Volume 5 Número 1 - abctp

Transcrição

ISSN 1808-9909
Volume 5, Número 1, 2009
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 5, n. 1, p. 1-70, 2009
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
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PERMUTA
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation deseja fazer permuta com revistas de áreas afins.
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Universidade Federal de Lavras Departamento de Biologia
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FICHA CATALOGRÁFICA
Diretoria
Presidente Renato Paiva UFLA
Secretário Moacir Pasqual UFLA
Secretário Adjunto Antônio Carlos Torres EMBRAPA Hortaliças
Tesoureiro Guilherme Augusto Canella Gomes Benger do Brasil
Comissão Editorial
Editor Chefe
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Conselho Editorial
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Renato Paiva UFLA
Secretaria
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Diogo Pedrosa Corrêa da Silva UFLA
Gabriela Ferreira Nogueira UFLA
Nomenclatura Científica
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Revisão de Português
Rose Mary Chalfoun Bertolucci
Revisão de Inglês
Renato Paiva UFLA
Revisão de Referências Bibliográficas
Márcio Barbosa de Assis
Editoração Eletrônica
Luciana Carvalho Costa Editora UFLA
Christyane Aparecida Caetano Editora UFLA
Isabel Cristina de Oliveira Editora UFLA
Consultoria Científica (v.5, n.1, 2009)
Adriana Madeira Santos Jesus EMBRAPA
Ana Cardoso Clemente Filha Ferreira de Paula UNIFENAS
Antonio Carlos Torres EMBRAPA
Átila Francisco Mogor UFPR
Carlos Vinício Vieira UFMT
Celso Luiz Salgueiro Lage UFRJ
Elisabeth Atalla Mansur de Oliveira UERJ
Eunice Oliveira Calvete UPF
Evaristo Mauro de Castro UFLA
Fabiano Guimarães da Silva CEFET-RV
José Raniere F. Santana UEFS
Lilia Gomes Willadino UFRPE
Luciana Lopes Fortes Ribas UFPR
Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa UFRN
Marcelo Murad Magalhães UFLA
Mauricio Reginaldo Alves dos Santos EMBRAPA
Osmar Alves Lameira EMBRAPA
Rodrigo Kelson Silva Rezende UFGD
Therezinha Rangel Câmara UFRPE
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
Sacarose e um aditivo orgânico complexo na micropropagação de amoreira-preta (Rubus sp.)
Sucrose and a complex organic addictive on micropropagation of Blackberry (Rubus sp.)
Fabíola Villa, Moacir Pasqual, Franscinely Aparecida Assis, Leila Aparecida Salles Pio
..
1
Estudo da anatomia de plântulas da espécie Malus domestica var. Golden delicious cultivada in vitro
Anatomical study of Malus domestica var. Golden delicious cultivated in vitro
Kelly Cristina de Macedo Bezerra, Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa, Juliana Espada Lichston ....................
9
Crescimento in vitro de pequizeiro (Caryocar brasiliense a. St.-hil.): influência da polaridade e
luminosidade
In vitro growth of Caryocar brasiliense a. St.-hil.: influence of polarity and light
Breno Régis dos Santos, Renato Paiva, Sandro Barbosa, Patrícia Duarte de Oliveira Paiva, Daiane
Peixoto Vargas, Cristiano Martinotto ...........................................................................................................
19
Factors affecting in vitro germination of passion fruit seeds
Fatores afetando a germinação in vitro de sementes de maracujazeiro
Rodrigo Sobreira Alexandre, Flávio Alencar D araújo Couto, José Maria Moreira Dias, Wagner Campos
Otoni, Paulo Roberto Cecon, Simone Bhering de Souza Gomes .................................................................
27
Assepsia de rizomas e ápices caulinares de Curcuma alismatifolia
Asepsis of Curcuma alismatifolia rhizomes and shoot tips
Tatiana Michlovská Rodrigues, José Magno Queiroz Luz, Leandro de Oliveira Lino, Carlos Ribeiro Rodrigues,
Geraldo Batista de Melo ..................................................................................................................................................................
36
Teor de flavonas e do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico em calos e em plantas in vitro e in vivo de
carqueja [Baccharis trimera (LESS) dc.]
Flavones and 3,5-O-dicaphenoilchinic acid contents on callus and on in vitro and in vivo Baccharis
trimera (LESS) dc. plants
Fabiano Guimarães Silva, Ana Helena Januário, José Eduardo Brasil P. Pinto, Vivian Elias Nascimento,
Wellington dos Santos Barizan, Suzelei de Castro França ...........................................................................
42
Comparison of two particle bombardment devices using histochemical and fluorimetric assays of
-glucuronidase in soybean embryogenic suspensions
Comparação de dois aparelhos de bombardeamento de partículas utilizando os ensaios histoquímicos e
fluorimétricos da -glucuronidase em suspensões embriogênicas de soja
Marcelo Murad Magalhaes, Pon Samuel Jayakumar, Hee Sook Song, Sonitichai Chanprame, Jack
Milton Widholm ............................................................................................................................................
50
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
Aclimatização do híbrido de orquídea em substratos a base de pó de bagaço de cana-de-açúcar
Acclimatization of orchid hybrid in sugar cane bagasse powder based substrates
Lilian Yukari Yamamoto, Vanessa Stegani, Ricardo Tadeu de Faria, Inês Cristina de Batista Fonseca,
Bruno Luiz Domingues de Angelis ...........................................................................................................
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.1, p. 1-70, 2009
60
Micropropagation of black pepper (Piper nigrum)
Micropropagação da pimenta-do-reino (Piper nigrum)
Elisa Ferreira Moura, Ilmarina Campos de Menezes, Oriel Filgueira de Lemos, Osmar Alves Lameira
Leila Márcia Souza do Amaral, Clarisse Beltrão Rosas Rocha ....................................................................
65
SACAROSE E UM
ADITIVO
Sacarose
e um aditivo ORGÂNICO
orgânico complexo... COMPLEXO NA
MICROPROPAGAÇÃO DE AMOREIRA-PRETA (Rubus sp.)
1
SUCROSE AND A COMPLEX ORGANIC ADDICTIVE ON MICROPROPAGATION
OF BLACKBERRY (Rubus sp.)
FABÍOLA VILLA1, MOACIR PASQUAL2, FRANSCINELY APARECIDAASSIS3, LEILAAPARECIDA SALLES PIO4
1
Engenheira Agrônoma, Dra., Bolsista FAPEMIG Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais/EPAMIG Setor de
Fruticultura - Rua Washington Alvarenga Viglione Vargedo 37200-000 Maria da Fé, MG [email protected]
2
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular do DAG Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
3
Engenheira Agrônoma, Mestranda em Entomologia no DEN Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
4
Engenheira Agrônoma, Dra., Bolsista da FAPEMIG
Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
RESUMO
A micropropagação de amoreira-preta é utilizada,
principalmente, para a obtenção de plantas livres de vírus e
em curto espaço de tempo. Com o objetivo de aprimorar
técnicas de cultivo in vitro de amoreira-preta cv. Tupy, testouse o uso de concentrações de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1)
e de suco de uva (SuFresh ) (0, 5, 10, 15 e 20%) adicionadas
ao meio MS acrescido de 1,0 mg L-1 de BAP, 6,0 g L-1 de ágar
e pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121ºC e 1,0
atm por 20 minutos. Segmentos nodais, oriundos de brotações
pré-estabelecidas in vitro foram excisados e inoculados em
tubos de ensaio contendo 15 mL do meio de cultura e mantidos
em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2ºC, irradiância
de 32 mol m 2 s 1 e fotoperíodo de 16 horas. O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualisado,
utilizando-se 4 repetições com 12 segmentos cada. O
experimento foi avaliado após 70 dias de cultivo in vitro.
Melhores resultados na micropropagação da amoreira-preta
cv. Tupy ocorrem com a adição de altas concentrações de
sacarose (45-60 g L -1) associadas a baixas concentrações de
suco de uva (0-5%).
Termos para indexação: cultivo in vitro, meio de cultura MS,
carboidrato, suco de uva, Rubus.
to a growth room with temperature of 25 ± 2ºC, irradiance of
32 mol m-2 s-1 and photoperiod of 16 hours. The experiment
was a complete randomized design with four replicates and 12
segments each. The experiment was evaluated after 70 days of
in vitro cultivation. Best results for micropropagation of the
blackberry cv. Tupy were obtained using high (45-60 g L-1)
sucrose concentrations associated with reduced (0-5%)
concentrations of grape juice.
Index terms: In vitro culture, MS culture medium, carbohydrate,
grape juice, Rubus.
INTRODUÇÃO
A amoreira-preta (Rubus sp.) é uma frutífera de clima
temperado pertencente à família Rosaceae, que contém
aproximadamente 740 espécies. Estima-se que a área
cultivada no Brasil esteja ao redor de 250 hectares, sendo
o Rio Grande do Sul o principal produtor, seguido de Santa
Catarina, Paraná, São Paulo e Sul de Minas (ANTUNES &
RASEIRA, 2004).
A sua propagação se faz por meio de estacas de
ABSTRACT
The blackberry micropropagation is used, mainly to
produce virus-free plants in a short period of time. With the
objective to improve the techniques of in vitro blackberry cv.
Tupy cultivation, different concentrations of sucrose (0, 15,
30, 45 and 60 g L-1) and grape juice (SuFresh ) (0, 5, 10, 15 and
20%) added to MS medium supplemented with 1.0 mg L-1
BAP, 6.0 g L-1 agar and pH adjusted to 5.8 prior sterilization at
121ºC and 1 atm for 20 minutes were tested. Nodal segments,
originated from in vitro plants were excised and inoculated in
tubes containing 15 mL of culture medium and then transferred
raízes, brotos (rebentos) originados de plantas cultivadas,
ou ainda por estacas herbáceas. Além disso, com a
micropropagação da amoreira-preta, é possível obter
plantas livres de vírus, geneticamente uniformes e em curto
espaço de tempo, sendo assim uma alternativa viável
(SKIRVIN et al., 1981).
Um dos objetivos da micropropagação é a
maximização da multiplicação de gemas. Muita atenção para
(Recebido em 8 de janeiro de 2008 e aprovado em 16 de março de 2009)
2
VILLA, F. et al.
sua obtenção tem sido dada à manipulação de reguladores
vegetais no meio. Vários meios de cultura para amoreirapreta têm sido testados e um específico é identificado pela
composição de sais minerais, enquanto as vitaminas,
reguladores vegetais e outros suplementos orgânicos
variam em concentração (ERIG et al., 2002; VILLA et al.,
2004, 2008).
O meio nutritivo é composto por água, elementos
essenciais, vitaminas, aminoácidos, açúcares, agente
solidificante, reguladores vegetais e eventualmente
aditivos como antibióticos, carvão ativado e aditivos
orgânicos complexos. Essas são preparações obtidas de
produtos naturais, de composição indefinida, mas que
atendem ao propósito de enriquecimento do meio, visando
a melhor resposta no padrão de crescimento das plantas
in vitro (TORRES et al., 2001).
Vários elementos aditivos complexos como coco
(endosperma, água, leite), peptona de carne, polpa de
banana, sucos de frutas, foram utilizados no meio de cultura
de tecidos (orquídeas) (STANCATO et al., 2008); (citros)
(FERREIRA et al., 2004). Entretanto, os dados
comparativos disponíveis não permitem uma discussão
razoável sobre o efetivo estímulo ao crescimento
promovido por esses elementos (GEORGE, 2008). Sucos
de frutas são considerados fontes de carboidrato
alternativas, em substituição à sacarose (SILVA, 2003).
A sacarose é um componente importante no meio
de cultura, servindo como fonte de esqueleto de carbono
e energia. Sua concentração também é um fator
determinante no crescimento e é dependente do tipo de
explante. Estudos comprovaram que 75 a 85% do aumento
da biomassa se devem à incorporação de carbono pela
adição de sacarose (CALDAS et al., 1990). Para amoreirapreta cv. Tupy, esse aumento se deu em meio de cultura
MS 150%, acrescido de 45-60 g L-1 de sacarose (VILLA et
al., 2004).
Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de avaliar
os efeitos da sacarose e de outra fonte de açúcar, como o
suco de uva industrializado, no cultivo in vitro de amoreirapreta cv. Tupy.
MATERIAL E MÉTODOS
Segmentos nodais de amoreira-preta, cv. Tupy,
contendo duas gemas axilares e 2 cm de comprimento,
oriundos de dois subcultivos in vitro de brotações
preestabelecidas, foram excisados e introduzidos em tubos
de ensaio (20x150mm), contendo 15 mL de meio MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962). Este meio foi acrescido
de 1,0 mg L-1 de BAP, 6 g L-1 de ágar (Merck®) e de
combinações de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1) e de suco
de uva (Su Fresh® - 0, 5, 10, 15 e 20%). O pH foi ajustado
para 5,8 antes da esterilização a 121ºC e 1 atm por 20 minutos.
Posteriormente, os tubos de ensaio contendo os explantes
foram transferidos para a sala de crescimento, para os quais
as condições de cultivo foram mantidas a 25 ± 2ºC,
irradiância de 32 mol m 2 s 1 e fotoperíodo de 16 horas.
Ao final de 70 dias de cultivo in vitro, foram
avaliados número de brotos, número de folhas, massa
fresca da parte aérea, comprimento da parte aérea, número
de raízes e massa fresca de calos.
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualisado com quatro repetições
constituídas de três explantes cada uma, totalizando 12
brotações. Os dados foram analisados por meio do software
Sisvar (FERREIRA, 2000) e as concentrações de sacarose
e suco de uva comparadas por regressão polinomial.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da análise de variância são
apresentados na Tabela 1. A interação entre as
concentrações de suco de uva e de sacarose promoveu
efeito significativo para todas as variáveis analisadas.
Maior valor absoluto para número de folhas foi
obtido com 5% de suco de uva associado a 60 g L-1 de
sacarose. Por outro lado, sob o ponto de vista econômico,
melhores resultados (25,85) foram verificados com 20% de
suco de uva adicionado ao meio de cultivo MS e na ausência
de sacarose (Figura 1).
No meio MS, contendo 0% e 5% de suco de uva,
maior número de folhas foi obtido com 60 g L-1 de sacarose,
enquanto que no meio MS contendo 20% de suco de uva
Sacarose e um aditivo orgânico complexo...
3
TABELA 1 Resumo da análise de variância para número de folhas (NF), número de brotos (NB), número de raízes
(NR), comprimento da parte aérea (CP) e peso da matéria fresca da parte aérea (PMF). UFLA, Lavras, MG, 2007.
FV
GL
Quadrados médios
NF
4
Sac.
NB
93,40**
NR
CP
PMF
0,0447
n.s.
0,8083**
7,0976**
0,033**
n.s.
Suco
4
199,04**
0,3944
0,9287**
4,544**
0,0362**
Sac. x suc.
16
219,38**
0,3595**
0,2979**
8,9457**
0,0135**
erro
71
0,1
0,6
0,12
1,91
0,004
23,27
18,20
19,50
2,67
5,09
CV%
** Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
sac. = sacarose; suc. = suco de uva; n.s. = não significativo.
Y0% suco de uva = 9,04 + 0,63x - 0,0064x2
45
R2 = 0,94
Y5% suco de uva = 13,94 + 0,2028x + 0,0032x2 R2 = 0,76
40
Y20% suco de uva = 25,84 - 0,2068x - 0,0015x2
R2 = 0,98
Número de folhas
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
-1
Sacarose (g L )
0% suco de uva
5% suco de uva
20% suco de uva
FIGURA 1 Número de folhas de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentrações de suco de uva e de
sacarose, após 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.
houve tendência de redução nesse número em relação ao
aumento da concentração de sacarose. O comportamento
do número de brotos dessa cultivar foi semelhante ao
número de folhas, sendo estimulado pelo aumento da
concentração de sacarose associado a 0 e 5% de suco de
uva (Figura 2).
Maior número de brotos ocorreu com 5% de suco
de uva associado a 60 g L-1 de sacarose, corroborando
assim com Villa et al. (2004, 2008), cujos autores estudando
diferentes meios para micropropagação da amoreira-preta,
afirmaram que, o uso de 60 g L-1 de sacarose proporcionou
maior número de brotos (2,8) das cultivares Ébano e Tupy.
Porém, Cao et al. (2003) afirmaram que, maior número de
brotos de Vaccinium corymbosum L. cvs. Bluecrop, Duke
e Georgiagem deu-se com a adição de 15 g L-1 de sacarose
adicionado ao meio de cultura WPM modificado.
Mesmo na ausência de sacarose foi observada a
produção de brotos de amoreira-preta, corroborando assim
com Souza (1995), cujo autor verificou que na ausência de
sacarose ocorreu uma produção média de 2,9 brotos/
4
VILLA, F. et al.
explante e com 35,3 g L-1 de sacarose a produção passava
de 18,2 brotos/explante. Essa resposta, divergente do
presente estudo, sugere que o explante utilizado pode ter
usado suas próprias reservas de carbono na indução de
novas brotações, sendo dispensável a sacarose como
fonte de carbono.
Com o aumento nas concentrações de sacarose,
verificou-se um aumento quadrático no número de raízes,
sendo que maior número ocorreu entre 45-60 g L-1 de
sacarose na ausência de suco de uva adicionado ao meio
de cultura (Figura 3). Leite et al. (2000) também afirmaram
que a percentagem de enraizamento de porta-enxerto de
3,0
Número de brotos
2,5
2,0
1,5
2
2
Y0% suco de uva = 1,43 + 0,0415x - 0,0005x R = 0,99
2
2
Y5% suco de uva = 1,80 + 0,0141x + 1E-06x R = 0,83
2
2
Y15% suco de uva = 2,50 - 0,0299x + 0,0003x R = 0,83
1,0
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
-1
Sacarose (g L )
0% suco de uva
5% suco de uva
15% suco de uva
FIGURA 2 Número de brotos de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentrações de suco de uva e de
2,5
Número de raízes
2,0
1,5
1,0
2
2
Y0% suco de uva = 0,99 + 0,0312x - 0,0002x R = 0,97
2
2
Y5% suco de uva = 1,22 + 0,0037x + 1E-04x R = 0,60
2
2
Y10% suco de uva = 1,05 + 0,0055x + 0,0001x R = 0,74
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
-1
Sacarose (g L )
0% suco de uva
5% suco de uva
10% suco de uva
FIGURA 3 Número de raízes de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentrações de suco de uva e de
pereira OH x F97 apresentaram comportamento quadrático
significativo, com aumento nas concentrações de sacarose
estudadas.
Maior percentual de enraizamento foi obtido na
presença de uma situação oposta, ou seja, pela combinação
da maior concentração de sacarose associada à menor de
suco de uva industrializado. A combinação de altas
concentrações de sacarose (60 g L -1) associadas as
menores concentrações (0-10%) da outra fonte de
carboidrato, provavelmente afetam negativamente o
enraizamento por meio do aumento do potencial osmótico
do meio, fator sabidamente conhecido como inibidor do
crescimento radicial, durante o processo de propagação
vegetativa (MALDANER et al., 2006).
Comportamento semelhante ao número de raízes
deu-se para comprimento da parte aérea e número de folhas.
Maior comprimento da parte aérea de amoreira-preta cv.
Tupy foi verificado com 45 g L-1 de sacarose, sem a adição
de suco de uva (Figura 4). A adição de sacarose no meio de
cultivo pode atuar como substrato para o processo de
respiração celular, fornecendo quantidade de energia para
o processo de rizogênese e também atuaria na manutenção
5
do potencial osmótico do meio. Os dados obtidos
corroboram com as afirmações de vários autores de que a
presença de carboidrato é essencial para a indução e
desenvolvimento de raízes in vitro de muitas espécies
frutíferas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Quando se elevou a concentração de sacarose, o
desenvolvimento da parte aérea diminuiu na maior
concentração de suco de uva (20%). É possível que o
aumento do potencial osmótico e a consequente redução
na absorção de nutrientes pelos explantes não tenha
evitado um efeito deletério causado pela alta concentração
do suco de uva. O aumento da concentração de sacarose
no meio de cultivo não apenas elevou o suprimento de
carbono disponível à cultura, como também estimulou o
crescimento do material vegetal, conforme verificado na
ausência e com a adição de 5% de suco de uva. Já para
20% de suco de uva, o crescimento in vitro teve uma
resposta inversa, decorrente das altas concentrações de
fonte de carbono presentes no suco de uva, diminuindo
assim o potencial osmótico do meio.
A adição de 5% de suco de uva no meio de cultura
proporcionou maior massa fresca de brotações, com
2
2
2
2
Y0% suco de uva = 1,57 + 0,1927x - 0,0017x R = 0,88
Y5% suco de uva = 2,42 + 0,1555x - 0,0018x R = 0,82
9
2
2
Y20% suco de uva = 4,94 - 0,0112x - 0,0006x R = 0,73
8
Comprimento da
parte aérea (cm)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
-1
Sacarose (g L )
0% suco de uva
5% suco de uva
20% suco de uva
FIGURA 4 Comprimento da parte aérea de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentrações de suco
de uva e de sacarose, após 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.
6
VILLA, F. et al.
aumento de sacarose até a concentração de 60 g L-1 (Figura
5). Embora a alta concentração de sacarose possa ter
elevado o potencial osmótico, a absorção de nutrientes
pelos explantes não foi prejudicada.
Verificou-se a formação de calos na base dos
explantes de amoreira-preta. Os resultados obtidos nas
concentrações de 0 a 10% de suco de uva foram muito
próximos (Figura 6), porém destaque deve ser dado à
ausência do suco de uva no meio de cultivo, quando maior
massa fresca de calos foi obtida com 60 g L-1 de sacarose.
O aumento nas concentrações de sacarose verificou-se de
forma quadrática uma intensa formação de calos. Esses
1,6
1,4
Massa fresca da
parte aérea (g)
1,2
1,0
0,8
2
2
Y0% suco de uva = 1,02 + 0,007x - 6E-05x
0,6
R = 0,82
2
2
Y5% suco de uva = 1,09 + 0,0007x + 7E-05x R = 0,97
0,4
0,2
0,0
0
10
20
30
40
50
60
-1
Sacarose (g L )
0% suco de uva
5% suco de uva
FIGURA 5 Massa fresca da parte aérea de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentrações de suco
de uva e de sacarose, após 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.
1,4
Massa fresca de calos (g)
1,2
1,0
0,8
2
2
Y0% suco de uva = 0,99 + 0,0058x - 5E-06x
0,6
R = 0,97
2
2
Y5% suco de uva = 1,00 + 0,0072x - 6E-05x
R = 0,98
2
2
Y10% suco de uva = 1,04 + 0,0073x - 0,0001x R = 0,87
0,4
0,2
0,0
0
10
20
30
40
50
60
-1
Sacarose (g L )
0% suco de uva
5% suco de uva
10% suco de uva
FIGURA 6 Massa fresca de calos de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentrações de suco de uva
e de sacarose, após 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.
resultados estão de acordo com Erig et al. (2004), quando
elevadas concentrações de sacarose induziram a formação
de calo na base dos explantes de marmeleiro (Cydonia
oblonga Mill.), cultivares MC e Adams. Essa formação na
zona de enraizamento é indispensável, pois pode afetar a
qualidade das raízes, principalmente no que se refere à
conexão vascular com a planta (FACHINELLO et al., 1995).
Pela pouca diferença entre a ausência de sacarose
e sua adição no meio de cultivo para massa fresca da parte
aérea e de calos, o melhor resultado verificado foi na
ausência dessa fonte de carboidrato.
Outro aspecto a ser considerado é que a sacarose
também contribui na diferenciação dos tecidos vasculares
(SRISKANDARAJAH & MULLINS, 1981). Observou-se
que nos diferentes tratamentos nos quais ocorreram pouca
ou nenhuma formação de calos na base dos explantes, as
raízes formaram-se diretamente da epiderme, pois com a
formação de calos, as raízes formadas não são diretamente
ligadas aos explantes, podendo acarretar grande taxa de
mortalidade das brotações, por ocasião de transferências
para o substrato na fase de aclimatização.
A sacarose e o suco de uva, como fontes de
carboidratos, visam a suprir as necessidades metabólicas
dos explantes de amoreira-preta, atuando como fonte de
esqueletos carbônicos na diferenciação celular e no
crescimento, porém em concentrações antagônicas (altas
concentrações de sacarose e baixas de suco de uva) foram
essenciais no desenvolvimento in vitro dessa cultivar.
CONCLUSÕES
Maiores concentrações de sacarose associadas a
baixas concentrações de suco de uva proporcionaram
melhor cultivo in vitro da amoreira-preta cv. Tupy.
Plantas com maior número de raízes foram obtidas
na ausência do suco de uva em meio de cultura, adicionado
de 45, 60 g L-1 de sacarose.
