LH IRMA - Meditecno

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LH IRMA - Meditecno

LH IRMA
®
Coat-A-Count LH IRMA
English
Intended Use: Coat-A-Count LH IRMA is
an immunoradiometric assay designed for
the quantitative measurement of
luteinizing hormone (LH, lutropin) in serum
and heparinized or EDTA plasma. It is
intended strictly for in vitro diagnostic use
as an aid in clinical diagnosis of gonadal
dysfunction.
Catalog numbers: IKLH1 (100 tubes)
The 100-tube kit contains less
than 20 microcuries
(740 kilobecquerels) of
125
radioactive I polyclonal anti-LH.
Summary and Explanation of
the Test
Luteinizing hormone (LH, lutropin) is
secreted by the β-cells of the anterior
pituitary under the control of hypothalamic
gonadotropin releasing hormone (GnRH).
It is a carbohydrate-containing protein with
a molecular mass of approximately
28,000 daltons consisting of two
polypeptide chains designated alpha and
beta. The alpha chains of LH, FSH, TSH
and HCG are biochemically identical,
whereas the beta chains are biochemically
unique and confer biological and
immunological specificity. Bioactivity is
also determined by the beta chain.
LH in the female causes ovulation and
steroid (estrogen and progesterone)
production by the corpus luteum. In the
male it stimulates interstitial cells (Leydig
cells) to produce androgens and
estrogens. Small quantities of LH are also
necessary to promote estrogen production
by the FSH-stimulated maturing follicle.
Circulating levels of LH are controlled by a
negative feedback effect on the
hypothalamus by the steroid hormones.
Although LH and FSH are required for
normal sexual function in both males and
females, the secretory patterns are very
different for the two sexes. In sexually
mature adults, FSH and LH are not
secreted in constant amounts; rather,
secretion occurs in pulses which result in
rapid fluctuations over the entire reference
2
range (up or down by 50 to 100%).
Because of this pulsatile secretion,
samples obtained in a single day from the
same patient may fluctuate widely within
the reference range, reflecting
physiological variation rather than errors in
technique or methodology.
The primary clinical use of LH
measurement is in clearly defining the
hypothalamic-pituitary-gonadal axis.
Measurement of serum gonadotropin
levels will allow for distinguishing between
primary gonadal failure and deficient
gonadal stimulation. If LH and FSH levels
are elevated (hypergonadotropic
hypogonadism), primary gonadal failure is
present.
If, on the other hand, gonadotropin levels
are low (hypogonadotropic
hypogonadism), deficient gonadal
stimulation has resulted in the
hypogonadal state. Apart from the
essential role of LH and FSH
measurements in diagnosing gonadal
dysfunction, LH measurement is also of
clinical importance because growth
hormone and LH are frequently the first
hormones to be affected by pituitary
disease.
Serum determinations have been very
useful in the diagnosis and treatment of
infertility in women. A midcycle rise in the
LH level is a good indication that ovulation
will occur approximately 24 hours later.
Subfertile couples and also women being
treated with gonadotropins for infertility
can be informed that ovulation is about to
take place.
The reproductive phase in females is
terminated by menopause, when ovarian
function, with its estradiol secretion,
decreases and eventually ceases. Due to
low levels of circulating estradiol and
progesterone, there is a loss of negative
feedback to the hypothalamus; as a result,
circulating levels of LH are greatly
increased. Similarly, LH levels are
increased in younger women of
premenopausal age who suffer ovarian
failure or whose ovaries have failed to
develop during puberty. It is important to
note that the midcycle peak is completely
obliterated in healthy women using oral
Coat-A-Count LH IRMA (PIIKLH-9, 2010-11-02)
contraceptives, reappearing in the first full
cycle after the medication is discontinued.
No effect on LH levels has been found
following fasting, feeding, physical stress
and exercise, insulin hypoglycemia or
arginine monohydrochloride infusion (used
for studies of growth hormone).
Testosterone and estrogen administration
depress LH levels in the post-menopausal
state.
Principle of the Procedure
Some components supplied in this kit may
contain human source material and/or
other potentially hazardous ingredients
which necessitate certain precautions.
Follow universal precautions, and handle
all components as if capable of
transmitting infectious agents. Source
materials derived from human blood were
tested and found nonreactive for syphilis;
for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis
B surface antigen; and for antibodies to
hepatitis C.
Coat-A-Count LH IRMA is a solid-phase
immunoradiometric assay based on
monoclonal and polyclonal anti-LH
125
antibodies: I-labeled anti-LH polyclonal
antibodies in liquid phase, and monoclonal
anti-LH antibodies immobilized to the wall
of a polystyrene tube.
Sodium azide, at concentrations less than
0.1 g/dL, has been added as a
preservative. On disposal, flush with large
volumes of water to prevent the buildup of
potentially explosive metal azides in lead
and copper plumbing.
In the procedure:
Radioactivity
A copy of any radioisotope license
certificate (Specific or General) issued to a
US customer must be on file with Siemens
Healthcare Diagnostics before kits or
components containing radioactive
material can be shipped. These
radioactive materials may be acquired by
any customer with the appropriate Specific
license. Under a General license these
radioactive materials may be acquired
only by physicians, veterinarians in the
practice of veterinary medicine, clinical
laboratories and hospitals — and strictly
for in vitro clinical or laboratory tests not
involving external or internal
administration of the radioactive material
or its radiation to human beings or other
animals. Its acquisition, receipt, storage,
use, transfer and disposal are all subject
to the regulations and a (General or
Specific) license of the U.S. Nuclear
Regulatory Commission or a State with
which the NRC has entered into an
agreement for the exercise of regulatory
control.
LH is captured between monoclonal antiLH antibodies immobilized on the inside
surface of the polystyrene tube and the
radio-labeled polyclonal anti-LH tracer.
125
Unbound I-labeled anti-LH antibodies
are removed by decanting the reaction
mixture and washing the tube; this
reduces nonspecific binding to a very low
level, and ensures excellent low-end
precision.
The LH concentration is directly
proportional to the radioactivity present in
the tube after the wash step. The
radioactivity is counted using a gamma
counter, after which the concentration of
LH in the patient sample is obtained by
comparing the patient counts-per-minute
with those obtained for the set of
calibrators provided.
Reagents to Pipet: 1
Total Incubation Time: 1 Hour (on a rack
shaker)
Total Counts at Iodination:
approximately 300,000 cpm
Warnings and Precautions
For in vitro diagnostic use.
Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator
designated for incoming radioactive
materials. Dispose of in accordance with
applicable laws.
Do not use reagents beyond their
expiration dates.
Water: Use distilled or deionized water.
Handle radioactive materials according to
the requirements of your General or
Specific license. To minimize exposure to
radiation, the user should adhere to
guidelines set forth in the National Bureau
of Standards publication on the Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
and in subsequent publications issued by
State and Federal authorities.
3
Wipe up spills promptly and
decontaminate affected surfaces. Avoid
generation of aerosols. Dispose of solid
radioactive waste according to license
requirements. General licensees (holders
of NRC Form 483) may dispose of solid
radioactive waste as nonradioactive
waste, after removing labeling. Specific
licensees (NRC Form 313) should refer to
Title 10, Code of Federal Regulations,
Part 20. Licensees in Agreement States
should refer to the appropriate regulations
of their own state. General licensees may
dispose of liquid radioactive waste of the
type contained in this product through a
laboratory sink drain. Licensees must
remove or deface labels from empty
containers of radioactive materials before
disposal of solid waste. Specific licensees
may dispose of small quantities of liquid
radioactive waste of the type used in this
product through a laboratory sink drain.
Refer to the appropriate regulations
applicable to your laboratory.
Materials Supplied:
Initial Preparation
LH Ab-Coated Tubes (ILH1)
Polystyrene tubes coated with murine
monoclonal antibodies to LH and
packaged in zip-lock bags. Store
refrigerated and protected from moisture,
carefully resealing the bags after opening.
Stable at 2–8°C until the expiration date
marked on the bag.
IKLH1: 100 tubes.
125
I LH Ab (ILH2)
Iodinated goat anti-LH polyclonal
antibodies. The reagent is supplied in
liquid form, ready to use. Each vial
contains 5.5 mL. Stable at 2-8°C for 30
days after opening, or until the expiration
date marked on the label.
IKLH1: 2 vials.
LH Calibrators (LHI3–9,X)
Eight vials, labeled A through H, of
lyophilized LH calibrators in a human
serum/buffer matrix, with preservative. At
least 30 minutes before use, reconstitute
the zero calibrator A with 6 mL distilled or
deionized water, and the remaining
calibrators B through H with 3 mL each.
Stable at 2–8°C for 30 days after
reconstitution, or at –20°C (aliquotted) for
4
2 months.
IKLH1: 1 set.
The reconstituted calibrators contain,
respectively, 0, 1.5, 7.5, 15, 30, 75, 150
and 300 milli-International Units of LH per
milliliter (mIU/mL) in terms of the World
Health Organization's First International
Reference Preparationof LH for
Immunoassay, number 68/40 (1st IRP
68/40), and World Health Organization's
Second International Standard of LH for
Immunoassay, number 80/552 (2nd IS
80/552). Intermediate calibration points
may be obtained by mixing calibrators in
suitable proportions.
Note that the Coat-A-Count LH IRMA
calibrators are not interchangeable with
those supplied in the Double Antibody LH
kit.
Buffered Wash Solution Concentrate
(1TSBW)
Concentrated buffered saline solution,
with surfactants, and with sodium azide as
a preservative. Using a transfer container,
dilute the contents of each vial with
400 mL distilled water, for a total volume
of 440 mL. Stable at 2–8°C for 6 months
after preparation.
IKLH1: 1 vial × 40 mL.
Materials Required But Not
Provided
Gamma counter — compatible with
standard 12x75 mm tubes
Rack shaker — set at approximately 200
strokes per minute
Reagent Preparation
Distilled or deionized water
Volumetric pipet: 3.0 mL
Graduated cylinder — for dispensing
400 mL
Plastic storage container with lid – for
preparation and storage of Buffered Wash
Solution
Immunoassay
Micropipets: 100 µL and 200 µL
Dispenser — for delivering 2.0 mL of
Buffered Wash Solution
Foam decanting rack — available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: FDR).
3-cycle log-log graph paper
1
A tri-level, human serum-based
immunoassay control, containing LH as
one of over 25 assayed constituents, is
available from Siemens Healthcare
Diagnostics (catalog number: CON6)
Label sixteen LH Ab-Coated Tubes A
(nonspecific binding) and B through H
("maximum binding") in duplicate.
Label additional LH Ab-Coated Tubes,
also in duplicate, for controls and
patient samples.
Optionally, label two plain (uncoated)
12x75 mm polystyrene tubes T (total
counts) in duplicate.
Specimen Collection
The patient need not be fasting, and no
special preparations are necessary.
14
Collect blood by venipuncture into plain,
heparinized or EDTA tubes, being very
careful to avoid hemolysis, and separate
the serum or plasma from the cells. (See
also the section on Alternate Sample
Types.) Since LH is known to exhibit a
small circadian rhythm, the time of
collection should be noted.
Calibrators
WHO 1st IRP 68/40
WHO 2nd IS 80/552
mIU/mL
T*
—
A (NSB)
0
B
1.5
C
7.5
The use of an ultracentrifuge is
recommended to clear lipemic samples.
Hemolyzed samples may indicate
mistreatment of a specimen before receipt
by the laboratory; hence the results should
be interpreted with caution.
Blood collection tubes from different
manufacturers may yield differing values,
depending on materials and additives,
including gel or physical barriers, clot
activators and/or anticoagulants. Coat-ACount LH IRMA has not been tested with
all possible variations of tube types.
Consult the section on Alternate Sample
Types for details on tubes that have been
tested.
2
15
3
F
75
G
150
H ("MB")
300
Pipet 200 µL of each calibrator,
control and patient sample into the
tubes prepared.
Add 100 µL of
tube.
125
I LH Ab to every
Pipet directly to the bottom, and make
sure that sample and tracer are
thoroughly mixed. A repeating
dispenser is recommended. Set the
(optional) T tubes aside for counting at
step 6; they require no further
processing.
Samples expected to exceed the
concentration of the highest calibrator
(300 mIU/mL) should be diluted with the
zero calibrator before assay.
All components must be at room
temperature (15–28°C) before use.
30
Pipet directly to the bottom. Patient
samples expected to contain LH
concentrations greater than the
highest calibrator (300 mIU/mL)
should be diluted in the zero calibrator
before assay. The use of disposabletip micropipets is recommended, to
avoid carryover from sample to
sample. Positive-displacement pipets
and automatic pipettor-diluters should
be used only if the possibility of
carryover has been evaluated and
found to be insignificant.
Storage: 2–8°C for 2 weeks, or at –20°C
for up to 2 months.
Immunometric Assay
Procedure
15
E
* Optional
Volume Required: 200 µL of serum or
plasma per tube.
Before assay, allow samples to come to
room temperature (15–28°C) and mix by
gentle swirling or inversion. Aliquot, if
necessary, to avoid repeated thawing and
freezing. Do not attempt to thaw frozen
specimens by heating them in a
waterbath.
D
4
Shake for 1 hour on a rack shaker.
5
Decant and drain thoroughly. Next,
add 2.0 mL Buffered Wash Solution to
each tube. Wait 1 to 2 minutes, then
5
decant thoroughly. Again add 2.0 mL
Buffered Wash Solution, wait 1 to 2
minutes, and decant thoroughly.
Removing all visible moisture will
greatly enhance precision. After the
second wash, decant the contents of
all tubes (except the T tubes) using a
foam decanting rack, and allow them
to drain for 2 or 3 minutes. Then strike
the tubes sharply on absorbant paper
to shake off all residual droplets.
6
Count for 1 minute in a gamma
counter.
In multi-head gamma counters, the
(optional) Total Counts tubes should
be separated from the remaining
assay tubes by at least one space, to
minimize the possibility of spillover.
Calculation and Quality Control
To calculate results (in terms of
concentration units) from a log-log
representation of the calibration curve, first
correct the counts per minute (CPM) of
each pair of tubes by subtracting the
average CPM of the nonspecific binding
tubes (calibrator A):
Net Counts = Average CPM minus Average
NSB CPM
Then determine percent binding (relative
to that of the highest calibrator) — here
called "%B/MB" — of each pair of tubes as
a percent of "maximum binding," with the
NSB-corrected counts of the highest
calibrator taken as 100%:
Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts)
× 100
Using 3-cycle log-log graph paper, plot
Percent Bound versus Concentration for
each of the nonzero calibrators, and draw
a curve approximating the path of these
points. (Connect the calibration points with
arcs or straight line segments. Do not
attempt to fit a single straight line to the
data.) Concentrations for controls and
unknowns within range of the nonzero
calibrators may then be estimated from
the calibration curve by interpolation. An
additional plot of Percent Bound versus
Concentration for the three lowest
calibrators on linear-linear graph paper
may be used for interpolation near zero
dose.
6
Comments: Although other approaches
are acceptable, data reduction by the
method just described has certain
advantages from the standpoint of quality
control. In particular, it yields a calibration
curve that is relatively linear in both log-log
and linear-linear representations, and
relatively stable from assay to assay. It
also yields valuable QC parameters,
namely, Percent Bound (%B/MB) values
for the nonzero calibrators. A still more
informative graph, conveying a sense of
within-assay reproducibility as a function
of concentration, can be obtained by
plotting the Percent Bound values of
individual calibrator tubes directly, i.e.
without first averaging the CPM of
replicates.
Alternatives: Although Percent Bound
can be calculated directly from Average
CPM, correction for nonspecific binding
usually produces a calibration curve that is
more nearly linear throughout its range. A
calibration curve can also be constructed
by plotting CPM or Average CPM directly
against Concentration on either log-log or
linear-linear graph paper. (Semi-log graph
paper should not be used.) This approach
has the virtue of simplicity, but is less
desirable from the standpoint of quality
control.
Computerized Data Reduction: "Pointto-point" methods, including linear and
cubic spline fits, are suitable; but since
they provide little assistance in monitoring
the integrity of an assay, it is important to
prepare the recommended log-log plot of
the calibration curve, either manually or by
computer, as a quality control step. Data
reduction techniques based on the logistic
model may also be applicable. Within this
family, curve fitting routines based on the
4- or 5-parameter logistic are the most
suitable candidates. However, some
algorithms currently in use may not
converge successfully, even when the
logistic model is true to the data. If a
logistic method is adopted, it is essential
to verify its appropriateness for each day's
assay by monitoring the backcalculation of
the calibrators, and other parameters. In
addition, a plot of the calibration curve in a
log-log representation is highly
recommended, as this is more informative
than the conventional semi-log plot.
Sample Handling: The instructions for
handling and storing patient samples and
components should be carefully observed.
Dilute patient samples expected to contain
LH concentrations greater than the
highest calibrator (300 mIU/mL) with the
zero calibrator before assay. All samples,
including the calibrators and controls,
should be assayed at least in duplicate. It
is important to use a disposable-tip
micropipet, changing the tip between
samples, to avoid carryover
contamination. Positive-displacement
pipets and automatic pipettor-diluters
should be used only if the possibility of
carryover has been evaluated and found
to be insignificant. Pairs of control tubes
may be spaced throughout the assay to
help verify the absence of significant drift.
Inspect the results for agreement within
tube pairs.
Gamma Counter: To minimize the
possibility of spillover in multi-well gamma
counters, the optional total counts tubes
(T) should be separated by one or more
spaces from the other assay tubes.
Alternatively, add only 25 µL of the tracer
to each of the T tubes at step 3, and
multiply the observed counts per minute in
these tubes by 4.
Controls: Controls or serum pools with at
least two LH concentration levels (low and
high) should routinely be assayed as
unknowns, and the results charted from
day to day as described in Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981; 27:493-501. Repeat
samples are a valuable additional tool for
monitoring interassay precision.
Further Reading: See Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985; 31:1264-71.
Example Run: For illustration only, not for
calculating results from another run. (See
"Example Run" table.)
Expected Values
For a woman of childbearing age not
taking contraceptives, the LH reference
range is a function of her position in the
menstrual cycle. Accordingly, normally
ovulating women were monitored
throughout one cycle using the
Coat-A-Count LH IRMA kit. Serum
samples were collected at intervals for 28
days commencing with the last menstrual
period. Normalization to the midcycle peak
was achieved by designating for each
subject the occasion of her LH peak as
day zero. Assignment of the samples to
the follicular and luteal phases was made
by working backward for the follicular
phase and forward for the luteal phase. In
addition, samples from 74 adult males
were also assayed by the Coat-A-Count
LH IRMA procedure. The results are
tabulated below in mIU/mL (WHO 1st IRP
68/40 and WHO 2nd IRP 80/552).
Group
Adult Males
95% Absolute
Range Range
n Median (mIU/mL) (mIU/mL)
74
2.0
0.4 – 5.7
0.6 – 6.2
Females
Follicular
58
2.1
Midcycle
10
29.5
Luteal
78
1.6
T = Total Counts (as counts per minute)
Postmenopausal
18
19.3
%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total
Counts)
Oral
Contraceptives
104
1.8
QC Parameters: We recommend keeping
track of these performance measures:
12 – 51
ND – 6.0
11 – 50
ND – 5.9
%MB = 100 × (Net MB Counts / Total Counts)
ND: not detectable
And the Percent Bound ("%B/MB") values
of all but the highest of the nonzero
calibrators, for example:
Laboratories should consider these results
as guidelines only. Each laboratory should
establish its own reference ranges.
%C/MB = 100 × (Net Calibrator "C" Counts / Net
MB Counts)
Nine normally ovulating women were
followed throughout one cycle using the
Coat-A-Count LH IRMA procedure. Serum
collection, as well as normalization of LH
values relative to the midcycle peak, were
achieved as described above. The graph
below depicts maximum, mean and
minimum LH values in mIU/mL (WHO 1st
IRP 68/40 and WHO 2nd IS 80/552) for
Record Keeping: It is good laboratory
practice to record for each assay the lot
numbers of the components used, as well
as the dates when they were first
reconstituted or opened.
7
these samples on each day in the cycle.
(LH concentration is indicated on the
y-axis and normalized cycle day on the
x-axis.)
from the results of pairs of tubes in 20
different assays. (See "Interassay
Precision" table.)
Specificity: The Coat-A-Count LH IRMA
antibodies are highly specific for LH, with
low crossreactivity to structurally related
glycoprotein hormones such as FSH, HCG
and TSH. (See "Specificity" table for
representative data.)
End-of-Run Effect: None up to
approximately 200 tubes. (See "End-ofRun Effect" table.)
Linearity: Samples were assayed under
various dilutions. (See "Linearity" table for
Recovery: Samples spiked 1 to 19 with
two LH solutions (475 and 1,025 mIU/mL)
were assayed. (See "Recovery" table for
Limitation
Because of pulsatile secretion, samples
obtained within the same day from the
same patient may fluctuate widely within
the reference range, reflecting
physiological variation rather than errors in
technique or methodology.
Performance Data
LH results in the sections below are
expressed as milli-International Units of
LH per milliliter (mIU/mL) in terms of the
World Health Organization's First
International Reference Preparation of LH
for Immunoassay, number 68/40 (1st IRP
68/40), and World Health Organization's
Second International Standard of LH for
Immunoassay, number 80/552 (2nd IS
80/552).
Unless otherwise specified, results are
based upon analysis of serum samples.
Calibration Range: Up to 300 mIU/mL
(WHO 1st IRP 68/40 and 2nd IS 80/552)
Bilirubin: Presence of bilirubin in
concentrations up to 200 mg/L has no
effect on results, within the precision of the
assay.
Hemolysis: Presence of packed red blood
cells in concentrations up to 30 µL/mL has
no effect on results, within the precision of
the assay.
Alternate Sample Type: To assess the
effect of alternate sample types, blood
was collected from 10 volunteers into
plain, heparinized, EDTA and Becton
®
Dickinson SST vacutainer tubes. All
samples were assayed by the
Coat-A-Count LH IRMA procedure, with
the following results.
(Heparin) = 1.03 (Serum) – 0.3 mIU/mL
r = 0.999
(EDTA) = 0.95 (Serum) + 0.6 mIU/mL
r = 0.993
(SST) = 1.02 (Plain tubes) – 0.19 mIU/mL
r = 0.999
High-dose Hook Effect: Up to
20,000 mIU/mL.
Means:
10.4 mIU/mL (Serum)
10.4 mIU/mL (Heparin)
10.5 mIU/mL (EDTA)
10.4 mIU/mL (SST)
Intraassay Precision (Within-Run):
Statistics were calculated for samples
from the results of 20 pairs of tubes in a
single assay. Results are expressed in
mIU/mL. (See "Intraassay Precision"
table.)
Method Comparison: The Coat-A-Count
LH IRMA procedure was compared to
IMMULITE LH on 46 patient samples with
LH concentrations ranging from
approximately 0.5 to over 50 mIU/mL.
(See graph) By linear regression:
Interassay Precision (Run-to-Run):
Statistics were calculated for samples
(CAC IRMA) = 0.79 (IML) – 0.24 mIU/mL
r = 0.972
Analytical Sensitivity: 0.15 mIU/mL.
8
Means:
8.1 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA)
10.5 mIU/mL (IMMULITE)
References
1) Beitens I, et al. Gonadotropin determinations
in timed 3-hour urine collections during the
menstrual cycle and lhrh testing. J Clin Endo
Metab 1976;43:46-55. 2) Chipman J, et al.
