado na identificação dos isolados.
Como o equipamento Vitek MS® ficou disponível por tempo limitado para a
realização dos experimentos deste estudo, não foi possível realizar os testes a partir
da extração de proteínas.
Nossos achados concordam com relatos anteriores (Fang et al., 2012;
Schulthess et al., 2012; van Veen et al., 2010), onde houve 100% de concordância
na identificação de E. faecalis e E. faecium, utilizando o equipamento Microflex LT®
Bruker® e muito semelhantes aos encontrados por Çekin et al. (2012) onde houve
97,8% de concordância na identificação de espécies de Enterococcus com o método
molecular de referência, utilizando o sistema Phoenix®. Resultados similares foram
obtidos nos estudos de Moon et al. (2013) e Fang et. al. (2012), que verificaram
100% de concordância na identificação de E. faecalis e E. faecium, utilizando Vitek
MS®.
117
Discussão
Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e presença do gene vanA:
Quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, optou-se por analisar o
perfil de sensibilidade do gênero, em seguida, estratificado de acordo com as
espécies E. faecalis e E. faecium, pois alguns laboratórios nacionais ainda não
conseguem realizar a identificação final da espécie utilizando os métodos de
identificação convencionais. Deste modo, ao avaliar a sensibilidade do gênero no
nosso estudo, todos os 144 isolados (100%) apresentaram sensibilidade a
daptomicina e linezolida, após confirmação das CIMs desses antimicrobianos por
Etest®. Já para ampicilina, estreptomicina-sinergismo e gentamicina-sinergismo, a
sensibilidade foi respectivamente 77,1%, 58,3% e 57,6%. Para vancomicina, a
sensibilidade do gênero foi de 75,7%.
Quando os isolados foram estratificados por espécie, verificou-se que: o único
isolado de E. durans foi sensível a todos os antimicrobianos avaliados, entre os 110
E. faecalis, 98,2% foram sensíveis à ampicilina, 66,4% a estreptomicina-sinergismo
e apenas 47,3% de sensibilidade à gentamicina-sinergismo. Entre os 33 isolados de
E. faecium observamos um baixo índice de sensibilidade aos antimicrobianos, onde
apenas 6,1% foram sensíveis a ampicilina e 27,3% foram sensíveis à
estreptomicina-sinergismo. Vale ressaltar que os nossos E. faecium apresentaram
maior sensibilidade à gentamicina-sinergismo (90%) quando comparados com os
isolados de E. faecalis (57,6%).
Quanto à vancomicina, 35/144 (24,3%) isolados foram resistentes dos quais:
60,6% (n=20/33) foram E. faecium e 13,6% (n=15/110) foram E. faecalis. Todos
esses 35 isolados apresentaram o gene vanA positivo, nenhum apresentou vanB,
concordando com estudos brasileiros, em que o gene vanA foi o único mecanismo
de resistência à vancomicina encontrado entre os Enterococcus spp. (Merlo et al.,
2015; Resende et al., 2014; da Silva et al., 2012; dÀzevedo et al., 2009; dÀzevedo
et al., 2008). Em nosso país, são raros os relatos de resistência à vancomicina
devido à presença do gene vanB entre isolados de Enterococcus spp. (Merquior et
al.2012; Cantarelli et al., 2011).
Houve uma discrepância significativa entre as CIMs obtidas pelo Phoenix®
para daptomicina e linezolida quando comparadas com as CIMs obtidas por Etest®.
Para o Phoenix houve uma tendência de CIMs maiores para ambos os
antimicrobianos, com diferença de até duas diluições. Para daptomicina todos os
118
Discussão
isolados foram considerados sensíveis por ambas as metodologias, apesar de cinco
isolados apresentarem até duas diluições acima das CIMs, quando utilizado o
Phoenix. Enquanto que, para linezolida houve mudança da categoria de
sensibilidade para dois isolados, que apresentaram resistência intermediária
segundo o Phoenix com CIM de 4 µg/mL, já para o Etest® foram considerados
sensíveis (um apresentando CIM de 1 µg/mL e o outro apresentando 2 µg/mL). Vale
ressaltar que, as amostras avaliadas com relação a sensibilidade à daptomicina,
foram enviadas numa época em que esse antimicrobiano ainda não era utilizado no
Brasil.
Ao analisar os dados sobre prevalência de ERV isolados de ICS na literatura,
é possível observar que existe uma variação na epidemiologia de acordo com a
região geográfica e critérios de inclusão no estudo (Marra et al., 2011). Na maioria
dos relatos em diversas partes do mundo, existe uma tendência entre os isolados E.
faecium de se apresentarem mais resistentes à vancomicina do que E. faecalis
(Anvisa 2014; Mira et al., 2014; Adam et al., 2011). Aparentemente, o mesmo ocorre
com relação a gentamicina-sinergismo (Mengeloğlu et. al., 2011).
