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Revista do
Instituto Adolfo Lutz
ISSN: 0073-9855 (impresso)
ISSN: 1983-3814 (on-line)
RIALA6
Volume 74 número 4, 2015
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE
ISSN 0073-9855
Secretaria de Estado da Saúde
Coordenadoria de Controle de Doenças
REVISTA DO
INSTITUTO ADOLFO LUTZ
Volume 74 número 4, 2015
Outubro – Dezembro 2015
Publicação trimestral/ quarterly publication
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REVISTA DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ
(Secretaria de Estado da Saúde)
São Paulo, SP – Brasil
1941
2015, 74(4)
ISSN 0073-9855
CDD18614.07205
RIALA 6
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Abstracts; Sumários Correntes Brasileiros; Toxicology Abstracts; Tropical
Diseases Bulletin; e Virology Abstracts.
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Rev Inst Adolfo Lutz. 2015; 74 (4)
ARTIGO ORIGINAL/ORIGINAL ARTICLE
1666 Padronização da metodologia dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em saliva
Standardization of dot-ELISA methodology for detection of IgG antibodies anti-Toxoplasma gondii in saliva
Barbara Fialho Carvalho SAMPAIO, Luciana Regina MEIRELES, Heitor Franco de ANDRADE JÚNIOR.....................................310-319
1667 Validação de ensaio imunoenzimático utilizando-se o Conceito do Erro Total, os Perfis de Exatidão e o Índice de Exatidão como
alternativa à abordagem clássica do ICH
Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay by using the Total Error Concept, the Accuracy Profiles and the Accuracy Index
as alternatives to the traditional ICH approach
Jorge Luiz dos Santos POSSAS, Jarbas Emílio dos SANTOS, Michele Cardoso do NASCIMENTO, Patrícia Alves dos SANTOS,
Deivid Wanderson Couto dos ANJOS, Eduardo de Bonis de BRITTO, Antônio Eugênio Castro Cardoso de ALMEIDA, Wlamir
Corrêa de MOURA.........................................................................................................................................................................................320-336
1668
Avaliação da concordância entre as linhagens de camundongos Swiss Webster e B6D2F1 no teste de potência da Eritropoietina
Humana Recombinante (rhEPO): a experiência do Laboratório Nacional de Controle
Evaluation of the agreement between Swiss Webster and B6D2F1 mice lineages in the potency test of Recombinant Human Erythropoietin
(rhEPO): the Brazilian National Control Laboratory experience
Michele Cardoso do NASCIMENTO, Clarice Lima do Canto ABREU, Rodrigo Netto COSTA, Wlamir Corrêa de MOURA, Isabella Fernandes
DELGADO.........................................................................................................................................................................................................337-346
1669 Determinação de fluoreto em baixas concentrações: validação de método com eletrodo íon seletivo para análise da água utilizada
na preparação de soluções de diálise
Determination of fluoride at low concentrations: validation of method using ion selective electrode to analyze the water used in the
preparation of dialysis solutions
Sérgio DOVIDAUSKAS, Isaura Akemi OKADA, Marina Miyuki OKADA, Rita de Cássia BRIGANTI, Camila Cardoso de
OLIVEIRA..........................................................................................................................................................................................................347-360
1670 Validação de um método prático para determinação de níveis de amoxicilina em águas naturais por CLAE-UV e sua aplicação na
qualidade ambiental
Validation of a practical method for determination of amoxicillin contents in natural waters by means of HPLC-UV and its application
in the environmental quality
Caio Matheus da Rocha Couqueiro Monteiro de OLIVEIRA, Kaíque Mesquita CARDOSO, Milena Mendes de SOUZA, José Soares dos
SANTOS, Maria Lúcia Pires dos SANTOS...................................................................................................................................................361-370
v
1671 Avaliação da técnica PCR multiplex para detecção de fraude por adição de carne bubalina em carne moída bovina
Evaluation of a multiplex PCR for detection of a fraud in the minced beef meat by adding buffalo meat
Andrey Carlos do Sacramento de OLIVEIRA, Bárbara Cristina Amorim FERREIRA, Gabrielle Virgínia Ferreira CARDOSO, Cleyzer
Lopes SILVA, Andréia Silva da SILVA, Flávio da SILVA, Rafael Monteiro de MELO, Diogo José CARDILLI, Fábio Pereira Leivas LEITE,
Talita Bandeira ROOS, Carina Martins de MORAES....................................................................................................................................371-379
1672
Composição centesimal de iogurtes tradicionais e iogurtes líquidos: incompatibilidade com as descrições da rotulagem
Centesimal composition of traditional yoghurts and drinking yoghurts: inconsistency with the descriptions on the labels
Heloísa Fernanda Bandeira PACHECO, Letícia Maria Nogueira SÍGOLO, Ana Paula Badan RIBEIRO, Julicristie Machado de
OLIVEIRA.........................................................................................................................................................................................................380-389
1673 Composição proximal e mineral de biscoitos tipo amanteigado enriquecidos com diferentes farinhas de casca de frutas
Proximal and mineral composition of buttery biscuits enriched with different fruits peel flours
Myrian Dayane Santana NOVAES, Adriana Paiva de OLIVEIRA, Thais HERNANDES, Erika Cristina RODRIGUES, Keyla dos Santos
SIGARINI, Francisca Graciele Gomes PEDRO, Ricardo Dalla VILLA.........................................................................................................390-398
1674 Ocorrência de Escherichia coli e Staphylococcus aureus resistentes a antimicrobianos e parasitos Entamoeba coli e Ascaris lumbricoides
em merendas escolares
Occurrence of antibiotic-resistant Escherichia coli and Staphylococcus aureus and of Entamoeba coli and Ascaris lumbricoides parasites
in the school snacks
Daiane Bertholin ANSELMO, Catierine Hirsh WERLE, Fernando Leite HOFFMANN(in memorian). .....................................................399-409
1675 Qualidade de frutas e hortaliças orgânicas comercializadas em feiras livres
Quality of organic fruits and vegetables sold in street markets
Amanda Brinco FERREIRA, Sandra Helena Ferreira de ALVARENGA, Jackline Freitas Brilhante de SÃO JOSÉ...........................410-419
1676 Qualidade microbiológica do alho (Allium sativum) produzido e comercializado em mercados públicos
Microbiological quality of garlic (Allium sativum) produced and sold in public markets
Luiza Mayara dos Santos FONTENELE, Maria Liliane Ximendes AZEVEDO, Francisco das Chagas CARDOSO FILHO, Maria Christina
Sanches MURATORI, Leonel Rômulo Souza de SÁ, Maria Marlucia Gomes PEREIRA......................................................................420-425
1677 Parâmetros de qualidade de polpas de frutas congeladas
Parameters of quality of frozen fruit
Tânia Maria Neves CASTRO, Pâmella Volpato ZAMBONI, Silvia DOVADONI, Adelino CUNHA NETO, Luiz José
RODRIGUES...................................................................................................................................................................................................426-436
COMUNICAÇÃO BREVE/ BRIEF COMMUNICATION
1678 Detection of Leishmania (Viannia) braziliensis by PCR in samples collected by scraping the lesion edges from patients of an
endemic area
Detecção de Leishmania (Viannia) braziliensis por PCR em amostras coletadas por raspagem de bordas de lesões de pacientes de uma
área endêmica
Aparecida Helena de Souza GOMES, Izabel Madornado ARMELIN, Vera Lucia PEREIRA-CHIOCCOLA....................................437-441
1679 Importância da atuação do Laboratório de Saúde Pública nas perícias judiciais relacionadas a matérias estranhas em alimentos
Importance of the Public Health Laboratory on the expert advice requested by the courts regarding foreign matter in food
Sonia de Paula Toledo PRADO, Cristina Eico YOKOSAWA, Roberta Ribeiro Costa ROSALES............................................................442-446
vi
1680 Avaliação das características físico-químicas da carne de perna de avestruz (Struthio camelus) para produção de embutidos
Evaluation of physical-chemical characteristics of the meat from the of ostrich (Struthio camelus) leg for sausage production
Edvaldo Vasconcelos de CARVALHO FILHO, João Andrade da SILVA......................................................................................................447-452
RELATO DE CASO/ CASE REPORT
1681 Esporotricose em cão Yorkshire Terrier na cidade de São Paulo, SP – Brasil: relato de caso
Sporotrichosis in Yorkshire Terrier dog in the city of São Paulo, SP – Brazil: case report
Fernanda Fidelis GONSALES, Juliana Mariotti GUERRA, Danilo Gouveia WASQUES, Rodrigo Albegaria RÉSSIO, Paulo Eduardo
BRANDÃO, Laura Yaneth VILLARREAL Buitrago, Natália Coelho Couto de Azevedo FERNANDES.............................................453-457
RESUMOS DE TESES E DISSERTAÇÕES
1682 Avaliação de diferentes vias de imunização com novo adjuvante para Neisseria meningitidis em diferentes linhagens de
camundongos
Evaluation of different immunization routes with new adjuvant for Neisseria meningitidis in different strains of mouse
Brito LT......................................................................................................................................................................................................................4 5 8
1683 Imunogenicidade de antígenos de vesículas de membrana externa (OMVs) de Neisseria meningitidis B associado a lípide catiônico
(DDA-BF)
Immunogenicity of Neisseria meningitidis B outer membrane vesicles (OMVs) associated with cationic lipid (DDA-BF)
Rinaldi FM.............................................................................................................................................................................................................. . 4 5 9
COLABORADORES..................................................................................................................................................................................................460-467
INSTRUÇÕES AOS AUTORES................................................................................................................................................................................468-476
vii
Rev Inst Adolfo Lutz
Artigo Original/ Original Article
Padronização da metodologia dot-ELISA para detecção
de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em saliva
Standardization of dot-ELISA methodology for detection of
IgG antibodies anti-Toxoplasma gondii in saliva
RIALA6/1666
Barbara Fialho Carvalho SAMPAIO*, Luciana Regina MEIRELES, Heitor Franco de ANDRADE JÚNIOR
*Endereço para correspondência: Laboratório de Protozoologia, Instituto de Medicina Tropical de São Paulo,
Universidade de São Paulo. Av. Dr. Eneas de Carvalho Aguiar, 470, São Paulo, SP, Brasil, CEP: 05403-000.
Tel: 11 3061-7010. E-mail: [email protected]
Recebido: 15.07.2015 - Aceito para publicação: 21.12.2015
RESUMO
O diagnóstico da infecção pelo T. gondii é usualmente feito pelas técnicas sorológicas, mas a amostra
(soro ou plasma) pode ser restrita em determinados grupos protegidos, em que a coleta de sangue é
considerada agressiva e invasiva. Os anticorpos são encontrados em outros materiais biológicos, de
coleta não invasiva, como a saliva. Os métodos de detecção de anticorpos no mercado estão padronizados
para utilizar amostras de soro, e há metodologias alternativas de maior sensibilidade utilizando-se
saliva, mas estas requerem equipamentos de difícil uso no campo. Dot-ELISA tem alta sensibilidade
e leitura visual sem equipamentos, que facilita a execução de ensaio em campo utilizando-se técnica
de triagem rápida e eficiente. Neste contexto, foi padronizado o dot-ELISA de alta sensibilidade para
detecção de anticorpos anti-T. gondii em saliva e soro, utilizando-se amostras de 20 voluntários adultos.
A sensibilidade e a especificidade do dot-ELISA padronizado foram semelhantes em soro e saliva,
com exata distinção de amostras positivas e negativas, mesmo na ocorrência de baixas concentrações
de anticorpos como na saliva. A saliva mostra ser material biológico adequado para detecção de
anticorpos anti-T. gondii em estudos epidemiológicos da toxoplasmose em crianças ou outros grupos
protegidos, em que a coleta de sangue é restrita.
Palavras-chave. toxoplasmose, saliva, imunoglobulina G, imunoensaio, dot-ELISA.
ABSTRACT
The diagnosis of T. gondii infection is usually performed by serological tests, but the blood collection
could be restricted in some groups as children. Antibodies are also found in other biological materials,
such as saliva, whose sampling has been done by means of non-invasive procedure. Commercially
available assays for performing antibody detection are standardized for analyzing serum samples.
There are alternative techniques for detecting antibody in saliva, however they demand the use of
equipment which is not easy to be used in field. Dot-ELISA is highly sensitivity and the results are of
visual reading without any equipments, being available to be used in field studies, by means a rapid
and efficient screening technique. Thus, a dot-ELISA with high sensitivity was standardized for detecting
anti-T. gondii antibodies in saliva and serum by using samples from 20 adult volunteers. Sensitivity
and specificity of the standardized dot-ELISA were similar in both saliva and serum samples, and
precisely distinguishing the positive and negative samples, even in low antibody concentrationcontaining sample as saliva. Saliva showed to be as a potential biological material for detecting
anti-T. gondii antibody in epidemiological studies on toxoplasmosis in children or other protected
groups, where the blood collection is restricted.
Keywords. toxoplasmosis, saliva, immunoglobulin G, immunoassay, dot-ELISA.
310
Rev Inst Adolfo Lutz. 2015; 74(4):310-9
Sampaio BFC, Meireles LR, Andrade Júnior HF. Padronização da metodologia dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG antiToxoplasma gondii em saliva. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):310-9.
INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma doença causada
pelo coccídeo Toxoplasma gondii que apresenta
alta infecciosidade e baixa patogenicidade
em hospedeiros humanos com abrangência
cosmopolita, afetando grande fração da
população humana1. A infecção é adquirida
através da ingestão de oocistos, em solo,
água ou presentes em frutas e verduras mal
lavadas, cistos em carne crua ou malcozida e
pela infecção transplacentária2. Outras formas
menos freqüentes de adquirir a doença são
transfusão sanguínea, transplantes de órgãos
e acidentes laboratoriais3. O agente pode ser
isolado durante a fase aguda da infecção ou
em reativações em componentes orgânicos de
diversos tipos, tais como sangue, líquido
cefalorraquidiano, saliva e medula óssea, assim
como dos conteúdos coletados de infiltrados
cutâneos, de manifestações exantemáticas, do
baço e especialmente, de gânglios linfáticos,
mas o isolamento é demorado e a detecção de
ácidos nucleicos de sensibilidade variável4.
Assim, a principal ferramenta para o
diagnóstico da toxoplasmose é a detecção
de anticorpos no sangue. Diversas provas
sorológicas foram preconizadas para o diagnóstico
laboratorial da toxoplasmose, como: reação
de Sabin – Feldman5; reação de aglutinação
do látex6; reação de fixação de complemento7;
reação de hemaglutinação indireta8; reação
de imunofluorescência indireta2 e diversas
reações imunoenzimáticas (ELISA) de diversos
desenhos e revelações, além de immunoblotting
ou western blotting e dot–ELISA9.
Todos os testes comerciais de detecção
de anticorpos na toxoplasmose são desenhados
para o uso de soro, que apresenta concentração
alta e semelhante de IgG entre as amostras,
mas sua coleta implica em pequena invasão
do hospedeiro. Em estudos de incidência
de doenças de alta prevalência e cicatriz
sorológica, como a toxoplasmose10, o grupo
alvo de detecção de incidência é o menos exposto
ou recentemente exposto, ou seja, crianças e
escolares pela pouca idade e tempo de
exposição, já que a toxoplasmose é cosmopolita
e tem poucas regiões de baixa prevalência11.
A saliva é um fluído específico proveniente
da secreção das glândulas salivares como a
parótida, submandibular, sublingual e glândulas
menores, acrescida de substâncias oriundas do
fluido crevicular gengival com IgG, secreções
brônquicas
ou
nasais,
células
epiteliais
descamadas, restos de alimentos, micro-organismos
e produtos de seus metabólicos12.
Como alternativa na detecção de IgG
específica, a saliva pode oferecer a facilidade
de coleta, de baixo custo e conforto ao paciente
(principalmente crianças), além de ser um
material de fácil manuseio nos procedimentos
diagnósticos. Sua principal desvantagem é a
quantidade variável de IgG e a necessidade de
refrigeração13. Granade et al14 já preconizavam
o uso da saliva para a detecção de IgG específico
para rubéola e vírus da imunodeficiência humana
tipo I, e Santos et al15 também demonstraram
o potencial da saliva para o imunodiagnóstico
da
infecção
por
Schistosoma
mansoni.
Na toxoplasmose, a saliva foi eficiente para
pesquisa de anticorpos IgA, IgM e IgG quando
comparada a amostras pareadas de soro,
usando immunoblot e aglutinação direta16.
A presença de IgG anti-T. gondii em saliva
foi demonstrada por immunoblot, com alta
especificidade para triagem laboratorial da
toxoplasmose17. Para investigar o potencial uso
da saliva para detecção de anticorpos contra
Toxoplasma gondii, Loyola et al18 realizaram
estudos epidemiológicos e de vigilância da
toxoplasmose, demonstrando a aplicabilidade
da detecção de anticorpos IgA na saliva como
marcadores de toxoplasmose aguda em ensaios
de ELISA.
O dot-ELISA tem sido descrito como
um método diagnóstico eficiente para doenças
infecciosas parasitárias como a esquistossomose19,
a toxoplasmose20,21 e a angiostrongilíase22.
Este teste é um método sensível, rápido, de
baixo custo e de fácil aplicação na rotina
laboratorial, permitindo a detecção de anticorpos
em pequenas quantidades de amostra sem uso de
equipamentos.
Normalmente, os estudos sorológicos têm
utilizado a coleta de sangue, através de punção
311
clássica por agulha com produção de soro ou
coletas de sangue total com lanceta e em papel
filtro. Os dois materiais, com diferentes graus de
pureza, são fontes de IgG especifica, detectadas
por testes de diferentes sensibilidades e
especificidades, no caso da toxoplasmose humana.
Nossa alternativa foi o uso de saliva,
que possuem IgG secretada, através de coleta
simples seguida de concentração, o que permite
a detecção de IgG especifica contra o agente
em diversos grupos. Por estas razões, otimizamos
o teste dot-ELISA para detecção de anticorpos
anti-T. gondii em amostras pareadas de soro e
saliva, trabalhando com uma saliva concentrada
10X como descrito em metodologia, permitindo
resultados mais específicos.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras e antígenos
A pesquisa foi conduzida dentro dos
padrões exigidos pela Resolução 466 de 12 de
dezembro de 2012 do Ministério da Saúde.
Todos os voluntários trouxeram ou assinaram o
TCLE, contendo todos os procedimentos a serem
desenvolvidos, conforme a resolução nº 196/96,
que regulamenta a pesquisa envolvendo seres
humanos. Vale ressaltar que este estudo foi
submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)
da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo – FMUSP e aprovado sob o processo
nº 23109613.1.0000.0065.
Foram testadas 20 amostras de soro e
saliva pelas técnicas de ELISA e dot-ELISA.
Todas as amostras de soro foram validadas
pelo teste comercial Elecsys Toxo IgG/IgM
(Roche Diagnostics®, Somerville, NJ, USA), no
setor de Imunologia da Divisão do Laboratório
Central do Hospital das Clínicas – FMUSP.
Das 20 amostras de soro validadas pelo
Laboratório Central do Hospital das Clínicas –
FMUSP, 4 amostras de soro foram positivas
e 16 amostras de soro foram negativas.
Os voluntários eram alunos de pós-graduação
do Laboratório de Protozoologia do Instituto
de Medicina Tropical de São Paulo.
Suspensões de taquizoítos da cepa RH
de T. gondii foram mantidas no Laboratório
312
de Protozoologia do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo, por meio de sucessivas
passagens com intervalos de 3 a 4 dias,
em camundongos Swiss não isogênicos,
pesando em torno de 20 g, e com idade
variando entre 30 e 60 dias. Os animais
previamente infectados foram submetidos
à eutanásia por narcose em câmara de CO2
e o peritônio lavado com 5 mL de solução
salina tamponada com fosfato 0,01M pH 7,2
(PBS) estéril contendo penicilina cristalina
2500 UI/mL e estreptomicina 10 mg/mL.
Após quantificação em câmera de Neubauer, os
parasitas foram diluídos apropriadamente em
PBS e cada animal recebeu 107 taquizoítos por
inóculo intraperitoneal. A suspensão parasitária,
obtida através do lavado peritoneal de animais
infectados, foi purificada por filtração em
membrana de policarbonato 5 μm (Millipore®)
e centrifugada a 700 g por 10 min a 4 oC.
Estes taquizoitos livres de células foram
contados e estocados a -20 º C até o momento
do uso. O extrato antigênico salino (antígeno
salino23) foi obtido de antígeno protéico
solúvel de T. gondii com concentração de
3 x 108 taquizoítos da cepa RH. O precipitado foi
suspenso em 5 mL de água destilada submetido
à sonicação (0,40 MHz, 4 Vdc) por 4 períodos
de 30 segundos, em banho de gelo via
sonicador de ponta Thornton®. Após certificação
microscópica da lise total dos taquizoítos, foi
acrescentado 5 mL de solução de NaCl 0,3 M
sendo a suspensão centrifugada a 10.000g
a 4 oC por 30 min, em centrífuga refrigerada
Eppendorf 5403. O sobrenadante foi separado
em alíquotas e mantidas à -70 oC até o
momento de seu uso. Todas as reações
foram realizadas com uma mesma partida de
antígeno. O extrato antigênico alcalino (antígeno
alcalino) foi obtido a partir de uma suspensão de
3 x 108 taquizoítos da cepa RH de T. gondii
que foi tratada com 20 mL de NaOH a 0,15 M
e mantida a 4 °C por 6 h. Em seguida, a
solução antigênica foi neutralizada com HCl 0,3 M
para o pH 7,5, e estocada em alíquotas a
-20 ºC. Para aumentar o rendimento também
foi realizada a extração de antígeno de parasita
por detergente suave, desoxicolato de sódio.
Extrato protéico solúvel por detergente
desoxicolato de sódio (DOC): uma suspensão
de 3 x 108 taquizoítos da cepa RH foi
tratada com DOC nas concentrações de 0,1 %
e 0,5 % em Tris-HCl. Após 30 min de incubação
a 4 °C, a suspensão foi centrifugada a 10000g
por 15 min a 4 °C e o precipitado
descartado. O sobrenadante foi aliquotado e
estocado a -20 °C.
As dosagens protéicas dos diferentes
preparados
antigênicos
foram
efetuadas
empregando-se o método de Bradford24.
A qualidade do antígeno foi avaliada por
eletroforese
em
poliacrilamida25,
seguida
de
transferência
para
membranas
e
imunomarcação usando soro positivo humano,
seguido de conjugado peroxidase anti-IgG
humano,
em
condições
convencionais26.
As membranas foram fotografadas para
documentação. Utilizamos o mesmo antígeno
em ambos os testes imunoenzimáticos,
diferenciando-se
apenas
as
concentrações
antigênicas para cada metodologia.
Saliva
Para a intervenção da coleta de saliva
utilizamos o que denominamos “kit coleta de
saliva”, entregue a cada voluntário. Após a
entrega do Termo de Consentimento Livre
Esclarecido, os voluntários eram conduzidos
para a coleta da saliva. Era realizada a
higiene da cavidade oral, com uso de 25-40 mL
de enxaguante oral (Listerine®), de uso
comercial, bochechos e 03 lavagens da
cavidade com água potável sem aditivos.
Sem qualquer outro estimulo, foi solicitado
para que os voluntários completassem com
saliva até a marca de 05 mL ou mais
do tubo de coleta, na dependência da
produção individual de cada um. Nenhum
voluntário foi convidado a coletar mais saliva
do que o necessário para o teste. Após a
intervenção, os tubos coletados contendo a
saliva eram colocados em banho de gelo para
evitar perdas e mantidos assim até seu
transporte e processamento no Laboratório de
Protozoologia, no mesmo dia.
ELISA (Enzyme – Linked Immunosorbent
Assay)
A técnica foi desenvolvida de acordo
com a metodologia descrita por Venkatesan
e Walklin27. Placas de poliestireno de 96
poços para microtitulação (Costar®) foram
sensibilizadas com 100 µL/poço com proteínas
de T. gondii em suas diferentes preparações.
A leitura das densidades ópticas (D.O.) foi
realizada em leitor automático de microplacas
(Labsystems Multiskan MS) a 492 nm.
Dot-ELISA
A técnica de dot–ELISA foi executada
segundo a metodologia descrita por Hakes e
Armstrong9, com modificações realizadas pelo
Laboratório de Protozoologia do Instituto de
Medicina Tropical/USP, utilizando membrana
de nitrocelulose (BioRad®), foram sensibilizadas
com 50 µL/poço com antígeno solúvel de
T. gondii, suspensos em tampão 0,1 M carbonatobicarbonato de sódio pH 9,5, nas concentrações
de 0,5 µg/mL para triagem de amostras de
soro e 1,5 µg/mL de antígeno para amostras
de saliva, utilizando-se um sistema dot blot
de 96 poços (BioRad®). Após sensibilização, as
membranas eram retiradas do sistema dot blot,
cortadas em tiras de aproximadamente 0,4 mm
e colocadas em bandejas de incubação com
canaletas de 10,5 cm x 5 mm (BioRad®),
onde foram bloqueadas com Solução Salina
Tamponada Tween Leite 5 % (SSTTL), por 2 h
em temperatura ambiente. Em seguida, as
membranas foram lavadas três vezes por 5 min
com SSTTL 0,05 % sob agitação. Em seguida,
foram aplicados volumes de 500 µL/canaleta
de amostras de soro ou saliva, com incubação
por 1 h sob agitação em temperatura ambiente.
Após a incubação, as membranas foram
novamente lavadas três vezes e foram aplicados
500 µL/canaleta do conjugado anti-IgG humano
na diluição de 1/10.000, sendo as amostras
incubadas por 1 h em temperatura ambiente.
Decorrido o tempo de incubação, as membranas
foram novamente lavadas três vezes. A reação
foi revelada utilizando-se como cromógeno o
3,3-diaminobenzidina (DAB), sendo aplicados
500 µL/canaleta da solução cromógena (10 µg DAB,
313
acrescido de 10 mL PBS e 15 µL de água
oxigenada 30 %).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os índices de sensibilidade relativa,
especificidade
relativa,
co-positividade
e
co-negatividade, valores preditivos positivo e
negativo, os intervalos de confiança de 95 %
para proporções e a concordância entre testes
(Índice Kappa) foram calculados pelo programa
EpiInfo 6.04, usando a reação de ELISA como
teste de referência. Os intervalos de confiança
de 95 % e os índices relativos foram incluídos
em todas as citações dada a amostragem reduzida.
RESULTADOS
Para padronização dos nossos testes,
utilizamos 20 amostras de soro e saliva estocadas
no banco de material biológico do Laboratório
de Protozoologia do IMTSP. As amostras de
soro foram submetidas ao teste convencional
de ELISA e validados pelo Laboratório Central
do HC-FMUSP, sendo considerado nosso padrão
ouro para análise da sensibilidade relativa,
especificidade relativa e valores preditivos
positivos e negativos para o teste de dot-ELISA.
Estas amostras foram ensaiadas na diluição
1/100 frente às diferentes preparações antigênicas
como demonstrado na Figura 1A. Dos 20 soros
testados, 4 foram reagentes ao T. gondii e 16 foram
não reagentes.
Utilizando o teste estatístico t student,
verificamos que o antígeno salino apresentou os
melhores resultados, com clara distinção entre
amostras positivas e negativas.
A partir dos resultados obtidos no ELISA
para as amostras de soro, realizamos uma
eletroforese das diferentes preparações antigênicas
de T. gondii para verificarmos o perfil dos
antígenos de cada preparação. Como podemos
observar na Figura 1B, o extrato protéico salino
foi o antígeno que revelou um maior número
de frações antigênicas, mantendo, portanto, um
maior número de epítopos protéicos capazes
de se ligarem aos anticorpos presentes nos soros,
o que confirma os melhores resultados do ELISA
para esta preparação. As demais preparações
apresentaram um número menor de bandas,
provavelmente, por perdas maiores de epítopos
durante o processamento do antígeno. Contudo,
é possível visualizar em todas as preparações,
uma banda de 30 KDa, que corresponde à
proteína (p30), a mais abundante na superfície
de taquizoítos de T. gondii.
Assim, o ensaio de ELISA com extrato
protéico salino foi considerado o teste padrão
ouro para análise posterior dos resultados do
dot-ELISA.
Inicialmente, padronizamos o ensaio de
dot-ELISA em amostras de soro, onde a
concentração de IgG específica é maior,
facilitando a detecção dos anticorpos e, em
Figura 1. A - Resultados do teste imunoenzimático ELISA para amostras de soro humano. Os soros positivos
estão representados em vermelho e os negativos em azul. As linhas representam as médias de cada grupo; B- resultados da
eletroforese para as diferentes preparações antigênicas de T. gondii. PM = padrão de peso molecular
314
Figura 2. Resultados da padronização da concentração protéica do antígeno salino, antígeno alcalino, antígenos DOC 0,1 % e
DOC 0,5 % para a reação de dot-ELISA em amostras de soro humano
seguida, partimos para a padronização da
técnica em amostras de saliva. Embora o extrato
protéico salino tenha fornecido os melhores
resultados no ELISA, continuamos a trabalhar
com as diferentes preparações antigênicas durante
a padronização do dot-ELISA, a fim de obtermos
o máximo de eficiência em nosso teste.
Para padronização da reação de dot-ELISA,
utilizamos os soros na diluição 1/100, sendo
as membranas de nitrocelulose sensibilizadas
com diferentes preparações antigênicas em
diferentes concentrações protéicas.
Como podemos observar na Figura 2,
a concentração protéica ideal para todas as
preparações antigênicas utilizadas no dot-ELISA
para soro foi a de 0,625 µg/mL, que corresponde
a 31 ng/50 µL, volume utilizado em cada
poço da membrana no dot blot (Bio Rad®).
Nesta concentração, foi possível distinguir
claramente os soros positivos, com marcação
(dot) bem definida, dos soros negativos,
sem marcação visível ou com apenas uma
pequena marcação de fundo sem definição, que
corresponde ao background da reação.
Após padronização do dot-ELISA para
soro, partimos para padronização da reação
em amostras de saliva. Esta padronização foi
realizada da mesma forma que a do dot-ELISA
dos soros. Assim, podemos verificar na Figura
3 que a concentração protéica ideal em todas
as preparações antigênicas foi a de 1,25 µg/mL
que corresponde a 62 ng/50 µL, volume utilizado
em cada poço da membrana no dot blot
(Bio Rad®). Nesta concentração, foi possível
distinguir claramente as amostras de saliva
positivas, com marcação (dot) bem definida,
das amostras negativas, sem marcação visível ou
com apenas uma pequena marcação de fundo
sem definição, que corresponde ao background
da reação.
Após padronização da concentração protéica
ideal para as diferentes preparações antigênicas,
avaliamos a reprodutibilidade intrateste da
reação de dot-ELISA para saliva, através das
marcações obtidas nos (dots) das quadruplicatas
de cada saliva testada. Como podemos observar
na Figura 4, os quatro (dots) da mesma amostra
tiveram marcação semelhante, com mesmo grau
de intensidade, confirmando a reprodutibilidade
intrateste do dot-ELISA. Estes dados também
Figura 3. Resultados da padronização da concentração
protéica para as diferentes preparações antigênicas utilizadas
nas reações de dot-ELISA em amostras de saliva humana
315
podem ser confirmados nas Figuras 5A, 5B, 5C
e 5D, que apresentam os resultados das
quadruplicatas das amostras de saliva frente
às diferentes preparações antigênicas. Já, para
avaliar a reprodutibilidade interteste, comparamos
as marcações (dots) das quadruplicatas de cada
amostra, testadas em dias diferentes. Na Figura
4, podemos verificar uma boa reprodutibilidade
dos resultados do primeiro e segundo teste,
indicando que o dot-ELISA apresentou uma boa
reprodutibilidade interteste.
Após padronização da concentração protéica
ideal de antígeno, avaliamos 20 amostras de saliva
com seus respectivos soros, estocadas no banco de
Figura 4. Resultado da reprodutibilidade da técnica
dot-ELISA intrateste e interteste
material biológico do laboratório de Protozoologia
do IMSTSP. Estas amostras foram testadas por
dot-ELISA em quadruplicatas frente às diferentes
preparações antigênicas. A sensibilidade relativa,
especificidade relativa e valores preditivos positivos
e negativos, de cada antígeno, foram calculados no
programa EpiInfo 6.04, utilizando o ELISA do soro
como teste de referência.
Como podemos observar na Figura 5A,
o teste dot- ELISA com antígeno alcalino
apresentou resultados discordantes do teste
ELISA para as amostras de saliva, com um resultado
falso positivo e um resultado falso negativo,
diminuindo assim a sensibilidade relativa do
dot-ELISA, tendo uma sensibilidade relativa de
75 % e especificidade relativa de 93,8 %.
O dot-ELISA com antígeno DOC 0,1 %
(Figura 5B), apresentou resultados discordantes
do teste ELISA, tanto para as amostras de soro
como saliva, sendo um resultado falso negativo
e dois resultados falsos positivos para saliva e
13 resultados falsos positivos para soro, com
isso a sensibilidade relativa foi de 75 % e a
especificidade relativa de 87,5 %.
Para o dot-ELISA com antígeno DOC 0,5 %,
a presença de resultados discordantes do teste
ELISA foi ainda maior como podemos verificar
na Figura 5C, com dois resultados falso negativo
Figura 5. Resultados dot-ELISA com antígeno alcalino (A), dot-ELISA com antígeno DOC 0,1 % (B), dot-ELISA com antígeno
DOC 0,5 % (C) e dot-ELISA com antígeno salino (D), para amostras de soro e saliva estocadas no Laboratório de Protozoologia
– IMTSP
316
para soro e dois resultados falsos positivos
para saliva e 13 resultados falsos positivos para
soro, sendo assim a sensibilidade relativa foi
de 50 % e a especificidade relativa de 100 %.
O dot-ELISA com antígeno salino
(Figura 5D) apresentou resultados concordantes
com o teste ELISA, tanto para as amostras de
soro como de saliva, tendo uma co-positividade
e co-negatividade em amostras de soro e saliva,
com 100 % de sensibilidade relativa e 100 %
de especificidade relativa, sendo o antígeno
mais promissor para ensaios futuros.
DISCUSSÃO
Nossos dados mostram que o ensaio
imunoenzimático dot-ELISA foi capaz de
detectar anticorpos IgG anti-T. gondii em saliva
com a mesma eficiência de detecção em soro,
material mais utilizado para este fim. Esta
abordagem de coleta de saliva é extremamente
importante para determinados grupos específicos
de pacientes, como as crianças, que são, muitas
vezes, protegidas da coleta invasiva convencional
de sangue. Isto tem uma implicação muito
importante para o diagnóstico das doenças
infecciosas, em especial, da toxoplasmose,
já que permite a utilização de um material de
fácil obtenção, sem necessidade de métodos
invasivos de coleta, como é o caso do sangue.
Esta abordagem também tem apresentado
resultados positivos para grupos de indivíduos
adultos, colaborando com a adesão dos pacientes
em estudos, já que aumenta a confiança e a
perseverança dos mesmos no tratamento, por não
envolver sistematicamente a invasão pela agulha
durante a consulta, evitando o absenteísmo28.
Em nosso trabalho, padronizamos um
ensaio de dot-ELISA com alta sensibilidade e
especificidade, permitindo a detecção de IgG
em pequenas quantidades de material, que é
extremamente importante no caso da saliva,
que apresenta baixa concentração de IgG.
Outros autores já haviam relatado anteriormente
a importância e aplicabilidade da reação de
dot-ELISA para outras protozooses, mas para a
toxoplasmose estes dados são escassos29, sempre
utilizando soro como fonte de anticorpos.
Na toxoplasmose, há relatos da utilização
da saliva para detecção de anticorpos a partir
de ensaios de ELISA e immunoblotting16-18,
sendo o nosso trabalho pioneiro na utilização
da técnica de dot-ELISA para saliva.
Nossos dados de padronização mostram que
o extrato salino foi o antígeno que apresentou os
melhores resultados no dot-ELISA, possibilitando
uma clara distinção entre amostras positivas
e negativas. Estes resultados são corroborados
pelos dados descritos por outros autores20,29
que utilizaram o dot-ELISA com antígeno salino
para detecção de IgG anti-T. gondii em amostras
de soro.
Estudos comparativos entre a eficiência
de diferentes métodos de detecção de IgG
anti-T. gondii em saliva são raros, mas os
resultados do ELISA e do dot-ELISA do nosso
estudo foram semelhantes aos descritos por
Stroehle17 em um trabalho comparativo entre
o ELISA e o immunoblotting para detecção de
IgG anti-T. gondii em saliva, com valores altos
de sensibilidade e especificidade, sendo estes
resultados semelhantes aos descritos por Morris
et al30 em estudos de detecção de anticorpos
IgG anti-rubéola em saliva.
Contudo, alguns autores relataram valores
menores de sensibilidade e especificidade do
dot-ELISA, propondo um aprimoramento do
teste como demonstrado por Shukla et al31 em
um estudo utilizando antígenos de Cysticercus
fasciolaris, com 88 % de sensibilidade e 74 % de
especificidade. Verificamos em nossos ensaios
de padronização, que a concentração necessária
de antígeno salino para detecção de IgG em
saliva correspondeu ao dobro da concentração
necessária para detecção no soro. Este dado pode
ser explicado pelo fato da saliva total conter altos
níveis de IgA secretora e baixos níveis de IgG.
Além disso, a presença de bactérias, leucócitos,
mucina, células epiteliais e restos de alimento
podem provocar a degradação da IgG por
proteases bacterianas e salivares, podendo,
também, dificultar o processamento do material
dada sua viscosidade32.
Em nosso trabalho obtivemos valores altos
de sensibilidade relativa 100 % e especificidade
relativa 100 % para o dot-ELISA com antígeno
317
salino em saliva. Estes dados são corroborados
pelo estudo pioneiro em detecção de anticorpos
anti-T. gondii em saliva16, que utilizaram a técnica
de immunoblotting com antígeno salino, muito
similar ao nosso antígeno.
Nossos resultados demonstraram que o
dot-ELISA com antígeno salino é um método
excelente para o diagnóstico e triagem da
toxoplasmose, utilizando tanto amostras de
soro quanto de saliva, com altos valores de
sensibilidade e especificidade. Stroehle et al17
ressaltam a importância da utilização da
saliva como material por não ser um método
invasivo, mas destacam que é necessário o
aprimoramento das técnicas diagnósticas,
bem como o processamento da saliva após
sua obtenção, que é uma meta futura do nosso
trabalho. Além disso, em estudos futuros
iremos aprimorar o nosso teste, aumentando
sua capacidade de detecção de IgG em saliva,
através da utilização de dot-ELISA de captura
com proteína A ou utilizando sistemas de
revelação de maior sensibilidade.