Interrelationship of plasma and urinary
gonadotropins: correlations for 24 hours, for
sleep/wake periods, and for 3 hours after
luteinizing hormone-releasing hormone
stimulation. Clin Endo Metab 1981;52:225-30. 3)
Davidsohn I, Henry J, editors. Clinical diagnosis
by laboratory methods. 15th ed. Philadelphia:
W.B. Saunders, 1974: 704. 4) Kulin H, et al.
Integration of pulsatile gonadotropin secretion by
timed urinary measurements: an accurate and
sensitive 3-hour test. J Clin Endo Metab
1975;40:783-9. 5) Kulin H, Santner S. Timed
urinary gonadotropin measurements in normal
infants, children, and adults, and in patients with
disorders of sexual maturation. J Pediatrics
1977;90:760-5. 6) Nankin H, et al. Repetitive
luteinizing hormone elevations in serum of
normal men. J Clin Endo Metab 1972;33:558-60.
7) Odell W, et al. Radioimmunoassay for
luteinizing hormone in human plasma or serum.
J Clin Invest 1967;46:248. 8) Peterson MA,
Swerdloff RS. Separation of bound from free
hormone in radioimmunoassay of lutropin and
follitropin. Clin Chem 1979;25:1239-41. 9) Rebar
R, Yen S. In: Dorothy Krieger, editor. Endocrine
rhythms. New York: Raven Press, 1979. 10)
Santner S, Santen R, Kulin H, Demers L. A
model for validation of radioimmunoassay kit
reagents: measurement of follitropin and lutropin
in blood and urine. Clin Chem 1981;27:1892-5.
11) Urban M, et al. Comparison of estimates of
gonadotropin levels by isolated blood samples,
integrated blood concentrations, and timed
urinary fractions. J Clin Endo Metab
1979;48:732-5. 12) Wood WG, Stalla G, Muller
OA, Scriba PC. A rapid and specific method for
separation of bound and free antigen in
radioimmunoassay systems. J Clin Chem Clin
Biochem 1979;17:111-4. 13) Zia P, Coombes R.
Simplified radioimmunoassay of follicle
stimulating hormone and luteinizing hormone in
human urine. AACC abstract (1981). 14)
National Committee for Clinical Laboratory
Standards. Procedures for the collection of
diagnostic blood specimens by venipuncture;
approved standard. 4th ed. NCCLS Document
H3-A4, Wayne, PA: NCCLS, 1998. 15) Burtis
CA, Ashwood ER, editors. Tietz textbook of
clinical chemistry. 2nd ed. Philadelphia: W.B.
Saunders, 1994:920.
To place an order: Tel: 800.255.3232.
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The Quality System of Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003.
Tables and Graphs
Example Run
Tube1
Duplicate Average
CPM2
CPM3
T7
242,352
242,401
242,450
Net
CPM4
Percent
LH
Bound5 mIU/mL6
A
(NSB)8
131
141
136
0
—
0
B
607
643
625
489
0.9%
1.5
C
2,435
2,652
2,544
2,408
4.4%
7.5
D
4,614
4,633
4,624
4,488
8.3%
15
E
8,296
8,497
8,397
8,261
15.2%
30
F
20,885
21,195
21,040
20,904
38.5%
75
G
36,602
37,124
36,863
36,727
67.7%
150
H
("MB")9
53,834
54,391
54,113
53,977
100%
300
10
Unknowns
X1
1,593
1,682
1,638
1,502
2.8%
5
X2
8,627
8,821
8,724
8,588
15.8%
31
X3
17,746
17,895
17,821
17,685
32.6%
64
Quality Control Parameters:11
T7 = 242,401 cpm
%NSB8 = 0.06%
%MB9 = 22%
Intraassay Precision (mIU/mL)
Mean1
SD2
CV3
1
9.3
0.15
1.6%
2
16.4
0.20
1.2%
3
22.4
0.22
1.0%
Technical Assistance
In the United States, contact Siemens
Healthcare Diagnostics Technical
Services department. Tel: 877.229.3711.
9
Interassay Precision (mIU/mL)
1
2
Linearity (mIU/mL)
3
Mean
SD
CV
1
2.1
0.15
7.1%
2
6.3
0.21
3
9.2
4
16.8
5
6
Dilution1 Observed2 Expected3 %O/E4
8 in 85
25.1
—
—
3.3%
4 in 8
13.2
12.6
105%
0.24
2.6%
2 in 8
6.5
6.3
103%
0.37
2.2%
1 in 8
3.1
3.1
100%
19.9
0.74
3.7%
8 in 8
25.4
—
—
23.8
0.81
3.4%
4 in 8
13.7
12.7
108%
2 in 8
6.5
6.4
102%
1 in 8
3.5
3.2
109%
16 in 16
40.3
—
—
8 in 16
21.9
20.2
108%
4 in 16
10.4
10.1
103%
2 in 16
4.9
5.0
98%
1 in 16
2.7
2.5
108%
Specificity
TSH
HCG
2
3
Amount
Added2
Apparent
mIU/mL3
2,000 mIU/mL
0.31
100 mIU/mL
ND
Compound1
FSH
1
1,000 µIU/mL
2.7
100 µIU/mL
0.35
27,000 mIU/mL
839 mIU/mL
4
16 in 16
54.5
—
—
8 in 16
27.5
27.3
101%
14.2
4 in 16
13.7
13.6
101%
8.4
2 in 16
6.3
6.8
93%
1 in 16
3.6
3.4
106%
ND: not detectable4
End-of-Run Effect (mIU/mL)
Tubes1
19-30
Tubes
87-98
Tubes
155-156
Tubes
224-234
1
2.4
2.2
2.3
1.7
2
6.6
6.7
6.3
6.1
3
9.4
9.4
9.3
8.8
4
17
17
17
16
5
6
20
23
20
23
20
22
20
Recovery (mIU/mL)
Solution1 Observed2 Expected3 % O/E4
1
2
23
3
4
10
—
1.8
—
—
A
23.2
25.7
90%
95%
B
49.9
52.7
—
2.0
—
—
A
26.5
25.9
102%
103%
B
54.5
52.9
—
2.1
—
—
A
23.1
26.0
89%
91%
B
48.0
53.0
—
2.3
—
—
A
23.7
26.2
90%
B
50.7
53.2
95%
11
Parametri per il Controllo di Qualità.
Intraassay Precision: 1Media, 2SD (Deviazione
Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione).
Interassay Precision: 1Media, 2SD (Deviazione
Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione).
Linearity: 1Diluizione, 2Osservato (O), 3Atteso
(A), 4%O/A, 58 in 8. Recovery: 1Soluzione,
2
Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A. Specificity:
1
Composto, 2quantità aggiunta, 3Percentuale di
Crossreattività, 4ND: non determinabile. End-ofRun Effect: 1Provette.
Method Comparison
50
CAC LH IRMA
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
IMMULITE LH, mIU/mL
(CAC IRMA) = 0.79 (IML) – 0.24 mIU/mL
r = 0.972
Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat
CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent
Bindung, 6Ca. LH, mIU/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Unbekannte,
11
Qualitätskontrollparameter. Intraassay
Precision: 1Mittelwert, 2SD
(Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Interassay Precision:
1
Mittelwert, 2SD (Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Linearity: 1Verdünnung,
2
Beobachtet (B), 3Erwartet (E), 4% B/E, 58 in 8.
Recovery: 1Lösung, 2Beobachtet (B), 3Erwartet
(E), 4% B/E. Specificity: 1Verbindung,
2
zugesetzte Menge, 3% Kreuzreaktivität, 4NN:
Nicht nachweisbar. End-of-Run Effect:
1
Röhrchen.
1
2
Español. Example Run: Tubo, Duplicado
CPM, 3Media CPM, 4 CPM Netas, 5Porcentaje
de unión, 6LH, aprox., mIU/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Desconocido, 11Parámetros del control
de calidad. Intraassay Precision: 1Media, 2DS,
3
CV. Interassay Precision: 1Media, 2DS, 3CV.
Linearity: 1 Dilución, 2Observado (O),
3
Esperado (E), 4%O/E, 58 en 8. Recovery:
1
Solución, 2Observado (O), 3Esperado (E),
4
%O/E. Specificity: 1Compuesto, 2 Cantidad
añadida, 3% Reacción cruzada, 4ND: no
detectable. End-of-Run Effect: 1Tubos.
1
2
Français. Example Run: Tube, Duplicate
CPM, 3 CPM moyen, CPM corrigé,
Pourcentage lié, 6Approx. LH, mIU/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Patients, 11Paramètres
Contrôle de Qualité. Précision Intra dosage:
1
Moyenne, 2SD, 3CV. Précision Inter dosage:
1
Moyenne, 2SD, 3CV. Linéarité: 1Dilution,
2
Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A, 58 dans 8.
Récupération: 1Solution, 2Observé (O),
3
Attendu (A), 4%O/A. Spécificité: 1Composé,
2
ajouté, 3Réaction croisée%. 4ND: non
détectable. Effet de Série: 1Tubes.
5
Italiano. Example Run: 1Provetta, 2CPM in
duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti,
5
Percentuale di Legato, 6Appross. LH, mIU/mL,
7
Totale, 8%NSB, 9%MB, 10 Campioni Non Noti,
Português. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem
de Ligação, 6Aprox. LH, mIU/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Desconhecidas, 11Parâmetros do
controlo de qualidade. Intraassay Precision:
1
Média, 2Desvio padrão, 3Coeficiente de
variação. Interassay Precision: 1Média,
2
Desvio padrão, 3Coeficiente de variação.
Linearity: 1Diluição, 2Observado (O), 3Esperado
(E), 4%O/E, 58 em 8. Recovery: 1Solução,
2
Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E.
Specificity: 1Composto, 2Quantidade
adicionada, 3Percentagem de reacção cruzada,
4
ND: não detectável. End-of-Run Effect:
1
Tubos.
Deutsch
Anwendung: Immunradiometrischer
Assay (beschichtete Röhrchen) zur
quantitativen Bestimmung des
Luteinisierenden Hormons (LH, Lutropin)
im Serum, Heparin- oder EDTA-Plasma.
Der Test ist ausschließlich in der In-VitroDiagnostik im Zusammenhang mit der
klinischen Diagnose von gonadalen
Erkrankungen einzusetzen.
Artikelnummern: IKLH1 (100 Tests)
Die Packung mit 100 Röhrchen
enthält weniger als 20 Microcurie
(740 Kilobequerel) an
125
radioaktivem I-markierten polyklonalen
LH-Antikörpern.
Klinische Relevanz
Luteinisierendes Hormon (Lutropin, LH) ist
ein Kohlenhydratprotein mit einem
Molekulargewicht von 28 000 Dalton, es
wird durch die B-Zellen der vorderen
Hypophyse sezerniert. Die Kontrolle der
Ausschüttung erfolgt durch das
Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH)
des Hypothalamus. LH besteht aus zwei
Polypeptidketten, die Alpha- und die Beta11
Kette. Die Alpha-Ketten von LH, FSH,
TSH und HCG sind biochemisch identisch,
während die jeweiligen Beta-Ketten
eindeutig biochemisch sind und
verantwortlich für die Bioaktivität, sowie für
die biologische und immunologische
Spezifität der Hormone.
In Frauen verursacht das LH die Ovulation
und die Produktion der Steroide Östrogen
und Progesteron durch den Corpus
luteum. Im Mann stimuliert das LH die
Ledig-Zellen zur Produktion von
Androgenen und Östrogenen. Kleine
Mengen an LH sind zusätzlich noch nötig
um die Östrogenproduktion im FSHheranreifenden Follikel zu fördern. Die
zirkulierenden LH-Spiegel unterliegen der
Kontrolle durch einen, von
Steroidhormonen gesteuerten, negativen
Rückkopplungseffekt auf den
Hypothalamus. Obwohl LH und FSH für
die normale sexuelle Funktion in beiden
Geschlechtern notwendig sind, sind die
sekretorischen Muster in beiden
Geschlechtern unterschiedlich. Bei
geschlechtsreifen Erwachsenen, erfolgt
die FSH und LH-Ausschüttung nicht in
konstanten Mengen, sondern erfolgt
pulsartig mit schnellen Fluktuationen über
den gesamten Referenzwertbereich (unter
oder über 50 bis 100%). Wegen dieser
pulsartigen Ausschüttung, können Proben,
die an einem Tag von einem Patienten
entnommen wurden, weit innerhalb des
Referenzbereiches schwanken,
wiedergespiegelte physiologische
Schwankungen, eher als Fehler in der
Technik oder Methodik.
Die primäre klinische Anwendung der LHMessung ist die eindeutige
Zustandsbeschreibung der HypothalamusHypophysen-Gonaden-Achse.
Gonadotropinbestimmungen aus dem
Serum erlauben die Unterscheidung
zwischen einer primären Gonadenstörung
und einer unzulänglichen Stimulation der
Gonaden. Erhöhte LH- und FSHKonzentrationen verweisen auf einen
vorhandenen primären Schaden der
Gonaden.
Wohingegen bei niedrigen GonadotropinKonzentrationen eine unzureichende
gondale Stimulation zum
Hypogonadismus führt. Abgesehen von
der wesentlichen Funktion von LH und
FSH Messungen beim diagnostizieren von
gonadalen Dysfunktionen, sind LH12
Messungen von großer klinischer
Wichtigkeit, da LH und
Wachstumshormone häufig die ersten
Hormone sind, die von Erkrankungen der
Hypophyse beeinflusst werden.
LH-Bestimmungen im Serum haben sich
als sehr nützlich in der Diagnose und
Therapie von Infertilität bei der Frau
erwiesen. Ein Anstieg in der mittleren
Zyklusphase lässt den Eisprung innerhalb
der nächsten 24 Stunden erwarten.
Subfertile Paare und Frauen, die mit
Gonadotropinen gegen Infertilität
behandelt werden, können somit über den
bevorstehenden Eisprung informiert
werden.
Die reproduktive Phase der Frau wird
durch die Menopause beendet, wenn die
Ovarialfunktion und damit die
Östadiolsekretion abnimmt oder eventuell
sogar komplett eingestellt wird. Aufgrund
der niedrigen zirkulierenden Östradiol- und
Progesteron-Spiegel wird der negative
Feedback zum Hypothalamus reduziert,
was dazu führt, dass die zirkulierenden
LH-Spiegel stark ansteigen. Genauso sind
die LH Spiegel bei jüngeren
prämenopausalen Frauen erhöht, wenn
Erkrankungen des Ovars vorliegen oder
die Ovarien während der Pubertät nicht
entwickelt wurden. Es ist wichtig zu
beachten, dass der LH-Gipfel in der
Zyklusmitte bei gesunden Frauen unter
oralen Kontrazeptiva komplett
verschwindet, aber im ersten Zyklus nach
Absetzen des Medikaments wieder
auftaucht.
Kein Einfluss auf die LH Spiegel konnte
festgestellt werden nach Fasten, Essen,
physischem Stress und körperlichem
Training, nach Insulin-Hypoglykämie oder
Arginin-Hydrochlorid Infusion
(Wachstumshormon-Stimulation). Die
Gabe von Testosteron und Östrogenen in
der post-Menopause erniedrigt die LHSpiegel.
Methodik
Der Coat-A-Count LH IRMA ist ein
Festphasen immunradiometrischer Assay
(beschichtete Röhrchen) mit
monoklonalen und polyklonalen anti-LH
125
Antikörpern: I-markierte polyklonale
anti-LH Antikörper liegen in der flüssigen
Phase vor und monoklonale anti-LH
Antikörper sind auf der Wand eines
Röhrchens immobilisiert.
Testablauf:
LH wird zwischen den auf der Wand eines
Polystyrolröhrchens immobilisierten
monoklonalen anti-LH Antikörpern und
dem radioaktiv markierten polyklonalen
anti-LH Antikörpern gebunden.
125
Ungebundene I-markierte anti-LH
Antikörper werden durch Dekantieren des
Reaktionsgemisches und anschließendem
Waschen der Röhrchen entfernt; dies
reduziert die unspezifischen Bindungen
sehr stark und gewährleistet eine
exzellente Präzision bei niedrigen
Konzentrationen.
Die LH Konzentration ist der nach dem
Waschen im Röhrchen verbliebenen
Radioaktivität direkt proportional. Die
Radioaktivität wird in einem GammaCounter gemessen. Die LH Konzentration
in der Patientenprobe wird durch den
Vergleich der gemessenen Counts pro
Minute mit denen der mitgelieferten
Standards unterschiedlicher Konzentration
ermittelt.
Zu pipettierende Reagenzien: 1
Testdauer: 1 Stunde (auf einem
Schüttler)
Totalaktivität zum Zeitpunkt der
Markierung: ca. 300 000 cpm
Hinweise und
Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnostik.
Reagenzien: Die Packung mit den
Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem
Kühlschrank gelagert werden, der für
radioaktives Material ausgewiesen ist. Die
Entsorgung muss nach den jeweils
gültigen Gesetzen erfolgen.
Die Reagenzien dürfen nur bis zum
Verfallsdatum verwendet werden.
Einige Komponenten des Kits können
Material humanen Ursprungs und/oder in
anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe
enthalten, die es unbedingt notwendig
machen die folgenden
Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten.
Die generell geltenden
Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten
und alle Komponenten als potenziell
infektiös zu behandeln. Alle aus
menschlichem Blut gewonnenen
Materialien wurden auf Syphilis,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2,
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
Hepatitis-C-Antikörper untersucht und
negativ befundet.
Bestimmten Komponenten wurde
Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um
die Bildung von explosiven Metallaziden in
Blei- und Kupferrohren zu vermeiden,
sollten die Reagenzien nur zusammen mit
großen Wassermengen in die Kanalisation
gespült werden.
Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes
Wasser benutzen
Radioaktivität
Der Umgang mit radioaktivem Material ist
in Deutschland genehmigungspflichtig.
Deshalb muss der Siemens Healthcare
Diagnostics eine Kopie der aktuellen
gültigen Umgangsgenehmigung des
Kunden vorliegen, bevor radioaktive
Reagenzien versendet werden dürfen. Die
Strahlenschutzverordnung ist zu
beachten.
Das radioaktive Material ist gemäß der
jeweiligen Umgangsgenehmigung zu
handhaben.
Die Strahlenexposition ist zu minimieren.
Spritzer sind sofort aufzuwischen und die
betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden.
Flüssiger und fester radioaktiver Abfall
sind unter Beachtung der gültigen
Richtlinien zu entsorgen.
Bestandteile der Testpackung:
Vorbereitung
LH Antikörper-beschichtete Röhrchen
(ILH1)
Polystyrolröhrchen beschichtet mit
monoklonalen LH Antikörpern von der
Maus, verpackt in wiederverschließbaren
Plastikbeuteln. Kühl lagern, vor
Feuchtigkeit schützen und nach dem
Öffnen wieder sorgfältig verschließen.
Lagerung bei 2–8°C bis zum
Verfallsdatum.
IKLH1: 100 Röhrchen.
125
I LH Antikörper (ILH2)
Jodierte polyklonale anti-LH Antikörper
von der Ziege. Das Reagenz wird
gebrauchsfertig in flüssiger Form geliefert.
13
Jede Flasche enthält 5,5 ml. Bei 2–8°C für
30 Tage nach dem Öffnen oder bis zum
Verfallsdatum auf der Flasche haltbar.
IKLH1: 2 Flaschen.
LH Standards (LHI3–9,X)
8 Flaschen, A – H, mit lyophilisiertem LH
Standards in einer humanen Serum/Puffer
Matrix, mit Konservierungsmitteln.
Mindestens 30 Minuten vor Testbeginn,
den 0-Standard A mit 6 ml destilliertem
oder deionisiertem Wasser und die
restlichen Standards B – H mit je 3 ml
auflösen. Bei 2–8°C 30 Tage nach dem
Auflösen oder portioniert bei –20°C für 2
Monate haltbar.
IKLH1: 1 Set.
Die aufgelösten Standards enthalten 0;
1,5; 7,5; 15; 30; 75; 150 und 300 mIU/mL
LH kalibriert an der “World Health
Organization's First International
Reference Preparation” für LH für
Immunoassays, Nummer 68/40 (1st IRP
68/40) und dem “World Health
Organization's Second International
Standard” für LH Immunoassays, Nummer
80/552 (2nd IS 80/552). Weitere
Standardkurvenpunkte können durch
Mischen der Standards hergestellt
werden.
Bitte beachten: Die Coat-A-Count LH
IRMA Standards können nicht mit denen
im Doppel-Antikörper LH RIA
mitgelieferten ausgetauscht werden.
Gepufferte Waschlösung, Konzentrat
(1TSBW)
Konzentrierte gepufferte Salzlösung mit
Detergenz und Natriumazid als
Konservierungsmittel. Unter Zuhilfenahme
eines Transferbehälters jede Flasche
Konzentrat mit 400 ml destilliertem
Wasser lösen, das Endvolumen beträgt
440 ml. Bei 2–8°C für 6 Monate nach
Zubereitung stabil.
IKLH1: 1 Flasche × 40 ml.
Erforderliche Laborgeräte und
Hilfsmittel
Gammacounter – kompatibel mit
12x75 mm Röhrchen
Schüttler – ca. 200 Zyklen pro Minute
einstellen
Reagenzien Vorbereitung
Destilliertes oder deionisiertes Wasser
14
Volumetrische Pipetten: 3,0 ml
Messzylinder – zum Abmessen von
400 ml
Plastikbehälter mit Verschluss – zur
Herstellung und Lagerung der gepufferten
Waschlösung
Immunoassay
Mikropipetten: 100 µl und 200 µl
Dispenser – Für die Zugabe von 2,0 ml
der gepufferten Waschlösung
Dekantierständer – erhältlich bei Siemens
Healthcare Diagnostics (Artikelnummer:
FDR).
Logarithmisches Papier, 3 Dekaden
Immunoassay-Kontrollen (mehrere
Parameter, 3 Konzentrationen)
(Artikelnummer: CON6).
Probengewinnung
Es ist keine besondere Vorbereitung der
Patienten nötig. Blutentnahme durch
14
Venenpunktion in unbeschichtete,
Heparin- oder EDTA-Röhrchen, Hämolyse
vermeiden, Trennung des Serums oder
Plasma von den Zellen. (Abschnitt
Alternativer Probentyp beachten.) Wegen
möglicher tageszeitlichen Schwankungen
sollte der Abnahmezeitpunkt notiert
werden.
Der Einsatz einer Ultrazentrifuge wird zur
Klärung von lipämischen Proben
empfohlen.
Bei hämolysierten Proben besteht die
Möglichkeit einer unsachgemäßen
Handhabung vor Eintreffen im Labor,
daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu
interpretieren.
Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen
Herstellern können differierende Werte
verursachen. Dies hängt von den
verwendeten Materialien und Additiven
(Gel oder physische Trennbarrieren,
Gerinnungsaktivatoren und /oder
Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count LH
IRMA sind nicht mit allen möglichen
Röhrchenvariationen ausgetestet worden.
Details der getesteten Röhrchenarten sind
dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu
entnehmen.
Erforderliche Menge: 200 µl Serum oder
Plasma pro Röhrchen.
15
Lagerung: Bei 2–8°C für 2 Wochen,
oder bei –20°C für bis zu 2 Monaten.
Die Proben vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen und
vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes
Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei
Bedarf portionieren. Gefrorene Proben
dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad
aufgetaut werden.