Deste modo, nossos achados concordam com os resultados obtidos por
Adam et al. (2011), que ao avaliar a prevalência de patógenos resistentes em mais
de 8.000 hemoculturas colhidas entre 2007 e 2009 no Canadá, em que todos os 502
isolados de Enterococcus spp. apresentaram sensibilidade a daptomicina e
linezolida. No entanto, quanto a sensibilidade à vancomicina, Adam et al. (2011)
relataram que apenas 5/479 isolados de E. faecalis (cerca de 1%) e 18/23 (78%) dos
E. faecium apresentaram-se resistentes. Sendo que,
todos os 18 EFMRV
apresentaram gene vanA, quanto aos cinco EFSRV, quatro apresentaram vanB e
apenas um apresentou vanA. Enquanto que, Mira et al. (2014) encontraram 54,05%
(n=20) de resistência à vancomicina entre os isolados de E. faecium e nenhum
isolado de E. faecalis foi resistente nessa casuística. Além disso, 91,4% dos E.
faecium desse estudo foram resistentes a gentamicina-sinergismo contra 63% dos
E. faecalis.
Segundo dados relatados pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças
Infecciosas – Centers for Disease Control and Prevention (CDC) em 2013, dos
66.000 isolados de Enterococcus spp./ ano 20.000 foram resistentes à vancomicina,
dos quais, 77% dos E. faecium (n=10.000) e 9% dos E. faecalis (n=3.100). Entre os
isolados que não tiveram a espécie identificada, 40% deles (n=6.900) foram
119
Discussão
resistentes à vancomicina, entretanto, esses dados incluem amostras de sangue,
sítios cirúrgicos e trato urinário. Esse fato pode gerar dados incongruentes, devido
ao tipo de infecção e critérios de inclusão dos pacientes/isolados no estudo.
Nossos achados são muito semelhantes aos dados nacionais, sobre ERV
isolado de ICS apresentados pela ANVISA (2014), onde 19,1% (210/1098 isolados)
de todos os Enterococcus spp. foram resistentes à vancomicina. Ao estratificar
esses dados pelas espécies verificou-se que 11,3% (54/476) dos E.faecalis e 48,9%
(91/186) dos E.faecium relacionados com ICS primária confirmada laboratorialmente
(IPCSL) foram resistentes à vancomicina. A resistência à vancomicina entre os
isolados de Enterococcus spp. que não tiveram sua espécie identificada foi de
14,9% (65/436) dos isolados.
Segundo a literatura, as CIMS de daptomicina e linezolida obtidas pelo
sistema Phoenix®, geralmente apresentam uma ou mais diluições acima daquelas
obtidas pelo Etest® (Riedel et al. 2014; Davies et al. 2013). Além disso, alguns
estudos demonstraram que, os métodos comerciais comumente utilizados pelos
laboratórios de rotina de microbiologia clínica frequentemente produzem CIMs entre
1-2 log2 de diferença para daptomicina frente a isolados de Enterococcus spp., em
comparação com o método de Microdiluição em Caldo (Bryant et al. 2014; Riedel et
al., 2014; Riedel et al. 2012).
Tipagem molecular dos isolados de Enterococcus spp. resistentes à
vancomicina:
A tipagem molecular aplicada à microbiologia clínica permite caracterizar a
diversidade dos microrganismos de interesse médico, contribuindo para a sua
classificação e para a discriminação entre indivíduos da mesma espécie,
apresentando um grande potencial para esclarecer sobre a origem e disseminação
de uma estirpe causadora de um surto infeccioso.
A tipagem molecular dos isolados de ERV enviados de diversas parte do
Brasil realizada nesse trabalho é importante para melhor caracterizar a diversidade
das linhagens circulantes no nosso país e melhor compreender o comportamento
desses microrganismos diante de ICSs e até mesmo dar subsídios para condutas
terapêuticas.
120
Discussão
Desse modo, as amostras avaliadas no nosso estudo foram submetidas a
duas técnicas de tipagem padronizadas e utilizadas em todo o mundo: PFGE e
MLST, e uma terceira, que pode ser promissora para utilização num futuro bem
breve, MALDI-TOF MS.
Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE):
A genotipagem por PFGE foi realizada para todos os isolados de ERV. Os
perfis de macrorrestrição do DNA genômico dos 15 E. faecalis resistentes à
vancomicina, enviados por três centros médicos incluídos no estudo, analisados pelo
programa
BioNumerics
7.5,
revelou
dois
diferentes
grupos
“clusters”,
respectivamente com sete e quatro isolados. Todos os sete isolados pertencentes
ao mesmo grupo foram enviados pelo centro 1 e apresentaram o mesmo padrão de
PFGE (padrão C) pelos critérios de Tenover et al. (1995), provavelmente, tratam-se
do mesmo clone circulante nesse centro na época do estudo. Entre esses sete
isolados, quatro foram enviados no ano de 2008 e três no ano de 2009, cinco dos
sete pacientes apresentavam acesso central como fonte bacteriana e 5 foram a
óbito.
Quanto ao grupo formado por quatro isolados, todos com mesmo padrão de
PFGE (padrão B) e enviados por 3 centros diferentes, dois localizados na cidade de
São Paulo (Centros 1 e 2) e um em Diadema (Centro 3). Dois isolados foram
enviados no ano de 2008, um em 2009 e outro em 2011, demonstrando a
persistência desse clone circulante por pelo menos 3 anos. Quatro isolados de
EFSRV não foram agrupados em nenhum dos dois clusters (a similaridade foi
inferior a 80%).
Sobre os EFMRV, foi possível observar um maior polimorfismo no padrão de
macrorrestrição dos isolados, com uma grande variação no padrão de PFGE (19
padrões diferentes: A1-A10; B; C; D1-D5; E; F), onde três grupos apresentaram
similaridade superior a 80%. Um grupo apresentou 82,4% de similaridade (contendo
10 isolados), esse grupo é representados por isolados enviados pelos centros 01
(seis isolados) e 04 (um isolado) localizados na cidade de São Paulo e pelos centros
12 (um isolado) e 13 (dois isolados), respectivamente localizados em GO e DF. É
interessante observar que apesar da distância geográfica entre os centros, ocorre a
presença de um mesmo clone em diferentes regiões do Brasil.