CONCLUSÃO
Entendemos que os resultados advindos
do aprimoramento do teste possam permitir, no
futuro, o desenvolvimento e aplicação de um teste
comercial para detecção de IgG anti-T. gondii em
saliva, a semelhança do que é feito atualmente
com o teste rápido para diagnóstico de indivíduos
reagentes ao vírus HIV, a partir da detecção de
IgG em saliva.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado por LIM 49-HCFMUSP, CNPq e CAPES.
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319
Validação de ensaio imunoenzimático utilizando-se o
Conceito do Erro Total, os Perfis de Exatidão e o Índice de
Exatidão como alternativa à abordagem clássica do ICH
Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay by
using the Total Error Concept, the Accuracy Profiles and the
Accuracy Index as alternatives to the traditional ICH approach
RIALA6/1667
Jorge Luiz dos Santos POSSAS, Jarbas Emílio dos SANTOS, Michele Cardoso do NASCIMENTO, Patrícia
Alves dos SANTOS, Deivid Wanderson Couto dos ANJOS, Eduardo de Bonis de BRITTO, Antônio Eugênio
Castro Cardoso de ALMEIDA, Wlamir Corrêa de MOURA*
*Endereço para correspondência: Laboratório de Vacinas Virais, Departamento de Imunologia, Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, FIOCRUZ. Av. Brasil, 4365, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil, CEP: 21040-900. Tel: 21 3865-5130. E-mail: [email protected]
RESUMO
O uso do conceito do Erro Total em validação de métodos analíticos é uma abordagem que incorpora
a soma da veracidade e precisão. Este método utiliza ainda Perfis de Exatidão baseados em intervalos de
tolerância para decidir se um modelo de calibração dará resultados de qualidade, e realiza o controle do risco
de aceitar uma metodologia imprópria. Foram aplicados o Conceito do Erro Total, os perfis de Exatidão e o s
Índice de Exatidão na validação de um ensaio imunoenzimático (ELISA) para determinar o teor residual de
ovoalbumina em vacinas. Este estudo testou uma amostra pura e fortificada com três diferentes concentrações
(baixa, média e alta). A abordagem foi usada também para avaliar o método de cálculos que renderia resultados
mais exatos. Os resultados obtidos no intervalo de concentrações testado com o modelo de cálculos escolhido
foram: veracidade - ER% de 1,61 % a 12,15 %; precisão intermediária - CV% de 6,91 % a 9,31 % e o Erro Total
de 9,83 % a 19,07 %, obtendo-se dados em conformidade com os guias internacionais. O estudo demonstrou
que o método empregado é confiável para avaliar o teor de ovoalbumina, e que a abordagem do Conceito do
Erro Total apresenta aplicabilidade na validação de ensaios imunoenzimáticos.
Palavras-chave. validação, imunoensaio, erro total, perfis de exatidão, índices de exatidão, ELISA.
ABSTRACT
The use of Total Error Concept for validating analytical methods is an approach that incorporates the sum of
the Trueness and the Precision. This method also uses the accuracy profiles based on the tolerance intervals
for whether a calibration model will give the quality results and it enables to control the risk in accepting an
inappropriate methodology. The Total Error Concept, the Accuracy Profiles and the Accuracy Index were
applied in this study for validating an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the residual
contents of ovalbumin in vaccines. This study tested a pure vaccine sample and spiked with three different
concentrations (low, medium and high). Also an approach was used for evaluating the calculations methods
which would yield the most accurate results. The obtained results in the concentrations range tested with the
chosen model were: Trueness - ER% from 1.61 % to 12.15 %; intermediate precision - CV% from 6.91 % to
9.31 %; and the Total Error from 9.83 % to 19.07 %, which are in conformity with the international guides. This
study showed that the method is reliable to evaluate the ovalbumin contents, and that the Total Error Concept
approach has applicability for validating enzyme immunoassays..
Keywords. validation, immunoassay, total error, accuracy profile, accuracy index, ELISA.
320
Possas JLS, Santos JE, Nascimento MC, Santos PA, Anjos DWC, Britto EB et al. Validação de ensaio imunoenzimático utilizando-se o Conceito
do Erro Total, os Perfis de Exatidão e o Índice de Exatidão como alternativa à abordagem clássica do ICH. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo,
2015;74(4):320-36.
INTRODUÇÃO
A Febre Amarela é a febre viral
hemorrágica
original,
uma
sepse
viral
pansistêmica apresentando virêmia, febre,
prostração,
injúrias
hepáticas,
renais
e
miocárdicas, hemorragia, choque e alta
letalidade1. O nome da doença se deve à
icterícia que afeta alguns pacientes, causada
pelas severas injúrias hepáticas2.
É estimado que ocorram 200.000 casos
de Febre Amarela causando 30.000 mortes,
a cada ano mundialmente, 90 % dos casos
acontecendo na África. O vírus é endêmico em
áreas tropicais da África e América Latina2.
A doença não ocorre na Ásia e países do
Pacífico mesmo com a presença do vetor
do ciclo urbano, o mosquito Aedes aegypt,
o que ainda não é completamente entendido3.
A vacinação é a medida de maior
importância na prevenção da Febre Amarela.
Em áreas de alto risco onde a cobertura vacinal
é baixa, o pronto reconhecimento e controle de
surtos, usando a imunização, são fundamentais
para conter epidemias2.
No Brasil, a vacina contra Febre Amarela
é produzida com vírus atenuado. É adotado
o sistema de lote semente primário da cepa
vacinal 17D, por meio de passagens em ovos de
galinha SPF (Specific Pathogen Free – Livre de
Patógenos Específicos) embrionados para obter o
lote semente secundário4.
A ovoalbumina, que corresponde a mais
de 50 % das proteínas presentes na clara do
ovo, é um resíduo da produção capaz de induzir
reações em indivíduos alérgicos, devendo ser
verificado seu teor. A Farmacopeia Brasileira4
descreve o método imunoenzimático de detecção
e estabelece o limite ≤ 5,0 µg/dose. No Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
(INCQS), o Laboratório Nacional de Controle,
a quantificação de ovoalbumina residual é feita
usando o ensaio imunoenzimático (ELISA),
desenvolvido por Biomanguinhos (FIOCRUZ - RJ)4.
O ELISA para Detecção do Teor de Ovoalbumina
(EDTO) é do tipo sanduiche, utilizando anticorpos
de captura e conjugado à peroxidase, que são
reagentes derivados de fontes biológicas.
Validação
A implementação de sistemas de acreditação
de laboratórios de análise, com base na norma
ISO 17.0255, é no presente uma realidade.
Dois requisitos fundamentais figuram na parte
5 da ISO 17.0255: a definição de procedimentos
para validar métodos e estimar a incerteza de
medição6.
Na indústria farmacêutica, validações de
métodos analíticos seguem o guia ICH Q2(R1)7,
onde é definido como objetivo principal deste
tipo de estudo demonstrar que o método
analítico é apropriado ao uso a que se destina.
Entretanto, este guia faz a ressalva de que métodos
analíticos utilizados em produtos biológicos e
biotecnológicos podem ser validados, em alguns
casos, com abordagens diferentes das descritas
naquele guia. Isto se deve ao fato de ser difícil
seguir o guia ICH7, especialmente no caso de
produtos derivados de matrizes biológicas (soros
e vacinas), e/ou usando ensaios biológicos ou de
ambos8.
No entanto, a norma ISO 17.0255, adotada
no INCQS, só considera necessária a validação
de métodos normalizados quando tenham sofrido
modificações. Por esta razão, após a adoção de
alguns desvios na técnica descrita na Farmacopéia
Brasileira4, o EDTO foi submetido a um pré-estudo
de validação no INCQS, utilizando a abordagem
do Erro Total, demonstrando sua relevância e
precisão apropriadas ao objetivo de uso e
a confiabilidade da aplicação da abordagem
alternativa de validação do Conceito do Erro Total.
O estudo foi descrito por Possas et al9.
Conceito do Erro Total e Perfis de Exatidão
A abordagem do Erro Total se baseia
na construção de perfis de exatidão como
descrito pela “Société Française des Sciences
et Techniques Pharmaceutiques” (SFSTP)10-13
e tem sido amplamente discutida14. Em 2003,
a “American Association of Pharmaceutical
Scientists” (AAPS) recomendou sua utilização
na validação de ensaios de ligação de
macromoléculas15. A partir de 2012, a “European
Medicines Agence” (EMA) implementou as
normas para validação de métodos bioanalíticos
que incluem a abordagem do Erro Total16 e o
321
2015;74(4):320-36.
FDA publicou, em 2013, uma revisão de seu guia
para validação de métodos bioanalíticos17,
incorporando a abordagem do Erro Total18,
embora ainda não tenha sido implementada.
Apesar destes guias serem focados em métodos
bioanalíticos para medir a concentração de
drogas em matrizes biológicas obtidas em estudos
clínicos ou toxicológicos, eles contêm orientações
úteis sobre algumas questões fundamentais
e definições no domínio das validações de
ensaios do tipo imunoenzimáticos aplicáveis
à área de controle da qualidade para liberação
de lotes16,18.
O princípio básico dos perfis de exatidão
consiste em combinar figuras de mérito, obtidas
em condições de precisão intermediária, e limites
de tolerância de expectativa β em uma ilustração
gráfica que permite tomar uma decisão sobre a
validade do método6.
Em resumo, a abordagem do Erro Total
e dos perfis de exatidão consiste de: a) construir
um intervalo bicaudal com limites de tolerância
de expectativa β (Limite Inferior - LI, Limite
Superior - LS) com o nível de confiança desejado
γ (por exemplo, 95 %); b) comparar o intervalo
(LI, LS) com os limites de aceitação adotados
(A, B); c) se (LI, LS) estiverem completamente
dentre (A, B), o método é aceito; caso contrário,
o método não é aceito.
O ICH7 recomenda que os parâmetros
mais relevantes para validação de métodos
quantitativos são linearidade (do inglês linearity
- habilidade, dentre um dado intervalo, de
obter resultados de teste que sejam diretamente
proporcionais à quantidade de analito nas
amostras7) e exatidão (do Inglês accuracy grau de concordância entre um resultado de
teste ou resultado de medição e o valor
verdadeiro19).
Escolha do modelo estatístico de cálculo de
resultados de ensaio
Uma fonte significativa de variabilidade
nas curvas de calibração pode ser proveniente
do modelo estatístico utilizado para o ajuste
da curva, portanto, é extremamente importante
a escolha de um modelo apropriado para
este cálculo20. Alguns autores10,21 introduziram
322
o uso do perfil de exatidão baseado nos intervalos
de tolerância para decidir se um modelo de
calibração obterá resultados de qualidade22.
Definições dos parâmetros de validação
É importante ressaltar que tem sido
incentivado no meio científico a adoção das
definições do Vocabulário Internacional de
Metrologia (VIM)23, no entanto este vocabulário
é direcionado às medições de grandezas.
Ao se trabalhar com testes como um ELISA,
que medem características, uma alternativa
mais apropriada é a adoção das definições
da norma ISO 3534-219, guia que incorpora
definições que abrangem tanto medições
(de grandezas), quanto testes (de características).
Também há divergências entre as
definições de importantes parâmetros de validação
em diferentes normas e áreas científicas22,24.
A veracidade, precisão e a exatidão são três
termos fundamentais como parâmetros de
validação de métodos analíticos. A veracidade
(do inglês trueness) é o grau de concordância
entre a expectativa de um resultado de teste/
medição e um valor verdadeiro16. A medida da
veracidade é normalmente expressa em termos
de tendência (do inglês bias), sendo a diferença
entre a expectativa de um resultado de teste/
medição e um valor verdadeiro, é o erro
sistemático total em contraste com o erro
aleatório19. A precisão (do inglês precision) é
definida como o grau de concordância entre
resultados de testes/medições independentes,
obtidos em condições estipuladas (repetibilidade,
entre
ensaios,
precisão
intermediária,
reprodutibilidade). A medida da precisão é
normalmente expressa em termos de imprecisão
e calculada como desvio padrão (e.g. coeficiente
de variação) dos resultados dos testes/medições.
Depende apenas da distribuição dos erros
aleatórios e não se relaciona com o valor
verdadeiro19. A exatidão dos resultados do
método (do inglês accuracy), grau de
concordância entre o resultado do teste/medição
e o valor verdadeiro19, por conseguinte,
refere-se a um erro total de medição25,
determinado pela combinação da veracidade
e da precisão26.
2015;74(4):320-36.
Validação em uso
O presente trabalho tem a finalidade
de confirmar a aplicabilidade do conceito do
Erro Total e dos perfis de exatidão, avaliados
pelo índice de exatidão, como alternativa à
abordagem pontual recomendada pelo ICH na
validação de métodos analíticos. Para tanto,
dá continuidade ao processo de validação do
EDTO anteriormente avaliado em um pré-estudo
de validação9, agora na fase de validação em uso
do ensaio. Um avanço em relação ao pré-estudo
foi a adoção de características e critérios de
aceitação para validação preconizados pela
EMA16, específicos para ensaios bioanalíticos do
tipo ensaios de ligação, categoria que abrange
os imunoensaios. Esta norma oficial não estava
em vigor no período da realização do pré-estudo
de validação. Dentre as principais características
de um método bioanalítico preconizadas pela
EMA16 essenciais para garantir a aceitabilidade do
desempenho e da confiabilidade dos resultados
analíticos, as que se aplicam ao EDTO são:
seletividade, curva de calibração (função de
resposta), intervalo de quantificação, limite
inferior de quantificação, veracidade e precisão.
O estudo de validação em uso foi
desenvolvido em duas etapas:
a) Avaliação do método estatístico de cálculos
de resultados capaz de prover resultados
mais exatos, onde foram avaliados a regressão
logística de quatro parâmetros (4PL), a regressão
logística de cinco parâmetros (5PL) e o modelo
de linhas paralelas (PAR), pelo uso dos perfis
de exatidão e do índice de exatidão como descrito
anteriormente por Possas et al9.
b) Usando os resultados obtidos no modelo
escolhido para os cálculos de resultados,
foram determinados os seguintes parâmetros
recomendados
em
EMA16 para
ensaios
imunoenzimáticos:
veracidade;
precisão
(repetibilidade,
inter-ensaios
e
precisão
intermediária);
linearidade;
intervalo
de
quantificação;
limites
de
quantificação
avaliados como descrito por Possas et al9;
curva de calibração e seletividade
foram
avaliados como recomendado em USA17,18,27,
respectivamente.
Faz-se necessário ressaltar algumas
diferenças metodológicas entre o presente
estudo, a validação em uso, e o pré-estudo
de validação9: algumas abordagens na fase
de validação em uso foram adotadas em
consequência dos resultados do pré-estudo9,
como a concentração 2,0 µg.mL-1 para o padrão
de calibração. Na fase de pré-estudo foram
usados apenas padrões de calibração e padrões
de validação (diluídos em PBS) e as concentrações
foram expressas em µg.mL-1. Na fase de validação
em uso, foram testados o padrão de calibração
e uma amostra de vacina ora pura, ora fortificada
com três concentrações de ovoalbumina (amostras
de validação) e as concentrações destas foram
expressas em µg.0,5 mL-1, volume da dose
da vacina. Na fase de pré-estudo a versão do
programa de computador utilizado para cálculo
de resultados não incluía o modelo de cálculos
5PL que foi incorporado à nova versão lançada
em 2013, o que permitiu a comparação dos três
modelos na fase de validação em uso. No entanto,
na realização do pré-estudo, foi realizada uma
comparação dos resultados utilizando os dois
modelos disponíveis 4PL e PAR que não foi
incluída na publicação, servindo apenas para
embasar a escolha do modelo adotado naquela
fase, o 4PL.
Outro avanço em relação ao pré-estudo
foi a adoção de características e critérios de
aceitação para validação preconizados pela
EMA16, específicos para ensaios bioanalíticos do
tipo ensaios de ligação, categoria que abrange
os ELISAs. Esta norma oficial não estava em
vigor no período da realização do pré-estudo
de validação.
Em relação ao pré-estudo, o cálculo da
incerteza também foi modificado para uma
abordagem mais abrangente, incorporando em
sua determinação os dados de Veracidade e
Precisão Intermediária obtidos.
MATERIAL E MÉTODOS
Padrão de Calibração
Para o ajuste da curva de calibração
uma solução estoque padrão de calibração de
ovoalbumina de ovos de galinha (Sigma, A2512,
pó liofilizado, ≥ 98 %) na concentração de
323
2015;74(4):320-36.
100 µg.mL-1 (p/v) foi preparada e diluída em água
destilada a 2,0 µg.mL-1 (p/v).
PAR no software estatístico CombiStats® do
EDQM28.
Amostras de validação
Na fase de validação em uso, foi testado
um único lote de vacina contra febre amarela.
A cada ensaio, foi testada a amostra pura
paralelamente à mesma amostra deliberadamente
fortificada (“spiked”) com três concentrações
de ovoalbumina. O conjunto de amostras pura
(doravante referida como 0,18 µg.0,5 mL-1,
teor médio determinado em três ensaios
prévios) e fortificadas, foi denominado “amostras
de validação”. Para fortificação das amostras,
foi utilizada a solução estoque padrão de
ovoalbumina diluída na amostra de vacina para
obter as seguintes concentrações em relação ao
limite de aceitação do teor de ovoalbumina de
5,0 µg.0,5 mL-1: baixa = 25 % (1,25 µg.0,5 mL-1),
Média = 100 % (5,0 µg.0,5 mL-1), e Alta = 300
% (15 µg.0,5 mL-1). Na prática, foram usadas
alíquotas arredondadas e foi aplicada uma
correção a estas concentrações para efeito de
cálculo, os valores assumidos foram: 0,18; 1,26;
5,05 e 14,9 µg.0,5 mL-1.
Desenho do estudo - Matriz de Ensaios
Com a finalidade de avaliar os parâmetros
definidos, uma matriz de ensaios foi desenhada
visando obter o máximo de informações de cada
corrida. Foram realizadas cinco corridas válidas
(p = 5) com amostras de um mesmo lote de
vacina contra febre amarela, fortificadas com três
concentrações de padrão de ovoalbumina mais a
amostra pura (m = 4) em placas duplicatas (n = 2).
Visando incluir concentrações pura, baixa,
média e alta. A amostra de vacina pura serviu
para determinar a diferença entre o teor original
(média dos resultados de todos os ensaios)
e o recuperado nas amostras fortificadas.
Um total de 40 resultados foi obtido nesta etapa.
Posteriormente, foram realizados quatro
ensaios para avaliação da seletividade como
recomendado em USA27 onde foram testados
uma amostra de vacina e o padrão de ovoalbumina
(2,0 µg/mL): a) como padrão de calibração diluído
em PBS, b) como padrão de validação também
diluído em PBS, c) como padrão de validação
utilizando a amostra de vacina como diluente
(matriz). Um total de 20 resultados foi obtido
nesta etapa.
Método analítico: ELISA para a determinação
do teor de ovoalbumina
Os padrões de calibração de ovoalbumina
e amostras de validação foram submetidos ao
EDTO como descrito por Possas et al9, exceto
onde mencionado. A curva padrão de ovoalbumina
foi elaborada com oito diluições contendo de
0,2 µg a 0,0016 µg.mL-1. A cada ensaio, o padrão
de calibração e as amostras de validação foram
pré diluídas visando obter as concentrações
desejadas. Como no ensaio de rotina, foram
diluídos a 1/10 e aplicados nos primeiros poços,
sendo diluídos com fator dois a partir dos segundos
poços da placa até completar um total de oito
diluições para o padrão e para cada amostra.
Controles positivos e negativos (branco) foram
incluídos em cada placa. A leitura das Densidades
Óticas (DOs) foi feita em leitor de microplacas
(VersaMax - Molecular Devices, Califórnia, EUA)
a um comprimento de onda bicromático de
450/630 nm. O teor de ovoalbumina residual
foi calculado utilizando os modelos 4PL, 5PL e
324
Análise Estatística
Escolha do modelo de cálculos usando o conceito do
Erro Total
Os resultados do teor de ovoalbumina
foram calculados para as duplicatas de placa e
concentrações dos ensaios pelos métodos de 4PL,
5PL e PAR, utilizando o programa de computador
CombiStats®28, versão 5, visando determinar qual
destes modelos rende resultados mais exatos.
Posteriormente, os resultados obtidos
com o modelo escolhido foram utilizados para
calcular os demais parâmetros de validação
definidos.
Foi empregada a abordagem do Conceito
do Erro Total seguindo as recomendações da
SFSTP10-13 e o perfil de exatidão dos resultados
obtidos com os três modelos de curva nas
diferentes concentrações estudadas, construído
2015;74(4):320-36.
como descrito por Rozet et al25. Para interpretar
a adequação do perfil de exatidão obtido, foi
empregado o índice de exatidão25, para tanto,
uma planilha do Microsoft Excel® foi elaborada e
validada frente aos dados do referido artigo. Os
gráficos apresentados e análises complementares
como teste de desvio de linearidade, coeficientes
de regressão e de inclinação das curvas padrão,
foram feitos utilizando o programa estatístico
GraphPad Prism® (San Diego, Califórnia, EUA).
Veracidade
A veracidade do método, expressa como
a tendência em Erro Relativo % (ER%), foi
determinada como descrito por Rozet et al25,
utilizando a equação 1.
Equação 1.
Onde:
ER% = Erro Relativo percentual
µ = média dos resultados obtidos
µT = concentração nominal
Precisão
A partir das concentrações estimadas,
utilizando uma ANOVA como descrito por
Rozet et al25, foram calculadas a variância da
repetibilidade (
), utilizando os resultados
das diferentes replicatas em cada ensaio; da
precisão entre-ensaios (
), utilizando
os resultados obtidos nas diferentes corridas
de ensaios e da precisão intermediária, pela
soma das variâncias intra e entre-ensaios
(
),
que permitiram avaliar a
precisão do método pela determinação da
repetibilidade, da precisão entre-ensaios e
da precisão intermediária, expressas como
coeficiente de variação percentual (CV%)
obtidos por divisão dos desvios padrões
calculados
pela
concentração
nominal
(
) nos quatro níveis de
concentrações como anteriormente descrito por
Hubert et al10 e por Rozet el al25.
Exatidão
Na abordagem do Conceito do Erro Total,
foi construído um Intervalo de Tolerância de
Expectativa-β, com nível de confiança γ de 95 %.
O intervalo (LI, LS), que é calculado utilizando
o ER% e a precisão intermediária e apresenta
a exatidão dos resultados obtidos no método,
foi comparado com os limites de aceitação
adotados de ± 30 % (A, B). Quando o intervalo
(LI, LS) se apresentou completamente entre os
limites de aceitação (A, B), o método foi aceito
como apresentando resultados exatos; quando
não, o método foi rejeitado. A exatidão foi então
analisada pelos perfis de exatidão construídos e
avaliados pelo índice de exatidão.
Índice de exatidão
Derringer e Suich29 e Derringer 30
elaboraram os índices globais de conveniência
(IGC) baseados nos critérios mais importantes
de validação, variando de 0 a 1, para aumentar
a objetividade da tomada de decisão permitindo
avaliar a qualidade geral do método sendo
validado sob o Intervalo estudado. Para tanto
foi necessário atribuir um IGC ao intervalo de
doses (ID), à veracidade (Iv) e à precisão (IP),
os cálculos foram feitos segundo Rozet et al25.
Finalmente para estimar a qualidade geral do
método, foi calculado um Índice denominado
índice de exatidão (IE), que é definido como a
combinação dos critérios anteriores obtido da
média geométrica dos três Índices.
Critérios de aceitação da Exatidão
Para que um método de imunoensaio
seja aceito, é recomendado que a precisão
intermediária (CV%) e a veracidade (ER%)
sejam ambas ≤ 20 % (25 % no Limite Inferior
de Quantificação - LIQ)16 e o Erro Total ≤ 30 %
(40 % no LIQ)16.
Foram
computados
para
cada
concentração estudada os intervalos de
tolerância de expectativa β (IT-β) ajustados para
95 %, que foram comparados aos limites de
aceitação ± 30 % (λ). Os resultados obtidos
nos três modelos de cálculos foram plotados
em gráficos para construir o perfil de
exatidão. Assim, o IT-β é o intervalo que
contém uma proporção de 95 % dos futuros
resultados.
325
2015;74(4):320-36.
Determinação dos Parâmetros de Validação
Uma vez escolhido o modelo de cálculos
que rende resultados mais exatos, foram calculados
os demais parâmetros de validação.
Seletividade
Para produtos associados a matrizes
complexas, seletividade (às vezes referida
como especificidade) envolve a comprovação
da ausência de interferência dos componentes
da matriz ou a presença daqueles relacionados
ao produto. Isto pode ser avaliado pela diluição
paralela do padrão com e sem a presença
dos componentes potencialmente interferentes.
Se as curvas forem similares e os resultados
estiverem de acordo com o esperado para uma
comparação de padrão-com-padrão, o ensaio
é específico para o componente. Para esta
finalidade tanto os resultados quanto a
similaridade devem ser avaliados usando testes
de equivalência apropriados27.
Para avaliar a seletividade do método
foram analisados paralelamente, em quatro
ensaios adicionais, um padrão de calibração
(2,0 µg.mL-1), um padrão de validação (idêntico
ao anterior, 2,0 µg.mL-1), uma amostra de vacina
e um padrão diluído em amostras de vacina
(2,0 µg.mL-1). O ER% obtido para os padrões de
validação e para o padrão diluído em amostra
de vacina (subtraído o valor obtido para a
amostra de vacina) deve ser ± 20 % (± 25 % no
LIQ). Para avaliar a equivalência das curvas de
calibração foram comparadas as inclinações
obtidas para cada padrão testado.
Curva de Calibração (Função de Resposta)
É a relação entre a resposta instrumental
e a concentração17. Foi avaliada pela curva
de calibração, determinada para o padrão de
calibração nos ensaios realizados, avaliando
as concentrações introduzidas em função das
respostas obtidas (absorbância medida em
Densidades Óticas - DOs). As curvas devem
ser capazes de adequadamente descrever a
relação concentração-resposta17. Serão comparados
os parâmetros coeficiente de determinação
(r2) e inclinação (Hill Slope) de cada curva
obtida.
326
Linearidade
A linearidade de um método analítico
é sua capacidade dentro de um intervalo
definido de obter resultados diretamente
proporcionais às concentrações de analito na
amostra. As concentrações calculadas devem
apresentar os valores das concentrações
introduzidas ± 20 %16. A Linearidade foi analisada
utilizando os perfis de linearidade para
avaliar o método. Foram considerados os
valores absolutos obtidos nos ensaios, para
determinar qual o intervalo em que seria
possível obter resposta linear utilizando o
método.
Intervalo e Limite Inferior de Quantificação
O Intervalo de um ensaio é definido como
as concentrações ou potências para as quais tenha
sido confirmado que o método analítico tenha
níveis conformes de veracidade e precisão
intermediária e o limite inferior de quantificação
será a menor concentração ou potência em
que estas condições forem atendidas.
Cálculo da Incerteza
É o parâmetro associado ao resultado
da medição ou ao resultado do teste, que
caracteriza a dispersão dos valores que podem
ser razoavelmente atribuídos à quantidade
particular sujeita à medição ou a característica
sujeita a teste19. Foi realizada uma avaliação do
Tipo A, a partir de uma série de observações
repetidas, utilizando métodos estatísticos. Foram
utilizados os resultados da precisão intermediária
e da Tendência dos resultados obtidos com o
modelo escolhido. Foram calculadas a Incerteza
padrão combinada (uc) e a incerteza expandida
(U) com um fator de abrangência (k) igual a
2, próximo ao intervalo de 95 % de confiança.
Os cálculos foram realizados como descrito pelo
Nordtest Project31.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi avaliada no presente estudo a
eficácia do uso do conceito do Erro Total e dos
perfis de exatidão, avaliados pelo índice de
exatidão na validação de métodos analíticos,
2015;74(4):320-36.
como alternativa à abordagem pontual
recomendada pelo ICH. Para tanto foi realizada
a validação em uso de um imunoensaio, o
EDTO em vacinas contra febre amarela dando
continuidade ao processo iniciado com o
pré-estudo de validação descrito por Possas et al9.
O estudo de validação em uso incorporou
mudanças metodológicas em relação ao
pré-estudo de validação9, como descrito na
introdução. Assim, foi aplicada a abordagem
de validação do Conceito do Erro Total para
construir os perfis de exatidão do EDTO,
como descrito pela comissão da SFSTP10-13,25.
Em uma primeira etapa, para selecionar o
modelo de ajuste de curvas que rendia resultados
mais exatos, foram avaliados os modelos 4PL,
5PL e PAR utilizando os perfis de exatidão
e os índices de exatidão calculados a partir dos
parâmetros veracidade e precisão, combinados
para demonstrar a exatidão dos resultados.
O modelo 5PL apresentou os resultados mais
exatos e foi o escolhido. Em uma segunda etapa,
foram utilizados os resultados obtidos com o
modelo 5PL para avaliar as demais características
recomendadas em EMA16 para validação de
ensaios bioanalíticos do tipo imunoenzimáticos:
linearidade, intervalo de quantificação, limite
inferior de quantificação, curva de calibração e
seletividade.
De acordo com a ISO 17.0255, validação
não pode simplesmente ser a caracterização
do método em termos de valores de mérito,
ou seja, apenas calcular um desvio padrão de
repetibilidade não quer dizer que o método
esteja válidado. Esses dados são úteis, mas devem
confrontar o objetivo do método6. A utilização do
critério do Erro Total, que incorpora a avaliação
simultânea dos erros sistemáticos e aleatórios,
é uma abordagem estatística e cientificamente
lógica.
Os guias de validação de métodos
bioanalíticos da EMA16 e do FDA18 incorporam
a abordagem do Erro Total com especificações
para este parâmetro para os diferentes tipos
de ensaios, destacando a relevância desta
abordagem alternativa em validações de ensaios
desta natureza. No entanto, esses documentos
utilizam o termo “exatidão”, como no guia ICH7,
em lugar do termo veracidade, como definido
pela ISO26, expressando o Erro Total como a soma
da “exatidão” e da precisão. No documento do
FDA18, é feita a ressalva de que o termo Exatidão
é às vezes substituído pelo termo veracidade em
algumas normas.
Uma busca na base de dados PubMed por
estudos de validação de ELISAs, publicados nos
últimos 10 anos, revelou 736 artigos. Usando os
termos “Accuracy profile” e “Total Error” foram
encontrados 34 e 55 artigos, respectivamente
e finalmente usando os termos “Immunoassay”
e “Total Error”, aparecem 29 artigos.
Um levantamento na base Scielo encontrou
apenas quatro (Validação e ELISA) e dois
(Validação e Ensaio). No Laboratório de Vacinas
Virais do INQCS, foi aplicada a abordagem
do Erro Total em validações de ensaios
biológicos32 e imunoenzimáticos9. Os números
revelam a relevância de estudos de validação
no cenário científico internacional e a escassez
de publicações destes estudos em periódicos
nacionais.
Escolha do modelo de cálculo usando o conceito
do Erro Total
Uma fonte significativa de variabilidade
nas curvas de calibração pode ser proveniente
do modelo estatístico utilizado para o ajuste,
portanto, é extremamente importante a escolha
de um modelo apropriado para este cálculo20.
Os resultados obtidos no estudo utilizando os
métodos 4PL, 5PL e PAR por replicata, por dia
e por concentração, podem ser observados na
Tabela 1 com os valores brutos recuperados nas
amostras de validação fortificadas após a subtração
da média de resultados obtidos pela amostra pura.
Os resultados de cada grupo foram submetidos
a uma análise de variância para verificar sua
homogeneidade. Não houve valores aberrantes
em nenhum dos grupos.
O controle estatístico de processo realizado
com as inclinações da curva de calibração
demonstrou que as curvas obtidas em cada placa
replicata foram válidas e estavam sob controle
(dados não apresentados). Os resultados puderam
então ser utilizados nos cálculos dos parâmetros
avaliados.
327
2015;74(4):320-36.
Tabela 1. Resultados calculados para cada concentração, por replicata e por corrida de ensaio no intervalo de concentrações de
0,18 a 14,9 µg.0,5mL-1 subtraídas as médias dos resultados obtidos com a amostra pura (0,18). Utilizando: A – Curva Logística de
4 parâmetros; B - Curva Logística de 5 parâmetros; C – Modelo de Linhas Paralelas
A - 4PL
CI µg.0,5mL-1
Pura(0,18)
1,26
5,05
14,9
Replicatas
Média
n1
n2
n1
n2
n1
n2
Ensaios 1
2
3
4
0,183
1,317
1,300
1,429
1,358
1,342
1,094
1,387
1,297
5,685
5,661
6,055
5,641
5,341
5,027
5,784
5,541
14,966
15,406
16,362
15,231
14,198
13,973
15,087
15,112
1,305
1,367
5,580
6,296
14,823
17,836
5
B - 5PL
CI µg.0,5mL-1
Pura(0,18)
1,26
5,05
14,9
Replicatas
Média
n1
n2
n1
n2
n1
n2
Ensaios 1
2
3
4
0,183
1,321
1,305
1,437
1,362
1,346
1,097
1,389
1,309
5,682
5,670
6,050
5,649
5,329
5,031
5,779
5,572
14,949
15,327
16,286
15,193
14,077
13,936
15,038
15,103
1,307
1,368
5,580
6,294
14,793
17,816
5
C - PAR
CI µg.0,5mL-1
Pura(0,18)
1,26
5,05
14,9
Replicatas
Média
n1
n2
n1
n2
n1
n2
Ensaios 1
2
3
4
0,215
1,280
1,271
1,478
1,353
1,339
1,072
1,383
1,215
6,077
6,009
6,810
6,045
5,610
5,313
6,154
5,942
16,370
16,156
17,955
15,567
14,072
13,929
15,203
16,128
1,312
1,404
5,715
6,772
13,245
16,812
5
CI – concentração introduzida
A Tabela 2 apresenta os resultados dos
parâmetros determinados para a construção dos
Perfis de Exatidão do EDTO quando os resultados
foram calculados com o ajuste de curva logística
de 4PL, curva logística de 5PL e modelo de
PAR. Os limites de tolerância de expectativa β
(relativos e absolutos) foram calculados para 95 %
de conteúdo e os limites de aceitação ± λ foram
definidos como ± 30 % como preconizado para
o Erro Total de ensaios de ligação16.
Os resultados obtidos para veracidade,
determinada pela tendência (ER%; amplitude 1,61 %
5PL a 19,31 % PAR) e precisão intermediária (CV%;
amplitude 7,31 % 5PL a 11,38 % PAR) estavam
328
todos respectivamente dentro ± 20 % e foram
≤ 20 %, critérios de aceitação recomendados
para estes parâmetros avaliados individualmente16.
O Erro Total variou de 9,83 % no modelo 5PL
a 31,09 % no PAR.
No pré-estudo de validação do EDTO,
foi obtido o valor máximo de tendência
(ER%) = -4,91 % (amplitude -0,45 a -4,91 %) e
de precisão intermediária, o CV% máximo de
6,65% (amplitude de 5,25 a 6,65%). Os resultados
obtidos no presente estudo para veracidade e
precisão intermediária, embora satisfatórios em
relação aos critérios de aceitação, apresentaram
valores superiores aos da fase de pré-estudo,
2015;74(4):320-36.
Tabela 2. Resultados obtidos para construção dos Perfis de
Exatidão do ensaio de determinação do teor de Ovoalbumina
por modelo de cálculo: A – Curva Logística de 4 parâmetros;
B - curva Logística de 5 parâmetros; C – Modelo de Linhas
Paralelas
A
4PL
Introduzido*
0,18
1,26
5,05
14,9
Média*
0,18
1,32
5,66
15,54
ER%
1,83
4,72
12,10
4,32
CV%PI
9,46
7,30
6,96
9,75
LST%
24,13
22,06
28,68
27,45
LIT%
-20,47
-12,62
-4,48
-18,81
LST*
0,22
1,54
6,50
18,99
LIT*
0,14
1,10
4,82
12,10
Erro Total
11,29
12,02
19,06
14,07
B
5PL
Introduzido*
0,18
1,26
5,05
14,9
Média*
0,18
1,32
5,66
15,25
ER%
1,61
5,08
12,15
2,36
CV% PI
9,31
7,31
6,91
7,46
LST%
23,59
22,45
28,62
20,07
LIT%
-20,36
-12,28
-4,31
-15,35
LST*
0,22
1,54
6,50
17,89
LIT*
0,14
1,11
4,83
12,61
Erro Total
10,93
12,39
19,07
9,83
C
PAR
Introduzido*
0,18
1,26
5,05
14,9
Média*
0,22
1,31
6,04
15,54
ER%
19,31
4,03
19,70
4,32
CV% PI
11,78
9,11
9,27
9,75
LST%
47,26
25,69
41,69
27,45
LIT%
-8,63
-17,63
-2,29
-18,81
LST*
0,27
1,58
7,16
18,99
LIT*
0,16
1,04
4,93
12,10
Erro Total
31,09
13,14
28,97
14,07
ER – Erro Relativo; CV – Coeficiente de Variação; PI – Precisão
Intermediária; LST e LIT Limites Superior e Inferior de Tolerância
de expectativa β; * - Valores absolutos em µg.0,5mL-1
provavelmente devido a um efeito da matriz de
componentes biológicos do produto, uma vez
que na fase de pré-estudo foram testados apenas
padrões de validação diluídos em PBS e não
amostras fortificadas. No entanto, tal efeito não
foi significativo e não interferiu na seletividade
do método, apresentando-se conforme com
os critérios de aceitação adotados para este
parâmetro27.
Os parâmetros veracidade (ER%) e
precisão intermediária (%CV) foram combinados
na escolha do melhor modelo de ajuste para
cálculo dos resultados (4PL, 5PL e PAR) utilizando
a construção dos perfis de exatidão.
A Figura 1 - A, B e C apresenta os perfis
de exatidão construídos. Em A, foram inseridos
os resultados obtidos com 4PL, em B os resultados
de 5PL e em C utilizando PAR. Os perfis de
exatidão comprovaram que os modelos de ajuste
de 4PL e 5PL descreveram a relação concentraçãoresposta com exatidão em todo intervalo de
concentrações estudado.
Índices de Exatidão
Para avaliar objetivamente os perfis de
exatidão foram calculados os índices globais de
conveniência e combinados no índice de exatidão
para cada modelo de cálculo utilizado. Os resultados
foram: índice de precisão (4PL=0,26; 5PL=0,43 e
PAR=0,07); índice de intervalo (4PL=1,00; 5PL=1,00
e PAR=0,14); índice de veracidade (4PL=1,00;
5PL=0,89 e PAR=0,59) e a combinação dos três,
o índice de exatidão (4PL=0,635; 5PL=0,723 e
PAR=0,179).