Proben, in denen Konzentrationen
erwartet werden, die über dem höchsten
Standard (300 mIU/ml) liegen, sind vor
dem Einsatz in den Assay mit 0-Standard
zu verdünnen.
Einmal-Pipettenspitzen empfohlen.
Verdrängungspipetten, sowie
automatische Pipettor-Dilutoren
sollten nur verwendet werden, wenn
eine mögliche Verschleppung
untersucht und für vernachlässigbar
befunden wurde.
3
Direkt auf den Boden pipettieren,
Vergewissern Sie sich, dass Probe
und Tracer gut gemischt sind. Die
Verwendung eines Dispensers wird
empfohlen. Die T-Röhrchen bis zur
Messung (siehe Schritt 6) beiseite
stellen; sie bedürfen keiner weiteren
Behandlung.
Immunometrischer Assay
Testdurchführung
Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen.
1
Jeweils 2 LH-Antikörper-beschichtete
Röhrchen mit A (unspezifische
Bindung, 0-Standard) und von B bis H
(Maximalbindung) beschriften. Jeweils
2 weitere Antikörper-beschichtete
Röhrchen für Kontrollen und
Patientenproben beschriften.
4
Für 1 Stunde auf einem Schüttler
inkubieren.
5
Vollständig dekantieren und trocknen.
2,0 ml gepufferte Waschlösung in
jedes Röhrchen geben 1–2 Minuten
stehen lassen, dann erneut vollständig
dekantieren. Nochmals 2,0 ml
gepufferte Waschlösung in jedes
Röhrchen geben, 1–2 Minuten warten
und dann erneut vollständig
dekantieren.
Jeweils 2 unbeschichtete 12x75 mm
Polystyrol-Röhrchen mit T (Totalaktivität) beschriften.
Standards
WHO 1st IRP 68/40
WHO 2nd IS 80/552
mIU/mL
T*
—
A (NSB)
0
B
1,5
C
7,5
D
15
E
30
F
75
G
150
H ("MB")
300
* Optional
2
200 µl der Standards, Kontrollen und
Patientenproben in die vorbereiteten
Röhrchen pipettieren.
Direkt auf den Boden des Röhrchens
pipettieren. Proben, in denen
Konzentrationen erwartet werden, die
über dem höchsten Standard
(300 mIU/ml) liegen, sind vor dem
Einsatz in den Assay mit 0-Standard
zu verdünnen. Um Verschleppung zu
vermeiden, wird die Verwendung von
125
100 µl I LH Antikörper in jedes
Röhrchen hinzufügen.
Vollständiges Entfernen der
Flüssigkeit verbessert die Präzision
deutlich. Nach dem 2. Waschgang,
mit Hilfe eines Dekantierständers alle
Röhrchen (außer die T-Röhrchen)
dekantieren und 2–3 Minuten
umgedreht stehen lassen.
Anschließend werden die Röhrchen
kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um
alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.
6
Alle Röhrchen 1 Minute im GammaCounter messen.
In Mehrkanal-Gamma-Countern
sollten die T-Röhrchen mindestens 1
Position Abstand von den übrigen
Teströhrchen haben, um ein
“Spillover” zu vermeiden.
Berechnung und
Qualitätskontrolle
Um die Konzentrationen aus der Log-Log
Darstellung der Standardkurve abzulesen
werden zunächst der Mittelwert jedes
Röhrchenpaars, bereinigt um den
Mittelwert der NSB (Standard A) Counts
pro Minute (cpm) berechnet:
15
Netto CPM = Mittelwert CPM minus Mittelwert
NSB CPM
Anschließend wird die Bindung jedes
Röhrchenpaars als Prozent der
Maximalbindung (MB, Bmax) bestimmt
(%B/MB). Hierzu werden die mittleren
CPM des G-Standards korrigiert um die
mittlere NSB als 100% gesetzt:
Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB
Counts) × 100
Die Prozentbindungen der Standards
werden gegen die Konzentration auf
Logarithmenpapier mit je 3 Dekaden
aufgetragen und durch eine Kurve mit
bestmöglicher Annäherung an diese
Punkte verbunden. (Die einzelnen
Standardpunkte sollten jeweils mit einem
Bogen oder einer geraden Linie aber nicht
durch eine gerade Linie durch alle Punkte
verbunden werden.) LH Konzentrationen
innerhalb des Konzentrationsbereichs der
Standards können an der Kurve durch
Interpolation abgelesen werden. Die
Prozentbindungen der drei niedrigsten
Standards können zusätzlich auf linearem
Papier gegen die Konzentration
aufgetragen werden, um durch
Interpolation Ergebnisse in der Nähe von
0 genauer zu ermitteln.
Hinweis: Obwohl auch andere Verfahren
akzeptabel sind, hat die beschriebene
Berechnung der Daten Vorteile im Sinne
der Qualitätskontrolle. Man erhält eine
Standardkurve, die sowohl in der Log-Log,
als auch in der Lin-Lin Darstellung
weitgehend linear verläuft und sich von
Ansatz zu Ansatz nur wenig verändert.
Man erhält so auch wichtige Parameter für
die Qualitätskontrolle wie die
Prozentbindungen der Standards mit
Konzentrationen ungleich 0 (%B/Bmax oder
"%B/MB"). Mehr Informationen über die
Intra-Assay-Präzision als Funktion der
Konzentration vermittelt die direkte
Darstellung der Prozentbindung jedes
einzelnen Standard-röhrchens und nicht
des Mittelwertes.
Alternative Berechnung: Obwohl die
Berechnung der Prozentbindung auch
direkt aus dem Mittelwert der CPM
erfolgen kann, führt die Korrektur um die
NSB normalerweise eher zu einer über
den gesamten Messbereich linear
verlaufenden Kurve. Eine Standardkurve
kann auch durch das direkte Auftragen
16
der CPM, bzw. mittleren CPM gegen die
Konzentration auf Log-Log oder Lin-Lin
Papier erstellt werden.
(Halblogarithmisches Papier sollte nicht
verwendet werden.) Dieses Verfahren ist
zwar einfacher, aber weniger hilfreich für
die Qualitätskontrolle von Lauf zu Lauf.
Computergestützte Berechnung:
"Punkt-zu-Punkt" Methoden, insbesondere
lineare und kubische-spline
Berechnungen können für den Coat-ACount LH IRMA angewendet werden.
Auch wenn die Berechnung durch ein
Computerprogramm erfolgt, ist die
grafische Log-Log Darstellung der
Standardkurve (manuell oder automatisch)
als ein weiterer Schritt der
Qualitätskontrolle empfehlenswert. Für die
Berechnung der Daten sind auch sog.
logistische Verfahren anwendbar. Aus
dieser Gruppe sind die 4- oder 5Parameter Logistik am besten geeignet.
Es ist zu berücksichtigen, dass manche
der üblichen Algorithmen sich nicht
erfolgreich annähern, selbst wenn
logistische Modelle die Daten richtig
erfassen. Wird ein logistisches Verfahren
angenommen, ist es in jedem Fall
erforderlich, die Korrektheit des täglichen
Ansatzes mit Hilfe der Rückberechnung
der Standards und anderer Parameter zu
beurteilen. Zusätzlich wird die grafische
Darstellung in Log-Log-Form empfohlen,
da diese mehr Informationen bietet als die
konventionelle halblogarithmische
Darstellung.
Proben-Handhabung: Die Anweisungen
zur Handhabung und Lagerung von
Proben und Komponenten müssen
beachtet werden. Patientenproben mit
erwarteten Konzentrationen über dem
höchsten Standard (300 mIU/ml) müssen
vor dem Einsatz in den Test mit 0Standard verdünnt werden. Alle Proben,
inklusive Standards und Kontrollen, sollten
in Doppelbestimmung gemessen werden.
Um Verschleppung zu vermeiden ist es
wichtig, Pipetten mit Einwegspitzen zu
verwenden und diese zwischen den
Proben zu wechseln. Verdrängungspipetten, sowie automatische PipettorDilutoren sollten nur verwendet werden,
wenn eine mögliche Verschleppung
untersucht und für vernachlässigbar befunden wurde. Kontrollpaare sollten an
verschiedenen Stellen des Testansatzes
platziert werden, um eine eventuelle Drift
zu erkennen. Die Einzelergebnisse der
Duplikate sollten auf Übereinstimmung
überprüft und Verschleppung von Probe
zu Probe vermieden.
Gamma Counter: In Mehrkanal-GammaCountern sollten die T-Röhrchen
mindestens 1 Position Abstand von den
übrigen Teströhrchen haben, um ein
“Spillover” zu vermeiden. Alternativ
können auch nur 25 µl in die Röhrchen mit
der Totalaktivität im Schritt 3 pipettiert und
anschließend die CPM mit dem Faktor 4
multipliziert werden.
Kontrollen: Kontrollen mit mindestens 2
LH Konzentrationen (niedrig und hoch)
sollten routinemäßig als unbekannte
Proben eingesetzt und von Tag zu Tag
protokolliert werden.
Wiederholungsmessungen von Proben
sind ein wertvolles Hilfsmittel in der
Beurteilung der Interassay Präzsion.
Qualitätskontroll-Parameter: Es wird
empfohlen die folgenden Parameter zu
protokollieren:
T = Total Counts (als Counts pro Minute)
%NSB = 100 × (Mittlere NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Net MB Counts / Total Counts)
Und die Prozentbindungen (%B/Bmax oder
"%B/MB") aller Standards mit Ausnahme
des höchsten Standards, zum Beispiel:
%C/MB = 100 × (Netto Standard "C" Counts /
Net MB Counts)
Aufzeichnungen: Es ist gute Laborpraxis
die Chargennummern, sowie das Datum
der ersten Öffnung bzw. Rekonstitution
der verwendeten Komponenten zu
protokollieren.
Literatur: Siehe auch: Dudley RA, et al.
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient
nur zur Veranschaulichung und ist nicht
dazu geeignet Werte aus einem anderen
Testansatz damit zu ermitteln. (siehe
Tabelle "Example Run").
Referenzwerte
Bei Frauen im gebärfähigen Alter, die
keine Verhütungsmittel verwenden, ist der
LH Referenzbereich eine Funktion der
Position im Menstruationszyklus.
Dementsprechend wurden normal
zirkulierende Frauen über einen Zyklus mit
dem Coat-A-Count LH IRMA Kit
überwacht. Serumproben wurden in
Intervallen von 28 Tagen, beginnend mit
der letzten Menstruationsperiode,
abgenommen. Eine Normalisierung auf
den LH-Gipfel in der Zyklusmitte wurde
erreicht durch die Festsetzung des
individuellen LH-Gipfels für jede Frau als
Tag 0. Die Zuweisung der Proben zur
follikulären- bzw. lutealen Phase erfolgte
durch Rückwärtszählen für die follikuläre
Phase und Vorwärtszahlen für die luteale
Phase. Zusätzlich wurden Proben von 74
erwachsenen Männern mit dem
Coat-A-Count LH IRMA gemessen. Die
Ergebnisse sind nachfolgend in mIU/mL
angegeben (WHO 1st IRP 68/40 and
WHO 2nd IRP 80/552).
Gruppe
Erwachsene
Männer
95%
Absolut
Bereich Bereich
n Median (mIU/mL) (mIU/mL)
74
2,0
0,4 – 5,7
0,6 – 6,2
Frauen
Follikelphase
58
2,1
Mittelzyklus
10
29,5
Lutealphase
78
1,6
Postmenopausal
18
19,3
104
1,8
Orale
Kontrazeptiva
12 – 51
ND – 6,0
11 – 50
ND – 5,9
ND: Nicht nachweisbar
Im Labor sollten diese Ergebnisse
lediglich als Richtwerte betrachtet werden.
Jedes Labor sollte seine eigenen
Referenzbereiche etablieren.
Neun Frauen mit normalem
Ovulationszyklus wurden über einen
Zyklus mit dem Coat-A-Count LH IRMA
überwacht. Die Serum Gewinnung wie
auch die Normalisierung relativ zum LHGipfel in der Zyklusmitte erfolgte wie oben
beschrieben. Die nachfolgende Grafik
zeigt maximale, mittlere und minimale LH
Werte in mIU/mL (WHO 1st IRP 68/40 and
WHO 2nd IS 80/552) für diese Proben an
jedem Tag innerhalb des Zyklus. (Die LH
Konzentration ist in der y-Achse und der
normalisierte Zyklustag in der x-Achse
angezeigt.)
17
Spezifität: Das im Coat-A-Count LH IRMA
verwendete Antiserum ist hochspezifisch
für LH, mit einer niedrigen Kreuzreaktivität
zu strukturell ähnlichen GlykoproteinHormonen wie FSH, HCG und TSH. (Für
repräsentative Daten siehe Tabelle
"Specificity".)
"End of Run" Effekt: Tritt bis ca.
200 Röhrchen nicht auf. (siehe Tabelle
"End-of-Run Effect").
Linearität: Proben wurden in
verschiedenen Verdünnungen getestet.
(Repräsentative Daten entnehmen Sie
bitte der Tabelle „Linearität“.)
Grenzen der Methode
Aufgrund der pulsatilen Sekretion des LH
können Proben, die am gleichen Tag vom
gleichen Patienten stammen, innerhalb
des Referenzbereiches deutlich
schwanken. Dies entspricht der
physiologischen Variabilität des LH.
Leistungsdaten
Die Ergebnisse sind in mIU/ml
angegeben, kalibriert an der “World Health
Organization's First International
Reference Preparation” von LH für
Immunoassays, Nummer 68/40 (1st IRP
68/40) und am “World Health
Organization's Second International
Standard” von LH für Immunoassay,
Nummer 80/552 (2nd IS 80/552).
Wenn nicht anders angegeben, wurden
die Ergebnisse basierend auf der Analyse
von Serumproben ermittelt.
Messbereich: Bis 300 mIU/mL
(WHO 1st IRP 68/40 und 2nd IS 80/552)
Analytische Sensitivität: 0,15 mIU/mL,
High-Dose-Hook-Effect: Tritt bis zu
20 000 mIU/mL nicht auf.
Intraassay-Präzision: Statistische
Berechnung der Ergebnisse von 3
Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in
einem Ansatz gemessen wurden. Die
Ergebnisse sind als mIU/mL ausgedrückt.
(Siehe Tabelle „Intraassay-Precision“.)
Interassay-Präzision: Statistische
Berechnung der Ergebnisse von 6
Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in
verschiedenen Ansätzen gemessen
wurden. (Siehe Tabelle „InterassayPrecision“.)
18
Wiederfindung: Proben wurden 1:19 mit
2 LH Lösungen (475 und 1 025 mIU/ml)
versetzt und gemessen. (Repräsentative
Daten entnehmen Sie bitte der Tabelle
„Recovery“.)
Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentrationen
bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die
Ergebnisse, der größer als die Impräzision
des Assays selbst ist.
Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate
haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml
keinen Einfluss auf die Messung, der
größer als die Impräzision des Assays
selbst ist.
Alternativer Probentyp: Um die
Auswirkungen von verschiedenen
Probenarten zu untersuchen, wurde Blut
von 10 Freiwilligen in Röhrchen ohne
Additiva, in Heparin-, EDTA- und Becton
®
Dickinson SST Vacutainer-Rörchen
gesammelt. Alle Proben wurden im CoatA-Count LH IRMA Verfahren, mit den
folgenden Ergebnissen gemessen.
(Heparin) = 1,03 (Serum) – 0,3 mIU/ml
r = 0,999
(EDTA) = 0,95 (Serum) + 0,6 mIU/ml
r = 0,993
(SST) = 1,02 (einfachen Röhrchen) – 0,19 mIU/ml
r = 0,999
Mittelwerte:
10,4 mIU/ml (Serum)
10,4 mIU/ml (Heparin)
10,5 mIU/ml (EDTA)
10,4 mIU/ml (SST)
Methodenvergleich: Das Coat-A-Count
LH IRMA Verfahren wurde mit dem
IMMULITE LH anhand von 46
Patientenproben mit LH Konzentrationen
von ca. 5,5 bis über 50 mIU/mL
verglichen. (Siehe Grafik) Berechnung der
linearen Regression:
(CAC IRMA) = 0,79 (IML) – 0,24 mIU/mL
r = 0,972
Mittelwerte:
8,1 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA)
10,5 mIU/mL (IMMULITE)
Anwendungsberatung
Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an
Ihre Niederlassung.
Das Qualitätsmanagement-System der Siemens
Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach
DIN EN ISO 13485:2003.
Español
Utilidad del análisis: El ensayo Coat-ACount LH IRMA es un análisis
radioinmunométrico diseñado para la
determinación cuantitativa de la hormona
luteinizante (LH, lutropina) en suero y en
plasma heparinizado o con EDTA. Su uso
es estrictamente para diagnóstico in vitro,
como una ayuda en el diagnóstico de la
disfunción gonadal.
Referencia: IKLH1 (100 tubos)
El kit de 100 tubos contiene
menos de 20 microcurios (740
kilobequerelios) de anticuerpo
125
policlonal anti-LH marcado con I
radiactivo.
Resumen y Explicación del
Test
La hormona luteinizante (LH, lutropina), es
secretada por las células β de la hipófisis
anterior, bajo el control de la hormona
liberadora de gonadotropina hipotalámica
(GnRH). Es una proteína que contienen
hidratos de carbono, con un peso
molecular aproximado de 28 000 daltons,
la cual consiste de dos cadenas
polipeptídicas denominadas alfa y beta.
Las cadenas alfa de las hormonas LH,
FSH, TSH y HCG son bioquímicamente
idénticas, mientras que las cadenas beta
son bioquímicamente únicas y confieren la
especificidad biológica e inmunológica. La
bioactividad también está determinada en
la cadena beta.
En la mujer, la LH causa ovulación y
producción de esteroides (estrógeno y
progesterona) por el cuerpo lúteo. En el
hombre, estimula las células intersticiales
(células de Leydig) para producir
andrógenos y estrógenos. Pequeñas
cantidades de LH también son necesarias
para promover la producción de
estrógenos por el folículo en maduración
estimulado por la FSH. Los niveles
circulantes de LH están controlados por
un efecto de retroalimentación negativa
de las hormonas esteroideas sobre el
hipotálamo. Si bien LH y FSH son
necesarias para la función sexual normal
en el hombre y la mujer, los patrones de
secreción son muy diferentes en los dos
sexos. En los adultos sexualmente
maduros, la FSH y la LH no se secretan
en cantidades constantes; más bien la
secreción se da en pulsos, lo cual resulta
en fluctuaciones rápidas en todo el
intervalo de referencia (50 a 100% por
arriba o por debajo). Debido a esta
secreción pulsátil, las muestras que se
obtienen del paciente en un mismo día
pueden fluctuar ampliamente dentro del
intervalo de referencia, reflejando una
variación fisiológica más que errores en la
técnica o la metodología.
El uso clínico principal de las
determinaciones de LH es definir
claramente el eje hipotalámicohipofisiario-gonadal. Las determinaciones
de los niveles de gonadotropina séricos
permitirán distinguir entre una
insuficiencia gonadal primaria y una
estimulación gonadal deficiente. Si los
niveles de LH y FSH están elevados
(hipogonadismo hipergonadotrópico), hay
una insuficiencia gonadal primaria.
Si, por el contrario, los niveles de
gonadotropina son bajos (hipogonadismo
hipogonadotrópico), la estimulación
gonadal deficiente ha resultado en un
estado hipogonadal. Aparte del papel
esencial de las determinaciones de LH y
FSH en el diagnóstico de la disfunción
gonadal, la determinación de LH también
tiene importancia clínica porque la
hormona de crecimiento y la LH son
frecuentemente las primeras hormonas
afectadas por la enfermedad hipofisiaria.
Las determinaciones en suero han sido
muy útiles en el diagnóstico y tratamiento
de la infertilidad en la mujer. Un aumento
del nivel de LH a mitad del ciclo es una
19
buena indicación de que la ovulación
ocurrirá aproximadamente 24 horas
después. Esto permite informar a las
parejas subfértiles y también a las
mujeres que están siendo tratadas con
gonadotropinas por infertilidad, que la
ovulación está por ocurrir.
La fase reproductiva en la mujer termina
con la menopausia, cuando la función
ovárica, con su secreción de estradiol,
disminuye y eventualmente termina.
Debido a niveles bajos de estradiol y
progesterona circulante, hay una pérdida
de retroalimentación negativa sobre el
hipotálamo; como resultado, los niveles
circulantes de LH aumentan
considerablemente. De forma similar, los
niveles de LH están aumentados en las
mujeres más jóvenes de edad
premenopáusica, quienes sufren
insuficiencia ovárica o cuyos ovarios no se
han desarrollado durante la pubertad. Es
importante notar que el pico en la mitad
del ciclo está completamente obliterado
en las mujeres sanas que usan
anticonceptivos orales, y reaparece en el
primer ciclo completo después de
descontinuar la medicación.
No se ha encontrado ningún efecto sobre
los niveles de LH después de: ayunar,
ingerir alimentos, estrés físico, hacer
ejercicio, hipoglucemia insulínica o
infusión de monohidrocloruro de arginina
(usado para estudios de hormona de
crecimiento). La administración de
testosterona y estrógeno deprime los
niveles de LH en el estado
posmenopáusico.
Principio del análisis
Coat-A-Count LH IRMA es un ensayo
radioinmunométrico en fase sólida basado
en anticuerpos monoclonales y
policlonales anti-LH: anticuerpos
125
policlonales anti-LH marcados con I en
fase líquida y anticuerpos monoclonales
anti-LH inmovilizados en la pared de un
tubo de poliestireno.
En el procedimiento:
La LH es capturada entre los anticuerpos
monoclonales anti-LH que están
inmovilizados en la superficie interna del
tubo de poliestireno y el trazador anti-LH
policlonal marcado radiactivamente.
20
125
Los anticuerpos anti-LH marcados con I
no unidos se remueven decantando la
mezcla de reacción y lavando el tubo; esto
reduce la unión inespecífica a un nivel
muy bajo, y asegura una precisión
excelente a concentraciones bajas.
La concentración de LH es directamente
proporcional a la radiactividad presente en
el tubo después del paso de lavado. La
radiactividad se mide con un contador
gama, después de lo cual se determina la
concentración de LH en la muestra del
paciente comparando las cuentas por
minuto de la muestra del paciente con las
obtenidas con el juego de calibradores
suministrados.
Reactivos a pipetear: 1
Tiempo total de incubación: 1 hora
(sobre una gradilla agitadora)
Cuentas totales en la iodización:
aproximadamente 300 000 cpm
Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro.
Reactivos: Almacenar a 2–8°C en una
cámara preparada para almacenar
material radiactivo. Desechar de acuerdo
a la legislación en vigor.
No usar los reactivos después de su fecha
de caducidad.
Algunos componentes suministrados en el
kit pueden contener material de origen
humano y/o otros componentes
potencialmente peligrosos que necesiten
ciertas precauciones.
Siga las precauciones universales y
manipule todos los componentes como si
fueran capaces de transmitir agentes
infecciosos. Los materiales derivados de
sangre humana han sido analizados y son
negativos para sífilis; para anticuerpos
frente al VIH 1 y 2; para el antígeno de
superficie de hepatitis B y para los
anticuerpos de hepatitis C.
Se ha usado Azida sódica, en
concentraciones menores de 0,1 g/dl,
como conservante. Para su eliminación,
lavar con grandes cantidades de agua
para evitar la constitución de residuos de
azidas metálicas, potencialmente
explosivas, en las cañerías de cobre y
plomo.