121
Discussão
O segundo grupo apresentou 83,4% de similaridade (quatro isolados: três do
RS e um de SP) e o terceiro grupo apresentou 86,7% de similaridade contendo
apenas dois isolados, que foram enviados pelo mesmo centro localizado no DF.
Novamente observamos a presença do mesmo clone em regiões geográficas
distintas.
A maior prevalência de ERV (de ambas espécies, E. faecalis e E. faecium)
ocorreu entres os anos de 2008 e 2009. Esse fato, pode ser explicado devido ao
maior número de amostras enviadas pelos centros participantes durante esses dois
anos (107 dos 144 isolados incluídos, onde 28 foram ERV). Além disso, as
reformulações ocorridas no projeto SCOPE entre 2010 e 2011 podem justificar a
diminuição do número de amostras enviadas, durante esse período, pelos centros
participantes. Quanto ao maior número de ERV isolados no estado de SP, isso pode
ser melhor compreendido devido à metade dos centros (seis) estarem localizados
nesse Estado. Entre os seis centros paulistas encontram-se hospitais de alta
complexidade e Hospitais/Escola, além disso, a localização do LEMC (laboratório
para onde os isolados foram enviados) na mesma cidade pode ter contribuído com o
maior número de isolados concentrados em SP.
Nossos achados concordam com o estudo conduzido por Zanella et al. (2003)
que caracterizou o polimorfismo de 85 EFSRV e 62 EFMRV, onde também foram
encontrados cinco tipos diferentes de PFGE (A, B, C, D, E) para E. faecalis (o tipo A
apresentou oito subtipos e o tipo B dois subtipos, totalizando 15 padrões de bandas
diferentes). Para E. faecium, foram encontrados apenas três tipos (M,N,O), no
entanto, houve 18 padrões de bandas diferentes, evidenciando também um grande
polimorfismo para essa espécie. Apesar dos isolados avalizados por Zanella et al.
(2003) serem originários de diversos sítios biológicos diferentes e de apenas um
centro médico, o padrão de polimorfismo obtido foi semelhante ao nosso estudo.
Em outro estudo Brasileiro, conduzido por DÀzevedo et al. (2008) no Hospital
São Paulo, onde foram avaliados nove EFSRV e 10 EFMRV obtidos de cultura de
vigilância, foram encontrados três padrões e seis tipos (com sete padrões) de PFGE
respectivamente. O número menor de padrões de PFGE pode ser explicado por se
tratarem de poucos isolados incluídos no estudo e por serem oriundos de pacientes
internados no mesmo hospital.
Morrison et al. (1999) também evidenciaram um alto polimorfismo nos
padrões de PFGE de 30 isolados EFMRV, de diferentes pacientes, durante um
122
Discussão
período de 11 meses, encontrando 17 padrões de bandas distribuídos em quatro
grupos distintos com similaridade de 82%. Assim como, Stampone et al. (2005)
também observaram um grande polimorfismo entre oito EFSRV, bem como entre os
31 EFMRV isolados de ICS num estudo ocorrido na Itália entre os anos de 2001 e
2003.
Existem
poucos
estudos
multicêntricos
de
tipagem
molecular
de
Enterococcus spp. por PFGE, isolados de sangue. A grande maioria dos estudos
envolve amostras isoladas de vários sítios biológicos e geralmente oriundas do
mesmo centro médico (mesmo hospital) o que pode dificultar a análise comparativa
com a literatura (o nosso estudo envolve apenas isolados de hemoculturas e
oriundos de centros médicos localizados em diferentes regiões do Brasil). O uso
limitado da técnica de PFGE pode ser explicado por ser laboriosa, de alto custo e
demorada (Bedendo & Pignatari, 2000).
Sequenciamento de Múltiplos Loci (Multilocus Sequence Typing - MLST):
No nosso estudo, encontramos quatro STs diferentes entre os E. faecalis
resistentes à vancomicina: ST9 (um isolado), S103 (dois isolados), ST525 (um
isolado) e ST526 (três isolados). Como apenas os centros médicos localizados no
estado de SP enviaram EFSRV e, além disso, o número de isolados selecionados
para realização do MLST foi de apenas sete isolados, não foi possível observar a
dispersão nacional de nenhum ST predominante.
Entre os STs de EFSRV encontrados no nosso estudo e que estão mais
relacionados com infecções nosocomiais destacam-se: o ST526, que, de acordo
com o eBurst, apresenta um locus variante (single loci variation – SLV) do complexo
clonal 2 (CC2), e o ST9 que é o próprio complexo clonal 9 (CC9) (Solheim et al.,
2011; Clewell et al. 2002). De acordo com a literatura, os complexos clonais CC2 e
CC9 apresentam quase que exclusivamente isolados de origem nosocomial
(Kawalec et al., 2007; Ruiz-Garbajosa et al., 2006; Clewell et al. 2002), outros 2
complexos clonais também relacionados com isolados hospitalares são CC28 e o
CC40 (Solheim et al., 2011; Solheim et al., 2009; Ruiz-Garbajosa et al., 2006),
entretanto nenhum dos dois últimos foram encontrados no nosso estudo.
