métodos em BioCel CCM 2015

Métodos e estudo em
biologia celular e tecidual
CCM – 23/04/2015
Nathalie Cella
PERGUNTAS
FERRAMENTAS
Perguntas de Biologia Celular
Qual é o aspecto de uma célula?
como as células proliferam?
como as células crescem?
como as células se diferenciam?
como as células se comunicam?
como as células formam um tecido?
como os tecidos formam órgãos?
como as célula respondem a agressões?
como as células se movimentam?
como as células interagem com o meio externo?
Do que a célula é composta?
Por que/Como as células “adoecem”?
como o ovo (zigoto) se torna um organismo multicelular?
Theodor Schwann
Matthias Schleiden
Rudolf Virchow
História da Teoria Celular
https://www.youtube.com/watch?v=4OpBylwH9DU
ferramentas
•
•
•
•
Imagem
bioquímica
Biologia molecular
computacional
Microscopia óptica
Bright filed
Differencial-interference-contrast
Phase contrast
Dark field
Processamento de imagem
deconvolução
e imagem
microscopia
óptica confocal
microscopia
óptica convencional
Divisão de uma célula animal
https://www.youtube.com/watch?v=DD3IQknCEdc
Microscopia eletrônica (ME)
de transmissão
e
de varredura
Microcscopia eletrônica
Estereocílios de uma célula
do ouvido interno de um sapo
Microscopia
óptica
ME
de
varredura
ME
de
transmissão
Alvéolo mamário
Flor de trigo
Célula de levedura
Imunogold
Como detectar diferentes
proteínas e mRNAs na célula?
Imunização de animais
ANTICORPOS
imunocitoquímica/imunohistoquímica
detecção de moléculas in situ
Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
diferentes marcadores
DAB
fluoresceína
detecção de moléculas
na célula
Vermelho – células proliferando
Verde – proteína“V”
https://www.youtube.com/watch?v=-k2xmEUSKYk
Detecção de mRNA
localização da expressão
de genes diferentes
Dinâmica de proteínas por
microscopia óptica
https://www.youtube.com/watch?v=w0-7c8Ui84U
FRAP
fluorescence recovery after photobleaching
https://www.youtube.com/watch?v=FbCHqk37yQ4
Estudo da estrutura e função da
proteína SHAKIRA
Como estudar esta proteína?
“evidência correlativa”
Shakira
Schlafen
“Perda de função”
supressão da
expressão de
Shakira
(exemplo)
aumento da migração
aumento da proliferação
“ganho de função”
Super-expressão
de Shakira
aumento da adesão
diminuição da proliferação
Expressão de Shakira
Pele
cérebro
Intestino
Pâncreas
glândula mamária
glândulas salivares
Reduzir para entender..
Cultura celular (in vitro)
Cultura celular in vitro
S
um determinado tecido
tem vários tipos celulares
Isolamento das células que
expressam Shakira
S
S
S
S
Anti-shakira
fluoróforo
células que expressão
Shakira isoladas
FACS
fluorescence activated cell sorter
Isolamento das células que expressam
Shakira
supressão da
expressão de
Shakira
Interferência de RNA (RNAi)
shakira
tubulina
Shakira tem alguma função na
proliferação celular?
Ensaio de incorporação de BrdU
Shakira tem alguma função na
proliferação celular?
Imunofluorescência
com anti-BrdU
Shakira tem alguma função na
migração celular?
https://www.youtube.com/watch?v=iFOus8ehxUc
time-lapse video-microscopy
Shakira tem alguma função na
migração celular?
Ensaio de “fechamento de ferida”
controle
Shakira -
não é importante
na migração
controle
Shakira -
é importante
na migração
controle
Shakira -
células sem Shakira
“morrem”
E se as células isoladas não
expressarem Shakira?
Super-expressão
do gene que
codifica
Shakira
COMO ?
Clonagem de fragmentos de DNA
Propagação dos plasmídeos
Introdução de DNA em uma célula
Outras perguntas
• Há alteração da expressão gênica na
ausência de Shakira?
• Há alterações no ciclo celular?
• Há alterações na morfologia?
• Há alterações na função celular ?
• Como é animal sem Shakira (knockout)?
• Como é o animal com Shakira mutada?
• Que moléculas interagem com Shakira?
