noções de espectrometria de massa

The world leader in serving science
NOÇÕES DE
ESPECTROMETRIA DE
MASSA
José Felipe Lugão
[email protected]
Cromatografia Acoplada a Espectrometria de Massa
Responde às duas perguntas mais importantes da Química
Analítica:
• O que é ?
• Tempo de Retenção
• Peso molecular
• Estrutura molecular
Cromatograma
• Quanto tem ?
• Área cromatográfica
Espectro MS
Qual é o espectrômetro de massa ideal ?
?
Entrada
de
Amostras
Componentes do Espectrômetro de Massa
Atmosfera
Sistema de
Vácuo
Entrada da
Amostra
Ionização
Analizador
de Massas
Detector
Sistema
de
Dados
Espectro X Cromatograma
?
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?
TIC
100
Se ampliarmos
esta região do
cromatograma...
%
50
Time
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
3.00
3.25
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?
TIC
100
Veremos que nesta
escala o pico é
feito por pontos
discretos...
%
78
Time
2.12
2.14
2.16
2.18
2.20
2.22
2.24
2.26
2.28
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?
100
240
Cada ponto
representa uma
única varredura
(espectro) do
analisador de
massa...
%
241
0
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?
Cada ponto do
cromatograma
possui um
espectro único
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?
TIC - Cromatograma
produzido pela soma
do sinal de todas as
massas observadas
a cada varredura...
espectro
TIC x RIC (Cromatograma de Massa Reconstruído)
TIC
40
RT: 29,60
20
Relative Abundance
RT: 30,43
RT: 26,82
0
26
27
28
29
Time (min)
30
31
RIC 93
26,13
27,83
29,06
50
26,30
27,20
29,60
28,95
29,85
26,95
0
27
28
29
Time (min)
31,66
30,91
30,43
30
NL:
4,24E6
m/z=
93,11-94,11
MS PPB006
94,03
161,07
133,03
0
50
100
150
204,11
207,12 258,88 280,44
200
250
m/z
300
340,84 385,77 413,66 439,50
350
0
400
27
450
28
27,18
100
29
Time (min)
30
31
32
NL:
2,33E7
m/z=
159,55163,26 MS
PPB006
RT: 28,41
RIC 161
27,88
50
27,35
29,06
26,28 26,82
29,85
30,43
30,91
31,66
0
26
69,01
50
TIC MS ICIS
PPB006
RT: 30,93
RT: 30,43
RT: 26,82
32
93,01
100
RT: 29,60
20
RT: 31,66 1,68E8
TIC
40
26
31,10
31
RT: 26,13
60
32
RT: 28,35
100
26
Relative Abundance
TIC MS ICIS
PPB006
RT: 30,93
NL:
RT: 27,83
RT: 28,16
RT: 28,41
80
Relative Abundance
RT: 26,13
RT: 31,66 1,68E8
Relative Abundance
NL:
RT: 27,83
RT: 28,16
RT: 28,41
80
60
30/9/2008 08:02:25
Relative Abundance
Relative Abundance
C:\Documents and Settings\...\PPB006
27
28
29
Time (min)
30
31
32
161,07
100
105,01
50
81,01
133,04
0
50
100
150
204,11
189,08 207,13
200
281,12
250
m/z
300
327,36
385,52
350
400
440,36
450
Modos de Ionização
API
CI
EI
Ionização
Sem fragmentos
Com Fragmentos
Fontes de Íons
Filamento
GC/MS
•
EI
Ion Volume
Removível
• CI
e- e+-e+
+
LC/MS
• ESI
• APCI
Coluna
Lentes
Espectro EI
M + e- → M.+ + 2e- + fragmentos
Pico
Base
Ion
Molecular
Fonte de Íons
Molecular Weight
100,000
ESI
1000
EI/CI
Non-Polar
APCI
Polar
ESI
APCI
Analizadores de Massa
Quadrupolo
Triplo Quadrupolo
Ion Trap 3D
Ion Trap Linear
Ion Ciclotron
Time Of Flight
Setor Magnetico
Orbitrap
Híbridos
....
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GC/MS
QUADRUPOLO
Quadrupolo
+
+
Os íons são varridos pela variação das
voltagens DC/RF aplicadas às barras do
quadrupolo.
Quadrupolo
+
+
Os íons são varridos pela variação das
voltagens DC/RF aplicadas às barras do
quadrupolo.