Segundo Clewell et al. (2002), em E. faecalis, uma grande variedade de
plasmídeos conjugativos e transposons estão envolvidos na transferência genética
123
Discussão
de determinantes de resistência e de fatores de virulência, o que também pode ter
facilitado também a adaptação dos CC2 e CC9 no ambiente hospitalar. Em um
estudo brasileiro conduzido por De Almeida et al. (2014), foram analisados cinco
EFSRV, nesse estudo também foram encontrados os ST 525 e ST 526. Sendo,
quatro isolados pertencentes ao ST 525 (três isolados de sangue e um de urina) e
um ST 526 isolado de urocultura.
Entre os 15 EFMRV submetidos a tipagem por MLST no nosso estudo,
encontramos quatro STs diferentes: ST18, ST412, ST478 e ST896. Entre esses
STs, observou-se que o ST412 foi o mais prevalente, encontrado em 11 dos 17
isolados de EFMRV. A análise do eBurst nos permitiu observar que o ST412
apresenta três loci variantes do ST17 (CC17) e foi isolado de seis diferentes centros
médicos no nosso estudo: Centros 1; 4; 6; 7; 12 e 13, localizados em três estados
brasileiros, a saber: nos estado de SP (centros 1, 4 e 6), RS (centro 7) em GO
(centro 12) e no DF (centro 13) demonstrando uma disseminação significativa nas
regiões Centro-Oeste, Sudeste e Sul do Brasil. O ST478 que apresenta quatro loci
variantes do ST17 foi identificado em dois isolados do nosso estudo, um enviado
pelo centro 1 (SP) e um enviado pelo centro 13 (DF). O ST18, que apresenta dois
loci variantes do ST17 e que é um subgrupo fundador, foi observado em um isolado
do centro 4 (localizado em SP) e o ST896 em apenas um isolado do centro 3 (SP).
Todos os 11 isolados de ST412 do nosso estudo foram resistentes a
ampicilina, 8 isolados (73%) foram resistentes a estreptomicina-sinergismo, no
entanto, nenhum isolado apresentou resistência a gentamicina-sinergismo. Dos 11
pacientes que tiveram ICS por EFMRV pertencentes ao ST412 nove apresentavam
cateter venoso em posição central e tiveram esse acesso como fonte bacteriana
primária e sete foram a óbito.
No nosso estudo não foram avaliados os fatores de virulência dos isolados,
entretanto, de acordo com os dados apresentados na literatura, os isolados
pertencentes ao CC17 e seus STs variantes, geralmente apresentaram o gene esp
(enterococcal surface protein - proteína de superfície enterocócica) que contribui na
produção de biofilme (Deplano et al., 2007), esse fato provavelmente pode ter
contribuído com a colonização do cateter previamente a ICS dos isolados derivados
do CC17 avaliados no nosso estudo.
Recentemente, estudos de tipagem molecular demonstraram que a maioria
das cepas de EFMRV associadas com infecções nosocomiais, em todo o mundo,
124
Discussão
fazem parte da mesma linhagem conhecida como CC17 (Leavis et al., 2007;
Camargo, Gilmore & Darini, 2006; Klare et al., 2005; Willems et al., 2005; Willems et
al., 2001).
Supõe-se que a aquisição de sequências de inserção (IS) proporcionou ao
CC17 um aumento da plasticidade no seu genoma, facilitando sua adaptação do
mesmo no ambiente hospitalar (Leavis et al., 2007). Além disso, isolados
pertencentes ao CC17 e seus STs variantes são geralmente resistentes à ampicilina
e carreiam vários genes codificadores de fatores de virulência como a proteína
superfície enterocócica e a hialuronidase e, na maioria das vezes, a ilha de
patogenicidade putativa (Top, Willems & Bonten, 2008; Leavis et al., 2006; Willems
et al., 2005; Klare et al., 2005; Bonora et al., 2004; Leavis et al., 2004; Werner et al.,
2003; Willems et al., 2001).
Segundo Ochoa et al. (2013), Damani et al. (2010) e Panesso et al. (2010),
existem vários STs pertencentes ao complexo clonal 17, como ST16, ST17, ST18,
ST203 e ST412, que estão disseminados em todo o mundo. Dois desses STs foram
encontrados no nosso estudo ST18 e ST412. STs pertencentes ao CC17 e suas
variantes também foram encontrados em estudo conduzido por Damani et al. (2010),
que avaliaram 359 ERV, dos quais 199 isolados (55,4%) apresentaram o ST412,
onde todos foram resistentes a ampicilina, estreptomicina-sinergismo e 95% (190
isolados) foram resistentes a gentamicina-sinergismo. Na Cidade do México, Ochoa
et al. (2013) analisaram 12 EFMRV, onde seis pertenciam ao ST412, sendo dois
desses isolados de hemocultura. O ST412 foi o mais prevalente em um estudo
multicêntrico realizado na América do Sul incluindo quatro países (Colômbia,
Equador, Peru e Venezuela). Outros STs encontrados nesse estudo foram: ST17,
ST18, ST125, ST203, ST280, e ST282, todos pertencentes ao CC17 (Panesso et al.,
2010).
Os STs encontrados no nosso estudo (SCOPE Brasil) concordam com outros
estudos brasileiros que avaliaram isolados contemporâneos (isolados entre os anos
de 2007 e 2011). Em um estudo de vigilância de EFSRV e EFMRV, realizado
durante o ano de 2009, conduzido por Merlo et al. (2015) num hospital brasileiro, na
cidade de Belo Horizonte, foi observada uma prevalência do ST103 entre cinco dos
14 EFSRV estudados. Entre os EFMRV, o ST412 foi identificado em 35 dos 47
isolados estudados, sugerindo uma disseminação desses STs no hospital onde o
estudo foi realizado. Tal estudo é contemporâneo ao projeto SCOPE Brasil, o que
125
Discussão
pode justificar o isolamento de ERV com os mesmos STs em ambos.