Agua: Usar agua destilada o desionizada.
Radiactividad
Una copia de cualquier certificado de
licencia de radioisótopos (específico o
general) emitido a la aduana de los
EE.UU. se registrará en los ficheros de
Siemens Healthcare Diagnostics antes de
que se puedan enviar kits o componentes
conteniendo material radiactivo. Estos
materiales radiactivos pueden adquirirse
por cualquier cliente con la licencia
específica apropiada. Con una licencia
general, estos materiales radiactivos
pueden adquirirse sólo por médicos,
veterinarios en la práctica de la medicina
veterinaria, laboratorios clínicos y
hospitales — y estrictamente para la
clínica in vitro o tests de laboratorio que
no conlleven la administración interna o
externa de material radiactivo o su
radiación a humanos u otros animales. Su
adquisición, recepción, almacenaje, uso,
trasferencia y desecho están regulados y
se expenderá una licencia (general o
específica) de la Comisión Nuclear de
EE.UU. o de un Estado con el NRC para
su consiguiente control.
Manejar los materiales radiactivos de
acuerdo a los requerimientos de su
licencia general o específica. Para
minimizar la exposición a la radiación, el
usuario debe adherirse al cuarto conjunto
de guías publicadas por el National
Bureau of Standards con el nombre Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
y en las consiguientes publicaciones de
las autoridades Federales o Estatales.
Limpiar y decontaminar rápidamente las
superficies afectadas. Evitar la generación
de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos
radiactivos de acuerdo con los
requerimientos de su licencia. Licencias
generales (NRC Form 483) pueden
eliminar sus residuos sólidos radiactivos
como residuos no radiactivos, después de
retirar las etiquetas. Licencias específicas
(NRC Form 313) se deben referir al Título
10, Código de Regulaciones Federales,
Parte 20. Las licencias en Estados
Asociados deben referirse a las
normativas de su correspondiente Estado.
Licencias generales pueden eliminar sus
residuos líquidos radiactivos contenidos
en este tipo de productos como cualquier
otro material líquido, quitando las
etiquetas de los contenedores y
procesándolos como residuos sólidos.
Licencias específicas pueden eliminar
pequeñas cantidades de residuos líquidos
radiactivos contenidos en este tipo de
productos como cualquier otro material
líquido. Refiérase a la normativa aplicable
a su laboratorio.
Materiales Suministrados:
Preparación Inicial
Tubos recubiertos de anticuerpo frente
a la LH (ILH1)
Tubos de poliestireno recubiertos con
anticuerpos monoclonales murinos antiLH y embalados en bolsas de cierre
hermético. Almacenar refrigerados y
protegidos de la condensación, cerrando
cuidadosamente las bolsas después de su
uso. Estable a 2–8°C hasta la fecha de
caducidad impresa en la bolsa.
IKLH1: 100 tubos.
125
I LH Ab (ILH2)
Anticuerpos policlonales anti-LH de cabra
125
marcados con I. El reactivo se
suministra en forma líquida, listo para
usar. Cada vial contiene 5,5 ml. Estable a
2–8°C durante 30 días después de su
apertura, o hasta la fecha de caducidad
impresa en la etiqueta.
IKLH1: 2 viales.
Calibradores de LH (LHI3–9,X)
Ocho viales de calibradores de LH
liofilizados, marcados A – H, en una
matriz de suero humano y solución
amortiguadora, con conservante. Por lo
menos 30 minutos antes de usar,
reconstituir el calibrador cero A con
6,0 ml de agua destilada o desionizada, y
cada uno de los calibradores restantes, B
a H, con 3,0 ml de agua destilada o
desionizada. Estable a 2–8°C durante
30 días después de la reconstitución, o
hasta 2 meses (alicuotados) a –20°C.
IKLH1: 1 juego.
Los calibradores reconstituidos contienen
respectivamente 0, 1,5, 7,5, 15, 30, 75,
150 y 300 mili-Unidades Internacionales
de LH por mililitro (mIU/ml) en términos de
la Primer Preparación Internacional de
Referencia de LH de la Organización
Mundial de la Salud, número 68/40 (1st
IRP 68/40), y el Segundo Estándar
Internacional de LH para inmunoensayo
de la Organización Mundial de la Salud,
número 80/552 (2nd IS 80/552). Se
21
pueden obtener los puntos de calibración
intermedios mezclando los calibradores
en las proporciones adecuadas.
Note que los calibradores Coat-A-Count
LH IRMA no son intercambiables con
aquellos suministrados en el kit Doble
Anticuerpo LH.
Concentrado de Solución
Amortiguadora de Lavado (1TSBW)
Solución salina amortiguadora, con
surfactantes, y con azida sódica como
conservante. Utilizando un depósito de
transferencia, diluir el contenido de cada
frasco con 400 ml de agua destilada, para
un volumen total de 440 ml. Estable a
2–8°C durante 6 meses después de la
preparación.
IKLH1: 1 vial × 40 ml.
Materiales Requeridos pero no
suministrados
Contador Gamma — compatible con
tubos estándar de 12 x 75 mm
Agitador — configurado para dar
aproximadamente 200 sacudidas por
minuto
Preparación del Reactivo
Agua destilada o desionizada
Pipetas volumétricas: 3,0 ml
Probeta graduada — para dispensar
400 ml
Depósito para almacenamiento de plástico
con tapa — para la preparación y
almacenaje de la Solución Amortiguadora
de Lavado
Inmunoensayo
Micropipetas: 100 µl y 200 µl
Dispensador – para dispensar 2,0 ml de
Solución Amortiguadora de Lavado
Gradilla de espuma — disponible en
Siemens Healthcare Diagnostics
(Referencia: FDR).
Papel para gráfica log-log de 3 ciclos
Un control de inmunoensayo de tres
niveles con base de suero humano,
conteniendo LH y más de otros 25
analitos. Puede obtenerse en Siemens
Healthcare Diagnostics (Referencia:
CON6).
22
Recogida de la muestra
El paciente no necesita estar en ayunas
así como tampoco cualquier otro tipo de
preparación. Recoger la sangre por
14
venipunción en tubos sin anticoagulante,
heparinizados o con EDTA, teniendo
mucho cuidado de evitar la hemólisis, y
separar el suero o plasma de las células.
(Ver también la sección sobre Tipo de
Muestra Alternativa). Debido a que se
sabe que la LH exhibe un ritmo circadiano
leve, se deberá registrar la hora de la
recolección.
Se recomienda el uso de una
ultracentrífuga para aclarar las muestras
lipémicas.
Las muestras hemolizadas podrían indicar
una mala manipulación de la muestra
antes de ser recibida por el laboratorio; en
este caso, los resultados deben
interpretarse con precaución.
Los tubos para recoger sangre de
distintos fabricantes pueden producir
valores diferentes, dependiendo del
material del tubo y de los aditivos,
incluyendo barreras de gel o barreras
físicas, activadores de la coagulación y/o
anticoagulantes. El LH Coat-A-Count
IRMA no ha sido analizado con todos los
distintos tipos de tubos. Para obtener
detalles sobre los tipos tubos que se han
analizado, consulte la sección de Tipos de
Muestras Alternativos.
Volumen requerido: 200 µl suero o
plasma por tubo.
Conservación: 2–8°C durante
15
2 semanas, o hasta 2 meses a –20°C.
Antes del ensayo, llevar todas las
muestras a temperatura ambiente
(15–28°C) y mezclar por inversión.
Alicuotar, si es necesario, para evitar la
repetición de congelación y
descongelación. No intentar la
descongelación de muestras congeladas
calentándolas en un baño de agua.
Las muestras que se espera que
contengan concentraciones mayores que
la del calibrador más alto (300 mIU/ml)
deberán diluirse con el calibrador cero
antes del análisis.
Se recomienda usar un dispensador
de repetición. Dejar los tubos T a un
lado para su contaje (paso 6); no
requieren más procesamiento
posterior.
Ensayo Inmunométrico
Todos los componentes deben llevarse a
temperatura ambiente (15–28°C) antes de
su uso.
1
Marcar 16 tubos recubiertos con TSH
Ab con A (unión no específica) y
desde B a H (“unión máxima”) por
duplicado. Marcar también por
duplicado, tubos recubiertos con LH
Ab, para controles y muestras de
pacientes.
4
Agitar durante 1 hora sobre una
gradilla agitadora.
5
Decantar y escurrir completamente.
Luego, añadir 2,0 ml de la Solución
Amortiguadora de Lavado a cada
tubo. Esperar 1 a 2 minutos, luego
decantar. Nuevamente, añadir 2,0 ml
de la Solución Amortiguadora de
Lavado, esperar 1 a 2 minutos y
decantar.
Opcionalmente, marcar por duplicado,
dos tubos de poliestireno (no
recubiertos) de 12 x 75 mm.
Calibradores
WHO 1st IRP 68/40
WHO 2nd IS 80/552
mIU/ml
T*
—
A (NSB)
0
B
1,5
C
7,5
D
15
E
30
6
F
75
G
150
H ("MB")
300
* Opcional
2
Pipetear 200 µl de cada calibrador,
controles y muestras de suero de
pacientes en los tubos preparados al
efecto.
Pipetear directamente al fondo del
tubo. Las muestras que se espera
que contengan concentraciones de
LH mayores que el calibrador mas
alto (300 mIU/ml) deberán diluirse en
el calibrador cero antes del ensayo.
Se recomienda el empleo de
micropipetas con puntas desechables
para evitar acarreo de muestra a
muestra. Se deberán usar pipetas de
desplazamiento positivo y pipetoresdilutores únicamente si se ha
evaluado la posibilidad de acarreo y
se ha encontrado insignificante.
3
Agregar 100 µl de LH Ab I
tubo.
125
Eliminar toda la humedad visible para
mejorar la precisión. Después del
segundo lavado, decantar los
contenidos de todos lo tubos (excepto
los tubos T) usando una gradilla de
decantación de espuma, y permitir
que escurran durante 2 o 3 minutos.
Golpear los tubos contra papel
absorbente para eliminar las gotas
residuales.
a cada
Pipetear directamente al fondo del
tubo, y asegurarse de que la muestra
y el trazador estén mezclados
completamente. No hacer espumar.
Contar durante 1 minuto en un
contador gamma.
En los contadores gamma
multicabezas, los tubos de Cuentas
Totales (opcional) deberán separarse
del resto de los tubos del ensayo por
cuando menos un espacio, para
minimizar la posibilidad de derrames
en los otros tubos.
Cálculo y Control de Calidad
Para calcular los resultados (en términos
de unidades de concentración) desde una
representación log-log de la curva de
calibración, primero corregir las cuentas
por minuto (CPM) de cada par de tubos
restando las CPM promedio de los tubos
de unión no específicos (calibrador A).
Cuentas netas = Media CPM menos Media NSB
CPM
Luego determinar el porcentaje de unión
(relativo al del calibrador más alto) – aquí
llamado “%B/MB” – de cada par de tubos
como por ciento de “unión máxima,” con
las cuentas NSB corregidas del calibrador
mas alto tomado como 100%:
Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas
MB netas) × 100
23
Utilizando papel de gráficas log-log de 3
ciclos, trazar el Porcentaje de Unión
versus la Concentración para cada uno de
los calibradores no cero y dibujar una
curva que se aproxime a la trayectoria de
estos puntos. (Conectar los puntos de
calibración con arcos o segmentos de
líneas rectas. No intentar acomodar una
sola línea recta a los datos.) Las
concentraciones para controles y
desconocidos dentro del rango de los
calibradores no cero puede entonces ser
calculada por interpolación de la curva de
calibración. Se puede usar un trazo
adicional de Porcentaje Unido versus
Concentración para los calibradores más
bajos en papel de gráfica lineal-lineal para
una interpolación cercana a la dosis cero.
Comentarios: Aunque otros enfoques
son aceptables, la reducción de datos por
el método recién descrito tiene ciertas
ventajas desde el punto de vista de
control de calidad. En particular,
proporciona una curva de calibración que
es relativamente lineal en
representaciones tanto log-log como
lineal-lineal y relativamente estable de
ensayo a ensayo. También proporciona
valiosos parámetros de Control de
Calidad, es decir, valores de Porcentaje
de Unión (%B/MB) para los calibradores
no cero. Se puede obtener una gráfica
todavía más informativa, dando un sentido
de reproducibilidad dentro del ensayo
como una función de la concentración,
haciendo un trazo de valores del
Porcentaje de Unión de los tubos
calibradores directamente, esto es, sin
primero promediar las CPM de los
duplicados.
Alternativas: Aunque el Porcentaje de
Unión se puede calcular directamente de
las CPM Promedio, la corrección para
unión no específica generalmente
produce una curva de calibración que es
más lineal a lo largo de su rango. Una
curva de calibración también puede
construirse trazando las CPM o CPM
Promedio directamente contra la
Concentración en papel de gráfica log-log
o lineal-lineal. (No debe emplearse papel
de gráfica semilogarítmico). Este enfoque
tiene la virtud de la simplicidad, pero es
menos deseable desde el punto de vista
del control de calidad.
Reducción de Datos Computarizada:
Los métodos “punto a punto”, incluyendo
24
lineal y spline cúbico, no son adecuados;
pero ya que proporcionan poca ayuda en
el monitoreo de la integridad de un
ensayo, es importante preparar el trazo
log-log recomendado de la curva de
calibración, ya sea manualmente o por
computadora, como un paso de control de
calidad. Las técnicas de reducción de
datos basadas en el modelo logístico
también pueden ser aplicables. Dentro de
esta familia, las rutinas de curva basada
en el parámetro logístico de 4 o 5 son los
candidatos más apropiados. Sin embargo,
algunos algoritmos actualmente en uso no
pueden convergir con éxito, aun cuando el
modelo logístico es fiel a los datos. Si se
adopta un método logístico, es esencial
verificar su propiedad para el ensayo de
cada día monitoreando el retrocálculo de
los calibradores y otros parámetros.
Adicionalmente, se recomienda un trazo
de la curva del calibrador en una
representación log-log, ya que esto es
más informativo que el trazo
semilogarítmico convencional.
Manipulación de la Muestra: Las
instrucciones para manipular y almacenar
las muestras de pacientes y los
componentes deberán observarse
cuidadosamente. Antes de analizar, diluir
las muestras de los pacientes que se
espera que contengan concentraciones
de LH mayores que la del calibrador más
alto (300 mIU/ml) con el calibrador cero.
Todas las muestras, incluyendo los
calibradores y controles, deberán
someterse a ensayo, cuando menos por
duplicado. Es importante utilizar una
micropipeta con punta desechable,
cambiando la punta entre muestras para
evitar contaminación por arrastre. Se
deberán usar pipetas de desplazamiento
positivo y pipetores-dilutores automáticos
sólo si se ha evaluado la posibilidad de
arrastre y se ha determinado que sería
insignificante. Se pueden espaciar pares
de tubos de control a lo largo del ensayo
para ayudar a verificar la ausencia de
arrastre significativo. Inspeccionar los
resultados para comprobar el acuerdo
entre los pares de tubos.
Contador Gamma: Para minimizar la
posibilidad de derrames en los contadores
gamma de múltiples pozos, los tubos de
cuentas totales (T) opcionales deberán
estar separados de los otros tubos del
ensayo por uno o más espacios.
Alternativamente, agregar sólo 25 µl del
trazador a cada uno de los tubos T en el
paso 3 y multiplicar las cuentas por minuto
observadas en estos tubos por 4.
Controles: Los controles o pools de
sueros con al menos dos niveles de
concentración de LH (bajo y alto) deberán
ensayarse rutinariamente como
desconocidos y los resultados se deberán
trazar de día en día como se describe en
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981; 27:493501. Las muestras de repetición son una
valiosa herramienta adicional para el
seguimiento de la precisión Inter-ensayo.
Parámetros de Control de Calidad:
Recomendamos controlar estas medidas
de rendimiento:
T = Cuentas totales (como CPM)
%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / Cuentas
totales)
mitad del ciclo se logró designando, para
cada mujer, el día en que el resultado LH
fue más alto como el día cero. Las
muestras se asignaron a las fases folicular
y lútea, retrocediendo para la fase folicular
y avanzando para la fase lútea. También
se analizaron muestras de 74 hombres
adultos mediante el procedimiento CoatA-Count LH IRMA. Los resultados se
tabulan a continuación en mIU/ml (WHO
1st IRP 68/40 y WHO 2nd IRP 80/552).
Rango
Rango
95%
absoluto
n Mediana (mIU/ml) (mIU/ml)
Grupo
74
Hombres adultos
2,1
10
29,5
Lútea
78
1,6
18
19,3
104
1,8
Posmenopáusicas
Y los valores de Unión Porcentual
(“%B/MB”) de todos menos los
calibradores no cero mas altos, por
ejemplo:
ND: no detectable
Lectura Adicional: Ver Dudley RA, et al.
Ejemplo: Sólo como ilustración, no se
puede utilizar para calcular resultados.
(Ver la tabla "Example Run").
0,6 – 6,2
58
Mitad del ciclo
Anticonceptivos
orales
Mantenimiento de Registros: Se
considera buena práctica de laboratorio el
registrar para cada ensayo los números
de lote y las fechas de reconstitución de
los componentes utilizados, así como los
resultados de control y los parámetros de
Control de Calidad.
0,4 – 5,7
Folicular
%MB = 100 × (Cuentas MB netas / Cuentas
totales)
%C/MB = 100 × (Conteos netos calibrador “C” /
Conteos Netos MB)
2,0
Mujeres
12 – 51
ND – 6,0
11 – 50
ND – 5,9
Los laboratorios deben considerar estos
resultados sólo como una guía. Cada
laboratorio deberá establecer sus propios
intervalos de referencia.
Se utilizó el procedimiento Coat-A-Count
LH IRMA para monitorear a nueve
mujeres que ovulaban normalmente,
durante un ciclo. La recolección de los
sueros, así como la normalización de los
valores de LH relativos al pico a la mitad
del ciclo, se realizaron como se describió
anteriormente. El gráfico que se muestra a
continuación presenta los valores
máximos, medios y mínimos de LH en
mIU/ml (WHO 1st IRP 68/40 and WHO
2nd IS 80/552) para las muestras, en
cada día del ciclo. (La concentración de
LH se indica en el eje y, y el día del ciclo
normalizado en el eje x)
Valores esperados
El intervalo de referencia para una mujer
en edad fértil que no toma anticonceptivos
está en función de su ubicación en el ciclo
menstrual. De acuerdo con esto, se utilizó
el kit Coat-A-Count LH IRMA para
monitorear durante un ciclo a mujeres que
ovulan normalmente. Se recogieron
muestras de suero a intervalos de 28 días,
comenzando en el último periodo
menstrual. La normalización del pico en la
25
Precisión entre ensayos (de una tanda
a otra): Las estadísticas se calcularon
para las muestras a partir de los
resultados obtenidos por duplicado en 20
ensayos diferentes. (Ver la tabla
"Interassay Precision").
Especificidad: Los anticuerpos Coat-ACount LH IRMA son altamente específicos
para LH, con una reactividad cruzada baja
para las hormonas glicoproteicas
estructuralmente relacionadas como FSH,
HCG y TSH. (Para datos representativos,
ver la tabla “Specificity”).
Limitación
Debido a la secreción pulsátil, las
muestras obtenidas el mismo día del
mismo paciente pueden fluctuar
ampliamente dentro del rango de
referencia, reflejando una variación
fisiológica más que errores en la técnica o
la metodología.
Características analíticas
Los resultados en las secciones
siguientes se expresan en mili-Unidades
Internacionales de LH por mililitro
(mIU/ml) en términos de la Primer
Preparación Internacional de Referencia
de LH para Inmunoensayo de la
Organización Mundial de la Salud, número
68/40 (1st IRP 68/40), y el Segundo
Estándar Internacional de LH para
Inmunoensayo de la Organización
Mundial de la Salud, número 80/552 (2nd
IS 80/552).
A menos que se especifique lo contrario,
los resultados se basan en el análisis de
muestras de suero.
Intervalo de calibración: Hasta
300 mIU/ml (WHO 1st IRP 68/40 y
2nd IS 80/552)
Sensibilidad analítica: 0,15 mIU/ml,
Efecto de gancho a altas dosis: hasta
20 000 mIU/ml.
Precisión intraensayo (dentro de una
tanda): Las estadísticas se calcularon
para las muestras a partir de los
resultados de 20 pares de tubos en una
tanda. (Ver la tabla "Intraassay
Precision").
26
Efecto deriva: Ninguno hasta
aproximadamente 200 tubos. (Ver la tabla
"End-of-Run Effect").
Linealidad: Las muestras fueron
analizadas con varias diluciones. (Ver la
tabla "Linerarity" para resultados
representativos.)
Recuperación: Se han analizado
muestras cargadas 1 a 19 con dos
soluciones de LH (475 y 1 025 mIU/ml).
(Ver la tabla "Recovery" para resultados
representativos).
Bilirrubina: La presencia de bilirrubina,
en concentraciones de hasta 200 mg/l, no
tiene ningún efecto sobre los resultados
en términos de precisión.
Hemólisis: La presencia de eritrocitos
hasta concentraciones de 30 µl/ml no
tiene efecto en los resultados, en lo
concerniente a la precisión del ensayo.
Tipo de Muestra Alternativa: para
evaluar el efecto de los diferentes tipos de
muestras alternativos, se recogió sangre
de 10 voluntarios en tubos normales,
tubos con Heparina, tubos con EDTA y
®
tubos vacutainer SST de Becton
Dickinson. Todas las muestras se
analizaron mediante el procedimiento
Coat-A-Count LH IRMA, dando los
siguientes resultados.
(Heparina) = 1,03 (Suero) – 0,3 mIU/ml
r = 0,999
(EDTA) = 0,95 (Suero) + 0,6 mIU/ml
r = 0,993
(SST) = 1,02 (tubos simples) – 0,19 mIU/ml
r = 0,999
Medias:
10,4 mIU/ml (Suero)
10,4 mIU/ml (Heparina)
10,5 mIU/ml (EDTA)
10,4 mIU/ml (SST)
Comparación de los métodos: Se
comparó el procedimiento Coat-A-Count
LH IRMA con el procedimiento IMMULITE
LH en 46 muestras de pacientes con
concentraciones de LH de 0,5 a
50 mIU/ml aproximadamente. (Ver el
gráfico) Por regresión lineal:
(CAC IRMA) = 0,79 (IML) – 0,24 mIU/ml
r = 0,972
Medias:
8,1 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA)
10,5 mIU/ml (IMMULITE)
Asistencia técnica
Póngase en contacto con el distribuidor
nacional.
El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está certificado por la ISO
13485:2003.
Français
Domaine d'utilisation: Coat-A-Count LH
IRMA est un dosage
radioimmunométrique destiné à la mesure
quantitative de l'hormone lutéotrope (LH)
dans le sérum et plasma hépariné ou
EDTA. Il est réservé à un usage
diagnostic in vitro et constitue une aide au
diagnostic et au traitement des désordres
pituitaires et gonadiques.
Référence catalogue : IKLH1 (100 tubes)
Le coffret de 100 tubes contient
moins de 20 microcuries
(740 kilobecquerels) d'anticorps
polyclonal anti-LH marqué à l'iode 125.