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ESTUDO DA ANATOMIA
DE PLÂNTULAS
DA ESPÉCIE Malus
Estudo da anatomia
de plântulas da espécie...
domestica Borkh var. golden delicious CULTIVADA IN VITRO
9
ANATOMICAL STUDY OF Malus domestica var. golden delicious CULTIVATED IN VITRO
KELLY CRISTINA DE MACEDO BEZERRA1, MAGDI AHMED IBRAHIM ALOUFA2,
JULIANA ESPADA LICHSTON3
1
Bióloga, MsC. Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Parnamirim, RN [email protected]
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Adjunto Departamento de Botânica Ecologia e Zoologia Universidade Federal do Rio
Grande do Norte/UFRN Rua Engo Nelson Bahia, 1800 Cidade Jardim 59078-280 Natal, RN [email protected]
3
Bióloga, Dra., - Professora Adjunta - Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte/UFRN Avenida Salgado Filho s/n Lagoa Nova 59078-970 Natal, RN [email protected]
2
RESUMO
A técnica de cultura in vitro na fruticultura vem crescendo,
principalmente, para facilitar a produção de variedades resistentes
e de alta qualidade, havendo necessidade de novas alternativas a
fim de atender ao mercado consumidor. Neste trabalho objetivouse analisar as estruturas anatômicas de plântulas de macieira
(Malus domestica Borkh var. golden delicious) germinadas
assepticamente in vitro e avaliar a taxa de germinação das
sementes. As sementes de macieira foram escarificadas, inoculadas
em meio MS básico, e mantidas em condições controladas de luz,
temperatura, fotoperíodo e luminosidade. Para os estudos
anatômicos, as plântulas germinadas foram fixadas em álcool, e
utilizadas para confecção de lâminas, pelo método à mão livre,
como lâminas permanentes. As sementes que tiveram o tegumento
totalmente removido apresentaram a maior percentagem de
germinação e a menor taxa de contaminação. No estudo histológico,
verificaram-se na raiz, em secção transversal, células da epiderme
com espessamento na parede periclinal interna. Observou-se que
seu sistema vascular é composto por cinco pólos de protoxilema
alternando-se com cinco do protofloema. No caule, o sistema
vascular é representado por um número variado de feixes do tipo
colateral. A folha é dorsiventral e hipoestomática, e a epiderme
apresenta acentuadas sinuosidades, com cutícula de espessura
delgada. Quanto à anatomia, Malus domestica apresenta
organização tecidual típica das eudicotiledôneas, havendo
diferença entre os indivíduos que crescem naturalmente e os de
cultivo in vitro.
Termos para indexação: Malus domestica, escarificação,
histologia.
ABSTRACT
The technique of in vitro culture in horticulture has
grown mainly to facilitate the production of resistant high quality
varieties, with the need of new alternatives in order to attend
the consumer market. The objective of this work was to analyse,
in vitro, the anatomical structure of apple plantlets (Malus
domestica var. golden delicious) germinated aseptically in vitro,
as well as to evaluate their seed germination rate. The apple
tree seeds underwent a scarification process being inoculated in
basic MS medium, and maintained under controlled conditions.
The germinated seedlings were scarified, for the anatomical
study, and both free hand and permanent laminae methods were
used. The seeds whose tegument was completely removed
presented the highest germination percentage and the lowest
contamination rate. For the histological study, it was found in
the root, using transverse section, cells of the epidermis with
thickening in the internal periclinal wall. Five protoxylem poles
alternated with five protophloem compose its vascular system.
In the stem, the vascular system is represented by a varied
number of bunches of collateral type. The leaf is dorsiventral
and hipostomatic, the epidermis presents accentuated sinuosity,
with thin thickness cuticle. As for the anatomy, Malus domestica
presents the typical tissue organization of the eudicotyledons,
showing difference among the individuals growing naturally
and those cultivated in vitro.
Index terms: Malus domestica, scarification, histology.
INTRODUÇÃO
O cultivo de diversas variedades de macieira está
consolidado como um empreendimento rentável e viável
no Brasil (CRUZ JUNIOR & RICARDO, 2002). A qualidade
da maçã produzida no país vem tornando o mercado
competitivo em relação à maçã importada (FREY, 1990).
Mas, na região Sul do Brasil, onde ocorre maior produção
de macieira do país, a maioria dos cultivares não tem sua
necessidade de frio invernal satisfatória, apresentando
sérios distúrbios fisiológicos, como brotações deficientes
e desuniformes, reduzindo a produtividade (CRUZ JUNIOR
& RICARDO, 2002).
A variedade golden delicious é de origem americana,
uma das mais cultivadas do mundo. Sua casca é verde,
com pontos escuros pequenos. Seu formato é redondo e
regular. A polpa é substancial, suculenta, doce e aromática.
(Recebido em 31 de julho de 2008 e aprovado em 16 de março de 2009)
10
BEZERRA, K. C. de M. et al.
Foi introduzida no mercado mundial em 1914 (ESCLAPON,
1969).
A macieira por muitas vezes apresenta período
juvenil encurtado, ocasionando um longo intervalo de
tempo até a germinação, tornando mais difícil e longo o
programa de melhoramento genético para esta espécie
(ROEN, 1994). As sementes da macieira apresentam
dormência e necessitam de uma temperatura ótima para a
sua superação (DANTAS et al., 2002). Nesse sentido, o
cultivo in vitro dessas sementes apresenta-se como uma
alternativa de propagação da espécie, de forma rápida e
como possível fonte asséptica de explantes para
experimentos posteriores. Quando a dormência é
ocasionada por um balanço desfavorável entre promotores
e inibidores de germinação, métodos que aumentem a
concentração dos promotores ou que atuem impedindo a
ação dos inibidores deverão ser empregados, como é o
caso da estratificação, lixiviação e aplicação direta de
citocinina e/ou giberelina (FERREIRA & BORGHETTI,
2004). As interações entre fitoreguladores afetam a
superação da dormência e a subsequente germinação das
sementes (DUNLAP & MORGAN, 1977). Um outro tipo
de dormência verificado é a imposta pelo tegumento, que
é eficiente para retardar a germinação (KHAN, 1996). E
uma forma de permitir a quebra da germinação, é pela
escarificação mecânica, que é obtida pela ruptura ou
abrasão do tegumento (COHN, 1996; FERREIRA et al.,
1992).
Segundo Calvete et al. (2002), o cultivo de sementes
in vitro promove alterações anatômicas, morfológicas e
fisiológicas nas plantas. Por isso, é importante a
identificação dos aspectos estruturais da plântula para uma
melhor compreensão. As plantas crescidas in vitro podem
apresentar características peculiares como: abundância de
espaços intercelulares, sistema vascular pouco
desenvolvido e reduzida capacidade de sustentação (baixa
incidência de tecidos como esclerênquima e colênquima),
estômatos não funcionais e baixa atividade autotrófica,
dentre outros tipos de desordens (CAMPOSTRINI &
OTONI, 1996).
As estruturas morfoanatômicas dos vegetais
sofrem grande influência das condições ambientais em que
vivem, embora a relação entre esses caracteres adaptativos
e condições ambientais, em muitos casos, seja difícil de
estabelecer. Segundo Reeve & Sherman (1993), o termo
adaptação tem sido utilizado em anatomia vegetal para
descrever certos caracteres anatômicos associados a
determinadas condições ambientais e de cultivo.
Plântulas removidas do ambiente in vitro
necessitam de um período de aclimatização, que lhes
permitirão adaptar-se às condições de cultivo em campo.
Campostrini & Otoni (1996) alertam para a dificuldade de
transição do mecanismo heterotrófico para autotrófico em
plantas micropropagadas, em virtude das alterações
epigenéticas, anatômicas e fisiológicas, induzidas pelas
condições in vitro. Os estudos das adaptações vegetais
em cultivo in vitro são de grande relevância para
compreender o processo de aclimatização das espécies e
seu desenvolvimento tecidual em resposta às novas
condições ambientais.
Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de
analisar as estruturas anatômicas de plântulas de maçã
(Malus domestica Borkh var. golden delicious) germinadas
assepticamente in vitro, por meio de um processo de
escarificação de sementes de maçã e avaliar a taxa de
germinação das sementes sob as condições citadas.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Biotecnologia Vegetal, do Departamento de Botânica,
Ecologia e Zoologia, do Centro de Biociências da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Para o
experimento de germinação, utilizou-se o meio Murashige
& Skoog (1962), contendo sais, vitaminas, 0,1 g L-1 de mioinositol, 6,0 g L-1 de agar e 30 g L-1 de sacarose. O pH do
meio foi ajustado para 5,7 antes da autoclavagem.
Utilizaram-se sementes de macieira (Malus domestica var.
golden delicious), retiradas assepticamente a partir de
frutos maduros, que foram colocadas para germinar sob
três tratamentos assim denominados: T1 (sementes que
Estudo da anatomia de plântulas da espécie...
não sofreram nenhuma escarificação); T2 (a semente sofreu
um corte transversal) e T3 (remoção total do tegumento da
semente). Em seguida, as sementes foram inoculadas em
frascos contendo o meio acima citado. As culturas foram
mantidas em salas de crescimento com condições
controladas de luz (25 M m-2 s-1), fotoperíodo (12h),
temperatura (26±2ºC) e umidade relativa (76%). Utilizou-se
o delineamento inteiramente casualizado, com três
repetições de 10 frascos experimentais, onde cada frasco
apresentava uma semente. A cada 10 dias foram realizadas
as observações, analisando a porcentagem de germinação
e contaminação.
Para o estudo anatômico, utilizaram-se raízes, caules e
folhas de plântulas originadas de semente sem o tegumento
oriundas do cultivo in vitro, sendo retiradas do meio MS
após 30 dias de incubação. As amostras foram retiradas a
partir de material fresco e fixadas em álcool 70% (JOHANSEN,
1940). Os cortes obtidos à mão livre foram corados com azul
de astra e safranina (KRAUS & ARDUIM, 1998). As lâminas
semi-permanentes foram montadas em gelatina glicerinada
50%. Para a confecção de lâminas permanentes, o material foi
submetido às técnicas usuais em anatomia vegetal (SASS,
1958), seccionados transversal e longitudinalmente, sendo
corados com azul de astra e safranina e montados em resina
sintética (KRAUS & ARDUIM, 1998). Testes histoquímicos
foram realizados em corte de material fresco com a utilização
de sudan IV para evidenciar substâncias lipofílicas,
floroglucina para elementos lignificados, lugol para
evidenciar reservas de amido e cloreto férrico para sinalizar
substâncias fenólicas (JOHANSEN, 1940). Para a obtenção
de fotomicrografias, foi utilizado o equipamento
fotomicroscópio ZEISS. Os cortes histológicos foram
observados com o auxilio de objetivas de 10X, 40X e 100X
de aumento. Utilizou-se também microscópio eletrônico de
varredura para a análise das plântulas.
Germinação das Sementes
Os resultados obtidos neste trabalho mostraram
que no tratamento T1 (sementes sem corte), apenas
11
4,45% das sementes germinaram, obtendo-se a menor
porcentagem de germinação entre os tratamentos,
mostrando a dificuldade de embebição imposta pelo
tegumento e uma taxa de contaminação de 63,33% que
provavelmente ocorreu pelo fato das sementes não ter
passado por um processo de desinfestação, pois as
maçãs eram flambadas e cortadas dentro da capela de
fluxo laminar e as sementes eram logo colocadas em
frascos com meio de cultura. No tratamento T2 (com
corte), observou-se 15,55% de germinação resultado que
mostra que sementes parcialmente escarificadas
apresentam um aumento de germinação, comprovando
que a retirada parcial do tegumento torna o ambiente
das sementes mais favorável ao seu desenvolvimento,
essa idéia é reforçada quando se retira totalmente o
tegumento no tratamento T3 (sem tegumento) onde a
taxa de germinação alcançou 72,22%, mostrando que a
retirada total do tegumento é bastante eficiente,
favorecendo uma melhor embebição para dar início à
germinação. Estando de acordo com Santos et al. (2003),
que trabalhando com sementes de Smilax japicanga
Grisebach, não obtiveram germinação nas suas sementes
sem escarificação. Em relação à contaminação o maior
índice 75,55% ocorreu no tratamento 2 provavelmente
em razão da incisão na semente, permitindo a entrada de
microorganismo além dos presentes no tegumento e o
menor índice 25,5% ocorreu no tratamento 3, mostrando
que a retirada total do tegumento, tem relação direta,
tanto com a germinação como a contaminação (Figura
1). A escarificação mecânica do tegumento também foi
eficiente na superação da dormência das sementes de
várias espécies com tegumento impermeável, como as
de Bauhinia monandra Kurz e B. ungulata L. (ALVES
et al., 2000) e Dimorphandra mollis Benth
(HERMANSEN et al., 2000). Podemos inferir que as
sementes de macieira da variedade golden delicious,
possuem uma impermeabilidade do tegumento, como
mostra o tratamento T1, concordando com os trabalhos
de Barbosa et al. (1996) e Crepaldi et al. (1998), no que
diz respeito à dureza do tegumento das sementes.
12
médias das taxas de germinação
médias das taxas de contaminação
90,00
75,55
75,00
Porcentagem
72,22
63,33
60,00
45,00
25,55
30,00
15,00
15,55
4,45
0,00
Sem corte
Com corte
Sem tegumento
FIGURA 1 Taxa de contaminação e germinação de sementes de macieira em três tratamentos diferentes.
As sementes de muitas espécies frutíferas,
principalmente daquelas que possuem frutos carnosos,
germinam em tempo relativamente curto quando colocadas
em condições de solo e ambiente favorável, porém outras,
nas mesmas condições, não germinam (LEDO &
CABANELAS, 1996).
Caracteres estruturais da raiz
Em estudos realizados com a raiz, ao nível da zona
pilífera, em secção transversal, verificou-se uma epiderme
unisseriada, destacando espessamento em algumas células
no sentido periclinal, pelos absorventes curtos e numerosos,
com cutícula delgada. A exoderme, também apresentou
paredes espessadas. A região cortical compreende cerca de
sete camadas de células parenquimáticas, com grandes
espaços intercelulares. Limitando o córtex, a endoderme
caracteriza-se pela parede delgada, não sendo observada
estrias de Caspary, reforços de suberina que sustentam o
feixe vascular, comumente encontrado nas raízes de
angiospermas (GLÓRIA & GUERREIRO, 2006). O periciclo é
unisseriado, com células maiores que as observadas na
endoderme e paredes delgadas. No cilindro central, o xilema
é formado por cinco pólos de protoxilema (pentarca), cujo
espessamento é delgado. O arco procambial se mostra
evidente. A região da medula é ocupada por um parênquima
de parede delgada e poucos espaços intercelulares, sendo
registrada pouca substância ergásticas identificadas pela
coloração escura dada pelos corantes lugol e cloreto férrico.
Caracteres estruturais do caule
Na secção transversal do caule, na estrutura
primária, observa-se uma epiderme unisseriada, e a cutícula
se mostra delgada. Sob a epiderme, verificam-se dois
estratos de células do colênquima, que de acordo com o
espessamento é do tipo angular. Verificaram-se ainda, nesta
região, células com conteúdo fenólico, determinado pela
coloração escura dada pela reação com o cloreto férrico. O
parênquima cortical é formado por cerca de cinco estratos,
com formato isodiamétrico, deixando poucos espaços
intercelulares (Figura 2). Delimitando o córtex, vê-se uma
camada de células parenquimáticas, a bainha amilífera. O
sistema vascular é circular, fechado e do tipo colateral.
Idioblastos fenólicos surgem entre os feixes vasculares,
principalmente próximos aos elementos do floema. A medula
é ampla e constituída por células parenquimáticas com
poucos espaços intercelulares (Figura 3).
Caracteres estruturais da folha
Na figura 4, representa-se um corte paradérmico da
folha de M. domestica. Verifica-se que as células da
epiderme da superfície adaxial são delgadas, e menores
quando comparadas às da superfície abaxial (Figura 4 e 5).
13
FIGURA 2 Secção transversal do caule de Malus
domestica de plântulas oriundas do cultivo in vitro em
estrutura primária, revelando epiderme (ep), colênquima
(co), córtex (c), xilema (x) floema (f) (40X). Barra = 30 µm.
FIGURA 3 Pormenor do caule de plântulas oriundas do
cultivo in vitro de Malus domestica, observando o sistema vascular. Córtex (c), compostos fenólicos (cf), floema
(f), xilema (x) e medula (m) (100X). Barra = 30 µm.
FIGURA 4
Vista frontal da epiderme, superfície
adaxial da folha de Malus domestica (100X). Barra =
50 µm.
FIGURA 5 Vista frontal da epiderme da superfície abaxial
da folha de Malus domestica, evidenciando estômatos
(es) arredondados e abertos (100X). Barra = 50 µm.
As paredes das células da superfície abaxial são delgadas
apresentando maiores sinuosidades; os estômatos são
grandes e do tipo anomocíticos. Na figura 5, verificou-se
que a maioria dos estômatos está aberto, com célulasguarda em formato arredondado, típico de eudicotiledôneas
(RAVEN et al., 2001). Assim sendo, como os estômatos
são pouco funcionais, as plantas respondem muito
lentamente ao estresse hídrico (PREECE & SUTTER, 1991).
Os estômatos se localizam acima das demais células
da epiderme (Figura 6 e 7). Verificou-se ainda crista
estomática. A câmara subestomática é ampla e as célulasguarda possuem espessamento nas paredes periclinal
externa e interna, sendo mais espessada a periclinal externa.
Em secção transversal, a folha é hipoestomática e
dorsiventral, sendo observada apenas uma camada de
células paliçádicas, contíguas com numerosos cloroplastos;
o parênquima lacunoso apresenta grandes espaços.
A cera foliar epicuticular constitui interface natural
entre as folhas e o meio, tendo como função básica conferir
ao vegetal uma maior resistência à perda d água e a doenças
(HARBORNE & TURNER, 1984) e adicionalmente, pode
ser importante na interação inseto-planta (BALSDON et
al., 1995; SUGAYAMA & SALATINO, 1995).
Nas Figuras 6 e 7, evidencia-se a morfologia da
cera foliar epicuticular de M. domestica cultivada in vitro,
classificada segundo Barthlott et al. (1998) como uma cera
do tipo filme com circunvoluções como crostas sobrepostas
à epiderme, não caracterizando cristais de cera.
14
FIGURA 6 Superfície abaxial da folha de macieira.
FIGURA 7 Superfície adaxial da folha de macieira.
Vários pesquisadores afirmam que a morfologia da
cera foliar epicuticular reflete a sua constituição química
influenciado no equilíbrio hídrico da variedade em cultivo
in vitro, evidenciado pela ausência de estresse hídrico.
(BARTHLOTT, 1998; BONDADA et al., 1996). Segundo
Na variedade golden delicious, encontramos 7
Salatino et al. (1986), a cera inicia o depósito sobre a
camadas de células parenquimáticas, com grandes espaços
cutícula, como uma camada amorfa que pode receber
intercelulares, o periciclo unisseriado e o cilindro central
camadas adicionais que se cristalizam e sugerem que ceras
formado com 5 pólos de protoxilema, diferindo do estudo
que permanecem amorfas devem ter predomínio de
realizado por Rodrigues et al. (2006) com macieira da
terpenóides, substâncias que determinam um alto poder
variedade gala, cuja raiz se observa uma região cortical,
de impermeabilização foliar e conferem defesa contra
apresentando cerca de 4 a 5 camadas de células
fungos. Considerando a possibilidade da cera foliar
parenquimáticas, com pequenos espaços intercelulares,
epicuticular de M. domestica ter um predomínio de
periciclo do tipo uniestratificado e cilindro central formado
terpenóides, estes constituintes químicos podem ter
por 4 a 6 pólos de protoxilema. As variedades citadas acima
apresentam semelhança na região da medula, na qual
apresentam um parênquima de parede delgada e poucos
espaços intercelulares. Mas, de acordo com Fahn (1990),
na maioria das espécies, o número de pólos de protoxilema
pode variar entre plantas diferentes, ou em raiz diferentes
na mesma planta.
Na estrutura caulinar, observamos que a variedade
golden delicious apresenta um sistema vascular do tipo
circular, fechado e colateral, confirmando o sistema de
classificação de Foster & Gifford Junior (1974), o qual
confirma que as eudicotiledôneas apresentam sistema
vascular do tipo eustele. O caule da plântula de macieira
variedade golden delicious apresentou as mesmas
características da macieira variedade gala, como relatado
por Rodrigues et al. (2006). Como a conexão entre o sistema
vascular do caule e das raízes ainda é precária para permitir
o fluxo transpiratório adequado e o número de elementos
condutores é reduzido, estes também podem ser
considerados fatores de risco na aclimatização
(JOHANSSON et al., 1992; PREECE & SUTTER, 1991).
Nas folhas de macieira, desenvolvidas in vitro,
observou-se que, sua espessura é menor quando
comparadas com as espécies desenvolvidas naturalmente.
A cutícula se mostra também menos espessa e os estômatos
acima das células, como mencionado nos trabalhos de
Donnely & Vidaver (1984) e Johansson et al. (1992).
Resultado semelhante foi verificado por Barboza et al (2006)
em estudo com plantas micropropagadas de abacaxizeiro.
Vários autores afirmam que plantas sob condições
satisfatórias de suprimento hídrico e alto índice de umidade
tendem a desenvolver uma cutícula foliar menos espessa
(SUGAYAMA & SALATINO, 1995), minimizando o gasto
energético contra a dessecação. Em condições de cultivo
in vitro, a macieira evita o gasto metabólico excessivo com
a produção de cutícula, uma vez que a planta encontra-se
adaptada ao ambiente úmido e com grande oferta de água
característico deste meio de cultivo.
As células da epiderme da superfície adaxial são
menores em relação à da abaxial. O mesofilo compreende
apenas uma camada de células paliçádicas apresentando
15
espaços intercelulares. Nos estudos realizados por Brainerd
& Fuchigami (1981) para as folhas de ameixeira
micropropagadas in vitro, verificou-se que a camada de
células paliçádicas era formada apenas por uma camada.
Esse mesmo comportamento foi observado na espécie
framboesa vermelha (DONNELLY & VIDAVER, 1984),
videira (SMITH et al., 1986) e morangos (FABBRI et al.,
1986), as plantas crescidas no campo apresentam outro
comportamento, como a presença de tricomas unicelulares.
Em relação aos estômatos, alguns autores relatam
à inabilidade de fechamento dos estômatos de plantas
cultivadas in vitro, quando removidas do meio de cultura.
A forma arredondada dos estômatos de Malus domestica
difere das células-guarda existentes em grandes variedades
de maçã (BLANKE & BELCHER, 1989). Na variedade
estudada, a maioria dos estômatos está aberta,
concordando com os estudos realizados por Brainerd &
Fuchigami (1981). Resultados idênticos foram obtidos com
folhas incisadas de Solanum laciniatum Ait. (CONNER &
CONNER, 1984). Foi observado por Sutter (1988) que
estômatos de brotos de maçãs permaneceram abertos
após a sua remoção do meio de cultura, porém cerca de
78% dos estômatos das cerejas e plantas de goma doce
desenvolvida in vitro se fecharam após uma hora de
exposição às condições ambientais numa bancada de
laboratório.
As plantas micropropagadas crescem em condições
de alta umidade relativa do ar, baixa luminosidade e trocas
gasosas restritas, resultando em baixas taxas de
transpiração e fotossíntese (POSPÍSILOVÁ et al., 1999;
PREECE & SUTTER, 1991). Durante a aclimatização, as
plantas sofrem mudanças morfológicas, anatômicas e
fisiológicas, que as tornam capazes de crescer em um novo
ambiente (SUTTER et al., 1992). Essas alterações
anatômicas nas plantas cultivadas in vitro podem
inviabilizar a aclimatização das mesmas (ALBARELLO et
al., 2001). Brainerd & Fuchigami (1981) relataram a
necessidade da aclimatização das plantas provenientes da
cultura in vitro, porque elas são sensíveis e tenras, a
cutícula é pouco desenvolvida, resultando em alta
16
transpiração e a parede celular não apresenta rigidez
suficiente para a sustentação.
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CONCLUSÕES
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Sementes de Malus domestica cultivadas in vitro e
desprovidas de tegumentos, promoveram uma germinação
de forma mais rápida e com menor índice de contaminação.
As plântulas desenvolvidas in vitro apresentaram
características anatômicas que não permitem colocá-las
de imediato para aclimatização, por isso é recomendável
que seja feita uma pré-aclimatização para maior sucesso
das plantas propagadas.
O estudo anatômico de plântulas cultivadas in vitro
mostra-se como uma importante ferramenta para programar
as etapas do processo de aclimatização do vegetal
maximizando as chances de viabilidade da espécie em
campo.
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CRESCIMENTO INCrescimento
VITRO in DE
vitro dePEQUIZEIRO
pequizeiro (Caryocar... (Caryocar brasiliense19
A. St.-Hil.): INFLUÊNCIA DA POLARIDADE E LUMINOSIDADE
IN VITRO GROWTH OF Caryocar brasiliense A. St.-Hil.: INFLUENCE OF
POLARITY AND LIGHT
BRENO RÉGIS DOS SANTOS1, RENATO PAIVA2, SANDRO BARBOSA3,
PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA4, DAIANE PEIXOTO VARGAS5, CRISTIANO MARTINOTTO6
1
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor, Universidade Federal de Alfenas/UNIFAL Rua Gabriel Monteiro da Silva 700 Centro
37130-000 Alfenas, MG [email protected]
2
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor, Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
3
Biólogo, Dr., Professor, Universidade Federal de Alfenas/UNIFAL Rua Gabriel Monteiro da Silva 700 Centro 37130-000
Alfenas, MG [email protected]
4
Engenheira Agrônoma, Dra., Professora, Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
5
Bióloga, Dra., Bolsista FAPEMIG
Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-00 Lavras, MG
[email protected]
6
Engenheiro Agrônomo, Dr., Universidade Federal de Lavras/UFLA
Cx. P. 3037
37200-00
Lavras, MG
[email protected]
RESUMO
Decorrente da devastação do Cerrado, a propagação
natural do pequizeiro tem sido comprometida. Além disso,
suas sementes apresentaram sérios problemas de dormência
tegumentar e uma possível presença de inibidores. Nesse
contexto, a cultura de tecidos torna-se uma alternativa para a
propagação do pequizeiro. Objetivou-se avaliar o efeito da
polaridade de explantes foliares e nodais durante o cultivo in
vitro e verificar a influência da luminosidade na calogênese e
na indução de brotações de pequizeiro. O estudo da polaridade
na calogênese foi observado por meio da inoculação de
segmentos foliares em meio WPM. O efeito da luminosidade
na calogênese foi verificado por meio da inoculação de explantes
foliares em meio WPM, acrescido de 1 mg L-1 de TDZ e 2 mg
L-1 de 2,4-D, permanecendo os explantes após a inoculação na
presença e ausência de. O efeito da luminosidade na indução
de brotações foi averiguado por meio da inoculação de
segmentos nodais em meio WPM acrescido com 0,75 mg L-1
de BAP e 0,05 mg L-1 de ANA, sendo que, após a inoculação
os explantes foram mantidos na presença e ausência de luz.