Em outro estudo brasileiro realizado por da Silva et al. (2012) dos 53 EFMRV
isolados de diversos materiais clínicos (sendo a grande maioria oriundos de cultura
de vigilância) incluídos nesse estudo, foi realizada tipagem por MLST de 31 isolados,
onde 38.7% (n = 12) foram pertencentes ST412 e 32.3% (n = 10) ao ST478.
Palazzo e colaboradores (2011) realizaram a tipagem por MLST de 11
isolados de E. faecium isolados no ano de 2007 num hospital universitário da cidade
de Campinas, entre os quais, um isolado de hemocultura foi pertencente ao ST412 e
sete foram pertencentes ao ST478 (incluindo um isolado de hemocultura). Esse
último apresentou dois loci variantes (doble loci variation) do ST203, que por sua vez
é pertencente ao CC17.
Todos esses relatos reforçam a capacidade adaptativa dos ST412 e ST478
(ambos variantes do CC17) ao ambiente hospitalar. Os dados encontrados no nosso
estudo, somados aos relatos encontrados em outros estudos brasileiros, sugerem
uma disseminação desse ST entre vários centros médicos brasileiros. No entanto,
vale ressaltar que a maioria destes estudos foram realizados com isolados colhidos
de diversos materiais clínicos humanos, sendo a grande maioria obtida de culturas
de vigilância, aparentemente, não foi realizado nenhum estudo nacional sobre
tipagem de ERV por MLST incluindo apenas isolados de ICS durante o período do
nosso estudo.
Tipagem por Espectrometria de Massas:
MALDI-TOF MS é considerado revolucionário, devido à sua precisão na
identificação de microrganismos, velocidade e custo-efetividade em relação às
técnicas de cultura existentes (Murray, 2012; Dekker et al., 2011; Bizzini & Greub,
2010; van Veen et al., 2010; Seng et al., 2009; Carbonnelle et al., 2007).
A identificação acurada e rápida de microrganismos isolados de ICS,
juntamente com a realização de uma “Tipagem em Tempo Real por MALDI-TOF MS”
pode nos fornecer informações preciosas sobre clones que possam apresentar
fatores de virulência e resistências aos antimicrobianos mediadas por genes
cromossomais, proporcionando uma gestão dos pacientes em tempo real,
sobretudo nos casos de infecção por isolados multirresistentes que geram uma
limitação terapêutica significativa como é o caso das ICS por E. faecalis ou E.
126
Discussão
faecium resistentes à vancomicina, agilizando o uso antimicrobiano adequado e
prevenindo o uso excessivo de antibióticos empíricos e sua toxicidade.
Pensando em melhor compreender a epidemiologia de ERV isolados de ICS
no Brasil, decidimos avaliar a acurácia da técnica de MALDI-TOF MS 5para realizar
a identificação de espécies de Enterococcus e a tipagem destes num mesmo ensaio
laboratorial. Para tanto, verificamos a aplicabilidade dos equipamentos Vitek MS®
(BioMérieux) e Microflex LT® (Bruker) para realização de tipagem de EFMRV e
EFSRV através do padrão de proteínas. Além disso, verificamos a acurácia do
Microflex LT® na tipagem e diferenciação entre os isolados E. faecalis e E. faecium
de acordo com a sensibilidade à vancomicina.
Avaliamos o padrão proteico dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 EFMRV,
obtido pelo Vitek MS® (BioMérieux) utilizando o programa Saramis®, através do
dendrograma do tipo UPGMA com o objetivo de comparar a relação do padrão de
similaridade com o método de tipagem considerado PFGE e com a tipagem por
MLST. O dendrograma gerado pelo Saramis® apresenta a similaridade de acordo
com o número de massas idênticas e não por porcentagem de similaridade ou
distância espectral (Manual do usuário Saramis®).
Vale ressaltar que, a base de cálculo utilizada para gerar o padrão de
similaridade no Saramis® é do tipo Euclidiana e também considera a intensidade dos
picos. Sendo essa, uma variável errática, não foi possível estabelecer uma relação
entre o padrão de similaridade gerado pelo Vitek MS®, tanto para os isolados de
EFSRV quanto para os isolados de EFMRV, quando comparado com a tipagem por
PFGE e MLST dos mesmos isolados.
Não foi possível gerar um dendrograma com o algoritmo Ward utilizando o
sistema Saramis®, o que poderia ter facilitado a comparação do dendrograma com
os espectros produzidos pelo Vitek MS® com o dendrograma obtido pelos outros
métodos, já que o algoritmo de Ward permite a construção de dendrograma
representando porcentagem de similaridade. Também não foi possível realizar a
importação do padrão de espectros obtidos pelo Vitek MS® para melhor avaliação
utilizando o BioNumerics 7.5, que permite gerar dendrograma desconsiderando a
intensidade dos picos.
Além disso, não encontramos nenhum estudo na literatura que utilizou o Vitek
MS® e o sistema Saramis® para tipagem de ERV. Deste modo, nós não
conseguimos comparar os nossos dados com outras experiências semelhantes para
127
Discussão
análise da similaridade.