Full Scan X SIM
Full Scan
SIM (173)
CHBr3
Full Scan + SIM na mesma corrida
SIM: Análise de traços de compostos alvos
Full Scan: Espectro de massa para identificação
de desconhecidos e confirmação dos alvos
encontrados
Exemplo:
• 14 Pesticidas
• EI, Full Scan + SIM
• Matriz: Morango/Espinafre/Pera
Método Full Scan + SIM
Método Full Scan + SIM
GCMS Quadrupolo– EI Full Scan + SIM
RT: 4.97 - 33.08
NL: 3.96E7
TIC MS data08
8.80
100
12.09 12.39
5.18
21.24
50
Raw
0
NL: 3.96E7
8.80
100
12.09 12.39
5.18
Full Scan
TIC F: + c Full ms
[ 50.00-500.00]
MS data08
21.24
50
Relative Abundance
0
3 dos 14
segmentos
SIM
NL: 7.57E4
21.82
100
TIC F: + c SIM ms
[ 131.50-132.50]
MS data08
21.24
50
0
NL: 2.06E3
TIC F: + c SIM ms
[ 224.50-225.50]
MS data08
14.61
100
Methiocarb
50
0
NL: 7.43E3
11.06
100
TIC F: + c SIM ms
[ 178.50-179.50,
263.50-264.50]
MS data08
11.35
50
0
6
8
10
12
Pesticides analysed in strawberry/spinach/pea
extract at 5 pg/µl, 2ul injection
14
16
18
20
Time (min)
22
24
26
28
30
32
GC/MS Quadrupolo (ISQ) – Sensibilidade
Turbo 70L/s, EI Full Scan
1pg OFN
RT: 3.50 - 4.50
100
RT: 3.92
AA: 321
AH: 406
m/z 272
S/N 27:1
NL:
1.28E3
TIC MS
ICIS
500_ag
95
90
85
80
75
70
65
m/z 272
S/N > 600:1
Relative Abundance
60
55
NCI, SIM
500 ag OFN (5 x 10E-16g)
ISQ – Aplicação: Poluentes Semivoláteis em Águas
120 Compostos
20 minutos
1uL, Split 1:20
Average IDL = 0,023 ng/uL (~20pg on column)
Working Range: 0.05 to 200 ng/uL
ISQ – Aplicação: Poluentes Voláteis em Águas
EPA 524.3
84 compostos
18 min
5 ml amostra
30:1 split
Average IDL = 0,035 ug/L (~5pg on column)
Working Range: 0.05 to 200 ng/uL
Cocaína em Urina
(3)
(4)
(1)
(2)
1
3
4
2
Aplicação ISQ Toxicologia
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MS/MS
ION TRAP E
TRIPLOQUADRUPOLO
Isolando a Matriz
?!
GC/MS – Organofosforado
MS/MS
GC/MS/MS Ion Trap – Organofosforado
251 > 169
MS/MS
Análise de composto-alvo
Coeluição de muitos picos
Matriz interferente
Confirmação
Caracterização Estrutural
MS/MSn continua
sendo necessário e
complementar à
informação de
massa exata
Esta informação coletivamente
define a estrutura da molécula
Fragmentação por LC/MS/MS
Cromatograma
[MH]+
ESI Full Scan MS
ESI Full Scan MS/MS
Ion Trap
Ion Trap Linear
Why Linear (2D) Ion Traps?
A technology evolution based on basic principles
3-Dimensional vs. 2-Dimensional
RF Quadrupole Ion Trap
Trapping Efficiency (Effect of RF Phase)
760 kHz
Successful Trapping of Injected Ions
~ 5%
~ 70%
1.2 MHz, 5kV
Ion Ejection – 2D vs 3D
Ion Transfer
Tube
Skimmer
Tube Lens
Radial Detection ~ High Sensitivity
Linear Ion Trap
~ 100% of ions trapped are
detected due to radial ejection
Skimmer
Axial ejection allows for hybridization
– without compromise (FT)!
Hybrid Quadrupole Trap
Majority of trapped ions
cannot be scanned out
~ 15% detected*
Axial ejection depends on fringe fields generated by grid –
this grid compromises triple quadrupole performance
*Hager, J., RCM., 2003, 17, 1389
Ion Trap Linear x 3D
LTQ
3D Traps
Increase
•Trapping efficiency
~ 55-70%
~5%
~ 11-14x
•Detection efficiency
~ 50-100%
~50%
~ 1-2x
•Trapping capacity
~ 20,000 ions
~500 ions
~ 40x
Exemplo MS/MSn Flavonóide
Exemplo MS/MSn Flavonóide
Rhoifolin
Ion Trap - Aplicações
Triploquadrupolo
Fragmentando moléculas de mesma massa
+
100
60
40
+
100
80
20
Triploquadrupolo TSQ GC/MS/MS & LC/MS/MS
NPAMOZ – LANAGRO
0,025 ppb
0,250 ppb
2,0 ppb
C:\Xcalibur\...\231106\NPF_36
23/11/2006 14:21:13
2.0ng/mL NPFs/NPAHD3.0ng/mL ACE 3 C18 50 X 2 Acetato NH40.5mM/MeOH(50;50) 200uL/min.