Para a indução de calos em explantes foliares, a inoculação
com a superfície abaxial voltada para o meio de cultivo e na
orientação horizontal apresentou melhores resultados. Para
explantes nodais, a orientação horizontal mostrou-se mais
eficiente, uma vez que, este procedimento permitiu obter 3,88
brotos/explantes, em média, sendo este valor superior ao
encontrado na orientação vertical (1,5 brotos/explantes). A
formação de calos foi 38,31% maior na ausência de luz. As
brotações em segmentos nodais desenvolveram-se melhor na
presença de luz.
ABSTRACT
Due to the great devastation of cerrado, the natural
propagation of Caryocar brasiliense has been seriously affected.
Besides, its seeds present serious problems of coat dormancy
and possible presence of inhibitors. In this context, plant tissue
culture becomes an alternative for the especies propagation. The
objective of this work was to evaluate the effect of the polarity
on leaf and nodal explants of Caryocar brasiliense during in vitro
cultivation and verify the influence of light on callus and shoot
induction. The study of the polarity influence on callus induction
was observed inoculating leaf segments on WPM. The influence
of light on callus induction was investigated inoculating leaf
explants on WPM supplemented with 1.0 mg L-1 TDZ and 2.0
mg L-1 2.4-D, and maintained under the presence and absence of
light. The influence of light on shoot induction was evaluated
inoculating nodal segments on WPM supplemented with 0.75
mg L-1 BAP and 0.05 mg L-1 NAA and maintained in the presence
and absence of light. For callus induction, inoculation of leaf
explants with the abaxial surface in contact with the cultivation
medium on the horizontal position showed better results. For
nodal explants, the horizontal orientation showed to be more
effective resulting in an average production of 3.88 shoots/explant
when compared with the vertical position (1.5 shoots/explant).
Callus induction was 38.31% higher in the absence of light. Shoots
induced on nodal segments developed better in the presence of
light.
Termos para indexação: Micropropagação, Caryocar
brasiliense, explante.
O cerrado é considerado um ecossistema com
recursos renováveis se manejado adequadamente.
Index terms: Micropropagation, Caryocar brasiliense, explant.
INTRODUÇÃO
(Recebido em 26 de maio de 2008 e aprovado em 19 de março de 2009)
20
SANTOS, B. R. dos et al.
Entretanto, vem sendo destruído e, com ele, espécies
frutíferas importantes que poderiam ser utilizadas com
propósito econômico e social (POZO, 1997).
O pequizeiro (Caryocar brasiliense A. St,-Hil.)
destaca-se pelo uso de seus frutos na culinária, extração
de óleos para a fabricação de cosméticos ou mesmo na
medicina popular para tratamento de problemas
respiratórios. Além disso, sua madeira é considerada de
ótima qualidade e resistência (ALMEIDA & SILVA, 1994).
Em razão da grande devastação do cerrado e matas
ciliares, a propagação natural do pequizeiro tem sido
comprometida e, além disso, suas sementes apresentam
sérios problemas de dormência tegumentar e presença de
inibidores (DOMBROSKI, 1997; MELO & GONÇALVES,
1991).
As dificuldades encontradas no processo de
propagação do pequizeiro por meio de sementes valorizam
a busca por soluções alternativas para a produção de
mudas de maneira rápida e eficiente, o que, sem dúvida,
pode significar um maior estímulo ao cultivo econômico
do pequizeiro. Nesse contexto, a cultura de tecidos
apresenta-se como uma solução que pode favorecer a
obtenção de mudas de pequizeiro, tornando possível a
produção destas em grande quantidade.
Os explantes inoculados in vitro normalmente
exibem uma acentuada polaridade na proliferação celular e
na morfogênese, de maneira a estarem relacionados com a
posição em que o órgão ou tecido se encontra na planta
intacta e também com sua orientação dentro do recipiente
de cultivo (SANTANA, 2003). Outro fator importante é
que na micropropagação não basta conseguir altas taxas
de multiplicação, o importante é obter uma taxa média
satisfatória por explante (ERIG & SCHUCH, 2002). Para
isso, é necessário estudar os fatores que influenciam as
respostas morfogênicas no cultivo in vitro de plantas.
Santos et al. (2006) estabeleceram protocolos de
micropropagação para o pequizeiro e relataram que o melhor
tratamento para indução de brotações foi aquele que
utilizou meio WPM suplementado com 0,05 mg L-1 de ANA
combinado com 0,75 mg L-1 de BAP, proporcionando a
maior taxa de multiplicação. Contudo, os autores não
trabalharam com os efeitos da influência da luminosidade
e polaridade na micropropagação dessa planta.
Neste trabalho objetivou-se avaliar o efeito da
polaridade de explantes foliares e nodais durante o cultivo
in vitro e estudar a influência da luminosidade na
calogênese e na indução de brotações in vitro de
pequizeiro, para otimização dos protocolos de cultura de
tecidos e a produção eficiente de mudas micropropagadas.
MATERIAL E MÉTODOS
Efeito da polaridade de explantes foliares na obtenção de
calos in vitro
Folhas retiradas de plantas matrizes mantidas em
sala de crescimento sob irradiância luminosa de 67 µmol
m-2 s-1, temperatura de 28 ± 3 ºC e umidade relativa média
de 63% foram lavadas em água corrente por 12 horas. Em
seguida, efetuou-se a desinfestação em câmara de fluxo
laminar, utilizando álcool etílico 70% por 1 minuto e
hipoclorito de sódio comercial (2,5% de cloro ativo) por
10 minutos, com subsequente lavagem, por três vezes,
em água estéril.
Após a assepsia, as folhas foram excisadas em
fragmentos de ± 3 cm2 e inoculadas em tubos de ensaio,
contendo 15 mL de meio WPM (Wood Plant Médium)
(LLOYD & MCCOWN, 1980), suplementado com 30 g L-1
de sacarose, solidificado com 7g L-1 de ágar e acrescido
com 1 mg L-1 de TDZ e 2 mg L-1 de 2,4-D. O pH do meio de
cultura foi ajustado para 5,8; autoclavado a 121ºC e pressão
de 1 atm, por 20 minutos. Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento com fotoperíodo de 16 h e temperatura
de 25 ±1ºC.
O experimento foi conduzido em delineamento
experimental inteiramente casualizado, com 2 tratamentos
e 25 repetições, sendo cada repetição composta por um
tubo de ensaio contendo um explante. O tratamento 1
correspondeu à inoculação do explante foliar com a
superfície abaxial voltada para o meio de cultivo e o
tratamento 2 correlata-se à inoculação do explante foliar
com a superfície adaxial voltada para o meio de cultivo.
Crescimento in vitro de pequizeiro (Caryocar...
Foram avaliados, aos 30 dias após a inoculação, a
porcentagem de calos formados e o peso da matéria fresca
dos mesmos.
A análise estatística dos dados foi realizada com
base no teste T-student, considerando significância de
5%.
Efeito da polaridade dos segmentos nodais na obtenção
de brotações in vitro
Foram utilizados segmentos nodais de pequizeiro,
com aproximadamente 1 cm, possuindo 2 gemas, obtidos
de plantas matrizes mantidas em sala de crescimento, sob
as mesmas condições citadas no item 1. Após a
desinfestação, os seguimentos foram inoculados em tubos
de ensaio, contendo 15 mL de meio WPM suplementados
e ajustados conforme item 1, porém acrescidos de 0,05 mg
L-1 de ANA; 0,75 mg L-1 de BAP e 800 mg L-1 de PVP. Os
explantes foram mantidos em sala de crescimentos com
fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25 ±1ºC.
inteiramente casualizado, constando de 2 tratamentos
21
Após a assepsia, as folhas foram excisadas em
fragmentos de aproximadamente 3 cm2 e inoculados em
tubos de ensaio, contendo 15 mL de meio WPM
suplementados e ajustados conforme item 1.
O experimento foi conduzido em delineamento
experimental inteiramente casualizado com 2 tratamentos e
15 repetições, em que o tratamento 1 correspondeu à
permanência dos explantes após a inoculação sob
irradiância de 36 µmol m-2 s-1, fornecida por lâmpadas
fluorescentes frias, com fotoperíodo de 16 horas, o
tratamento 2 correspondeu à permanência dos explantes
na ausência de luz. Os tratamentos foram mantidos a uma
temperatura de 25 ±1ºC.
Foi avaliada, aos 30 dias após a inoculação a
formação de calos, o peso da matéria fresca dos calos
formados e o aspecto visual dos mesmos. Para a análise
dos dados, foram utilizados os testes de T-student e Teste
de F, considerando significância de 5%.
Efeito da luminosidade na indução de brotações em
segmentos nodais de pequizeiro
(inoculação com a base do segmento inserido no meio de
cultivo na posição vertical e na horizontal) e 15 repetições,
cada uma composta por um tubo.
tamanho aproximado de 1 cm foram extraídos de plântulas
Aos 30 dias de cultivo, foram avaliados os números
germinação in vitro de sementes. Os materiais botânicos
de brotações, o número de gemas por explantes, o número
foram inoculados em meio WPM, acrescido de 800 mg L-1
de folhas, o comprimento da maior brotação e a taxa de
de PVP, 30 g L-1 de sacarose, 0,05 mg L-1 de ANA e 0,75 mg
multiplicação que se refere à razão entre o número de gemas
L-1 de BAP, sendo solidificado com 7 g L-1 de ágar, sendo o
obtidas como resposta aos tratamentos empregados e o
pH ajustado para 5,8 e autoclavado a 121ºC e pressão de 1
número de gemas iniciais contidas no explante utilizado,
atm, por 20 minutos.
Segmentos nodais, consistindo de 2 gemas e
com aproximadamente 6 cm de altura, obtidas por meio da
segundo metodologia descrita por Erig & Schuch (2000).
Após a inoculação, os explantes foram mantidos
Para este estudo, foi realizado o teste de Kruskall-Wallis
em sala de crescimento a uma temperatura de 25 ±1ºC na
(TRIOLA, 1999), considerando significância de 5%.
ausência de luz e em fotoperíodo de 16 h, irradiância de 36
Efeito da luminosidade na obtenção de calos in vitro a
partir de explantes foliares
µmol m-2 s-1. Aos 30 dias de cultivo, foram avaliados o
Folhas foram retiradas de plantas matrizes mantidas
em sala de crescimento e lavadas em água corrente por 12
horas, ao término das quais, efetuou-se a desinfestação
em câmara de fluxo laminar conforme procedimento descrito
no item 1.
de folhas, a taxa de multiplicação e o comprimento da maior
número de brotos, o número de gemas por explante, número
brotação. A taxa de multiplicação foi determinada
dividindo-se o número de gemas formadas por explante,
obtidos aos 40 dias, pelo número de gemas do explante no
momento da inoculação (ERIG & SCHUCH, 2002).
inteiramente casualizado com 2 tratamentos e 15 repetições,
sendo a unidade amostral composta por um tubo contendo
um explante. Para a análise dos dados foi utilizado o teste
de probabilidade Kruskall-Wallis (TRIOLA, 1999),
considerando significância de 5%.
Efeito da polaridade de explantes foliares na obtenção de
calos in vitro
Os resultados apresentados na Tabela 1 referem-se
à análise dos pesos obtidos da matéria fresca dos calos
formados em explantes foliares de pequizeiro nos dois
tratamentos. Os tratamentos não diferiram pelo teste tstudent para um nível de significância de 5%.
TABELA 1 Peso da matéria fresca dos calos formados
em explantes foliares de Caryocar brasiliense submetidos
a diferentes polaridades. Lavras, 2008.
Tratamento
Média
Abaxial (0)
0,319
Adaxial (1)
0,313
Esse resultado demonstra que, para a formação de
calos em explantes foliares de pequizeiro, não há
necessidade de se observar a posição em que este será
inoculando no meio de cultivo. O mesmo resultado foi
obtido por Martins et al. (2001) quando trabalharam com
explantes foliares de macieira.
Mesmo que os dados da porcentagem de indução
de calos não tenham sido significativos a 5% de
probabilidade, a diferença numérica da média de indução
obtida quando se inoculam os explantes com a superfície
abaxial em contato com o meio de cultivo (49,2%), chega
a ser 52% maior do que a superfície adaxial no meio de
cultivo (25,6%) (Figura 1). Do ponto de vista biológico, a
polaridade influenciou a calogênese in vitro de explantes
foliares de pequizeiro, sendo mais eficiente a inoculação
dos explantes com a superfície abaxial voltada para o
meio de cultivo.
60
49,2
50
Formação de calos (%)
22
40
30
25,6
20
10
0
Abaxial
Adaxial
Polaridade de inoculação
FIGURA 1 Médias de calos formados em função da
polaridade de inoculação dos explantes foliares de
pequizeiro. Lavras, 2008.
2 Efeito da polaridade dos segmentos nodais na obtenção
de brotações in vitro
A posição de inoculação dos segmentos nodais
(vertical ou horizontal) influenciou a resposta morfogênica
significativamente, segundo o teste de Kruskall-Wallis a
5% para o número de brotos formados por explante,
número de gemas observado e taxa de multiplicação
(Tabela 2).
TABELA 2 Médias para as variáveis: número de
brotações, de folhas, de gemas, comprimento e taxa de
multiplicação para segmentos nodais de pequizeiro para
orientação vertical e horizontal de inoculação. Lavras,
2008.
Variável
Tratamento
Médias
Número de
brotações
Vertical
8,00 a
Horizontal
23,0 b
Vertical
13,3 a
Horizontal
17,7 a
Vertical
9,00 a
Horizontal
22,0 b
Número de
folhas
Número de
gemas
Comprimento
Taxa de
multiplicação
Vertical
18,0 a
Horizontal
13,0 a
Vertical
9,00 a
Horizontal
22,00 b
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem
estatisticamente pelo teste de Kruskall-Wallis 5%.
As características comprimento da maior brotação
e número de folhas não apresentaram resultados
significativos. McClelland & Smith (1990), testando a
influência da orientação na indução de brotações em
segmentos nodais de Amelanchier spicata K. Koch., Acer
rubrum L., Malus domestica Borkh. e Betula nigra L.,
observaram que não houve diferença entre os
comprimentos das brotações desenvolvidas a partir dos
explantes inoculados na orientação horizontal e vertical. O
mesmo resultado foi observado por Erig & Schuch (2002)
para o comprimento da maior brotação em segmentos
nodais de macieira (Malus prunifolia).
Para todas as características avaliadas, os maiores
valores observados foram obtidos quando se inoculou o
segmento nodal na posição horizontal, embora não tenham
sido detectadas diferenças estatísticas pelo teste KruskallWallis (5%) para número de folhas e com maior brotação.
Ao se inocular os segmentos nodais na orientação
horizontal, induziu-se a formação de 3,88 brotos por
explante, em média, mais do que o dobro de brotos obtidos
nos explantes que foram inoculados na orientação vertical
(1,5 broto/explante). A orientação horizontal promoveu um
maior número de brotações por explantes em 5 espécies
lenhosas estudadas por McClelland & Smith (1990)
(Amelanchier spicata Lam., Acer rubrum L., Malus
domestica Borkh., Betula nigra L., Forsythia intermedia
Zab.), em relação à inoculação dos segmentos nodais na
orientação vertical, corroborando os resultados
encontrados neste trabalho.
Apesar da não significância estatística, as
brotações provenientes dos segmentos nodais inoculados
na orientação horizontal produziram 1,3 folha a mais do
que as brotações desenvolvidas a partir dos explantes
inoculados na orientação vertical. Antagonicamente, no
comprimento da maior brotação, os valores dos caracteres
avaliados foram maiores nas brotações provenientes dos
segmentos nodais inoculados na orientação vertical,
apresentando média de 12,14 mm, enquanto as brotações
provenientes dos segmentos nodais inoculados na
horizontal tiveram o comprimento médio de 9,88 mm.
23
Em relação ao número de gemas e à taxa de
multiplicação, os resultados dos explantes inoculados na
orientação horizontal foram quase três vezes maiores que
os obtidos pela inoculação destes na posição vertical. O
número de gemas por explante obtido pela inoculação na
orientação horizontal foi de 9,13 e, para os inoculados na
orientação vertical, 3,71. A taxa de multiplicação que é um
dos fatores mais importantes para a micropropagação de
uma espécie por fornecer mais explantes para os
subcultivos, foi em média, de 4,56 para os explantes que
foram inoculados na orientação horizontal, e de 1,86 para
os segmentos nodais inoculados na orientação vertical.
Segundo Erig & Schuch (2002) um maior número de
brotações, maior número de gemas e maior taxa de
multiplicação foram obtidos ao se inocular explantes nodais
de macieira (Malus prunifolia Steud.) na orientação
horizontal, assim como os resultados encontrados para a
indução de brotações em segmentos nodais de pequizeiro.
Santana (2003), ao estudar a influência da orientação
dos explantes na indução de brotações em fruta-do-conde
(Annona squamosa L.), observou resultados inversos ao
encontrado neste trabalho, tendo o melhor resultado sido
encontrado na inoculação dos explantes na posição
vertical, com média de 8,3 brotos/explante. Em seus estudos
com outras anonáceas, o autor relata que a influência da
polaridade no potencial morfogênico é um fenômeno
provavelmente ligado ao transporte de fitorreguladores
no explante. Pelos resultados deste trabalho, pode-se
sugerir que os segmentos nodais de pequizeiro inoculados
na posição vertical têm predominância de auxinas
endógenas, pois, segundo Taiz & Zeiger (2004), estas
inibem a formação de múltiplas brotações, estabelecendo
a dominância apical. A obtenção de um maior número de
brotações com o segmento nodal na orientação horizontal
deve-se, principalmente, à quebra da dominância apical
(ERIG & SCHUCH, 2002) que poderia ser ocasionada pela
maior concentração endógena de citocininas, em
detrimento do conteúdo de auxinas, o que explicaria o
surgimento de várias brotações no mesmo explante
inoculado na orientação horizontal. Taiz & Zeiger (2004)
24
comentam que a razão auxina/citocinina regula a
morfogênese de tecidos cultivados in vitro o que permite
inferir que a modificação da orientação do explante no
cultivo in vitro, pode sim alterar a relação endógena de
auxinas e citocininas, ocasionando respostas morfogênicas
diferentes.
Efeito da luminosidade na obtenção de calos in vitro a
partir de explantes foliares
Os resultados para porcentagem de formação de
calos e peso de matéria fresca não foram significativos
pelo teste Kruskall-Wallis (Tabela 3).
TABELA 3 Médias da porcentagem de formação de calos
e peso da matéria fresca dos calos em função dos
tratamentos utilizados. Lavras, 2008.
Tratamento
% de calogênese
Peso (g)
Claro
44,00
0,598
Escuro
71,33
0,784
Embora as análises estatísticas não demonstrem
resultados significativos, pode-se observar que a diferença
da porcentagem de indução de calos entre os tratamentos
foi 38,31% maior que na ausência da luz. Nogueira (2003),
trabalhando com murici-pequeno (Byrsonimia intermédia
A. Juss.), também obteve maior porcentagem de indução
de calos no cultivo in vitro na ausência de luz (90%),
quando comparado com o cultivo in vitro na presença de
luz (30%). Em estudos com o pequizeiro, Landa (2000)
obteve resultados semelhantes a estes, verificando maior
formação de calos na ausência de luz após os 20 dias de
inoculação, utilizando como reguladores de crescimento
combinações de ANA e BAP. Trabalhos com indução de
calos em Taxus spp. demonstraram que estes, induzidos
na presença de luz (fotoperíodo de 16 horas), apresentaram
pior aspecto visual e menor quantidade, quando
comparados com a indução na ausência de luz
(Wickremesinhe & Arteca, 1993).
O mesmo comportamento foi observado para o peso
da matéria fresca dos calos obtidos. Os explantes que foram
cultivados na ausência de luz obtiveram uma média de
0,784 g, sendo, portanto, 23,73% maiores em relação à média
do peso da matéria fresca obtida pelos explantes cultivados
na presença de luz. George (1996) comenta que o
crescimento de tecidos vegetais organizados no cultivo in
vitro geralmente não é inibido pela luz, entretanto, pode
ocorrer em alguns casos, no início das divisões celulares
de explantes.
Efeito da luminosidade na indução de brotações em
segmentos nodais de pequizeiro
Os resultados demonstrados na Tabela 4 referemse aos tratamentos que testam a influência da luz na
indução de brotações de pequizeiro por meio do teste
Kruskall-Wallis, considerando o nível de significância
fixado em 5%.
De acordo com o teste aplicado, não houve
diferença estatística entre os tratamentos no que diz
respeito às variáveis: número de brotos, de gemas e taxa
de multiplicação.
As brotações desenvolvidas no escuro não
apresentaram formação foliar diferindo significativamente
das desenvolvidas na presença de luz, as quais
apresentaram, em média, 2,27 folhas por brotação. Esses
resultados demonstram que para a indução de brotações
in vitro, os segmentos nodais devem ser cultivados na
presença de luz e que meios suplementados com BAP e
ANA favorecem a formação de brotações. Silva et al. (2008)
relataram que a micropropagação de laranja-azeda, a partir
de segmentos de epicótilo, é favorecida pela adição de
BAP e ANA, porém a ausência de luz foi prejudicial à
organogênese in vitro dessa espécie. Vale ressaltar que
variações obtidas na resposta morfogênica, associadas à
utilização ou não de fitorreguladores, devem estar
relacionadas, entre outros fatores, à concentração
endógena de auxinas e citocininas no tecido vegetal. A
suplementação do meio de cultura com citocinina,
principalmente o BAP, tem sido considerada fundamental
para se obter melhores respostas na organogênese in vitro
de diferentes espécies do Cerrado brasileiro
(MARTINOTTO, 2007; NICIOLI et al., 2008; NOGUEIRA,
25
TABELA 4 Médias para as variáveis: número de brotações, de folhas/brotação, de gemas (total), comprimento da
maior brotação e taxa de multiplicação em função da presença e ausência de luz em segmentos nodais de pequizeiro.
Lavras, 2008.
Luminosidade
Nº de brotos
Nº de folhas
Nº de gemas
Comprimento
Taxa de multiplicação
Ausência
3,40 a
0,00 a
8,80 a
28,13 a
4,40 a
Presença
3,60 a
2,27 b
9,07 a
9,67 b
4,53 a
* Médias seguidas da mesma letra não diferiram ao nível de significância de 5%.
2003; OLIVEIRA et al., 2008; SANTANA, 2003; SANTOS
et al., 2006).
Observa-se também, na Tabela 4, que o comprimento
médio da maior brotação apresentou diferença significativa
em resposta ao tratamento de luminosidade utilizado. As
brotações desenvolvidas na presença de luz apresentaram
comprimento médio de 9,67 mm. Rocha et al. (2008) e Santos
et al. (2006) relataram que o meio suplementado com BAP
estimulou maior altura das brotações em pequizeiro e
algodoeiro colorido em presença de luz, respectivamente,
e que a ausência de luz pode intensificar o crescimento.
ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W. Multiplicação in vitro do portaenxerto de macieira cv. Marubakaido: efeito da orientação
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CONCLUSÕES
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and improvement of Rhododendro spp. Hort Science,
Alexandria, v. 15, n. 3, p. 416, June 1980. Abstract 321.
A melhor resposta morfogênica foi obtida quando
os segmentos nodais de pequizeiro foram inoculados na
orientação horizontal e os explantes foliares voltados com
a superfície abaxial voltada para o meio.
Maior formação de calos foi obtida por meio do
cultivo dos explantes foliares na ausência de luz.
As brotações se desenvolveram melhor na
presença de luz e apresentaram maior comprimento ao serem
cultivadas na ausência de luz.
ALMEIDA, S. P.; SILVA, J. A. Piqui e Buriti: importância
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FACTORS AFFECTING
VITRO ofGERMINATION
OF
Factors affecting in IN
vitro germination
passion...
PASSION FRUIT SEEDS
27
FATORES AFETANDO A GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES
DE MARACUJAZEIRO
RODRIGO SOBREIRAALEXANDRE1, FLÁVIO ALENCAR D ARAÚJO COUTO2, JOSÉ MARIA MOREIRA DIAS3,
WAGNER CAMPOS OTONI4, PAULO ROBERTO CECON5, SIMONE BHERING DE SOUZA GOMES6
1
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Adjunto na Universidade Federal do Espírito Santo/UFES Centro Universitário Norte do
Espírito Santo/CEUNES Rua Humberto de Almeida Francklin, 257, Bairro Universitário 29933-415 São Mateus, ES
[email protected]
2
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Adjunto na Universidade Federal de Viçosa/UFV Avenida P.H. Rolfs Campus Universitário
36570-000 Viçosa, MG [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Adjunto na Universidade Federal de Viçosa/UFV - Avenida P.H. Rolfs Campus Universitário
4
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Associado na Universidade Federal de Viçosa/UFV Avenida P.H. Rolfs Campus Universitário
5
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Associado na Universidade Federal de Viçosa/UFV Avenida P.H. Rolfs Campus Universitário
6
Engenheira Agrônoma B&G Flores LTDA Ed. Sede FUNARBE, S/N Prédio Anexo - Sala 102 - Campus UFV 36570-000
Vicosa, MG.
ABSTRACT
The objective of this study was to standardize the in
vitro germination of yellow passion fruit seeds based on physical
treatments on the tegument in different consistency of the culture
medium and temperature control. A completely randomized design
was used with four replications of 30 seeds in a 4 x 3 x 6 factorial
design (physical treatments on the tegument: intact, scarified,
cracked and removed x culture medium consistency: liquid (0 g L1
), semi-solid (6 g L-1) and semi-solid (8 g L-1) x temperatures (22,
27, 32, 22-27, 22-32 and 27-32oC) totaling 72 treatments. The
most efficiency result for the in vitro development of passion
fruit axenic plantlets was achieved with the removal of the seed
tegument and cultivation on semi-solid culture medium (8 g L-1)
at 27oC.