O índice de exatidão mais elevado
apresentado pelo modelo 5PL (0,723) indicou
ser este o modelo de cálculos que permitiu obter
resultados mais exatos. Baseado nestes resultados,
o 5PL foi o modelo de cálculos escolhido.
A escolha do modelo de cálculos utilizando
os perfis de exatidão, que permitem quantificar
o desempenho destes modelos, comprova a
importância da validação, uma vez que na análise
de rotina as concentrações do analito nas amostras
são desconhecidas e não podem ser comparadas
a um valor verdadeiro. A escolha de um modelo
inadequado, como se mostrou o PAR, pode levar o
laboratório a emitir resultados inexatos.
329
2015;74(4):320-36.
O IE obtido no pré-estudo de validação
do EDTO9 utilizando a 4PL foi 0,70, próximo
aos obtidos pelos modelos 4PL e 5PL. Gaudin e
Laurentie14 relataram IE de 0,64 ao empregar estes
índices na validação de um kit de ELISA para
detecção de Nicarbazina residual em ovos.
Figura 1. Perfis de Exatidão obtidos para a Determinação do
Teor Residual de Ovalbumina usando a curva 4PL (A), 5PL (B)
e PAR (C) no intervalo de doses de 0,18 a 14,9 µg.0,5 mL-1
A linha contínua apresenta o Erro Relativo %, as linhas
pontilhadas os limites de aceitação ± 30 % e as linhas
tracejadas são os Limites Inferior e Superior relativos de 95 %
de expectativa de tolerância β. Os pontos são os erros relativos
% por replicatas das amostras de validação. O ensaio é capaz
de quantificar com Exatidão apenas quando os intervalos de
tolerância estão incluídos nos limites de aceitação (± 30 %)
330
Parâmetros de validação determinados com o
modelo 5PL
Uma vez escolhido o modelo 5PL como o
que produziu os resultados mais exatos, foram
calculados os demais parâmetros de validação
recomendados em EMA16. O resumo dos resultados
é apresentado na Tabela 3. Na determinação da
veracidade o ER % variou de 1,61 % a 12,15 %;
o CV % para avaliação da precisão intermediária
variou de 6,91 % a 9,31 % e o Erro Total de 9,83 %
a 19,07 %. Boemer et al35 aplicaram pela primeira
vez os perfis de exatidão baseados em intervalos
de tolerância na medição do Erro Total em um
ELISA para quantificação dos níveis de Hormônio
Estimulante da Tireoide (TSH) em amostras de
sangue seco de recém-nascidos, fixando os limites
de aceitação em ± 30, como no presente estudo.
Myler et al36 reportaram a validação em uso de um
ELISA sanduíche para quantificação de uma
proteína de fusão em pacientes de transplantes
renais e hepáticos, relataram veracidade e precisão
conformes, obtendo: ER% entre -4 e 4 %, CV %
≤ 13 % e Erro Total entre 6-15 %. Cullen et al37,
na validação de um ELISA, reportaram precisão
inter-ensaios com CV % ≤ 12,1 % e ER % ≤ 10,9 %, o
Erro Total do ensaio foi ≤ 23 %. A repetibilidade do
ensaio na concentração de padrão de validação “alta”
foi CV % ≤ 5,5 %. De Bock et al38 descreveram a
validação de um ELISA para detecção de citocromo
3A4 em microssomas hepáticos humanos, onde
quantidades entre 2 e 300 pmol.mg-1 de proteína
microssomal puderam ser quantificados usando o
modelo 5PL com fator de ponderação 1/x. Os CV %
de repetibilidade e entre-ensaios ficaram entre 9,54
e 13,98 %, e entre 10,51 e 14,55 %, respectivamente.
O ER % variou entre -5,96 e 6,68 %, e o Erro Total
entre 11,93 e 21,23 %. Laurentie e Gaudin39 relataram
ER % = 2,0 % e CV % de precisão intermediária
= 13,8 s%, na validação de um ELISA para detecção
de Sulfametazina em leite, quando o modelo 5PL
foi utilizado.
2015;74(4):320-36.
Os resultados relatados por todos estes
autores são concordantes com os obtidos no
presente estudo para veracidade, precisão e Erro
Total, utilizando o modelo 5PL.
Seletividade
A análise de variância dos 20 resultados
obtidos nos quatro ensaios para avaliação
da seletividade (p = 0,071) demonstrou a
homogeneidade dos resultados. Todos os valores
de ER% estavam no intervalo ± 20 % e a análise de
variância das inclinações das curvas obtidas para os
padrões de calibração, validação e padrão diluído
em amostras (p= 0,7345) demonstrou a equivalência
das inclinações. Portanto o método apresenta
seletividade conforme para a ovoalbumina.
Tabela 3. Resumo dos resultados obtidos com o modelo 5PL na validação em uso do ensaio para determinação do teor
residual de ovoalbumina em vacinas e critérios de aceitação adotados
Parâmetro
Resultados/conclusão
Critério de Aceitação
Seletividade
Amplitude do ER% (-17,95 a 11,06 %)
Conclusão = Conforme
O ER% deve ser ± 20 % (± 25 % no LIQ) da
concentração nominal fortificada tanto em
diluente quanto em amostra27
Veracidade
Amplitude do ER% = 1,61 a 12,15 %
ER%* ± 20 % (± 25 % no LIQ e LSQ)16
Repetibilidade
Amplitude CV% = 5,76 a 7,46
CV% ≤ 20 % (≤ 25 % no LIQ e LSQ)16
Precisão Entre ensaios
CV% ≤ 20 % (≤ 25 % no LIQ e LSQ)16
Precisão Intermediária
CV% ≤ 20 % (≤ 25 % no LIQ e LSQ)16
Exatidão (Erro Total)
0,18 = [-20,47; 24,13]
1,26 =[-12,62; 22,06]
≤30 %(≤ 40 % no LIQ e LSQ)16
5,0 =[-4,48; 28,68]
Os limites de tolerância de expectativa β
14,9 =[-18,81; 27,45]
relativosdevem estar incluídos nos limites de
Erro Total máximo = 19,07.
aceitação (± 30%)25
Conclusão = Conforme em todo intervalo estudado
Curva de Calibração
R > 0,98 nas 10 curvas de calibração realizadas. Equação mais simples que descreve a
função17
Linearidade
As médias das concentrações calculadas foram
iguais às concentrações introduzidas ± 20 %.
Os intervalos de tolerância β estão incluídos nos
limites de aceitação (± 30 %), em todo o intervalo
de quantificação. Conclusão: O Método apresenta
resultados com relação linear com a concentração
introduzida.
Intervalo de Quantificação
Limite Inferior de
Quantificação
0,18 a 14,9 µg/0,5 mL
0,18 µg/0,5 mL
As concentrações calculadas devem
apresentar os valores das concentrações
introduzidas ± 20 %16 e limites de tolerância
de expectativa βabsolutos devem estar
incluídos nos limites de aceitação (± 30 %)25
Intervalo
que apresentou resultados
com Exatidão conforme16
Menor
concentração
no
Intervalo
que
apresentou
resultados
com
Exatidão conforme16
331
2015;74(4):320-36.
Curva de Calibração (Função de Resposta)
A função de resposta foi avaliada pela
curva de calibração, determinada para o padrão
de calibração, considerando as concentrações
introduzidas em função das respostas obtidas
(absorbância medida em DOs). A avaliação das
10 diferentes curvas de calibração por cada
replicata nos cinco ensaios realizados quando
foi ajustada a regressão linear simples do logaritmo
das concentrações (diluições) em função do
logaritmo das respostas obtidas (absorbâncias),
tendo todas as curvas sido satisfatórias, o que
pode ser percebido pelo valor de R maior que
0,98. Todas as curvas foram capazes de descrever
adequadamente a relação concentração-resposta,
como recomendado em USA17,18. A similaridade
entre as inclinações obtidas nas 10 curvas
foi comprovada pelo teste F (p = 0,7374), o que
indica não haver diferença estatística significativa
entre os valores.
Linearidade
Diferenciar claramente a curva de
calibração (função de reposta) de linearidade
permite aplicar o conceito de linearidade não
apenas aos valores relativos, mas também aos
valores absolutos do método, como para titulações
onde os resultados não são obtidos por cálculo
em retorno dos resultados a partir de uma
curva de calibração22.
A linearidade de um método analítico
é sua capacidade, dentro de um intervalo
definido, de obter resultados diretamente
proporcionais às concentrações de analito
na amostra. As concentrações calculadas
devem apresentar os valores das concentrações
introduzidas ± 20 %16.
As médias e os intervalos de aceitação
± 20 % por concentração foram: 0,18 = 0,183
(0,144 a 0,216); 1,26 = 1,324 (1,01 a 1,51);
5,05 = 5,66 (4,04 a 6,06) e 14,9 = 15,25 (11,2 a 17,88).
O coeficiente de correlação entre as concentrações
introduzidas e concentrações calculadas foi
0,999 (p = 0,0006), equação: Y = 1,022X + 0,1431.
O teste de desvio de linearidade (p = 1,0) indicou
relação linear perfeita entre as concentrações
introduzidas e as concentrações calculadas.
Também visando avaliar a linearidade,
332
o intervalo de tolerância de expectativa-β absoluto
foi aplicado para construir a Figura 2 que apresenta
os perfis de linearidade obtidos no estudo
pelo modelo de ajuste 5PL que compreende
as concentrações de 0,18 a 14,9 µg.0,5 mL-1.
Neste caso, os limites de tolerância de expectativa
β absolutos devem estar incluídos nos limites de
aceitação (± 30 %)25.
Na avaliação da linearidade, como
recomendado pelo EMA16 todas as concentrações
calculadas apresentaram valores das concentrações
fortificadas ± 20 %, confirmando a relação linear
do ensaio. Também foi elaborado o perfil de
linearidade aplicando o conceito do Erro Total que
utilizou os valores absolutos obtidos nos ensaios,
inseridos em gráfico com os limites de aceitação
absolutos para o Erro Total de ± 30 % calculados
para cada concentração. Os ITβ absolutos foram
conectados, de modo semelhante ao empregado
Figura 2. Perfis de Linearidade obtidos para a Determinação
do Teor Residual de Ovalbumina usando a curva;
5PL como modelo de cálculos no intervalo de doses de 0,18 a
14,9 µg.0,5 mL-1
A linha contínua representa a linha de identidade (x=y), as
linhas pontilhadas os limites de aceitação absolutos adotados
± 30 % e as linhas tracejadas são os Limites Inferior e Superior
de 95 % de expectativa de tolerância β em valores absolutos
conectados. Os pontos são os resultados individuais obtidos
para as replicatas das amostras de validação. Os intervalos de
tolerância estão incluídos nos limites de aceitação (± 30 %),
em todo o intervalo de doses, portanto o ensaio é capaz de
quantificar com linearidade satisfatória neste intervalo
2015;74(4):320-36.
na avaliação da Exatidão (que utiliza os valores
relativos). A linearidade foi considerada conforme
no modelo 5PL.
O limite inferior de quantificação foi
0,18 µg.0,5 mL-1, a menor concentração incluída
no estudo onde foi possível quantificar a
ovoalbumina com exatidão. Este resultado é
comparável ao obtido no pré-estudo de validação,
uma vez que naquele estudo os resultados foram
expressos em μg/mL e o LIQ foi a concentração
1,25 μg.mL-1 a menor concentração do intervalo
de estudo capaz de ser quantificada com exatidão
e na concentração abaixo 0,25 μg.mL-1, no intervalo
de controle não foi mais possível fazê-lo. Corrigindo
a expressão para µg.0,5 mL-1, temos as concentrações
0,625 µg.0,5 mL-1 e 0,125 µg.0,5 mL-1 respectivamente.
A concentração 0,18 µg.0,5 mL-1 está entre as duas
concentrações e no presente estudo, em relação
às demais concentrações estudadas, apresentou
perda da precisão, como esperado no LIQ, embora
a tendência tenha sido equivalente.
Cálculo da Incerteza
Foram calculadas as incertezas padrão
combinada (uc) e incerteza expandida (U)
a partir dos valores determinados para a precisão
intermediária e para a tendência para os resultados
obtidos com o modelo 5PL para cada diferente
nível de concentração do Intervalo estudado.
As incertezas determinadas foram: 0,18 µg.0,5mL-1
(uc = 4,93 %; U = 9,86 %); 1,26 µg.0,5mL-1
(uc = 6,26 %; U = 12,52 %); 5,05 µg.0,5mL-1
(uc =12,63 %; U= 25,27 %) e 14,9 µg.0,5mL-1
(uc = 4,42 %; U = 8,83 %).
Os métodos clássicos de validação e
de controle da qualidade avaliam a magnitude
dos componentes veracidade e precisão
separadamente, mas esta abordagem é pouco
eficiente, pois valores muito pequenos de um dos
componentes não compensam a falha do outro
componente33.
O uso de intervalos de confiança e/
ou Erro Total em validação de métodos tem
sido discutido ou proposto na literatura10-13,25,33.
O uso do Erro Total é uma abordagem estatística
e cientificamente fundamentada que incorpora
tanto os erros sistemáticos (veracidade) quanto
aleatórios (precisão).
Uma vantagem desta abordagem é refletir
mais diretamente o comportamento de ensaios
individuais, o que resultará em menor rejeição
de corridas em uso, do que procedimentos
que comparam pontos de estimativa da tendência
e precisão observadas22. O reconhecimento
do valor do Erro Total em validações foi
consolidado com as publicações de guias
internacionais que incorporam esta abordagem
em validações de métodos bioanalíticos como
a AAPS15, SFSTP10-13,25, EMA16 e FDA18.
CONCLUSÃO
O estudo confirma a aplicabilidade do
conceito do Erro Total e dos Perfis de Exatidão
para validação de métodos, apresentando
vantagens sobre abordagens baseadas na
estimação de pontos para avaliar a Veracidade
e Precisão, principalmente na validação de
ensaios bioanalíticos do tipo imunoenzimáticos.
A abordagem do intervalo de confiança prove
um controle maior dos riscos associados em
aceitar um procedimento inadequado e rejeitar
um método satisfatório.
A validação em uso do ELISA para
detecção do teor de ovoalbumina permite concluir
que o ensaio apresenta – seletividade, veracidade,
repetibilidade, precisão entre-ensaios, precisão
intermediária, exatidão, curva de calibração
e linearidade conformes no intervalo de 0,18 a
14,9 µg.0,5 mL-1, e é um método confiável para
avaliar o teor de ovoalbumina.
AGRADECIMENTOS
À Direção e à Coordenação de Pós-Graduação do
INCQS/FIOCRUZ pelo apoio na realização deste
trabalho que foi produzido como dissertação de
conclusão do Curso de Mestrado em Controle
da Qualidade de Produtos, Ambientes e Serviços
Vinculados à Vigilância Sanitária; aos colegas do
Departamento de Imunologia que contribuíram
na realização deste trabalho; à Biomanguinhos/
FIOCRUZ pelo fornecimento dos insumos para
realização dos ensaios.
333
2015;74(4):320-36.
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[dissertação de mestrado profissional]. Rio de Janeiro
(RJ): Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz; 2014.
Avaliação da concordância entre as linhagens de
camundongos Swiss Webster e B6D2F1 no teste de potência
da Eritropoietina Humana Recombinante (rhEPO):
a experiência do Laboratório Nacional de Controle
Evaluation of the agreement between Swiss Webster and
B6D2F1 mice lineages in the potency test of Recombinant
Human Erythropoietin (rhEPO): the Brazilian National
Control Laboratory experience
RIALA6/1668
Michele Cardoso do NASCIMENTO*, Clarice Lima do Canto ABREU, Rodrigo Netto COSTA, Wlamir
Corrêa de MOURA, Isabella Fernandes DELGADO
*Endereço para correspondência: Laboratório de Vacinas Virais e Cultura de Células, Setor de Vacinas
Virais, Departamento de Imunologia, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação
Oswaldo Cruz. Avenida Brasil, 4365, CEP: 21040-900, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Tel: 21 3865-5262.
RESUMO
A eritropoietina humana recombinante (rhEPO) é um hormônio glicoproteico. Diante da gama
de produtos contendo rhEPO disponíveis no mercado, da abrangência da indicação terapêutica e
das características dos usuários de rhEPO, o ensaio de atividade biológica é de grande importância
para o processo de liberação de lotes deste produto. O teste de potência é uma avaliação laboratorial
para averiguar a eficácia do produto final, recomendada pela Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.).
Este trabalho teve como objetivo avaliar a concordância entre os valores de potência biológica
obtidos quando a linhagem de camundongos preconizada pela Ph. Eur. (B6D2F1) foi utilizada
em comparação com a Swiss Webster (SW). Vinte e dois lotes foram testados usando-se estas
duas linhagens, e 44 ensaios válidos foram obtidos com resultados satisfatórios. Em nenhuma das
análises houve necessidade de efetuar repetição de ensaios, bem como a combinação de resultados.
A variação entre linhagens e a veracidade foram avaliadas, obtendo-se os seguintes resultados:
Coeficiente de Variação (CV) < 10 %; Erro Relativo % (ER %) < 10 %, respectivamente. As linhagens
testadas geraram resultados homogêneos sem diferença estatisticamente significativa entre elas.
A linhagem SW mostrou características adequadas para ser empregada como alternativa à linhagem
B6D2F1 na avaliação da potência biológica de rhEPO.
Palavras-chave. eritropoietina humana recombinante, biológicos, vigilância sanitária, concordância, Swiss
Webster, B6D2F1.
ABSTRACT
The recombinant human erythropoietin (rhEPO) is a glycoprotein hormone. In face of the broad
range of rhEPO-containing products in the market, the scope of their therapeutic indication and the
characteristics of the rhEPO users, the biological activity testing is of high relevance for their batches
releasing process. The potency testing is a laboratory evaluation for assessing the effectiveness of the final
product, recommended by the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). This paper aimed at evaluating the
agreement between the biological activity results obtained when the strain of mice-B6D2F1, recommended
by Ph. Eur., was used in comparison to the Swiss Webster (SW). Twenty-two batches were assayed
using these two mice strains, and a total of 44 valid assays were obtained with satisfactory results. In none
of these analyses, neither repeating assays nor results combination were needed. The inter-strains variation
and the accuracy were evaluated, and the following results were detected: Coefficient of Variation (VC)
< 10 % and Relative Error % (RE) < 10 %, respectively. The tested lineage provided homogeneous results,
and no statistically significant difference between them was found. The SW strain might be used as an alternative in
place of B6D2F1 for performing the biological potency evaluation of rhEPO.
Keywords. recombinant human erythropoietin, biologicals, sanitary surveillance, agreement, Swiss Webster,
B6D2F1.
337
Nascimento MC, Abreu CLC, Costa RN, Moura WC, Delgado IF. Avaliação da concordância entre as linhagens de camundongos
Swiss Webster e B6D2F1 no teste de potência da Eritropoietina Humana Recombinante (rhEPO): a experiência do Laboratório Nacional
de Controle. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):337-46.
Introdução
A eritropoietina (EPO) é um hormônio
glicoproteico essencial à vida. É produzido no
indivíduo adulto principalmente pelas células
do córtex renal e tem como principal função
a regulação da eritropoiese 1-5.
Em 1977, a EPO foi extraída e purificada
da urina de pacientes anêmicos. Com o advento
da tecnologia do DNA recombinante (rDNA),
baseado na sequência de aminoácidos dos dados
da purificação, o gene da EPO humana foi então
clonado para obter a Eritropoietina Humana
Recombinante (rhEPO), um avanço tecnológico
que revolucionou o tratamento da anemia6,7.
Antes do desenvolvimento da rhEPO,
a transfusão de sangue era o mais comum
tratamento para pacientes com anemia, contudo,
desde o seu advento, a rhEPO vem sendo
amplamente utilizada na prática clínica, para
redução da necessidade de transfusão sanguínea
em processos cirúrgicos8 e no tratamento de
anemias de várias etiologias9,10.
Um fator de grande relevância, quando
do uso da rhEPO, diz respeito à sobrevida dos
pacientes e à melhora da qualidade de vida,
ocorrendo um decréscimo na sensação de fadiga.
O uso da rhEPO permite normalizar o apetite de
pacientes anêmicos e acelerar o seu retorno às
atividades de rotina11,12.
A patente das primeiras formulações
de eritropoietina disponíveis comercialmente
começou a expirar em 2007, o que levou ao
surgimento de eritropoietinas similares no
mercado mundial, chamadas de biossimilares.
Este fato causa preocupação aos órgãos
regulatórios, sobretudo quanto à eficácia e
segurança de tais produtos, uma vez que os
mesmos não são idênticos aos originais13,14.
Diante da gama de produtos disponíveis
no mercado, da abrangência da indicação
terapêutica e das características dos pacientes
usuários de rhEPO, é de grande importância
o efetivo controle da qualidade deste produto
previamente ao seu ingresso no mercado.
Dentre os testes preconizados pela Farmacopeia
Europeia (Ph. Eur.)15 para controle da qualidade
deste produto, está o ensaio de potência ou
338
atividade biológica, que é uma avaliação
laboratorial de suma importância, uma vez
que seu resultado está relacionado à eficácia do
produto final.
Atualmente, esta avaliação pode ser
realizada por dois métodos distintos. Um método
utiliza camundongos policitêmicos (método A)
e outro utiliza camundongos normocitêmicos
(método B)15. O método B tem sido o método
de escolha, uma vez que o método A - em
camundongos policitêmicos - causa maior
sofrimento e estresse aos animais que devem
ser mantidos por longos períodos em câmaras
hipobáricas e expostos a radioisótopos16.
Como resultado dessa escolha, diferentes
linhagens de camundongos normocitêmicos têm
sido testadas para a avaliação da potência de
rhEPO, tais como CF1, BALB/c, Swiss Webster
(SW), NIH, C57BL6, e B6D2F115, 17-21.
A linhagem B6D2F1 é um híbrido de
primeira geração do cruzamento de duas
linhagens inbred, (fêmea de C57BL/6 com o macho
de DBA/2)22 tem menor porte, menor número
de filhotes por ninhada e menor fertilidade,
quando comparada aos animais outbred.
Camundongos híbridos de primeira geração
(F1) têm como vantagens a uniformidade genética
e fenotípica, a maior resistência a doenças e
maior longevidade22-24.
Animais outbred são também chamados
animais heterogênicos. Este estado de alta
heterozigoze (99 %) deve ser conhecido e
mantido. São animais de constituição genética
variada, por serem obtidos por cruzamentos
aleatórios, evitando que os animais em
acasalamento sejam parentes próximos. Com
isso, busca-se manter um baixíssimo grau de
consanguinidade, cerca de 1 %23-25.
Vale ressaltar que a linhagem SW, outbred,
é de fácil aquisição junto ao Centro de Criação
de Animais de Laboratório da FIOCRUZ
(CECAL/FIOCRUZ), sua criação é mais simples,
é consagrada pelo uso e vem sendo utilizada
há décadas em diferentes estudos, demonstrando
sua aplicabilidade em pesquisas e testes de
segurança de produtos.
Diante do exposto, o presente trabalho
teve como objetivo comparar os resultados de
potência de rhEPO obtidos pelo Laboratório
Nacional de Controle (Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Saúde – INCQS/
Fiocruz) com as linhagens B6D2F1 e SW de forma
a avaliar a concordância entre essas linhagens.
Material e Métodos
Amostras e reagentes utilizados
Foram utilizadas 22 amostras de rhEPO
recebidas no INCQS para análise, modalidade
orientação, no período de 2010-2012, com
apresentação de 4.000 UI/mL.
O Padrão de Referência de Trabalho
utilizado foi o lote MRT(B) rhepo/0208,
contendo 3773UI/mL, produzido pelo Centro
de Imunologia Molecular de Cuba, envasado
no Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
– Bio-Manguinhos e estabelecido por meio de
estudo interlaboratorial frente ao Padrão
Internacional, lote 2 da Ph. Eur.
Os reagentes azul de metileno; citrato
de sódio; cloreto de sódio e fosfato de sódio
dibásico
foram
adquiridos
da
Merck®;
a albumina sérica bovina, da Sigma®; a
heparina da Eurofarma®; a Cellmlise III
- Solução hemolisante a base de amônio
quaternário, da CELM® e a solução oftálmica
anestésica local a base de Oxybuprocaina da
Latinofarma®. Todos os reagentes foram de alta
pureza e estavam disponíveis comercialmente.
Animais de laboratório
Foram utilizados em cada teste, 36
camundongos normocitêmicos de cada uma
das linhagens SW e B6D2F1, fêmeas com peso
variando entre 15 e 17 g provenientes do CECAL/
Fiocruz (Centro de Criação de Animais de
Laboratório).
Após o recebimento, os animais foram
pesados e avaliados quanto ao sexo e estado de
saúde geral. Os animais permaneceram em
aclimatação por um período de 24 horas, no
mínimo, antes de cada ensaio. Foi oferecido
aos animais, água e ração ad libitum. Os animais
foram mantidos em ciclo claro/escuro alternados,
com 12 horas cada, temperatura variando de
21 ± 2 °C e 55 ± 10 % de umidade do ar.
O protocolo experimental foi aprovado
pela Comissão de Ética no Uso de Animais
da FIOCRUZ, com licença de número LW-14/11.
Avaliação da potência biológica
Foram realizados 22 ensaios para a
avaliação da potência biológica de rhEPO
utilizando cada uma das linhagens SW e B6D2F1,
conforme metodologia descrita na Ph. Eur.15
- método B e POP 65.3430.04226. Este método
tem como base a medida do estímulo da produção
de reticulócitos após a injeção de rhEPO, sem
qualquer exposição prévia.
O ensaio foi realizado com desenho de
blocos ao acaso, onde os animais são distribuídos
de forma aleatória. O tratamento dos animais
foi por via subcutânea com as doses de 30, 90 e
270 UI/0,2 mL. Foram inoculados animais com
a amostra teste e animais com padrão de
referência, sendo seis animais representantes de
cada dose, totalizando 36 animais em cada teste.
Após um período de 72 ou 96 horas,
para a SW e B6D2F1, respectivamente, foi
realizada a coleta de sangue por via plexo orbital
com o auxílio de pipetas Pasteur heparinizadas,
sob anestesia local, com Oxybuprocaina. O sangue
coletado foi transferido para tubos tipo “safe lock”
e mantido sob refrigeração (banho de gelo, com
temperaturaentre 4 a 8 ºC) até o momento do seu
processamento, que foi feito logo após a coleta.
Tal processamento, consta da indução da
hemólise seletiva e coloração do material
genético dos reticulócitos com corante vital azul
de metileno. Posteriormente, tais células foram
contadas em hemocitômetro (câmara de
Neubauer).
O mesmo procedimento foi aplicado em
ambas as linhagens, B6D2F1 e SW, para cada
amostra testada.
Cálculos e análise estatística
O método de linhas paralelas, ensaio
3+3 doses, com delineamento de blocos ao
acaso foi utilizado para avaliar a validade do
ensaio e para o cálculo da estimativa de potência.
Para tal, utilizou-se o programa computacional
CombiStats®27 desenvolvido segundo o capítulo
5.3 da Ph. Eur.28, o qual foi alimentado com os
339
dados da contagem dos reticulócitos.
O ensaio foi considerado válido quando
atendeu aos critérios de aceite, que são regressão
linear, paralelismo e linearidade, onde:
• regressão linear: deve ser significativa, ou seja,
a probabilidade calculada deve ser menor que
0,05;
• linearidade: não deve haver desvios
significativos, ou seja, a probabilidade calculada
deve ser maior ou igual a 0,05;
• paralelismo: não deve haver desvios
significativos, ou seja, a probabilidade calculada
deve ser maior ou igual a 0,05;
A amostra foi considerada conforme quando
o ensaio foi válido e a estimativa da potência
estava entre 80 % e 125 % e os limites fiduciais
entre 64 % e 156 % da potência declarada.
Foi realizada uma análise estatística para
avaliar a variabilidade e o grau de concordância
entre as linhagens estudas. Para tal foram
aplicados os seguintes testes: (a) Análise de
variância; (b) Teste qui-quadrado; (c) Gráfico
de Bland-Altman e (d) Regra 4-6-30 % com Erro
Relativo e Coeficiente de Variação.
(a) Análise de variância
Os resultados foram comparados utilizando
a análise de variância (ANOVA) para determinar
se houve variabilidade significativamente maior
das variâncias entre grupos ou dentro dos
grupos sobre a variação total do método.
Quando F calculado foi menor que o
F crítico, considerou-se que os grupos não
diferiram significativamente.
(b) Teste qui-quadrado
A concordância entre os resultados das
diferentes linhagens foi avaliada, utilizando
o programa CombiStats®27, por meio do teste
qui-quadrado para determinar a homogeneidade
entre os dados utilizando os intervalos de
confiança da potência como fator de ponderação,
com α = 0,05. Quando o valor calculado no
teste qui-quadrado foi maior do que o valor
tabulado, as potências foram consideradas
heterogêneas, o que foi demonstrado pela
obtenção de p < 0,05. Isto significa que a
variação entre as estimativas individuais foi
340
maior do que havia sido previsto a partir das
estimativas dos limites de confiança, isto é,
que existe uma variabilidade significativa entre
os ensaios28.
(c) Gráfico de Bland-Altman
Os gráficos de Bland-Altman foram
confeccionados utilizando o programa GraphPad
Prism®. Este método calcula a média, a diferença
entre cada par de dados, o viés/tendência (bias)
e os Limites de Concordância (LC).
É esperado que as diferenças plotadas
contra as médias estejam dentro do LC calculado.
Segundo Bland e Altman29, medir as
diferenças entre dois métodos para cada amostra
e testá-las contra as médias é a melhor maneira
de avaliar a relação entre os métodos. A dispersão
das diferenças ao longo da linha zero é uma
indicação da concordância entre os dois métodos29.
(d) Regra 4-6-30 % com Erro Relativo e Coeficiente
de Variação
Os critérios de aceitação para a validação
de ensaios do Food and Drug Administration
– FDA30 preconizam que pelo menos 66,7 %
(4 em 6 resultados) das amostras de controle
da qualidade estejam entre 15 % do seu valor
nominal. Porém, em certas circunstâncias,
critérios de aceitação mais amplos podem ser
justificáveis. Este critério ficou conhecido como
a regra 4-6-1531.
Bioensaios normalmente usados para
estimar a potência de drogas podem ser
distinguidos de testes químicos por serem
realizados em substratos biológicos (e.g.
animais, células vivas ou complexos funcionais
de receptores alvo), e desta forma, devido
a múltiplos fatores operacionais e biológicos
advindos da base biológica, eles tipicamente
exibem uma maior variabilidade do que os
testes químicos32. Assim, foi avaliada a proporção
de Erro Relativo (ER) de resultados de potência
obtidos nas duas linhagens utilizadas no estudo,
que se apresentou dentro do intervalo esperado
para Tendência de ± 30 %, visando determinar
se o ensaio obedece ao critério de aceitação
4-6-n %, como descrito pelo FDA30, adotando
o ER máximo aceito de 30 % (4-6-30). Desta
forma, o método utilizando a linhagem SW é
considerado satisfatório se pelo menos 4 (66,7 %)
em 6 ensaios apresentarem resultados dentro
da faixa de ± 30 %.
Para calcular as tendências (do termo inglês
bias, diferença entre a expectativa de resultado
de um teste ou medição e um valor verdadeiro33)
entre os resultados obtidos pelas duas linhagens,
os valores de potência em percentagem obtidos
com a linhagem B6D2F1, foram considerados
como o valor verdadeiro e a diferença entre
os valores percentuais destes resultados com os
da linhagem SW, para cada par de resultados,
foram considerados como o ER, sendo também
calculados os coeficientes de variação (CV %)
para cada par de resultados.
A Veracidade (do termo inglês trueness,
grau de concordância entre a expectativa de
um resultado de teste ou um resultado de
medição e um valor verdadeiro33) expressa como
Erro Relativo percentual (ER %) foi calculada
utilizando a equação 1. Neste caso, a potência
nominal foi considerada como 100 %.
Equação 1
Onde:
ER% = Erro Relativo percentual
µ = média dos resultados obtidos
µT = Potência nominal
RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta os resultados de
potência para cada amostra em cada linhagem.
Os valores de potência na linhagem SW variaram
entre 80 e 113 %. Os limites entre 70 e 129 %
e a média entre as 22 amostras testadas foi
92,77 %, com uma veracidade (expressa pelo ER %)
de -7,23 %. Os valores de potência na linhagem
B6D2F1 variaram de 80 a 102 %. E os limites
entre 70 e 116 %. A média dos valores de
potência para as 22 amostras testadas foi de
92,95 %, com uma veracidade (expressa
pelo ER %) de -7,05 %.
Tabela 1. Valores de potência e limites de confiança obtidos para 22 amostras de rhEPO testadas utilizando as linhagens de
camundongos SW e B6D2F1
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
µ
ER%
Pot (%)
92
98
88
83
80
113
96
94
90
98
94
102
110
86
92
81
98
85
87
93
88
93
92,77
-7,23
SW
LI (%)
72
85
76
73
70
99
76
80
78
90
73
91
97
74
81
71
85
71
74
82
77
78
LS (%)
116
112
102
95
91
129
121
109
103
106
121
114
126
101
104
93
113
102
101
106
101
110
Pot (%)
98
93
93
98
99
80
94
93
93
97
86
98
95
88
97
95
102
96
82
86
90
92
92,95
-7,05
Linhagem
B6D2F1
LI (%)
84
76
80
86
85
64
83
78
80
87
76
82
81
75
89
82
92
81
70
73
81
83
LS (%)
115
113
107
112
116
99
106
110
109
108
103
118
112
103
106
109
114
112
95
102
100
103
SW x B6D2F1
CV%
ER
4,87
-6
3,53
5
3,72
-5
11,83
-15
15,28
-19
24,37
33
1,83
2
0,61
1
2,55
-3
0,73
1
4,36
8
2,81
4
10,48
15
1,38
-2
3,90
-5
10,59
-14
21,13
-4
7,94
-11
4,13
5
5,25
7
1,39
-2
0,36
1
Pot: Potência; LI: Limite Inferior; LS: Limite Superior; µ: média dos resultados obtidos; ER: Erro Relativo; ER%: Erro Relativo%; CV%: Coeficiente
de Variação; SW: Swiss Webster
341
O teste ANOVA foi realizado com
os resultados de potência das linhagens SW
e B6D2F1. Os resultados da ANOVA para
um nível de significância α = 0,05 foram:
a média de quadrados (MQ) entre grupos
(variância entre grupos) foi de 42,0087 e a
MQ dentro dos grupos (variância dentro
dos grupos) foi de 57,3182. O valor p igual
a 0,7599, maior que 0,05 e o F calculado,
0,7329, menor que o F crítico de 2,0587.
Com a finalidade de avaliar o grau
de concordância entre os resultados, a
homogeneidade foi determinada. Os resultados
obtidos por amostra nas duas linhagens foram
submetidos ao teste qui-quadrado utilizando
o programa CombiStats®27. Os resultados da
comparação dos ensaios podem ser vistos na
Tabela 2. Foi adotado um nível de significância
de 5 % (α = 0,05), onde 20 dos 22 pares de
resultados (90,90 %) foram considerados
homogêneos (p > 0,05). Apenas as amostras
5 e 6 foram consideradas heterogêneas (p < 0,05).
linhagens. A Figura 1 apresenta as diferenças e
as médias entre as duas linhagens, de cada
amostra testada, com a tendência (bias = 0,1818)
e os limites de concordância (LC: -21,29 a 21,66).
Apenas um valor ficou fora do LC.
No eixo x estão representadas as médias
([B6D2F1+SW]/2) e no eixo Y as diferenças
(B6D2F1-SW).Foi calculado o Erro Relativo (ER)
entre os valores percentuais de potência para a
mesma amostra testada nas duas linhagens.
LC: Limite de Concordância; bias: Tendência
Tabela 2. Valores de p obtidos no teste qui-quadrado entre
pares de resultados de potência obtidos nas linhagens de
camundongos SW x B6D2F1 em 22 amostras testadas
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
valor p
0,618
0,668
0,597
0,069
0,027
0,006
0,840
0,936
0,721
0,879
0,666
Amostra
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
valor p
0,704
0,142
0,860
0,454
0,114
0,646
0,335
0,577
0,466
0,812
0,959
Figura 1. Bland-Altman para as linhagens de camundongos
SW x B6D2F1
Observando a Figura 2 e a Tabela 1,
podemos ver que a maior parte dos valores de
ER (16/22) encontra-se dentro de ± 10 %, apenas
um ER ficou acima de ± 30 % (ER = 33;
amostra 6).
SW: Swiss Webster
Para avaliar a concordância entre as
linhagens de camundongos SW e B6D2F1 foi
aplicado o método de Bland-Altman29, o qual foi
realizado utilizando o programa de computador
GraphPad Prism®, analisando os valores de
potência das 22 amostras testadas nas duas
342
Figura 2. Erro Relativo entre as linhagens de camundongos
SW e B6D2F1 (n=22)
O CV% entre as linhagens SW e B6D2F1
foi calculado a cada ensaio e 16 dos 22 valores
ficaram abaixo de 10 % (tabela 1). A figura 3
apresenta a distribuição desses valores. Podemos
observar que todos os valores de CV% ficaram
abaixo de 30 %.
CV%: Coeficiente de Variação %
Figura 3. Coeficiente de Variação % entre as linhagens de
camundongos SW e B6D2F1 (n=22)
DISCUSSÃO
Desde a sua descoberta, purificação, clonagem
e produção pela tecnologia do DNA recombinante,
dando origem a rhEPO, a EPO vem sendo
amplamente estudada. Na seleção de ensaios a
serem realizados durante o processo de controle da
qualidade da rhEPO, deve se levar em consideração
a complexidade deste medicamento biológico,
com padrão de glicosilação heterogêneo, onde
o conteúdo de ácido siálico pode influenciar
significativamente em seu metabolismo. Deste
modo e dada tal complexidade, não há ainda
modelos in vitro para a avaliação da atividade
biológica da rhEPO, e internacionalmente,
preconiza-se a realização de testes in vivo para
determinação de sua potência 15,17.
Todos os ensaios realizados - tanto na
linhagem SW quanto na B6D2F1 - cumpriram
com os critérios de validade (regressão, linearidade
e paralelismo) e apresentaram resultados dentro
dos limites estabelecidos pela Ph. Eur.15, isto é,
a potência entre 80 % e 125 % e limites entre 64 %
e 156 % da potência rotulada. Em todos os
grupos de dados avaliados, não existe evidência
estatística que comprove que a distribuição
não seja normal pelo teste de KS, p > 0,05.