Introduction
L'hormone lutéotrope (LH), glycoprotéine
de poids moléculaire de 28 000 D, est
sécrétée par les cellules β de
l'antéhypophyse sous le contrôle de la
gonadotrophine releasing hormone
(GnRH) produite par l'hypothalamus. LH
est constituée de deux chaînes
polypeptidiques : α et β. Les chaînes α de
la FSH, LH, TSH et HCG sont
biochimiquement identiques, alors que les
chaînes β sont biochimiquement
différentes, leur conférant la spécificité
immunologique et leur rôle biologique.
Chez la femme, la LH est à l'origine de
l'ovulation et de la sécrétion d'hormones
stéroïdiennes telles que la progestérone
et les œstrogènes par le corps jaune. De
faibles quantités de LH sont également
nécessaires à la production d'œstrogènes
par le follicule en phase de maturation.
Chez l'homme, la LH en stimulant les
cellules interstitielles de Leydig est à
l'origine de la sécrétion d'androgènes et
d'œstrogènes par ces cellules. Les taux
de LH circulantes sont régulés par un
rétrocontrôle négatif déclenché par les
hormones stéroïdiennes qui agissent sur
l'hypothalamus. La LH est sécrétée chez
l'homme ou chez la femme de façon
pulsatile avec des fluctuations rapides sur
toute l'étendue du domaine de normalité.
Par conséquent, les concentrations
trouvées le même jour chez le même
patient peuvent varier de façon
considérable.
Le dosage de la LH a pour intérêt clinique
l'exploration de l'axe hypothalamohypophysaire gonadique. Le dosage des
gonadotrophines sériques permet de
différencier une insuffisance gonadique
primaire et une déficience de stimulation
gonadique. Si les taux de LH et FSH sont
élevés, il s'agit d'une insuffisance
gonadique primaire.
Par contre, si les taux de LH et FSH sont
bas, on est en présence d'une déficience
de stimulation gonadique. Le dosage de la
LH a également une importance clinique
dans le cas de maladies hypophysaires où
la LH et l'hormone de croissance sont les
premières à être touchées.
Le dosage de la LH sérique est aussi très
utile dans le diagnostic et le traitement de
la stérilité féminine. En effet, une
augmentation de LH en milieu de cycle est
un bon indicateur d'ovulation qui aura lieu
au plus tard dans les 24 heures. Ainsi, les
femmes stériles traitées par des
gonadotrophines sauront à quel moment
aura lieu leur ovulation grâce au dosage
de la LH.
La phase de reproduction chez la femme
est achevée lors de la ménopause, quand
la fonction ovarienne, avec sa sécrétion
d'oestradiol, diminue et finalement cesse.
Les taux circulants d'oestradiol et de
progestérone bas sont dus à une perte du
27
rétrocontrôle négatif de l'hypothalamus,
ayant pour résultat une augmentation très
importante du taux circulant de la LH. De
la même façon, le taux de la LH augmente
chez la femme à l'âge de la
préménopause souffrant d'une
insuffisance ovarienne ou d'un défaut de
développement des ovaires durant la
puberté. Il est important de noter que le
pic du milieu de cycle est complètement
effacé chez les femmes utilisant des
contraceptifs oraux et qu'il réapparaîtra
lors du premier cycle après arrêt du
traitement.
Le taux de LH n'est pas affecté par le
jeûne, par l'alimentation, par le stress et
l'exercice physique, par l'insuline,
l'hypoglycémie ou le monohydrochloride
d'arginine (utilisé pour l'étude de
l'hormone de croissance). L'administration
de testostérone et d'oestrogènes diminue
le taux de LH dans l'état de post
ménopause.
Principe du test
Coat-A-Count LH IRMA est un dosage
radioimmunométrique en phase solide
utilisant des anticorps monoclonaux et
polyclonaux anti-LH: un anticorps
polyclonal anti-LH marqué à l'iode 125, en
phase liquide et un anticorps monoclonal
anti-LH fixé à la paroi du tube en
polystyrène.
Dans le protocole:
La LH est capturée entre l'anticorps
monoclonal anti-LH fixé à la surface
interne du tube en polystyrène et
l'anticorps polyclonal anti-LH du traceur
radiomarqué.
L'anticorps libre anti-LH marqué à l'iode
125 est éliminé du mélange réactionnel
par décantation et lavage du tube; il en
résulte une très faible liaison non
spécifique, assurant ainsi une excellente
précision pour les valeurs basses.
La concentration de LH est directement
proportionnelle à la radioactivité présente
dans le tube après l'étape de lavage. La
radioactivité est mesurée grâce à un
compteur gamma et les concentrations de
LH dans les échantillons de patients sont
obtenues en comparant les cpm du
patients à ceux obtenus par la gamme
d'étalonnage.
28
Réactifs à distribuer: 1
Temps d'incubation totale : 1 heure (sur
un portoir agitateur)
Activité totale en début de marquage :
environ 300 000 cpm
Précautions d'emploi
Réservé à un usage diagnostique in vitro.
Réactifs : Conserver à +2/+8°C dans un
réfrigérateur autorisé à recevoir du
matériel radioactif. Éliminer les déchets
conformément aux lois en vigueur.
Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur
date d'expiration.
Certains composants fournis avec ce
coffret peuvent contenir des agents
humains et/ou d'autres éléments
potentiellement infectieux qui nécessitent
certaines précautions.
Respecter les précautions d'emploi et
manipuler tous les composants du coffret
comme des produits potentiellement
infectieux. Les réactifs dérivés de produits
humains et utilisés dans ce coffret ont subi
un test sérologique pour la Syphilis et des
tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-VHC et pour l'antigène de
surface de l'hépatite B, qui se sont tous
avérés négatifs.
De l'azide de sodium à des concentrations
inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme
conservateur ; lors de l'élimination,
l'évacuer avec de grandes quantités d'eau
pour éviter une accumulation d'azides
métalliques explosifs dans les
canalisations.
Eau : utiliser de l'eau distillée ou
désionisée.
Radioactivité
Ce coffret de réactif est réservé à l'usage
in vitro (Autorisation DGSNR).
Règles de base de protection contre les
rayonnements ionisants et précautions
d'emploi.
Ce produit radioactif ne peut être reçu,
acheté, détenu ou utilisé que par des
personnes autorisées à cette fin et dans
des laboratoires dotés de cette
autorisation. Cette solution ne peut en
aucun cas être administrée à l'homme ou
aux animaux. Respecter impérativement
les dates de péremption indiquées sur
l'emballage extérieur et sur les étiquettes
des différents réactifs du coffret. Tous les
réactifs, dont les tubes revêtus
d'anticorps, doivent être conservés à
+ 4/+ 8° C dans leur conditionnement
d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la
possession, l'utilisation et l'échange de
matières radioactives sont soumis aux
réglementations en vigueur dans le pays
de l'utilisateur. Les règles de base de
protection contre les rayonnements
ionisants doivent être respectées selon
des procédures en vigueur. Ne pas
pipeter des solutions radioactives avec la
bouche. Eviter le contact direct avec la
peau ou les muqueuses de tout produit
radioactif en utilisant des blouses et gants
de protection. Toute manipulation de
matières radioactives se fera dans un
local ad hoc éloigné de tout passage. Les
produits radioactifs seront stockés dans
leur conditionnement d'origine dans un
local approprié. Un cahier de réception et
de stockage de produits radioactifs sera
tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la
verrerie qui ont été contaminés doivent
être éliminés au fur et à mesure afin
d'éviter une contamination croisée de
plusieurs isotopes. Chaque contamination
ou perte de substance radioactive devra
être réglée selon les procédures établies.
Toute mise aux déchets de matière
radioactive se fera en accord avec les
réglementations en vigueur. Ne pas
manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer
des cosmétiques dans les laboratoires où
des produits radioactifs sont utilisés. Les
réactifs radioactifs ne peuvent être vendus
qu'à des personnes habilitées à manipuler
des substances radioactives.
Matériel Fourni :
Préparation Initiale
Tubes revêtus d'anticorps anti-LH
(ILH1)
Tubes en polystyrène revêtus d'anticorps
monoclonal murin anti-LH, conditionnés
dans des sachets hermétiques à glissière.
Les conserver réfrigérés et protégés de
l'humidité, bien refermer les sachets après
utilisation. Stable à +2/+8°C jusqu'à la
date d'expiration notée sur le sachet.
IKLH1: 100 tubes.
Anticorps anti-LH marqué à l'iode 125
(ILH2)
Anticorps polyclonal de chèvre anti-LH
marqué à l'iode 125. Le réactif est fourni
sous forme liquide, prêt à l'emploi.
Chaque flacon contient 5.5 ml. Stable à
+2/+8°C pendant 30 jours après
ouverture, ou jusqu'à la date d'expiration
marquée sur l'étiquette.
IKLH1: 2 flacons.
Standards LH (LHI3–9,X)
Huit flacons, étiquetés de A à H, de
standard LH dans une matrice sérique
humaine en tampon, avec conservateur.
Les standards sont fournis sous forme
lyophilisés : au moins 30 minutes avant
emploi, reconstituer le flacon de standard
zéro A avec 6 ml d'eau distillée ou
désionisée, et 3 ml pour les autres flacons
de standard, de B à H, chacun. Stable à
+2/+8°C pendant 30 jours après
ouverture. Pour une conservation plus
longue, aliquoter et congeler : stable à
–20°C pendant 2 mois.
IKLH1: 1 jeu.
Les standards contiennent respectivement
0, 1,5, 5, 7,5, 15, 30, 75 et 150 milli-Unités
Internationales de LH par millilitre
(mUI/ml) obtenus à partir de la première
préparation internationale de référence de
LH hypophysaire de l'OMS 68/40 et
seconde préparation internationale de
référence pour LH de l'OMS 80/552 (2nd
IS 80/552). Des points intermédiaires
peuvent être obtenus en mélangeant des
standards dans des proportions
compatibles.
Noter que les standards du coffret Coat-ACount LH IRMA ne sont pas
interchangeables avec ceux du coffret
Double Antibody LH.
Solution de tampon de lavage
concentrée (1TSBW)
40 ml d'une solution tampon saline
concentrée, avec surfactants et azide de
sodium comme conservateur. Utiliser un
récipient de transfert, diluer le contenu de
chaque flacon avec 400 ml d'eau distillée,
pour obtenir un volume total de 440 ml.
Stable à +2–8°C 6 mois après
préparation.
IKLH1: 1 flacon × 40 ml.
29
Matériel requis mais non fourni
Compteur Gamma – permettant
l'utilisation de tubes standards 12x75 mm
Agitateur — environ 200 tpm
Préparation des réactifs
Eau distillée ou désionisée
Eprouvette graduée — pour distribuer
400 ml
Pipette volumétrique de 3 ml
Flacon de conservation en plastique avec
couvercle— pour la préparation et le
stockage de la solution de tampon de
lavage
Immunodosage
Micropipettes: 100 µl et 200 µl
Distributeur — pour distribuer 2,0 ml de
solution de tampon de lavage
Un portoir de décantation – disponible
chez Siemens Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : FDR).
Papier graphe Log-log 3-cycles
Un contrôle, à base de sérum humain, à
trois niveaux de concentration, contenant
de la LH (parmi les 25 paramètres
dosables), est disponible chez Siemens
Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : CON6).
Recueil des échantillons
Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et
aucune préparation spéciale n'est requise.
14
Prélever le sang par ponction veineuse
sur tubes secs, héparinés ou EDTA, en
évitant l'hémolyse, et séparer le sérum ou
plasma des cellules. Noter l'heure de
prélèvement, car la sécrétion de LH
montre un léger cycle circadien.
Il est recommandé de clarifier les
échantillons hyperlipémiques par
ultracentrifugation.
coffret LH Coat-A-Count IRMA n'a pas été
testé sur tous les types de tubes
possibles. Veuillez consulter le chapitre
intitulé Autres Types d'Échantillons pour
plus de renseignements sur les tubes qui
ont été évalués.
Volume nécessaire : 200 µl de sérum ou
plasma par tube
Conservation: 2 semaines à +2/+8°C
ou jusqu'à 2 mois à –20°C.
15
Avant le dosage, laisser les échantillons
parvenir à température ambiante (15°C–
28°C) et mélanger par légères rotations
ou retournements. Aliquoter, si
nécessaire, afin d'éviter de répéter les
cycles congélation / décongélation. Ne
pas tenter de décongeler les spécimens
congelés à l'aide d'un bain-marie.
La trousse Coat-A-Count LH IRMA a un
domaine de mesure allant jusqu'à
300 mUI/ml. Les échantillons dont le taux
de LH est suspecté supérieur à cette
valeur, doivent être dilués dans le
standard A avant le dosage.
Protocole de dosage
Immunométrique
Chaque composant doit être à
température ambiante avant utilisation
(15°C–28°C).
1
Etiqueter 16 tubes coatés d'anticorps
anti-LH en duplicate, A (liaison non
spécifique) et de B à H (liaison
maximale LM). Etiqueter les tubes
coatés d'anticorps supplémentaires,
également en duplicate, pour les
échantillons de patients et les
contrôles.
Etiqueter 2 tubes (non coatés) 12 x
75 mm en polypropylène pour l'activité
totale.
Des échantillons hémolysés peuvent être
révélateurs d'une préparation inadéquate
du prélèvement avant son envoi au
laboratoire ; il faudra donc interpréter les
résultats avec prudence.
Des tubes pour prélèvements sanguins
provenant de fabricants différents peuvent
donner des résultats différents, selon les
matériaux et additifs utilisés, y compris
gels ou barrières physiques, activateurs
de la coagulation et/ou anticoagulants. Le
30
Standards
WHO 1st IRP 68/40
WHO 2nd IS 80/552
mUI/mL
T*
—
A (LNS)
0
B
1,5
C
7,5
D
15
E
30
F
75
G
150
H ("LM")
300
* En option
2
Pipeter 200 µl de chaque standard,
contrôle et échantillon sérique de
patient dans les tubes préparés.
Distribuer directement au fond du
tube. Les échantillons de patients
suspectés de contenir des
concentrations de LH supérieures au
standard le plus élevé (300 mUI/ml)
doivent être dilués avec le standard
zéro avant le dosage. Il est bon
d'utiliser des embouts de
micropipettes jetables, de changer
d'embout entre les échantillons de
manière à éviter toute contamination.
Les pipettes à « capillaire » et les
pipetteurs-diluteurs automatiques ne
doivent être utilisés que si le risque de
contamination a été évalué et jugé
insignifiant.
3
Ajouter 100 µl d'anticorps anti-LH
marqué à l'iode 125 dans chaque
tube.
Distribuer directement au fond du
tube. Bien s'assurer que l'échantillon
et le traceur sont parfaitement
mélangés. Une multipette est
recommandée. Les tubes T peuvent
être mis de côté jusqu'au comptage
(étape 6); ils n'ont besoin d'aucun
autre traitement.
4
Incuber 60 minutes sous agitation.
5
Décanter complètement. Ajouter à
chaque tube 2 ml de solution tampon
de lavage. Attendre 1 à 2 minutes et
décanter parfaitement. Ajouter de
nouveau 2 ml de solution tampon de
lavage, attendre 1 à 2 minutes et
décanter totalement.
Eliminer toute trace d'humidité pour
améliorer la précision. Après le
second lavage, utiliser un portoir de
décantation, décanter le contenu de
chacun des tubes (excepté les tubes
T) et laisser égoutter pendant 2 ou 3
minutes. Retourner alors
vigoureusement les tubes sur du
papier absorbant afin d'éliminer les
gouttelettes résiduelles.
6
Compter 1 minute dans un compteur
gamma.
Pour les compteurs gamma multipuits, les tubes T (optionnels) doivent
être séparés des autres tubes par au
moins un espace, afin de minimiser
les risques de contamination.
Calcul des Résultats et
Contrôle de Qualité
Pour calculer les concentrations de LH à
partir d'une courbe standard représentée
en log-log, il faut, dans un premier temps,
corriger les coups par minute (cpm) de
chaque paire de tubes en soustrayant la
moyenne des cpm des tubes à liaison non
spécifique (standard A):
Coups corrigés = Moyenne CPM moins
Moyenne LNS CPM
Puis déterminer pour chaque doublet la
capacité de liaison en pourcentage
(%B/B300, ici nommée "%B/LM") de liaison
maximale (LM), corrigée des cpm dus au
LNS des tubes H tubes considérés à
100%:
% liaison = (Cpm corrigés / Cpm corrigés H
(LM)) × 100
Utiliser le papier log-log 3 cycles pour la
construction de la courbe, en portant sur
l'axe des ordonnées les pourcentages de
liaison, et sur l'axe des abscisses les
valeurs des standards différents de zéro.
Tracer la courbe qui passe
approximativement par ces points. Relier
les points par des arcs ou des segments
de droite. Ne pas chercher à réaliser une
seule droite à partir des résultats. Les
concentrations des contrôles et des
inconnus dans le domaine de mesure du
standard zéro peuvent être lues à partir de
la droite par interpolation. Il est possible
de tracer un autre graphe à partir des 3
premiers standards pour apprécier les
valeurs proches de zéro.
31
Commentaires: Bien que d'autres
approches de calcul soit aussi
acceptables, la réduction des données
avec la méthode indiquée ci-dessus a
certains avantages du point de vue du
contrôle de qualité. En particulier, elle
donne une courbe d'étalonnage qui est
relativement linéaire avec les
représentations log-log et linéaire-linéaire,
et est relativement stable d'une dosage à
l'autre. Elle donne également des
paramètres déterminants pour le contrôle
de qualité, plus précisément, les valeurs
de % de liaison (%B/B300 ou "%B/LM) pour
les standards différents de zéro. Un
graphique encore plus utile, donnant une
idée de la reproductibilité intra-essai, peut
être obtenu en représentant directement
le pourcentage de liaison de chaque
standard, par exemple sans faire un calcul
de valeur moyenne à partir des cpm des
doublets.
Alternatives: Le pourcentage de liaison
peut être aussi calculé directement à partir
de la moyenne des cpm, la correction par
la liaison non spécifique produit
habituellement une courbe de calibration
qui est pratiquement linéaire sur tout le
domaine. Une courbe de calibration peut
être aussi créée en portant directement
sur l'ordonnée les cpm ou la moyenne des
cpm et en abscisse la concentration sur
du papier log-log ou linéaire-linéaire (le
papier semi-log ne doit pas être utilisé).
Cette méthode à l'avantage de sa
simplicité mais elle est moins
recommandée pour ce qui concerne le
Contrôle de Qualité.
Traitement informatique des données:
Les méthodes "Point-par-point", incluant
les fonctions de lissage linéaire, peuvent
être utilisées ; bien qu'elles ne permettent
qu'une faible assistance pour le suivi de la
qualité des tests, il est important de tracer
en log-log, selon les recommandations, la
courbe d'étalonnage, soit manuellement
soit informatiquement, en considérant que
c'est une étape du Contrôle de Qualité. Le
traitement des données utilisant des
fonctions polynomiales de 4ème ou 5ème
degré est aussi possible et est adapté.
Garder à l'esprit, cependant, que certains
algorithmes actuellement utilisés peuvent
ne pas être adaptés. Si une de ces
méthodes semble adaptée, il est essentiel
de vérifier qu'elle reste appropriée dans le
temps, par recalcul des concentration de
32
standards et d'autres paramètres. De plus,
un tracé log-log de la courbe de
calibration est fortement recommandé car
il est plus informatif que le tracé habituel
en semi-log.
Traitement des échantillons: Les
recommandations données concernant
l'utilisation et la conservation des sérums
doivent être respectées. Les échantillons
de patients suspectés de contenir des
concentrations de LH supérieures au
standard le plus élevé (300 mUI/mL)
doivent être dilués avec le standard zéro
avant le dosage. Tous les échantillons,
standards et contrôles inclus, doivent être
dosés en duplicate. Il est important
d'utiliser des micropipettes à embouts
jetables, de changer d'embout entre les
échantillons de manière à éviter toute
contamination. Les pipettes de transfert et
les pipeteurs diluteurs automatiques ne
doivent être utilisés que si le risque de
transmission de contamination a été
évalué et considéré comme insignifiante.
Les doublets de tubes de contrôles
doivent être espacés au long de la série
de dosage afin de vérifier l'absence de
dérive significative. Vérifier la
concordance des résultats entre les
doublets de tubes.
Compteur Gamma : Pour minimiser
l'éventualité d'une contamination dans le
compteur gamma multipuits, il convient de
séparer les tubes d'activité totale T des
autres tubes par au moins un espace. En
alternative, il est possible d'ajouter
uniquement 25 µl (au lieu de 100 µl) et de
multiplier par 4 le nombre de cpm obtenus
comme activité totale.
Contrôles: Les contrôles ou des pools de
sérum avec au moins deux niveaux de
concentration de LH (bas et élevé) doivent
être dosés en routine comme inconnus, et
les résultats notés jour après jour comme
décrit par exemple dans Westgard JO, et
al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Un redosage
d'échantillon peut être précieux pour
suivre la précision inter essai.
Paramètres du Contrôle de Qualité:
Nous recommandons de garder une trace
de ces résultats de performances:
T = Activité totale (cpm)
%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS /
cpm Totaux)
%LM = 100 × (Cpm corrigés H / cpm totaux)
Et toutes les valeurs de pourcentage de
liaison (%B/B300 ou "%B/LM") sauf la plus
élevée des standards différents de zéro,
par exemple:
%C/LM = 100 × (cpm standard C corrigés /
cpm H(LM) corrigés)
Conservation des données: Il est bon
d'enregistrer pour chaque dosage les
numéros de lots et la date de
reconstitution et/ou ouverture des
composants utilisés.
Bibliographie: Se reporter à Dudley RA,
et al. Guidelines for immunoassay data
Ces valeurs sont données à titre indicatif
uniquement. Chaque laboratoire devra
établir ses propres valeurs de référence.
9 femmes normales en phase ovulatoire
ont été étudiées sur un cycle avec le
coffret Coat-A-Count LH IRMA : le graphe
suivant montre les valeurs minimales,
moyennes et maximales observées en
mUI/mL (WHO 1st IRP 68/40 et WHO 2nd
IS 80/552) observées pour ces
échantillons à chaque jour du cycle. (Sur
l'axe des ordonnées, est reportée la
concentration en LH, l'axe des absisses
représente en jours un cycle normal.)
Exemple de série: A titre d'exemple
uniquement, et non pour calculer des
résultats provenant d'une autre série. (Voir
le tableau “Example Run”.)
Valeurs de référence
Pour les femmes en âge de procréer et
sans contraceptif, le domaine normal de la
LH est fonction de la période du cycle
considérée. En conséquence, le cycle
ovarien normal féminin peut être suivi
avec la trousse Coat-A-Count LH IRMA.
Les échantillons sont recueillis sur un
intervalle de 28 jours à partir des
dernières règles. Le pic ovulatoire a été
pris comme “ J 0 “ pour la période des 28
jours du cycle. J+1 à J+15 pour la phase
lutéale, J-1 à J-15 pour la phase
folliculaire. Des échantillons de 74 adultes
de sexe masculin ont également dosés
avec le coffret Coat-A-Count LH IRMA :
les résultats obtenus sont résumés dans
le tableau ci-dessous en mUI/ml de la
préparation des standards WHO 1st IRP
68/40 and WHO 2nd IRP 80/552.