Termos para indexação: Passiflora edulis f. flavicarpa,
propagação in vitro, dormência.
Index terms: Passiflora edulis f. flavicarpa, propagation in vitro,
dormancy.
grown material derived from in vitro-germinated seeds
RESUMO
Neste trabalho, objetivou-se padronizar a germinação in
vitro de sementes do maracujazeiro-amarelo com base em
tratamentos físicos no tegumento, em diferentes estados físicos
do meio de cultura e controle de temperatura. O delineamento foi
o inteiramente casualizado, com 4 repetições de 30 sementes, em
esquema fatorial 4 x 3 x 6 (tratamentos físicos no tegumento:
intacto, escarificado, trincado e removido x estado físico do meio
de cultura: líquido (0 g L-1), semi-sólido (6 g L-1) e semi-sólido (8
g L-1) x temperaturas: 22, 27, 32, 22-27, 22-32 e 27-32ºC),
totalizando 72 tratamentos. Para o desenvolvimento in vitro de
plântulas axênicas do maracujazeiro, o resultado mais eficiente
foi obtido com o tegumento da semente removido e cultivada em
meio semi-sólido (8 g L-1), à temperatura de 27ºC.
INTRODUCTION
Successful passion fruit tissue culture has often
been limited because it is heavily dependent on explants
derived from plants kept in a greenhouse (REIS, 2001).
This kind of explant presents a high contamination
percentage, especially of bacterial origin as reported by
several authors, whereas other authors have used in vitro(BIASI et al., 2000; DREW, 1991; HALL et al., 2000).
Passion fruit seed in vitro germination enables
axenic plantlets to be obtained and consequently
contamination-free explants ( DIAS et al., 2003; REIS, 2001).
Because these plants are juvenile, they have a high
morphogenetic response and depending on the results of
phytoregulator application, they may form complete plants.
Maciel et al. (1997) studied the growth and
development of passion fruit (P. edulis Sims f. flavicarpa
Deg.) seeds and analyzed the embryonic stage from the
point of view of germination and plantlet emergence.
(Recebido em 4 de abril de 2008 e aprovado em 23 de abril de 2009)
28
ALEXANDRE, R. S. et al.
Regarding seed morphology, they identified the existence
of one embryonic axis (hypocotyls-rootlet), two laminar
cotyledons, a yellowish endosperm, a hard episperm with
internal evaginations and external invaginations, and the
embryo was situated in the thinnest region of the seed.
According to Morley-Bunker (1974) the seeds in
the Passifloraceae family present a tegumentary
impediment that hinders the seed imbibition process. Thus
mechanical processes are recommended to remove the
tegument and improve the environmental conditions for
fast and uniform germination. However, in an attempt to
make the germination uniform, several studies were carried
out for mucilage removal in passion fruit seeds searching
for a technique that would not physically damage any seed
structure, for instance, pre-germination treatments from
the effect of fermentation and drying (SÃO JOSÉ &
NAKAGAWA, 1987), fermentation alone (CARDOSO et
al., 2001; MELETTI & MAIA, 1999; SANTOS et al., 1999),
friction in a sieve, abrasion with lime and immersion in
hydrochloric acid (PEREIRA & DIAS, 2000).
Dias et al. (2003) assessed different methods of
preparing seeds by treatments applied to the tegument
and their influence on germination. In this case, it was
ascertained that tegument absence resulted in a higher
germination index.
Passion fruit (P. edulis Sims f. flavicarpa Deg.) seed
germination is being studied to identify efficient methods
to ensure uniform germination. There are many problems,
including the use of seeds from non-selected plants
(BATISTA & GOMES, 1981), the presence of growth
regulating substances (PEREIRA & DIAS, 2000) and the
presence of impermeable tegument on the seed (DIAS et
al., 2003; REIS, 2001). In vitro seed germination reduces
cultivation time and increases the efficiency of the process
and uniformity of the plantlets.
The objective of this study was to standardize the
yellow passion fruit (P. edulis Sims f. flavicarpa Deg.)
germination based on physical treatments of the tegument
in different culture medium physical states and at different
temperatures.
MATERIALS AND METHODS
The experiment was carried out in the Plant Cell
and Tissue Culture Laboratory of the Plant Science
Department the Federal University of Viçosa, in Viçosa,
MG, Brazil.
The seeds were derived from ripe oval evenly
colored fruits with a thin peel, completely full internal cavity
and high juice yield, from productive plants without pests
or diseases, collected from a single passion fruit tree from
an open-pollinated in the orchard.
The seed aril was removed under laboratory
conditions using a fine mesh sieve. The seeds were gently
and carefully pressed against the sieve mesh after covering
them in dead lime. The seeds were then washed in tap
water to remove all the dead lime and placental remains.
Afterwards, they were dried in the shade on a paper towel
for three days. After drying and selection, the seeds were
divided into four batches, prepared as follows: the first
batch consisted of seeds with an intact tegument; in the
second batch the tegument was scarified manually at the
opposite end to the thin part of the seed using sandpaper
no. 220; in the third batch, the tegument was cracked using
a minimorse; and in the fourth batch, the external tegument
(episperm) was completely removed mechanically using a
minimorse.
Separately, and at the same time, seeds from each
batch were disinfected in a laminar flow chamber. Initially,
they were submitted for one minute to a 70% (v/v) ethanol
solution, followed by three washings and immediate
immersion in sodium hypochlorite solution at 2.0-2.5% (v/
v) of commercial product (Super Globo®, Brazil), for five
minutes, and then washed for periods of 5, 10, 10 and 10
minutes, respectively, under constant agitation in deionized and autoclaved water.
The culture medium for seed germination consisted
of MS mineral nutrients Murashige & Skoog (1962), 100
mg L-1 myo-inostol, 0.5 mg L-1 pyridoxine, 2.0 mg L-1 glycine,
0.5 mg L-1 nicotinic acid, and 30 g L-1 sucrose. Regarding
the physical state, the culture medium was prepared with 6
and 8 g L-1 agar (Isofarma®, Brazil) agar, and the seeds in
Factors affecting in vitro germination of passion...
the liquid culture medium were supported by a Germitest®
paper bridge with central perforation where the thinnest
region of the seed was inserted. The culture medium pH
was adjusted to 5.7 ± 0.1 before the addition of agar melted
in a microwave oven. Aliquots of 10 mL of this culture
medium were placed in 25 x 150 mm test tubes. The test
tubes were sealed closed immediately with a transparent
polypropylene transparent lid and the edges were
protected with transparent PVC film (Rolopac®) and they
were then autoclaved at 121oC and 1.5 kg cm-2 pressure, for
20 minutes.
The seeds were sown on the culture medium one
per test tube. After sowing, the tubes were closed again,
and placed soon afterwards in appropriate racks and
wrapped in aluminum foil.
The cultures were transferred to a BOD (FANEM
BOD, model 347-6, Brazil) at constant temperatures of 22oC,
27oC, and 32oC and alternated temperatures of 22-27oC, 2232oC and 27-32oC (with 8 hours at the highest temperatures
and 16 hours at the lowest temperature, in the case of the
alternated temperatures). Aluminum foil was used to protect
the seeds from light because they are classified as
photoblastic negative.
The first count of the germination test was carried
out on the 7th day and the final germination on the 28th day
after sowing (BRASIL, 1992). Germination tests were
performed on three samples of 10 seeds from each of the
four batches, prepared as previously described and sown
individually in a test tube containing the culture medium
in the three physical states: liquid, solidified with 6 g L-1
and 8 g L-1 agar. The germinated seeds were counted on
the 7th, 14th, 21st and 28th days after sowing to assess the
germination percentage and daily to calculate the
germination speed index (MAGUIRRE, 1962). The seed
vigor was assessed by the GSI and hypocotyl length on
the 28th day.
The experiment was set up in a totally randomized
design, with four replications in a 4 x 3 x 6 factorial scheme
(physical treatments in the seed tegument x different
physical states of the culture medium x temperature control)
29
with split plots totaling 72 treatments. Each plot consisted
of 30 test tubes. The data was submitted to analysis of
variance, the normality and homogeneity test that indicated
that data transformation was not necessary. The means
were submitted to the Tukey test at a level of 5% probability.
RESULTS AND DISCUSSION
The presence of the total or partial tegument in the
seeds with intact, scarified or cracked tegument delayed
germination on the 7th day after sowing, when the seeds
were cultivated in three types of culture medium and kept
under the fixed and alternated temperatures. In the seeds
with intact or scarified tegument, the germination process
was null, and the seeds with the cracked tegument obtained
germination rates of 20% at most (Figure 1a). Figure 1a
also shows the results of 100% germination obtained with
the tegument completely removed at the temperatures of
22oC in all the culture mediums; 27oC in the semi-solid (6 g
L-1 and 8 g L-1 agar); 22-32oC in the semi-solid culture medium
(8 g L-1 agar) and 27-32oC in the liquid culture medium from
the first germination count, showing the importance of
tegument removal in the passion fruit seed germination
process.
The germination test indicated that complete
tegument removal was the best physical treatment (Figures
1 and 2, a and b). Furthermore, at 14 days (Figure 1b) the
seeds without tegument in most treatments had completed
their germination. According to Dias et al. (2003) and Reis
(2001) tegument absence provides a higher germination
rate, indicating that the passion fruit tegument presents a
possible resistance to oxygen diffusion and water
absorption. It is probable that with the decrease in
temperature (22oC) the respiratory metabolism has been
incipient demanding small amounts of oxygen for the full
germination process, thus reaching maximum germination
in all culture mediums (Figure 1a). It can further be deduced
that the oxygen concentration in the test tubes was
sufficient to meet the requirements of the germination
process, a fact reported in studies by (EDWARDS, 1973)
where the oxygen absorbed by intact seeds had a reduced
30
effect, indicating that the tegument presented resistance
to oxygen diffusion.
Seeds with scarified tegument sown on semi-solid
culture medium with 8 g L -1 agar under alternated
temperatures (22-32oC) resulted in 100% at 14 days (Figure
1b) germination in contrast with the data obtained on the 7th
day (Figure 1a) when this rate was null. The highest
germination rates recorded for seeds with scarified, cracked
or intact teguments (the latter with inferior results) were
obtained under alternated temperatures of 22-32oC on the
14th day after sowing (Figure 1b). This result is similar to that
reported by (SANTOS et al., 1999) where the most suitable
temperature for passion fruit (P. edulis Sims f. flavicarpa
Deg.) seed germination was 20-30oC alternated, while at 25oC
higher percentages of hard and dead seeds were detected.
It is likely that temperature alternation acts on the
seed tegument, making them more permeable to water and
oxygen and it also seems to influence the balance among
the germination promoting and inhibiting substances
(CÍCERO, 1986). Pereira & Andrade (1994) recommended
the use of alternated temperature (20-30oC) for Passiflora
edulis Sims. seed germination. Osipi & Nakagawa (2005)
analyzed Passiflora alata Curtis seed germination under
controlled temperatures and reported that the best results
were obtained with alternated temperatures of 20-30oC with
higher percentage values for seeds with primary root
emission and for normal plantlets, and lower percentages
for abnormal plantlets. However, to make routine tissue
culture laboratory work easier and based on these results,
27oC is recommended for the in vitro passion fruit (P. edulis
Sims f. flavicarpa Deg.) germination process, which does
not require the use of special incubators of the BOD type,
or altering the cultivation room temperature that is generally
around 27oC.
At 21st day after sowing higher germination rates
were obtained at 22oC, 27 and 32oC in the seeds without
tegument, regardless of the culture medium consistency
(Figure 2a).
Germination was generally greater when
temperatures of 22oC and 32oC were alternated, regardless
of the physical state of the semi-solid culture medium for
scarified seeds and the semi-solid medium (6 g L-1 agar) for
intact seeds (Figure 2b). This shows the interactive effect
of the culture medium physical state and temperature in
the in vitro germination process of passion fruit seeds.
Within the Passiflora genus, the species responds
differently to temperature treatments (BENVENUTTI et al.,
2001). These authors ascertained that in Passiflora
incarnata L. optimal germination occurred at 35oC and that
variation of 5oC in the temperatures promoted a decrease
in the germination rate of 50 and 15% for 30oC and 25oC,
respectively. This was not observed in the present study,
where optimal germination (100%), regardless of the culture
medium consistency, was obtained at 22oC, 27oC and 32oC
in the seeds without tegument on the 21st day after sowing
(Figure 2a). Also, when Dias et al. (2003) completely
removed the passion fruit (P. edulis Sims f. flavicarpa Deg.)
seed tegument, 97% germination percentage, a higher
percentage of plants 7 centimeters or more in length longer
(83%) and a more rectilinear plantlet architecture were
obtained. According to Reis (2001) seeds without tegument
formed normal plantlets that reached an average length of
13.26 ± 3.88 cm 28 days after the experiment was set up.
When the data in Figure 2b (28th day) are compared
with those in Figure 1a (7th day) it is clear that of all
treatments, associating the effect of the culture medium
physical state and temperature levels to seeds without
tegument that had not yet reached 100% germination on
the 7th day, only those submitted to the solid culture
medium semi-solid with 6 g L-1 agar and 27oC and to liquid
culture medium and temperatures of 32oC and 22-27oC
attained 100% germination on the 28th day of incubation.
The low germination percentages in seeds with
intact tegument may be due to impeded water imbibition,
embryo emergence and the presence of some germination
inhibitors in the tegument. However, there was no
germination until the 28th day for 22oC, 27oC, 32oC and 2223oC in the seeds that were not submitted to physical
treatments on the tegument (Figure 2b). Similar results were
observed by Dias et al. (2003) in passion fruit (P. edulis
Cracked
Aa
Aa
Aa
Aa
Abb
Bb Bb
Ac
Ab
Aa Aba
Bb
Bb Bb
Ba
Ba
Bb
Ba
b
Intact
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
Aa
Ab
Ac
Ba
Ba
Ba
Ba Ba Ca
Ca
Ba Ba Ca
Ba Ba Ca
Bb Bb
Aa Aa Aa
Aa
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ab
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Ab
Ab
Ab
Ab
Ab
Bb Bb
Aa Aa
Aa
Aa Aa
Aa
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aa Aa
22
27
Aa
Bb Bb Bb
Bb
32
Bb
22-27
Aa
Bb
Bb Bb
22-32
Removed
Germination (%)
Germination (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
31
Removed
27-32
Aa
Ba
Ba
Ab Ab
Bb
Bc
Ca
Ca Ca
Db
Db
22
Db
Ca
Db
27
Db
32
Db Db
22-27
22-32
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aa
Ab
Cc
Bb
Aa
Da
Cb
Ca
Cb
Bc
Da
Da
Db
Semi-
Semi-Solid (8 g L )
Ca
Ba
Eb
Db
Eb
27-32
Temperature (ºC)
-1
Scarified
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Cracked
Germination (%)
Temperature (ºC)
-1
Semi-Solid (6 g L )
-1
Semi-Solid (6 g.L-1)
Liquid (0 g.L-1)
Liquid (0 g L-1)
FIGURE 1 Mean in vitro germination percentage on 7th (a) and 14th (b) days of passion fruit seeds submitted to
physical treatments on the tegument, in culture medium in different consistency and temperatures conditions. (*):
Means followed by the same upper case letters for the temperatures and the same lower case letter for the culture
medium do not differ by the Tukey test at 5%.
Sims f. flavicarpa Deg.) seeds with intact tegument when
incubated in vitro at 27 ± 2oC in a growth room. This
indicates that the mechanical barrier imposed by the
tegument is reflected in a more extended period of primary
root extension, according to of the post-seminal
morphology development in P. edulis Sims (PEREIRA &
ANDRADE, 1994). São José & Nakagawa (1987) reported
that treatments for seed mucilage removal alone without
establishing any physical treatment for the tegument were
not sufficient to obtain maximum germination values.
Nevertheless, total tegument removal and quick sowing
on culture medium prevent possible water losses and
maintain seed viability, as reported by (PINHEIRO et al.,
2001).
The germination speed index (Figure 3) reached
higher values in seeds with totally removed tegument and
cultured onto semi-solid (8 g L-1 agar) and liquid media at
22-32oC and 27-32oC, respectively. Greater hypocotyl length
(average 120 mm) were observed from seeds with the
tegument fully removed, and cultivated onto semi-solid
medium with 8 g L-1 agar at 32oC (Figure 4). In the seeds
with intact, scarified or cracked tegument, the total or partial
tegument presence in the seed jeopardized the hypocotyls
development (Figure 4).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Bb
50
40
30
20
10
0
Bc
Ba Ca Ca
Ba Ca Ca
Ba Ca
Ca
Ba Ca Ca
Aa
Aa
Ab
Ab
Abc
Abb
BCb
Ca
Ca
Ba
BCb
BCa
Ba
Ca
Bb
Aa
Ab
Aa
Ba
Bb
Bc
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
b
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aa
Ca
Ab Ab
Bb
Bc
Cb
Da
Cracked
Germination (%)
Aa
Ba
Ca
Db
Dc
Ea Da
Eb
Eb
22
Eb
Ec
27
32
22-27
22-32
Ca
Ba
Bb
BCb
BCc
Ba
Ca
Aa
Cb
Da
Aa
Aa
Aa
Aa Aa
Aa
Aa Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa Aa
Ba
Ba
Ab
Ca
Cb
Bb
Cc
Da
Da
Db
Ea
Eb
Eb
Db
Eb
Aa Aa Aa
Ec
Aa Aa Aa
Aa
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aa
Bb Bb
22
27-32
27
32
22-27
Bb Bb
22-32
Aa
Bb Bb
27-32
Temperature (ºC)
T emperature (ºC)
Semi-Solid (8 g L-1)
Bb
Ca
Aa Aa Aa
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ab
Ab
Ba
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ba
Ca
Aa
Aab
Aa Aa Aa
Cracked
Aa
Scarified
Ab
Aa
100
90
80
70
60
Removed
Intact
Ab
Intact
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aa
a
Scarified
Germination (%)
Germination (%)
Germination (%)
Aa
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Removed
32
Semi-Solid (6 g L-1)
Liquid (0 g L-1)
FIGURE 2 Mean values of the in vitro germination test of passion fruit seeds on the 21st (a) and 28th (b) day, submitted
to physical treatments on the tegument, in culture medium in different consistency and temperatures conditions. (*):
Despite having reached germination uniformity in
seeds without tegument at 22oC and 27oC from day 14
onwards (Figure 1b), these temperatures in the in vitro
culture medium did not confer greater length in the passion
fruit hypocotyls (Figure 4).
Complete tegument removal also favored a high
germination speed index (GSI, Figure 3) when these seeds
were sown in a semi-solid (8 g L-1 agar) and liquid culture
Ba Ba Ba
Ba Ba Ba
Ba Ba Ba
Ba Ba Ba
Aa
ABa
Ba
Ca
Bb
22
Ba
BCa
Ab
ABa
ABb Bb
27
32
Aa
Aab
ABc
Bb
ABb ABa
Cb
22-27
22-32
Scarified
4,0
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
4,0
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
33
Bb
Cab
Bb
BCa BCa
Bb
Cb
Aa
Abb
Ba
ABCb
Abb
ABCa
BCa
Ab
Aa
CDa
Dd
27-32
BCab
CDa
BCa
BCDb
Ec
22
27
32
Temperature (ºC)
Aa
Aa
Ab Aab
Ba
Ba
BCb
Ba
Aa
Abc
Removed
Aa Ab Aa
Ab Aa Aa
Cracked
4,0
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
Intact
4,0
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
GSI
GSI
CDb
DEb
Db
22-27
22-32
27-32
Temperature (ºC)
Liquid (0 g.L-1)
Aa
Ab
Ba
Ca
Cc
Eb Da
Da
Db
Fb
Ac
Bb
Cb
Dc
Fa
Bc
Eb
Dc
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Cracked
Hypocotyl length (mm)
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Scarified
FIGURE 3 Mean values of germination speed index (GSI) of passion fruit seeds submitted to physical treatments on
the tegument, in culture medium in different consistency and temperatures conditions. (*): Means followed by the
same upper case letters for the temperatures and the same lower case letter for the culture medium do not differ by the
Tukey test at 5%.
Aa
Ba
Cb
Fb
Ea
Dc
Da Db
27
Ac
Da
Bc
Ec
Fb
22
Ca
Ab
32
Eb
22-27
Bb
Cc
22-32
27-32
Temperature (ºC)
Aa
Ac Ab
Ba
Ba
Cb
Ca
Da
Ea
Bc
Cb
Db
Fc
Dc
22
27
32
22-27
Removed
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Eb Fc
Fb Ec
22-32
27-32
Temperature (ºC)
Liquid (0 g.L-1)
th
FIGURE 4 Mean hypocotyls length (28 day) of plantlets from in vitro germinated passion fruit seeds, submitted to
physical treatments on the tegument, in culture medium in different consistency and temperatures conditions. (*):
34
medium and kept at alternated temperatures of 22-32oC and
27-32oC, respectively. Probably in the first case the
consistency of the solid culture medium allowed the seeds
to benefit from the gaseous environment inside the test
tube, even when at the alternated temperatures of 22-32oC
the environmental variation was 10oC. In the second case,
in liquid culture medium, the best result may have been
due to a smaller, 5 o C, variation in the incubation
environment at the alternated temperatures of 27-32oC.
These findings, based on in vivo studies, showed that
regardless of the species, adequate water supply, gas
composition and suitable temperatures are fundamental
factors for germination ( BEWLEY & BLACK, 1994;
MAYER & POLJAKOFF-MAYBER, 1982). The semi-solid
culture medium was indicated as the most suitable for the
in vitro germination process because it presented the best
results and easy handling.
CONCLUSIONS
For the development of in vitro yellow passion fruit
axenic plantlets, it is recommended that the tegument be
completely removed from the seed.
The germination in vitro of seeds of the passion
fruit plant facilitates the work not having need of
incubators and nor of alterations in the temperature of the
cultivation room.
For the handling easiness the semi-solid middle was
indicated as the most appropriate for the process of
germination in vitro of seeds of that species.
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36
ASSEPSIA DE RIZOMAS
E ÁPICES
CAULINARES DE
RODRIGUES,
T. M. et al.
Curcuma alismatifolia
ASEPSIS OF Curcuma alismatifolia RHIZOMES AND SHOOT TIPS
TATIANA MICHLOVSKÁ RODRIGUES1, JOSÉ MAGNO QUEIROZ LUZ2, LEANDRO DE OLIVEIRA LINO3,
CARLOS RIBEIRO RODRIGUES4, GERALDO BATISTA DE MELO5
1
Engenheira Agrônoma, Dra, Pós-doutoranda Instituto de Ciências Agrária/ICIAG Universidade Federal de Uberlândia/UFU Av.
Amazonas, s/n BL 2E Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected].
2
Engenheiro Agrônomo, Dr, Professor do Instituto de Ciências Agrária/ICIAG Universidade Federal de Uberlândia/UFU Av.
Amazonas, s/n BL 2E, Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected]
3
Graduando em Agronomia Instituto de Ciências Agrária/ICIAG Universidade Federal de Uberlândia/UFU Av. Amazonas, s/n
BL 2E Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected]
4
Engenheiro Agrônomo, Dr., Pós-doutorando Instituto de Ciências Agrária/ICIAG Universidade Federal de Uberlândia/UFU Av.
Amazonas, s/n BL 2E Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected].
5
Odontólogo, Dr., Professor Instituto de Ciências Biomédicas Universidade Federal de Uberlândia/UFU Av. Amazonas, s/n BL
2E Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected]
RESUMO
O gênero Curcuma apresenta potencial para expansão
no mercado de plantas ornamentais. Sua propagação é basicamente
por divisão de touceiras rizomatosas, porém esta prática
dissemina doenças fúngicas e bacterianas. Nesse contexto, a
micropropagação possibilita a produção de material livre de
microorganismos, em maior quantidade e em menor tempo. Neste
trabalho objetivou-se determinar assepsia específica dos rizomas
de C. alismatifolia Gagnep. para inoculação in vitro e detectar
fungos e bactérias presentes no material contaminado. Foi realizada
uma pré-assepsia do rizoma e aplicados os tratamentos em
delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 8
com quatro repetições, sendo cinco diferentes períodos de imersão
(0, 10, 20, 30 e 40 minutos) dos ápices caulinares em diferentes
concentrações (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70% v v-1) de solução
comercial de hipoclorito de sódio. Foram inoculados os ápices
caulinares no meio de cultura MS, contendo 2 mg L-1 de BAP
acrescido de 7 g L-1 de ágar, 30 g L-1 de sacarose e pH de 5,8. Para
a assepsia, o melhor tratamento foi de 40 minutos de imersão em
solução comercial de hipoclorito de sódio de 40% (v v-1). Não foi
detectada presença de agentes fúngicos, porém ocorreu o surgimento
de bactérias tanto Gram positivas como negativas no formato de
bastonetes. São necessários mais estudos para a descontaminação
e identificação das bactérias para melhor combatê-las e obter maior
sucesso no estabelecimento in vitro dessa espécie.
Termos para indexação: Desinfestação, micropropagação,
Zingiberaceae, Curcuma alismatifolia.
ABSTRACT
The genus Curcuma has great expansion potential on the
ornamental plants market. Its propagation is basically obtained
by the division of rhizomes; however, this practice spreads fungal
and bacterial diseases. In this context, micropropagation allows
the high production of material free of microorganisms in a short
period of time. This study determined the specific asepsis of
C. alismatifolia Gagnep. rhizomes for in vitro inoculation and to
detect the fungi and bacteria present in the contaminated material.
A pre-asepsis of the rhizome was done and the treatments applied
in a complete randomized design, 5 x 8 factorial, with four
replicates and five different immersion periods (0, 10, 20, 30 and
40 minutes) of the sprouts in different concentrations (0, 10, 20,
30, 40, 50, 60 and 70% v v-1) of commercial sodium hypochloride
solution. Shoot tips were inoculated in MS culture medium
containing 2 mg L-1 BAP added to 7 g L-1 agar, 30 g L-1 sucrose
and pH adjusted to 5.8. The best treatment for asepsis was 40
minutes immersion in 40% sodium hypochloride solution. No
fungi were found; however, both negative and positive Gram rod
shaped bacteria were observed. Studies of disinfection and bacteria
identification are still needed in order to obtain higher success for
the in vitro establishment of this species.