Cabe ainda ressaltar, que segundo
recomendação da Ph. Eur. é possível a combinação
de resultados válidos obtidos em ensaios
independentes de potência biológica para a
liberação de um lote de rhEPO e que no presente
estudo, não houve a necessidade de combinação
de ensaios para obtenção de resultados
satisfatórios em nenhuma das duas linhagens
testadas. Esses dados diferem de estudos
anteriores, onde foi necessária a combinação
de dois ou até três ensaios independentes para
obtenção de resultados satisfatórios para uma
mesma amostra, tanto na linhagem SW21,34,35
como em outras linhagens17-20. Este fato se deve,
provavelmente, à padronização alcançada em
nosso Instituto em termos de controle de fatores
sistemáticos que podem interferir no resultado
final de um ensaio, tais como faixa de peso
corpóreo e idade dos animais; temperatura
e umidade ambiental do biotério; precisão no
preparo das amostras e na leitura de reticulócitos;
uso de instrumentos calibrados etc. que
consequentemente geraram resultados com
variabilidade adequada ao tipo do ensaio.
A variabilidade de ensaios in vivo é
bem conhecida e muito maior que aquela
esperada para outros tipos de ensaios, como
e.g. ensaios químicos. Segundo a OMS36 ensaios
biológicos, sejam eles in vitro ou in vivo,
podem apresentar variabilidade acima de 50 %.
Neste contexto, Fitzgerald et al37 recomendam
a utilização do padrão de referência, incluído
em cada ensaio, para avaliar e auxiliar no
controle desta variabilidade.
O ANOVA realizado entre os resultados de
potência das linhagens SW e B6D2F1 demonstrou,
para um nível de significância α = 0,05, que os
dados são homogêneos e que não houve evidência
estatística que comprovasse que os resultados
obtidos com ambas as linhagens não sejam
concordantes (valor p > 0,05).
Observando a média de quadrados (MQ)
entre grupos (variância entre grupos) e a MQ
dentro dos grupos (variância dentro dos grupos)
vimos que a variação entre grupos não contribui
343
mais que a variação dentro dos grupos. Isto
também demonstra a homogeneidade entre os
grupos avaliados.
A concordância também pode ser
demonstrada por meio da avaliação da
homogeneidade entre as linhagens pelo teste
do qui-quadrado (Tabela 2). Um total de 90,90 %
dos pares de resultados foram considerados
homogêneos, uma proporção significativa de
ensaios concordantes.
Segundo Bland e Altman29, medir as
diferenças entre dois métodos para cada amostra
e testá-las contra as médias é a melhor maneira
de avaliar a relação entre os métodos. Aplicando
essa regra aos nossos dados (Figura 1), ficou
demonstrada considerável concordância entre as
linhagens avaliadas. Tendo em vista a tendência
de 0,1818, ou seja, as diferenças não se afastaram
de zero de forma significativa, além de ser
possível observar a dispersão aleatória das
diferenças em torno da média, uma vez que os
resultados se mantiveram dentro dos limites
de concordância (-21,29 a 21,66), com exceção
de apenas um valor que ficou fora. A dispersão
das diferenças ao longo da linha zero é uma
indicação da concordância entre dois métodos29.
A concordância entre as linhagens SW
e B6D2F1 pode ainda ser demonstrada pela
avaliação dos Erros Relativos entre as linhagens
(Figura 2). Apenas um ER, dos 22, ficou fora
do intervalo ± 30 % (-33 %), sendo que a maioria
ficou dentro de ±10 %.
A regra 4-6-3032 para veracidade foi
atendida, ou seja, 1 resultado em 22 (4,54 %) se
apresentou fora do limite de aceitação de ± 30 %,
logo 95,45 % dos resultados se mantiveram dentro
do limite de aceitação de ± 30 %. A regra preconiza
que 4 em 6 amostras (66,67 %) devem estar
dentre os limites de aceitação de 30 %.
O CV% máximo esperado entre as linhagens
era de 30 %, no entanto todos os valores de CV
(Tabela 1 e Figura 3) ficaram abaixo de 30 % e
a maioria dentro de 10 %, demonstrando uma
baixa variabilidade (imprecisão) entre as linhagens.
Outro ponto importante é em relação ao
custo de obtenção dessas duas linhagens. Uma
fêmea de seis semanas de idade da linhagem
SW custa cerca de US 5,20, o custo da linhagem
344
B6D2F1 é de cerca de US 25,4025. Se calcularmos
o custo de um ensaio com 36 animais da linhagem
SW, o valor por ensaio ficaria em torno de US 187,20.
Já o custo do ensaio para a linhagem B6D2F1
ficaria em torno de U$914,40.
CONCLUSÃO
O ensaio de potência utilizando a linhagem
SW demonstrou estar padronizado e apresentou
alta concordância com os resultados utilizando a
linhagem B6D2F1.
Para os parâmetros avaliados, tais como
precisão intra- e inter-ensaios e veracidade, com
ambas as linhagens testadas, os valores obtidos
foram conformes e satisfatórios para os 22 lotes
analisados.
Cabe ressaltar que camundongos das
linhagens SW e B6D2F1 geraram resultados
estatisticamente semelhantes e homogêneos,
portanto, podem ser consideradas linhagens
com resposta concordantes na avaliação da
potência biológica de rhEPO. Por fim, pode-se
concluir que esta linhagem pode ser empregada
na avaliação da potência biológica de rhEPO
para fins regulatórios.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho é parte da dissertação de mestrado de
Michele Cardoso do Nascimento apresentada no
Programa de Pós-graduação em Vigilância Sanitária
do INCQS/Fiocruz. Isabella Fernandes Delgado é
bolsista de produtividade do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (DT-II/
CNPq).
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Determinação de fluoreto em baixas concentrações:
validação de método com eletrodo íon seletivo para análise
da água utilizada na preparação de soluções de diálise
Determination of fluoride at low concentrations: validation of
method using ion selective electrode to analyze the water used in
the preparation of dialysis solutions
RIALA6/1669
Sérgio DOVIDAUSKAS1*, Isaura Akemi OKADA1, Marina Miyuki OKADA1, Rita de Cássia
BRIGANTI1, Camila Cardoso de OLIVEIRA2
*Endereço para correspondência: 1Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas, Centro de Laboratório
Regional de Ribeirão Preto, Instituto Adolfo Lutz. Rua Minas nº 877, Ribeirão Preto, SP, Brasil,
CEP: 14085-410. Tel: 16 3625-5046. E-mail: [email protected]
2
Núcleo de Análise e Tratamento de Dados, Centro de Materiais de Referência, Instituto Adolfo Lutz, São
Paulo, SP
RESUMO
Este trabalho descreve o desenvolvimento e validação de metodologia analítica para determinar
a concentração de fluoreto em água empregada para a preparação de soluções de diálise, por
meio de potenciometria com eletrodo íon seletivo. Os parâmetros de validação investigados foram:
seletividade, homoscedasticidade, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, veracidade
de medição e precisão. As condições otimizadas de análise foram: tampão HOAc/-OAc/NaCl/
CDTA (pH = 5,0 ± 0,1), na proporção 10:1 (amostra/tampão); concentrações das soluções-padrão
da curva analítica: 0,05 a 0,80 mg/L. O método avaliado exibiu parâmetros de validação adequados
com limites de detecção e de quantificação, respectivamente, de 0,020 e 0,050 mg/L. Ademais,
foi também desenvolvida e validada uma planilha eletrônica para efetuar o monitoramento da
qualidade da curva analítica do método que calcula o limite de decisão para 0,20 mg/L.
Palavras-chave. fluoreto, água, diálise, potenciometria, eletrodo íon seletivo, validação de método.
ABSTRACT
This paper describes the development and validation of an analytical methodology for determining
the concentration of fluoride in water used for the preparation of dialysis solutions, by means
of potentiometry with ion selective electrode. The investigated validation parameters were:
selectivity, homoscedasticity, linearity, limit of detection, limit of quantification, reliability of
measurement and precision. The optimized conditions of analysis were: HOAc/-OAc/NaCl/CDTA
buffer (pH = 5.0 ± 0.1), in ratio of 10:1 (sample/buffer); concentrations of the standard solutions
in the analytical curve: 0.05-0.80 mg/L. The evaluated method exhibited suitable validation
parameters with detection and quantification limits equal to 0.020 and 0.050 mg/L, respectively.
Also, an electronic spreadsheet was developed and validated for monitoring the quality of analytical
curve of the methodology that calculates the decision limit to 0.20 mg/L.
Keywords. fluoride, water, dialysis, potentiometry, ion selective electrode, method validation.
347
Dovidauskas S, Okada IA, Okada MM, Briganti RC, Oliveira CC. Determinação de fluoreto em baixas concentrações: validação de método com
eletrodo íon seletivo para análise da água utilizada na preparação de soluções de diálise. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):347-60.
INTRODUÇÃO
Em termos de Saúde Pública, é comum
inicialmente associar o flúor (ou fluoreto, seu
respectivo ânion) à sua ação benéfica no controle
da progressão da cárie dentária, principalmente
através do seu uso sistêmico em águas destinadas
ao consumo humano (fluoretação) e do seu uso
tópico em dentifrícios1. Em um segundo momento,
passa-se a considerar a ocorrência da fluorose
dentária e, em casos mais graves, da fluorose
óssea, ambos em virtude da ingestão excessiva
de fluoreto. Esta ingestão excessiva pode ocorrer
pela exposição ao ar (como em certas províncias
da China, nas quais o cozimento e a cura de
alimentos são feitas através da queima de carvão
rico em fluoretos), pelo consumo de alguns
alimentos (como as folhas de chá comprimidas
em blocos, o popular “bricktea” na Ásia), ou
mesmo pela água (como no Quênia, onde a
concentração de fluoreto em alguns lagos
pode ser extremamente alta, chegando a
atingir 2800 mg/L). Até o presente, não há
nenhuma evidência consistente correlacionando
o consumo de água fluoretada com morbidade
ou mortalidade devido à ocorrência de câncer2.
Desta forma, além de se encontrar
na literatura estudos lidando com a presença
de fluoreto em águas3,4, também encontram-se
trabalhos envolvendo a presença de fluoreto em
alimentos5,6 e fluoreto como contaminante no
meio-ambiente, oriundo das indústrias de
fertilizantes, cerâmicas, vidrarias e adesivos,
além da indústria metalúrgica (aço, cobre e
níquel)7. No papel de contaminante, é preciso
considerar que, além dos impactos sobre a água
e os alimentos, o fluoreto pode atuar
dramaticamente no ecossistema, interferindo
no ciclo de nutrientes ambientais através de
reações com carbono orgânico, alumínio e ferro,
por exemplo8. Com relação à fluorose, Fewtrell
et al9 procuraram inclusive estimar a Carga
Global de Doença (a Global Burden of Disease,
da Organização Mundial da Saúde) em virtude
do fluoreto naturalmente presente em águas
destinadas ao consumo humano em várias
regiões do planeta.
Assim, torna-se evidente que a eficácia da
348
ação benéfica do flúor com relação à saúde
bucal fica condicionada a uma quantidade
ótima de ingestão: acima desta quantidade
existe o risco de fluorose, abaixo ocorreria
perda da eficácia na redução da cárie dentária
– no Estado de São Paulo, por exemplo,
0,7 mg/L é considerada a concentração ideal
em águas destinadas ao consumo humano,
sendo consideradas dentro do padrão de
potabilidade as que apresentarem concentração
na faixa 0,6 a 0,8 mg/L10. Em termos ambientais,
no entanto, o fluoreto é avaliado somente com
relação aos seus efeitos toxicológicos.
A este quadro geral da relação entre
fluoreto e Saúde Pública, pode-se ainda adicionar
um outro aspecto que, embora específico,
também é muito importante: a sua indesejável
presença em águas destinadas ao preparo de
soluções de diálise. No Brasil, por exemplo,
a legislação em vigor estabelece um valor
máximo permitido (VMP) igual a 0,2 mg/L
para águas de Serviços de Diálise11. Este VMP
relativamente baixo é justificado pela exposição
acentuada a que estão sujeitos os pacientes
com insuficiência renal crônica, quando são
submetidos à hemodiálise (HD) – nesta situação,
o volume de água em contato com o paciente
pode variar ente 375 e 700 litros por semana12.
Uma comparação entre dois casos de intoxicação
descritos na literatura, um relacionado ao
consumo comum de água (como bebida) e
outro relacionado ao uso em HD, ressalta a
importância do baixo VMP para Serviços de
Diálise: (i) em 1980, uma intoxicação severa por
fluoreto ocorreu numa feira agrícola realizada
em uma escola no Estado de Vermont (EUA),
provocada pela ingestão de água com teor de
fluoreto em torno de 1000 mg/L – este elevado
teor, provocado pela operação inadequada de
um equipamento rudimentar de fluoretação,
afetou 22 pessoas, causando náuseas e, em casos
mais graves, vômitos13; (ii) em 1993 (Illinois,
EUA), um teor de aproximadamente 20 mg/L
na água para a preparação da solução de diálise
induziu em vários pacientes sintomas como
prurido, náusea, dores de cabeça, dores no peito
e nas costas, ocorrendo ainda 3 mortes por
ataque cardíaco – neste caso, a contaminação da
água foi devido à falhas na manutenção do
sistema de purificação14. Outro caso notório em
HD é o ocorrido em 1980 em Maryland (EUA):
um excesso de flúor na água causou sérias
complicações em 8 pacientes, resultando em um
óbito12. Obviamente que a preocupação com a
qualidade da água para diálise não se restringe
somente ao controle da presença de fluoreto,
mas também a uma variedade de contaminantes
químicos e bacteriológicos que podem ser
transferidos aos pacientes seja durante as sessões
de HD12-15, seja no transcurso da diálise
peritoneal – o “Programa de Monitoramento
da Água Tratada para Hemodiálise do Estado
de São Paulo” reflete esta preocupação16,17.
Do exposto até aqui, pode-se inicialmente
prever duas abordagens na determinação da
concentração de fluoreto em amostras de águas:
uma voltada para concentrações mais altas, como
aquelas esperadas em águas de abastecimento
público no Estado de São Paulo, e outra voltada
para concentrações mais baixas, como aquelas
esperadas em águas para preparação de soluções
de diálise.
Entre os métodos disponíveis para a
determinação de fluoreto em concentrações
mais altas, o método colorimétrico (denominado
SPADNS devido ao uso do ácido 4,5-di-hidróxi3-parasulfofenilazo-2,7-naftaleno-di-sulfônico),
e o método potenciométrico com eletrodo íon
seletivo (método ISE) são os mais utilizados18,19.
Algumas características deste segundo método,
quando comparadas ao primeiro, tornaram a
sua aplicação bastante geral, seja em amostras de
águas, de alimentos ou em estudos ambientais:
(i) a simples adição de uma solução-tampão
adequada (o tampão TISAB, acrônimo de Total
Ionic Strenght Adjustment Buffer) a uma alíquota
da amostra, torna o método ISE livre da maioria
dos interferentes, ponto crítico no método
SPADNS; (ii) amostras coloridas ou turvas devem
ser destiladas antes de serem analisadas por
SPADNS – esta operação é desnecessária no
método ISE; (iii) O método SPADNS, para ser
aplicado, exige a ausência de cloro residual livre
(CRL) na amostra de água, o que não é necessário
no método ISE. Este fato é muito importante se
considerarmos que a água para consumo humano
deve conter, no mínimo, 0,2 mg/L de CRL em
toda extensão do sistema de distribuição
(reservatório e rede), de acordo com a Portaria
2914 do Ministério da Saúde20; em adição,
se a água tratada utilizada na preparação de
solução para
diálise originar-se de fonte
alternativa, a concentração de CRL deverá ser
maior que 0,5 mg/L, conforme especifica a
Resolução RDC 11, de 13/03/201411. Para eliminar
a interferência do CRL, o método SPADNS utiliza
o tóxico arsenito de sódio.
A princípio, esta comparação poderia
sugerir que a escolha natural entre os dois
métodos para analisar água a ser usada em diálise
deveria ser pelo método ISE. Porém, há que se
considerar a capacidade de cada método em
determinar fluoreto em baixas concentrações.
Por exemplo: o Standards Methods for
Examination of Waterand Wastewater informa
que uma curva linear de calibração no método
SPADNS pode ser construída no intervalo entre
0 (zero) e 1,4 mg/L, enquanto curvas lineares
de calibração no método ISE podem ser
construídas somente a partir de 0,1 mg/L19.
Este comportamento não linear (ou “não
nernstiano”) do eletrodo íon seletivo para fluoreto
a baixas concentrações já tinha sido constatado
em 1966, quando Frant e Ross publicaram o
primeiro artigo descrevendo a sua construção,
funcionamento e aplicação21. Esta perda de
linearidade tem sido atribuída à contaminação
dos reagentes das soluções-tampão utilizadas
e à variação na solubilidade (baixa) do cristal
de LaF3 dopado com Eu3+ (a membrana sólida
que constitui o sensor do eletrodo íon seletivo):
o citrato, por exemplo, poderia complexar com a
membrana cristalina, aumentando a solubilidade
do LaF3; o acetato, por sua vez, não somente
complexaria como também poderia participar
de uma reação de troca iônica não reversível
com a membrana, o que resultaria na associação
definitiva acetato-membrana, caracterizando um
envenenamento gradual e progressivo do eletrodo,
comprometendo sua veracidade de medição e
precisão22,23.
No intuito de se melhorar as características
da membrana e a performance do método ISE
para determinação de fluoreto, o que inclui
349
estender a faixa de linearidade da curva
de calibração a concentrações mais baixas,
muitos estudos podem ser encontrados na
literatura, dentre os quais pode-se citar algumas
abordagens: (i) em 1971, Baumann24 mostrou
que a presença de agentes complexantes de F(como Zr4+, Th4+ e La3+) poderia estender
a resposta nernstiana até 10-9 mol/L
(aproximadamente 0,02 µg/L); contudo, esta
capacidade do eletrodo em reconhecer fluoreto
em baixíssimas concentrações não foi utilizada
na determinação de fluoreto em amostras;
(ii) a importância da solução-tampão na
determinação de fluoreto é reconhecida desde a
década de 1970: em 1977, Kauranen25 estudou
a influência da composição em 17 tampões e,
em 1981, Nicholson e Duff22 fizeram estudo
semelhante, envolvendo outros 11 tampões;
posteriormente, foram investigadas composições
soluções-tampão específicas para a análise de
fluoreto em baixas concentrações23,26, incluindo a
análise em águas para diálise27; (iii) em 2011,
pesquisadores da área de Odontologia,
preocupados com a padronização de métodos
para a análise de fluoreto em amostras biológicas
e não-biológicas, publicaram um artigo sugerindo
protocolos padronizados para minimizar as
diferenças
observadas
em
um
estudo
interlaboratorial28, recomendando que acima de
0,0105 μmol/g (aproximadamente 0,2 mg/g de
amostra) a regressão linear da curva de calibração
fosse utilizada, enquanto que abaixo deste valor
a correção de branco ou a regressão polinomial
seriam os procedimentos mais adequados.
Neste contexto, este artigo descreve o
desenvolvimento e validação de uma metodologia
analítica para a determinação da concentração
de fluoreto em água usada para a preparação
de soluções de diálise, através do estudo
do comportamento eletroquímico deste ânion
em soluções aquosas (baixas concentrações),
por potenciometria com eletrodo íon seletivo
utilizando calibração externa de modo a produzir
a melhor precisão no valor do VMP (0,2 mg/L).
Em adição, é brevemente descrita uma planilha
eletrônica construída em software Excel 2010®
para o controle da qualidade da curva analítica
do método.
350
MATERIAL E MÉTODOS
Materiais e reagentes
A água usada nas preparações foi
previamente destilada e desionizada. Todos os
reagentes utilizados eram de grau analítico
(marcas Merck®, Synth® e Vetec®). Solução-padrão
de fluoreto foi preparada em água destilada
e desionizada a partir de NaF anidro, marca
Merck® com pureza 99 % (mínimo), previamente
seco em estufa a 105 oC por 2 horas. Para o
estudo da interferência de íons hidroxila, três
soluções tampão de acetato (TISAB II) de
pHs diferentes foram preparadas segundo
o Standard Methods for the Examination of
Waterand Wastewater19, com o pH final sendo
ajustado para os valores 4,50, 5,00 e 5,50,
e três soluções tampão de citrato (TISAB III)
de pHs diferentes foram preparadas segundo
normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz18,
com o pH final sendo ajustado para os valores
5,00, 5,50 e 6,00. Para o estudo da interferência
dos íons Al3+ e Fe3+, foram utilizadas soluções
padrão 1002 ± 5 mg/L (Inorganic Ventures) de
cada um dos íons e, para efeito de comparação,
uma solução tampão semelhante ao TISAB II
foi preparada, mas sem a presença do ácido
1,2-ciclohexileno-dinitrilo-tetracético
(CDTA),
sendo designada como TISAB II SEM CDTA.
Na avaliação da veracidade da medição e
da precisão, foram usados dois materiais de
referência certificados (MRC) da Environment
Canada: (i) ONTARIO-99, lote 1109, amostra de
água de lago, valor declarado igual a 0,63 mg/L
com limite para medida individual (2σ) igual
a 0,09 mg/L; e (ii) MISSIPPI-03, lote 1010, amostra
de água de rio, valor declarado igual a 0,15 mg/L
e 2σ igual a 0,04 mg/L.
Procedimentos
Nas medidas de potencial utilizou-se um
eletrodo íon-seletivo, marca Digimed® modelo
DMI-FL2, acoplado a um potenciômetro marca
Orion modelo 370. Em uma análise típica:
a 50 mL da solução-teste (padrão ou amostra)
são adicionados 5 mL de solução tampão
(proporção 10:1); o eletrodo íon seletivo é inserido
na solução mantida sob agitação, seguindo-se
a medida do potencial após a sua estabilização.
A análise estatística dos dados foi realizada nos
softwares Excel 2010® e OriginPro 9.0®.
Validação do método
A validação foi conduzida seguindo
documento orientativo da Coordenação Geral de
Acreditação do Instituto Nacional Metrologia,
Qualidade e Tecnologia (INMETRO)29, normas
ISO30-32 e recomendações da International
Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)33.
Os parâmetros de validação investigados foram:
seletividade, homoscedasticidade, linearidade,
limite de detecção (LD), limite de quantificação
(LQ), veracidade de medição e precisão.
Planilha eletrônica para controle da qualidade
da curva analítica
A planilha foi construída em software
Microsoft Excel 2010®, conforme descrito
anteriormente34,35, com equações baseadas
nas normas ISO 1109531, ISO 11843-232 e
ISO 8466-130, e em recomendações IUPAC36.
Os cálculos efetuados pela planilha foram
validados através da comparação dos resultados
gerados com aqueles resultantes do processamento
manual dos dados.
Seletividade: efeito da solução tampão e do pH
Em concentrações mais altas de fluoreto,
o desempenho do eletrodo íon seletivo geralmente
não depende do pH na faixa entre 4 e 9, mas
em concentrações mais baixas Moritz e Müller37
mostraram que o LD pode ser fortemente
influenciado quando o pH é variado de 4 a 8.
Assim, tendo como objetivo a determinação da
faixa linear para a construção da curva analítica,
experimentos foram realizados de modo a avaliar
o impacto de variações de pH nos potenciais do
eletrodo em soluções de diferentes concentrações
de fluoreto. Para tanto, usaram-se duas soluções
tampão comumente utilizadas na análise de águas.
A Figura 1A exibe medidas de potencial
obtidas em soluções aquosas de fluoreto no
intervalo de concentrações entre 0,05 e 1,5 mg/L,
usando-se duas soluções tampão (TISAB II e
TISAB III), cada solução tampão ajustada a três
pHs diferentes (cada ponto no gráfico representa
a média de ensaios realizados em triplicata).
Dois fatos podem ser observados nesta figura:
(i) os potenciais obtidos com o uso do tampão
TISAB III são sistematicamente menores que os
observados para o TISAB II na região de
menores concentrações e (ii) o TISAB II mantém
o comportamento nernstiano a concentrações
menores quando comparado ao TISAB III.
Este segundo fato é mais evidente quando
se comparam as Figuras 1B e 1C: enquanto
a Figura 1B sugere que, no caso do TISAB II,
o comportamento nernstiano possa ser estendido
até 0,050 mg/L independentemente do pH, a
Figura 1C indica que, para o TISAB III,
existe uma dependência maior em função
do pH: o comportamento nernstiano pode ser
assumido acima de 0,10 mg/L em pH = 5,0, e
acima de 0,20 mg/L em pH = 6,0. A Figura 1D
compara os potenciais obtidos com o uso das duas
soluções tampão no mesmo pH (5,0) – neste caso,
observa-se que a composição do tampão também
influencia a faixa de trabalho: a Figura sugere
que esta faixa pode se iniciar em 0,05 mg/L no caso
do TISAB II, e em 0,10 mg/L no caso do TISAB III.
Assim, as Figuras 1A-D sugerem que
a melhor condição para tamponamento das
soluções de fluoreto seria o uso de TISAB II em
pH = 4,5. Contudo, deve ser considerado que
à medida que o pH é abaixado, o valor se
aproxima do pKa do ácido fluorídrico (igual a
3,2), aumentando a fração de fluoreto na forma
não dissociada. Desta forma, para a continuidade
do trabalho optou-se pelo uso de TISAB II em
pH = 5,0 ± 0,1 na proporção 10:1 (amostra:
tampão). Este tampão é comumente usado na faixa
de pH entre 5,0 e 5,5 na proporção 1:119.
Seletividade: efeito de íons interferentes (Fe3+
e Al3+)
Além da influência dos íons OH- sobre
o potencial do eletrodo íon seletivo de fluoreto
(mantida sob controle através do tamponamento
da solução em pH adequado), os principais
interferentes na determinação de fluoreto
em amostras de águas são os íons Fe3+ e Al3+.
No caso de concentrações mais elevadas, como
351
Figura 1. Influência da solução tampão e do pH nos potenciais do eletrodo íon seletivo de fluoreto em soluções contendo
diferentes concentrações de fluoreto
aquelas esperadas nas águas de abastecimento
público do Estado de São Paulo, essas interferências
já são bem estabelecidas: 200 mg/L de Fe3+
causam um erro negativo de 0,1 mg/L na
concentração de fluoreto igual 1 mg/L, e 3,0 mg/L
de Al3+ causam um erro de mesma magnitude e
direção, com o uso do TISAB II na proporção
1:119. Tendo em vista que o VMP para águas
de Serviços de Diálise é igual a 0,2 mg/L, e que
a proporção do TISAB II foi alterada assim como
a faixa de pH foi restringida em relação
ao comumente usado, estudou-se a influência dos
dois íons (separadamente) sobre o potencial
desenvolvido no eletrodo em uma solução
tamponada com TISAB II em pH = 5,0 (proporção
10:1) contendo 0,20 mg/L, de modo a estimar
352
o impacto sobre uma possível tomada de decisão
entre conforme e não conforme.
A Figura 2A apresenta a variação dos
potenciais do eletrodo em função do aumento
da concentração de Fe3+ em duas soluções
contendo 0,20 mg/L. Cada uma dessas soluções
foi tamponada com duas soluções diferentes
(TISAB II e TISAB II SEM CDTA), ambas no
mesmo pH (5,0 ± 0,1) e na mesma proporção
(10:1). Pode ser observado que na ausência de
CDTA, o potencial aumenta continuamente o seu
valor, enquanto que em sua presença o potencial
tem um discreto aumento até aproximadamente
60 mg/L de Fe3+; a partir desta concentração, o
potencial aumenta a uma taxa similar à obtida
com o TISAB II SEM CDTA. De fato, as
TISAB II, pH = 5,0
TISAB II sem CDTA, pH = 5,0
180
Potencial (mV)
em função do aumento da concentração de Al3+
(Figura 2B, linha contínua). Para comparação,
os ensaios foram repetidos com o uso da
solução TISAB III (pH = 6,0, proporção 10:1)
e os resultados mostraram uma alta tolerância
à presença de Al3+ sem mudança significativa
de potencial (Figura 2B, linha tracejada).
A partir de curvas analíticas construídas no
decorrer dos ensaios, estimou-se que a presença
de 1,6 mg/L de Al3+ causa um erro de -10%
na concentração 0,20 mg/L de F-. Este valor
(1,6 mg/L) é 160 vezes maior que o VMP
estabelecido
pela
Resolução
RDC
1111.
Da mesma forma, foram estimadas as
concentrações de F- antes e após a primeira
adição (ausência de Al3+ e presença de 0,18 mg/L
de Al3+, respectivamente) – neste caso, o teste
t Student entre as médias (α = 0,05), não indicou
diferença significativa (P = 0,058). Desta forma,
embora o TISAB II (pH = 5,0 ± 0,1 proporção
10:1) não tenha se revelado capaz de limitar
a interferência do Al3+, resolveu-se continuar
o desenvolvimento do método com este tampão
em vista de seu potencial em produzir curvas
de calibração lineares a concentrações mais baixas
– a interferência da presença de até 0,18 mg/L
de Al3+ foi considerada não significativa.
TISAB II, pH = 5,0
TISAB III, pH = 6,0
B
A
178
180
178
176
176
174
174
172
0
10
20
30
40
50
60
Fe3+ (mg/L)
70
80
90
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Potencial (mV)
concentrações de fluoreto, estimadas através
de curvas analíticas construídas no decorrer
dos ensaios, diminuíram de 0,203 ± 0,014 mg/L
(0 mg/L de Fe3+) para 0,176 ± 0,012 (90 mg/L
de Fe3+), com um valor igual a 0,195 ± 0,014 mg/L
na presença de 60 mg/L de Fe3+. Nas condições
em que os ensaios foram realizados, a quantidade
calculada de CDTA disponível permitiria a
complexação de 56 mg/L de Fe3+, o que é
consistente com a mudança de taxa de aumento
de potencial observada em torno de 60 mg/L.
O teste t Student (α = 0,05) mostrou que as
médias das concentrações na ausência de Fe3+ e na
presença de 60 mg/L não apresentavam diferença
significativa (P = 0,062). Desta forma, conclui-se
que o sistema TISAB II em pH = 5,0 ± 0,1
(proporção 10:1) é capaz de limitar interferência
significativa de até 60 mg/L de Fe3+; a partir desta
concentração, pode ser previsto um erro negativo
de magnitude continuamente crescente em
função do aumento da concentração de Fe3+.
Registre-se aqui que a Resolução RDC 11 de
13/03/201411 não especifica VMP para este íon.
No caso do Al3+, a solução TISAB II
(pH = 5,0 ± 0,1, proporção 10:1) não é capaz
de limitar a sua interferência, como pode ser
observado pela curva crescente de potencial
172
Al3+ (mg/L)
Figura 2. Influência da presença de Fe3+ (A) e Al3+ (B) no potencial do eletrodo íon seletivo de fluoreto em uma solução contendo
0,20 mgF-/L. Cada ponto nos gráficos representa a média de potenciais obtidos de ensaios realizados em triplicata
353
Homoscedasticidade dos sinais analíticos das
soluções padrão da curva analítica
Considerando que a curva analítica
adequada para a determinação de fluoreto
em águas para diálise deve promover a melhor
precisão na concentração correspondente ao
VMP, e que os potenciais são grafados em função
do logaritmo da concentração, planejou-se
inicialmente uma curva analítica cuja posição
central em termos logarítmicos correspondesse a
0,20 mg/L. Assim, as concentrações escolhidas
foram 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, e 0,80 mg/L.
A Figura 3A exibe os histogramas dos potenciais
obtidos para 25 soluções de cada uma dessas
concentrações, enquanto as Figuras 3B-F
apresentam cada um desses histogramas em
particular. Nesses histogramas podemos observar
que os valores p calculados pelo teste de
normalidade Kolmogorov-Smirnov são maiores
que um nível de significância igual a 0,05 – isso
14
0,80mg/L
12
10
Frequência
A
0,40mg/L
0,20mg/L
implica que, nesse nível de significância, os
sinais analíticos das 5 soluções padrão podem
ser consideradas com distribuição normal.
Para testar a homoscedasticidade, realizou-se
o teste de homogeneidade das variâncias segundo
a ISO 8466-130 (nível de significância = 0,01),
que consiste em se fazer um teste F entre as
variâncias da solução de menor concentração
com a de maior concentração (no nosso caso,
0,05 e 0,80 mg/L, respectivamente). O valor
de F calculado (denominado de “valor PG”
na norma ISO) resultou em 1,65, um valor
menor que o de F tabelado (igual a 2,66).
Desta forma, considerou-se que as variâncias
eram homogêneas, ou seja, que uma regressão
linear por mínimos quadrados ordinários
(ISO 1109531 e ISO 8466-130) ou uma regressão
polinomial de segunda ordem (ISO 8466-238)
poderiam ser empregadas no ajuste de uma
função matemática aos dados.
B
0,05mg/L
0,05mg/L
p(KS) = 0,94
C
0,10mg/L
p(KS) = 1
0,10mg/L
8
6
4
2
0
140
160
180
200
205
206
207
Potencial (mV)
14
12
208
209
210
211 189
190
191
Potencial (mV)
D
0,20mg/L
p(KS) = 0,86
192
193
194
195
Potencial (mV)
E
0,40mg/L
p(KS) = 0,23
F
0,80mg/L
p(KS) = 0,78
Frequência
10
8
6
4
2
0
172
173
174
175
Potencial (mV)
176
177
154
155
156
157
158
Potencial (mV)
159
160 136
137
138
139
140
141
142
Potencial (mV)
Figura 3. Histogramas de 25 sinais analíticos das soluções padrão de fluoreto de concentrações 0,05 a 0,80 mg/L (A). As Figuras
B-F são os histogramas individuais do conjunto exibido na Figura A, com respectivas curvas normais (p(KS) é a probabilidade
calculada pelo teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov)
354
Linearidade
Para testar a linearidade dos dados da
curva analítica, seguiu-se o procedimento
indicado na ISO 8466-130. O teste estatístico
para linearidade consiste no cálculo do
valor da estatística PG pela equação 1:
O valor calculado de PG é então
comparado com o valor de F tabelado, conduzindo
a duas decisões possíveis: a) se PG ≤ F: a função
de calibração não-linear não promove um
ajuste significativamente melhor – a função de
calibração é considerada linear; b) se PG > F:
os dados devem ser avaliados usando uma função
de calibração não-linear.
Aos dados obtidos em um experimento de
medidas (em duplicata) de potencial de soluções
padrão 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, e 0,80 mg/L
procedeu-se a um ajuste linear e a um ajuste
não-linear (polinômio de 2ª ordem). As Figuras 4A
e 4B apresentam esses dois ajustes. O valor de PG
calculado (1,40) é muito menor que o valor de F
tabelado (F =18,51) para um nível de significância
α = 0,05. De fato, este resultado era esperado uma
vez que a simples inspeção visual do gráfico
potencial versus log (concentração) sugeriu a
regressão linear como aplicável aos dados,
enquanto os coeficientes de correlação (r, Pearson)
onde
• s2y2= variância da função de calibração nãolinear
• DS2 = diferença de variâncias, calculada pela
equação 2
onde
• N = número de soluções-padrão
• s2y1= variância da função de calibração
linear
B
A
210
potencial 0901 (mV)
195
180
165
y = 134,1 - 58,1x
2
sy1= 0,4689
y = 133,4 - 61,2x - 2,2x
r (Pearson) = -0,99977
sy2= 0,41328
2
150
135
2
2
2
Rajust= 0,99939
Rajust= 0,99946
C
210
195
potencial 1001 (mV)
medida em 09/01/2014
ajuste polinomial 2ª ordem
ajuste linear
D
ajuste polinomial 2ª ordem
ajuste linear
180
165
y = 134,7 - 57,4x
2
sy1= 0,912
y = 133,3 - 63,8x - 4,6x
r (Pearson) = -0,99954
sy2= 0,167
2
150
135
2
2
2
Rajust= 0,99978
Rajust= 0,99878
-1,2
-0,8
log conc fluoreto
-0,4
0,0
-1,2
-0,8
-0,4
0,0
log conc fluoreto
Figura 4. Curvas analíticas construídas por meio de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ordinários (A e C)
e de regressão polinomial de 2ª ordem (B e D). Os pares de curvas A-B e C-D foram construídas a partir dos dados obtidos em
dois experimentos diferentes
355
e de determinação ajustado (R2ajust) obtidos
prenunciaram o resultado do teste da estatística
PG, assim como os valores relativamente
próximos das variâncias s2y1 e s2y2. Contudo,
observou-se que uma pequena variação nos dados
experimentais pode ocasionar uma grande variação
na estatística PG. Tal fato é ilustrado nas Figuras
4C e 4D, em que os mesmos ajustes (linear e
polinomial de 2ª ordem) foram aplicados a dados
obtidos posteriormente. Neste caso, tanto a
inspeção visual como os valores de r e R2ajust
apresentam características similares aos exibidos
nas Figuras 4A e 4B, mas as variâncias s2y1 e s2y2
apresentam valores bastante diferentes entre si
(0,912 e 0,167, respectivamente) o que conduziu
a uma PG = 14,4, um valor ainda menor que o
valor crítico de F (18,51). Assim, apesar dessa
diferença entre as estatísticas PG nos dois
experimentos, ambos produziram dados aos
quais a regressão linear por mínimos quadrados
ordinários pôde ser aplicada para o ajuste
matemático da função de calibração. Ressalte-se
que em todas as curvas analíticas construídas
posteriormente o valor de R2ajust para o ajuste de
uma função linear foi maior que 0,999.
Limite de detecção (LD) e limite de quantificação
(LQ)
Como discutido anteriormente, a curva
analítica foi considerada linear acima de 0,05 mg/L.
Portanto, considerou-se essa concentração como
o LQ do método.
No caso do LD, não se pôde calculá-lo
como o faz a ISO 11843-232, ou seja, a partir de
dados da curva analítica, uma vez que a função
matemática ajustada não está definida para valores
menores que 0,05 mg/L. Por outro lado, também
não se pôde calculá-lo a partir de medidas
de soluções isentas de fluoreto (brancos),
como sugerido pelo documento orientativo
DOQ-CGCRE-008 (INMETRO)29, uma vez que o
potencial do eletrodo íon seletivo não se
estabiliza nessa condição (fluoreto ausente)37.
A alternativa que se seguiu para o cálculo do LD
é baseada em recomendações da IUPAC39: o
LD corresponde ao ponto de intersecção entre
a extrapolação do segmento linear da curva
analítica na direção de concentrações mais
356
baixas e a extrapolação dos pontos de mais
baixa concentração do segmento não-linear
na direção de concentrações mais altas.
Seguindo este procedimento gráfico, o LD
foi estimado em 0,020 mg/L.