RT : 0,00 - 9,00 SM : 7G
RT : 1,99
SN: 128
8000
NL: 8,01E3
m /z= 290,50-291,50
F: + c sid=-10,00
SRM m s2
335,10@-12,00 [
262,00-291,00] M S
NPF_39
7500
7000
RT : 0,00 - 9,00 SM : 7G
RT: 1,99
SN: 1154
RT : 0,00 - 9,00
NL: 6,30E4
m /z= 290,50-291,50
F: + c si d=-10,00
SRM ms2
335,10@-12,00 [
262,00-291,00] M S
NPF_33
60000
55000
SM: 7G
RT: 1,96
SN: 8257
NL: 4,64E5
m/z= 290,50-291,50
F: + c sid=-10,00
SRM m s2
335,10@-12,00 [
262,00-291,00] MS
NPF_36
460000
440000
420000
400000
380000
6500
50000
360000
6000
340000
45000
320000
5500
5000
40000
4500
35000
300000
260000
Intensity
Intensity
Intensity
280000
4000
30000
3500
240000
220000
200000
25000
180000
3000
160000
20000
2500
140000
120000
2000
15000
100000
1500
80000
10000
60000
1000
40000
5000
500
20000
0
2
4
6
T ime (m in)
8
0
2
4
6
T im e (mi n)
8
0
2
4
6
T im e (m in)
8
330 pesticidas em alimentos
Aplicações Triploquadrupolo
Multiresíduo – 32 pesticidas, 10ng/mL – Spike em Água
Amostra Real – Extrato Vegetal
?
?
?
?
?
?
?
?
?
Bitertanol
Iprodione
?
Elemental composition
Calculations for : 250 amu
monoisotopic mass
C 12.0000 - 1 to 20
H 1.0078 - 0 to 60
N 14.0030 - 0 to 10
O 15.9949 - 0 to 10
S 31.9720 - 0 to 5
35000
Cl 34.9688 - 0 to 5
30000
Isolation Window
+-2 amu = 30.562
+-1 amu = 15.278
+-0.5 amu = 7.632
+-0.2 amu = 3.704
+-0.1 amu = 2.564
30562
25000
20000
15278
15000
10000
5000
7832
2564
3704
0,1
0,2
0
0,5
1
2
SRM with Unit Resolution
Q3
Q1
Q2
256.3
256.2
408.6
408.1
1 Da
1 Da
Improved Selectivity in H-SRM Mode
Q3
Q2
Q1
256.3
1 Da
408.6
408.1
0.2 Da
Iprodione
Bitertanol
MS/MS Triploquadrupolo – Análise de Composto Alvo
Benefícios e Limitações da Técnica SRM Triploquadrupolo
Benefícios:
Baixos limites de detecção são alcançados
Excelente quantificação
Robustez
Limitações:
Apenas compostos alvos podem ser analisados
Não permite novos resultados após a aquisição
Limitado número de compostos por corrida
Não é possível buscar compostos desconhecidos
Orbitrap: A new class of
Mass Spectrometer
The world leader in serving science
Resolução
Resolução
Exact Mass and Isobaric Compounds
Element
H
C
N
O
Exact Mass
1.007825
12.000000
14.003074
15.994915
100
100
0.1033 amu
Relative Abundance
90
90
289.1022
288.0441
70
70
288.0949
50
50
40
40
289.1424
289.1390
289.1314
289.1547
289.1329
289.0514
80
80
60
60
Is a simultaneous
measurement
possible?
C9H21O2P1S3
RR==100,000
10,000
20,000
Terbufos
289.1215
C13H21O3P1S1
289.1021
289.0514
288.1142
C15H17N4Cl1
289.1424
Iprobenfos
289.1329
Myclobutanil
289.1215
288.1256
C11H20N4O3S1
289.0513
289.1022
30
30
288.1351
C11H21N4O3P1
20
20
288.1474
C16H20N2O3
Epronaz
289.1329 289.1424
Pirimethaphos
289.1215
Imazamethabenz
10
10
00
289.00
289.00
289.05
289.05
289.10
289.10
m/z
m/z
Yes, at high resolution !