Index terms: disinfestation, micropropagation, Zingiberaceae,
Curcuma alismatifolia.
INTRODUÇÃO
O cultivo de flores tropicais tem-se tornado uma
atividade agrícola cada vez mais importante no Brasil,
decorrente da alta demanda do mercado de plantas
ornamentais. Dentre as famílias com potencial para
expansão desse mercado, está a Zingiberaceae que possui
o gênero Curcuma como destaque. Esse gênero tem
espécies que são utilizadas como tempero e também
apresentam propriedades medicinais, óleos essenciais, além
de serem utilizadas como flor de corte, de vaso e como
plantas aplicadas no paisagismo. Como produto
ornamental, a Curcuma alismatifolia Gagnep. é
(Recebido em 9 de maio de 2008 e aprovado em 7 de maio de 2009)
Assepsia de rizomas e ápices caulinares...
comercializada no mercado externo como flor de corte e
como rizoma (PINTO & GRAZIANO, 2003).
A propagação do gênero Curcuma é basicamente
por divisão de touceiras rizomatosas. Em razão dessa prática
de propagação vegetativa tradicional, existe a preocupação
de disseminação de doenças causadas por bactéria
(Ralstonia solanacearum) (THAMMAKIJJAWAT et al.,
1999; VUDHIVANICH, 2002), nematóide (Meloidogyne
incógnita) e fungo (Colletotrichum gloeosporioides
(Penz.) Penz. & Sacc.e Rhizoctonia solani J. G. Kuhn.)
(LINS & COELHO, 2004). Ralstonia solanacearum,
anteriormente Pseudômonas é uma espécie heterogênea,
presente nos solos primitivos, e possui variabilidade tanto
genética como fenotípica (HOLT et al., 1994; HORITA &
TSUCHIYA, 2000). A bactéria tem sido relatada por causar
murcha em plantas da família das Zingiberaceae como na
curcuma e tomate (HUANG & ALLEN, 2000).
Rizomas infectados por Ralstonia solanacearum
ficam com aspecto encharcado, incapaz de ocorrer novas
brotações e, eventualmente, morre. Se ocorrer a brotação
de rizomas infectados, após o aparecimento da murcha, as
folhas ficam em tom marrom secam desde o topo até o
pseudocaule da planta. Em última análise as plantas
morrem, enquanto que a bactéria ainda permanece no solo,
se não for retirados as partes contaminantes. Atualmente,
muitos agricultores utilizam produtos químicos para
controle de R. solanacearum, mas este procedimento
resulta uma grande contaminação do solo (THONGWAI
& KUNOPAKARN, 2007).
Nesse contexto, com a propagação in vitro, estes
problemas são minimizados, pois esta técnica possibilita a
aquisição de material propagativo vegetal livre de
microorganismos. Além disso, por meio da
micropropagação pode-se obter maior quantidade de
mudas em um curto período de tempo, quando comparado
com a propagação vegetativa tradicional.
A principal etapa da micropropagação sofrida por
um explante é o estabelecimento in vitro do material a ser
multiplicado e para tanto, tem de se determinar a melhor
metodologia para desinfestação dos explantes a serem
37
inoculados para que esta etapa tenha sucesso (SOUZA et
al., 2006).
Em alguns casos, a presença de bactérias nas
plantas in vitro é detectada após algum tempo de cultivo,
com a formação de colônias ao seu redor, geralmente
quando um grande número de plantas já está em produção.
Além disso, por serem de difícil visualização, são facilmente
transmitidas de um material para outro durante a
manipulação dos explantes para a inoculação in vitro.
Quando as condições do meio de cultura (nutrição, pH)
tornam-se favoráveis ao seu desenvolvimento, os
microorganismos passam a competir por nutrientes minerais
e carboidratos do meio de cultura, comprometendo a
multiplicação e o desenvolvimento dos cultivos, podendo
levá-los rapidamente à morte. Essa deterioração dos
explantes está relacionada com a produção de metabólitos
fitotóxicos pelos microorganismos, tais como os ácidos
láctico, acético e cianeto (PEREIRA et al., 2003).
A técnica de coloração de Gram é muito importante
para a caracterização de amostras de bactérias, pois facilita
a visualização das bactérias ao microscópio óptico, para a
determinação da morfologia, do tamanho das amostras
analisadas e também possibilita a classificação das
bactérias Gram positivas e Gram negativas (FERREIRA &
SALGADO, 1995).
Diante do exposto, neste trabalho, objetivo-se
determinar uma assepsia eficiente para os rizomas de
Curcuma alismatifolia reduzindo a contaminação in vitro
por microorganismos, detectar a presença de fungos e
bactérias e quando bactérias, verificar se são Gram
positivas ou negativas.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de
Biotecnologia do Instituto de Ciências Agrárias (ICIAG)
da Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Uberlândia,
MG, Brasil. Após a aquisição dos rizomas de Curcuma
alismatifolia em vasos, estes foram mantidos em casa-devegetação para sua manutenção até o momento da
montagem do experimento.
38
RODRIGUES, T. M. et al.
Para a montagem do experimento, os rizomas foram
lavados em água corrente, fazendo uso de detergente neutro
e escova para retirada do excesso de solo, tomando cuidado
para não danificar o tecido do rizoma. Logo em seguida, foi
realizada uma pré-assepsia que consistiu em imersão dos
rizomas em água a 52 °C, durante 10 minutos, reduzindo
dessa maneira a contaminação bacteriana. Em seguida,
foram imersos em álcool 70% por 2 minutos e posterior
imersão destes em solução comercial de hipoclorito de sódio
a 20% (v v-1) por 5 minutos acrescido com 2 gotas de
detergente neutro.
O material vegetal previamente limpo foi colocado
imediatamente em frascos, contendo água destilada e
autoclavada e levados à câmara de fluxo laminar para
aplicação dos tratamentos.
O delineamento experimental foi o inteiramente
casualizado em esquema fatorial 5 x 8 com quatro repetições,
sendo cinco diferentes períodos de imersão dos rizomas
em solução comercial de hipoclorito de sódio (0, 10, 20, 30
e 40 minutos) e oito concentrações deste (0, 10, 20, 30, 40,
50, 60 e 70% v v-1). Após imersão nos tratamentos, os
rizomas foram enxaguados três vezes em água destilada e
autoclavada. Cada tubo de ensaio continha um ápice
caulinar (meristema) e este considerado uma parcela e cada
repetição composta por quatro parcelas.
O meio de cultura foi o de Murashige & Skoog
(1962) (MS) contendo 2 mg L-1 de 6-benzilaminopurina
(BAP) acrescido de 7 g L-1 de ágar, 30 g L-1 de sacarose e o
pH foi ajustado para 5,8. Posteriormente, realizou-se
autoclavagem à 121°C, 1 atm por 20 minutos, e após o
resfriamento e solidificação do meio, inocularam-se os
ápices caulinares (cerca de um milímetro de diâmetro) que
foram extraídos dos rizomas com o auxílio de uma lupa e
bisturi. Os explantes foram mantidos em sala de crescimento
com temperatura de 26 ± 1°C e com fotoperíodo de 16 horas
de luz num período de 30 dias.
A variável analisada após 30 dias da inoculação foi
a porcentagem de material não contaminado. O resultado
obtido foi submetido à análise de variância com o auxílio
do programa SISVAR®. Os dados em porcentagem, por
não apresentarem homogeneidade e normalidade, foram
transformados para: arcsen x 100 (BANZATTO &
KRONKA, 1992).
Observou-se também o tipo de contaminantes
(fungo e/ou bactéria) e quando bactéria, sua separação
por grupo (Gram positiva ou negativa). As colônias
bacterianas foram isoladas com base nas características
fenotípicas (pigmentação) e realizou-se o teste tintorial de
coloração de Gram (HUMPHRIES, 1974).
No teste de interação entre o tempo de imersão e a
concentração da solução comercial de hipoclorito de sódio,
houve efeito significativo de 1% de probabilidade pelo
teste de F. O desdobramento mais adequado foi a
concentração da solução comercial de hipoclorito de sódio
dentro do tempo de imersão.
Somente nos tratamentos onde os rizomas
permaneceram na concentração de 40% (v v-1) durante 40
minutos em imersão na solução comercial de hipoclorito
de sódio, obteve-se resposta significativa de 1% de
probabilidade e tendo uma curva quadrática (Figura 1).
Trabalhos foram feitos com brotos de Curcuma
zedoaria Roxb., quando se preparava o rizoma de forma
que o cultivava até a formação dos brotos e estes eram
desinfestados com solução comercial de hipoclorito de
sódio na concentração de 20% e imersão em 20 minutos e
feita a inoculação (MELLO et al., 2000). A diferença entre
os resultados de Curcuma zedoaria e da Curcuma
alismatifolia desenvolvidos no presente trabalho, devese à diferentes estágios de desenvolvimento dos tecidos
vegetais em que se extraiu o explante.
Em Curcuma zedoaria, Mello et al. (2000) fizeram
uso de tecido jovem, sendo necessário esperar que as
gemas presentes nos rizomas se desenvolvessem até a
formação dos brotos, para poder realizar a retirada do ápice
caulinar. Enquanto que no presente trabalho utilizou-se
explante proveniente de tecidos mais velhos de Curcuma
alismatifolia, quando estes ficaram diretamente em contato
com o substrato e as remoções dos ápices caulinares
Material não contaminado (%)
39
100
80
2
y = -0,0491x + 4,1577x + 17,042
60
2
R = 0,8458**
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Concentração da solução comercial de hipoclorito de sódio (%)
FIGURA 1 Porcentagem de material não contaminado em relação à concentração da solução comercial de hipoclorito
de sódio (% v v-1) utilizada em rizomas de Curcuma alismatifolia.
ocorreram diretamente do rizoma, diminuindo, dessa
maneira, o período de espera da formação dos brotos. A
remoção dos ápices caulinares diretamente do rizoma, sem
a espera de formação de brotações serviu para agilizar o
processo de instalação do material vegetal no cultivo in
vitro. Trabalho similar foi realizado por Debiasi et al. (2004)
em que se retirou uma porção do rizoma que continha o
ápice caulinar, reduzindo o tamanho inicial do explante da
espécie de Zingiber officinalle Roscae (Zingiberaceae)
para a assepsia.
Após o período de trinta dias de inoculação, não
foi detectado a contaminação dos explantes por fungos,
mostrando que todos os tratamentos testados foram
eficientes no controle destes microorganismos. Dessa
maneira, pelos resultados obtidos, somente a realização
da pré-assepsia foi suficiente para que o explante ficasse
isento de contaminantes fúngicos. Porém, foram notadas
a presença de bactérias que se desenvolviam em torno de
explante, o que mostra ser uma bactéria endofítica presente
nos tecidos vegetais (Figura 2).
Um dos maiores problemas no cultivo in vitro de
tecidos vegetais são as contaminações bacterianas. Pereira
et al. (2003) verificaram a contaminação por bactérias
endofíticas na micropropagação de batata (Solanum
tuberosum L.). Becker et al. (2002) tiveram problema com
copo-de-leite colorido (Zantedeschia sp.) tanto com
contaminantes fúngicos como bacterianos, porém, o uso
prolongado de antibiótico provocou o retardamento do
crescimento dos explantes com posterior oxidação deste.
Provavelmente esse fato ocorreu em razão da fitotoxidez
do produto e pelas longas horas de imersão. É importante
realizar a identificação do contaminante para utilizar o
antibiótico adequado, a fim de obter maior sucesso na
descontaminação e utilização de quantidades adequada
para a morte do patógeno e não do explante.
Em alguns casos, não se evidencia de imediato a
presença de bactérias nas plantas, sendo detectada
somente após algum tempo de cultivo, geralmente quando
um grande número de plantas já está propagado. Além
disso, por serem de difícil visualização, são facilmente
transmitidas de um material para outro, durante a
manipulação dos explantes.
A identificação das colônias bacteriana foram tanto
Gram positivas (coloração em azul) e Gram negativas
(coloração em rosa) e ambas em formato de bastonetes longos.
Faz-se necessário aprofundar os estudos na
identificação das bactérias, com o intuito de se utilizar
antibióticos específicos durante o cultivo in vitro para a
inibição e o combate do crescimento e desenvolvimento
das mesmas, presentes nos tecidos vegetais e/ou oriundas
por manipulação do explante, durante o procedimento de
inoculação.
40
RODRIGUES, T. M. et al.
FIGURA 2 Desenvolvimento de bactéria ao redor do ápice caulinar de Curcuma alismatifolia cultivados in vitro.
CONCLUSÕES
Para a assepsia de rizomas de Curcuma
alismatifolia, o tratamento mais eficiente foi o de 40
minutos de imersão numa solução comercial de
hipoclorito de sódio com concentração de 40% (v v-1)
de cloro ativo.
Não foi detectada a presença de agentes fúngicos
na cultura in vitro de ápices caulinares de Curcuma
alismatifolia, porém ocorreu o surgimento de bactérias
aos redor do explante, indicando que a bactéria é de origem
endofítica. Foram encontradas tanto bactérias Gram
positivas como negativas em forma de bastonetes.
São necessários mais estudos da identificação das
bactérias e para a desinfestação de explantes para o
estabelecimento de ápices caulinares de Curcuma
alismatifolia.
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42 TEOR
DE FLAVONAS E DO
ÁCIDO
SILVA,
F. G. et al. 3,5-O-DICAFEOILQUÍNICO
EM CALOS E EM PLANTAS IN VITRO E IN VIVO DE
CARQUEJA [Baccharis trimera (LESS) DC.]
FLAVONES AND 3,5-O-DICAPHENOILCHINIC ACID CONTENTS ON CALLUS AND
ON IN VITRO AND IN VIVO Baccharis trimera (LESS) DC. PLANTS
FABIANO GUIMARÃES SILVA1, ANA HELENA JANUÁRIO2, JOSÉ EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO3,
VIVIAN ELIAS NASCIMENTO4, WELLINGTON DOS SANTOS BARIZAN5,
SUZELEI DE CASTRO FRANÇA6
1
Engenheiro Agrônomo, Dr., Laboratório de Cultura de Tecidos CEFETRV Cx. P. 66 75901-970 Rio Verde, GO
[email protected]
2
Química, Dra., Núcleo de Pesquisas em Ciências Exatas e Tecnológicas Universidade de Franca/UNIFRAN Av. Dr. Armando
Salles de Oliveira, 201 Parque Universitário 14404-600 Franca, SP [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Dr., Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais/DAG Universidade Federal de Lavras/UFLA
Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
4
Engenheira Agrônoma, Dra., Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais/DAG Universidade Federal de Lavras/UFLA
Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
5
Químico, MBA, Unidade de Biotecnologia da UNAERP Av. Costábile Romano 2201 14096-380 Ribeirão Preto, SP.
6
Química, PhD, Unidade de Biotecnologia da UNAERP Av. Costábile Romano 2201 14096-380 Ribeirão Preto, SP
[email protected]
RESUMO
O presente trabalho foi realizado com o objetivo de
comparar o acúmulo das flavonas 5,3 -dihidroxi-4 ,6,7trimetóxiflavona (eupatorina) (1) e 5-hidroxi-3 ,4 ,6,7tetrametóxiflavona (2) e do ácido clorogênico 3,5-O-dicafeoilquínico
em calos, em plantas cultivadas in vitro e in vivo de Baccharis
trimera (Less.) DC., bem como avaliar o efeito da cinetina (CIN)
no acúmulo de fitomassa nos calos. Plântulas provenientes da
germinação in vitro foram transferidas para meio MS suplementado
com 10,0 µM de ácido naftaleno acético (ANA) combinados com
0; 1,0 e 5,0 µM de CIN e mantidos na ausência de luz para indução
de calos. Em plantas cultivadas in vitro, constatou-se acúmulo da
flavona eupatorina (53,21 ± 6,40 mg/gPS), porém, em concentrações
inferiores às encontradas em plantas in vivo (172,27 ± 36,18 mg/
gPS). A flavona 2 não foi constatada em plantas in vitro nas condições
de análise adotadas. Em calos, não foram detectadas as flavonas
eupatorina e 2. Por outro lado, o ácido clorogênico não só foi
constatado nos calos, como revelou teores mais elevados quando
comparado com os teores detectados em plantas in vitro e in vivo.
A ausência de CIN induziu calos com tendência de menor acúmulo
de fitomassa, comparado a 1,0 e 5,0 µM. O teor do ácido
clorogênico não diferiu entre as concentrações de CIN avaliadas,
porém apresentou tendência de maior elevação quando esta foi
adicionada na concentração de 1,0 µM, comparado à sua ausência
e 5,0 µM de CIN. Maior rendimento de ácido clorogênico foi
alcançado na presença de 1,0 µM de CIN (5,80 mg/frasco),
comparado à sua ausência (2,48 mg/frasco).
ABSTRACT
The objective of this work was to compare the
accumulation of two flavones 5,3 -dihydroxi-4 ,6,7trimetoxiflavone (1) and 5-hy droxi-3 ,4 ,6,7tetrametoxiflavone (2) and chlorogenic acid 3,5-Odicafeoilquinic on callus and on in vivo and on in vitro
Baccharis trimera (Less.) DC. plants as well as to evaluate
the effect of kinetin (KIN) on the accumulation of callus
mass. In vitro-germinated seedlings were transferred to MS
medium supplemented with 10.0 µ M naftalene-acetic acid
(NAA) combined with 0; 1.0 and 5.0 µM KIN and maintained
in the absence of light for callus induction. Plants cultivated
in vitro presented lower accumulation (53.21 ± 6.40 mg/
gPS) of flavone 1 then in vivo plants (172.27 ± 36.18 mg/
gPS). Flavone 2 was not found on in vitro plants under the
evaluated conditions. Flavones 1 and 2 were not detected in
callus. On the other hand, chlorogenic acid detected in callus
presented higher content compared with in vitro and in vivo
plants. KIN absence induced callus with a trend to decreased
plant mass accumulation, compared with 1.0 and 5.0 µ M.
The content of chlorogenic acid did not differ among
evaluated KIN concentrations, but it presented a trend to a
higher increase at the concentration of 1.0 µ M, compared
with its absence and the use of 5.0 µ M. Increased yield of
chlorogenic acid was reached in the presence of 1.0 µ M
KIN (5.80 mg/flask), compared with its absence (2.48 mg/
flask).
Termos para indexação: Asteraceae, Baccharis trimera,
flavonas, ácido 3,5-O-dicafeoilquínico.
Index terms: Asteraceae, Baccharis trimera, flavones, 3,5-Odicaphenoilchinic acid.
(Recebido em 14 de abril de 2008 e aprovado em 18 de maio de 2009)
Teor de flavonas e do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico...
INTRODUÇÃO
O gênero Baccharis é representado por mais de
500 espécies distribuídas na América Latina. Grande
número das quais são utilizadas na medicina popular na
forma de chás para males do estômago, fígado, anemias,
inflamações, diabetes, e outras doenças. Baccharis é
caracterizado pela presença de flavonóides (flavonas e
flavonóis), diterpenos (labdanos e clerodanos), triterpenos
e derivados do ácido cafeoilquínicos (VERDI et al., 2005).
Os ácidos 3,5 e 4,5-O-dicafeoilquínicos foram
isolados pela primeira vez no gênero Baccharis nas partes
aéreas da espécie B. thesioides Kunth. (MIKETOVA et al.,
1999).
Derivados de ácidos cafeoilquínicos possuem um
largo espectro de atividades farmacológicas, destacandose mais recentemente a descoberta de seu efeito
neuroprotetor que reduz o estresse oxidativo, associado a
doenças neurodegenerativas, incluindo o mal de Parkison
e doença de Alzheimer. As atividades anti HIV-1, HIV-2 e
vírus da herpes, bem como os potenciais antioxidante,
hepatoprotetor, antibacteriano e antihistamínico também
estão associados a essa classe de compostos (KIM et al.,
2005).
Em cultura de tecidos, quando o objetivo é a produção
de metabólitos secundários in vitro, a primeira estratégia
utilizada para a otimização de sua produção é, de maneira
geral, a manipulação epigenética. A formulação de sais do
meio de cultura tem sido bastante estudado e melhorado em
muito a produção (LUCZKIEWICZ & GLÓD, 2003). A fonte
e a concentração de carbono também têm sido bastante
estudadas (LUCZKIEWICZ & CISOWSKI, 2001).
Os fatores ambientais luz e temperatura estão entre
os mais estudados. Calos de Saussurea medusa Maxim.
(Asteraceae) submetidas à luz branca, azul, vermelho e
vermelho distante, demonstrou que a luz azul e vermelha
foram mais eficientes na indução do flavonóide 6dimetoxiflavona (ZHAO et al., 2001). Em Genista tinctoria
L., (Fabaceae) a luz teve um efeito positivo no crescimento
de calo e na biossíntese de isoflavonas (LUCZKIEWICZ
& GLÓD, 2003).
43
O grau de diferenciação tem demonstrado exercer
grande influência no metabolismo secundário. Como regra
geral, em plantas há uma grande correlação entre
citodiferenciação e a produção e acúmulo de compostos
do metabolismo secundário. Essa correlação foi observada
com respeito à síntese dos flavonóides catequinas e
proantocianinas; calos que apresentaram maior teor de
clorofila, apresentaram maior desempenho na síntese de
flavonóides (SHIBASAKI-KITAKAWA et al., 2003).
Calos de Hypericum perforatum L. (Clusiaceae), não
apresentaram síntese dos flavonóides rutina, hiperosídeo e
quercetina, mas as plantas regeneradas a partir destes calos
sintetizaram os flavonóides. Mesmo nessas plantas, o
acúmulo desses flavonóides foi intensificado conforme
ocorria o desenvolvimento das plantas, ficando clara a
necessidade de diferenciação de órgãos para o acúmulo
desses flavonóides (PASQUA et al., 2003).
Neste trabalho objetivou-se realizar um estudo
comparativo do teor das flavonas 5,3 -dihidroxi-4 ,6,7trimetóxiflavona (1), 5-hidroxi-3 ,4 ,6,7-tetrametóxiflavona
(2) e do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico (3) em calos e plantas
de B. trimera in vitro e in vivo, bem como avaliar o efeito
da CIN no acúmulo de fitomassa e rendimento dos
compostos 1, 2 e 3, nos calos dessa espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal: foram utilizadas sementes de
carqueja [Baccharis trimera (Less) DC.], Asteraceae, cuja
exsicata do material vegetal encontra-se registrada no
Herbário do Departamento de Biologia/UFLA, sob o
número 169933.
Germinação in vitro: Sementes recém coletadas
foram submetidas à desinfestação, que consistiu de imersão
álcool 70% por trinta segundos, e agitação em água sanitária
por dez minutos. Na câmara de fluxo laminar, sofreram três
enxágues em água destilada e autoclavada, sendo
posteriormente inoculadas em frascos com capacidade de
268 mL, contendo 20 mL de meio MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962), suplementado com 100 mg L-1 de inositol e
solidificado com 6 g L-1 de agar.
44
SILVA, F. G. et al.
Indução de calos: Segmentos caulinares foram
retirados de plântulas com 30 dias de idade, provenientes
da germinação in vitro. Os segmentos caulinares foram
transferidos para meio de cultura MS, suplementado com
10,0 µM de ANA e três concentrações de CIN (0, 1,0 e 5,0
µM), conforme descrito por Nascimento et al. (2003). O pH
do meio foi ajustado para 5,7 antes da autoclavagem, a 121 ºC
por 20 minutos. Foram utilizados tubos de ensaio (25 x 150
mm), contendo 10,0 mL do meio e incubados em sala de
crescimento a 25 ± 1ºC, em ausência de luz. Ao final de 30
dias, os calos formados foram transferidos para o mesmo
meio de cultura, em que permaneceram por mais 30 dias.
Em seguida, foram quantificados o acúmulo de fitomassa,
flavonas e do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico.
Extração, isolamento e quantificação por CLAE:
Partes aéreas e calos foram secos em desumidificador Arsec
160®, em temperatura ambiente até atingirem massa constante,
acondicionados em tubos de ensaio vedados com tampa
plástica e lacrados com parafilme e mantidos em ausência de
luz em congelador. Amostras de 100 mg do material vegetal
triturado, em moinho Marconi® (MA 680) com peneira de 10
mesh, foram submetidas à extração com metanol grau
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em banho de
ultrassom por 30 min. As extrações foram realizadas em
triplicata e os extratos obtidos analisados por CLAE.
Utilizou-se um cromatógrafo Shimadzu LC-10AD
VP com detector DAD (arranjo de diodo) Shimadzu SPDM10 VP, injetor automático SIL-10AD VP, coluna RP-18
Shim-pack 25 cm x 4,6 cm (5m), empregando-se um gradiente
linear de MeOH/H2O + 0,1% CH3COOH 30% 100% (35
min) com fluxo 0,9 ml/min e detecção a 254 nm.
No doseamento das flavonas, a flavona 1, conhecida
também como eupatorina, foi utilizada como padrão externo,
construindo-se uma curva de calibração de 4 pontos, y =
3051122,6314x - 76576,1853, que apresentou linearidade de
resposta do detector no intervalo 0,039 mg/mL
2,5 µ g/
2
µL e coeficiente de correlação R = 0,9997.
Na quantificação do composto 3, empregou-se o
ácido 3,5-O-dicafeoilquínico como padrão externo,
obtendo-se a curva analítica de 4 pontos, y =
69305900,0000x + 44316,44823, que se apresentou linear no
intervalo de concentração de 0,0820 a 2,625 µ g/µ L com
coeficiente de correlação 0,9998.