Veracidade de medição e precisão
A veracidade de medição e a precisão
(condições de repetitividade) foram avaliadas
com o uso de dois MRCs:
a) para o MRC1, com teor de fluoreto declarado
igual a 0,15 ± 0,04 mg/L (limite de ± 2σ),
a concentração determinada em triplicata
com o uso da curva analítica linear na
faixa 0,05 – 0,80 mg/L resultou em 0,16 ±
0,01 mg/L (intervalo de 95 % de confiança,
n = 3), indicando uma recuperação de
+ 106,7 % e coeficiente de variação igual a
3,1 %. Observe-se que a faixa de valores
compreendendo a média das concentrações
determinadas, acompanhada do respectivo
intervalo de confiança 95 %, está inserida
na faixa de valores compreendendo o valor
declarado do MRC1 acompanhado do seu
limite 2σ.
b) para o MRC2, com teor de fluoreto declarado
igual a 0,63 ± 0,09 mg/L (limite de ± 2σ),
a concentração determinada em triplicata
com o uso da curva analítica linear na faixa
0,05 – 0,80 mg/L resultou em 0,66 ± 0,02 mg/L
(intervalo de 95 % de confiança, n = 3),
indicando uma recuperação de +104,8 % com
coeficiente de variação igual a 1,2 %. Observe-se
que a faixa de valores compreendendo a média
das concentrações determinadas, acompanhada
do respectivo intervalo de confiança 95 %,
está inserida na faixa de valores compreendendo
o valor declarado do MRC2 acompanhado do
seu limite 2σ.
Tanto a veracidade de medição como a
precisão foram consideradas satisfatórias.
Desenvolvimento de planilha eletrônica para o
controle da qualidade da curva analítica
Uma vez definida as características
básicas da curva de calibração que conduzem ao
LD e LQ indicados, bem como à veracidade
de medição e à precisão das concentrações
determinadas através do método, desenvolveu-se
uma planilha eletrônica capaz de controlar a
qualidade da curva analítica ao longo do tempo,
ou seja, uma planilha capaz de verificar se
aquelas características permanecem válidas após
a validação. Esse tipo de planilha já foi descrita
em trabalhos anteriores34, 35, e aqui descrevemos
a principal mudança com relação às planilhas
anteriores: o cálculo do limite de decisão (CCα)
para o VMP do fluoreto em águas utilizadas na
preparação de soluções de diálise.
A Figura 5 exibe uma visão geral da
planilha desenvolvida para o método descrito
nesse trabalho. No destaque desta Figura, pode
ser observado o cálculo do CCα para 0,20 mg/L
baseado nas equações 3 e 435. Os valores de
CCα obtidos nas curvas analíticas construídas
(R2ajust> 0,999) situaram-se no intervalo entre
0,208 e 0,216 mg/L.
yc ( 0, 20 mg / L ) = yˆ ( 0, 20 mg / L ) − t1−α (ν ) ⋅ σˆ
1
1
+
+
K I ⋅J
x2
I
J ∑ ( xi − x ) 2
(3)
i =1
CCα
t
( 0 , 20 mg / L )
= 10
y c ( 0 , 20 mg / L ) − aˆ
bˆ
(4)
Em adição, pode ser observado na Figura 5
que o gráfico de resíduos sugere uma função
polinomial de 2ª ordem para o ajuste mais adequado
aos dados. Contudo, no caso do eletrodo íon
seletivo de fluoreto, deve ser considerada também
a sua perda de eficiência em produzir curvas
analíticas lineares a concentrações mais baixas em
função do tempo de utilização, como já discutido
por Okada et al40: os autores sugerem a estatística
PG como a mais indicada para o monitoramento
dessa perda de eficiência – no momento em que
PG >Ftabelado, o eletrodo deverá ser substituído.
Figura 5. Visualização da planilha desenvolvida para o controle da qualidade da curva analítica da análise de fluoreto em água
para diálise. No destaque, as células destinadas ao cálculo do limite de decisão para o VMP (0,20 mg/L)
357
CONCLUSÃO
O método aqui descrito exibiu parâmetros
de validação adequados à determinação da
concentração de fluoreto em águas para a
preparação de soluções de diálise na presença de
até 60 mg/L de Fe3+ e de até 0,18 mg/L de Al3+.
Desse estudo, pode-se destacar que o uso de uma
solução tampão comum (TISAB II) promoveu
a obtenção de uma curva analítica linear em
torno do VMP através do controle rigoroso
do pH e da mudança da proporção amostra:
tampão geralmente utilizada (de 1:1 para 10:1).
Essas mudanças permitiram o uso da calibração
externa com a precisão sendo otimizada na
região do VMP, evitando assim a extrapolação,
intrinsicamente menos precisa, do método de
adição de padrão, como sugerido por Freitas et al27.
AGRADECIMENTOS
Aos Pesquisadores Científicos do Instituto Adolfo
Lutz Central, Paulo Tiglea (pelo fornecimento dos
padrões de Fe3+ e Al3+) e Maria Anita Scorsafava
(pelo fornecimento dos Materiais de Referência
Certificados).
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Validação de um método prático para determinação
de níveis de amoxicilina em águas naturais por
CLAE-UV e sua aplicação na qualidade ambiental
Validation of a practical method for determination of
amoxicillin contents in natural waters by means of HPLC-UV
and its application in the environmental quality
RIALA6/1670
Caio Matheus da Rocha Couqueiro Monteiro de OLIVEIRA*, Kaíque Mesquita CARDOSO, Milena
Mendes de SOUZA, José Soares dos SANTOS, Maria Lúcia Pires dos SANTOS
*Endereço para correspondência: Laboratório de Química Analítica e Ambiental, Departamento
de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Estrada do Bem Querer, km 4,
Vitória da Conquista, BA, Brasil. CEP: 45031-900. E-mail: [email protected]
RESUMO
A amoxicilina é penicilina sintética de uso em ambiente hospitalar, residencial e veterinário. O uso
indiscriminado deste medicamento pode acarretar prejuízos sociais e ambientais. O presente trabalho
determinou os níveis de amoxicilina em dois rios localizados no sudoeste do estado da Bahia, rios
Água Fria e Verruga. Uma metodologia analítica foi desenvolvida, otimizada e validada para efetuar
a determinação de resíduos de amoxicilina, empregando-se a cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada ao detector UV-visível (CLAE-UV). A avaliação do mérito do método foi baseada nos
parâmetros cromatográficos de validação: linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão,
exatidão e seletividade. Devido à inexistência de valores máximos de amoxicilina aceitáveis para a
água de consumo, os resultados obtidos podem constituir um indicativo dos níveis de contaminação
dos recursos hídricos por este medicamento. As maiores concentrações, superiores a 11 mg.L-1 deste
antibiótico, foram detectadas nas zonas onde recebem aportes dos deflúvios urbanos. Os parâmetros de
validação demonstraram que o método apresentou capacidade de detecção de baixos valores dos limites
de quantificação (2,7 mg.L-1) e de detecção (0,7 mg.L-1), boa precisão (DPR 7 %) e exatidão (96,75 %),
constituindo-se em uma importante ferramenta na avaliação de teores de amoxicilina.
Palavras-chave. antibiótico, cromatografia, recurso hídrico.
ABSTRACT
Amoxicillin is a synthetic penicillin used in the hospital, residential and veterinary surroundings. The
indiscriminate use of such medication may cause social and environmental damages. This study aims
at determining the amoxicillin contents in water of two rivers located in State of Bahia, the Água Fria
and Verruga rivers. An analytical method was developed, optimized and validated for determining the
amoxicillin residue, by using the high performance liquid chromatography coupled with UV-Visible
detector (HPLC-UV). The study was performed according to the chromatographic parameters validation.
Considering that the maximum acceptable values of amoxicillin for drinking water were nonexistent, the
found results might be considered as an indicator of contamination by this substance. The occurrence of
this antibiotic in the two rivers analyzed in this study indicated a heavy contamination in the urban areas
where the increased surface water runoffs occur; and their concentrations were higher than 11 mg.L-1.
The validation parameters indicated that the method showed the capacity for detecting low values of
quantification limits (2.7 mg.L-1) and of detection (0.7 mg.L-1), good precision (DSR 7 %) and accuracy
(96.75 %), thus it turned to be an important tool for assessing amoxicillin contents.
Keywords. antibiotic, chromatography, water resource.
361
Oliveira CMRCM, Cardoso KM, Souza MM, Santos JS, Santos MLP. Validação de um método prático para determinação de níveis de amoxicilina
em águas naturais por CLAE-UV e sua aplicação na qualidade ambiental. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):361-70.
INTRODUÇÃO
Medicamento é todo produto farmacêutico
que tem por finalidade ações profiláticas, curativas,
paliativas ou para fins de diagnósticos1. São inúmeras
as classes de medicamentos existentes devido ao
elevado grau de patologias, seja na população urbana
ou rural. Independentemente do que se destina a
ação do fármaco, uma vez administrado seguirá
uma série de etapas, chamada farmacocinética.
Sua ação é dividida em absorção, distribuição,
metabolização e excreção. É na excreção, etapa
final da farmacocinética, que o medicamento será
expelido do organismo em quase sua totalidade2.
Como as necessidades fisiológicas da maioria
da humanidade são realizadas em vasos sanitários
domésticos, os dejetos podem seguir caminhos
diferentes. Podem ser lançados tanto em rede
de esgoto, atingindo as estações de tratamento e
fossas sépticas, ou ainda ser despejados diretamente
em recurso hídrico, entrando assim em contato com
o meio ambiente.
Como muitos fármacos são produtos
adventos das indústrias, uma vez lançados no
meio ambiente persistem por muito tempo,
devido à ausência de micro-organismo para sua
degradação3. Os locais para detectar a presença
de fármacos no ambiente aquático são inúmeros,
pois uma vez lançado no ambiente, a ação da chuva
pode solubilizar o medicamento em mananciais de
superfície ou drená-lo para o lençol freático4.
Existem diversas classes de antibióticos,
entre as quais a penicilina e seus derivados,
como a amoxicilina, por exemplo, que é largamente
utilizada tanto em ambiente hospitalar quanto
doméstico. Trata-se de um medicamento listado
na RENAME (Relação Nacional dos Medicamentos
Essenciais), que estabelece quais medicamentos
que devem ser utilizados no Sistema Único de
Saúde (SUS), por municípios, estados e pela união5.
De acordo com sua farmacocinética, a amoxicilina
é excretada quase em sua totalidade na forma não
metabolizada por via renal2.
Muitos trabalhos na área da análise de
medicamentos utilizam a cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) e a cromatografia gasosa com
espectrometria de massas (CG-EM), seguida por
etapas de pré-concentração, principalmente por
serem consideradas técnicas sensíveis, seletivas,
362
confiáveis e práticas. A cromatografia é um método
de separação que permite de forma ampla a
identificação e determinação de componentes
químicos de misturas complexas. Entre as técnicas
analíticas de separação, a cromatografia líquida
de alta eficiência é uma das mais utilizadas,
devido à sensibilidade, adaptação e adequação para
determinação e separação de espécies não-voláteis
ou tecnicamente frágeis, com ampla aplicabilidade
às substâncias de interesses para muitos campos
da ciência6.
Assim, o presente estudo teve como
objetivo, otimizar e validar um método analítico
qualitativo e quantitativo para investigação da
possível presença de amoxicilina nos rios Água Fria
e Verruga na região de Vitória da Conquista/BA
por CLAE-UV, bem como realizar um estudo da
contaminação do ambiente aquático pelo analito.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e armazenamento das amostras
Foram coletadas 8 amostras de água de rios
da cidade, sendo quatro pontos no rio Verruga
e quatro pontos no rio Água Fria, em novembro
de 2012, período caracterizado como estação seca
na região.
As coletas de água foram realizadas de
acordo com as recomendações da Companhia
de Tecnologia de Saneamento Ambiental do
Estado de São Paulo (CETESB), por meio do guia
de coleta e preservação de amostras de água7,
em triplicata, utilizando frascos estéreis de
polietileno com capacidade de 1.000 mL, tendo
sido mantidas todas as amostras armazenadas a
4 ºC até o momento da análise.
Todas as vidrarias e frascos de polietileno
utilizados foram previamente imersos em solução
de HNO3 10 % (v/v) por 24 h e enxaguados com
água deionizada ultrapura.
Local de estudo
Os pontos de coleta no rio Verruga
foram determinados para avaliar os níveis de
contaminação por amoxicilina ao longo de seu
trajeto pelo município de Vitória da Conquista.
O ponto A1 correspondeu ao Poço Escuro,
uma reserva florestal e nascente do rio; os pontos
B1 e C1 estavam localizados na zona urbana e
o ponto D1 foi referente à estação de tratamento
de esgoto (Figura 1).
Figura 1. Pontos de coleta nas áreas em estudo: 1 (rio Verruga)
e 2 (sistema Água Fria)
Os pontos de coleta referente ao rio Água
Fria foram escolhidos para que englobassem os
dois reservatórios de água da cidade de Vitória da
Conquista (Água Fria I e Água Fria II), de forma
que demonstrassem os níveis do fármaco anterior
à contribuição citadina. O ponto A2 correspondeu
ao reservatório Água Fria I e o B2, ao término
do reservatório Água Fria II; o ponto C2
correspondeu ao açude da zona rural e D2, ao
reservatório Água Fria II.
A barragem de Água Fria I foi criada em
1970 e ampliada pela primeira vez na década de
80 com a construção da barragem de Água Fria
II, na confluência dos rios Monos e Água Fria,
responsáveis pelo abastecimento da região de
Vitória da Conquista. Por estar localizado em
uma área rural, o sistema Água Fria pode sofrer
contaminação por agrotóxicos devido à lavoura
de café e contaminação por medicamentos de
uso veterinário, devido à atividade pecuária8.
O rio Verruga nasce em uma área de
reserva florestal situada na área urbana de Vitória
da Conquista, no sudoeste do estado da Bahia.
O clima é característico das zonas de transição,
apresentando médias de temperatura e chuva
em torno de 23 oC e 900 mm, respectivamente.
A área correspondente do município é de
3743 km2, com uma população estimada em
260 mil habitantes. Nas últimas décadas, o
município apresentou um aumento populacional
o que demanda um planejamento urbano
adequado no sentido de evitar uma série de
impactos ambientais9.
Após a nascente, o trajeto superior do
rio Verruga flui para uma área metropolitana.
Mesmo com os problemas decorrentes da
expansão urbana, a cabeceira do córrego
encontra-se protegida por uma floresta de
vegetação densa. Contudo, após o percurso
canalizado, o córrego começa a receber em vários
pontos ao longo do seu leito, despejos de esgoto
sanitário e águas pluviais drenados por um
sistema de coleta combinado através de galerias
e emissários10.
Reagentes e Soluções
Para determinação da amoxicilina por
CLAE-UV, utilizou-se padrão de amoxicilina
(Vetranal®, 99,3 % de pureza), adquirido da
empresa Sigma-Aldrich® (São Paulo, SP, Brasil).
A fase móvel utilizada foi composta de fosfato
de potássio monobásico, KH2PO4 (Vetec®,
São Paulo, Brasil, 99 % de pureza), acetonitrila,
CH3CN (Merck® KGaA, Darmstadt, Alemanha,
grau de pureza 99,9 %) e hidróxido de potássio,
KOH (Nuclear®, São Paulo, Brasil, 85 % de pureza).
Todas as soluções foram preparadas
utilizando água ultrapura, obtida pelo sistema de
purificação Millipore® (São Paulo, Brasil).
Preparo das amostras
As amostras coletadas foram filtradas,
a vácuo, em membrana de borosilicato
0,47 µm. Após a filtração, 200 mL de cada
amostra foram introduzidos em evaporador
rotativo (Quimis®, Q344M2), a temperatura
de 79 °C, para se obter um volume de 10 mL,
ou seja, uma pré-concentração de 20 vezes.
Posteriormente à pré-concentração, as amostras
foram filtradas por filtros de microsseringa e
armazenadas em geladeira, entre 2 e 8 °C.
363
Preparo das soluções analíticas
Alíquota de 0,1 g do padrão de amoxicilina
foi dissolvida em 100 mL de mistura de solventes
H2O:CH3CN (1:1 v/v), para obter solução estoque
com 1.000 mg.L-1. Esta solução foi armazenada
em frasco de polietileno embalado com
papel alumínio para evitar contato com a luz.
Posteriormente, foi preparada uma solução
intermediária da amoxicilina de concentração
100 mg.L-1 e sob as mesmas condições, o preparo
das soluções de trabalho nas concentrações de
5, 10, 20, 40 e 80 mg.L-1.
Parâmetros Cromatográficos
O sistema de cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) utilizado foi composto
de uma bomba série 200, válvula de amostragem,
loop de 20 µL e um detector de ultravioleta de
comprimento de onda variável (série 200 UV/VIS,
Perkin Elmer®, EUA).
A separação do analito foi realizada
utilizando coluna RP-C18 (250 mm x 4,6 mm;
5 µm de tamanho de partícula, Thermo®, EUA).
A amostra injetada foi submetida a uma eluição
isocrática com água ultrapura, acetonitrila e
solução aquosa de fosfato de potássio monobásico
a 136,1 g.L-1 na proporção 83:16:1 (v/v/v), fluxo
de 1,2 mL.min-1 e detecção a 242 nm. A fase
móvel foi submetida a uma agitação ultrassônica
(lavadora ultrassônica, modelo USC-1800) por
vinte minutos.
Validação
A validação de métodos deve garantir,
através de dados experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade e reprodutibilidade
dos resultados11. Realizou-se a validação com
base nos parâmetros de linearidade, precisão
(repetibilidade e precisão intermediária), exatidão
(recuperação), limites de detecção e quantificação
e seletividade, seguindo o protocolo proposto
pela ANVISA e INMETRO11-15.
A linearidade corresponde à capacidade
que o método possui em fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração da
substância em exame, dentro de uma determinada
faixa de aplicação16,17. A curva de calibração foi
364
construída utilizando o método de padronização
externa com cinco pontos, com concentrações
variando de 5 a 80 mg.L-1. Para cada concentração
(5, 10, 20, 40 e 80 mg.L-1), foram preparadas
três soluções no dia da análise, com injeções em
triplicata de cada concentração.
A precisão representa a dispersão de
resultados entre ensaios independentes, repetidos
de uma mesma amostra, amostras semelhantes
ou padrões, sob condições definidas12,16.
Em validação de métodos, o número de
determinações é geralmente pequeno e o que se
calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto (s).
A repetibilidade representa a concordância entre
os resultados de medições sucessivas do mesmo
método, realizadas sob as mesmas condições de
medição. A repetibilidade envolve várias medições
da mesma amostra, em diferentes preparações18,19.
Foram feitos ensaios com a matriz em branco
fortificada em três concentrações distintas
(10, 20 e 40 mg.L-1) (n=3), sendo que, para cada
concentração foram preparadas três soluções.
A precisão intermediária demonstra o
efeito das variações dentro do laboratório devido
a eventos como diferentes dias ou analistas ou
diferentes equipamentos ou a combinação destes
fatores14. A precisão intermediária é estabelecida
como a mais representativa da variabilidade dos
resultados em um único laboratório e a mais
aconselhável de ser adotada. Com amostras em
concentrações semelhantes à repetibilidade,
as injeções foram em triplicata e os valores
foram expressos sob a forma de desvio padrão
relativo (% DPR).
A exatidão é um parâmetro o qual faz um
comparativo entre os valores obtidos em uma
análise com valores ditos como verdadeiros,
reais12,16. É válido ressaltar que os valores ditos
como verdadeiros ou exatos são obtidos através
de medições extremamente rigorosas e meticulosas
o qual é indeterminado por natureza20.
A recuperação deve ser avaliada na faixa de
concentração esperada para o composto de
interesse21. A exatidão do método foi avaliada
através do método da recuperação. Para tal, foi
utilizado o evaporador rotativo como técnica de
pré-concentração.
Os limites de detecção (LD) e quantificação
(LQ) determinam a menor quantidade que
um determinado analito pode ser detectado e
quantificado. O mesmo pode ser determinado
de três formas: visual, sinal-ruído, parâmetros
de curva analítica12,16. Para a determinação do
limite de quantificação foram feitas diluições
sucessivas do padrão até se obter uma relação
sinal/ruído 10:1. Já o limite de detecção foi obtido
quando a relação sinal/ruído se encontrou em 3:1.
A seletividade é o primeiro parâmetro
no desenvolvimento de validação de um
método instrumental de separação e deve ser
revista continuamente durante a validação e
posteriormente, durante o
uso do método.
Algumas amostras como fármacos podem sofrer
degradação formando compostos que possam
eluir junto com o analito em interesse13.
A seletividade da metodologia foi obtida
através da comparação dos cromatogramas
da solução padrão de amoxicilina com as
amostras fortificadas e amostras em branco.
As análises estatísticas dos dados foram
desempenhadas pelo programa SPSS 16.0
(Statistical Package for Social Sciences) da
Microsoft®. Para a avaliação da linearidade da
curva analítica foram feitos teste de
homocedasticidade e análise dos resíduos.
Otimização das fases móveis
Inicialmente, a primeira fase móvel utilizada
foi aquela proposta pela Farmacopéia Brasileira,
5a edição22, que consistiu em uma solução
aquosa de KH2PO4 (6,8 g.L-1), ajustado o pH
em 5,0 + 0,1 com hidróxido de potássio 45 %,
adicionada posteriormente de acetonitrila na
proporção
KH2PO4:CH3CN
(96:4
v/v).
Posteriormente, foi testada uma segunda fase
móvel, composta por água ultrapura, solução
aquosa de KH2PO4 (136,1 g.L-1) e acetonitrila na
proporção 91:1:8 (v/v/v).
Com a primeira fase móvel, os resultados
de medições sucessivas não apresentavam
concordâncias e nem sempre foram obtidos
sinais de resposta; todavia, quando o analito
foi detectado, o tempo de retenção equivaleu a
6,2 min. Com a segunda fase móvel, observou-se
sinais de resposta em todos os ensaios;
entretanto não possuíam repetibilidade, ou seja,
as áreas dos picos de resposta para uma
mesma concentração superavam um desvio padrão
relativo de 20 %. Contudo, notou-se uma redução
do tempo de retenção, diminuído a 4,2 minutos.
A fase móvel otimizada foi composta
por água ultrapura, solução aquosa de KH2PO4
(136,1 g.L-1) e acetonitrila na proporção H2O:
KH2PO4:CH3CN (83:1:16 v/v/v). O tempo
de retenção obtido foi de 2,4 min. Para se
confirmar que as áreas dos picos não iriam
sofrer alterações ao aumentar a concentração
da acetonitrila, foi realizado teste da fase móvel
com acetonitrila em 20 %, notou-se que as áreas
correspondiam as mesmas ao utilizar 16 %, com
pequenas variações no tempo de retenção,
porém por uma questão de economia de
solvente, optou-se pelo uso do eluente na
concentração de 16 %.
Linearidade
O coeficiente de correlação e a equação
da reta podem ser observados na Figura 2a.
Demonstra-se uma forte correlação, com
aumento das áreas dos picos de resposta à medida
que aumenta a concentração do analito13.
Para verificar a não ocorrência de tendência,
procedeu-se à análise de resíduos, sendo que
o gráfico de dispersão dos resíduos em
função dos valores preditos mostrou-se aleatório
(Figura 2b).
Para garantir a avaliação da linearidade da
curva foi feito um teste de homocedasticidade
pelo teste de Cochran (k = 5; n = 3; α = 0,05),
com o propósito de verificar a homogeneidade
da variância14,23,24. O comportamento das variáveis
foi homocedástico (Tabela 1).
Precisão
Repetibilidade (precisão intra-dia)
Expressaram-se os resultados na forma de
desvio padrão relativo (% DPR), sendo 7,25; 4,78
e 8,97 % para as concentrações de 10, 20 e
40 mg.L-1, respectivamente. Indica-se uma
precisão aceitável para a validação quando
inferior a 20 %25.
365
Figura 2. Modelo referente à curva analítica com 5 níveis em triplicata (a) e o gráfico de resíduos (b)
Tabela 1. Avaliação da linearidade (Teste de Cochran)
Resposta
Concentração mg.L-1
5
10
20
40
80
Cálculos
Replicata
Área
1
1245,300
2
1384,230
3
1870,840
1
2638,800
2
2903,550
3
2986,450
1
9017,540
2
9690,330
3
9974,000
1
22124,050
2
22124,240
3
24099,400
1
43387,650
2
45090,700
3
46408,240
Média
Variância
1500,123
107898,521
2842,933
32970,916
9560,623
241321,797
22782,563
1300544,114
44962,197
2293375,817
Avaliação
Variância
C de Cochran
366
Maior
2293375,817
Somatório
3976111,166
Calculado
0,577
Tabelado
0,684
Resultado
Homocedástico
Precisão intermediária (precisão inter-dias)
O teste para tal parâmetro foi realizado
com uma semana de intervalo. A precisão
intermediária para as concentrações de 10,
20 e 40 mg.L-1 foi de 8,88; 5,13 e 7,76 %,
respectivamente. Para ter validade o desvio
padrão relativo não deve ultrapassar 20 %25.
Exatidão (Recuperação)
A recuperação obtida apresentou-se na
faixa aceitável para validação de métodos
(91,74; 103,95 e 94,57 % para as concentrações
de 10, 20 e 40 mg.L-1 respectivamente), que
para análise de resíduos compreende entre 70 e
120 %10. A boa recuperação dos analitos indica
que não ocorreram degradações significativas
da amoxicilina, na rotaevaporação das amostras
a temperatura de 79 oC durante o processo de
extração.
Limite de Quantificação e Detecção (LD e LQ)
Esses
parâmetros
demostraram-se
satisfatórios, uma vez que foi obtido valores
baixos para ambos. Assim, LQ= 2,7 mg.L-1 e
LD= 0,7 mg.L-1.
Seletividade
O método foi seletivo, visto que não
existem compostos próximo ao tempo de retenção
do analito (Figura 3). Para garantir que o sinal
de
resposta
não
sofreria
sobreposição,
realizaram ensaios com a corrida cromatográfica
de 20 minutos, a qual não foi constatada
interferentes.
Figura 3. Cromatogramas: (a) Solução-padrão de amoxicilina a 40 mg.L-1; (b) Amostra fortificada a 40 mg.L-1; (c) Amostra
da estação de tratamento do rio Verruga pré-concentrada 20 vezes; (d) Água ultrapura e acetonitrila 1:1 (v/v); (e) Água ultrapura;
(f) Amostra do reservatório Água Fria I pré-concentrada 20 vezes
367
Aplicação
Pode-se
observar
que
as
maiores
concentrações de amoxicilina, na faixa de
11,24 mg.L-1 a 16,55 mg.L-1 se encontram nos
pontos da zona urbana (Tabela 2), estes valores
podem ser atribuídos devido principalmente a
proximidade desse trecho a uma unidade hospitalar,
como também por esta área ser um local de
lançamento direto de esgoto bruto da cidade.
Por outro lado, nas águas coletadas no
ponto A1, área de reserva ambiental e nascente
do rio Verruga, foram encontrados teores
de amoxicilina superiores aos detectados nas
amostras oriundas do trecho do rio próximo
a estação de tratamento de esgoto, ponto D1
(Tabela 2). Tal fato pode ser explicado em virtude
de possíveis descartes ilegais de medicamentos
na área localizada à montante do recurso hídrico.
Ou então, devido à visitação frequente de pessoas
no local para recreação. O descarte indevido de
fármacos no lixo doméstico e/ou o lançamento na
rede de esgoto, podem provocar a contaminação
dos solos, bem como, das águas superficiais
e subterrâneas. Tal comportamento pode se
constituir em um importante fator gerador de
impactos da saúde das populações e provocar
danos ao meio ambiente26. Ao contrário do que
se esperava, observou-se que o efluente da
estação de tratamento de esgoto (ETE), não
impactou as águas do rio Verruga com relação
aos níveis de amoxicilina. As amostras de
água coletadas próximo ao local de despejo do
efluente da ETE, ponto D1, apresentaram os
níveis mais baixos de amoxicilina. Isso ocorreu
provavelmente devido ao grande número
de tributários localizados à montante ao ponto
de coleta, os quais provocam uma elevada
vazão das águas do rio, refletindo-se assim na
diluição dos teores de amoxicilina.
No sistema Água Fria, por se tratar de
um recurso hídrico localizado em zona rural,
esperava-se níveis de amoxicilina inferiores.
Contudo, o fato da amoxicilina ser um
medicamento de uso humano e veterinário,
atribui-se os níveis desse analito ao uso veterinário,
devido ao manejo de animais na área.
A literatura especializada apresenta níveis
de amoxicilina em estações de tratamento de
água na Alemanha com concentrações de 28 a
82,7 µg.L-1, Itália na ordem de 120 µg.L-1 e
nos EUA em água de rio com concentração
de 10 ng.L-1 27-29. Desta forma, percebe-se que
os níveis de fármacos no ambiente aquático de
Vitória da Conquista, embora elevados nos
pontos de aporte, tende a se esvaecer à medida
que se distancia do local de fonte poluidora.
Tabela 2. Concentrações médias de amoxicilina (em mg.L-1 ± desvio padrão) das amostras de água
Local de Estudo
Rio Água Fria
368
Rio Verruga
Pontos
Concentrações
Pontos
Concentrações
A2
(Reservatório I)
< LD
A1
(Nascente)
3,70 ± 0,15
B2
(Término do Reservatório II)
1,10 ± 0,08
B1
(Zona Urbana)
16,55 ± 2,10
C2
(Zona Rural)
< LD
C1
(Zona Urbana)
11,24 ± 1,40
D2
(Reservatório II)
< LD
D1
(Estação de Tratamento)
1,50 ± 0,30
CONCLUSÃO
O método otimizado para avaliação de
amoxicilina em água mostrou-se eficiente.
Apresentou baixos valores dos limites de
quantificação e detecção, precisão e exatidão
satisfatórias, constituindo-se em uma importante
ferramenta na avaliação de teores de amoxicilina
nos recursos hídricos.
Os
resultados
mostraram
que
as
concentrações mais elevadas de amoxicilina
foram detectadas nas águas que sofrem influência
das atividades urbanas. O trecho urbano do rio
Verruga apresenta as maiores concentrações,
que tendem a diminuir à medida que se distancia
dos deflúvios da cidade.
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Evaluation of a multiplex PCR for detection of a fraud in the
minced beef meat by adding buffalo meat
RIALA6/1671
Andrey Carlos do Sacramento de OLIVEIRA1, Bárbara Cristina Amorim FERREIRA1, Gabrielle Virgínia
Ferreira CARDOSO1, Cleyzer Lopes SILVA1, Andréia Silva da SILVA1, Flávio da SILVA1, Rafael Monteiro de
MELO1, Diogo José CARDILLI2, Fábio Pereira Leivas LEITE3, Talita Bandeira ROOS1, Carina Martins de
MORAES1*
*Endereço para correspondência: 1Laboratório de Higiene e Qualidade de Alimentos e Laboratório
de Microbiologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Programa de Pós-graduação em Saúde
Animal na Amazônia, Universidade Federal do Pará (UFPA), Campus Castanhal. Instituto de
Medicina Veterinária da UFPA, Campus Castanhal. BR 316, Km 62, Bairro Saudade, Castanhal, PA.
CEP: 68740-970. Tel: 91 3711-4723. E-mail: [email protected]
2
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Vigilância Agropecuária Internacional – VIGIAGRO,
Aeroporto Val-de Cans, Belém, Pará
3
Laboratório de Bacteriologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec, Faculdade de Biotecnologia,
Universidade Federal de Pelotas (UFPel)
RESUMO
O presente trabalho avaliou a sensibilidade de uma modalidade de técnica de PCR multiplex para efetuar a
detecção de fraude por adição intencional de carne moída bubalina em carne moída bovina. Neste contexto,
as amostras de carnes moídas de bovinos com adição de 0,01 %, 0,1 %, 1,0 %, 5,0 %, 10,0 %, 25,0 %, 50,0 %,
75,0 %, 90,0 %, 95,0 %, 99,0 %, 99,9 %, 99,99 % de carne moída bubalina foram produzidas em triplicata
com cinco réplicas. As carnes moídas exclusivamente de cada uma das espécies foram utilizadas como
amostras controle. Cada uma das amostras produzidas foi analisada por meio de Reação em Cadeia da
Polimerase multiplex. A fim de realizar a análise da sensibilidade do teste, percentagens conhecidas de
amostras de DNA (0,01 %, 0,1 %, 1,0 %, 5,0 %,10,0 %, 25,0 %, 50,0 %, 75,0 %, 90,0 %, 95,0 %, 99,0 %, 99,9 %,
99,99 %) das espécies Bos taurus e Bubalus bubalis foram diluídas e misturadas em um volume final de 10 μL;
e estas foram também analisadas pela metodologia de PCR proposta. A técnica de PCR multiplex mostrou
ser eficaz e de alta sensibilidade, capaz de detectar incrementos de 10,0 % (2,05 ng) de DNA bubalino e de
0,1 % (0,041 ng) de DNA bovino.
Palavras-chave. identificação de espécies, autenticidade de alimentos, adulteração.
ABSTRACT
This study aimed at evaluating the sensitivity of a multiplex PCR technique for detecting fraud by the deliberate
addition of buffalo meat into the minced bovine beef. The minced bovine beef containing 0.01 %, 0.1 %,
1.0 %, 5.0 %, 10.0 %, 25.0 %, 50.0 %, 75.0 %, 90.0 %, 95.0 %, 99 %, 99.9 %, 99.99 % of minced buffalo beef
were produced in triplicate, with five replicates. The minced meats exclusively of each animal species were used
as control samples. Every prepared sample was analyzed by means of multiplex polymerase chain reaction.
For performing the assay sensitivity analysis, the known concentrations of DNA samples (0.01 %, 0.1 %, 1.0 %,
5.0 %, 10.0 %, 25.0 %, 50.0 %, 75.0 %, 90.0 %, 95.0 %, 99.0 %, 99.9 %, 99.99 %) from Bos taurus and Bubalus
bubalis species were diluted and mixed into a final volume of 10 μL; and these DNA samples were also
assayed by the proposed PCR methodology. The multiplex PCR showed to be is an effective and highly
sensitive technique enough for detecting increments of 10 % (2.05 ng) of bubaline DNA and of 0.1 %
(0.041 ng) of bovine DNA.
Keywords. species identification, food authenticity, adulteration.
371
Oliveira ACS, Ferreira BCA, Cardoso GVF, Silva CL, Silva AS, Silva F, et al. Avaliação da técnica PCR multiplex para detecção de fraude por adição
de carne bubalina em carne moída bovina. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):371-9.
INTRODUÇÃO
De acordo com a Instrução Normativa (IN)
n° 83 do Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento (MAPA), de 21 de novembro
de 2003, entende-se por carne moída o produto
cárneo obtido a partir da moagem de massas
musculares de carcaças de bovinos, seguido
de resfriamento ou congelamento. A referida
IN acrescenta que esse regulamento aplica-se
também ao produto obtido a partir da carne
de búfalos, porém o critério de Designação
(Denominação de Venda) do referido alimento
determina que este deva ser designado de
“Carne Moída”, seguido de expressões ou
denominações que o caracterizem de acordo
com sua temperatura e do nome da espécie da
qual foi obtida1.
Com o objetivo de atingir públicos de todas
as camadas sociais, a indústria de carne tem
produzido
alimentos
com
características
diversificadas2. A carne moída é um alimento
que se destaca entre os demais produtos
cárneos especialmente por sua elevada aceitação
pelo consumidor, ligada a sua praticidade e
preços acessíveis3,4. No entanto, com a elevação
dos custos dos cortes cárneos utilizados na
produção de carne moída bovina, tem-se
relatado que algumas indústrias, com o objetivo
de tornar a produção menos onerosa, têm
incorporado fraudulentamente tecidos inferiores
ou matérias-primas cárneas de baixo valor
comercial. Neste contexto, a carne bubalina
vem sendo introduzida no mercado como carne
bovina, visto que apesar de possuir um elevado
valor nutricional, em alguns lugares pode vir
a custar até 20 % menos que a carne bovina5,
devido principalmente à baixa aceitação do
consumidor ligada à ausência de informações
que estimulem um nicho de mercado para o
seu consumo, realidade que paises como a Itália
e Austrália já vivenciaram e superaram com a
implementação de campanhas publicitárias a
respeito da carne bubalina6. Portanto, em virtude
de ser amplamente consumida, torna-se
fundamental levantar as questões referentes
a possíveis fraudes na comercialização de
tais produtos2.
372
Segundo o Regulamento de Inspeção
Industrial e Sanitária de Produtos de Origem
Animal (RIISPOA), entende-se por fraude a
alteração ou modificação total ou parcial de
um ou mais elementos normais do produto,
quando as operações de manipulação e
elaboração forem executadas com a intenção
deliberada de estabelecer falsa impressão aos
produtos fabricados, quando há supressão de
um ou mais elementos e substituição por outros,
ou ainda, quando há especificação total ou
parcial na rotulagem de um determinado
produto que não seja o contido na embalagem
ou recipiente7. As ações fraudulentas privam o
consumidor do direito de conhecer efetivamente
o que está consumindo, podendo gerar problemas
de saúde ligados ao desenvolvimento de
processos alérgicos ou de intolerância, econômicos
ou de cunho religioso8.
Alguns pesquisadores relatam que a prática
de fraude em produtos miscigenados é mais
frequente entre alimentos que apresentam
características
organolépticas
semelhantes,
destacando a carne bovina e bubalina nessa
questão9. Segundo os dados recentes do Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística10, o Brasil
apresentava em 2012 um efetivo de rebanho
bubalino de 1.261.922 cabeças, onde a região
Norte representa o maior percentual de rebanho
de bubalinos do país, sendo que o estado do
Pará detém 36 % e o estado do Amapá 20,1 %
de todo o plantel nacional. No entanto, a cadeia
produtiva do búfalo não se encontra organizada
no país, apresentando uma ausência de estratégias
de coordenação. Apesar de percorrer diferentes
níveis, esses não encontram-se integrados na
referida cadeia produtiva, o que gera fragilidade
no seguimento, aumentando a probabilidade
de práticas fraudulentas5.
Faz-se necessário ressaltar o agravante
dos abates clandestinos que distorcem os dados
reais do consumo da carne bovina e bubalina
e estes, por não serem supervisionados, ocorrem
geralmente em locais não apropriados e em
condições higiênicas precárias, chegando a ser
responsáveis, em alguns estados do país, por
41 % da carne fornecida à população11. Por toda essa
problemática, a avaliação de autenticidade das carnes
tornou-se um elemento relevante em procedimentos
de controle de qualidade dos alimentos12.