Groupe
Hommes
Domaine
95%ile
absolu
n Médiane (mUI/mL) (mUI/mL)
74
2,0
0,4 – 5,7
2,1
0,6 – 6,2
Femmes
Phase Folliculaire 58
Milieu de cycle
10
29,5
Phase Lutéale
78
1,6
Post-ménopause 18
Contraceptif oral 104
12 – 51
ND – 6,0
19,3
1,8
11 – 50
ND – 5,9
ND = non détectable
Limites
Des échantillons obtenus le même jour
peuvent montré des variations importantes
à l'intérieur du domaine normal, suite au
caractère pulsatile de la sécrétion de LH,
sans qu'aucune erreur méthodologique ou
de la technique soit en cause.
Performances du test
Les résultats de la LH dans ces
paragraphes, sont exprimés en milli-unités
Internationales par millilitre (mUI/ml) à
partir de la première préparation
internationale de référence de LH
hypophysaire de l'OMS numéro 68/40 (1st
IRP 68/40), et seconde préparation
internationale de l'OMS, numéro 80/552
(2nd IS 80/552).
Tous les résultats, sauf notification
contraire, ont été obtenus avec des
échantillons sériques
Intervalle de linéarité :
jusqu'à 300 mUI/ml
(WHO 1st IRP 68/40 et 2nd IS 80/552)
Sensibilité analytique : 0,15 mUI/ml
33
Effet crochet : aucun jusqu'à
20 000 mUI/ml
Précision intra-dosage (au sein d'une
même série) : Les calculs ont été
effectués à partir des résultats de 20
dosages en double pour chacun des 3
échantillons dans une seule série. Les
résultats sont donnés en mIU/mL. (Voir le
tableau « Intraassay Precision ».)
Précision inter-dosage (entre plusieurs
séries) : Les calculs ont été effectués à
partir de 6 échantillons dosés en double
au cours de 20 séries différentes. (Voir le
tableau « Interassay Precision ».)
Spécificité : L'anticorps utilisé dans la
technique Coat-A-Count LH IRMA est
hautement spécifique de la LH, avec de
très faibles réactions croisées pour des
hormones glycoprotéiques comme la FSH,
l'hCG et la TSH. Voir le tableau
"Specificity" pour des données
représentatives.
Effet de la position des tubes : Aucun
jusqu'à 200 tubes. (Voir le tableau « Endof-Run Effect ».)
Test de dilution : Des échantillons ont
été dosés à différentes concentrations.
(Voir le tableau « Linearity » pour des
données représentatives.)
Test de récupération : Des échantillons
chargés dans un rapport de 1 à 19 avec
deux solutions de LH (475 et
1 025 mUI/ml) ont été dosés. (Voir le
tableau « Recovery » pour des données
représentatives.)
Bilirubine : La présence de bilirubine ne
présente aucun effet sur les résultats ni
sur la précision du dosage si la
concentration ne dépasse pas 200 mg/l.
Hémolyse : La présence d'agrégat
d'hématies jusqu'à une concentration de
30 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats
quant à la précision du dosage.
Autres types d'échantillons: pour
estimer l'effet de l'utilisation de différents
type d'échantillons, 10 volontaires ont été
prélevés sur tubes secs, héparinés, EDTA
®
et sur tubes vacutainer SST Becton
Dickinson. Tous les échantillons ont été
dosés avec le dosage Coat-A-Count LH
IRMA avec les résultats suivants :
(Héparine) = 1,03 (Sérum) – 0,3 mUIml
r = 0,999
34
(EDTA) = 0,95 (Sérum) + 0,6 mUI/ml
r = 0,993
(SST) = 1,02 (tubes ordinaires) – 0,19 mUI/ml
r = 0,999
Moyennes :
10,4 mUI/ml (Sérum)
10,4 mUI/ml (Héparine)
10,5 mUI/ml (EDTA)
10,4 mUI/ml (SST)
Comparaison de méthodes: Le dosage
Coat-A-Count LH IRMA a été comparé au
test IMMULITE LH sur 46 échantillons de
patients dont les concentrations en LH
allaient d'environ 0,5 à plus de 50 mUI/ml.
Par régression linéaire :
(CAC IRMA) = 0,79 (IML) – 0,24 mUI/ml
r = 0,972
Moyennes :
8,1 mUI/ml (Coat-A-Count IRMA)
10,5 mUI/ml (IMMULITE)
Assistance technique
Contacter votre distributeur national.
Le Système Qualité de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.
Italiano
Uso: Il dosaggio Coat-A-Count LH IRMA è
un dosaggio immunoradiometrico per la
determinazione quantitativa dell'ormone
luteinizzante (LH, lutropina) nel siero e nel
plasma eparinizzato o EDTA. E' a uso
diagnostico in vitro quale ausilio nella
diagnosi clinica di disfunzioni gonadiche.
Codice: IKLH1 (100 provette)
Il kit da 100 determinazioni
contiene meno di 20 microcurie
(740 kilobecquerel) di anticorpi
125
policlonali anti-LH marcati con I .
Riassunto e Spiegazione del
Test
L'ormone luteinizzante (LH, Lutropina) è
secreto dalla cellule β dell'ipofisi anteriore
sotto il controllo dell'ormone ipotalamico
che rilascia la gonadotropina (GnRH). Si
tratta di un carboidrato che contiene
proteine con una massa molecolare di
circa 28 000 dalton formato da due catene
di polipeptidi chiamati alfa e beta. La
catena alfa dell'LH, FSH e TSH ed HCG
sono biologicamente identiche, mentre le
catene beta sono biologicamente uniche e
conferiscono specificità biologica ed
immunologica. La bioattività è anche
determinata dalla catena beta.
L'LH nelle femmine provoca l'ovulazione e
la produzione di steroidi (estrogeni e
progesterone) da parte del corpo luteo.
Nel maschio stimola le cellule interstiziali
(cellule di Leydig) a produrre androgeni ed
estrogeni. Piccole quantità di LH possono
essere necessarie anche per favorire la
produzione di estrogeni attraverso il
follicolo in maturazione sotto stimolazione
dell'FSH. I livelli circolanti di LH sono
controllati da un feedback negativo
sull'ipotalamo da parte degli ormoni
steroidei. Benché l'LH e l'FSH siano
richiesti per le normali funzioni sessuali sia
nel maschio che nella femmina,
l'andamento delle secrezioni è molto
diverso nei due sessi. Negli adulti
sessualmente maturi, l'FSH e l'LH non
sono secreti in quantitativi costanti;
piuttosto le secrezioni avvengono ad
impulsi che provocano rapide fluttuazioni
sull'intero range di riferimento (sopra o
sotto dal 50 al 100%). A causa di questa
secrezione ad impulsi, i campioni ottenuti
in un unico giorno dallo stesso paziente
possono fluttuare in maniera
considerevole entro il range di riferimento,
e riflettono le variazioni fisiologiche
piuttosto che gli errori nella tecnica o nella
metodologia.
L'utilizzo clinico primario delle misurazioni
di LH è nella definizione dell'asse
ipotalamo-ipofisi-gonadi. Le
determinazioni dei livelli di gonadotropina
sierica consentiranno di distinguere tra
disturbi gonadici primari e stimolazione
gonadica deficitaria. Se i livelli di LH e di
FSH sono elevati (ipogonadismo
ipergonadotropico), è presente un
malfunzionamento gonadico primario.
Se, d'altro canto, i livelli di gonadotropina
sono bassi (ipogonadismo
ipogonadotropico), la stimolazione
gonadica deficitaria provoca
ipogonadismo. A parte il ruolo essenziale
che giocano le determinazioni di LH ed
FSH nel diagnosticare le disfunzioni
gonadiche, le determinazioni di LH hanno
importanza clinica poiché l'ormone della
crescita e l'LH sono di frequente i primi
ormoni ad essere interessati dalle
patologie dell'ipofisi.
Le determinazioni sieriche si sono rivelate
di grande aiuto nella diagnosi e terapia
dell'infertilità femminile. Un innalzamento
a metà ciclo del livello di LH costituisce un
buon indice che l'ovulazione avverrà circa
24 ore dopo. Le coppie con problemi di
fertilità ed anche le donne sottoposte a
terapia con gonadotropine possono
essere informate che l'ovulazione sta per
avvenire.
La fase riproduttiva nelle donne termina
con la menopausa quando la funzione
ovarica, con la secrezione di estradiolo
decresce e potenzialmente cessa. A
causa dei bassi livelli di estradiolo e
progesterone nel circolo, c'è una perdita di
feedback negativo da parte dell'ipotalamo;
provocando un rilevante aumento dei
livelli di LH in circolo. In maniera analoga, i
livelli di LH aumentano nelle giovani
donne in premenopausa che soffrono di
disturbi ovarici o le cui ovaie non si sono
sviluppate durante la pubertà. E'
importante notare che il picco a metà ciclo
è completamente assente in donne sane
che utilizzano contraccettivi orali, e
riappare nel primo ciclo normale dopo
l'interruzione dei contraccettivi.
Nessun effetto sui livelli di LH è stato
riscontrato dopo digiuno, assunzione di
cibo, stress ed esercizio fisico, ipoglicemia
da insulina o infusione con arginina
monoidrocloruro (utilizzata nello studio
dell'ormone della crescita). La
somministrazione di testosterone e di
estrogeni provoca una depressione nei
livelli di LH in donne in post-menopausa.
Procedura del Dosaggio
Il dosaggio Coat-A-Count LH IRMA è un
dosaggio immunoradiometrico in fase
solida basato su anticorpi monoclonali e
policlonali anti-LH: anticorpi policlonali
125
anti-LH marcati con I e anticorpi
monoclonali anti-LH adesi alla parete di
una provetta di polistirene.
Nel Dosaggio:
L'LH è catturato tra gli anticorpi
monoclonali anti-LH adesi alla superficie
interna della provetta di polistirene ed il
tracciante policlonale anti-LH
radiomarcato.
35
Gli anticorpi non legati anti-LH marcati con
125
I sono rimossi decantando la miscela di
reazione e lavando la provetta; ciò riduce
il legame non specifico ad un livello molto
basso, ed assicura un'eccellente
precisione low-end.
La concentrazione di LH è direttamente
proporzionale alla radioattività presente
nella provetta dopo lavaggio. La
radioattività viene contata utilizzando un
gamma counter, dopo di che la
concentrazione di LH nel campione viene
ottenuta comparando le conte per minuto
del paziente con quelle ottenute per il set
di calibratori forniti.
Reagenti da Dispensare: 1
Tempo Totale di Incubazione: 1 ora
(su shaker)
Conte Totali alla iodinazione:
circa 300 000 cpm
Avvertenze e Precauzioni
Ad uso diagnostico in vitro.
Reagenti: Conservare a 2–8°C in un
frigorifero appositamente destinato al
materiale radioattivo. Eliminare secondo le
normative di legge vigenti.
Non utilizzare reagenti oltre la data di
scadenza.
Alcuni componenti forniti in questo kit
possono contenere materiale di origine
umana e/o altri ingredienti potenzialmente
pericolosi che necessitano di precauzioni
di utilizzo.
Seguire le precauzioni universali, e
manipolare tutti i componenti come se
potessero trasmettere agenti infettivi.
Sono stati dosati i materiali di origine
umana e sono stati trovati non reattivi per
la Sifilide; per gli Anticorpi Anti-HIV 1 e 2;
per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B;
e per gli Anticorpi Anti-Epatite C.
E' stata aggiunta Sodio Azide a
concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come
conservante. Al momento
dell'eliminazione, irrorare con molta acqua
per evitare la formazione di azidi
metalliche potenzialmente esplosive nelle
tubature di piombo e di rame.
Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o
deionizzata.
36
Radioattività
Una copia di tutti i certificati di
Autorizzazione per radioisotopi (Specifica
o Generica) rilasciata ad un cliente
americano deve essere conservata in file
presso la Siemens Healthcare Diagnostics
prima che i kit o i componenti contenenti
materiale radioattivo possano essere
spediti. Questi materiali radioattivi
possono essere acquisiti da qualsivoglia
cliente in possesso dell'Autorizzazione
Specifica. Con l'Autorizzazione Generica
questi materiali radioattivi possono essere
acquistati solo da medici, veterinari che
esercitino la professione, laboratori clinici
ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di
test clinici o di laboratorio in vitro che non
implichino somministrazione interna o
esterna del materiale radioattivo o delle
sue radiazioni alle persone o animali. La
sua acquisizione, ricevimento,
conservazione, utilizzo, trasferimento ed
eliminazione sono soggette a
regolamentazioni e ad Autorizzazione
(Generica o Specifica) della Commissione
Statunitense per il Nucleare o dello Stato
con il quale l'NRC abbia stipulato un
accordo per l'esercizio del controllo
regolatorio.
Manipolare i materiali radioattivi secondo
quanto previsto dall'Autorizzazione
Generica o Specifica. Per minimizzare
l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore
deve attenersi alle linee guida stabilite dal
National Bureau of Standards publication
su “Safe Handling of Radioactive
Materials” “Norme per una corretta
manipolazione dei Materiali
Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9
Marzo 1964) e successive edizioni
pubblicate dallo Stato e dalle Autorità
Federali.
Assorbire immediatamente le fuoriuscite e
decontaminare le superfici contaminate.
Evitare la formazione di aerosol. Eliminare
i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto
previsto dall'Autorizzazione. Le licenze
generiche (possessori di NRC Form 483)
possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi
come non radioattivi, dopo aver rimosso
l'etichetta. I detentori di autorizzazioni
specifiche (NRC Form 313) devono fare
riferimento al Titolo 10, Codice delle
Regolamentazioni Federali Parte 20. I
detentori di Autorizzazioni negli Stati che
hanno stipulato un accordo con l'NRC
dovrebbero far riferimento alle
regolamentazioni idonee dei loro stati. I
detentori di Autorizzazioni Generali
possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi
del tipo contenuto in questo prodotto
attraverso il lavello del laboratorio. I
detentori di autorizzazione devono
eliminare o rendere illeggibili le etichette
dei contenitori vuoti di materiali radioattivi
prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori
di autorizzazioni specifiche possono
eliminare piccoli quantitativi di rifiuti
radioattivi liquidi del tipo utilizzato in
questo prodotto attraverso il lavello del
laboratorio. Fare riferimento alle
regolamentazioni appropriate applicabili al
Vostro laboratorio.
Materiali Forniti:
Preparazione Iniziale
Provette Coattate con Anticorpo LH
(ILH1)
Provette di polistirene coattate con
anticorpi monoclonali murini anti-LH e
confezionate in buste a cerniera.
Conservare refrigerate al riparo
dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo.
Stabili a 2–8°C fino alla data di scadenza
indicata sulla confezione.
IKLH1: 100 provette.
125
Anticorpi LH marcati con I (ILH2)
Anticorpi policlonali iodinati di capra antiLH. Il reagente viene fornito in forma
liquida, pronto all'uso. Ciascun flacone
contiene 5,5 mL. Stabile a 2–8°C per 30
giorni dopo l'apertura, o fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta.
IKLH1: 2 flaconi.
Calibratori LH (LHI3–9,X)
Otto flaconi, etichettati dalla A alla H, di
calibratori LH liofili in una matrice di
siero/tampone umano, con conservanti.
Almeno 30 minuti prima dell'utilizzo,
ricostituire il calibratore zero A con 6 mL
di acqua distillata o deionizzata ed i
rimanenti calibratori dalla B alla H con
3 mL ciascuno. Stabile a 2–8°C per 30
giorni dopo la ricostituzione, o (aliquotati)
a –20°C per 2 mesi.
IKLH1: 1 set.
I calibratori ricostituiti contengono,
rispettivamente 0, 1,5, 7,5, 15, 30, 75, 150
e 300 milli-Unità Internazionali di LH per
millilitro (mIU/mL) in termini di WHO Prima
Preparazione Internazionale di
Riferimento dell'LH per immunodosaggi,
numero 68/40 (1°IRP 68/40) e WHO
Secondo Standard Internazionale dell'LH
per Immunodosaggi, numero 80/552 (2°
IS 80/552). I punti intermedi della
calibrazione possono essere ottenuti
mescolando i calibratori in proporzioni
idonee.
Attenzione i calibratori Coat-A-Count LH
IRMA non sono intescambiabili con quelli
forniti nel kit Doppio Anticorpo LH.
Soluzione di Lavaggio Concentrata
(1TSBW)
Soluzione di lavoro salina concentrata,
con surfactanti e con sodio azide come
conservante. Utilizzando un contenitore
per il trasferimento, diluire il contenuto di
ciascun flacone con 400 mL di acqua
distillata per un volume totale di 440 mL.
Stabile a 2-8°C per 6 mesi dopo la
preparazione.
IKLH1: 1 flacone × 40 mL.
Materiali Richiesti Ma Non
Forniti
Gamma counter — compatibile con
provette standard da 12x75 mm
Rack shaker — settato a circa 200 colpi al
minuto
Preparazione dei Reagenti
Acqua distillata o deionizzata
Pipetta volumetrica: 3,0 mL
Cilindro graduato — per la dispensazione
di 400 mL
Contenitore di plastica con coperchio –
per la preparazione e la conservazione
della Soluzione di Lavaggio
Immunodosaggio
Micropipette: 100 µL e 200 µL
Dispensatore — per la dispensazione di
2,0 mL di Soluzione di Lavaggio
Foam per la decantazione — disponibile
presso Siemens Healthcare Diagnostics
(Codice: FDR).
Carta per grafici a 3-cicli log-log
Un controllo su base sierica umana a tre
livelli, contenente LH tra gli altri oltre 25
costituenti dosati, disponibile presso
Siemens Healthcare Diagnostics (Codice:
CON6).
37
Anticorpo LH, anch'esse in duplicato,
per i controlli ed i campioni.
Prelievo dei Campioni
Non è necessario che il paziente sia a
digiuno, non sono necessarie preparazioni
14
particolari. Prelevare il sangue in
provette semplici, eparinizzate o EDTA,
facendo attenzione ad evitare l'emolisi, e
separando il siero o il plasma dalle cellule.
(Vedi anche la sezione sugli Tipo di
Campione Alternativo). Poiché è noto che
l'LH presenta un piccolo ritmo circadiano,
occorre annotare l'ora del prelievo.
Etichettare con T (opzionali), due
provette semplici (non coattate) da
12x75 mm di polipropilene (conte
totali) in duplicato.
Calibratori
WHO 1° IRP 68/40
WHO 2° IS 80/552
mIU/mL
T*
—
A (NSB)
0
B
1,5
I campioni emolizzati posson indicare il
trattamento non idoneo del campione
prima dell'arrivo al laboratorio; per questo
motivo, i risultati devono essere
interpretati con prudenza.
C
7,5
F
75
Provette per il prelievo di sangue di
produttori diversi possono dare valori
differenti, a seconda dei materiali e degli
additivi usati, incluso gel o barriere fisiche,
attivatori di coaguli e/o anticoagulanti.
L'Coat-A-Count IRMA LH non é stato
verificato con tutte le possibili variazioni di
tipi di provette. Consultare la sezione
riguardante Campioni Alternativi per
dettagli sulle provette testate.
G
150
H ("MB")
300
Si consiglia l'utilizzo di un'ultracentrifuga
per schiarire i campioni lipemici.
2
3
Dosaggio Immunometrico
1
38
Etichettare con A sedici Provette
Coattate con Anticorpo LH A (legame
non specifico) e dalla B alla H
("legame massimo") in duplicato.
Etichettare altre Provette Coattate con
Dispensare 200 µL di ciascun
calibratore, controllo e campione nelle
provette preparate.
Aggiungere 100 µL di anticorpi
125
marcati con I LH in ogni provetta.
Pipettare direttamente al fondo ed
assicurarsi che il campione ed il
tracciante siano completamente
mescolati. Si consiglia l'utilizzo di un
dispensatore a ripetizione. Mettere da
parte le provette T per la conta (al
punto 6); non sono necessari ulteriori
passaggi.
Campioni con concentrazioni attese
superiori al calibratore più elevato
(300 mIU/mL) devono essere diluiti con il
calibratore zero prima del dosaggio.
Tutti i componenti devono essere portati a
temperatura ambiente (15–28°C) prima
dell'utilizzo.
30
Pipettare direttamente al fondo.
Campioni con concentrazioni attese di
LH superiori al calibratore più elevato
(300 mIU/mL) devono essere diluiti
con il calibratore zero prima del
dosaggio. Si consiglia l'utilizzo di
micropipette con puntali monouso. Per
evitare il carryover da un campione
all'altro. Pipette a dislocazione positiva
e pipettatori-diluitori automatici
devono essere utilizzati solo se la
possibilità che si verifichi il carryover è
stata valutata e ritenuta insignificante.
15
Prima del dosaggio, fare in modo che tutti
i campioni raggiungano temperatura
ambiente (15–28°C) e mescolare
capovolgendo la provetta. Aliquotare, se
necessario per evitare cicli ripetuti di
congelamento e scongelamento. Non
tentare di scongelare i campioni congelati
riscaldandoli in un bagnetto termostatato.
15
E
* Opzionali
Volume Richiesto: 200 µL di siero o
plasma per provetta.
Conservazione: 2–8°C per 2 settimane,
o a –20°C fino a 2 mesi.
D
4
Scuotere per 1 ora su shaker.
5
Decantare ed asciugare
completamente, quindi, aggiungere
2,0 mL di Soluzione di Lavaggio in
ogni provetta. Attendere da 1 a 2
minuti, quindi decantare
completamente. Ancora aggiungere
2,0 mL di Soluzione di Lavaggio,
attendere da 1 a 2 minuti, e decantare
completamente.
Rimuovere tutta l'umidità visibile
aumentando così la precisione. Dopo
il secondo lavaggio, decantare il
contenuto di tutte le provette (ad
eccezione delle provette T) utilizzando
un foam per la decantazione, e fare in
modo che asciughino per 2 o 3 minuti.
Tamponarle su carta assorbente per
eliminare completamente i liquidi.
6
Contare per 1 minuto in un gamma
counter.
Nei gamma counter multi testina, le
provette delle Conte Totali (opzionali)
devono essere separate dalle
rimanenti provette di almeno uno
spazio, per minimizzare la possibilità
di fuoriuscite.
Calcolo e Controllo di Qualità
Per calcolare i risultati (in termini di unità
di concentrazione) da una
rappresentazione log-log della curva di
calibrazione, correggere inizialmente le
conte per minuto (CPM) di ciascuna
coppia di provette sottraendo i CPM medi
delle provette senza legame specifico
(calibratore A):
Conte Nette = Media dei CPM Meno Media CPM
NSB
Quindi determinare la percentuale di
legato (relativa a quella del calibratore più
elevato) – qui chiamato "%B/MB" – di
ciascuna coppia di provette come
percentuale del “legame massimo” con le
conte corrette con NSB del calibratore più
alto prese al 100%:
Percentuale di Legato = (Conte Nette / Conte
Nette MB) × 100
Utilizzando una carta per grafici log-log a
3 cicli, tracciare la Percentuale di Legato
vs. la Concentrazione per ciascuno dei
calibratori non zero e tracciare la curva
lungo il percorso di questi punti.
(Collegare i punti della calibrazione con
archi o segmenti. Non tentare di utilizzare
un'unica linea retta). Le concentrazioni per
i controlli ed i campioni non noti entro il
range dei calibratori non zero possono
essere calcolate dalla curva di
calibrazione per interpolazione. E'
possibile tracciare una curva ulteriore tra
la Percentuale di Legato e la
Concentrazione per i tre calibratori più
bassi con un grafico linear-linear per
calcolare l'interpolazione della dose
prossima a zero.