As flavonas 1 e 2 (Figura 1) foram isoladas do extrato
em CHCl3-MeOH (2:1) das partes aéreas de Baccharis
trimera e as estruturas químicas foram elucidadas pelas
análises de RMN (Ressonância Magnética Nuclear) e
comparação com dados de literatura, conforme descrito
por Silva et al. (2006).
Análises Espectroscópicas: Os espectros de
RMN 1 H e 13 C unidimensionais foram obtidos em
espectrômetro Bruker, modelo Avance DRX 400 e os
espectros bidimensionais em espectrômetro Bruker, modelo
Avance DRX 500 MHz. Solventes deuterados foram
empregados para a dissolução das amostras.
Calos de B. trimera produzidos na presença de 5,0
µM de cinetina, como descrito anteriormente, foram
submetidos à extração em metanol por maceração em banho
de ultrassom (30 min) por 3 vezes. Após a remoção do
solvente em evaporador rotatório, obteve-se 0,210 g do
extrato bruto. O extrato metanólico obtido foi submetido à
R
OMe
MeO
O
MeO
OH
O
R = OH (1)
R = OMe (2)
7
HO
COOH
1
HO
7
O
9
HO
5
O
3
O
O
7
1
9
OH
3
OH
4
6
OH
(3)
FIGURA 1 Estruturas das flavonas 5,3 -dihidroxi-4 ,6,7trimetóxiflavona (1) e 5-hidroxi-3 ,4 ,6,7-tetrametóxiflavona
(2) e do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico (3).
cromatografia de exclusão em coluna de sephadex LH-20
em metanol, levando ao isolamento do ácido 3,5-Odicafeoilquínico.
Delineamento experimental: foi inteiramente ao
acaso (DIC); cada unidade experimental foi composta por
3 repetições, perfazendo 15 unidades experimentais. Os
dados foram submetidos à análise de variância, utilizandose o programa de Análises Estatísticas e Genéticas (SAEG)
(RIBEIRO JUNIOR, 2001).
As análises quantitativas, das amostras de carqueja,
realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência
evidenciaram que em calos induzidos no meio MS
suplementados com 10,0 µ M de ANA e diferentes
concentrações de CIN mantidos em ausência de luz não
ocorreu síntese das flavonas (1) e (2) (Tabela 1). A ausência
dessas flavonas nos calos pode ser atribuída a vários
fatores, entretanto, ausência de luz no cultivo, é um dos
fatores ambientais que tem mostrado forte relação com a
indução da síntese de flavonóides (LUCZKIEWICZ &
GLÓD, 2003; SHIBASAKI-KITAKAWA et al., 2003; ZHAO
et al., 2001). Calos de Taraxacum officinale F.H.Wigg.
(Asteraceae) crescidos em presença de luz apresentaram
síntese da antocianina cianidina 3-(6"-malonilglucoside) e
uma coloração púrpura intensa. Já nos calos mantidos em
ausência de luz, proliferaram somente células com
45
coloração cinza, desprovidas de pigmentação, e não houve
síntese de antocianina por não haver expressão da chalcona
sintase, enzima chave da rota biossintética, diferindo das
células crescidas em presença de luz (AKASHI et al., 1997).
Segundo Dias et al. (1998), o ambiente in vivo não
oferece estresse como fungos e bactérias patogênicas e
radiação UV, entre outros. Em plantas in vivo, isoflavonas
podem servir como armazenamentos de fitoalexinas, que
são liberadas somente em condições de estresse
(LUCZKIEWICZ & GLÓD, 2003). Além disso, síntese de
compostos fenólicos ocorre principalmente durante a
diferenciação celular e após a maturação foliar, condições
que não ocorrem em calos. Da mesma maneira, calos de
Camellia sinensis Kuntze induzidos em ausência de luz e
repicados para a presença de luz apresentaram um
considerável aumento no acúmulo de flavonóides
(catequinas e proantocianina), sem reduzir o acúmulo de
fitomassa. Esse aumento em presença de luz foi atribuído a
um maior número de cloroplastos em células mantidas em
presença de luz, um importante sítio de síntese de
flavonóides. Além desse efeito, a luz tem demonstrado
promover a atividade da fenilalanina amônia liase (PAL),
enzima importante na via dos flavonóides (SHIBASAKIKITAKAWA et al., 2003).
Observa-se, pelos resultados da tabela 1, que em
plantas cultivadas in vitro, houve acúmulo da flavona (1),
porém em concentração inferior a um terço daquela
TABELA 1 Teor (mg/g de fitomassa seca) das flavonas (1), (2) e ácido 3,5-O-dicafeoilquínico (3), em calos, plantas in
vivo e in vitro de carqueja (Baccharis trimera).
5,3 -dihidroxi-4 ,6,7trimetóxiflavona (1)
Tipo de tecido
Planta in vivox
Planta in vitro
y
z
36,18
53,212
6,40
5,281
0,67
Ácido 3,5-Odicafeoilquínico (3)
10,49
0,81
-
8,72
1,19
-
-
92,36
13,33
z
-
-
129,57
9,63
z
-
-
93,07
3,43
Calos (0 M CIN )
Calos (1,0 M CIN )
Calos (5,0 M CIN )
x
172,272
5-hidroxi-3 ,4 ,6,7tetrametóxiflavona (2)
y
Planta matriz doadora das sementes para a implantação dos experimentos in vitro. Planta de carqueja germinadas in
vitro, e utilizadas para a indução dos calos. zCalos cultivados em meio MS suplementado com 10,0 M de ANA e 0; 1,0
e 5,0 M de CIN, em ausência de luz.
SILVA, F. G. et al.
(a)
a
a
50
45
FS (mg/frasco)
40
a
35
Z
30
25
20
15
10
5
0
(b)
a
Ácido clorogênico (mg/g calo seco)
encontrada na planta matriz in vivo. Já a flavona (2) não foi
constatada em plantas in vitro. Quanto ao ácido 3,5-Odicafeoilquínico (3) os teores foram bastante reduzidos em
plantas in vivo e in vitro, respectivamente 10 e 12 vezes
inferiores ao teor encontrado nos calos (média de 105,00
mg/g FS). Resultados semelhantes foram encontrados para
as espécies da família Asteraceae Saussurea medusa, cujos
calos apresentaram teor do flavonóide 6-dimetoxi flavona
18 vezes maiores que as plantas cultivadas in vivo (ZHAO
et al., 2001) e Rudbeckia hirta L., (Asteraceae) para a qual
a concentração de antocianina em calos foi mais de sete
vezes maior que em flores da planta mãe in vivo
(LUCZKIEWICZ & CISOWSKI, 2001). Espécies do gênero
Genista, (Fabaceae) também demonstraram maior
capacidade de acumular isoflavonas em calos, comparadas
às plantas in vivo (LUCZKIEWICZ & GLÓD, 2003).
Na presença de 5,0 µ M de CIN, os calos
apresentaram coloração mais clara. Foi verificada uma
tendência de inferioridade na fitomassa seca de calos,
quando CIN não foi adicionada ao meio (Figura 2a). O teor
do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico apresentou uma tendência
de superioridade quando CIN foi adicionada na
concentração de 1,0 µM (129,57 mg/g massa seca),
comparado com os calos cultivados sem a citocinina (92,36
mg/g massa seca) ou na presença de 5,0 µM de CIN (93,07
mg/g massa seca). Não houve, entretanto, diferenças
significativas entre as concentrações avaliadas (Figura 2b).
Já o rendimento de ácido 3,5-O-dicafeoilquínico (3) foi
diferente entre as concentrações de CIN; em 1,0 µM (5,80
mg/frasco), foi superior à sua ausência (2,48 mg/frasco); e
na concentração de 5,0 µM (4,33 mg/frasco), apresentou
rendimento intermediário (Figura 2c).
Ressalta-se que, de maneira geral, condições que
maximizam acúmulo de fitomassa de calos não são
apropriadas para acúmulo de metabólitos secundários, o
que requer sistemas de duas fases, ou seja, uma primeira
fase para crescimento celular e uma segunda para acúmulo
de metabólitos secundários (CHEN et al., 1997;
LUCZKIEWCZ & CISOWSKI, 2001). Portanto, assim como
ocorrido para várias espécies do gênero Genista
140
120
a
Z
a
100
80
60
40
20
0
a
(c)
6
Ácido clorogênico (mg/frasco)
46
ab
5
4
Z
b
3
2
1
0
0
1
5
Cinetina
(µM)
Cinetina
( M)
FIGURA 2 Médias da fitomassa seca de calos (FS) (a),
teor (mg/g massa seca) (b) e rendimento/frasco (mg/frasco)
de ácido 3,5-O-dicafeoilquínico (c), em calos de carqueja
(Baccharis trimera) cultivados em meio MS suplementado
com 10,0 µM de ANA e diferentes concentrações de
cinetina (CIN), em ausência de luz. ZMédias seguidas pela
mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
(LUCZKIEWICZ & GLÓD, 2003), o meio que se mostrou
mais propício para a proliferação de calos coincidiu com o
maior acúmulo de composto 3. Porém, quanto às condições
de incubação, calos de carqueja induzidos em presença de
luz se apresentam totalmente escurecidos e, após o primeiro
subcultivo, ficam necrosados, motivo pelo qual ainda não
foi avaliado o acúmulo dos flavonóides em calos mantidos
em presença de luz. No entanto, Luczkiewicz & Glód (2003),
verificaram que calos induzidos e mantidos em presença
de luz mostraram maior acúmulo de isoflavona que os
mantidos em ausência de luz, independentemente do meio
de cultura.
47
No espectro de RMN1H de 3 (Tabela 2) observouse sinais de dois conjuntos de hidrogênios olefínicos trans
em 7,63 e 6,41 (d, J= 15,9 Hz, H-7 e H-8 ) e 7,60 e 6,31 (d,
J= 15,9 Hz, H-7 e H-8 ), que, juntamente com o duplo
dubleto a 6,98 (J = 2,2 e 8,0 Hz, H-6 e H-6 ), caracterizam
duas unidades cafeoíla. O duplo dubleto a 3,95 (J= 3,3;
9,2Hz) e os multipletos a 5,41 e 5,51 sugerem a presença
de uma unidade de ácido quínico.
Os sinais de duas carbonilas de ester no espectro
de RMN13C (169,25 para C-9 e 168,82 para C-9 )
evidenciam a natureza dissubstituida do derivado
dicafeoilquínico.
TABELA 2 Dados de RMN1H (400 MHz, CD3OD, deslocamentos químicos ppm, constantes de acoplamento em Hz)
e 13C (100 MHz, CD3OD) de 3.
C
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
C
74,8
37,2
72,3
72,8
72,3
37,2
n.d.
127,8
115,2
146,8
149,7
116,6
123,3
147,7
114,8
168,7a
127,7
115,3
146,8
149,7
116,6
123,3
147,7
114,8
168,4a
H
2ax
2eq
3eq
4
5ax
6ax
6eq
2
5
6
7
8
2
5
6
7
8
H
2,16 m
2,31 dd (14,7; 3,3)
5,51 m
3,95 dd (3,3; 9,2)
5,41 m
2,04 d (12,2)
2,62 d (12,2)
7,09 d (1,9)a
6,80 d (8,0)
6,98 dd (2,2; 8,0)
7,63 d (15,9)
6,41 d (15,9)b
7,08 d (1,9)a
6,80 d (8,0)
6,98 dd (2,2; 8,0)
7,60 d (15,9)
6,31 d (15,9)b
HSQC
C2
C2
C3
C4
C5
C6
C2
C5
C5
C7
C8
C2
C5
C6
C7
*Valores marcados com a mesma letra podem ser permutados.
HMBC
C2
C2
C2
C3 ,C4 ,C7
C6 ,C7 ,C8 ,C9
C1 , C9
C1 , C3
C5
C1 , C9
-
48
SILVA, F. G. et al.
As posições dos grupos cafeoíla foram
determinadas com base nos valores de deslocamentos
químicos e das constantes de acoplamento de H-3, H-4 e
H-5 e comparação com dados de literatura para os isômeros
dos ácidos 3,4, 3,5, e 4,5-O-dicafeoilquínico (ARBISER et
al., 2005; CHEMINAT et al., 1988; ROBISON JUNIOR et
al., 1996). A análise conjunta dos dados de RMN
bidimensionais HSQC e HMBC (Tabela 2), confirmaram a
identidade estrutural de 3 como sendo a do ácido 3,5-Odicafeoilquínico.
De acordo com os objetivos iniciais, os resultados
obtidos no presente trabalho são encorajadores, demonstram
que calos de B. trimera são capazes de sintetizar ácidos
fenólicos, mesmo em ausência de luz, e se apresentam
propícios para futuros estudos, envolvendo a elicitação
abiótica (com luz) e biótica (fungos endofíticos já isolados
da própria espécie).
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CONCLUSÕES
Plantas in vitro sintetizam a flavona 5,3 -dihidroxi4 ,6,7-trimetoxiflavona, porém em quantidades menores,
comparadas à planta matriz in vivo, e não sintetizam a
flavona 5-hidroxi-3 ,4 ,6,7-tetrametoxiflavona;
Calos de carqueja não sintetizaram as flavonas 5,3 dihidroxi-4 ,6,7-trimetoxiflavona e 5-hidroxi-3 ,4 ,6,7tetrametoxiflavona, mas sintetizam ácido 3,5-Odicafeoilquínico em quantidades superiores às plantas in
vitro e à planta mãe in vivo;
A citocinina CIN na concentração de 1,0 µ M
maximiza o rendimento do ácido 3,5-O-dicafeoilquínico, em
calos de carqueja, cultivados em meio MS, suplementado
com 10,0 µM de ANA, em ausência de luz.
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50 COMPARISON
OF TWOMAGALHÃES,
PARTICLE
DEVICES
M. M. BOMBARDMENT
et al.
USING HISTOCHEMICAL AND FLUORIMETRIC ASSAYS
OF B-GLUCURONIDASE IN SOYBEAN
EMBRYOGENIC SUSPENSIONS
COMPARAÇÃO DE DOIS APARELHOS DE BOMABARDEAMENTO DE
PARTÍCULAS UTILIZANDO OS ENSAIOS HISTOQUÍMICOS E
FLUORIMÉTRICOS DA B-GLUCURONIDASE EM
SUSPENSÕES EMBRIOGÊNICAS DE SOJA
MARCELO MURAD MAGALHAES1, PON SAMUEL JAYAKUMAR2, HEE SOOK SONG3,
SONITICHAI CHANPRAME4, JACK MILTON WIDHOLM5
1
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG Brasil [email protected]
Dow AgroSciences, 9330 Zionsville Rd., Indianapolis, IN 46268, USA [email protected]
3
BASF Plant Science, P.O. Box 13528, 26, Davis Dr., Research Triangle Park, NC 27709, USA . [email protected]
4
Department of Agronomy, Kasetsart University, Kamphang Sean Campus, Nakorn Phatom, Thailand 73140 [email protected]
5
University of Illinois, Department of Crop Sciences, Edward R. Madigan Lab., 1201 W. Gregory Dr., Urbana, IL 61801, USA
[email protected]
2
ABSTRACT
To compare the performance of the BIO-RAD Model
PDS-1000 He Biolistic Particle Delivery device (PDS) and the
Particle Inflow Gun (PIG), transient expression studies were
carried out with soybean embryogenic suspension cultures of
the cv. Jack. The bombarded construct contained the uidA reporter
gene driven by the 606 bp fragment of the tobacco anthranilate
synthase (ASA2) promoter that showed stronger expression than
the 1356 bp ASA2 promoter fragment or the CaMV 35S promoter.
Both histochemical and fluorimetric assays for GUS activity
were carried out 48 h after bombardment and high correlations
were found between the two assay methods. The best conditions
were 1100 psi, 13 cm flying distance, 1 mg gold and 1 µg of DNA
per shot for the PDS and 80 psi, 1 mg gold and 11 cm target
distance for the PIG. The sodium acetate DNA precipitation
method was as effective as the CaCl2-spermidine method and
was faster and easier. When both devices were compared using
their respective optimal conditions, the PDS produced about
50% more blue spots and GUS enzyme activity than the PIG
when gold particles were used but both gave similar but lower
expression when tungsten particles were used.
Index terms: ASA2 606 promoter; GUS assays; GUS transient
expression; particle bombardment; soybean embryogenic cultures.
RESUMO
Com a finalidade de comparar o desempenho dos modelos
para bombardeamento de partículas da BIO-RAD Modelo PDS1000 He o PIG (Particle Inflow Gen), estudos de expressão
transiente foram realizados com suspensão embriogênica de soja
cv. Jack. A construção gênica continha o gene repórter uidA e 606
pb do fragmento do promotor da sintase do antranilato (ASA2)
de fumo que apresentou uma expressão mais alta do que o
fragmento do promotor 1356 pb ASA2 ou o promotor Ca MV35S.
Os ensaios histoquímicos e fluorimétricos da atividade GUS foram
realizadas 48h após bombardeamento e altas correlações foram
encontradas entre os dois ensaios. As melhores condições foram
1100 psi, 13 cm de distancia de vôo, 1 mg de ouro e 1 µg de DNA
por tiro para o PDS e 80 psi, 1 mg de ouro e 11cm de distância do
alvo para PIG. O método de precipitação com acetato de sódio
foi mais efetivo, rápido e fácil do que o método de CaCl2espermidina. Quando os dois aparelhos foram comparados,
utilizando-se as suas respectivas ótimas condições, o PDS
produziu em torno de 50% a mais de manchas azuis e também a
atividade enzimática da GUS do que o PIG, quando as partículas
de ouro foram utilizadas, mas ambos os aparelhos propiciaram
menor expressão, quando as partículas de tungstênio foram
utilizadas.
Termos para indexação: promotor ASA2 606, ensaio GUS,
GUS expressão transiente, bombardeamento de partículas,
culturas embriogênicas de soja.
INTRODUCTION
Plant transformation is a very important technology
both for commercial and research applications. The most
widely used methods utilize Agrobacterium tumefaciens
or particle bombardment for DNA insertion. Both of these
methods require empirical optimization with each plant
Abbreviations: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronide = Xgluc; ß-glucuronidase = GUS; 4 methylumbelliferone = MU; 4methylumbelliferone-glucuronide = MUG; BIO-RAD Model
PDS-1000 He Biolistic particle delivery system = PDS; particle
inflow gun = PIG
(Recebido em 25 de setembro de 2007 e aprovado em 18 de maio de 2009)
Comparison of two particle bombardment devices...
tissue system. The initial optimization often utilizes reporter
genes such as uidA that encodes ß-glucuronidase (GUS)
whose expression can be readily measured (ABLE et al.,
2001; JEFFERSON et al., 1987; RASCO-GAUNT et al.,
1999). The GUS enzyme can be measured both
histochemically when the substrate 5-bromo-4-chloro-3indolyl-glucuronide (X-gluc) is incubated with intact
tissues or fluorimetrically when the substrate 4methylumbelliferone-glucuronide (MUG) is incubated with
tissue extracts. The hydrolysis of the glucuronide bond
by the GUS enzyme converts X-gluc to an indoxyl
intermediate that dimerizes to form a blue indigo
precipitate and MUG to the fluorescent compound 4methylumbelliferone (MU) that can be measured
quantitatively.
Soybean [Glycine max (L.) Merr.] is a very important
leguminous crop that is a leading source of vegetable oil
and protein in the world. Due to the importance of the crop
and difficulty in obtaining transformed plants, much effort
has been expended in developing methods for inserting
genes. The first examples of transformed soybean plants
was reported by Hinchee et al. (1988) using A. tumefaciens
and the cotyledonary node shoot regeneration system and
McCabe et al. (1988) using particle bombardment of apical
meristems capable of forming shoots. Presently the most
widely used methods for soybean transformation are the
A. tumefaciens-cotyledonary node system and the particle
bombardment of embryogenic suspension culture system
(CHEE & HU, 2000; DINKINS et al., 2002; FINER et al.,
1996; TRICK et al., 1997; WIDHOLM, 2004).
The embryogenic suspension culture system was
developed by Finer & Nagasawa (1988) and was first used
to produce transformed soybean plants by Finer &
McMullen (1991) using particle bombardment. Particle
bombardment has been the predominant method for DNA
delivery for the soybean embryogenic suspension culture
transformation system using either the BIO-RAD He
Biolistic Particle Delivery System (PDS) or the particle
inflow gun (VAIN et al., 1993). The commercially produced
PDS is more expensive to purchase and uses relatively
51
expensive supplies (rupture disk, macrocarrier, stopping
screen, metal particles) for each bombardment while the
PIG can be constructed relatively cheaply and uses no
disposable supplies other than metal particles.
There have been many reports of successful gene
insertion into soybean plants via particle bombardment of
embryogenic suspension cultures (summarized in the
reviews above). More recent reports include sense
suppression of the low abundance P34 seed allergen
protein (HERMAN et al., 2003), description of GUS gene
silencing in plants (REDDY et al., 2003), phytase expression
in seeds (CHIERA et al., 2004), maize zein expression in
seeds (LI et al., 2005) and the expression of the Cah gene
to produce cyanamide resistance (ZHANG et al., 2005).
Particle bombardment is the method most often
used for plastid transformation and a PIG has been used to
successfully insert a gene into embryogenic soybean callus
and transplastomic soybean plants were regenerated
(DUFOURMANTEL et al., 2004).
Bombardment of embryogenic soybean cultures
also has the capability of insertion of multiple genes at
one time when a mixture of plasmids is used. Hadi et al.
(1996) mixed 12 plasmids and some tissue culture clones
were obtained that contained all 12 of the plasmids. We
have been routinely mixing four cut out and gel purified
gene cassettes with promoter and terminator and find that
about 10% of the selected transgenic lines contain all four
genes (O. Zernova, V. Lozovaya and J. Widholm,
unpublished).
The embryogenic soybean culture system has also
been used in several studies where traits that are expressed
in seeds were followed in the tissue cultured embryos of
the transgenic lines without regenerating plants. These
include manipulation of seed fatty acid composition by
the insertion of novel genes (CAHOON et al., 1999, 2000,
2002). The timing of the expression of the seed specific
lectin promoter driving GUS was also demonstrated in
embryogenic soybean cultures (CHO et al., 1995).
Transient expression assays utilizing a reporter
gene driven by the promoter being studied have also been
52
MAGALHÃES, M. M. et al.
used to determine the strength and tissue specificity of the
promoter. This was done with the tobacco anthranilate
synthase (ASA2) gene promoter by Song et al. (1998) who
showed that the full-length 2.3 kb promoter drove transient
GUS expression in a tissue culture-specific manner, as also
was observed for the ASA2 mRNA and enzyme activity.
When the promoter was cut down to 1356 or 606 bp the
tissue culture specificity was lost and high level expression
was seen in tobacco cultured cells and leaves after particle
bombardment using the PIG. GUS transient expression was
also used to demonstrate the seed specific expression of
the soybean glycinin gene, Gy1, using immature soybean
seeds and leaves (IIDA et al., 1995) and Wei & Theil (2000)
used soybean leaf bombardment to study the iron regulatory
element of the soybean ferritin gene driving uidA or luciferase
reporter genes. Kalafallo et al. (2005) and Ponappa et al.
(1999) have studied transient green fluorescent protein
expression in soybean embryogenic suspension cultures.
The experiments described here were carried out to
first optimize the two bombardment devices using GUS
transient expression with soybean embryogenic cultures
and then compare the efficiencies. The GUS expression
was measured both histochemically by counting blue spots
after incubation with X-gluc and fluorimetrically using
MUG as substrate with tissue extracts to determine how
well these assays correlate. We also compared gold and
tungsten and two different DNA precipitation methods
using the transient expression assay.
MATERIALS AND METHODS
Soybean cultures: embryogenic suspension
cultures of soybean [Glycine max (L.) Merr.] cv. Jack were
initiated from immature cotyledons and maintained as
described by Finer & Nagasawa (1988). The cultures were
grown in 30 mL liquid medium in 125 mL Erlenmeyer flasks
on a gyratory shaker at 125 rpm and 27-28ºC.
Plasmids: the 606 and 1356 bp tobacco ASA2
promoter fragments were cloned into pBI221 to drive the
uidA gene in place of the CaMV 35S promoter by Song et
al. (1998). The pBI221 plasmid with the CaMV 35S promoter
driving uidA was also used. The plasmids were isolated
using a Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
Particle bombardment: about 1 g of embryogenic
suspension culture clumps were placed on a filter paper
disc moistened with the liquid culture medium in a 10 cm
diameter closed plastic Petri dish and placed in a laminar
flow hood overnight. The plasmid DNA was precipitated
on the gold (1.2 µm diameter) and tungsten (1.0 µm
diameter) particles using the calcium/spermidine method
of Klein et al. (1988a) or the sodium acetate method of
Morikawa et al. (1989). 10 µL of the particle and DNA
mixture was pipetted onto the macrocarrier for the PDS
and 15 µL onto the Millipore screen for the PIG. The initial
bombardments with the PDS were done with the CaCl2/
spermidine precipitation, 1100 psi pressure and 13 cm target
distance (CHANPRAME, 1998).
GUS assays: forty-eight h after bombardment and
incubation at 27-28ºC in liquid suspension culture medium,
the embryogenic clumps were transferred to the X-gluc
containing GUS assay medium (JEFFERSON et al., 1987)
overnight at 37ºC. The clumps were soaked in 95% ethanol
with 4 rinses and then a 1 mm2 mesh was placed over the
tissue and the blue foci counted with a Nikon dissecting
microscope. Blue foci in a total of 10 1 mm2 sections were
counted for each treatment with 4 replicate tissue samples.
For the fluorimetric assay, weighed samples of
about 0.5 g fresh weight from 4 replications were
homogenized in 600 µL of GUS extraction buffer, the
homogenate centrifuged at 13.000 xg for 10 min. One
hundred µL of the supernatant was added to 500 µL 37ºC
MUG assay buffer and the reaction stopped at 0, 30 and 60
min by the addition of 2.4 mL 0.2 M Na2CO3. The MU
formed was measured with a Hitachi F-2000 Fluorescence
Spectrometer with excitation at 320-390 nm and emission
at 415-490 nm. The concentrations were calculated using a
MU standard curve. Protein in the supernatant was
measured using the method of Bradford (1976).