Estudos descreveram diferentes métodos
aplicados à análise de adulterações em produtos
de origem animal em que diversas formas da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foram
apontadas como viáveis para a detecção de
fraude em produtos lácteos, tais como a PCR
tradicional, PCR multiplex e a Real Time PCR9.
Embora a referida técnica venha sendo descrita
para utilização em amostras de leite e seus
derivados, poucos estudos nacionais tem
demonstrado sua eficiência para análise de
produtos cárneos, como a carne moída.
Por esta razão, o presente trabalho tem
por objetivo avaliar a sensibilidade de uma
Reação em Cadeia da Polimerase multiplex
para detecção de fraude por adição de carne
bubalina à carne moída bovina, através da
produção de carne moída experimentalmente
fraudada contendo diferentes percentagens de
carne moída bubalina.
MATERIAL E MÉTODOS
Carnes
moídas
bovinas
fraudadas
experimentalmente foram fabricadas em triplicata
no Laboratório de Higiene e Qualidade de
Alimentos da Faculdade de Medicina Veterinária
da Universidade Federal do Pará – Campus
Castanhal, através do incremento de 0,01 %,
0,1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 90 %,
95 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % de carne bubalina
e carnes moídas exclusivamente de cada uma
das espécies foram produzidas para serem usadas
como grupo controle da variável em análise.
As amostras foram preparadas para uma massa
total de 10 g, sendo a sequência da moagem
iniciada nas amostras com menor concentração
de carne de búfalo. Após o preparo de todos
os percentuais de fraude, cinco réplicas de cada
grupo foram isoladas, perfazendo um total de
225 amostras.
O DNA das amostras foi extraído através
do kit Wizard Genomic DNA Purification
(Promega®) de acordo com as instruções
do fabricante, com modificações na etapa de
lise inicial, relacionadas com a adição de 20 mg
de Proteinase K e incubação overnight em
banho-maria, a 65 oC. As amostras de DNA foram
submetidas a eletroforese em gel de agarose a
1 %, corrida em tampão TBE a 0,5 % e em seguida
o gel foi imerso em brometo de etídeo na
concentração de 5 µg/mL, durante 30 minutos.
A análise dos resultados da eletroforese foi
realizada com o auxílio de um equipamento de
foto documentação sobre luz ultravioleta
associado ao Software Total Lab® TL 100v. 2006.
A fim de auxiliar a análise da sensibilidade
do teste, concentrações conhecidas de DNA
(0,01 %, 0,1 %, 1 %, 5 %,10 %, 25 %, 50 %, 75 %,
90 %, 95 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 %) das espécies
(bovino e bubalino) foram diluídas previamente
em tampão Tris-EDTA (TE) e misturadas em
um volume final de 10 μL para serem utilizadas
posteriormente como amostras controle durante
a realização da PCR multiplex proposta.
Para a quantificação do DNA, utilizou-se o
espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 UV-Vis
e com o objetivo de se verificar a pureza das
amostras, medição da absorbância a 280 nm foi
realizada, correspondendo ao pico de absorção
de raios ultra-violetas (UVs) de proteínas, e a
230 nm, que corresponde ao pico de absorção
de UVs de contaminantes orgânicos.
Para a realização das reações de PCR
multiplex foram utilizados iniciadores que
amplificam
sequências
específicas
para
a espécie bubalina (Primer reverse 5’
TTCATAATAACTTTCGTGTTGTTGGGTGT 3’),
para a espécie bovina (Primer reverse 5’
AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT
3’)
e que amplificam sequências comuns as
duas
espécies
(Primer
forward
5’
C TAG AG G AG C C T G TT C TATA AT C G ATA
3’), descritos previamente por López-Calleja et
al13, que amplificam sequências de 220 pares de
base (pb) para DNA bubalino e de 346 pb para
bovinos. Os iniciadores foram preparados de
acordo com a instrução do fabricante (Ludwing
Biotec®), sendo diluídos em tampão TE pH 8,0,
até a concentração de 100 pmol/µL.
A metodologia da PCR multiplex proposta foi
realizada de acordo com o descrito anteriormente
por Darwish et al14 com modificações, sendo
a solução para PCR calculada para um volume
373
final de 25 µL para cada reação. Para tal, foram
utilizados 50 mM de KCl e 10 mM Tris-HCl
(tampão 1X), 10 mM dNTP mix, aproximadamente
8,2 ng de DNA molde, 1U Taq DNA Polimerase
e 10 pmol de cada iniciador, sendo o volume
completado com água ultra pura esterilizada.
O termociclador foi programado para 30 ciclos,
onde as temperaturas e os tempos utilizados
para desnaturação, anelamento e extensão
foram, respectivamente, 93 °C/30 s, 56 oC/30 s e
72 °C/30 s, acrescidos de desnaturação inicial a
uma temperatura de 93 °C/3 min e extensão final
a 72 °C/10 min.
Os amplicons obtidos foram submetidos
à eletroforese em gel de agarose a 1,0 %, corrida
em tampão TBE a 0,5 %, sendo em seguida
imerso no brometo de etídeo na concentração de
5 µg/mL, durante 30 minutos. A análise dos
resultados foi realizada com o auxílio de um
equipamento de foto documentação sobre luz
ultravioleta associado ao Software Total Lab®
TL 100v. 2006.
RESULTADOS
Os resultados observados demonstraram
que DNA foi obtido por meio da técnica proposta
com qualidade e concentrações suficientes para
a execução da PCR. A pureza e o rendimento do
DNA total extraído foram verificados a partir
da medição da absorbância a 230 nm, 260 nm e
280 nm, que indicaram valores com parâmetros
de pureza e concentração média de DNA das amostras
de 4,1 ng/μL.
A Figura 1 demonstra os resultados obtidos
a partir da PCR multiplex realizada nos 15 grupos de
carne moída experimentalmente fraudadas.
A Figura 2 demonstra os resultados obtidos
a partir da PCR multiplex realizada nas diferentes
diluições de DNA bovino e bubalino.
Os resultados demonstraram que a PCR
multiplex proposta mostrou-se eficaz para a
detecção simultânea de DNA de bovinos e
bubalinos, com um limiar de 2,05 ng de DNA
bubalino e 0,041 ng de DNA bovino, sendo capaz
de identificar incrementos de 10 %, 25 %, 50 %,
75 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % e 100 %
de carne bubalina em carnes moídas bovinas e
374
Figura 1. Gel de agarose 1,0 % demonstrando a presença de
fragmentos de DNA bovino (346 pb) e bubalino (220 pb)
obtidos através de PCR multiplex realizada a partir de amostras
de carne moída experimentalmente fraudadas com diferentes
percentagens de carne moída bubalina e suas replicatas.
Para todas as corridas, M - marcador molecular 1 kb; BV –
controle bovino (346 pb) e BF – controle bubalino (220 pb);
Em A: canaletas 1 a 5 – carne moída 100 % bovina; canaletas
6 a 10 - carne experimentalmente fraudada contendo
0,01 % de carne moída bubalina; canaletas 11 a 15 - carne
experimentalmente fraudada contendo 0,1 % de carne moída
bubalina;
Em B: canaletas 1 a 5 - carne experimentalmente fraudada
contendo 1 % de carne moída bubalina; canaletas 6 a 10 carne experimentalmente fraudada contendo 5 % de carne
moída bubalina; canaletas 11 a 15 - carne experimentalmente
fraudada contendo 10 % de carne moída bubalina;
Em C: canaletas 1 a 5 - carne experimentalmente fraudada
Em D: canaletas 1 a 5 - carne experimentalmente fraudada
Em E: canaletas 1 a 5 - carne experimentalmente fraudada
contendo 99,9 % de carne moída bubalina; canaletas 6 a
10 - carne experimentalmente fraudada contendo 99,99 %
de carne moída bubalina e canaletas 11 a 15 - carne moída
100 % bubalina.
Figura 2. Gel de agarose 1,0 % demonstrando a presença de fragmentos de DNA bovino (346 pb) e bubalino (220 pb) obtidos
através de PCR multiplex realizada a partir das diferentes diluições de DNA bovino e bubalino, onde: M - marcador molecular
1 kb; BV – controle bovino (346 pb); BF – controle bubalino (220 pb); canaleta 1 – DNA 100 % bovino; canaleta 2 - diluição de
DNA contendo 0,01 % de DNA bubalino; canaleta 3 - diluição de DNA contendo 0,1 % de DNA bubalino; canaleta 4 - diluição
de DNA contendo 1 % de DNA bubalino; canaleta 5 - diluição de DNA contendo 5 % de DNA bubalino; canaleta 6 - diluição de
DNA contendo 10 % de DNA bubalino; canaleta 7 - diluição de DNA contendo 25 % de DNA bubalino; canaleta 8 - diluição de
DNA contendo 99 % de DNA bubalino; canaleta 13 - diluição de DNA contendo 99,9 % de DNA bubalino; canaleta 14 - diluição
de DNA contendo 99,99 % de DNA bubalino e canaleta 15 - DNA 100 % bubalino.
incrementos de 0,1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %,
75 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % e 100 %
de carne bovina em carnes moídas bubalinas.
DISCUSSÃO
Diversos pesquisadores, de diversas partes
do mundo, nos últimos anos vêm trabalhando
em uma linha similar de pesquisa relacionada
com fraude em alimentos, envolvendo carne de
diversas espécies de animais, alguns detectando
fraude por adição ou substituição de carnes de
ruminantes15,16, de aves domésticas17,18, de suínos15,18,
dentre outras19,20.
Vários
estudos
internacionais
têm
demonstrado a eficiência da utilização da
técnica de PCR multiplex em identificar
espécies diferentes em uma mesma reação, com
metodologias e resultados similares aos obtidos
na presente pesquisa. Alguns pesquisadores
utilizaram iniciadores para detecção de fraude
por adição e os resultados obtidos mostraram-se
altamente específicos visto que, de 39 amostras
analisadas
(15
carnes
cruas
congeladas,
12 alimentos instantâneos congelados e 12
alimentos prontos para consumo comercializados
por ambulantes) foi possível a detecção de
fraude por adição de carne de frango (Gallus
gallus) em carne de suíno (Sus scrofa) em
16,7 % dos alimentos instantâneos congelados
e detecção de fraude por adição de carne
de frango (Gallus gallus) e de ovino/caprino
(Ovis aries) em carne de suíno (Sus scrofa) em
33,3 % das “comidas de rua” analisadas através
da metodologia proposta por Kitpipit et al21.
O mesmo grupo incrementou a pesquisa
citada acima com a identificação de mais três
espécies além das propostas anteriormente, sendo
estas carne de avestruz (Struthio camelus), equina
(Equus ferus caballus) e bovina (Bos indicus),
e a reação multiplex proposta foi capaz de
identificar as seis espécies, sendo detectado em
um total de 125 amostras de carne coletadas,
5 % de fraude por substituição de carne de
avestruz (Struthio camelus) por carne de suíno
(Sus scrofa) em carnes cruas congeladas e 64,7 %
de fraude por substituição de carne de suíno
(Sus scrofa) por carne de frango (Gallus gallus)
em cortes frios analisados. O mesmo tipo
de fraude envolvendo as duas espécies acima
citadas foi detectada em carnes cruas congeladas
(7,7 %) e em “comidas de rua” (33,3 %)22.
Da mesma forma, foi testada a técnica de
PCR quanto à sua sensibilidade para detectar a
carne bovina misturada com a carne bubalina,
suína, caprina e de frango. Os resultados
evidenciaram que a PCR foi capaz de identificar
a espécie alvo a um nível inferior a 1 % de
375
incorporação9. Foi proposto também um método
baseado em PCR multiplex, utilizando dois pares
de iniciadores, em uma mesma reação, com o
objetivo de amplificar dois fragmentos de DNA
bovino de 121 e 290 pb. A pesquisa mostrou
que a PCR multiplex é uma técnica rápida e
segura, podendo ser considerada uma ferramenta
útil no controle de carne e produtos cárneos
de qualidade15.
No mesmo contexto, outro estudo utilizou
uma PCR multiplex para avaliar a presença de
carne fraudulenta em espécies de ruminantes
(Bos taurus, Capra hircus e Ovis aries), aves
domésticas (Gallus gallus e Meleagris meleagridis)
e de suíno (Sus scrofa) em carne moída,
embutidos e cortes frescos. Foram coletadas 10
amostras de cada fonte, constatou-se que nenhuma
das amostras apresentou resíduos de suíno, mas
40 % das amostras de embutidos e 30 % das
amostras de corte fresco apresentaram DNA
de aves, e não se constatou fraude nas carnes
moídas analisadas15. Os resultados das pesquisas
citadas acima juntamente com os apresentados
no presente trabalho corroboram a informação
de Veloso et al23, que afirmam que a utilização
da PCR torna possível a identificação de uma
espécie em diferentes produtos alimentares,
detectando, assim uma possível adulteração.
No presente estudo iniciadores que
amplificam sequências específicas da região alvo
mitocondrial 12S do RNA ribossômico13
foram utilizados e se mostraram altamente
específicos e eficientes em detectar a fraude
experimental realizada nas concentrações do
presente trabalho, visto que a extração de DNA
total das amostras das carnes moídas
experimentalmente fraudadas, possibilitou a
amplificação da sequência de DNA específica,
referente às espécies de interesse.
Através da PCR multiplex realizada nas
condições selecionadas no presente experimento
foi possível se obter amplicons de 346 pb para
carne moída bovina e 220 pb para carne moída
bubalina (Figuras 1 e 2) e, através da fabricação
de carnes moídas experimentalmente fraudadas
com incremento de diferentes percentagens
de carnes moídas bubalinas, observou-se que
a PCR multiplex proposta foi capaz de detectar
376
a incorporação de carne moída bubalina em
percentagens que variaram de 10 a 100 %, e a
incorporação de carne bovina em percentagens
que variaram de 0,1 a 100 %, semelhante ao
relatado por López-Calleja et al13 que desenharam
os iniciadores e propuseram o uso de uma PCR
tradicional para detecção de fraude em queijos.
Esses autores13, que desenharam um conjunto
de iniciadores, dos quais três foram os utilizados
no presente trabalho, analisaram misturas de
queijo de leite de búfala e mozzarella de leite de
búfala contendo diferentes percentagens de leite
ou de queijo mozzarella bovina. Os resultados
demonstraram um limiar de sensibilidade de
0,1 %. Os mesmos pesquisadores, em um outro
experimento24, analisaram 5 séries independentes
de misturas binárias de leite de vaca no leite
de búfala, e os resultados da PCR multiplex
nas misturas experimentais demonstraram
capacidade de detecção de 0,1 a 100 % de leite
de vaca no leite de búfala. Esse resultado foi
reproduzido na presente pesquisa, onde o limite
de detecção para a carne bovina foi de 0,1 %
(Figura 2). No entanto, uma sensibilidade
inferior foi apresentada na detecção de carne
bubalina, sendo esta de 10 % (Figura 2).
Não foi possível fazer uma correlação entre
a sensibilidade de detecção de carne bubalina
com os trabalhos citados anteriormente, visto que
em nenhum de seus experimentos López-Calleja
et al13, 24 avaliaram a sensibilidade de detecção da
espécie bubalina, em virtude de que o objetivo
dos autores sempre foi o de determinar o limite
de detecção da técnica para a detecção de DNA
da espécie bovina adicionada em amostras
bubalinas.
Essa capacidade diferenciada dos iniciadores
em uma mesma reação de PCR, segundo Hou
et al25 evidencia que a sensibilidade da PCR
multiplex varia de acordo com a espécie, gene
alvo e tamanho do fragmento amplificado.
Matsunaga et al18 identificaram espécies de gado
(Bos taurus), cabra (Capra hircus) e ovelha
(Ovis aries), utilizando como região alvo o
citocromo b, com um limite de detecção de 0,25 ng
para todas as espécies. Outros autores26 trabalhando
com o gene alvo 12S do rRNA detectaram um
limite de 0,002 % (0,0025 ng) para as mesmas
espécies de ruminantes. Zhang17 trabalhando com
alimentos pré-cozidos, cozidos e processados
de carne bovina, utilizando como alvo o gene
do citocromo b, detectaram o limite de 0,001 ng
de DNA. Zha et al27 amplificaram sequências
da região do tRNA e encontraram limites
diferenciados para as espécies em questão, sendo
0,5 % para bovinos (Bos taurus), 1 % para suínos
(Sus scrofa) e 5 % para frangos (Gallus gallus).
Estes dados demonstram que há uma carência
de informações quanto a sensibilidade envolvendo
a espécie Bubalus bubalis, porém os estudos
acima mencionados e os resultados apresentados
na presente pesquisa evidenciam que a variação
na sensibilidade de detecção em pesquisas de
PCR multiplex é um fenômeno natural e que
varia de espécie para espécie, o que pode explicar
o fato da sensibilidade aqui demonstrada para a
carne bubalina ter sido inferior do que a para a
carne bovina.
Os dados apresentados no presente trabalho
demonstram que a técnica proposta pode ser
uma importante ferramenta a ser utilizada pelos
órgãos oficiais de fiscalização, pois apresentou
elevada sensibilidade na análise de amostras
de alimentos. O teste empregado foi capaz de
identificar com exatidão as espécies em questão,
demonstrando bandas específicas apenas a
espécie alvo e não apresentando reação cruzada
ou formação de dímeros, o que indica sua
precisão. A técnica também se demonstrou
altamente sensível, sendo capaz de detectar
incrementos de 10 % (2,05 ng) de DNA bubalino
e 0,1 % (0,041 ng) de DNA bovino, sendo essa
sensibilidade compatível com a relatada por
diversos autores13,14,17,18,24.
Embora os dados demonstrados sejam de
extrema relevância, maiores estudos visando a
quantificação de DNA bubalino em amostras
obtidas no comércio devem ser realizados,
objetivando o emprego rotineiro da metodologia
em amostras em condições diferentes das
propostas neste experimento. Para tal, o uso de
Real Time PCR, que já vem sendo estudado no
Brasil para utilização em produtos alimentícios
a partir de matéria prima bubalina28,29, pode ser
uma alternativa viável para detecção de fraude
em produtos cárneos.
CONCLUSÃO
Concluiu-se que a PCR multiplex proposta
é uma técnica de elevada precisão, com capacidade
de detecção das espécies Bos taurus e Bubalus
bubalis sem pareamentos inespecíficos entre
os iniciadores. A técnica mostrou-se de alta
sensibilidade, capaz de detectar, de forma precisa,
a presença de fraude (identificação simultânea)
com um limiar de 2,05 ng de DNA bubalino
e 0,041 ng de DNA bovino, e um limiar de detecção
em incrementos de 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 90 %,
95 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % e 100 % de carne
moída bubalina em carnes moídas bovinas e de
0,1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 90 %,
95 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % e 100 % de carne
moída bovina em carne moída bubalina. Além
disso, as repetições utilizadas evidenciaram a
repetibilidade da técnica, podendo vir a ser uma
alternativa na rotina de fiscalização oficial desses
produtos.
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379
Composição centesimal de iogurtes tradicionais e iogurtes
líquidos: incompatibilidade com as descrições da rotulagem
Centesimal composition of traditional yoghurts and drinking
yoghurts: inconsistency with the descriptions on the labels
RIALA6/1672
Heloísa Fernanda Bandeira PACHECO, Letícia Maria Nogueira SÍGOLO, Ana Paula Badan
RIBEIRO, Julicristie Machado de OLIVEIRA*
*Endereço para correspondência: Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual
de Campinas, FCA/UNICAMP, Rua Pedro Zaccaria, 1300, Caixa Postal 1068, CEP: 13484-350,
Limeira, SP. Email: [email protected]
RESUMO
O presente estudo teve por objetivo analisar a composição centesimal de iogurtes tradicionais
e de iogurtes líquidos de diferentes marcas, e avaliar a fidedignidade desta por meio de
comparação com as informações declaradas no rótulo nutricional. Os principais procedimentos
metodológicos utilizados incluíram a determinação dos teores de umidade, proteínas, lipídios
totais, carboidratos, fibra alimentar total e cinzas. Os teores proteicos apresentaram-se em
concordância com as informações declaradas nos rótulos. Em relação aos lipídios, todas as
amostras de iogurtes tradicionais demonstraram valores analíticos superiores àqueles declarados
nos rótulos. Quanto aos iogurtes líquidos, quatro amostras estavam com discrepância em relação ao
teor lipídico e uma amostra não apresentou informação nutricional referente a este macronutriente.
Pelo exposto, destaca-se a importância da melhoria dos processos tecnológicos, pois a qualidade
das informações expressas nos rótulos dos iogurtes é imprescindível para o consumidor e para os
profissionais de saúde como os nutricionistas.
Palavras-chave: produtos lácteos, composição de alimentos, rotulagem de alimentos, análise de
alimentos, informação nutricional.
ABSTRACT
This study aimed at analyzing the centesimal composition of traditional yoghurt and drinking
yoghurts of different brands, and to evaluate the reliability of them by comparing with the
information declared on the nutrition facts labels. The included methodological procedures were
the determination of moisture, protein, total fat, carbohydrates, dietary fiber and ashes. The protein
contents were in accordance with the information declared on the labels. Concerning to lipids, all
of the traditional yoghurt samples showed analytical values higher than those declared on the
labels. Among the liquid yoghurts, four samples showed discrepancy regarding to the lipid
contents, and no nutritional information related to this macronutrient was provided in one
sample label. Accordingly to these findings, it is emphasized the importance of improving the
technological process, as the accuracy of the information declared in the nutritional label should
be guaranteed to the consumers and to the health professionals as dietitians.
Keywords: dairy products, food composition, food labelling, food analysis, nutritional information.
380
Pacheco HFB, Sígolo LMN, Ribeiro APB, Oliveira JM. Composição centesimal de iogurtes tradicionais e iogurtes líquidos: incompatibilidade
com as descrições da rotulagem. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):380-9.
INTRODUÇÃO
A produção de iogurte remonta há milhares
de anos, porém não se conhece sua origem
exata1,2. Acredita-se que sua produção tenha sido
desenvolvida por nômades no Oriente Médio que,
ao guardarem o leite à temperatura ambiente em
clima subtropical, proporcionaram a modificação
de sua estrutura, em decorrência da proliferação
de bactérias provenientes das condições primitivas
de ordenha e ausência de refrigeração2.
A partir de então, aperfeiçoaram-se os
processos de sua produção de tal forma que,
atualmente, o iogurte é considerado o leite
fermentado mais conhecido e difundido no
mundo2. Ademais, o consumo deste alimento tem
aumentado consideravelmente, em decorrência
da busca por um estilo de vida saudável3.
Segundo a Resolução nº 46 do Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA),
o iogurte é definido como leite fermentado
“...cuja fermentação se realiza com cultivos
protosimbióticos de Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus e Lactobacills bulgaricus aos quais
podem-se acompanhar, de forma complementar,
outras bactérias ácido-lácticas que, por sua
atividade contribuem para a determinação das
características do produto final”4.
A aceitação do iogurte por parte
dos consumidores depende da sua qualidade,
que é determinada especialmente por duas
características, como a consistência e a
viscosidade3. A Instrução Normativa nº 68 do
MAPA5 determina que sua consistência deve
ser líquida, pastosa ou gelificada, de cor branca ou de
acordo com as substâncias e/ou corantes alimentícios
que foram adicionados, além de apresentar odor e
sabor característicos.
Além de toda publicidade expressa na
mercadoria, a informação nutricional também
deve estar presente. Espera-se que esta seja
fidedigna à composição do produto colocado à
venda, pois o Código de Proteção e Defesa do
Consumidor6 assegura o acesso às informações
de qualidade, bem como aos indicadores de
segurança no consumo7.
Apesar do consumo de iogurte ter aumentado
no Brasil, há escassez de pesquisas que avaliam
a composição centesimal deste alimento, bem
como a veracidade das informações expressas
nos rótulos. Desta forma, o presente estudo teve
por objetivo analisar a composição centesimal
de iogurtes tradicionais e de iogurtes líquidos de
diferentes marcas e avaliar a fidedignidade destas
pela comparação com as informações declaradas
no rótulo nutricional.
MATERIAL E MÉTODOS
Para o estudo, foram selecionadas cinco
marcas para as classes tecnológicas do produto
em questão. A escolha das marcas foi baseada em
pesquisa de mercado, utilizando-se o levantamento
sobre os produtos mais comercializados no ano
de 20128.
Foram analisadas amostras de iogurtes
tradicionais sabor morango e iogurtes líquidos
com diferentes sabores. Os produtos foram
adquiridos na cidade de Limeira/SP, em setembro
de 2013, em embalagens íntegras e lacradas, sendo
improvável a contaminação externa.
Para cada marca dos produtos, foram
homogeneizadas três unidades para as diferentes
determinações analíticas. Estas amostras foram
designadas respectivamente como A, B, C, D e E,
para os iogurtes tradicionais, e da mesma forma
os iogurtes líquidos foram denominados como
amostras F, G, H, I e J.
Determinações Experimentais
O estudo da composição centesimal
incluiu a determinação dos teores de umidade,
proteínas, lipídios totais, carboidratos, fibra
alimentar total e cinzas. Com a exceção de
fibra alimentar total, as demais análises foram
realizadas em duplicata.
O teor de umidade foi investigado pela
técnica de secagem em estufa, de acordo com os
métodos oficiais da Association of Official Analytical
Chemists9 e os métodos analíticos do Instituto
Adolfo Lutz10. Os valores de proteína foram
calculados a partir dos teores de nitrogênio total,
usando-se os fatores de conversão da FAO/7311.
Determinou-se o teor de nitrogênio total pelo
método Kjeldahl, seguindo-se os procedimentos
da Association of Official Analytical Chemists9,
381
do Instituto Adolfo Lutz10 e da American Association
of Cereal Chemists12.
Os lipídios foram investigados pelo método
de extração Soxhlet, com hidrólise ácida prévia,
segundo as metodologias da Association of Official
Analytical Chemists9 e do Instituto Adolfo Lutz10.
A pesquisa do teor de cinzas foi realizada por
incineração em mufla, de acordo com Association
of Official Analytical Chemists9 e Instituto Adolfo
Lutz10.
Avaliou-se o teor de fibra alimentar total
por meio de método enzimático gravimétrico
conforme Association of Official Analytical
Chemists9 e Prosckyet et al13. Como os iogurtes
não representam fontes de fibras, esta análise
foi realizada uma única vez para as amostras.
O teor de carboidratos foi calculado pela
diferença entre 100 e a soma das porcentagens
de água, proteína, lipídeos totais, cinzas e fibras14.
A energia alimentar foi expressa em kilocalorias
(kcal) e kilojoules (kJ). No cálculo do valor
calórico de cada alimento utilizou-se o calor de
combustão e a digestibilidade, baseando-se nos
teores em proteínas, lipídios e carboidratos, de
acordo com o sistema Atwater, e utilizando-se os
coeficientes específicos15,16.
*Energia total metabolizável expressa em
kilojoule (kJ) foi calculada a partir da energia
dos nutrientes, considerando-se os fatores de
conversão de Atwater: (17 x g proteína) + (16 x g
carboidratos (total carboidratos) - fibra alimentar) +
(37 x g total lipídios) + (29 x g etanol);
*Energia
total
metabolizável
expressa
em
kilocalorias
(kcal)
foi
estabelecida
considerando-se os fatores de conversão de
Atwater: (4 x g proteína) + (4 x g carboidratos
(total carboidratos - fibra alimentar) + (9 x g total
lipídios) + (7 x g etanol).
Análise Estatística
As informações de composição centesimal
obtidas após as determinações laboratoriais
foram digitadas em um banco de dados do
programa Microsoft Excel, bem como a inserção de
fórmulas correspondentes a cada componente de
análise. A caracterização do perfil das amostras
estudadas foi realizada por análise descritiva, com o
cálculo de médias e desvios-padrão.
382
RESULTADOS
Iogurtes Tradicionais
Os resultados obtidos na análise da
composição centesimal das amostras de iogurte
tradicionais encontram-se na Tabela 1. Os teores
de umidade mostraram-se semelhantes em todas
as amostras avaliadas, situando-se entre 75,00 e
79,75 g/100 g. As amostras foram caracterizadas
por conteúdo proteico médio de 2,45 g/100 g,
com exceção da amostra B, que apresentou
teor de proteínas superior às demais amostras
avaliadas (4,11 g/100 g). O teor de lipídios
das diferentes amostras variou entre 4,83 e
6,25 g/100 g. Para as cinzas, foi verificado teor
máximo de 1,99 g/100 g para a totalidade das
amostras. No que se refere à quantidade de
carboidratos, as amostras avaliadas foram
caracterizadas por teores entre 9,55 e
15,62 g/100 g, que representam a maior variação
de um macronutriente específico entre os
produtos em análise. De modo geral, os iogurtes
não representam fontes de fibras, em consonância
com os resultados experimentais para as
amostras avaliadas, os quais se situaram entre
0,03 e 0,30 g/100 g, relativos possivelmente à
contribuição de aditivos na formulação.
Na Tabela 1 estão apresentadas a comparação
entre os resultados experimentais obtidos neste
estudo para as diferentes amostras avaliadas,
bem como as informações fornecidas nos rótulos
dos produtos, no que concerne à composição em
macronutrientes.
Quanto ao teor lipídico das amostras
avaliadas, notou-se que nos rótulos foram
declarados teores inferiores aos valores
determinados experimentalmente em quatro
produtos: A, B, D e E. Na amostra C, foi
indicada quantidade não significativa para
lipídios (inferior a 0,5 g/porção), enquanto o
valor experimental detectado foi igual a
5,40 g/100 g, e este resultado correspondeu à
maior diferença entre os valores encontrados
nos rótulos e os dados obtidos em análise
(4,9 g/100 g). Estas diferenças foram de
3,38 g/100 g, 3,02 g/100 g, 2,39 g/100 g e
3,7 g/100 g para os produtos A, B, D e E,
respectivamente.
NE
NE
NE
NE
NE
NE
75,00 +
4,95
75,00 +
3,53
79,00 +
0,00
76,75 +
0,35
79,75 +
0,35
82,00 +
0,00
82,00 +
0,00
81,75 +
0,35
79,00 +
0,00
81,00 +
0,00
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
2,58 +
0,08
2,29 +
0,05
2,67 +
0,00
2,56 +
0,40
2,40 +
0,27
2,16 +
0,09
2,49 +
0,10
2,76 +
0,06
4,11 +
0,06
2,76 +
0,14
Vobservado
2,44
2,55
2,27
2,55
2,70
2,11
2,33
2,80
3,44
2,77
Vrotulado
Proteínas1
2,44 +
0,21
3,23 +
0,24
3,97 +
0,18
1,88 +
0,38
3,35 +
0,18
6,25 +
0,04
4,83 +
0,09
5,40 +
0,22
6,13 +
0,24
5,71 +
0,60
Vobservado
NE
1,44
1,05
1,11
1,50
2,55
2,44
*
3,11
2,33
Vrotulado
Lipídeos1
2,98 +
0,02
0,24 +
0,34
2,49 +
0,00
0,49 +
0,00
2,00 +
0,70
1,99 +
0,01
1,99 +
0,01
0,00 +
0,00
1,00 +
0,00
0,73 +
0,34
Vobservado
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
Vrotulado
Cinzas1
0,24 +
0,00
0,31 +
0,00
00,0 +
0,00
0,48 +
0,00
0,09 +
0,00
0,30
0,28
0,03
0,04
0,18
Vobservado
NE
0,44
0,00
0,38
NE
**
0,00
**
**
0,00
Vrotulado
Fibras1
10,76 +
0,00
14,96 +
0,00
9,12 +
0,00
12,59 +
0,00
10,16 +
0,00
9,55 +
0,00
13,66 +
0,00
13,05 +
0,00
11,28 +
0,00
15,62 +
0,00
Vobservado
16,11
16,11
14,44
14,44
13,00
15,55
17,77
16,00
14,44
17,77
Vrotulado
Carboidratos1
74,36 +
0,00
96,83 +
0,00
82,89 +
0,00
75,60 +
0,00
80,03 +
0,00
101,89+
0,00
106,95+
0,00
111,72+
0,00
116,57+
0,00
124,19+
0,00
Vobservado
71,00
76,66
87,22
72,77
77,00
93,33
102,22
77,00
100,00
103,33
Vrotulado
Energia2
NE: Valor não estabelecido;*:Menor ou igual a 0,5 g/porção; **: Menor ou igual a 0,5 g/porção; 1: valores expressos em g/100 g; 2: valores expressos em Kcal/100 g;Vobservado: Média dos
valores obtidos experimentalmente + desvio padrão, considerando três amostras analisadas em duplicata;Vrotulado: Valor declarado na rotulagem do produto
NE
NE
NE
NE
Vrotulado
Umidade1
Vobservado
Amostras
Componentes
Tabela 1. Composição centesimal de amostras de iogurte tradicional (A a E) e de iogurte líquido (F a J), observada experimentalmente e declarada na rotulagem
383
Quanto ao conteúdo proteico, destacou-se
a amostra B em que foram detectados
valores superiores às demais amostras avaliadas.
Em referência à Tabela 1, das informações
declaradas nos rótulos das marcas de produtos
analisados, observou-se que o teor proteico
informado corrobora o valor definido nas
determinações analíticas.
Por meio de resultados experimentais,
verificou-se que a amostra E continha o menor
teor de carboidratos dentre as marcas avaliadas.
No entanto, este produto apresentou a diferença
mais significativa entre os resultados analíticos
e os valores apresentados no rótulo em relação
aos lipídios.
Na Tabela 2 estão expostos os valores
experimentais inerentes à composição centesimal
do produto analisado, bem como as informações
previamente disponíveis na literatura para fins
comparativos17-22.
Com referência à quantidade de proteínas,
as amostras D e E apresentaram o teor proteico
inferior ao valor mínimo reportado na literatura18.
Porém, considerando-se a legislação4, pode-se
afirmar que o teor de proteínas menor do que
2,90 g/100 g é aceitável para iogurtes com adição
de frutas e açúcares.
Quanto ao teor lipídico, todas as amostras
analisadas demonstraram quantidades superiores
às informadas nas referências consultadas, que
por sua vez, declararam quantidade de lipídios
entre 0,10 e 3,10 g/100 g. Em contrapartida,
os resultados experimentais apontam valores na
faixa de 4,83 e 6,25 g/100 g.
Iogurtes líquidos
Os
resultados
obtidos
na
análise
da
composição centesimal das amostras de
iogurtes líquidos estão também apresentados na
Tabela 1. Os teores de umidade mostraram-se
semelhantes em todas as amostras, situando-se
entre 79,00 e 82,00 g/100 g. Os teores de proteínas
nestas amostras apresentaram o valor médio
correspondente a 2,5 g/100 g. O teor de lipídios
variou de 1,88 g/100 g a 3,97 g/100 g, e o produto
G mostrou o menor teor quando comparado
aos demais. Quanto aos teores de cinzas, nos
produtos F, H e J foram detectados valores mais
elevados em relação aos outros iogurtes. O valor
mínimo de carboidratos obtido foi de 9,12 g/100 g,
e o valor máximo foi de 14,96 g/100 g, dados
estes que representaram a maior variação entre
todos os macronutrientes estudados. Os valores
encontrados para as fibras variaram de 0,00 g/100 g
a 0,48 g/100 g. O cálculo do valor calórico
apresentou grande variação entre as amostras.
O maior valor calórico entre os cinco iogurtes
analisados foi evidenciado no produto I e o
menor valor no produto J.
Conforme indicado na Tabela 1, efetuando-se
a comparação dos resultados experimentais
obtidos com os valores expressos nos rótulos
dos cinco iogurtes analisados, o teor de lipídios
mostrou valor elevado em quatro produtos: F, G,
Tabela 2. Composição centesimal de referenciada para iogurtes
Referência
TACO (2011)17
TBCA-USP (2008)18
Torres (2000)19
IBGE (1999)20
IBGE (2008-2009)24
Philippi (2002)21
Rensis (2008)22
USDA (2013)23
Franco (2007)25
Umidade
84,6
76,92
85,87
80
NA
NA
82,88
71,2
NA
1
Proteínas
2,7
2,54
4,29
3,5
3,46
3,1
4,81
3,00
3,5
1
Lipídeos
2,3
1,85
2,16
0,1
3,47
2,6
3,1
3,60
0,10
1
Componentes
Cinzas1
Fibras1
0,6
0,2
0,68
0
0,71
NA
0,9
0
NA
2,13
NA
NA
1,03
NA
NA
0,00
NA
NA
NA: não avaliado;1: valores expressos em g/100 g; 2: valores expressos em Kcal/100 g
384
Carboidratos1
9,7
18,01
5,26
15,5
14,62
16,81
8,18
21,60
15,50
Energia2
70,00
99,00
58,00
76,00
98,69
97,90
NA
127,00
76,00
H e I. O produto J não apresentou a informação
nutricional deste macronutriente. A maior diferença
entre os valores indicados nos rótulos e os dados
obtidos na análise foi de 2,92 g/100 g, que
foi detectada no produto H. As diferenças de
1,95 g/100 g, 0,77 g/100 g e 1,79 g/100 g foram
observadas nos produtos F, G e I, respectivamente.
Os teores de proteínas informados nos
rótulos dos iogurtes líquidos foram semelhantes
aos valores encontrados nas análises de todas as
amostras avaliadas. Entre as amostras analisadas,
os produtos H e J apresentaram as maiores diferenças
no teor de carboidratos quando os resultados
experimentais foram comparados aos dados
expressos nos respectivos rótulos.
Apenas o produto H demonstrou valor
calórico menor do que o indicado no rótulo; e o
produto I mostrou a maior diferença energética
entre o resultado obtido na amostra analisada e o
dado expresso no rótulo.
Considerando-se as faixas de valores
máximos e mínimos para cada componente, com
base nas referências17-19,23-25 e apresentados na
Tabela 2, pode-se observar que os produtos F e I
apresentaram quantidade de proteínas abaixo da
faixa estabelecida.
O produto H demonstrou valor acima
do teor máximo para lipídios, sendo o valor
experimental de 3,97 g/100 g e o de referência25
de 3,60 g/100 g. Em relação a cinzas, todos
os produtos estavam fora da faixa de valores aceitáveis
nas referências. Contudo, todos os resultados das
análises relativas ao valor calórico estavam de acordo
com as referências.
DISCUSSÃO
Os dados mais relevantes, quanto à
incongruência existente entre as informações
nutricionais descritas nos rótulos dos respectivos
produtos e a real composição dos iogurtes
detectada no presente trabalho, foram referentes
aos teores de lipídios e ao valor calórico de alguns
produtos.
Tendo em vista a Resolução nº 46 do
Ministério
da
Agricultura,
Pecuária
e
4
Abastecimento , que estabelece os padrões de
identidade e de qualidade dos leites fermentados
disponíveis para a comercialização e consumo,
o iogurte integral deve apresentar o teor lipídico
entre 3,00 e 5,90 g/100 g. Foi definido o valor
mínimo de 2,90 g/100 g para as proteínas,
todavia este teor poderá estar reduzido se os
iogurtes forem adicionados de frutas e açúcares.