289.15
289.15
289.20
289.20
Resolução e Massa Exata
Exatidão de Massa (ppm) = 106 X (Mm – Mr) / Mr
1 ppm = 200.0000 +- 0,0002 m/z
100.000 FWHM @ 200 m/z =
0,002 m/z
Resolução = M / (M2 – M1)
250.000
199,99 m/z
250.005
200 m/z
Standard Pesticide Mixture in Horse Feed Matrix
Unusually high error of 6.5 ppm indicates the need for higher resolution
Reanalysis at 80,000 resolving power
239.15181
C 11 H 19 O 2 N 4
6.50 ppm
Relative Abundance
100
80
R = 15,000
Error = 6.50 ppm
60
40
20
0
239.00
239.05
239.10
239.20
239.15033
C 11 H 19 O 2 N 4
0.32 ppm
100
Relative Abundance
239.15
m/z
239.25
R = 80,000
Error = 0.32 ppm
80
60
40
20
0
239.00
239.05
239.10
239.15
m/z
239.20
239.25
Quadrupole Orbitrap (Qexactive)
140.000 FWHM
1 – 3 ppm
MS/MS
Lord of the ion rings: Retainment of the rings
ω=
Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier
k
m/ z
Lord of the ion rings: Retainment of the rings
ω=
Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier
k
m/ z
Aplicação Exactive
510 Pesticides Exactive
RIC (1 ppb)
Multiresíduos por LC-Full Scan MS – Targeted Screening
Análise Pós-Aquisição
• Busca por compostos-alvos – “Screening”
•
•
•
•
•
•
•
Pesticidas
Drogas Veterinárias
Hormônios
Toxinas
Poluentes Orgânicos Persistentes
PCBs
Etc,
• Confirmação
• Distribuição Isotópica
• Full Scan MS/MS
Sample(s)
Database(s)
Result(s)
Relative mass errors at different resolving power settings of 151
compounds at the 25 ppb level in horsefeed and honey matrix.
Conclusion
Minimum 70,000 resolution is required
Mass Accuracy Should Cross the Peak
(not by averaging)
Orbitrap – Análise Antidoping
QEXACTIVE - Quanfirmation Azoxystrobin 1.5ppb
Number of scans across a peak doing MS/MS
Quantitation
RT: 0.00 - 18.00
RT: 7.50 - 7.90
Relative Abundance
0
100
Diuron
7.68
Azoxystrobin
0
100
7.99
Boscalid
0
100
NL: 5.99E6
m/z= 163.0528-163.0544 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
Spinosad D
NL: 1.02E6
m/z= 746.4801-746.4875 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
Indoxacarb
NL: 5.03E6
m/z= 528.0754-528.0806 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
10.01
0
100
NL: 2.18E6
m/z= 343.0382-343.0416 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
9.70
NL: 3.88E6
TIC F: FTMS + p
ESI Full ms2
[email protected]
[50.00-430.00]
MS cal5_02
7.69
100
90
NL: 6.40E6
m/z= 404.1221-404.1261 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
Methomyl
2.64
0
100
NL: 2.39E7
m/z= 233.0231-233.0255 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
80
Relative Abundance
7.32
100
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0
5
10
Time (min)
15
7.55
cal5_02 #1739 RT: 7.69 AV: 1 NL: 7.33E5
F: FTMS + p ESI Full ms2 [email protected] [50.00-430.00]
7.60
7.65
Azoxystrobin
MH+ = 404.1242
100
90
7.70
Time (min)
7.75
7.80
7.85
7.90
329.0806
Confirmation
344.1041
Relative Abundance
80
70
60
372.0992
50
40
30
20
134.0606
10
0
71.2217 82.0298
60
80
172.0399
183.0560
187.0509
107.0499 129.0454
100
120
140
160
180
301.0852 316.1092
216.0665
200
226.8040 242.0326
220
240
m/z
273.0899 287.0824
260
280
386.1146 401.8168
300
320
340
360
380
400
420.7813
420
Q Exactive Full Scan Quan (Azoxystrobin at 1.5ppb)
Direct comparison
of neat vs matrix
Q Exactive Quantitation Full Scan Targeted DD MS/MS
(Azoxystrobin at 1.5ppb)
Direct comparison
of neat vs matrix
Melamine-Tainted Milk Scandal
SIEVE Workflow
Unalign vs Align
Unaligned
Aligned
Incurred Orange Sample - Navel
Incurred Orange Sample - Navel
Imaverol
Isotope Ratio – Actual vs. Simulation
Mass Accuracy 0.454 ppm
Imaverol
Actual
Simulation
Obrigado
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