Gerando todo um organismo
geneticamente modificado (OGM)
Células-tronco embrionárias
DNA exógeno
células embrionárias com
uma cópia do DNA exógeno
injeção
das células
alteradas
Fêmea prenhe
embrião
embrião híbrido
transplante no útero
de fêmeas pseudo-prenhes
gene alterado nas gônadas
(ou seja, na linhagem germinativa)
X
F
M
X
AT
AA
animais transgênicas
com 1 cópia do gene alterado
AT
AT AT TT
animal homozigoto
para o gene alterado
Caracterização do fenótipo resultante da
alteração de determinado gene
E se a alteração resultar em letalidade?
Mutações e deleções “tecido-específicas”
Análise das células e tecidos por
microscopia
controle
knockout
normal (“selvagem”)
alterados (mutantes
ou knockouts)
Alteração/ausência
de Shakira
resulta em letalidade
na embriogênese
Que proteínas interagem com
Shakira?
PCR
polymerase chain reaction
Biblioteca de cDNA
mRNA
Transcrição reversa
separação das fitas e
adição do segundo primer
Clonagem de fragmentos de DNA
Sistema duplo-híbrido em levedura
shakira
proteína expressa
por um dos clones
“presa”
“isca”
genes recombinantes são
introduzidos em células de levedura
“isca”
“presa” capturada
sítio de ativação
de trasncrição
transcrição de
gene reporter
Estudo da estrutura e função da
proteína SHAKIRA
Shakira altera a expressão de
outros genes?
Shakira +
Shakira -
Microarrays de DNA
Genes sobre uma lâmina (DNA)
mRNA de células
Shakira +
mRNA de células
Shakira -
Análise dos genes alterados em
consequência da ausência de Shakira
ChIP - chromatin immunoprecipitation
Shakira atua diretamente na transcriçãod e genes?
Extração proteica
Fracionamento
celular
Figure 8-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
SDS-PAGE
SDS-polyacrylamide gel electrophresis
Detecção de proteínas no gel de
eletroforese
gel corado pelo
Coomassie blue
Western blot
Transferências das
proteínas do gel
para uma membrana
Imunodetecção (immunoblot)
shakira
2D-SDS-PAGE
2D-SDS-PAGE corado pelo Coommassie blue
Imunodetecção após 2D-SDS-PAGE
Há 4 tipos de Shakira!!!
Espectrometria de massa (MS)
• Ferramenta analítica para midir a massa de
uma molécula
• Determina a sequência de aminoácidos de
uma proteína
• Detecta alterações pós-traducionais
cristalografia de raio-X
determinação da estrutura tridimensional
Sequência de aa da Shakira
MDALQLANSAFAVDLFKQLCEKEPLGNVLFSPICLSTSLSLAQVGAKGDTANEI
GQVLHFENVKDIPFGFQTVTSDVNKLSSFYSLKLIKRLYVDKSLNLSTEFISST
KRPYAKELETVDFKDKLEETKGQINNSIKDLTDGHFENILADNSVNDQTKILVV
NAAYFVGKWMKKFPESETKECPFRLNKTDTKPVQMMNMEATFCMGNIDSINCKI
IELPFQNKHLSMFILLPKDVEDESTGLEKIEKQLNSESLSQWTNPSTMANAKVK
LSIPKFKVEKMIDPKACLENLGLKHIFSEDTSDFSGMSETKGVALSNVIHKVCL
EITEDGGDSIEVPGARILQHKDELNADHPFIYIIRHNKTRNIIFFGKFCSP
Três sítios de fosforilação em resíduos de tirosina (Y)
BLAST: Basic Local Alignment Search
NCBI - National Center for Biotechnology Information
Perguntas que o BLAST responde
• Que espécies de batérias têm uma proteína relacionada a uma certa
proteína cuja sequência de aminoácidos é conhecida?
• Que outros genes codificam proteínas com estrutura semelhante a uma
determinada estrutura de interesse?
• Que genes no homem se parecem com um determinado gene de
camundongo?
Blast quickstart
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1734/
Predição de sítios de fosforilação e
possíveis enzimas envolvidas
Predição de sinal de localização nuclear
Predição de outras alterações
pós-traducionais
MODELO de estudo
x
OBJETO de estudo
Modelos de estudo
vantagens e desvantagens
www.ibioseminars.org