No presente trabalho, os teores lipídicos
de todos os iogurtes tradicionais analisados
apresentaram valores analíticos superiores
aos expressos nos rótulos. Na amostra A,
o teor lipídico declarado no rótulo foi 40,80 %
menor do que o identificado pela análise
experimental. Outrossim, nos rótulos das
amostras B, D e E havia indicação de teores
lipídicos, respectivamente, de 50,73 %, 50,52 %
e 40,80 % inferiores aos valores determinados
experimentalmente.
O mesmo ocorreu para quatro iogurtes
líquidos
analisados.
Os
teores
lipídicos
mencionados nos rótulos dos produtos F, G, H
e I foram, respectivamente, 44,77 %, 59,04 %,
26,44 % e
44,58 % inferiores aos valores
apontados nas análises realizadas neste estudo.
Além disto, é importante destacar que, com
exceção das amostras B, F, H e I, as demais não
atenderam ao padrão estabelecido pela legislação,
pois foi informada a quantidade de lipídios inferior
a 3,00 g/100 g4.
As características sensoriais de alguns
alimentos são influenciadas, em certa medida,
pela presença de lipídios22. No entanto, sua ingestão
excessiva está associada ao desenvolvimento de
diversas doenças22,26. Desta forma, a fidedignidade
de informações presentes nos rótulos dos
alimentos é uma importante aliada no processo
de escolhas alimentares dos consumidores26.
Nos resultados experimentais obtidos
para carboidratos, foram encontrados valores
inferiores aos informados nos rótulos em todas
as amostras analisadas, porém dentro da faixa
de variabilidade preconizada pelo padrão de
identidade do produto em questão4.
Quanto
ao
valor
calórico
dos
iogurtes líquidos, os resultados experimentais
demonstraram valores superiores aos expressos
no rótulo de quatro produtos. Em um estudo
realizado com análise de diferentes marcas de
iogurte, observou-se que a adição de açúcares
385
ou outros ingredientes, que aumentam o teor
de sólidos, é determinante no valor calórico27.
Como o excesso de ingestão de energia e
açúcares está associado ao aumento de peso e
demais impactos negativos à saúde, é necessária
a instituição de medidas interventivas que
visem a redução do consumo de determinados
produtos28.
Considerando-se a já esperada variabilidade
na composição de alimentos em relação aos
macronutrientes, além da quantidade limitada
de estudos neste campo29, fez-se importante a
contextualização dos resultados obtidos neste
trabalho, comparando-os às diferentes fontes
da literatura.
Ao contrapor as informações disponíveis
na literatura para os iogurtes tradicionais17-22, os
resultados experimentais obtidos apresentaram-se
dentro das faixas de valores encontradas para
umidade, cinzas e carboidratos. Para os iogurtes
líquidos, os valores de umidade, fibra alimentar,
carboidratos e valor calórico foram concordantes
com a faixa de valores descrita em outros
estudos17-19,23-25.
As informações disponíveis na literatura
para macronutrientes foram obtidas por meio de
diferentes técnicas analíticas. Por conseguinte,
há limitações próprias que podem ter influenciado
na variabilidade de informações observadas
entre as diferentes fontes consultadas17-25.
Apesar de considerar estas limitações,
torna-se fundamental o fortalecimento da
fiscalização de produtos alimentícios por parte
da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), criada pela Lei nº 9.782/199930, para
assegurar o acesso às informações de qualidade
para o consumidor e para os profissionais de
saúde, como os nutricionistas. Os resultados do
presente estudo reforçam esta necessidade, pois
parte das informações nutricionais expressas nos
rótulos de iogurtes foram inconsistentes quando
comparadas aos dados obtidos na análise da
composição centesimal.
No estudo de Carneiro et al31, foram
observadas irregularidades em todas as amostras
avaliadas de acordo com a Resolução RDC
nº 360/200332, na qual foi estabelecida que é
tolerável, no máximo, mais de 20 % em relação
386
aos teores de nutrientes descritos nos rótulos
dos alimentos.
Nas amostras analisadas no presente
trabalho
foram
também
verificadas
as
irregularidades nos teores de lipídios e nos
valores calóricos conforme a definição 3.5.1
da Resolução RDC nº 360/200332. Com exceção
dos produtos C e J, os demais apresentaram
valores acima da tolerância máxima de 20%
para lipídios e o mesmo foi observado para os
produtos A, C e I em relação à energia.
Conforme as observações feitas por
Ishimoto e Nacif33, a segurança dos alimentos
está associada de forma direta com a
confiabilidade nas informações declaradas,
pois estas servem de subsídio para nortear
o consumidor no processo de aquisição dos
alimentos. Ademais, em consonância com a
Lei 11.346/200634, que consiste na “realização do
direito de todos ao acesso regular e permanente
a alimentos de qualidade...”, abrangendo também
“a garantia da qualidade biológica, sanitária,
nutricional e tecnológica dos alimentos...”7, a
confiabilidade torna-se imprescindível na construção
da Segurança Alimentar e Nutricional.
CONCLUSÃO
O estudo sobre a composição centesimal
mostrou que o teor de proteínas encontrava-se
em concordância com as informações expressas
nos rótulos de ambas as classes tecnológicas de
iogurtes. Quanto ao conteúdo de carboidratos,
foram também identificados valores inferiores
aos dos rótulos, porém dentro da faixa de
variabilidade preconizada.
No entanto, verificou-se grande divergência
no teor de lipídios nas amostras de iogurtes.
Além disto, de forma geral, os teores de lipídios
informados nos rótulos não atenderam ao padrão
estabelecido pela legislação vigente.
Estes dados reforçam a importância
do cumprimento de medidas de controle mais
efetivas por parte de órgãos fiscalizadores, bem
como a definição de critérios de fiscalização
que façam uso das diretrizes, normas e regras
presentes nas legislações de alimentos. Assim,
os produtos disponíveis no mercado poderão
apresentar informações condizentes com sua
composição, e os rótulos podem auxiliar no
processo de escolhas alimentares mais saudáveis
por parte da população.
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direito humano à alimentação adequada e dá outras
providências. Diário Oficial [da] República Federativa
do Brasil. Brasília, DF, 18 set. 2006. p 1.
389
Composição proximal e mineral de biscoitos tipo
amanteigado enriquecidos com diferentes farinhas de
casca de frutas
Proximal and mineral composition of buttery biscuits
enriched with different fruits peel flours
RIALA6/1673
Myrian Dayane Santana NOVAES , Adriana Paiva de OLIVEIRA *, Thais HERNANDES2,
Erika Cristina RODRIGUES1, Keyla dos Santos SIGARINI1, Francisca Graciele Gomes PEDRO1,
Ricardo Dalla VILLA3
1
1
*Endereço para correspondência: 1 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso,
Campus Cuiabá - Bela Vista. Avenida Juliano da Costa Marques s/n, Bairro Bela Vista, Cuiabá, MT,
Brasil, CEP: 78050-560. Tel: 65 3318-5122. E-mail: [email protected]
2
Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Cuiabá
Departamento de Química, Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Cuiabá
3
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo determinar a composição proximal e mineral de biscoitos tipo
amanteigado enriquecidos com farinha da casca de banana nanica (Musa paradisiaca), de manga
Tommy Atkins (Mangifera indica L.) e de mamão formosa (Carica papaya L.). Os biscoitos foram
elaborados utilizando-se diferentes níveis de substituição da farinha de trigo pelas farinhas das cascas
de frutas. A composição proximal foi obtida por meio de determinação dos teores de cinzas, umidade,
proteínas, lipídeos, fibras alimentares, carboidratos digeríveis e valor energético total. A composição
mineral foi determinada pela decomposição por via seca das amostras, e a quantificação foi feita por
espectrometria de absorção atômica em chama. Os resultados da composição proximal apresentaram
diferenças significativas (p ≤ 0,05) entre os biscoitos enriquecidos e a amostra de referência, exceto para
o teor de umidade. Os biscoitos enriquecidos apresentaram teores de cinzas acima do biscoito referência,
indicando um ganho em relação ao teor de minerais, o que foi comprovado para Fe, K, Cu e Ca.
Os biscoitos amanteigados elaborados neste trabalho podem ser uma alternativa simples, sustentável
e de baixo custo para o uso de resíduos de frutas na fabricação caseira de produtos alimentícios com
ganho nutricional principalmente de conteúdo mineral.
Palavras-chave. fruta, casca, aproveitamento, bolacha.
ABSTRACT
This study aimed at determining the proximal and the mineral composition of buttery biscuits enriched
with flours made from nanica banana (Musa paradisiaca), Tommy Atkins mango (Mangifera indica L.)
and papaya (Carica papaya L.) peels. The biscuits were prepared by proportional substitution of the
wheat flour and replacing with the respective quantity of fruits peel flours. The proximal composition was
analyzed by determining ash, moisture, protein, total fat, dietary fiber, digestible carbohydrates contents,
and the energetic value. The mineral composition was determined by means of dry decomposition of
samples and their quantification was performed by flame absorption atomic spectrometry. The proximate
composition results showed significant differences (p ≤ 0.05) between the fortified biscuits and the
reference sample except for the moisture contents. All of the enriched biscuits showed higher ash contents
than the reference biscuit, which indicate a gain regarding the mineral contents, and mainly in Fe, K,
Cu and Ca elements. The biscuits produced in this study might be a simple, sustainable and inexpensive
alternative by using fruits waste for producing home-made food products with nutritional gain, mainly
in the mineral contents.
Keywords. fruit, peel, harnessing, cookie.
390
Novaes MDS, Oliveira AP, Hernandes T, Rodrigues EC, Sigarini KS, Pedro FGG, et al. Composição proximal e mineral de biscoitos tipo
amanteigado enriquecidos com diferentes farinhas de casca de frutas. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):390-8.
INTRODUÇÃO
O desperdício de alimentos é um problema
mundial, e estima-se que aproximadamente um
quarto da produção anual de alimentos para o
consumo humano seja perdido ou desperdiçado,
o equivalente a cerca de 1,3 bilhões de toneladas
de alimentos. A Organização Mundial das Nações
Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO)
estima que estes alimentos seriam suficientes
para alimentar dois bilhões de pessoas1.
Anualmente, a América Latina e Caribe
perdem ou desperdiçam aproximadamente
15 % de seus alimentos disponíveis, o que
impacta a sustentabilidade dos sistemas
alimentares, reduz a disponibilidade local e
mundial de comida, gera menor renda para
os produtores e aumentam os preços para os
consumidores. Entre as perdas e desperdícios
que ocorrem ao longo da cadeia produtiva
nestas duas regiões, 28 % se dão no âmbito
do consumidor; 28 % da produção; 17 % no
mercado e distribuição; 22 % durante o manuseio
e armazenamento e o 6 % restantes na etapa de
processamento1.
No Brasil, o desperdício de alimentos
é elevado, aproximadamente 26 milhões de
toneladas anuais, uma quantidade que poderia
alimentar aproximadamente 35 milhões de
pessoas. O desconhecimento dos princípios
nutritivos do alimento pela população, bem
como o seu não aproveitamento, contribui para
esse desperdício de toneladas de recursos
alimentares2.
Os resíduos provenientes das frutas,
como cascas, sementes e mesocarpos, podem
contribuir como fonte alternativa de nutrientes
e serem utilizados como ingrediente substancial
de produtos alimentícios já existentes ou para
desenvolvimento de novos produtos3.
A banana (Musa spp.) é originária do
continente Asiático, todavia, atualmente é
produzida na maioria dos países tropicais e, o
Brasil é o quinto produtor mundial da fruta.
Essa fruta é um componente constante na dieta
dos brasileiros, principalmente os de baixa
renda, devido às suas características sensoriais e
alto valor nutritivo. Um único fruto de banana
pode suprir cerca de 30 % da ingestão diária
recomendada de ácido ascórbico, além de
fornecer quantidades significativas de vitaminas
A e B, K e outros minerais4,5.
A manga (Mangifera indica L.) pertence
à família Anacardiaceae e representa uma das
frutas tropicais de maior expressão econômica
mundial, sendo o Brasil o sétimo produtor
mundial3,6,7. Marques et al8 avaliaram a composição
centesimal e mineral da casca e da polpa da manga
variedade Tommy Atkins e observaram que o teor
de fibra alimentar da casca da fruta era superior
ao da polpa, considerada como rica nesse tipo
de nutriente. Além disso, o conteúdo proteico e o
teor de amido da casca foram maiores do que na
polpa, assim como a concentração dos minerais
Mg, P , Na, K e Ca.
O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma
das principais fruteiras das regiões tropicais
e subtropicais do mundo, sendo seu fruto
bastante consumido in natura ou industrializado.
O mamão destaca-se por seu elevado valor
nutricional, sendo rico em açúcares e compostos
bioativos, como os carotenóides e a vitamina C.
O Brasil é o segundo maior produtor
mundial, sendo excelentes as condições de
desenvolvimento da cultura do mamoeiro no
país, pois há possibilidade de cultivo e de
produção em todas as regiões, o ano inteiro9.
Os biscoitos são alimentos de consumo
rápido,
consumidos
principalmente
por
crianças. Neste contexto, o enriquecimento
deste tipo de alimento com farinhas de cascas
de frutas pode ser uma alternativa para a prática
de aproveitamento de resíduos de frutas e,
além disso, melhorar o valor nutricional de
um alimento consumido por uma parcela
importante
da
população,
desenvolvendo
assim, um alimento com características mais
saudáveis.
Neste contexto, o objetivo deste trabalho
foi determinar a composição proximal e mineral
de biscoitos do tipo amanteigado elaborados de
forma caseira e enriquecidos com farinha da casca
de banana nanica (Musa paradisiaca), manga
(Mangifera indica L.) variedade Tommy Atkins
e mamão (Carica papaya L.) variedade formosa,
maduros.
391
MATERIAL E MÉTODOS
As bananas nanicas (Musa paradisiaca),
mangas (Mangifera indica L.) da variedade
Tommy Atkins e mamões (Carica papaya
L.) da variedade formosa foram adquiridos
em supermercado de Cuiabá, Mato Grosso.
As frutas foram lavadas em água corrente para
retirada das sujidades, imersas em solução de
hipoclorito de sódio 5 % (v:v) por cerca de cinco
minutos e, em seguida lavadas, novamente em água
corrente. Posteriormente, as cascas foram retiradas
manualmente com auxílio de descascador
previamente higienizado.
As cascas foram acomodadas em assadeiras
e secas em forno convencional a 120-140 oC por
cerca de 30 minutos, com posterior trituração em
liquidificador, peneiramento e armazenamento
em local seco e arejado em recipientes plásticos
descontaminados.
Os ingredientes utilizados para o preparo
dos biscoitos do tipo amanteigado enriquecidos
com as farinhas das cascas de frutas e o biscoito
referência (apenas com farinha de trigo),
bem como, suas respectivas quantidades estão
descritos na Tabela 1.
A massa dos biscoitos foi processada
manualmente da seguinte forma: formou-se
um creme homogêneo com margarina e ovos.
Em seguida, foram misturados os ingredientes
Tabela 1. Ingredientes e quantidades utilizadas na elaboração
dos biscoitos amanteigados referência e enriquecidos com
farinhas da casca de banana, manga e mamão
Ingredientes
Manteiga (g)
Açúcar Refinado (g)
Ovo (unidade)
Farinha de trigo comercial (g)
FCB1(g)
FCM2 (g)
FCMA3(g)
Tipo de formulação
R
A
B
C
48,0
40,0
1,0
75,00
-
48,0
40,0
1,0
71,25
3,75
-
48,0
40,0
1,0
71,25
3,75
-
48,0
40,0
1,0
67,50
7,50
Farinha da casca de banana; 2Farinha da casca de manga; 3Farinha da
casca de mamão ; R= biscoito referência; A= biscoito com 5 % de farinha
de casca de banana; B= biscoito com 5 % de farinha de casca de manga;
C= biscoito com 10 % de farinha de casca de mamão
1
392
secos e a massa foi sovada até a obtenção de uma
massa contínua. Posteriormente, a mesma foi
moldada e os biscoitos foram assados a 140 oC por
20 minutos em forno convencional. Estes
foram resfriados à temperatura ambiente e
acondicionados em sacos de polipropileno
e em vidros hermeticamente fechados para
posterior análise da composição proximal e
mineral.
Antes das análises, dez unidades de
cada tipo de biscoito foram escolhidas
aleatoriamente e trituradas em liquidificador
doméstico por aproximadamente um minuto. Em seguida, as amostras trituradas foram
quarteadas, reduzidas a amostras laboratoriais
e armazenadas em recipientes de plástico
previamente descontaminados e mantidos em
local arejado e seco.
O teor de cinzas foi determinado por
meio do resíduo de incineração obtido por
aquecimento em forno mufla (Marca Fornitec®)
em temperatura de 550 oC (Método Oficial
no 923.0310), e a umidade pelo método gravimétrico
por meio da secagem em estufa (Marca FANEM®
520 Modelo A-HT) a 100 oC à pressão
atmosférica (Método Oficial no 925.0910).
O teor de proteínas foi determinado por meio do
método de Kjeldahl (Marca TECNAL® modelo
TE-0363, Método Oficial no 950.3610).
A porcentagem de fibras solúveis e
insolúveis foi feita pelo método gravimétrico
enzimático (Método Oficial no 991.4310) e o teor
de lipídeos foi feito pelo método gravimétrico
com extração em Soxhlet (Marca MARCONI®
Modelo MA044/8/50, Método Oficial no 920.39 C10).
Todas as determinações foram feitas em
triplicata, segundo as recomendações da Official
Association of Analytical Chemists (AOAC)10.
O teor de carboidratos digeríveis foi obtido
por diferença [Carboidratos digeríveis = 100 –
(proteínas + cinzas + umidade + lipídeos + fibras
alimentares)] segundo Lacerda et al11, e, o valor
energético total (VET) estimado pelos fatores de
conversão de Atwater [VET = (proteínas x 4) +
(cinzas x 4) + (gordura x 9)]12.
A fim de verificar a existência de diferenças
significativas entre os resultados médios
obtidos na composição proximal foi feito o teste
de Tukey (p = 0,05) utilizando o programa
ASSISTAT® versão beta 7.713.
O preparo das amostras para a
determinação da composição mineral foi feito
por meio da decomposição por via seca que
consistiu inicialmente da secagem das amostras
laboratoriais em estufa numa temperatura de
110 oC por 2 horas. Em seguida, as amostras
foram trituradas por meio de almofariz e pistilo.
Posteriormente, 2,5 g de amostra foram pesadas
em cadinhos de porcelana pré-tratados e,
as amostras foram calcinadas em forno mufla o
qual a temperatura foi elevada gradativamente
a cada 30 minutos em 100 °C até a temperatura
de 550 oC, permanecendo assim por
aproximadamente 8 horas. As cinzas foram
transferidas para dessecador e esfriadas até
temperatura ambiente. Após isso, as amostras
calcinadas passaram por filtração e diluição
em solução de 1:1 (v:v) de ácido nítrico,
e transferidas quantitativamente para balão
volumétrico de 25 mL, que teve o volume
completado com água deionizada até a marca
de aferição14.
A quantificação dos minerais foi feita
em um espectrômetro de absorção atômica em
chama marca Varian® modelo SpectrAA 220
e lâmpada de catodo oco marca Varian®.
As leituras foram feitas de acordo com as
recomendações do fabricante e taxa de
aspiração das soluções de trabalho e amostras
foram ajustadas em 2,00 mL.min-1.
Para a determinação dos parâmetros
instrumentais e da concentração dos minerais
nas amostras de biscoitos foram construídas
curvas analíticas, pelo método de padronização
externa, com as seguintes faixas de concentração:
0,0 - 100 mg.L-1 de Na; 0,0 - 6,0 mg.L-1 de K;
0,0 - 10,0 mg.L-1 de Fe; 0,0 - 5,0 mg.L-1 de Cu;
0,0 - 3,0 mg.L-1 de Zn; 0,0 - 0,5 mg.L-1 de Mn.
A fim de verificar a existência de diferenças
significativas entre os resultados médios obtidos
na composição mineral foi feito o teste de Tukey
(p = 0,05) utilizando o programa ASSISTAT®
versão beta 7.713.
Os resultados da composição proximal
do biscoito referência e dos enriquecidos com
farinhas da casca de banana, manga e mamão são
apresentados na Tabela 2.
Os resultados demonstraram que não houve
diferença significativa (p > 0,05) entre os teores de
umidade nos quatro tipos de biscoitos preparados
e todas as formulações apresentaram teor de
umidade em conformidade com a Resolução
nº 12 de 1978 da ANVISA15 onde o percentual
máximo permitido é de 14 %. A umidade é um
dos fatores mais importantes que afetam os
alimentos, pois tem efeito direto na manutenção
da qualidade. O baixo teor de umidade contribui
Tabela 2. Composição proximal dos biscoitos do tipo amanteigado (valor médio ± desvio padrão)
Parâmetros
Umidade (%)
Cinzas (%)
Proteínas (%)
Lipídeos (%)
Fibra Alimentar Insolúvel (%)
Fibra Alimentar Solúvel (%)
Carboidratos totais (%)
Valor energético total (kcal/100 g)
Tipo de biscoito
R
11,17 a ± 0,53
0,67 b ± 0,01
7,31 a ± 0,13
19,56 c ± 0,07
3,74 a ± 0,05
3,13 c ± 0,07
54,42
422,96
A
11,37 a ± 0,68
0,80 a ± 0,04
6,98 bc ± 0,16
21,40 b ± 0,06
2,61 b ± 0,05
3,25 c ± 0,05
53,59
434,88
B
10,36 ± 0,35
0,74 ab ± 0,05
7,20 ab ± 0,10
22,41 a ± 0,38
1,92 c ± 0,07
5,19 a ± 0,07
52,19
439,25
a
C
11,00 ± 0,77
0,81 a ± 0,02
6,75 c ± 0,07
21,14 b ± 0,05
1,69 c ± 0,06
3,55 b ± 0,05
55,07
437,54
a
R= biscoito referência; A= biscoito com 5 % de farinha de casca de banana; B= biscoito com 5 % de farinha de casca de manga; C= biscoito com
10 % de farinha de casca de mamão; Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa entre os resultados, para Teste de
Tukey ao nível de 5 % de probabilidade
393
para uma maior conservação do produto,
aumentando o tempo de vida útil, uma vez que
reduz a água disponível para a proliferação dos
microrganismos e para as reações químicas16.
Os teores de cinzas para todas as formulações
estão de acordo com a Resolução nº12 de 1978
da ANVISA15, onde o valor máximo permitido é de
3 %. Os biscoitos enriquecidos não apresentaram
diferenças significativas (p > 0,05) em relação aos
teores de cinzas. Os biscoitos enriquecidos com
farinha de casca de banana e mamão apresentaram
os maiores teores de cinzas e, apresentaram
diferenças significativas em relação à referência
(p ≤ 0,05), sugerindo um maior conteúdo mineral
devido à adição das farinhas das cascas das
frutas. Fasolin et al17 observaram o mesmo
comportamento em biscoitos do tipo cookies
enriquecidos com farinha de banana verde.
Para as proteínas, os biscoitos enriquecidos
com as farinhas da casca de banana e mamão
apresentaram teores significativamente (p ≤ 0,05)
inferiores ao do biscoito padrão. Segundo a
Tabela Brasileira de Composição de Alimentos
(TACO)18, para biscoito doce de maisena, o
que mais se aproxima ao deste trabalho, o teor
médio de proteínas descrito é de 8,1 g/100 g
de parte comestível. Sendo assim, os valores
obtidos neste estudo estão próximos ao teor
proteico médio descrito pela TACO. Fasolin
et al17 encontraram em biscoitos tipo cookies
enriquecidos com farinha de banana verde um
teor médio de proteínas de 7,17 %, valor
próximo aos quantificados para os biscoitos tipo
amanteigado enriquecidos com as farinhas da
casca de frutas avaliados neste trabalho.
Os teores de fibras alimentares insolúveis
quantificados nos biscoitos enriquecidos foram
inferiores ao biscoito padrão. Este fato pode ser
atribuído a substituição da farinha de trigo, rica
em fibras insolúveis, pelas farinhas das cascas de
frutas que contém maior quantidade de fibras
solúveis19.
No caso das fibras solúveis, os biscoitos
enriquecidos com farinha da casca de manga e
mamão apresentaram teores significativamente
(p ≤ 0,05) superiores ao biscoito padrão, o que
pode estar associado à quantidade destas fibras
presentes nas cascas das frutas adicionadas na
394
elaboração dos biscoitos. Stock et al20 verificaram
que a manga e o mamão apresentam maiores
teores de fibra bruta na casca (4,16 e 2,09 %) do
que na polpa (1,60 e 1,00 %). Já na banana, o teor
de fibra bruta é maior na polpa (2,00 %) do que
na casca (1,00 %). As fibras solúveis tem muitos
efeitos benéficos a saúde humana, podendo
contribuir de forma significativa na prevenção
de doenças, como, na diminuição de níveis de
colesterol e triglicérides e redução de doenças
coronárias19.
Para o teor de lipídeos, os biscoitos
adicionados de farinha de casca de frutas
apresentaram teores significativamente (p ≤ 0,05)
superiores ao biscoito padrão.
Em relação aos teores de carboidratos, todos
os biscoitos apresentaram teores inferiores ao teor
médio descrito pela TACO18 para biscoito doce de
maisena (75,2 %).
A Tabela 3 apresenta o perfil mineral
dos biscoitos amanteigados referência e dos
enriquecidos com as farinhas das cascas de
banana, manga e mamão.
Os resultados obtidos indicam que
não há diferença significativa entre os teores
médios de Zn, Mn, Mg e Na encontrados nos
biscoitos enriquecidos e no de referência. Para o
Fe o biscoito com farinha de casca de banana
obteve ganho significativo se comparado com
as outras amostras. O biscoito enriquecido
com farinha de casca de mamão apresentou os
maiores teores de Cu e K. Já para o mineral Ca,
os biscoitos enriquecidos com as farinhas das
cascas de banana e manga apresentaram maior
concentração deste mineral do que o biscoito de
referência.
Segundo a TACO18, a composição mineral
média descrita para biscoito doce de maisena
é de 54, 7,0, 0,78, 1,8, 352, 142, 0,17, 1,0 mg de
Ca, Mg, Mn, Fe, Na, K, Cu e Zn/100 g de parte
comestível, respectivamente. Alguns minerais
analisados nos biscoitos enriquecidos com as
farinhas de cascas de frutas possuem teores
próximos aos valores sugeridos para este biscoito,
como Zn e K. Já o Ca, Mg, Fe, Cu e Mn
apresentaram valores inferiores ao sugerido para
o biscoito tipo maisena. Estes resultados podem
estar relacionados aos diferentes ingredientes
Tabela 3. Composição mineral em mg.100 g-1 (valor médio ± desvio padrão) presentes nos biscoitos do tipo amanteigado
avaliados neste trabalho
Minerais
Tipo de biscoito
R
A
Ferro
0,68b ± 0,01
Zinco
0,55a ± 0,02
Manganês
C
0,72b ± 0,01
0,71b ± 0,01
0,56a ± 0,02
0,62a ± 0,03
0,60a ± 0,07
0,29a ± 0,03
0,33a ± 0,01
0,32a ± 0,01
0,32a ± 0,02
Cobre
0,07b ± 0,00
0,06c ± 0,00
0,08b ± 0,00
0,09a ± 0,00
Magnésio
16,61 ± 0,09
16,77 ± 1,44
18,11 ± 6,19
16,54a ± 0,25
Potássio
95,16b ± 8,49
135,99a ± 0,23
105,38b ± 9,56
152,93a ± 3,13
Cálcio
34,55c ± 1,70
43,90a ± 1,03
43,00ab ± 3,27
35,68bc ± 0,41
Sódio
174,36a ± 7,76
179,61a ± 0,96
172,88a ± 15,72
178,38a ± 1,73
a
0,92a ± 0,05
B
a
a
R= biscoito referência; A= biscoito com 5 % de farinha de casca de banana; B= biscoito com 5 % de farinha de casca de manga; C= biscoito
com 10 % de farinha de casca de mamão; Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa entre os resultados, para
Teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade
utilizados na elaboração dos dois tipos de
biscoitos e ao enriquecimento mineral,
principalmente de Ca e Fe, de alguns biscoitos
industrializados.
Para o Na, os valores encontrados nos
biscoitos enriquecidos estão abaixo do valor
médio apresentado para o biscoito tipo maisena.
Recentemente, o Ministério da Saúde e a
Associação Brasileira dos Produtores de
Alimentos Processados assinaram um documento
para garantir a redução gradual de sódio em
alimentos de aproximadamente 40 %21.
Neste contexto, produtos alimentícios fontes
de minerais e com baixo teor de sódio, como
os biscoitos enriquecidos desenvolvidos neste
trabalho, podem ser uma opção para pessoas
que precisam aumentar a ingestão de minerais,
sem o consumo excessivo de sódio.
A Food Drug and Administration (FDA)
recomenda uma ingestão diária (RDA) para
crianças entre quatro a oito anos (os maiores
consumidores de biscoitos) de: 1000 mg de Ca,
440 µg de Cu, 10 mg de Fe, 130 mg de Mg,
1,5 mg de Mn, 5 mg de Zn, 3,8 g de K e 1,2 g
de Na 22. A Resolução RDC nº 269 da ANVISA,
de 22 de setembro de 2005, que dispõe sobre
o regulamento técnico sobre a ingestão diária
recomendada (IDR) de proteína, vitaminas e
minerais indica uma ingestão diária para crianças
de quatro a seis anos de 600 mg de Ca, 6 mg
de Fe, 73 mg de Mg, 5,1 mg de Zn, 440 µg de Cu,
1,5 mg de Mn23.
A Tabela 4 mostra a porcentagem em
relação à ingestão diária recomendada pelo
FDA e ANVISA de minerais para crianças
presentes em 100 g de biscoitos amanteigados
enriquecidos com as farinhas das cascas de
banana, manga e mamão e no biscoito referência.
A Resolução RDC nº 54/2012, da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária24, define
“alimento fonte de vitaminas e minerais” como
“aquele com no mínimo 15 % da Ingestão Diária
Recomendada (IDR) de referência por 100 gramas
do alimento” e “alimento com alto conteúdo em
minerais e vitaminas” como “aquele que contém no
mínimo 30 % da IDR de referência por 100 gramas
do alimento”. Sendo assim, observa-se que para
crianças de 4 a 6 anos, os biscoitos amanteigados
enriquecidos com farinha da casca de banana
podem ser considerados fontes de Fe, Mg e Mn.
Já os biscoitos amanteigados enriquecidos com
farinha da casca de manga e de mamão podem
ser considerados fontes de Cu, Mg e Mn.
Neste contexto, os resultados obtidos
sugerem que o consumo diário de biscoitos
enriquecidos com farinhas das cascas de frutas
elaborados de forma caseira pode contribuir para
que os valores de ingestão diária recomendada
395
Tabela 4. Porcentagem da ingestão diária de minerais recomendadas pela ANVISA e FDA para crianças presentes em 100 g dos
biscoitos amanteigados referência e dos enriquecidos com farinha de casca de frutas
Porcentagem* (%) em relação à ingestão diária recomendada
ANVISA **
Minerais
FDA***
R
A
B
C
R
A
B
C
Na
-
-
-
-
14,53
14,97
14,41
14,86
K
-
-
-
-
2,50
3,58
2,77
4,02
Ca
5,76
7,32
7,17
5,95
3,45
4,39
4,30
3,57
Cu
15,90
13,64
18,18
20,45
15,90
13.64
18,18
20,45
Fe
11,33
15,33
12,00
11,83
6,80
9,20
7,20
7,10
Mg
22,75
22,97
24,81
22,66
12,78
12,90
13,93
12,72
Mn
19,33
22,00
21,33
21,33
19,33
22,00
21,33
21,33
Zn
10,78
10,98
12,16
11,76
11,00
11,20
12,40
12,00
R= biscoito referência; A= biscoito com 5 % de farinha de casca de banana; B= biscoito com 5 % de farinha de casca de manga; C= biscoito
com 10 % de farinha de casca de mamão;*Porcentagem calculada em relação ao valor médio obtido na Tabela 3; **Recomendações para
crianças de 4 a 6 anos, referência20; **Recomendações para criança de 4 a 8 anos, referência21
de minerais biodisponíveis ao organismo sejam
atingidos.
No que se refere aos hábitos alimentares,
à baixa ingestão de minerais é uma constante em
nossa população em função, por exemplo, do
baixo consumo de vegetais frescos, frutas,
entre outros na dieta alimentar. Neste
sentido, o desenvolvimento de novos produtos
alimentícios que possuam minerais em
sua composição natural, sem a necessidade da
agregação destes nutrientes em sua produção
de forma artificial, como é feito na maioria
dos biscoitos comercializados, é de suma
importância para a elaboração de alimentos
mais saudáveis que atinjam todas as faixas etárias
da população, em especial as crianças.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos na composição
proximal demonstraram que os teores de
umidade e de proteínas não apresentaram
diferenças significativas entre os biscoitos
avaliados. A porcentagem de fibras alimentares
solúveis nos biscoitos amanteigados enriquecidos
com farinha da casca de manga e de mamão
foram maiores do que a referência. Os teores
396
de lipídeos e o VET em todos os biscoitos
enriquecidos foram maiores do que no biscoito
referência, que pode ser atribuída a adição
das farinhas das cascas de frutas. Todos os
biscoitos enriquecidos apresentaram uma maior
porcentagem de cinzas quando comparados
ao biscoito referência, indicando um maior
conteúdo mineral.
A composição mineral indicou que o
biscoito enriquecido com farinha da casca de
banana apresentou uma maior concentração
de Fe e Ca em relação aos demais biscoitos
avaliados. Já o biscoito enriquecido com farinha
de casca de mamão apresentou maior teor de
Cu e K. Todos os biscoitos enriquecidos
apresentaram teor de sódio menor do que os
valores médios apresentados pela TACO
para biscoito tipo maisena utilizado para
comparação.
Neste
contexto,
os
biscoitos
tipo
amanteigados enriquecidos com farinhas das
cascas de banana nanica, manga Tommy Atkins
e mamão formosa podem ser uma alternativa
simples, sustentável e de baixo custo para o uso
de resíduos de frutas na fabricação caseira de
produtos alimentícios com ganho nutricional
principalmente em termos de conteúdo mineral.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao IFMT – Campus Cuiabá
- Bela Vista pela disponibilização dos laboratórios.
Ao Laboratório de Análises de Contaminantes
Inorgânicos (LACI) do Departamento de Química
da UFMT pelo uso dos equipamentos e reagentes
na determinação de cinzas, umidade e minerais. A
Faculdade de Nutrição (FANUT) da UFMT pela
disponibilização dos equipamentos e reagentes para
a determinação de fibras alimentares e lipídeos.
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for Industry: A Food Labeling Guide (14. Appendix F:
Calculate the Percent Daily Value for the Appropriate
Nutrients), 2013. [acesso 2014 Dez 16] Disponível
em: [http://www.fda.gov/food/guidanceregulation/
guidancedocumentsregulator yinformation/
labelingnutrition/ucm064928.htm].
23. Brasil. Ministério da Saúde. Agência de Vigilância
Sanitária. Resolução RDC nº 269, de 22 de setembro
de 2005. Regulamento técnico sobre a ingestão
diária de proteínas, vitaminas e minerais. Diário
Oficial [da] União, Brasília, DF, 23 de set. 2005.
[Acesso 2015 Fev 10] Disponível em: [ http://
portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/1884970
047457811857dd53fbc4c6735/RDC_269_2005.
pdf?MOD=AJPERES].
24. Brasil. Ministério da Saúde. Agência de Vigilância
Sanitária. Resolução RDC nº 54, de 12 de novembro
de 2012. Regulamento técnico sobre informação
nutricional complementar. Diário Oficial [da]
União, Brasília, DF, 12 de dez. 2012. [Acesso 2015
28 Set] Disponível em: [http://bvsms.saude.gov.br/
bvs/saudelegis/anvisa/2012/rdc0054_12_11_2012.
html].
Ocorrência de Escherichia coli e Staphylococcus aureus
resistentes a antimicrobianos e parasitos Entamoeba coli
e Ascaris lumbricoides em merendas escolares
Occurrence
of
antibiotic-resistant
Escherichia
coli
and Staphylococcus aureus and of Entamoeba coli and
Ascaris lumbricoides parasites in the school snacks
RIALA6/1674
Daiane Bertholin ANSELMO1*, Catierine Hirsh WERLE2, Fernando Leite HOFFMANN1(In Memorian)
*Endereço para correspondência: 1Laboratório de Microbiologia de Alimentos, Departamento
de Engenharia e Ciência de Alimentos, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Rua Cristóvão Colombo nº 2265,
Jardim Nazareth, São José do Rio Preto/SP, CEP: 15054-000. Tel: 17 3221-2200.
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Departamento de Genética Evolução e Bioagentes,
Universidade Estadual de Campinas
2
RESUMO
Vários surtos de doenças de origem alimentar têm sido relatados nas escolas, e que chegam a matar
milhões de crianças a cada ano em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi de avaliar o nível
de contaminação microbiológica e parasitológica de refeições escolares. Foram avaliadas 102
amostras de diferentes tipos de alimentos, em que foram analisados: coliformes totais, termotolerantes,
Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus coagulase positiva (CP), Bacillus cereus e clostrídios
sulfito redutores. Foram encontradas contagens > 1.100 NMP de coliformes totais e < 3 a 240 NMP de
termotolerantes. Quatro amostras apresentaram E. coli e Staphylococcus (CP) foi isolado em duas em nível
acima do permitido. No teste de sensibilidade a antimicrobianos, as cepas de E. coli e de Staphylococcus
(CP) detectadas neste estudo demonstraram resistência, respectivamente, a ampicilina e penicilina.
Na análise parasitológica dos alimentos crus foram pesquisados: Entamoeba coli, Entamoeba histolytica,
Giardia duodenalis e Ascaris lumbricoides. Entamoeba coli e Ascaris lumbricoides foram detectados na
salada. A merenda escolar oferece riscos à saúde das crianças, o que indica a necessidade de melhoria nas
condições de seu preparo e de implantação das Boas Práticas nas instituições de ensino.
Palavras-chave. higiene alimentar, alimentação escolar, segurança alimentar, doenças veiculadas por
alimentos.