Quanto ao Microflex LT® (Bruker) realizamos duas análises, uma pelo
programa BioTyper 3.1 OC e outra pelo BioNumerics 7.5. No primeiro programa, o
agrupamento foi realizado utilizando o padrão Euclidiano e o dendrograma do tipo
UHCA, que é o padrão disponível pelo programa BioTyper 3.1 OC. No segundo
programa, realizamos as análises por UPGMA (para facilitar a comparação com o
dendrograma também UPGMA obtido através da análise por PFGE) e pelo método
de Ward, desconsiderando a intensidade, possibilitando uma melhor reprodutividade
do método por gerar uma relação binária sobre a presença ou ausência de cada
espectro de massa, permitindo uma comparação com os métodos de tipagem que já
estão padronizados.
Apesar de ser uma técnica de fácil execução e de baixo custo, a sua
utilização para tipagem de microrganismos ainda não está muito bem padronizada,
fazendo-se necessário estabelecer alguns parâmetros. Quando utilizamos a técnica
de MALDI-TOF MS para tipagem dos Enterococcus spp. levantamos algumas
questões, que podem ter sido geradas por outros pesquisadores, por exemplo:
1 - Qual a matriz de distância, utilizada para agrupamento (“clusterização”),
pode ser a mais adequada? Acreditamos que a matriz pode depender do objetivo de
cada análise. No nosso caso, encontramos melhores resultados com o método
Euclidiano, com algumas modificações realizadas no tipo do algoritmo. É importante
lembrar que a técnica de MALDI-TOF MS utiliza as proteínas ribossomais e pode
gerar dezenas de picos, são necessários mais estudos para avaliar quais massas
devem ser utilizadas como parâmetro de tipagem e isso pode variar de acordo com
a espécie do microrganismo analisada, além da tolerância constante que deve ser
utilizada para a variação dos espectros.
2 - Qual o algoritmo de agrupamento mais adequado para cada tipo de
análise? Obtivemos melhores resultados com o algoritmo de Ward, excluindo a
intensidade dos picos, que foi possível apenas utilizando o programa BioNumerics
7.5. Sugerimos que o algoritmo para agrupamento seja realizado baseando-se
apenas nas massas, desconsiderando a “intensidade” das mesmas, que pode sofrer
influência quanto à matriz utilizada, o volume da matriz aplicado no spot, se o ensaio
foi realizado com ou sem extração de proteínas, pelo tipo de método de extração de
proteínas utilizado e pelo manipulador durante o preenchimento do spot (Croxatto, et
al 2012).
128
Discussão
3 - Qual o ponto de corte utilizado para avaliar a relação clonal entre os
isolados, seja por distância espectral, número de massas idênticas ou porcentagem
de similaridade? No nosso estudo, consideramos um coeficiente de similaridade
acima de 80% para definição de cada grupo de isolados. No entanto não existem
parâmetros na literatura para similaridade por MALDI-TOF MS e os estudos
disponíveis utilizaram algoritmos diferentes e não propuseram um coeficiente de
similaridade (Rim et al., 2015; Lash et al., 2014). Não estamos totalmente
convencidos que o coeficiente de similaridade de 80% pode responder as nossas
dúvidas sobre a relação clonal entre os isolados de Enterococcus spp. Este é um
estudo pioneiro, utilizando esse coeficiente de similaridade e o algoritmo de Ward,
no entanto, precisamos de mais estudos para deixar esses dados mais consistentes.
Nossos resultados do padrão de similaridade entre os isolados de EFSRV e
EFMRV pelo programa BioTyper 3.1 OC não permitiram estabelecer nenhum critério
de padronização do método, porque os resultados não foram reprodutíveis.
Avaliamos todos os métodos de clusterização disponíveis nesse programa e
obtivemos uma grande variação na similaridade dos isolados quando modificamos
os algoritmos.
Além disso, o tipo de dendrograma disponível no BioTyper 3.1 OC é sempre
UHCA e todos os métodos de agrupamento disponíveis realizam uma análise
multidimensional no cálculo da distância espectral correlacionando a massa e a sua
intensidade respectiva (Manual do Usuário MALDI BioTyper 3.1 OC). Ou seja, se
utilizados os espectros dos mesmos isolados em dias diferentes de ensaio, os
dendrogramas respectivos podem produzir um arranjo no padrão de similaridade
completamente diferente, dificultando a análise comparativa com os método de
tipagem conhecidos, tornando as ferramentas disponíveis pelo BioTyper 3.1 OC
para tipagem de Enterococcus spp. questionáveis ou pelo menos irreprodutíveis.
Quanto as análises realizadas no programa BioNumerics 7.5, com os
espectros importados do Microflex LT®, verificamos alguns pontos importantes para
serem discutidos:

Quando utilizamos o método de agrupamento UPGMA não tivemos uma boa
concordância com PFGE e MLST, porque alguns isolados com padrão de
bandas diferentes bem como STs diferentes, apresentaram similaridade
superior a 80% pela análise do padrão de massas, para ambas as espécies.
Isolados apresentando padrão de massas completamente diferentes foram
129
Discussão
considerados idênticos entre os isolados de E. faecalis, o que pode ter
ocorrido devido ao método de agrupamento levar em conta a intensidade das
massas e selecionar automaticamente os picos considerados principais como
parâmetro de clusterização.

Verificamos uma boa correlação entre a tipagem utilizando os espectros de
massas importados pelo Microflex LT® e as outras metodologias utilizadas
nesse estudo para tipagem dos ERV quando utilizamos o algoritmo de Ward
para construção dos dendrogramas no BioNumerics 7.5. Para EFSRV
observamos uma polarização dos isolados pertencentes a STs diferentes e
um agrupamento aos STs idênticos com similaridade superior a 80%.