Statistical analysis: samples in each experiment
were completely randomized with four replications and the
data was subjected to ANOVA and t test using SAS version
6.4 and values that are marked with different letters in the
Figures are statistically different at the 5% level.
When the ASA2 606 bp promoter, the ASA2 1356
bp promoter and the CaMV 35S promoter were compared
for transient GUS expression with the soybean embryogenic
suspension cultures, 606 gave higher histochemical and
fluorimetric expression than the other two promoters
following bombardment with the PDS using the
bombardment parameters shown by Chanprame (1998) to
be optimal (Figure 1A). When the helium pressure was
varied, both blue foci and GUS enzyme activity were higher
with 900 and 1100 psi than with 600 (Figure 1B).
The ASA2 606 promoter was previously shown to
drive higher GUS transient expression than ASA2 1356
and CaMV 35S in tobacco leaves and CaMV 35S in cultured
tobacco cells (SONG et al., 1998). The ASA2 1356 promoter
drove the highest GUS expression in the tobacco cultured
cells indicating that some sequences between 606 and 1356
enhance tobacco cell culture expression and depress leaf
expression (SONG et al., 1998).
The target distance of 13 cm was better than both
11 and 15 cm when measured histochemically while the
MUG assays showed 11 and 13 cm to be very similar (Figure
2A). The highest transient expression was found using 1
mg of gold particles per shot with less found with 0.5 or 1.5
mg or higher amounts (Figure 2B).
When the amount of DNA per shot using 1 mg of
gold particles was varied, the optimal amount was 1 µg
since lower numbers of GUS foci and lower fluorimetric
GUS activity were present when 0.5, 2.5 and 5 µg of DNA
were used (Figure 3). When 5 µg of DNA was used a
diffuse blue color formed in the GUS histochemical assay
but no activity was detected in the fluorimetric assay.
In the comparison of DNA precipitation methods,
when the DNA was precipitated onto the gold particles
using either the CaCl2/spermidine method (KLEIN et al.,
1988a) or the sodium acetate method (MORIKAWA et al.,
1989) and bombarded into the soybean embryogenic
cultures with the PDS using the optimal parameters, there
were no differences in levels of transient GUS expression
(Figure 4). Sonication did enhance the transient expression
using both precipitation methods.
B
40
100
A
31 86,6
30
80
A
25
70
71,3
B
18,75
15
B
60
55,0
50
C
13
10
40
30
120
35
90
pmol MU/min. mg protein
A
GUS foci per mm2 (mean number)
35
20
40
110
A
100
A
32,72
30
A
32
A
92
84,6
80
25
B
20
15
60
20,36
B
41,6
40
A
53
10
20
20
5
5
10
0
0
35 S
606 ASS2
Promoters
1356 ASS2
0
0
600 psi
900 psi
1100 psi
Pressure
FIGURE 1 Comparison of the CaMV 35S and ASA2 promoters driving uidA by transient GUS expression in
soybean embryogenic clumps (histochemical
and MUG assay ) using the PDS. The correlation coefficient
between the two assays was 0.72. The bombardment parameters were as described in the Material and Methods.
Brackets denote standard deviations. Bars in all figures marked with different letters are statistically different at
the 5% level (A). Effect of helium gas pressure on transient GUS expression in soybean embryogenic clumps
using the PDS (histochemical
and MUG assay
) bombarded with 1 µg 606-GUS and 1 mg gold particles.
The correlation coefficient between the two assays was 0.89 (B).
40
60
C
20
50
49
B
15,8
40
30
10
25
A
80
80,3
A
22,3
70
20
60
2
25
GUS foci per mm (mean number)
70
73
C
15
50
AB
B
B
12,8 42,3
12
B
41,6
10
B
B
11,2
39,3
20
5
10
11 cm
13 cm
Target distance
10
0
15 cm
40
30
20
8,8
5
0
100
90
80
B
30
30
90
A
A
34,2 86,5
35
15
B
100
A
54
0
1 mg
0,5 mg
1,5 mg
Gold
2 mg
0
FIGURE 2 Effect of target distance on transient GUS expression in soybean embryogenic clumps using the
PDS (histochemical
and MUG assay
). The correlation coefficient between the two assays was 0.90 (A).
Effect of amount of gold of per shot on transient GUS expression in soybean embryogenic clumps of soybean
using the PDS (histochemical
and MUG assay
). The correlation coefficient between the two assays was
0.91 (B).
30
100
90
A A
25 84,3
70
B B
20 65
20
60
15
10
50
C
C 42,6
11,5
C CD
9,8 33
40
30
D
20,3
5
80
2
25
20
10
0
*
0,5 g
1 g
2,5 g
3 g
DNA Concentration
(1 mg gold particle per shot)
5 g
0
* Over all appearence of diffuse blue color so spots not be counted
FIGURE 3 Effect of DNA amount on transient GUS expression in soybean embryogenic clumps using the
PDS (histochemical
and MUG assay
). The correlation coefficient between the two assays was 0.94.
Optimization of the bombardment conditions using
the PIG. When the PIG was used to propel the gold particles
carrying 606-GUS precipitated by the CaCl2/spermidine
method, the optimal conditions were 80 psi (Figure 5A), a
target distance of 11 cm (Figure 5B) and 1 mg of gold per
shot (Figure 5C). The sodium acetate precipitation method
gave results similar to those with CaCl2/spermidine (Figure
5D). The use of tungsten particles also gave similar
transient GUS expression as gold particles (Figure 5D).
Comparison of PDS and PIG devices. When the
PDS (Figure 6) and the PIG (Figure 5) were used with the
same soybean embryogenic tissue cultures at the same time,
the PDS was more effective than the PIG when gold particles
were used but when tungsten particles were used the results
70
140
A
124,6
A
A
60
120
118,6
58,5
50
100
40
B
B
67,3
30
80
74
60
B
23,4
20
B
40
A
60
55
17,5
10
20
0
h
wit
nic
so
n(
atio
C)
OA
Na
u
ho
wit
o
ts
atio
nic
n(
C)
OA
Na
tio
ica
on
hs
wit
Ca
n(
Cl 2
p
+s
u
ho
wit
erm
idin
ic
on
ts
e)
n(
atio
Cl 2
Ca
pe
+s
e)
idin
rm
0
Treatments
FIGURE 4 Effect of using the sodium acetate method of Morikawa et al. (1989) or the CaCl2/spermidine
method of Klein et al. (1988b) for the precipitation of DNA on the gold particles on the transient GUS
expression obtained in soybean embryogenic clumps using the PDS (histochemical
and MUG assay
). The
correlation coefficient between the two assays was 0.98.
were similar with the two devices. The PDS had decreased
efficiency with the tungsten particles while the PIG was
equally effective with both the gold and tungsten particles.
When the transient GUS expression was tested
using the two DNA precipitation methods and either gold
or tungsten particles with the PDS there were no differences
between the precipitation methods, except the
histochemical GUS expression was less than the MUG
expression with the tungsten particles (Figure 6). The
tungsten particle MUG expression was slightly lower than
that obtained with the gold particles. Did not try the smaller
0.6 µm particles and found the 13 cm target distance to be
better than 11 or 15 cm.
In a side by side comparison of the PDS and PIG
the bombardment effectiveness measured by GUS
transient expression was very similar when tungsten
particles were used (Figs. 1, 2, 3, 4 and 5). However, when
gold particles were used, the PDS was about 50% more
effective than the PIG due to higher GUS expression in
comparison with that obtained with the tungsten particles.
The PIG is much cheaper to obtain since it can be built in a
shop with commonly available materials, and is more rapid,
cheaper and easier to operate. The PDS is expensive to
purchase and has relatively expensive expendables, rupture
disk, macrocarrier and stopping screen, for each
bombardment while the PIG uses a reusable Millipore filter
holder to hold the DNA and particles.
We found similar results with both DNA
precipitation methods used,CaCl2/spermidine (KLEIN et
al., 1988a) and the sodium acetate (MORIKAWA et al.,
1989), with both devices. The latter method is easier and
more rapid due to fewer steps in the protocol.
In most of the experiments, the number of blue spots
counted correlated very well with the quantitative measure
of GUS enzyme activity by the MUG assay. Thus one can
conclude that either assay can be used to quantify the
transient GUS expression in a relative manner, at least with
the soybean embryogenic suspension culture system used
here. Kim et al. (1999) also found that total GUS activity
measured fluorimetrically correlated with the percentage
of the bombarded peanut leaf that was stained blue when
three different promoters were tested.
56
B
18
70
A
20
12
40
10
30
B
7,1
6
B
24,2
20
16
80
A
73
14
70
12
60
2
50
90
A
A
17,2
84
60
14
8
100
18
15,4
A
62
16
4
B
49
10
8
6
4
50
40
B
6,3
B
5,1
30
A
20
10
2
2
0
0
60 psi
0
80 psi
Pressures
10
0
9 cm
11 cm
13 cm
Target Distance
D
C
25
15
50
B
11,1
40
B
10,1
B
26
B
25,6
5
B
8,5
30
B
20,6
20
A
20,4
20
A
18,2 A
84
A A
20,699,6
A
85,3
A
21 A
96
80
15
60
10
40
5
20
10
0
0,5 mg
1 mg
1,5 mg
Gold
2 mg
0
100
pmol MU/ min. mg protein
60
A
58
A
18,1
10
120
70
20
0
PIG-Gold-NaOAc
PIG-Gold-CaCl2
PIG-Tu-NaOAc
PIG-Tu-CaCl2
0
Mode of delivery and precipitation
FIGURE 5 Effect of various helium gas pressure on the transient GUS expression in soybean embryogenic
clumps of soybean using the PIG with the sodium acetate DNA precipitation method on gold particles. The
correlation coefficient between the two assays was 0.99 (A). Effect of target distance on transient GUS
expression in soybean embryogenic clumps using the PIG with the sodium acetate DNA precipitation method on
gold particles. The correlation coefficient between the two assays was 0.73. (B). Effect of gold particle amount
on transient GUS expression in soybean embryogenic clumps using the PIG. The correlation coefficient between
the two assays was 0.95 (C). Effect of DNA precipitation method and particle composition on transient GUS
expression in soybean embryogenic clumps using the PIG. The correlation coefficient between the two assays
was 0.78 (D). (histochemical
and MUG assay
).
The measurement of gene expression by transient
expression can be used to optimize the amount of DNA
that enters the plant cells and measure promoter strength
and tissue specificity. However, in most cases, stable
expression is desired which occurs at a much lower
frequency. In studies with tobacco cells and leaves about
2-5% of the cells showing transient GUS expression
following bombardment became stably transformed
following antibiotic selection (KLEIN et al., 1988b;
TIMMERMANS et al., 1990). Thus stable integration of
45
140
A
121,3
35
120
123
A
35,8
B
B
102
30
101,3
100
A
28,4
80
25
B
21,4
20
B
22,4
60
15
A
40
57
40
10
20
5
0
DuP-Gold-NaOAc
DuP-Gold-CaCl2
DuP-Tu-NaOAc
DuP-Tu-CaCl2
0
Mode of delivery and precipitation
FIGURE 6 Effect of DNA precipitation method and particle composition on transient GUS expression in
soybean embryogenic clumps using the PDS (histochemical
and MUG assay
). The correlation coefficient
between the two assays was 0.93.
the bombarded genes occurs at low frequency in cells
where transient expression is seen and selection using a
selectable marker gene is usually needed over a period of
up to several months to obtain stable transformants. These
low selection percentages could also in part be due to a
low selection efficiency.
The results with the PDS are similar to those of
Khalafalla et al. (2005) who optimized transient green
fluorescent protein expression with particle bombardment
of soybean embryogenic cultures.
Foundation of Thailand for a scholarship for S. Chanprame.
Financial support was also provided by the Illinois Soybean
Program Operating Board, the North Central Soybean
Research Program, the United Soybean Board and the
Illinois Agricultural Experiment Station.
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CONCLUSIONS
These experiments show that the optimal conditions
for GUS transient expression with the PDS were 1100 psi,
13 cm flying distance, 1 mg gold and 1 µg of DNA per shot
while the optimal protocol for the PIG was 80 psi, 1 mg gold
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We thank the CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico in Brazil) for a
scholarship for M .M. Magalhaes and the Anadhamahidol
CAHOON, E. B.; MARILLIA, E. F.; STECCA, K. L.; HALL, S.
E.; TAYLOR, D. C.; KINNEY, A. J. Production of fatty acid
components of meadowfoam oil in somatic soybean embryos.
Plant Physiology, Washington, v. 124, n. 1, p. 243-251, 2000.
and 11 cm flying distance. The optimum conditions
included 0.6 µm diameter gold particles, 0.8 µg DNA, 1100
psi and 6 cm target distance.
58
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60
COMUNICAÇÃO
YAMAMOTO, L. CIENTÍFICA
Y. et al.
ACLIMATIZAÇÃO DO HÍBRIDO DE ORQUÍDEA EM SUBSTRATOS A BASE
DE PÓ DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
ACCLIMATIZATION OF ORCHID HYBRID IN SUGAR CANE BAGASSE
POWDER BASED SUBSTRATES
LILIAN YUKARI YAMAMOTO1, VANESSA STEGANI2, RICARDO TADEU DE FARIA3,
INÊS CRISTINA DE BATISTA FONSECA4, BRUNO LUIZ DOMINGUES DE ANGELIS5
1
Estudante do curso de Agronomia Universidade Estadual de Londrina/UEL Rua Ponta Grossa, 632 86060-450 Londrina, PR
[email protected]
2
Engenheira Agrônoma, Aluna de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Agronomia Universidade Estadual de Maringá/UEM
Rua Prof. João C. Ferreira, 1512 86809-140 Apucarana, PR [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular, Departamento de Agronomia da Universidade Estadual de Londrina/UEL Rodovia
Celso Garcia Cid Pr 445 Km 380 Cx. P. 6001 86051-990 Londrina, PR [email protected]
4
Engenheira Agrônoma, Dra., Professora Titular, Departamento de Agronomia da Universidade Estadual de Londrina/UEL Rodovia
Celso Garcia Cid Pr 445 Km 380 Cx. P. 86051-990 Londrina, PR [email protected]
5
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular, Departamento de Agronomia da Universidade Estadual de Maringá/UEM Av.
Colombo, 5790 87020-900 Maringá, PR [email protected]
RESUMO
Neste trabalho objetivou-se avaliar a utilização do pó de
bagaço de cana-de-açúcar puro e na mistura com outros substratos
em proporções iguais, como material alternativo ao xaxim na fase de
aclimatização da orquídea Miltonia regnellii x Oncidium concolor.
As plântulas provenientes da propagação in vitro, apresentavam
inicialmente, altura média de 1,0 ± 0,3 cm e foram transplantadas
para bandejas de isopor. Os substratos utilizados foram: xaxim
desfribrado (controle); pó de bagaço de cana-de-açúcar; pó de bagaço
de cana-de-açúcar + isopor; pó de bagaço de cana-de-açúcar + esfagno;
pó de bagaço de cana-de-açúcar + casca de pinus; pó de coco; pó de
coco + pó de bagaço de cana-de-açúcar e vermiculita + plantimax®.
Os substratos compostos foram combinados em proporções iguais.
As variáveis avaliadas após cinco meses do início do experimento
foram: a taxa de sobrevivência, comprimento da parte aérea,
comprimento da maior raiz, massa fresca total, número de raízes, de
pseudobulbos e de brotos. O delineamento experimental foi o de
blocos casualizados com 5 repetições e 10 plantas por parcela. Os
dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas
pelo teste estatístico de Scott-Knott, ao nível de 5% de significância.
Os tratamentos pó de coco e pó de coco + pó de bagaço de canade-açúcar foram os mais eficientes para todos os parâmetros
avaliados, podendo ser indicado como substitutos ao xaxim na
aclimatização da orquídea Miltonia regnellii x Oncidium concolor.
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the use of
sugar cane bagasse and in combination with other substrates
in equal proportions, as an alternative material to xaxim on
acclimatization stage of orchid Miltonia regnelli x Oncidium
concolor. Plantlets obtained by in vitro propagation with an
initial average height of 1.0 ± 0.3 cm were transplanted to
polystyrene trays. The substrates used were: defibered xaxim
(control); sugar cane bagasse powder; sugar cane bagasse
powder + estruted polystyrene; sugar cane bagasse powder +
sphagnum; sugar cane bagasse powder + husk pinus; coconut
powder; coconut powder + sugar cane bagasse powder and
vermiculite + plantimax®. The composed substrates were
combined in the same proportions. Survival rate, shoot lenght,
highest root lenght, total fresh mattert, number of roots, pseudo
bulb and sprouts were evaluated five months after the begining
of the experiment. The experimental was set up in randomized
blocks design, with 5 replicates and 10 plants per plot. Data
were submitted to an analysis of variance and the average
compared by the Scott-Knott test at 5% significance. The
treatments coconut powder and coconut powder + sugar cane
bagasse powder were the most efficient for all variables
evaluated, and thus may be indicated as substitutes for xaxim
on acclimatization of Miltonia regnellii x Oncidium concolor
orchid.
Termos para indexação: Propagação in vitro, Orchidaceae,
Miltonia regnellii, Oncidium concolor.
Index terms: In vitro propagation, Orchidaceae, Miltonia
regnellii, Oncidium concolor.
(Recebido em 21 de dezembro de 2007 e aprovado em 23 de março de 2009)
Aclimatização do híbrido de orquídea em substratos...
O mercado interno e externo de flores e plantas
ornamentais está em plena fase de expansão, ocupando
uma área de aproximadamente 190 mil hectares,
movimentando em torno de US$ 20 bilhões por ano (RISCH,
2006).
As orquídeas estão entre as plantas ornamentais
mais apreciadas e de maior valor comercial. Sua presença
se faz marcante na floricultura, onde são utilizadas tanto
como flor de corte, na composição de arranjos florais como
plantas de vaso, com a longevidade mantida por várias
semanas (LORENZI & SOUZA, 2001).
De acordo com o IBAMA (2005), a prática
extrativista para comercialização ou até mesmo a
devastação das matas propicia a extinção de algumas
orquídeas brasileiras do seu habitat natural. Dentre as
espécies ameaçadas de extinção temos como exemplos a
Oncidium concolor Hook. que se encontra na lista da Flora
Ameaçada de Extinção de Minas Gerais e de São Paulo e a
Miltonia regnellii Rchb. f. que está na lista do Rio Grande
do Sul (BIODIVERSITAS, 2005).
A produção de plantas micropropagadas surge
como uma alternativa viável, pois a propagação in vitro é
uma técnica bem sucedida e tem sido amplamente utilizada,
principalmente em plantas ornamentais, permitindo a
obtenção de um grande número de mudas em curto espaço
de tempo e em qualquer época do ano (MACIEL et al.,
2000).
Muitos pesquisadores têm estudado substratos que
possam ser alternativos ao xaxim, em razão do fato deste
(Dicksonia sellowiana Hook., popularmente denominado
de samambaia-açu) ainda ser o material utilizado pela
maioria dos orquidófilos e produtores brasileiros. Em 1992,
decorrente do extrativismo, foi criada no Rio Grande do
Sul, a lei 9.519 que proíbe a extração do xaxim em florestas
nativas (GONÇALVES, 1992; KÄMPF, 2000; STRINGHETA
et al., 2002).
A exploração de D. sellowiana Hook. levou a sua
inclusão em Listas Oficiais de Espécies da Flora Ameaçadas
de Extinção (Portaria/IBAMA. no 37-N/92 e COPAM 085/
97) e no Apêndice II da Convenção Internacional sobre o
61
Comércio Internacional de Espécies da Fauna e Flora em
Perigo de Extinção - CITES. De acordo com a Resolução
Conama nº 278/2001, a sua exploração está proibida, até
que sejam estabelecidos critérios técnicos, cientificamente
embasados, que garantam a sustentabilidade da exploração
e a conservação genética das populações exploráveis
(IBAMA, 2007).
Fermino (1996) esclarece que a utilização de resíduos
da agroindústria disponíveis regionalmente como
componente para substratos pode propiciar a redução de
custos, assim como auxiliar na minimização da poluição
decorrente do acúmulo desses materiais no meio ambiente.
Segundo Barroso et al. (1998), entre os resíduos
agroindustriais com alto potencial de utilização na produção
de mudas, encontra-se o bagaço de cana-de-açúcar que
consiste no resíduo obtido após a filtração do caldo da
cana. Leles et al. (1998), testando o bagaço de cana e torta
de filtro obteve sucesso na produção de mudas de
Hymenaea courbaril L. e Apuleia leiocarpa J. F. Macbr.
Samôr et al. (2002) confirmam que estes substratos podem
ser recomendados para a produção de mudas de angico e
sesbânia.
Entende-se por aclimatização o conjunto de técnicas
e procedimentos que tem como objetivo adaptar as mudas
que estavam em condições in vitro para as condições
ambientais casa-de-vegetação (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1990).
Colombo et al. (2005), esclarecem que durante a
fase de aclimatização no cultivo da orquídea Cattleya
chocolate drop x (C. guttata x L. tenebrosa) o substrato
pó de coco e o sistema de irrigação intermitente foram os
mais indicados. Faria et al. (2001), avaliaram diferentes
misturas de substratos para duas variedades de orquídeas
nativas do Brasil, e concluíram que para Oncidium baueri
o melhor substrato alternativo foi a vermiculita e para
Maxillaria picta Hook. os melhores substratos
alternativos foram vermiculita + carvão e vermiculita + casca
de arroz carbonizada.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização do
pó de bagaço de cana-de-açúcar puro e na mistura com
62
YAMAMOTO, L. Y. et al.
outros substratos em proporções iguais, como um material
alternativo ao xaxim na fase de aclimatização de orquídea
Miltonia regnellii x Oncidium concolor.
O experimento foi conduzido no Centro de Ciências
Agrárias (CCA) da Universidade Estadual de Londrina
(UEL), Estado do Paraná, localizado a 23º 23 de latitude
sul e 51º 11 de longitude oeste, a 566 m de altitude.
O híbrido utilizado neste trabalho foi obtido do
cruzamento artificial de Miltonia regnellii e Oncidium
concolor. As mudas provenientes da propagação in vitro,
com altura média da parte aérea de 1,0 cm ± 0,3 cm, foram
retiradas dos frascos e lavadas em água corrente, para
retirar o excesso do meio de cultura. As plântulas foram
cultivadas em bandejas de poliestireno expandido (18 cm
de largura x 23 cm de comprimento x 5 cm de altura e oito
furos na parte inferior).
Os susbstratos avaliados foram: (T1): xaxim
desfibrado (controle); (T2): pó de bagaço de cana-de-açúcar
(Pó Eco Vegetal-Santa Rita®); (T3): pó de bagaço de canade-açúcar (Pó Eco Vegetal-Santa Rita®) + isopor; (T4): pó
de bagaço de cana-de-açúcar (Pó Eco Vegetal-Santa Rita®)
+ esfagno; (T5): pó de bagaço de cana-de-açúcar (Pó Eco
Vegetal-Santa Rita®) + casca de pinus; (T6): pó de coco
(Padrão 11-Amafibra®); (T7): pó de bagaço de cana-deaçúcar (Pó Eco Vegetal-Santa Rita®) + pó de coco (Padrão
11-Amafibra®); e (T8): vermiculita (Agrofloc) + plantimax®.
Os substratos compostos foram combinados em 1:1 (v/v).
Após o transplantio, as bandejas foram mantidas
em casa-de-vegetação com 60% de sombreamento,
temperatura de 30 ± 5°C e umidade relativa de 50 a 60% e
colocadas sobre bancadas. A irrigação manual foi realizada
diariamente no verão e a cada dois dias no inverno. As
aplicações de nutrientes utilizando a formulação descritas
por Murashige & Skoog (1962) (MS) foram realizadas uma
vez por semana, sendo aplicados 25 mL por bandeja. O pH
foi aferido para 6,0, utilizando solução de KOH (1N).
O experimento foi avaliado 5 meses após a
instalação, sendo analisadas as seguintes variáveis: taxa
de sobrevivência (TS), comprimento da parte aérea (CPA),
comprimento da maior raiz (CMR), massa fresca total (MFT),
número de raízes (NR), de pseudobulbos (NP) e de brotos
(NB).
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados (DBC), com oito tratamentos e cinco
repetições, sendo cultivadas 10 plântulas por parcela. Os
dados foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste estatístico de Scott-Knott, ao nível
de 5% de significância.
Na Tabela 1, são observados os resultados das
variáveis avaliadas no experimento.
Durante a fase de aclimatização da orquídea,
observou-se que os substratos xaxim desfibrado (T1), pó
de coco (T6) e o pó de bagaço de cana-de-açúcar + pó de
coco (T7) proporcionaram maior massa fresca total (MFT)
e comprimento da maior raiz (CMR). A fibra de coco é uma
opção de substituição ao xaxim no enraizamento de estacas
de crisântemo de corte Dendranthema grandiflora
(Ramat.) Kitam. Tzvelev (BEZERRA et al., 2001). Bellé (1999)
relatou que a substituição do xaxim por casca de Pinus
elliotti Engelm. ocasionou a redução no crescimento das
raízes e da parte aérea da orquídea Maxillaria
consangüínea Klotzsch.
As mudas de orquídeas produzidas nos substratos
xaxim desfibrado (T1), pó de bagaço de cana-de-açúcar
(T2), pó de coco (T6), pó de bagaço de cana-de-açúcar +
pó de coco (T7) e vermiculita + plantimax® (T8)
apresentaram maior número de raízes quando comparados
aos substratos pó de bagaço de cana-de-açúcar + isopor
(T3), pó de bagaço de cana-de-açúcar + esfagno (T4) e pó
de bagaço de cana-de-açúcar + casca de pinus (T5), durante
a fase de aclimatização da mesma (Tabela 1).