Commenti: Benché altri approcci risultino
accettabili, il calcolo dei dati con il metodo
appena descritto ha alcuni vantaggi dal
punto di vista del controllo di qualità. In
particolare, produce una curva di
calibrazione che è relativamente lineare
sia nella rappresentazione log-log che
linear-linear, e relativamente stabile da
dosaggio a dosaggio. Produce anche
parametri di QC validi, ad es.: Valori di
Percentuale di Legato (%B/MB) per i
calibratori non zero. Un grafico che porta
ancora più informazioni, con un senso di
riproducibilità intra-dosaggio in funzione
della concentrazione, può essere ottenuto
direttamente tracciando i valori della
Percentuale di Legato delle singole
provette dei calibratori, i.e. senza prima
calcolare la media dei CPM dei replicati.
Alternative: Benché la percentuale di
Legato possa essere calcolata
direttamente dai CPM medi, la correzione
per il legame non specifico produce
normalmente una curva di calibrazione
che è più lineare lungo il suo range. Una
curva di calibrazione può anche essere
costruita tracciando i CPM o la Media dei
CPM direttamente vs. la concentrazione
sia su grafico log-log che linear-linear.
(non utilizzare grafici semi-log). Questo
approccio ha il vantaggio della semplicità,
ma è meno auspicabile dal punto di vista
del controllo di Qualità.
Calcolo Computerizzato dei Dati: Sono
accettabili metodi "Punto-a-punto", incluse
linee spline cubiche e lineari; ma poiché
sono poco d'aiuto nel monitoraggio
dell'integrità del dosaggio, è importante
preparare la rappresentazione log-log
della curva di calibrazione, sia
manualmente che con il computer come
step del controllo di qualità. Possono
essere utilizzate anche le tecniche di
calcolo dei dati basate sul modello
logistico. All'interno di questa famiglia, le
routine di curve-fitting basate sulla
logistica a 4 o 5 parametri sono i candidati
più idonei. Tuttavia, alcuni algoritmi ad
oggi in uso possono non convergere in
modo uniforme, anche quando il modello
logistico è in accordo con i dati. Se viene
39
adottato un metodo logistico, è essenziale
verificarne l'appropriatezza per la routine
giornaliera monitorando il calcolo dei
calibratori e di altri parametri. Inoltre, si
consiglia una rappresentazione log-log
della curva di calibrazione, poiché fornisce
più informazioni della rappresentazione
convenzionale semi-log.
Manipolazione dei Campioni: Le
istruzioni per la manipolazione e la
conservazione dei campioni e dei
componenti del kit devono essere
scrupolosamente osservate. Diluire i
campioni con concentrazioni attese
elevate con il calibratore zero prima di
dosarli. Tutti i campioni, inclusi i calibratori
ed i controlli debbono essere dosati
almeno in duplicato. E' importante
utilizzare una micropipetta con puntali
monouso, cambiando il puntale tra i
campioni per evitare la contaminazione da
carry-over. E' possibile utilizzare pipette a
dislocazione positiva e pipettatori-diluitori
automatici solo se è già stata esclusa la
possibilità che si verifichi il carry-over.
Coppie di provette dei controlli possono
essere intervallate all'interno del dosaggio
per verificare l'assenza di deviazioni
significative. Controllare i risultati per
verificare la concordanza all'interno delle
coppie di provette.
Gamma Counter: Per minimizzare la
possibilità che si verifichino fuoriuscite in
gamma counter multi-pozzetto, le provette
delle conte totali opzionali (T) devono
essere separate da uno o più spazi dalle
altre provette. In alternativa, aggiungere
solo 25 µL del tracciante ad ognuna delle
provette T al punto 3, e moltiplicare le
conte per minuto osservate in queste
provette per 4.
Controlli: controlli o pool di sieri con
almeno due livelli di concentrazioni di LH
(basso ed alto) devono essere dosati
routinariamente come campioni non noti,
ed i risultati annotati giorno dopo giorno
come indicato in in Westgard JO, et al. A
multi-rule chart for quality control. Clin
Chem 1981;27:493-501. Ripetere i
campioni quale ulteriore strumento di
monitoraggio della precisione interdosaggio.
%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte
Totali)
%MB = 100 × (Conte Nette MB / Conte Totali)
Ed i valori delle Percentuali di Legato
("%B/MB") di tutti i calibratori più alti ad
eccezione di quelli zero, ad esempio:
%C/MB = 100 × (Conte Nette del
Calibratore "C" / Conte Nette MB)
Archivio dei Dati: Si consiglia per ogni
dosaggio di annotare i numeri di lotto dei
componenti utilizzati, le date di
ricostituzione o di apertura.
Ulteriori Letture: Vedi Dudley RA et al.
Seduta Esemplificativa: a solo scopo
illustrativo e non per calcolare i risultati di
un'altra seduta. (vedi tabella "Example
Run").
Valori Attesi
In una donna in età fertile che non
assume contraccettivi, il range di
riferimento dell'LH è in funzione del
periodo mestruale. In maniera identica,
sono state monitorate donne con cicli
ovulatori normali con il dosaggio
Coat-A-Count LH IRMA. Sono stati
prelevati campioni di siero ad intervalli di
28 giorni ad iniziare dall'ultimo periodo
mestruale. La normalizzazione del picco a
metà ciclo è stata raggiunta indicando per
ciascun paziente il momento del picco di
LH come giorno zero. L'assegnazione dei
campioni alla fase follicolare e luteinica è
stata effettuata contando a ritroso per la
fase follicolare e contando in avanti per la
fase luteinica. Inoltre, sono stati dosati
campioni di 74 maschi adulti con il
dosaggio Coat-A-Count LH IRMA. I
risultati sono di seguito tabulati in mIU/mL
I risultati sono di seguito tabulati in
mIU/mL (WHO 1° IRP 68/40 e WHO 2°
IRP 80/552).
Parametri di QC: Consigliamo di
annotare tali prestazioni:
T = Conte Totali (conte al minuto)
40
Gruppo
Maschi Adulti
Range
95%
Range Assoluto
n Mediana (mIU/mL) (mIU/mL)
74
2,0
0,4 – 5,7
0,6 – 6,2
Donne
Fase Follicolare
58
2,1
Metà ciclo
10
29,5
Fase luteinica
78
1,6
Postmenopausa
18
19,3
104
1,8
Contraccettivi
orali
12 – 51
ND – 6,0
11 – 50
ND – 5,9
ND: non determinabile.
I laboratori devono considerare questi
risultati soltanto come linee guida. Ogni
laboratorio dovrebbe stabilire i propri
range di riferimento.
Nove donne con cicli ovulatori normali
sono state seguite lungo un ciclo
mestruale utilizzando il dosaggio
Coat-A-Count LH IRMA. Il prelievo del
siero, cosiccome la normalizzazione dei
valori di LH relativa al picco di metà ciclo,
sono stati raggiunti come più sopra
descritto. Il grafico di seguito riportato
descrive i valori massimo, medio e minimo
di LH in mIU/mL (WHO 1° IRP 68/40 e
WHO 2° IS 80/552) per quei campioni su
ogni giorno del ciclo. (La concentrazione
di LH è indicata sull'asse y ed il giorno di
normalizzazione sull'asse x).
Prestazioni del Dosaggio
I risultati dell'LH nelle sezioni di cui di
seguito sono espressi in milli-Unità
Internazionali di LH per millilitro (mIU/mL)
in termini di WHO Prima Preparazione di
Riferimento dell'LH per immunodosaggio,
numero 68/40 (1° IRP 68/40) e WHO
Secondo Standard Internazionale dell'LH
per Immunodosaggi, numero 80/552 (2°
IS 80/552).
Se non diversamente specificato, i risultati
sono basati sul dosaggio di campioni di
siero.
Range di Calibrazione: Fino a
300 mIU/mL (WHO 1°IRP 68/40 e
2°IS 80/552)
Sensibilità analitica: 0,15 mIU/mL
Effetto Gancio a Dosi Elevate: Fino a
20 000 mIU/mL.
Precisione Intra-Dosaggio (All'interno
della stessa seduta): Sono state
calcolate statistiche per ciascuno dei tre
campioni dai risultati di 20 coppie di
provette in un unico dosaggio. I risultati
sono espressi in mIU/mL. (Vedi tabella
“Intraassay Precision”.)
Precisione Inter-Dosaggio (Da una
seduta all'altra): Sono state calcolate
statistiche per ciascuno dei sei campioni
dai risultati di coppie di provette in 20
dosaggi diversi (Vedi tabella “Interassay
Precision”.)
Specificità: Gli anticorpi Coat-A-Count LH
IRMA sono altamente specifici per l'LH,
con una crossreattività bassa vs. ormoni
glicoproteici strutturalmente relazionati
quali FSH, HCG e TSH). (Vedi tabella
"Specificity" per dati rappresentativi.)
Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa
200 provette. (vedi tabella "End-of-Run
Effect").
Linearità: I campioni sono stati pdosati a
varie diluizioni. (Vedi tabella “Linearity” per
dati rappresentativi.)
Limiti
A causa della secrezione ad impulsi, i
campioni ottenuti lo stesso giorno dallo
stesso paziente possono fluttuare in
maniera consistente entro il range di
riferimento, riflettendo la variazione
fisiologica piuttosto che errori nella tecnica
o nella metodologia.
Recupero: Sono stati dosati campioni
1:19 con due soluzioni di LH (475 e
1 025 mIU/mL). (Vedi tabella “Recovery”
per dati rappresentativi).
Bilirubina: La presenza di bilirubina in
concentrazioni fino a 200 mg/L non ha
nessun effetto sui risultati entro il range di
precisione del dosaggio.
41
Emolisi: La presenza di globuli rossi
impaccati in concentrazioni fino a
30 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il
range di precisione del dosaggio.
Tipo di Campione Alternativo: Per
determinare l'effetto di campioni
alternativi, è stato prelevato del sangue da
10 volontari in provette semplici,
eparinizzate, EDTA e Becton Dickinson
®
vacutainer SST . Tutti i campioni sono
stati dosati con il dosaggio Coat-A-Count
LH IRMA, con i seguenti risultati:
(Eparina) = 1,03 (Siero) – 0,3 mIU/mL
r = 0,999
(EDTA) = 0,95 (Siero) + 0,6 mIU/mL
r = 0,993
(SST) = 1,02 (tubi semplici) – 0,19 mIU/ml
r = 0,999
Valore Medio:
10,4 mIU/mL (Siero)
10,4 mIU/mL (Eparina)
10,5 mIU/mL (EDTA)
10,4 mIU/mL (SST)
Comparazione di Metodi: Il dosaggio
Coat-A-Count LH IRMA è stato comparato
al dosaggio IMMULITE LH su 45 campioni
con concentrazioni di LH da circa 0,5 a
oltre 50 mIU/mL. (Vedi grafico) Mediante
regressione lineare:
r = 0,972
Valore medio:
Assistenza Tecnica
All'estero: Si prega di contattare il proprio
Distributore Nazionale.
Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.
Português
LH IRMA Coat-A-Count
Utilização: O LH IRMA Coat-A-Count é
um ensaio imunoradiométrico
desenvolvido para a mensuração
quantitativa do hormónio luteinizante (LH,
lutropina) em soro ou plasma
heparinizado ou com EDTA. É destinado
42
somente para uso diagnóstico in vitro
usado como auxiliar no diagnóstico clínico
da disfunção gonadal.
Números de catálogo: IKLH1 (100 tubos)
O kit de 100 tubos contêm menos
que 20 microcuries
(740 kilobecquerels) de anti-LH
125
policlonal I radioactivo.
Sumário e explicação do teste
O hormónio luteinisante (LH, lutropina) é
secretado das células β da pituitária
anterior, sob controle do hormónio
liberador da gonadotropina hipotalâmica
(GnRH). O LH é um carbohidrato
contendo proteína com massa molecular
de aproximadamente 28 000 daltons
consistindo de duas cadeias
polipeptídicas designadas de alfa e beta.
As cadeias alfa do LH, FSH, TSH e HCG
são bioquimicamente idênticas, no
entanto as cadeias beta são
bioquimicamente únicas e conferem a
especificidade biológica e imunológica. A
bio actividade também é determinada pela
cadeia beta.
Nas mulheres, o LH causa a ovulação e a
produção de esteróides (estrógenios e
progesterona) pelo corpo luteo. No
homem o mesmo estimula as células
intersticiais (células de Leydig) para
produzir androgenos e estrogenos.
Pequenas quantidades de LH são
também necessários para promover a
produção de estrogenios pelo folículo
maturante estimulado pelo FSH. Os níveis
circulantes de LH são controlados por um
efeito de retroalimentação (“feed back”)
negativo, no hipotálamo, por hormónios
esteróideanos. Apesar do LH e do FSH
serem requeridos para uma função sexual
normal em ambos, homens e mulheres,
os padrões secretórios são muito
diferentes para os dois sexos. Em adultos
sexualmente maduros, o FSH e o LH não
são secretados em quantidades
constantes; assim sendo, a secreção
ocorre em pulsos o qual resulta numa
rápida flutuação ao longo de toda faixa de
referência (para mais ou para menos de
50 à 100%). Em razão dessa secreção
pulsátil, as amostras obtidas num único
dia de um mesmo paciente pode flutuar
amplamente dentro da faixa de referência
reflectindo uma variação fisiológica ao
invés de erros na técnica ou na
metodologia.
O uso clínico primário das mensurações
de LH claramente define o eixo
hipotalâmico – pituitário – gonadal.
Mensurações dos níveis de gonadotrofina
sérica ira permitir a distinção entre uma
falência gonadal primária de um deficiente
estimulo gonadal. Se os níveis de LH e
FSH estiverem elevados (hipogonadismo
hipergonadotrofico), uma falência gonadal
primaria esta presente.
Por outro lado, se os níveis de
gonadotrofina estiverem baixos
(hipogonadismo hipogonadotrofico), uma
deficiência na estimulação gonadal resulta
em um estado hipogonadal. A parte do
papel essencial das medidas de LH e FSH
no diagnóstico na disfunção gonadal, a
mensuração de LH também possui uma
importância clínica em razão do hormónio
de crescimento e o LH serem
frequentemente os primeiros hormónios a
serem afectados por uma doença da
pituitária.
Determinações séricas tem sido muito
úteis no diagnostico e tratamento da
infertilidade da mulher. Um aumento no
meio do ciclo no nível de LH é um bom
indicador que a ovulação ira ocorrer em
aproximadamente 24 horas a posterior.
Casais subferteis e também mulheres
iniciando tratamento com gonadotrofinas
para infertilidade podem ser informadas
se a ovulação esta preste a ocorrer.
A fase reprodutiva nas mulheres é
terminada pela menopausa, quando a
função ovariana, com a sua secreção de
Estradiol, decresce e eventualmente
cessa. Devido aos baixos níveis
circulantes de Estradiol e Progesterona,
há uma perda na retroalimentação
negativa ao hipotalamo, assim como
resultado, os níveis circulantes de LH são
grandemente aumentados. Similarmente,
os níveis de LH são mais altos nas
mulheres jovens em idade de pré
menopausa as quais sofrem de falência
ovariana ou naquelas em que o ovário
falha o seu desenvolvimento durante a
puberdade. É importante notar que o pico
de meio de ciclo esta completamente
obliterado em mulheres saudáveis que
usam contraceptivos orais, reaparecendo
no primeiro ciclo completo após a
medicação ter sido descontinuada.
Não foi observado efeitos nos níveis de
LH seguindo-se a jejum, alimentação,
stress físico e exercício, hipoglicemia por
insulina ou por infusão de
monohidrocloridato de arginina (usados
em estudos do hormónio de crescimento)
a Testosterona e administração de
estrógenos deprimem os níveis de LH a
uma situação de pós menopausa.
Princípio do Procedimento
LH IRMA Coat-A-Count é um ensaio
imunoradiométrico fase sólida baseado
nos anticorpos monoclonal e policlonal
anti-LH: anticorpo policlonal anti-LH
125
marcado com I em fase líquida, e
anticorpo monoclonal anti-LH imobilizado
na parede do tubo de poliestireno.
No Procedimento:
O LH é capturado entre o anticorpo
monoclonal anti-LH imobilizado no interior
da superfície do tubo de poliestireno e o
anticorpo policlonal anti-LH radiomarcado.
125
Os anticorpos anti-LH marcados com I
não ligados, são removidos por
decantação da mistura de reacção e pela
lavagem do tubo; isto reduz a ligação não
específica a um nível muito baixo, e
assegura uma excelente precisão na
parte baixa da curva.
A concentração de LH é directamente
proporcional a radioactividade presente
no tubo após o item de lavagem. A
radioactividade é medida usando-se um
contador gamma, após a qual a
concentração de LH na amostra do
paciente é obtida pela comparação das
contagens por minuto do paciente com as
obtidas do conjunto de calibradores
fornecidos.
Reagentes para Pipetar: 1
Tempo de Incubação: 1 hora (no
agitador de estante)
Contagens Totais na Marcação com o
Iodo: aproximadamente 300 000 cpm
Precauções
Para uso de diagnóstico in vitro.
Reagentes: Conservar a 2–8°C num
frigorífico destinado para materiais
radioactivos. Eliminar de acordo com as
leis aplicáveis.
43
Não utilize reagentes com prazo de
validade expirado.
Alguns componentes fornecidos com este
dispositivo podem conter matéria de
origem humana e/ou outros ingredientes
potencialmente perigosos que necessitem
de algumas precauções.
Manipule com as devidas precauções
todos os materiais capazes de transmitir
doenças infecciosas. As matérias primas,
obtidas de soro humano, foram testadas,
revelando resultados negativos para a
sífilis, para os anticorpos do vírus da
imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2;
para o antígeno de superfície da hepatite
B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus
da hepatite C.
Azida de sódio foi adicionada como
conservante; para evitar acumulações de
azidas metálicas explosivas em
canalizações de cobre e alumínio, os
reagentes devem ser rejeitados no esgoto
apenas se estiverem diluídos e forem
lavados com grandes volumes de água.
Água: Utilize água destilada ou
deionizada.
Radioactividade
Uma cópia da licença de uso de produtos
radioactivos (especifico ou geral) enviada
pelo cliente, deve estar em poder da
Siemens Healthcare Diagnostics antes do
envio dos kits ou componentes contendo
material radioactivo. Estes materiais
radioactivos podem ser adquiridos por
qualquer cliente que possua a necessária
licença especifica. Com uma licença
generalista estes produtos radioactivos só
podem ser adquiridos por médicos,
veterinários na prática de medicina
veterinária, laboratórios clínicos e
hospitais. E somente para uso clinico in
vitro ou testes laboratoriais não
envolvendo administração externa ou
interna do material radioactivo ou da sua
radiação para o ser humano ou outros
animais. A sua aquisição, receita,
armazenamento uso, transporte e
eliminação estão sujeitas aos
regulamentos e à licenciada Comissão de
Regulação Nuclear ou do Estado
respectivo de acordo com a lei em vigor.
Tratar os materiais radioactivos de acordo
com a regulamentação da sua licença,
específica ou generalista. De modo a
minimizar a exposição à radiação deve o
44
utilizador seguir as instruções da
publicação do Departamento Nacional de
Padrões (Utilização segura de materiais
radioactivos-Livro No. 92, publicado em
Março de 1964) e publicações seguintes
do Estado e Autoridades Federais.
Limpar os derrames prontamente e
descontamine as superfícies afectadas.
Evitar os aerossóis. Elimine os lixos
radioactivos de acordo com a
regulamentação da licença. As licenças
generalistas (portadores da licença NRC
483) podem eliminar os lixos sólidos
radioactivos como lixo não radioactivo
depois de remover os rótulos. Licenças
Especificas (Licença NRC 313) devem ter
em conta o Capitulo 10 do artigo 20, do
Código de Regulamentações Federais.
Cada Estado deve referir a legislação em
vigor aprovada para o seu território. As
licenças generalistas podem eliminar os
lixos radioactivos líquidos do tipo deste
produto para um esgoto de laboratório. Os
licenciados devem remover os rótulos dos
frascos vazios de materiais radioactivos
antes de os colocar no esgoto sólido. As
licenças especificas podem eliminar
pequenas quantidades de lixo radioactivo
deste tipo de produto para o esgoto
normal do laboratório. Ter em atenção as
regulamentações em vigor para o seu
laboratório.
Materiais fornecidos:
Preparação inicial
Tubos revestidos com LH Ab (ILH1)
Tubos de poliestireno revestidos com
anticorpos monoclonal murino à LH em
pacotes com fecho de segurança.
Conservar refrigerado e protegido da
humidade, selar os sacos
cuidadosamente após cada abertura.
Estável a 2–8°C até à data de validade
inscrita na embalagem.
IKLH1: 100 tubos.
125
LH Ab I (ILH2)
Anticorpos policlonais de cabra anti-LH
iodado. O reagente é fornecido na forma
líquida, pronto para uso. Cada frasco
contêm 5,5 ml. Estável de 2–8°C por 30
dias após aberto, ou até a data de
expiração marcada no rótulo.
IKLH1: 2 frascos.
Calibradores de LH (LHI3–9,X)
Oito frascos, rotulados de A a H, de
calibradores de LH liofilizados em soro
humano/matriz tamponada, com
conservante. Pelo menos 30 minutos
antes do uso, reconstitua o calibrador zero
A com 6 mL de água destilada ou
deionizada, e os calibradores
remanescentes de B a H com 3 mL cada.
Estável de 2–8°C por 30 dias após
reconstituição, ou (aliquotado) a –20°C
por 2 meses.
IKLH1: 1 conjunto.
Cilindro graduado — para dispensação de
400 mL
Os calibradores reconstituídos contêm
respectivamente 0, 1,5, 7,5, 15, 30, 75,
150 e 300 mili-Unidade Internacional de
LH por mililitro (mIU/mL) nos termos da
Primeira Referência Internacional de
Preparação de LH por imunoensaio da
Organização Mundial de Saúde, número
68/40 (1st IRP 68/40), e Secundo Padrão
Internacional de LH por imunoensaio da
Organização Mundial da Saúde, número
80/552 (2nd IS 80/552). Pontos de
calibração intermediários podem ser
obtidos por mistura dos calibradores em
proporção adequada.
Estante de Espuma para decantação —
disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: FDR).
Note que os calibradores de LH IRMA
Coat-A-Count são não intercambiáveis
com os fornecidos no kit de LH Duplo
Anticorpo disponível.
Solução de Lavagem Concentrada
Tamponada (1TSBW)
Solução salina concentrada tamponada,
com surfactantes, e com azida sódica
como conservante. Use um container de
transferência, dilua o conteúdo de cada
frasco com 400 mL de água destilada,
para um volume total de 440 mL. Estável
de 2–8°C por 6 meses após preparação.
IKLH1: 1 frasco × 40 mL.
Materiais necessários mas não
fornecidos
Contador Gamma — compatíveis com
tubos 12x75 mm
Agitador de Estante — com
aproximadamente 200 agitações por
minuto
Preparação dos Reagentes
Água destilada ou deionizada
Pipeta volumétrica: 3,0 mL
Container plástico com tampa para
armazenagem – para preparação e
armazenagem da solução de lavagem
tamponada
Imunoensaio
Micropipetas: 100 µL e 200 µL
Dispensador — para dispensação de
2,0 mL de Solução de Lavagem
Tamponada
Papel gráfico log-log com três ciclos
Um controle de imunoensaios baseado
em soro humano com três níveis,
contendo LH como um dos 25
constituintes ensaiados esta disponível na
Siemens Healthcare Diagnostics (número
de catálogo CON6).