Entretanto, o número de amostras utilizadas para realizar a tipagem pela
técnica de MLST no nosso estudo foi limitada, impossibilitando avaliar a
acurácia do MALDI-TOF MS para tipagem de outros STs, por exemplo o ST9
e o ST525, representados por apenas um isolado cada.

Para E. faecium a correlação entre a similaridade baseada nos espectros de
massas, mesmo utilizando o algoritmo de Ward, com PFGE e MLST não foi
muito boa. Um isolado pertencente ao ST18 e outro pertencente ao ST 412
apresentaram 96% de similaridade, além disso, o método não agrupou
isolados pertencentes ao mesmo ST. Esse fato pode ser explicado devido ao
polimorfismo encontrado entre isolados de E. faecium (Morrison et al., 1999).
No entanto, observamos a presença dos picos de massas: 4431, 6349, 7297
e 7312 em todos os isolados do ST412.

Observamos também que o pico 6349 não esteve presente no ST896.
Embora, esses dados tenham sido encontrados em um pequeno número de
isolados estudados, esses achados podem ser significativos e sugerir que a
presença dessas massas podem sugerir alguma relação com os isolados
pertencentes aos STs derivados do CC17. Para tanto, torna-se necessária a
construção de um banco de dados com vários STs diferentes bem como a
inclusão de vários indivíduos representando o mesmo ST, afim de verificar a
reprodutibilidade desses achados, além de confirmar a exclusividade desses
picos no ST412, que apresentou-se predominante entre os EFMRV no nosso
estudo.

Existem várias ferramentas que devemos melhor compreender para utilização
do MALDI-TOF MS para tipagem molecular, como por exemplo: o range de
130
Discussão
massas que deverão ser consideradas na análise; o número principal de
componentes (que avalia as características diferentes, relacionadas com
presença ou ausência de picos e intensidade); a análise do tipo Principal
Component Analysis (PCA), que realiza uma análise onde cada pico e sua
intensidade respectiva gera um dimensão diferente dentro de um gráfico de
PCA, ou seja cada pico uma dimensão, talvez esse método de análise não
apresente um poder discriminatório suficiente para realização de tipagem de
microrganismos, devido à sua falta de reprodutibilidade; a tolerância
constante que permite avaliar um range do desvio padrão das massas que
devem ser consideradas idênticas; o tipo da análise de matriz de distância (ou
seja, qual a fórmula base para cálculo da similaridade entre os isolados
analisados) e o método de clusterização.

Vale ressaltar a importância de um software que permita a personalização da
análise sobre a seleção dos picos, além de identificar os picos
discriminatórios para cada espécie.
Não conseguimos realizar a padronização de um protocolo para tipagem de
Enterococcus spp. utilizando MALDI-TOF MS, sobretudo da espécie E. faecium,
provavelmente devido ao seu grande polimorfismo que pode ser observado no
PFGE e na variedade dos STs existentes. Além disso, a profundidade analítica
filogenética que pode ser alcançada com base no proteoma avaliado no nosso
estudo é relativamente limitado, pelo menos com relação às duas espécies
analisadas.
Existem atualmente cerca de 10 trabalhos publicados sobre a utilização do
Microflex LT® para tipagem de bactérias patogênicas. (Rim et al., 2015; Lash et al.,
2014; Gherardi et al., 2014; Johansson et al., 2014; Josten et al., 2013; Mencacci et
al., 2013; Christensen et al., 2012; Wolters et al., 2011; Murray, 2010; Barbuddhe et
al., 2008).
Além disso, não existem protocolos definidos para tipagem de Enterococcus
spp., bem como da matriz e até mesmo os programas de informática ideais para
esse tipo de análise. Todos esses fatos podem resultar numa má reprodutibilidade e
comprometer o tamanho e a qualidade dos picos o que influencia diretamente no
agrupamento dos dendrogramas (Rim et al., 2015; Hamprecht et al., 2014; Lash et
al., 2014).
No entanto apenas cinco desses estudos realizaram a construção de
131
Discussão
dendrograma a partir dos espectros de massas para avaliação da similaridade dos
microrganismos analisados (Rim et al., 2015; Lash et al., 2014; Mencacci et al.,
2013; Christensen et al., 2012; Wolter et al., 2011). Apenas um trabalho foi publicado
sobre tipagem de E. faecium utilizando os espectros de massas obtidos pelo
Microflex LT® (Lash et al., 2014) relatando que a técnica de MALDI-TOF MS não
apresenta poder discriminatório para tipagem de E. faecium e S. aureus.
No estudo conduzido por Rim et al. (2015) avaliando Acinetobacter
baumannii, todos os cut-offs utilizados foram baseados em consultas com
profissionais especializados em bioestatística e esses pontos de corte foram
considerados arbitrários.
Apesar da falta de protocolos para tipagem por MALDI-TOF MS, verificamos
que o método de extração de proteínas ribossomais totais da colônia (com
acetonitrila e ácido fórmico) evidenciaram melhores escores no Microflex LT®
quando comparamos com o método direto da colônia sem a extração no Vitek MS®,
concordando com os achados de Griffin et al. (2012).