Podemos considerar nas condições do presente
trabalho, que os tratamentos T7 (pó de bagaço de canade-açúcar + pó de coco) e T6 (pó de coco) são os
tratamentos mais indicados, podendo ser considerados
excelentes substitutos ao xaxim na aclimatização da
orquídea Miltonia regnellii x Oncidium concolor.
Segundo Assis et al. (2005), o xaxim pode ser
substituído por coco desfibrado e pela mistura de coco em
pó e coco em cubos no cultivo da orquídea Dendrobium
Aclimatização do híbrido de orquídea em substratos...
63
TABELA 1 Média dos tratamentos para as características: taxa de sobrevivência (TS), massa fresca total (MFT),
comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da maior raiz (CMR), número de raízes (NR), número de pseudobulbos
(NP) e número de brotos (NB) durante a aclimatização da orquídea Miltonia regnellii x Oncidium concolor, em oito
substratos.
Tratamentos
T1(2)
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
CV (%)
TS (%)
94,0 a(1)
92,0 a
96,0 a
92,0 a
86,0 a
96,0 a
98,0 a
90,0 a
8,86
MFT (g)
0,91 a
0,51 b
0,47 b
0,57 b
0,46 b
0,74 a
0,73 a
0,58 b
23,86
CPA (cm)
5,42 a
5,21 a
5,65 a
5,27 a
5,22 a
5,36 a
5,30 a
5,07 a
8,89
CMR (cm)
6,93 a
5,04 b
5,07 b
5,42 b
4,19 b
6,26 a
6,21 a
5,25 b
14,15
NR(3)
5,48 a
4,07 a
3,38 b
2,77 b
2,91 b
3,99 a
3,95 a
4,16 a
23,57
NP(3)
1,48 a
1,52 a
1,44 a
1,18 a
1,29 a
1,64 a
1,73 a
1,44 a
23,00
NB(3)
0,95 a
1,02 a
0,49 a
0,54 a
0,44 a
0,51 a
0,80 a
0,61 a
29,47
(1) Médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si, no nível de 5% de significância pelo teste Scott-Knott.
(2) T1: xaxim desfibrado (controle); T2: pó de bagaço de cana-de-açúcar; T3: pó de bagaço de cana-de-açúcar + isopor;
T4: pó de bagaço de cana-de-açúcar + esfagno; T5: pó de bagaço de cana-de-açúcar + casca de pinus; T6: pó de coco;
T7: pó de bagaço de cana-de-açúcar + pó de coco; T8: vermiculita+ plantimax®.
(3) Dados submetidos a transformação raiz quadrada.
nobile Lindl. Resultados positivos também foram obtidos
por Colombo et al. (2005), com os substratos pó de coco e
a fibra de coco, sendo considerados os mais indicados na
substituição do xaxim para a aclimatização da orquídea
Cattleya chocolate drop x (C. guttata x L. tenebrosa).
Análises referentes à taxa de sobrevivência (TS),
comprimento da parte aérea (CPA), número de pseudobulbos
(NP) e número de brotos (NB), demonstraram que não houve
diferença significativa entre os tratamentos, indicando que
todos os substratos proporcionaram condições semelhantes
de desenvolvimento para as plantas (Tabela 1).
Com base nos resultados obtidos, conclui-se que
o tratamento (T6) pó de coco puro e o tratamento (T7) pó
de bagaço de cana-de-açúcar na mistura com o pó de coco
(1:1 v/v) são os mais indicados para substituir o xaxim na
aclimatização da orquídea Miltonia regnellii x Oncidium
concolor.
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COMUNICAÇÃO
CIENTÍFICA
Micropropagation of black pepper
(Piper nigrum)
65
MICROPROPAGATION OF BLACK PEPPER (Piper nigrum)
MICROPROPAGAÇÃO DA PIMENTA-DO-REINO (Piper nigrum)
ELISA FERREIRA MOURA1, ILMARINA CAMPOS DE MENEZES2, ORIEL FILGUEIRA DE LEMOS3, OSMAR
ALVES LAMEIRA4, LEILA MÁRCIA SOUZA DO AMARAL5, CLARISSE BELTRÃO ROSAS ROCHA6
1
Bióloga, Dra., Embrapa Amazônia Oriental, Laboratório de Genética Molecular Trav. Enéas Pinheiro, s/n Marco 66095-100
Belém, PA [email protected]
2
Bióloga, MsC., Embrapa Amazônia Oriental, Laboratório de Genética Molecular Trav. Enéas Pinheiro, s/n Marco 66095-100
3
Engenheiro Agrônomo, Dr., Embrapa Amazônia Oriental, Laboratório de Biotecnologia Trav. Enéas Pinheiro, s/n Marco 66095-100
4
Engenheiro Agrônomo, Dr., Embrapa Amazônia Oriental, Laboratório de Biotecnologia Trav. Enéas Pinheiro, s/n Marco 66095-100
5
Engenheira Agrônoma, Embrapa Amazônia Oriental
Trav. Enéas Pinheiro, s/n Marco 66095-100 Belém, PA
[email protected]
6
Msc., Embrapa Amazônia Oriental Trav. Enéas Pinheiro, s/n Marco 66095-100 Belém, PA [email protected]
ABSTRACT
Black pepper (Piper nigrum L.) is widely used in
culinary as a condiment and is very important for the economy
of Northern Brazil. The aim of this work was to test
combinations and concentrations of plant growth regulators in
black pepper in vitro propagation. Shoot tips from seedlings
germinated in vitro were established on medium containing
Murashige & Skoog salts and vitamins supplemented with 3%
sucrose, 0.65% agar and three concentrations of 6benzylaminopurine - BAP or 6-furfurylaminopurine - KIN (6.2,
12.5 and 25 M) combined or not with 1.25 M 3-indolylacetic acid - IAA to verify the number of shoots produced.
After 30 days, nodal segments were excised from regenerated
shoots and were established on similar medium, but containing
5, 10 and 20 M BAP or KIN combined or not with 1 M
IAA, for two subcultures. It was verified the number of nodal
segments generated per explant. After the establishment and
the first subculture, there was no difference among the average
number of explants generated by all treatments. After second
subculture, there was difference among treatments means,
mainly due to a reduction on the average number of explants
generated. Five M BAP had the lowest reduction. IAA addition
was not efficient and it had a negative effect combined with
KIN. In vitro rooting was obtained with 0.54, 1.34 and 2.69
M NAA, with 98% efficiency. Microplants obtained in vitro
were transferred to vermiculite and were acclimatized
successfully under greenhouse conditions.
para a economia do Norte do Brasil. Neste trabalho objetivou-se
testar diferentes combinações e concentrações de reguladores de
crescimento na propagação in vitro da pimenta-do-reino. Ápices
caulinares de plântulas germinadas in vitro foram estabelecidos
em meio contendo sais e vitaminas de Murashige & Skoog com
3% de sacarose, 0,65% de ágar e três concentrações de 6benzilaminopurina - BAP ou 6-furfurilaminopurina - KIN (6,2,
12,5 e 25 M) combinadas ou não com 1,25 M de ácido 3indol-acético AIA, para verificar o número de brotos gerados.
Após 30 dias, segmentos nodais foram extraídos dos brotos
regenerados e estabelecidos em meio similar, mas contendo 5, 10
e 20 M de BAP ou KIN combinados ou não com 1 M de AIA,
por dois subcultivos. Foi verificado o número de segmentos nodais
gerados por explante. No estabelecimento e no primeiro
subcultivo, não houve diferença entre os tratamentos na média de
explantes gerados. No segundo subcultivo, houve diferença entre
os tratamentos, principalmente decorrente da redução na média
de segmentos nodais gerados. A menor redução ocorreu com 5
M de BAP. A adição de AIA teve efeito negativo para KIN. O
enraizamento in vitro foi obtido com 0,54, 1,34 e 2,69 M de
ANA, com 98% de resposta. As microplantas obtidas in vitro
foram transferidas para vermiculita e aclimatadas em casa-devegetação com sucesso.
Index terms: Plant growth regulators, organogenesis, aromatic
plant, Piper nigrum.
Black pepper is widely used in culinary as a
condiment. It is an important crop for the economy of
Northern Brazil, which in 2001 produced 45 thousand tons
of black pepper, 90% in Pará state alone . Black pepper
vines usually bear fruits from 5 to 15 years in Asia, but
RESUMO
A pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) é amplamente
utilizada na culinária como condimento e é muito importante
Termos para indexação: Reguladores de crescimento vegetais,
organogênese, planta aromática, Piper nigrum.
(Recebido em 4 de dezembro de 2007 e aprovado em 4 de maio de 2009)
66
MOURA, E. F. et al.
produces only from 3 to 5 years in Brazil. This is mainly
due to fusariose disease, caused by Fusarium solani f. sp.
piperis. This fungus tends to decrease drastically the
productive life cycle of the plant (ALBUQUERQUE &
DUARTE, 1977). The main method for black pepper mass
propagation is through cuttings, which, if not correctly
managed, may facilitate the fungi spread (DUARTE &
ALBUQUERQUE, 1980).
Cell culture techniques can be a viable alternative
to try to resolve many black pepper problems related to
breeding and productivity. Among plant cell culture
techniques, micropropagation has a high commercial
impact, since it provides the production of a great number
of aseptically plants in a short period of time
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). The success of
a plant micropropagation protocol depends on the control
of several variables (GRATTAPAGLIA & MACHADO,
1998), such as the disinfestation of explants sampled from
the field and acclimatization of microplants produced in
vitro. So, many tests are needed, in order to obtain an
efficient and practical micropropagation protocol.
Protocols for in vitro plant regeneration have been
described for many Piper species (ANAND & RAO, 2000;
BHAT et al., 1992, 1995; MADHUSUDHNAAN et al., 1996;
MISRA et al., 2004; PHILIP et al., 2000; SONIYA & DAS,
2002), including Piper nigrum, via direct organogenesis
(BHAT et al., 1995; JIN-PING & CHENG-MU, 2005; PHILIP
et al., 1992; RAJASEKARAN & KUMAR, 1997) or somatic
embryogenesis (NAIR & GUPTA, 2003, 2006), but using
Indian cultivars. There are no records of micropropagation
protocols for black pepper cultivars adapted to or
developed in Brazil. Due to the importance of black pepper
for the economy of Northern Brazil, the aim of this work
was to test combinations of plant growth regulators in
order to contribute to the development of a
micropropagation protocol for black pepper.
Seeds from black pepper cv. Guajarina were sampled
from the germplasm bank of Embrapa Amazonia Oriental,
in Belém, Pará, Brazil. Two hundred seeds without pulp
were washed under running tap water and submitted to
previous disinfestation, in 0.5% sodium hypochlorite at
38oC overnight. Afterwards, the seeds were immersed in
70% (v/v) alcohol for 1 minute before surface sterilization
with 2% sodium hypochlorite under agitation for 15
minutes. The seeds were rinsed three times in sterile
distilled water and were inoculated in 25 x 150 mm test
tubes with 10 mL of basal medium containing half
concentration of MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) salts
and vitamins, 3% sucrose and solidified with 0.65% agar.
Tubes were maintained in a culture room under 16 hour
photoperiod and 52 mol m-2 s-1 light intensity at 26 ± 1°C
for 60 days.
For establishment phase, forty-eight shoot tips were
excised from black pepper seedlings germinated in vitro in
a laminar flow bench and inoculated in 25 x 150 mm test
tubes containing 10 mL of basal medium (BM). BM
consisted of MS salts and vitamins, 3% sucrose and
solidified with 0.65% agar. BM was supplemented with
two concentrations of 3-indolyl-acetic acid - IAA (0 or 1.25
M) combined with 6-benzylaminopurine - BAP (6.2, 12.5
or 25 M) or 6-furfurylaminopurine - KIN (6.2, 12.5 or 25
M), totalizing 12 treatments. Tubes were maintained in a
culture room under 16 hour photoperiod and 52 mol m-2 s-1
photosynthetic active radiation at 26 ± 1°C for 30 days.
After establishment, nodal segments were excised
from in vitro regenerated shoots and were inoculated in
culture tubes containing 10 mL of BM supplemented with
two concentrations of IAA (0 or 1 M) combined with
BAP (5, 10 and 20 M) or KIN (5, 10 and 20 M), totalizing
12 treatments. This represented the first subculture. Tubes
were maintained in a culture room under 16 hour
photoperiod and 52 mol m-2 s-1 photosynthetic active
radiation at 26 ± 1°C for 90 days.
Then, after the nodal segments regenerated into
new shoots, nodal explants were excised and replaced into
flasks containing 30 mL of the same medium, using the
same twelve treatments, which represented the second
subculture. Flasks were maintained in a culture room under
16 hour photoperiod and 52 mol m-2 s-1 photosynthetic
active radiation at 26 ± 1°C for 90 days.
In order to induce rooting, the regenerated
plantlets were individualized and inoculated in flasks
containing 30 mL of BM supplemented with three
concentrations of 1-naphthalene acetic acid - NAA (0.54,
1.34 or 2.69 M). Tubes were maintained in a culture room
under 16 hour photoperiod and 52 mol m -2 s -1
photosynthetic active radiation at 26 ± 1°C for 90 days.
All culture media used in this research had their pH
adjusted to 5.8 ± 0.01 and were autoclaved at 121ºC and 1.5
atm for 15 minutes.
The rooted plantlets were acclimatized in vermiculite
substrate under greenhouse conditions.
Trials were conducted according to a full
randomized design. For the establishment phase, it was
analyzed the number of shoots per explant and for
subcultures, it was analyzed the number of nodal segments
produced per explant. All trials were conducted in four
replicates and Tukey s test was used to analyze significant
differences among treatments means, considering p<0.05.
Seeds started to germinate after 45 days of culture,
with 50 ± 10% efficiency. Black pepper shoot tips produced
shoots under the influence of the two cytokinins tested
(BAP and KIN) in three different concentrations and
67
combined or not with an auxin (IAA). Bhat et al. (1995) and
Philip et al. (1992) have already described black pepper in
vitro regeneration, but using Indian cultivars. Jing-ping &
Cheng-mu (2005) have also obtained black pepper
regeneration in vitro using shoot tips. Bhat et al. (1995)
tested several black pepper tissues as explants, such as
roots, leaves, internodes and nodal segments and observed
that only nodal segments could regenerate new plants.
According to this, the objective of black pepper
micropropagation is not restricted to obtain a great number
of shoots per explant, but also to obtain a vigorous plant
development. This would guarantee a satisfactory number
of nodal segments, which could be used as explants.
Shoots regenerated from the explants basis after 30
days on establishment phase. All twelve combinations of
growth regulators were able to regenerate shoots, and there
was no significant difference among them (Table
1).Treatments containing 1.25 M IAA plus 6.25 M BAP,
6.25 M and 12.5 M BAP and 12.5 M KIN produced the
highest media of number of shoots per explant (2.25).
After the first subculture, there was no differences
among the twelve treatments (p=0.92). The average number
of nodal segments generated per explant varied from 2.79,
TABLE 1 Number of shoots obtained for all treatments after 30 days of in vitro establishment of black pepper.
Number of shoots
Plant Growth Regulators ( M)
BAP
KIN
IAA
6.25
1.25
2.25a
12.50
1.25
2.25a
25.00
1.25
2.25a
6.25
1.50a
12.50
0.75a
25.00
0.50a
6.25
1.25
2.25a
12.50
1.25
1.25a
25.00
1.25
1.25a
6.25
1.75a
12.50
2.50a
25.00
2.25a
Means followed by the same letter within the columns do not differ from another for number of shoots of black pepper
cultured in vitro, according to Tukey s test, p<0.05.
68
MOURA, E. F. et al.
using 5 M KIN and 1 M IAA, to 7.83 using 10 M KIN
(Table 2). After the second subculture, there was difference
on the production of nodal segments among treatments
(p=0.00, Table 2). However, all growth regulators
combinations generated less nodal segments than after
the first subculture (Table 2). The least dramatic reduction
was related to the treatment supplemented with 5 M BAP,
which generated 6.17 nodal segments per explant in the
first subculture and 4.49 in the second subculture (Table
2). However, the remaining treatments went through a great
reduction in the formation of nodal segment per explant.
The 5 M BAP treatment , combined or not with IAA, had
the greatest formation of nodal segments.
Results demonstrated that IAA addition is not
required for black pepper micropropagation (Table 2). In
general, BAP and KIN and their different concentrations
generated similar number of nodal segments per explant,
with or without IAA. However, the addition of 1 M IAA
was more deleterious to treatments supplemented with
KIN, except at 20 M concentration.
For Rajasekaran & Kumar (1997), the use of the
auxin naphthalene acetic acid (NAA) combined with BAP
for shoot proliferation in black pepper generated good
results. However, Philip et al. (1992) observed that the
addition of indole-3-butyric acid - IBA to medium
supplemented with BAP reduced the proliferation of shoots
in black pepper. This could indicate that the efficiency of
auxin combined with a cytokinin in black pepper
micropropagation depends on the cultivar.
The two types of cytokinins caused different
actions on shoot regeneration. BAP had stimulated a higher
shoot proliferation, while KIN regenerated microplants with
a better formation. Bhat et al. (1995) observed different
reactions of nodal explants by using the same growth
regulators, since BAP had induced shoot buds proliferation,
and KIN had supported axillary bud proliferation. The
combination of both growth regulators has been tested to
verify the formation of multiple and well developed shoots
by Soniya & Das (2002), who was successful in obtaining
Piper longum explants shoot proliferation.
The period between subcultures was 90 days. It
was observed necrosis on shoots tissues after that, and
before 90 days the shoots were not long enough to be
subcultured. Philip et al. (1992) had established an interval
TABLE 2 Average number of nodal segments obtained for all treatments for two 90 days in vitro subcultures of black
pepper.
Average number of nodal segments
Plant Growth Regulators ( M)
BAP
KIN
IAA
1st subculture
2nd subculture
5
1
5.67a
3.36ab
10
1
6.54a
1.75abc
20
1
4.35a
1.42abc
5
6.17a
4.49a
10
5.89a
2.62abc
20
7.29a
1.32abc
5
1
2.79a
0.16c
10
1
2.98a
1.27abc
20
1
5.86a
0.62bc
5
6.52a
2.51abc
10
7.83a
0.43bc
20
5.52a
0.76bc
Means followed by the same letter within the columns do not differ from another for average number of nodal segments
of black pepper in vitro cultured, according to Tukey s test, < 0.05.
of 120 days between subcultures. An interval of 90 days
can generate a faster micropropagation protocol.
When the regenerated microplants were 4-5 cm long,
they were separated and transferred to MS medium
containing three different concentrations of NAA for
rooting. All NAA concentrations generated roots
formation, with a great efficiency (Table 3). There was no
difference among NAA concentrations, and they formed
at least 9 roots per plantlet (Table 3), which were short and
non-hairy. Philip et al. (1992) also obtained roots in black
pepper shoots cultured in vitro, using 5.37 M NAA. Black
pepper rooting can also be achieved using other
substances. Jin-ping & Cheng-mu (2005) obtained black
pepper plantlets rooting by using a combination of IBA
and IAA, and Rajasekaran & Kumar (1997) obtained black
pepper in vitro rooting using White s medium with or
TABLE 3
69
without activated charcoal and did not use growth
regulators.
The rooted plantlets were acclimatized on
vermiculate substrate under greenhouse conditions. After
eight weeks of evaluation, 91.0 ± 5.0% of the plants
survived, indicating they were healthy and well formed
(Figure 1).
Black pepper tissues obtained from in vitro
germinated plantlets can be used for proliferation. Among
cytokinins tested, BAP at 5 M had a greater response,
mainly because it did not have a great reduction on nodal
explants formation after two subcultures. IAA is not
essential for black pepper micropropagation, in addition
to BAP or KIN. For KIN at lower concentrations (5 and 10
M), it could be even harmful. Also, rooting of microplants
using NAA at 0.54 to 2.69 M was satisfactory.
Average number of roots and rooting efficiency on shoots of in vitro micropropagated black pepper.
NAA M
0.54
1.34
2.69
Average number of roots
11.00
9.30
10.60
Efficiency (%)
97.11
100.00
97.14
FIGURE 1 Plantlets of black pepper in vitro obtained being acclimatized under greenhouse conditions.
70
MOURA, E. F. et al.
REFERENCES
ALBUQUERQUE, F. C.; DUARTE, M. L. R. Pimenta do
reino e suas doenças na região Amazônica. Ciência
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Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 70, n. 3, p. 325327, 2002.
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS E COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation
é editada semestralmente pela Editora da Universidade
Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos
científicos e comunicações científicas da área de cultura
de tecidos de plantas, elaborados por membros da
comunidade científica nacional e internacional. Não é
cobrada taxa para publicação de trabalhos, desde que um
dos autores seja sócio e esteja em dia com a ABCTP
(Associação de Cultura de Cultura de Tecidos de Plantas).
É condição fundamental que os artigos/comunicações
submetidos à apreciação da revista Plant Cell Culture &
Micropropagation não foram e nem serão publicados
simultaneamente em outro lugar. Com a aceitação do artigo
para publicação, os editores adquirem amplos e exclusivos
direitos sobre o artigo para todas as línguas e países. A
publicação de artigos/comunicações dependerá da
observância das Normas Editoriais, dos pareceres do Corpo
Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os pareceres têm
caráter sigiloso e imparcial, e tanto os autores quanto os
membros do Corpo Editorial e/ou Comissão ad hoc não
obtêm informações identificadoras entre si.
Os conceitos e afirmações contidos nos artigos e
comunicações serão de inteira responsabilidade do(s)
autor(es).
1. SUBMISSÃO:
Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas e
junto do mesmo deverá ser encaminhado ofício dirigido ao
Editor Chefe da revista, solicitando a publicação do artigo.
Esse ofício deverá conter o pedido de apreciação
na revista ao editor chefe, a declaração de ser um trabalho
original e não ter sido submetido a nenhuma outra revista,
ser assinado por todos os autores, constar o endereço
completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão,
exclusão ou alteração na ordem dos autores, deverá ser
notificada mediante ofício assinado por todos os autores
(inclusive do autor excluído).
Originais: quatro vias impressas e uma via em CDR, com
texto e ilustrações e gráficos. Das 4 vias impressas apenas
1 deve conter os nomes completos dos autores e rodapé
na primeira página.
Processador de texto: Word for Windows (version 98, 2000,
XP ou 2003)
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Rodapé (2,5cm).
Papel: formato A4
Fonte: Times New Roman, tamanho 12
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas
consecutivamente, incluindo as ilustrações
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser
apresentadas no módulo tabela do Word. O título deve
ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados
em preto e branco, nítidos e com contraste, escaneados,
inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão tif ou jpg ,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito, sem caixa de textos e agrupados, em arquivo à
parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito
aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituirse em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da
pesquisa. Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos
Devem seguir as normas para citação no texto e na
seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na
seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que
o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este não
esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão
Disponível em: e da data de acesso ao documento,
precedida da expressão Acesso em: .
Nota: Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes (ABNT, NBR6023/2000, p. 4).
Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de
institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000.
Disponível em: <http://www.abipti.org.br>. Acesso em:
01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
O INFORMARÁ SOBRE SUA PUBLICAÇÃO. OS
ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇÕES
SERÃO DEVOLVIDOS AO AUTOR PARA A DEVIDA
REVISÃO.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM
DE APROVAÇÃO.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR DO
RECEBIMENTO DO ORIGINAL E, POSTERIORMENTE,
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO
DEVOLVIDOS.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS PELA
COMISSÃO EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Plant Cell Culture & Micropropagation , a
semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
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be associated and have paid all charges required by the
ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order to be
tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies that
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nor has appeared previously in part or in whole. On
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full copyright of the manuscript in all languages and
countries. Publications will depend on editorial rules and
on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer
and editorial opinions will be anonymously communicated
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communications are of the entire responsibility of the
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The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
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inclusion, exclusion or alteration in the authors order must
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excluded.
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Format: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou 2003)
Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper and
lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
footnote
Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper and
they must be presented in Word or Excel. The title should
be above and be presented in the language in which the
article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in
the text after citation and also in a separate file (on the
same diskette as the article) saved in extension tif or
jpg , with resolution of 300 dpi. The title should be below
and presented in the language in which the article was
written and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented using
a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words in
capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all written
in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five. They
should not repeat words that are already in the title. These
may include phrases as well as individual words and should
be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject area
that the paper will discuss. It should neither give an
extensive review nor should it include details about the
results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIALAND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(S) OF THE AUTHOR(S)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must
not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after
the abstract using terms different from those used in the
title and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article
ABSTRACT AND INDEX TERMS IN PORTUGUESE
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension TIFF or JPEG with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation and
also in a separate file (on the same diskette as the article)
saved in extension TIFF or JPEG with resolution of
300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman
font, size 10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
5. THE BRAZILIAN ASSOCIATION OF PLANT TISSUE
CULTURE (ABCTP) WILL INFORM THE AUTHOR THE
RECEIPT OF THE ORIGINAL MANUSCRIPT AND
EVENTUALLY IT WILLALSO SEND INFORMATION
REGARDING ITS PUBLICATION. MANUSCRIPTS
THAT REQUIRE MODIFICATIONS WILL BE
RETURNED TO THE AUTHOR FOR THE RESPECTIVE
REVISION ANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON T BE
RETURNED TO THE AUTHOR.
7. ARTICLES WILL BE PUBLISHED ACCORDING TO
THE ORDER OF RECEIPTAND APPROVAL.
8. IFANY OFTHESE RULES ARE NOTATTENDED THE
MANUSCRIPTWILL BE RETURNED TO THE AUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED BY
THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWINGADDRESS:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 Lavras MG BRAZIL

Volume 5 Número 1 - abctp

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102 Micropropagação: cultivo in vitro de calos de cenoura PDF

AUTORIZAÇÃO PARA MENORES LAVRAS RODEO FESTIVAL 2016

Volume 9 - Número 1-2