Colheita
O paciente não necessita dieta. Não são
necessárias preparações especiais.
14
Colectar o sangue por punção venosa,
em tubos comum heparinizados ou com
EDTA, tome muito cuidado para evitar a
hemólise e separe o soro ou plasma das
células. (Consulte secção de Tipo de
amostra alternativa). Considerando que o
LH exibe um pequeno ritmo cicardiano, a
hora da colheita deve ser anotada.
Recomenda-se o uso de uma ultra
centrífuga para clarear amostras
lipémicas.
Amostras hemolisadas podem indicar
tratamento incorrecto de uma amostra
antes do envio para o laboratório; portanto
os resultados devem ser interpretados
com cuidado.
Os tubos para colheita sanguínea de
diferentes fabricantes, podem originar
diferentes valores, dependendo dos
materiais e aditivos, incluíndo gel ou
barreiras fisicas, activadores do coágulo
e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count
IRMA LH não foram ainda testados com
todas as possiveis variações originadas
pelos tipos de tubos. Consultar a secção
Tipos de Amostras Alternativas para obter
detalhes sobre os tubos que foram
testados.
45
Volume de Amostra: 200 µL de soro ou
plasma por tubo.
Pipetar directamente para a base
dos tubos. Amostras de pacientes
nas quais se esperam conterem
concentrações de LH superiores ao
calibrador mais alto (300 mIU/mL)
devem ser diluídas com o calibrador
zero antes do ensaio. Recomenda-se
usar uma micropipeta com ponteira
descartável, evitando-se o arraste
entre as amostras. Pipetas com
desplaçamento positivo e diluidores
pipetadores automático somente
podem ser usados se a possibilidade
de arraste tiver sido avaliada e for
encontrada como sendo insignificante.
15
Estável: 2–8°C por 2 semanas, ou
então a –20°C por até 2 meses.
Antes do ensaio, mantenha as amostras
em temperatura ambiente (15–28°C) e
misture gentilmente por inversão ou
movimentos lentos. Aliquotar se
necessário para evitar repetidos
congelamentos/descongelamentos. Não
descongelar as amostras por aquecimento
em banho-maria.
Amostras das quais se esperam exceder
a concentração do calibrador mais alto
(300 mIU/mL) devem ser diluídas com o
calibrador zero antes do ensaio.
3
Todos os componentes devem estar à
temperatura ambiente (15–28°C) antes de
usar.
Rotular 16 tubos recobertos de LH Ab
em tubos A (contagem não
específica), e de B à H (ligação
máxima) em duplicata. Rotular tubos
adicionais recobertos de LH Ab,
também em duplicata, para controles
e amostras de pacientes.
Calibradores
T*
—
A (NSB)
0
B
1,5
C
7,5
D
15
E
30
F
75
G
150
H ("MB")
300
* Opcional
2
46
Pipetar 200 µL de cada calibrador,
controle e amostra de paciente nos
tubos preparados.
I a todos
4
Agite por 1 hora na estante de
agitação.
5
Decantar e drenar adequadamente.
Depois, adicione 2,0 mL de Solução
de Lavagem Tamponada a cada tubo.
Espere de 1 a 2 minutos. Decantar
vigorosamente. Novamente adicione
2,0 mL de Solução de Lavagem
Tamponada, espere de 1 a 2 minutos,
e decantar vigorosamente.
Opcionalmente, rotular dois tubos
comuns (não recobertos) 12 x 75 mm
de poliestireno como T (contagem
total) em duplicata.
WHO 1st IRP 68/40
WHO 2nd IS 80/552
mIU/mL
125
Pipetar directamente no fundo, e ter
certeza que a amostra e o traçador
estão bem misturados. Um
dispensador repetitivo é
recomendado. Deixar os tubos T para
as contagens (nº 6); não necessitam
mais processamento.
Procedimento Imunométrico de
doseamento
1
Adicione 100 µL de LH Ab
os tubos.
Removendo todo o líquido
remanescente melhora-se bastante a
precisão. Depois da segunda
lavagem, decante o conteúdo de
todos os tubos (excepto os tubos T)
usando-se uma estante de espuma
para decantação, e deixe escorrer por
2 ou 3 minutos. Eliminar todas as
gotas residuais com papel
absorvente.
6
Contar 1 minuto em contador gama.
Em contadores gamma multicanal, os
tubos de contagem total (opcional)
devem ser separados dos demais
tubos do ensaio por pelo menos um
espaço, para minimizar a
possibilidade de espraiamento.
Cálculos e Controlo de
Qualidade
Para calcular os resultados (em termos de
unidades de concentração) para uma
representação com papel logo-logo da
curva de calibração, inicialmente corrija as
contagens por minuto (CPM) de cada par
de tubos subtraindo a CPM média dos
tubos de ligação não específica
(calibrador A):
Contagens reais = Média CPM minutos Média
NSB CPM
Determine a porcentagem de ligação
(relativas a aquelas do calibrador mais
alto) — aqui chamados de "%B/MB" — de
cada par de tubos como uma
porcentagem de "ligação máxima" com os
tubos NSB corrigindo as contagens do
calibrador mais alto considerando-o como
100%:
Porcentagem de Ligação = (Contagens reais /
Contagens MB reais) × 100
Usando um papel gráfico tipo logo-logo
com 3 ciclos, represente a porcentagem
de ligação contra a concentração de cada
calibrador não zero, e trace uma curva
aproximando os cursos destes pontos.
(Conecte o ponto de calibração com arcos
ou segmentos de linha rectilíneos. Não
tente passar uma única linha para todos
os pontos. Concentrações para controles
e desconhecidos dentro da faixa dos
calibradores não zero podem ser
estimadas para curva de calibração por
interpolação. Em adicional a
representação porcentagem de ligação
versos a concentração para os três
calibradores baixos em papel gráfico
linear-linear podem ser usados para
interpolação próximos da dose zero.
Comentários: Apesar de outras
aproximações serem aceitáveis, o calculo
dos resultados pelo método acima
descrito possui certas vantagens do ponto
de vista do controle de qualidade. Em
particular, o mesmo gera uma curva de
calibração que é relativamente linear em
ambas representações logo-logo e linearlinear, e é relativamente estável de ensaio
a ensaio. Também gera parâmetros de
QC disponíveis, os valores de
porcentagem de ligação (porcentagem
B/MB) para os calibradores não zero. Um
informativo gráfico adicional, adequado
para reprodutibilidade dentro do ensaio
como uma função da concentração, pode
ser obtido pela plotagem dos valores da
porcentagem de ligação directamente dos
tubos de calibrador individual, e é sem as
replicatas médias da CPM inicial.
Alternativas: Apesar da capacidade de
ligação poder ser calculada directamente
da média de CPM, a correcção para a
ligação não específica normalmente
produz uma curva de calibração que é
mais aproximadamente linear dentro da
sua faixa. Uma curva de calibração
também pode ser construída pela
plotagem da CPM ou CPM média
directamente contra a concentração em
ambos papeis gráficos logo-logo ou linearlinear (o papel gráfico semi logo não deve
ser usado) esta aproximação tem a
virtude de simplificar, mas isto é o menos
desejável do ponto de vista do controle de
qualidade.
Cálculos Computadorizados: Métodos
"ponto a ponto", incluindo "spline fits"
lineares ou cúbicos, são adequados;
porém, como auxiliam pouco na
monitoração da integridade do ensaio, é
importante preparar a plotação log-log
recomendada da curva de calibração,
quer manualmente ou por computador.
Técnicas de cálculos de resultados
baseadas no modelo logístico também
podem ser aplicadas. Dentro desta
família, rotinas de adequação de curvas
baseadas no parâmetro logístico 4 ou 5
são as candidatas mais adequadas.
Entretanto, alguns algoritmos actualmente
em uso podem não convergir com
sucesso, mesmo quando o modelo
logístico é verdadeiro para os dados. Se
um método logístico for adoptado, é
essencial verificar sua adequação para
ensaios rotineiros, monitorando o retrocálculo dos calibradores e outros
parâmetros. Além disso, uma plotagem da
curva do calibrador numa representação
log-log é altamente recomendada, já que
é mais informativa que a plotação semilog convencional.
Manuseio da Amostra: As intrusões de
uso e dados de amostras de paciente e
componentes devem ser observados com
cuidado. Dilua as amostras de pacientes
esperando-se conterem concentrações de
LH superiores ao calibrador mais alto
(300 mIU/mL) com o calibrador zero antes
do ensaio. Todas as amostras, incluindo
os calibradores e controles, devem ser
47
ensaiados em duplicata. É importante o
uso de um dispensador tipo micropipeta
com ponteira descartável, trocando-a
entre as amostras para evitar uma
contaminação por arraste. Pipetas com
desplaçamento positivo e pipetadores
diluidores automáticos somente podem
ser usados se a possibilidade de arraste
tiver sido avaliada e encontrada como
insignificante. Pares de tubos controles
podem ser espaçados ao longo do ensaio
para ajudar na verificação da ausência de
uma queda insignificante. Inspeccione os
resultados para concordância com os
pares de tubos.
Contador Gamma: Para minimizar a
possibilidade de expraiamento dos
contadores gama de multi-canal, os tubos
de contagem opcional (T) devem ser
separados por um ou mais espaços dos
demais tubos do ensaio. Alternativamente,
adicionar apenas 25 µL do traçador em
cada um dos tubos T no item 3,
multiplicando as contagens observadas
por minuto nesses tubos por 4.
Controles: Controles ou pools de soro
com até dois níveis de concentração de
LH (baixo e alto) devem ser
rotineiramente ensaiados como
desconhecidos, e os resultados
registrados dia-a-dia como descrito em
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981; 27:493501. Repetir as amostras é uma
ferramenta valiosa para o monitoramento
da precisão interensaio.
Parâmetros de QC: Nós recomendamos
a manutenção dos registros da
mensuração desta performance:
T = Contagens totais (contagens por minuto)
%NSB = 100 × (Média Contagens NSB /
Contagens Totais)
%MB = 100 × (Contagens líquida MB /
Contagens Totais)
E os valores da Porcentagem de Ligação
("%B/MB") de todos os calibradores não
zero, por exemplo:
%C/MB = 100 × (Contagens Reais do calibrador
"C" / Contagem Real MB)
Manutenção dos Registros: È boa
prática laboratorial registar para cada
ensaio o número do lote dos
componentes usados, bem como as datas
de quando foram primeiro reconstituídas
ou abertas.
48
Leituras a posterior: Ver Dudley RA, et
al. Guidelines for immunoassay data
Exemplo de Ensaio: Apenas para
ilustração, não para calcular resultados de
outro ensaio. (Ver tabela "Exemplo de
Ensaio".)
Valores de Referência
Para uma mulher em idade fértil não
usando contraceptivos orais, a faixa de
referência do LH é uma função da sua
posição no ciclo menstrual. Desta
maneira, mulheres normalmente
ovulantes foram monitoradas ao longo de
um ciclo usando-se o kit LH IRMA Coat-ACount. As amostras de soro foram
colectadas à intervalos de 28 dias,
iniciado-se com o último período
menstraul. A normalização para o pico de
meio de ciclo foi realizada pela
designação de cada indivíduo pela
ocasião do seu pico de Hl como sendo o
dia zero. O acompanhamento das
amostras nas fases luta e folicular foram
realizadas trabalhando-se após a fase
folicular e anterior a fase lutea.
Adicionalmente, amostras de 74 homens
adultos, também foram ensaiadas pelo
procedimento LH IRMA Coat-A-Count. Os
resultados estão tabulados abaixo em
mIU/mL (WHO 1st IRP 68/40 e WHO 2nd
IRP 80/552).
Grupo
n
Homens adultos
74
Faixa de
95%
Mediana (mIU/mL)
2,0
0,4 – 5,7
0,6 – 6,2
Faixa
Absoluta
(mIU/mL)
Mulheres
Folicular
58
2,1
Meio do ciclo
10
29,5
Lutea
78
1,6
Pós menopausa
18
19,3
Contraceptivos
orais
104
1,8
12 – 51
ND – 6,0
11 – 50
ND – 5,9
Laboratórios devem considerar estes
resultados como directrizes apenas. Cada
laboratório deve estabelecer os seus
próprios valores de referência.
Nove mulheres normalmente ovulantes
foram acompanhadas ao longo de um
ciclo usando-se o procedimento LH IRMA
Coat-A-Count. A colecta do soro, assim
como a normalização dos valores de LH
relativos ao pico do meio do ciclo, foram
realizados como descrito acima. O gráfico
abaixo representa os valores máximo,
médio e mínimo de LH em mIU/mL (WHO
1st IRP 68/40 e WHO 2nd IS 80/552) para
estas amostras em cada dia do ciclo. (A
concentração de LH está indicada no eixo
y – e o dia normalizado do ciclo no eixo x.)
de tubos em um único ensaio. Os
resultados são apresentados em mIU/mL.
(Consulte a tabela “Precisão Intraensaio".)
Precisão Inter-ensaio (Ensaio a
ensaio): Estatísticas foram calculadas
para cada seis amostras dos resultados
de pares de tubos em 20 ensaios
diferentes. (Consulte a tabela “Precisão
Inter-ensaio".)
Especificidade: Os anticorpos de LH
IRMA Coat-A-Count são altamente
específicos para LH, com uma baixa
reacção cruzada a outros hormónios
glicoproteicos estruturalmente
relacionados, tais como FSH, HCG e
TSH. (Ver tabela "Especificidade" para
dados representativos.)
Efeito fim-de-série: Nenhum até
aproximadamente 200 tubos. (Ver tabela
"Efeito fim-de-série".)
Limitação
Em razão da secreção pulsátil, amostras
obtidas dentro do mesmo dia para um
mesmo paciente podem amplamente
flutuar dentro da faixa de referência,
reflectindo uma variação fisiológica, ao
invés de erros na técnica ou metodologia.
Características do Ensaio
Os resultados de LH nas secções abaixo
estão expressos em milli-Unidades
Internacional de LH por mililitro (mIU/mL)
nos termos da Primeira Referência
Internacional de Preparação de LH para
imunoensaio da Organização Mundial de
Saúde, número 68/40 (1st IRP 68/40), e
Segundo Padrão Internacional de LH para
imunoensaio da Organização Mundial de
Saúde, número 80/552 (2nd IS 80/552).
A não ser de outra maneira especificada,
os resultados foram baseados nas
análises de amostras de soros.
Calibração: Até 300 mIU/mL
(WHO 1st IRP 68/40 e 2nd IS 80/552)
Sensibilidade Analítica: 0,15 mIU/mL,
Efeito Hook de Alta Dose: Acima de
20 000 mIU/mL.
Precisão Intra-ensaio (Entre ensaios):
Estatísticas foram calculadas para cada
três amostras dos resultados de 20 pares
Linearidade: As amostras foram
doseadas sob várias diluições. (Consulte
a tabela "Linearidade" para dados
representativos.)
Recuperação: Amostras foram
misturadas em 1 para 19 com duas
soluções LH (475 e 1 025 mIU/mL) e
foram ensaiadas. (Ver tabela de
"Recovery" para dados representativos.)
Bilirrubina: A presença de bilirrubina em
concentrações até 200 mg/L não tem
efeito em resultados, dentro da precisão
do ensaio.
Hemólise: A Presença de eritrocitos em
concentrações até 30 µL/mL não tem
efeito no resultado, dentro da precisão do
ensaio.
Tipo de amostra alternativa: Para
determinar o efeito de amostras
alternatives, foi colhido sangue de 10
voluntários em tubos secos, com EDTA,
®
heparinizados e tubos de vacum SST da
Becton Dickinson. Todas as amostras
foram ensaiadas pelo procedimento LH
IRMA Coat-A-Count, gerando os
seguintes resultados.
(Heparina) = 1,03 (Soro) – 0,3 mIU/mL
r = 0,999
(EDTA) = 0,95 (Soro) + 0,6 mIU/mL
r = 0,993
(SST) = 1,02 (tubos simples) – 0,19 mIU/ml
r = 0,999
49
Médias:
10,4 mIU/mL (Soro)
10,4 mIU/mL (Heparina)
10,5 mIU/mL (EDTA)
10,4 mIU/mL (SST)
Comparação de Métodos: O
procedimento LH IRMA Coat-A-Count foi
comparado ao LH IMMULITE em
amostras de 46 pacientes com faixas de
concentração de LH de aproximadamente
0,5 à acima de 50 mIU/mL. (Ver gráfico)
Regressão linear:
r = 0,972
Médias:
Assistência Técnica
Por favor contacte o seu Distribuidor
Nacional.
O Sistema da Qualidade da Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está registado sob a norma ISO
13485:2003.
IMMULITE® and Coat-A-Count® are trademarks
of Siemens Healthcare Diagnostics.
©2010 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. All
rights reserved.
Origin: US
Siemens Healthcare Diagnostics Inc.
Los Angeles, CA 90045 USA
Siemens Healthcare Diagnostics Ltd.
Sir William Siemens Sq.
Frimley, Camberley, UK GU16 8QD
2010-11-02
PIIKLH – 9
Changes in this Edition:
cc#19759: Removed IKLH2 and IKLH5 kit sizes
and all associated component sizes and
radioactivity information. In Materials Required
But Not Provided section, added FDR catalog
number for foam decanting rack; removed
“available from Siemens” claim for graph paper
ZPIRM, rack shaker DPSR1/DPSR2 and 2 mL
dispenser DB2ML. Removed Technical Bulletin
ZJ019 from Further Reading section.
50
Understanding the Symbols
Understanding the Symbols
En English
Erklärung der Symbole
De Deutsch
Descripción de los símbolos
Es Español
Explication des symboles
Fr Français
Comprensione dei simboli
It
Descrição dos símbolos
Pt Português
Italiano
The following symbols may appear on the
product labeling: / Die folgenden Symbole
können auf dem Produktetikett verwendet
werden: / Los siguientes símbolos pueden
aparecer en la etiqueta del producto: / Les
symboles suivants peuvent apparaître sur les
étiquettes des produits : / Sull'etichetta del
prodotto possono essere presenti i seguenti
simboli: / Os seguintes símbolos podem
aparecer no rótulo dos produtos:
Symbol Definition
En: In vitro diagnostic medical
device
De: Medizinisches Gerät zur
In-vitro Diagnose
Es: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Fr: Dispositif médical de
diagnostic in vitro
It: Dispositivo medico per
diagnostica in vitro
Pt: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
En: Catalog Number
De: Katalog-Nummer
Es: Número de referencia
Fr: Numéro de référence
catalogue
It: Numero catalogo
Pt: Número de catálogo
En: Manufacturer
De: Hersteller
Es: Fabricante
Fr: Fabricant
It: Produttore
Pt: Fabricante
En: Authorized Representative in
the European Community
De: Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Union
Es: Representante autorizado en
la Unión Europea
Fr: Représentant agréé pour
l’Union européenne
It: Rappresentante autorizzato
nella Comunità europea
Pt: Representante Autorizado na
Comunidade Europeia
Symbol Definition
En: CE Mark
De: CE-Kennzeichen
Es: Símbolo de la CE
Fr: Marque CE
It: Marchio CE
Pt: Marca CE
Symbol Definition
En: Temperature limitation
(2–8°C)
De: Temperaturgrenze (2–8°C)
Es: Limitación de la temperatura
(2–8°C)
Fr: Limites de température
(2–8°C)
It: Limiti di temperatura (2–8°C)
Pt: Limites de temperatura
(2–8°C)
En: CE Mark with identification
number of notified body
De: CE-Kennzeichen
Identifikationsnummer der
benannten Stelle
Es: Marca de la CE con número
de identificación del organismo
notificado
Fr: Marque CE avec numéro
d’identification du corps notifié
It: Marchio CE con numero
identificativo dell'ente notificato
Pt: Marca CE, com número de
identificação do órgão notificado
En: Upper limit of temperature
(≤ -20°C)
De: Obere Temperaturgrenze
(≤ -20°C)
Es: Limitación superior de la
temperatura (≤ -20°C)
Fr: Limite supérieure de
température (≤ -20°C)
It: Limite superiore di temperatura
(≤ -20°C)
Pt: Limite máximo de temperatura
(≤ -20°C)
En: Consult instructions for use
De: Bedienungshinweise
beachten
Es: Consulte las instrucciones de
uso
Fr: Consulter le mode d’emploi
It: Consultare le istruzioni per
l'uso
Pt: Consulte as instruções de
utilização
En: Lower limit of temperature
(≥2°C)
De: Mindesttemperatur (≥2°C)
Es: Temperatura maxima (≥2°C)
Fr: Limite inférieure de
température (≥2°C)
It: Limite inferiore di temperature
(≥2°C)
Pt: Limite inferior de temperatura
(≥2°C)
En: Caution! Potential Biohazard
De: Vorsicht! Biologisches
Risikomaterial
Es: ¡Precaución! Peligro Biológico
Potencial
Fr: Avertissement ! Risque
biologique potentiel
It: Attenzione! Potenziale Pericolo
Biologico
Pt: Precaução! Potenciais Riscos
Biológicos
En: Do not freeze (> 0°C)
De: Nicht einfrieren (> 0°C)
Es: No congelar (> 0°C)
Fr: Ne pas congeler (> 0°C)
It: Non congelare (> 0°C)
Pt: Não congele (> 0°C)
En: Keep away from sunlight
De: Vor Sonneneinstrahlung
schützen
Es: Mantener protegido de la luz
solar
Fr: Maintenir hors de portée de la
lumière du soleil
It: Non esporre alla luce del sole
Pt: Manter protegido da luz solar
En: Radioactive Materials
De: Radioaktives Material
Es: Materiales radiactivos
Fr: Matériaux radioactifs
It: Materiali radioattivi
Pt: Materiais Radioactivos
En: Caution
De: Vorsicht
Es: Precaución
Fr: Avertissement
It: Attenzione
Pt: Precaução
LOT
En: Batch code
De: Chargenbezeichnung
Es: Código de lote
Fr: Numéro de code du lot
It: Codice lotto
Pt: Código de lote
51
Symbol Definition
En: Contains sufficient for (n)
tests
De: Es reicht für (n) tests
Es: Contiene material para (n)
pruebas
Fr: Suffisant pour (n) tests
It: Contiene materiale sufficiente
per (n) test
Pt: Contém o suficiente para (n)
testes
2008-01
En: Date format (year-month)
De: Datumsformat (Jahr-Monat)
Es: Formato de fecha (año-mes)
Fr: Format de la date
(année-mois)
It: Formato data (anno-mese)
Pt: Formato de data (ano-mês)
En: Use by
De: Verwendbar bis
Es: Fecha de caducidad
Fr: A utiliser avant
It: Usare entro
Pt: Use até
En: Harmful
De: Gesundheitsschädlich
Es: Nocivo
Fr: Nocif
It: Nocivo
Pt: Nocivo
En: Corrosive
De: Ätzend
Es: Corrosivo
Fr: Corrosif
It: Corrosivo
Pt: Corrosivo
En: Toxic
De: Giftig
Es: Tóxico
Fr: Toxique
It: Tossico
Pt: Tóxico
En: Dangerous for the
environment
De: Umweltgefährlich
Es: Peligroso para el medio
ambiente
Fr: Dangereux pour
l'environnement
It: Pericoloso per l'ambiente
Pt: Perigoso para o ambiente
52

LH IRMA - Meditecno

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