A dificuldade da correlação entre MALDI-TOF MS e os outros métodos de
tipagem pode ser explicada porque a técnica de espectrometria de massas utilizada
detecta apenas um subproteoma bacteriano bastante aleatório num range de
massas limitado (2.000-12.000 m/z) (Lash et al., 2014). Além disso, nessa
metodologia, apenas um número selecionado de proteínas é preferencialmente
ionizado, o que reduz o número possível de sinais disponíveis para caracterização
dos isolados e que a maior parte dos picos de massas e biomarcadores taxonespecíficos correspondem às proteínas ribossomais (Suarez et al., 2013).
Deve ser considerado que o nosso estudo apresenta algumas limitações, por
exemplo: apenas 22 isolados foram submetidos a técnica de MLST; não realizamos
sequenciamento do genoma completo dos nossos isolados o que poderia ter
facilitado a comparação com a análise pelo MALDI-TOF MS. Por outro lado,
sabemos que é um estudo multicêntrico pioneiro no Brasil, sobre a epidemiologia
molecular de isolados de Enterococcus spp. de ICS multicêntrico, trazendo
informações importantes sobre a distribuição dos ERV no Brasil e sobre os clones
mais prevalentes, além da utilização do MALDI-TOF MS para tipagem.
O nosso estudo pode também ser o início de uma nova proposta de tipagem,
onde o MALDI-TOF, que apresenta resultados de identificação de microrganismos
em pouco tempo, possa também, num futuro bem próximo ser utilizado para
132
Discussão
realização da tipagem de microrganismos de interesse clínico, assim como segregar
os Enterococcus spp. resistentes à vancomicina dos sensíveis e quem sabe, até
mesmo trazer informações sobre fatores de virulência e mecanismos de resistência,
proporcionando uma tipagem em tempo real” e uma gestão dos pacientes também
em “tempo real”.
Deste modo, são necessários mais estudos utilizando o MALDI-TOF MS com
o objetivo de padronizar a tipagem de microrganismos com protocolos de análise de
dendrograma reprodutíveis e que possam trazer informações importantes e
confiáveis para a prática médica. Apesar de ser um método de fácil execução,
rápido e de baixo custo-efetividade, quando comparado com os métodos de
sequenciamento e de PFGE, o poder discriminatório de MALDI-TOF MS para
tipagem de Enterococcus spp. ainda não foi totalmente explorado.
Outros estudos incluindo amostras de hemoculturas e de outros sítios e
também amostras de surtos, de diferentes centros médicos do Brasil poderão
fornecer maior diversidade molecular permitindo a construção de um banco de
dados de proteínas e de STs.
133
Conclusões
7. CONCLUSÕES
134
Conclusões

E. faecalis foi a espécie mais prevalente entre os isolados de Enterococcus
spp. de ICS.

Neoplasias foram as doenças de base mais encontradas entre os pacientes
com ICS por Enterococcus spp. Entre as doenças de bases e fatores
associados ao desenvolvimento de ICS, neoplasia foi significante para E.
faecium e cateter vesical para E. faecalis.

Tanto o método fenotípico quanto MALDI-TOF MS apresentaram boa
concordância com o método molecular para identificação das espécies de
Enterococcus isolados de ICS.

E. faecalis foram mais sensíveis a ampicilina e estreptomicina-sinergismo e E.
faecium apresentaram-se mais sensíveis a gentamicina-sinergismo. Todos os
isolados foram sensíveis a daptomicina e linezolida. Todos os isolados
resistentes à vancomicina apresentaram o gene vanA, sendo 60,6% dos E.
faecium e 13,6% dos E. faecalis.

De acordo com a tipagem por PFGE foram encontrados dois padrões (B e C)
predominantes entre os EFSRV, entre os EFMRV observou-se um maior
polimorfismo e três clusters, sendo o padrão A, o predominante. Na tipagem
por MLST o ST526 foi o mais encontrado entre os EFSRV. Para EFMRV o
ST412 foi o mais prevalente, encontrados em três regiões diferentes do
Brasil, sugerindo uma disseminação desse clone .

Vitek MS®, através do programa Saramis® e o
Microflex LT® utilizando o
programa BioTyper 3.1 OC não apresentaram poder discriminatório para
tipagem dos ERV.

A tipagem com os espectros produzidos no Microflex LT ® e analisados no
BioNumerics 7.5 apresentou uma boa concordância com o MLST para E.
faecalis, quando utilizado o algoritmo de Ward desconsiderando a intensidade
135
Conclusões
dos espectros. Mesmo utilizando Ward para E. faecium não houve boa
correlação com o MLST.
136
Anexos
8. ANEXOS
137
Anexos
8.1 Anexo 1
Tabela 14. Incongruências nas identificações dos isolados de Enterococcus spp.,
®
incluídos no Projeto SCOPE Brasil, pelos sistemas Phoenix e Vitek MS em relação a
PCR, e a sensibilidade à ampicilina e vancomicina.
Nº isolado
30.667
31.925
37.144
38.038
Nº isolado
34.501
34.632
39.453
41.093
Metodologia de Identificação
®
PCR
Phoenix
E. faecium
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
E. faecium
E. faecalis
E. faecium
E. faecalis
Metodologia de Identificação
®
PCR
Vitek MS
E. faecalis
E. faecium
E. faecium
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
E. faecium
E. faecalis
CIM (µg/mL)
AM
VC
>16
≤0,5
8
≤0,5
>16
1
>16
1
CIM (µg/mL)
AM
VC
>256
4
>256
>16
>256
4
>256
>16
138
Referências Bibliográficas
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