ABSTRACT
Several outbreaks of food-borne diseases have been reported in schools, and these have been
responsible for causing death of millions children per year worldwide. The objective of this study
was to evaluate the rate of microbiological and parasitological contamination of school meals. This
study evaluated 102 samples of different types of food by analyzing total coliforms, thermotolerant,
Escherichia coli, Salmonella spp., coagulase-positive Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and sulfitereducing clostridia. Total coliforms counts were > 1,100 MPN, and of < 3 a 240 MPN for thermotolerant.
E. coli was isolated from four samples, and S. aureus was detected in two samples in a rate higher than
the permitted one. By means of antimicrobial susceptibility testing, E. coli and S. aureus strains showed
to be resistant to ampicillin and penicillin, respectively. In the parasitological analysis in raw foods,
the following parasites were investigated: Entamoeba coli, Entamoeba hystolitica, Giardia duodenalis
and Ascaris lumbricoides. Entamoeba coli and Ascaris lumbricoides were found in salad. The school
meals offer risks to the children health; therefore, it has to improve the conditions of their preparation
and to implement the Good Practices in the educational institutions.
Keywords. food hygiene, school meals, food security, food-borne diseases.
399
Anselmo DB, Werle CH, Hoffmann FL. Ocorrência de Escherichia coli e Staphylococcus aureus resistentes a antimicrobianos e parasitos
Entamoeba coli e Ascaris lumbricoides em merendas escolares. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):399-409.
INTRODUÇÃO
As Doenças Veiculadas por Alimentos
(DVA) abrangem uma ampla variedade de
doenças que se manifestam após a ingestão de
alimentos contaminados, onde a verdadeira
extensão do seu impacto na saúde global é
imensa, mas ainda é desconhecida por muitos1.
Os alimentos fornecidos para a alimentação
escolar, consumidos diariamente pelos alunos,
são essenciais para a preservação da saúde, desde
que apresentem condições de higiene satisfatórias.
Seu controle inadequado é responsável pela
ocorrência de surtos de doenças, provocadas
principalmente pela ingestão de micro-organismos
ou de suas toxinas, causando infecções ou
intoxicações2.
De acordo com o Ministério da Saúde,
de 2000 a 2014 foram notificados 9.719 surtos
de DVA pela Secretaria de Vigilância em Saúde
(SVS), afetando 1.948.144 pessoas, resultando em
192.803 doentes e mais de 112 óbitos no Brasil;
sendo os micro-organismos mais ocorrentes
Salmonella spp., Staphylococcus aureus e
Escherichia coli. As informações ignoradas sobre
o agente etiológico são de 52,3 %. Segundo a SVS,
as creches/escolas ocupam o terceiro lugar em
ocorrências de surtos3.
A
prevalência
de
micro-organismos
importantes como Escherichia coli e Staphylococcus
aureus resistentes a vários antimicrobianos está
aumentando, principalmente devido ao seu uso
extensivo e indiscriminado. Isso representa um
grande problema e ameaça para a saúde pública em
muitos países, devido à persistência da circulação de
cepas de bactérias resistentes no ambiente e a possível
contaminação de água e alimentos, podendo tornarse um meio pela qual estas bactérias patogênicas
resistentes aos antimicrobianos são transmitidas para
as pessoas, dificultando o tratamento4. Em termos
de clínica e terapêutica, o teste de susceptibilidade
aos antimicrobianos assume grande relevância para
a saúde pública5.
Além das bactérias, outro grave problema
de saúde pública no Brasil constitui as parasitoses
intestinais, responsáveis por um terço da carga
global de doença humana1. A ascaridíase, uma
doença grave provocada pelo Ascaris lumbricoides,
400
acomete milhões de pessoas, especialmente
crianças, tornando-as debilitadas, afetando-as
física e intelectualmente. Sendo causa e
consequência do subdesenvolvimento de um
país ou de uma região6.
Para garantir alimentos seguros aos
alunos, os serviços de alimentação precisam
seguir criteriosamente as normas estabelecidas
pela Vigilância Sanitária, pois as medidas de
segurança tomadas durante as várias fases de
preparação da alimentação escolar são ainda
insuficientes7.
Assim, com a maior frequência de crianças
nas escolas durante o período integral, realizando
suas principais refeições neste local, a segurança
alimentar é uma preocupação, pois é ameaçada
principalmente devido a grandes quantidades
de alimentos que são preparadas com
antecedência nas instituições escolares, então
se faz necessário uma investigação e
acompanhamento
da
qualidade
desses
alimentos consumido pelos alunos em fase
de desenvolvimento.
Neste estudo foi investigada a merenda
escolar das escolas e creches de uma cidade
do interior do estado de São Paulo - Brasil.
A comida foi avaliada utilizando os seguintes
parâmetros microbiológicos: coliformes totais,
coliformes termotolerantes, Escherichia coli,
Staphylococcus
aureus,
Salmonella
spp.,
Bacillus cereus, clostridios sulfito redutores e
parasitológicos: Entamoeba coli, Entamoeba
histolytica, Giardia duodenalis, Ascaris lumbricoides
e Taenia spp.
Este estudo teve como principal objetivo
avaliar o nível de contaminação microbiológica
e parasitológica de refeições escolares. Sendo de
suma importância epidemiológica em relação à
saúde pública e cuidados higiênico-sanitários no
preparo de tais refeições.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram obtidas amostras de merenda
escolar da cozinha piloto e de seis escolas de
ensino infantil e fundamental de uma cidade
do interior do estado de São Paulo. A coleta
das amostras foi realizada imediatamente após
o preparo e no momento em que chegaram
nas creches e escolas, antes de serem servidas
às crianças. As amostras foram coletadas em
dias alternados da semana, para garantir
uma avaliação completa do cardápio servido
às crianças. Foram realizadas coletas nos meses
de fevereiro, março, abril e novembro, sendo
seis coletas nas duas creches e três coletas nas
quatro escolas, totalizando 33 coletas e 102
amostras.
Estas amostras foram divididas nas
categorias de arroz, feijão, produtos cárneos
e saladas. E subdivididas em arroz branco
(18 amostras); arroz + carne moída + macarrão
+ cenoura (cinco amostras); arroz + seleta de
legumes (cinco amostras); galinhada (cinco
amostras); feijão (18 amostras); carne de
porco (três amostras); carne em pedaços com
batata (três amostras); linguiça calabresa
(três amostras); linguiça de frango assada (três
amostras); frango assado (três amostras); linguiça
de frango assado + tomate (três amostras); salada
de repolho + cenoura (nove amostras); salada
de alface (nove amostras); salada de tomate
(dez amostras) e salada de repolho + tomate
(cinco amostras).
Todas as amostras coletadas foram
encaminhadas
para
o
Laboratório
de
Microbiologia de Alimentos da Universidade
Estadual Paulista – UNESP – Campus de São
José do Rio Preto, acondicionadas em recipiente
isotérmico com gelo, e lá mantidas em geladeira até
a análise. As merendas escolares foram avaliadas
quanto à presença de coliformes totais, coliformes
termotolerantes, Escherichia coli8, Staphylococcus
aureus9 Salmonella spp.10, Bacillus cereus11 e
clostridios sulfito redutores12. As análises foram
realizadas no mesmo dia da coleta. As cepas de
Escherichia coli e Staphylococcus aureus isoladas
foram submetidas ao teste de susceptibilidade
antimicrobiana13-15. E nos alimentos crus foram
realizadas análises parasitológicas16,17.
RESULTADOS
As contagens de coliformes totais
variaram de 3,6 a 1.100 NMP/g. Das 102 amostras
avaliadas, 17 (16,7 %) apresentaram contagem
igual ou superior a 1.100 UFC/g, dentre estas
estão: arroz + seleta de legumes (Escola C), salada
de repolho + tomate (Escola A e Escola V), salada
de tomate (Cozinha Piloto, Escola A e Escola
O), salada de repolho + cenoura (Cozinha Piloto
e Creche I) e salada de alface (Cozinha Piloto,
Creche I e Creche D). A maior contagem de
bactérias foi obtida nas saladas, observaram-se
menores contagens de bactérias nas saladas
das escolas e creches em comparação com a
cozinha piloto.
Coliformes termotolerantes foram detectados
em 15 (14,7 %) amostras, sendo que apenas
uma amostra (1 %) não atendeu aos padrões
recomendados pela ANVISA18. Destas 15
amostras, três (20 %) confirmaram presença
de E. coli (Cozinha e Cheche I), como mostra
a Tabela 1, não atendendo aos padrões
estabelecidos18.
Staphylococcus aureus foi detectado em
sete (10,1 %) amostras (Galinhada da Cozinha
Piloto e Escolas; Arroz da Cozinha Piloto e
Creche I), sendo que apenas duas (2,9 %)
ultrapassaram o padrão recomendado pela
ANVISA18 (Cozinha e Creche I) como mostra a
Tabela 2. Também foi detectado Staphylococcus
coagulase negativa em 18 (26,1 %) amostras,
com contagens de 0,5x102 a 1,8x105 UFC/g,
dentre estas estão: Arroz + carne moída +
macarrão + cenoura (Escola C); Arroz + seleta
de legumes (Cozinha Piloto e escolas); Arroz
(Cozinha Piloto, Creche D e Creche I); Feijão
(Cozinha Piloto, Creche D e Creche I); Linguiça
calabresa (Creche D e Creche I) e Frango Assado
(Creche D).
Foram pesquisadas 102 amostras de
alimentos para presença de Salmonella spp.,
estando todas estas de acordo com o padrão
estabelecido18.
Para a análise de clostridios sulfito
redutores, todas as amostras apresentaram
contagens <10 UFC/g, atendendo aos padrões
estabelecidos pela legislação brasileira18.
Todas as 69 (100 %) amostras analisadas
para Bacillus cereus estavam dentro dos padrões
estabelecidos pela legislação18, porém uma (1,4 %)
amostra de arroz da Creche D apresentou contagem
de 2x102 UFC/g.
401
Tabela 1. Resultados obtidos após pesquisa de Escherichia coli na Cozinha piloto, Creche D, Creche I, Escola C, Escola O e
Escola V
Amostras
Coliformes
termotolerantes
20 NMP/g
23 NMP/g
28 NMP/g
9,2 NMP/g
15 NMP/g
3,6 NMP/g
3,6 NMP/g
3,6 NMP/g
240 NMP/g
9,2 NMP/g
9,2 NMP/g
9,2 NMP/g
21 NMP/g
3,6 NMP/g
3,6 NMP/g
102 NMP/g
Local
Repolho com cenoura
Salada de alface
Repolho com cenoura
Salada de alface
Salada de alface
Salada de alface
Repolho com cenoura
Salada de alface
Repolho com cenoura
Salada de alface
Arroz+carne moída+macarrão+cenoura
Salada de tomate
Salada de tomate
Padrão Federal Brasil 2001
Cozinha piloto
Cozinha piloto
Cozinha piloto
Cozinha piloto
Creche D
Creche D
Creche I
Creche I
Creche I
Creche I
Escola C
Escola O
Escola O
Escola V
Escola A
E. coli
Ausente
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausência
NMP= técnica de número mais provável
Tabela 2. Resultados obtidos da contagem de Staphylococcus spp. (UFC/g) na Cozinha piloto, Creche D e Creche I
Amostras
Coleta dia 26/02/2013
Arroz
Feijão
Carne de porco
Arroz
Feijão
Carne com batata
Arroz
Feijão
Linguiça calabresa
Arroz
Feijão
Linguiça de frango
Arroz
Feijão
Frango assado
Arroz
Feijão
Linguiça de frango
Padrão Federal Brasil 2001
402
Cozinha Piloto
Locais
Creche D
Creche I
< 100
< 100
< 100
1,5 x 102 (-)
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
1 x 102 (-)
< 100
< 100
0,5 x 102 (-)
0,5 x 102 (-)
< 100
3 x 102 (-)
1 x 102 (-)
1 x 102 (-)
1 x 102 (-)
3 x 102 (-)
1,5 x 102 (-)
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
1,9 x 104 (-)
< 100
4 x 104 (-)
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
5 x 103 (+)
< 100
< 100
6 x 103 (+)
< 100
< 100
103 UFC/g para Staphylococcus aureus
Já nas análises parasitológicas, o cisto
de Entamoeba coli estava presente na salada de
alface da Creche D e ovo de Ascaris lumbricoides
(não larvado, não havendo risco de infecção)
na salada de repolho com cenoura da Creche I,
como mostra a Tabela 3.
Para os testes de sensibilidade aos
antimicrobianos das três cepas de Escherichia coli
testadas, duas (66,7 %) foram sensíveis a
todos antimicrobianos e uma (33,3 %) foi
resistente a um antimicrobiano, a ampicilina.
Já para Staphylococcus aureus, todas as sete
cepas (100 %) analisadas foram resistentes
a um antimicrobiano, a penicilina, o restante
dos antimicrobianos testados foram eficazes para
100% das cepas testadas.
Tabela 3. Resultados de análises parasitológicas das saladas da cozinha piloto, Creche D, Creche I, Escola V, Escola C, Escola O
e Escola A
Amostra/Data
Repolho com cenoura
26/02/2013
Salada de alface
05/03/2013
Salada de alface
12/03/2013
Repolho com cenoura
26/03/2013
Repolho com cenoura
03/04/2013
Salada de tomate
09/04/2013
Repolho com tomate
18/04/2013
Salada de tomate
05/11/2013
Salada de alface
12/11/2013
Local
Resultado
Cozinha piloto
Creche D
Creche I
Cozinha piloto
Creche D
Creche I
Cozinha piloto
Creche D
Creche I
Cozinha piloto
Creche D
Creche I
Cozinha piloto
Creche D
Creche I
Cozinha piloto
Escola V
Escola C
Escola O
Escola A
Cozinha piloto
Escola V
Escola C
Escola O
Escola A
Cozinha piloto
Escola V
Escola C
Escola O
Escola A
Cozinha piloto
Creche D
Creche I
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Cisto de Entamoeba coli
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ovo de Ascaris lumbricoides*
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
403
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
As altas contagens de coliformes totais
demonstram uma deficiência das condições
higiênica da Cozinha Piloto, Escola C, Escola
A, Escola V, Escola O, Creche I e Creche D.
A maior contagem de coliformes totais nas
saladas pode ser explicada por ser um alimento
cru, que tem a contaminação facilitada devido
ao contato direto com o solo ou até mesmo
causado pela falta de higiene do manipulador.
Acredita-se que as menores contagens de bactérias
observadas nas saladas das escolas em comparação
com a cozinha piloto, seja devido ao vinagre usado
nas escolas para temperar as saladas, como mostra
o estudo de Sengun e Karapinar19 que concluíram
que o vinagre causa uma redução significativa
da carga microbiana presente no alimento.
No período de 1996 a 2004, a Administração
de Alimentos e Drogas (FDA) respondeu a 14
surtos de doenças transmitidas por alimentos, nos
quais alfaces ou tomates foram confirmados como
a fonte de infecção, sendo associados a 859
casos da doença relatados. Em 2011, o Comitê
Consultivo para a Segurança Microbiológica de
Alimentos (ACMSF) informou que no Reino
Unido houve 531 casos de morbidade devido o
consumo de frutas e vegetais, incluindo um óbito20.
A presença de coliformes termotolerantes
pode ser explicada pela falha na higienização das
mãos dos manipuladores, resultando em uma
contaminação cruzada. Da mesma forma Santana
et al7 encontraram coliformes termotolerantes
nas saladas de alface com cenoura e tomate da
merenda escolar de escolas públicas de Salvador
- Brasil. Sospedra et al21 também coletaram várias
amostras de alimentos, onde seus resultados
mostraram que as amostras de alface e tomate
foram os vegetais que mais apresentaram
contaminação por enterobactérias, estando estes
micro-organismos em menor quantidade no
arroz (13 %). De acordo com os autores, as
falhas de higiene na manipulação de alimentos
têm contribuído para a contaminação dos
alimentos, o que poderá causar surtos de
toxinfecção alimentar, sendo estes ainda mais
graves se causados pela E. coli que pode estar
presente. Neste estudo, três (20 %) amostras
404
foram confirmadas para presença de E. coli
como mostra a Tabela 1, não atendendo
aos padrões estabelecidos, que estipulam ausência
deste micro-organismo, considerado como um
grande indicador de contaminação fecal.
Os sintomas da doença incluem cólicas
abdominais e diarreia, que podem ser de
sangue. Febre e vômitos também podem ocorrer.
A maioria dos pacientes se recupera dentro de
dez dias, embora em alguns casos a doença
pode tornar-se fatal. Os riscos desta doença
são maiores em idosos e em crianças menores
de cinco anos de idade2. Da mesma forma,
Sospedra et al21 também encontraram E. coli em
6,6 % amostras de alface. Em 2006, nos Estados
Unidos, houve um surto de E. coli O157:H7
devido ao espinafre contaminado, envolvendo
276 casos e três mortes foram relatadas. Em maio
de 2011 na Alemanha, foi relatado um surto de
E. coli produtor de toxina Shiga (STEC), o sorotipo
O104:H4. No final do surto, 3.785 casos da doença
e 45 mortes foram relatados na Alemanha. Outras
doenças e mortes referidas a este surto foram
relatadas fora da Alemanha, onde mais tarde
foi descoberto que os veículos do surto foram
brotos de feijão20. De acordo com a legislação,
esses alimentos contaminados com E. coli são
impróprios para o consumo. No entanto estes
estão sendo ingeridos por crianças diariamente,
podendo causar graves doenças. Esses resultados
sugerem um maior cuidado na aquisição da
matéria-prima utilizada e principalmente em sua
manipulação.
Os resultados apresentados na Tabela 2
podem ter sido ocasionados devido a uma
contaminação cruzada, resultante da má higiene e
manipulação do manipulador, pois o contato direto
das mãos ou recipientes contaminados pode ser
suficiente para transferir para o alimento uma
quantidade de bactérias suficiente até mesmo
para causar doença. O principal reservatório de
Staphylococcus aureus em seres humanos são as
narinas, embora também possa ser encontrada nas
mãos, no entanto esta é a causa da maioria
dos surtos de intoxicação alimentar, tendo como
principais agravantes a produção de toxinas e
resistência antimicrobiana22. Já para Staphylococcus
coagulase negativa, a ANVISA não possui padrões
de contagem, porém temos que evitar sua
presença, pois estudos realizados por Freitas et
al23 detectaram a presença de genes toxigênicos
de Staphylococcus spp. isolados de queijo de
coalho, o que nos mostra que a ocorrência de
vários genes toxigênicos em amostras de
Staphylococcus coagulase negativa é um fato
importante e preocupante. Ryu et al24, ao analisarem
amostras de alimentos servidos em escolas não
encontraram este micro-organismo em nenhuma
das amostras investigadas. Por outro lado,
Kotzekidou25 encontrou Staphylococcus aureus em
12,5 % das sobremesas com creme de leite e em
11 % dos sanduíches de cantinas universitárias,
resultado semelhante a este estudo. Assim como foi
encontrado Staphylococcus aureus nas amostras
de arroz nesta pesquisa, Santana et al7, investigando
refeições servidas em escolas, mostraram que
o arroz e as almôndegas também estavam
contaminados
por
Staphylococcus
aureus,
apresentando contagens maiores do que os padrões
estabelecidos pela ANVISA18. O S. aureus é a
terceira causa mais importante de DVA no mundo,
tendo como seus principais agravantes a produção
de toxinas e resistência antimicrobiana22.
Quanto a pesquisa de Salmonella spp.,
os alimentos estavam dentro dos padrões
higiênico-sanitários adequados, devido à ausência
deste micro-organismo em todas as amostras.
Estes resultados foram semelhantes a estudos
realizados por Oliveira et al26 em alimentos
servidos em escolas públicas de Porto Alegre. No
entanto, Duarte et al27 encontraram amostras
positivas para Salmonella spp. em 9,6 % de
carcaças de frango, onde a Salmonella Enteritidis
foi o sorotipo mais frequente. Faustino et al28,
realizaram pesquisas em alimentos suspeitos de
DVA, onde 30,7% das amostras foram condenadas
devido a presença de Salmonella spp. em mousse
de clara de ovos e bolo de chocolate. Em
avaliações realizadas no restaurante e na cantina
de uma universidade, das 343 amostras
analisadas, Kotzekidou29 encontrou apenas uma
(0,3 %) positiva para Salmonella spp. em torta
congelada. A ausência de Salmonella spp. é
importante, pois este micro-organismo é uma
das principais causas de hospitalização e morte,
bem como gastrinterite, principalmente por
se tornarem cada vez mais resistentes aos
antimicrobianos clinicamente importantes30.
Apesar de apenas uma (1,4 %) amostra
apresentar contagem de 2 x 102 UFC/g para
Bacillus cereus e esta não ultrapassar os padrões
estabelecidos, sua presença deve ser evitada,
pois estudos realizados por Chaves et al31,
sobre diversidade genética, em relação ao perfil
toxigênico de Bacillus cereus isolados de
alimentos, sugerem que a maioria das estirpes
presentes em vários tipos de alimentos no
Brasil representa um risco potencial de
provocar intoxicação alimentar, devido à elevada
prevalência dos genes de toxinas encontrados
nestas estirpes. Aragon-Alegro et al32, também
confirmaram que todas as cepas de Bacillus
cereus investigadas em alimentos no Brasil,
apresentaram capacidade toxigênica podendo
representar um risco para os consumidores se
as boas práticas não forem seguidas. Em pesquisas
realizadas por Kotzekidou25, foi encontrada
a bactéria patogênica B. cereus em 31,8 %
dos bolos congelados vendidos em cantinas
universitárias. Ryu et al24 também encontraram
Bacillus cereus em uma amostra de alimento
servida em uma escola da Coréia do Sul. Bacillus
cereus foi o agente mais identificado, 41,2 % dos
80 surtos de DVA ocorridos no Distrito Federal33.
Para análise de clostridios sulfito redutores,
foram pesquisadas amostras a base de carne,
que apresentaram contagens < 10 UFC/g do
micro-organismo, sendo os mesmos resultados
encontrados por Vieira et al34, que avaliaram a
qualidade microbiológica de preparações a base
de carne servidas em nove escolas de Poços
de Caldas, MG. Já um surto investigado por
Dailey et al35 ocorrido na Carolina do Norte,
foi confirmado por eio de amostras de fezes
dos participantes de uma conferência, que
Clostridium perfringens foi a causa do surto,
onde os participantes referiram que o frango
servido estava mal cozido. Daelman et al36
realizaram análises nos alimentos de uma
empresa para gestão da segurança alimentar
da mesma e detectaram a presença de clostridios
sulfito redutores em 1,94 % das 258 amostras
analisadas.
Pelos resultados apresentados na Tabela 3,
405
as formas evolutivas de parasitos nas saladas
apresenta uma necessidade de melhoria na
higienização das mesmas e também das mãos
dos manipuladores que podem ser um veículo
de transmissão, para assim evitar a contaminação
às crianças. Peres Junior et al37, avaliando amostras
de alface de dez restaurantes, também detectaram
a presença de enteroparasitos em amostras de
dois restaurantes (20 %), sendo encontrados a
ameba Endolimax nana e o ciliado Balantidium
coli. Este estudo indica que a via de infecção por
saladas desempenha um papel importante na
transmissão de parasitas.
Fracassos em tratamentos devido à
resistência aos antimicrobianos aumentam o
custo do tratamento e causam morbidade por
mais tempo aos pacientes, sendo um grande
desafio, a busca de estratégias para a cura, que
representa um grande problema e ameaça para a
saúde pública. Edward e Chikwem38 também
detectaram amostras (100 %) de E. coli isoladas de
saladas resistentes à amoxicilina. Todos os isolados
de E. coli foram sensíveis a ofloxacina (100 %).
A porcentagem de sensibilidade no caso da
gentamicina foi de 96,7 %, ác. nalidíxico 90 %,
nitrofurantoína 80 %, cotrimoxazol 50 % e
tetraciclina 6,7 %. Ao contrário de resultados
encontrados por Furlaneto-Maia et al39, onde
não
houve
isolados
de
E.
coli
resistentes à ampicilina em amostras de
sanduíches. Já o oposto deste estudo, em uma
pesquisa sobre a caracterização de S. aureus em
alimentos infantis como cereal de arroz e leite
em pó, Wang et al40 encontraram 54 cepas
resistentes a eritromicina (75,9 %), ciprofloxacina
(51,9 %) e trimetoprim/sulfametoxazol (27,8 %),
gentamicina (22,2 %), tetraciclina (18,5 %) e
cefoxitina (3,7 %). Já iguais a este estudo, todos
S. aureus isolados por Wang et al40 foram
sensíveis à oxacilina e cloranfenicol. Guimarães
et al5 ao investigarem o perfil de susceptibilidade
aos antimicrobianos de cepas de Staphylococcus
coagulase positiva em amostras de queijo de
coalho,
mostraram
que
nitrofurantoína,
tetraciclina, cloranfenicol e sulfametoxazoltrimetropim foram eficazes, iguais aos resultados
obtidos neste estudo; no entanto, verificou-se
resistência a gentamicina, oxacilina (13,3 %) e a
406
eritromicina (26,7 %).
Nesta pesquisa, as cepas analisadas
apresentam-se
sensíveis
a
maioria
dos
antimicrobianos testados. No entanto, o grande
desenvolvimento de resistência relatado em vários
estudos, estabelece uma grande preocupação
em relação à saúde pública, reduzindo a
quantidade de antimicrobianos eficazes nos
tratamentos, destacando a importância do uso
adequado dos antimicrobianos, evitando a
veiculação de espécimes multirresistentes.
Por fim, os dados aqui apresentados
mostram a necessidade de um melhor
aperfeiçoamento nas condições de preparo
dos alimentos, devido à alta prevalência de
coliformes, a detecção das bactérias Escherichia
coli e Staphylococcus aureus resistentes à
ampicilina e penicilina respectivamente, e de
parasitos que indicam condições higiênicas
inadequadas. A contaminação detectada pode
ocasionar sérias doenças às crianças, além
de diminuir os recursos de antimicrobianos
que poderão ser utilizados em tratamentos.
Recomenda-se a adoção de medidas higiênicosanitárias e capacitação dos manipuladores de
alimentos para garantir alimentos seguros e
de qualidade às crianças envolvidas e evitar
possíveis surtos.
AGRADECIMENTOS
A CAPES e CNPQ pelo apoio financeiro, a
prefeitura, secretaria de educação, cozinha piloto
e escolas por permitirem a realização da pesquisa
no município.
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409
Qualidade de frutas e hortaliças orgânicas comercializadas
em feiras livres
Quality of organic fruits and vegetables sold in street
markets
RIALA6/1675
Amanda Brinco FERREIRA, Sandra Helena Ferreira de ALVARENGA, Jackline Freitas Brilhante
de SÃO JOSÉ*
*Endereço para correspondência: Departamento de Educação Integrada em Saúde, Centro de
Ciências da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo. Av. Marechal Campos, 1468 – Maruípe,
CEP: 29040-090, Vitória, ES, Brasil. Tel: 27 3335-7223. E-mail: [email protected]
RESUMO
Pelo cultivo diferenciado, os produtos orgânicos podem estar mais expostos à contaminação
microbiológica do que os convencionais, visto que fertilizantes orgânicos geralmente consistem
de estrume (adubo orgânico), que pode abrigar micro-organismos patogênicos. Com isso,
objetivou-se avaliar a qualidade de frutas e hortaliças orgânicas comercializadas em duas feiras
livres da Grande Vitória/ES, bem como as condições higiênico-sanitárias das barracas
que comercializam os produtos. Para avaliação das boas práticas foi aplicada uma
lista de verificação baseada na Resolução RDC 216/2004. Foram coletadas 16 amostras
entre frutas e hortaliças, e submetidas às seguintes análises: pH, acidez total titulável,
contagem de mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, determinação do Número
Mais Provável (NMP) de coliformes totais e a 45 °C e pesquisa de Salmonella spp. Todas
as barracas avaliadas foram classificadas como regulares. A contagem de coliformes a
45 °C acima do estabelecido pela legislação vigente foi detectada em uma das amostras (6,25 %).
Nessa mesma amostra foi detectada a presença de Salmonella spp., o que está em desacordo com
o exigido pela legislação brasileira vigente. Apesar de 93,75 % das amostras estarem de acordo
com os padrões microbiológicos vigentes, ressalta-se a importância do controle das fontes de
contaminação, desde o campo até a comercialização dos alimentos.
Palavras-chave. análise microbiológica, alimentos orgânicos, Salmonella.
ABSTRACT
Due to the differentiated cultivation, the organics products might be more exposed to
microbiological contamination than the conventional products, since the organic fertilizers are
usually consisted of manure (fertilizer compost), and this material might harbor pathogenic
microorganisms. This study aimed at evaluating the hygienic conditions of the stalls in two
street markets of Vitória/ES, and to assess the quality of organic fruits and vegetables sold in
these locations. For assessing the good practices, a checklist based on Resolution RDC 216/2004
was applied. Sixteen samples of organic fruits and vegetables collected in these street markets
were analyzed on pH, titratable acidity, mesophilic aerobic bacteria, yeasts and molds, determination
of the Most Probable Number (MPN) of total and fecal coliforms, and Salmonella spp detection.
All of the evaluated stalls were classified as regular. The coliforms counting at 45 °C above the
value established by the current legislation were found in one sample (6.25 %). Salmonella spp.
was detected in the same sample, which iwas noncompliant with the Brazilian legislation.
Although 93.75 % of the samples were in accordance with the current microbiological standards,
it is emphasized the importance of controlling the contamination sources, from the field to the food
marketing.
Keywords. microbiological analysis, organic food, Salmonella.
410
Ferreira AB, Alvarenga SHF, São José JFB. Qualidade de frutas e hortaliças orgânicas comercializadas em feiras livres. Rev Inst Adolfo Lutz.
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
INTRODUÇÃO
Desde 1990, a agricultura orgânica vem
crescendo rapidamente, tanto em área cultivada
como em número de produtores e mercado
consumidor¹, impulsionado, principalmente, pela
intensa preocupação dos consumidores com o
uso intensivo de produtos químicos na agricultura
convencional, pela preocupação social com a
sustentabilidade, segurança e a qualidade dos
produtos convencionais².
A agricultura orgânica tem atraído a
atenção do setor de produção de alimentos em
todo o mundo, uma vez que revive princípios
da ecoagricultura que englobam o uso do solo,
da água, a manutenção da qualidade do ar e a
aplicação da horticultura mantendo o respeito ao
meio ambiente e as relações sociais, econômicas
e culturais³.
Os alimentos orgânicos são definidos como
aqueles alimentos in natura ou processados
que são oriundos de um sistema orgânico de
produção agropecuária e industrial. A produção
de alimentos orgânicos é baseada em técnicas
que dispensam o uso de insumos como pesticidas
sintéticos, fertilizantes químicos, medicamentos
veterinários,
organismos
geneticamente
modificados, conservantes, aditivos e irradiação4.
Dentre
os
alimentos
orgânicos
comercializados têm-se as frutas e hortaliças.
Essas podem ser consumidas cruas e desta
forma, em caso de contaminação, tornam-se
importantes veículos de patógenos5. Devido a
forma diferenciada de cultivo, o produto
orgânico pode ser mais exposto à contaminação
microbiológica do que os produtos convencionais,
uma vez que os fertilizantes orgânicos geralmente
consistem de estrume (adubo orgânico), e
este material pode abrigar micro-organismos
patogênicos, tais como Salmonella spp., Listeria
monocytogenes e Escherichia coli O157:H7³.
Smith6
menciona
que
a
contaminação
microbiológica dependerá principalmente das
práticas de produção adotadas e das condições
ambientais e, assim sendo, tanto os alimentos
orgânicos como os convencionais estariam
sujeitos ao mesmo nível de risco.
Embora qualquer patógeno possa se tornar
problema potencial em frutas e hortaliças,
Salmonella spp. assume relevância especial
para a saúde pública7. Dentre as doenças de
origem alimentar (DOA), as mais críticas são
aquelas causadas pela Salmonella spp., considerada
como um dos principais agentes envolvidos
em surtos de infecção alimentar registrados em
vários países8,9.
A realização de análises microbiológicas
e a comparação dos resultados obtidos com
os
padrões
estabelecidos
pelos
órgãos
regulamentadores são imprescindíveis para
averiguar a qualidade dos alimentos oferecidos
aos consumidores. Entretanto, não existem
parâmetros microbiológicos para alimentos
provenientes de cultivo orgânico. Dessa forma,
adota-se como referência a RDC nº 12, de
2 de janeiro de 2001, da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária10, que dispõe sobre os
limites microbiológicos para frutas e hortaliças in
natura. Devido ao aumento da procura por parte
dos consumidores e ao incremento na produção
orgânica de alimentos, os produtos orgânicos
têm ganhando espaço no mercado brasileiro.
Entretanto, os relatos sobre a comercialização
destes produtos na região estudada são
escassos. Informações sobre boas práticas e
qualidade microbiológica destes produtos
são de relevância para contribuir na
determinação da escolha dos consumidores.
Deste modo, objetivou-se avaliar as condições
higiênico-sanitárias das barracas de duas feiras
livres da Grande Vitória/ES, bem como avaliar
a qualidade de frutas e hortaliças orgânicas
comercializadas nestes locais.
MATERIAL E MÉTODOS
Trata-se de um estudo transversal realizado
no período de outubro de 2014 a maio de 2015.
As amostras de frutas e hortaliças orgânicas
foram coletadas em feiras livres de produtos
orgânicos localizadas na Serra/ES e em Vitória/ES,
sendo que existiam 12 e 15 barracas em cada feira,
respectivamente. Em ambas as feiras, 11 barracas
comercializavam apenas frutas e hortaliças
orgânicas. As barracas foram escolhidas de
acordo com a variedade de produtos
411
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
comercializados.
Inicialmente, os comerciantes foram
contatados para apresentação dos objetivos da
pesquisa e solicitação de doação de amostras
dos alimentos comercializados. A definição
das amostras a serem coletadas foi baseada nos
seguintes critérios: culturas que permaneçam em
contato com o solo, o que possibilita a retenção
e a sobrevivência de micro-organismos, e que
sejam culturas consumidas na forma in natura
(sem cocção).
A coleta das frutas e hortaliças foi realizada
no horário de comercialização dos produtos.
Os pesquisadores responsáveis pela coleta das
amostras utilizaram luvas e acondicionaram os
alimentos em sacos plásticos disponibilizados
pelos comerciantes. Os sacos plásticos foram
fechados e identificados. Em seguida, foram
transportados em caixas isotérmicas até o
laboratório. As amostras foram mantidas a 7 ± 1 °C
por no máximo 24 h até o momento das análises.
Foi considerada unidade amostral de cerca de
500 g de alimento. Foram coletadas 16 amostras,
sendo 14 hortaliças e apenas 2 frutas, de acordo
com critérios de escolha. Foram coletadas
8 amostras na feira localizada na Serra/ES e
8 na feira localizada em Vitória/ES.
Do total de barracas que comercializavam
frutas e hortaliças orgânicas, foram coletadas
amostras em 45,45 % (n = 5). As barracas nas
quais foi feita a coleta foram identificadas como
barraca 1, 2, 3, 4 e 5. Nas barracas foram coletados os
seguintes alimentos: barraca 1 – alface, morango e
caqui; barraca 2 – manjericão e rúcula; barraca 3
– couve, tomate, coentro, e agrião; barraca 4 –
repolho, rabanete, salsa, cenoura, cebolinha,
pepino; barraca 5 – pimentão.
Avaliação das boas práticas das barracas das
feiras
A coleta dos dados ocorreu por meio de
observação direta durante as visitas realizadas
por pesquisador treinado. Para a avaliação,
foi utilizada uma lista de verificação baseada
na Resolução RDC nº 216, de 15 de setembro
de 2004, da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária11, dividida em identificação do local,
avaliação e classificação do estabelecimento. A
412
lista de verificação apresentava quatro blocos de
itens avaliados em cada barraca, totalizando 33
itens, conforme a seguir: ‘instalações e utensílios’
(13 itens); ‘abastecimento de água’ (1 item);
‘hábitos higiênicos e vestuário dos manipuladores’
(12 itens) e ‘higiene do alimento’ (7 itens). Cada
item possuía três possibilidades de resposta:
‘Conforme’, ‘Não Conforme’ e ‘Não se aplica’ (NA).
A classificação de cada barraca baseou-se nos
seguintes critérios de pontuação, fundamentados
na Resolução RDC nº 275, de 21 de outubro de
2002, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária12:
Bom (75 a 100 % de atendimento dos itens),
Regular (50 a 74,9 % de atendimento dos itens)
e Ruim (0 a 49,9 % de atendimento dos itens).
Adotou-se essa mesma classificação para cada um
dos quatro blocos da lista de verificação.
Análises Químicas
Foram avaliadas a acidez titulável e o
valor de pH das amostras. Essas análises
foram realizadas com objetivo de caracterizar
quimicamente as amostras. Para determinação
do pH foram pesadas 5 g da amostra em
um béquer contendo 50 mL de água e
posteriormente homogeneizado com bastão de
vidro13. A determinação do pH foi realizada por
medida direta em potenciômetro devidamente
calibrado (Tecnopon®, Londrina-PR, Brasil).
A acidez total titulável foi determinado por
titulação com NaOH 0,1 N. Foram utilizadas
5 g de amostra e estas foram posteriormente
homogeneizadas juntamente com 50 mL de água
destilada. Em seguida, adicionou-se três gotas de
indicador de fenolftaleína 1 %, procedendo-se
às titulações, sob agitação, com solução de
NaOH 0,1 N. Os resultados foram expressos em
percentual de ácido cítrico14.
Análises Microbiológicas
Os procedimentos empregados nessa etapa
foram realizados de acordo com a metodologia
da American Public Health Association (APHA),
descrita no Compendium of Methodos for the
Microbiological Examination of Food 15. Foram
pesados 25 g de amostra e em seguida foram
adicionados 225 mL de água peptonada 0,1 %
previamente esterilizada. A homogeneização
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
foi feita manualmente durante aproximadamente
5 minutos. Nessa etapa, foi obtida a diluição 10-1
da amostra. Em seguida, diluições decimais
apropriadas foram preparadas e alíquotas dessas
diluições foram transferidas para meios de cultura
específicos para a determinação de cada grupo
microbiano.
A determinação de mesófilos aeróbios foi
realizada pela técnica de plaqueamento em
profundidade utilizando 1 mL das diluições
previamente preparadas e em seguida, foi
adicionado Ágar Padrão para Contagem (PCA)
(Himedia®), sendo as placas incubadas invertidas
a 35 ºC por 48 h. O plaqueamento das alíquotas
foi realizado em duplicata e o resultado expresso
em unidades formadoras de colônias por grama
(UFC/g).
Para determinar a presença de fungos
filamentosos e leveduras foi inoculado 0,1 mL
das diluições das amostras sobre a superfície seca
de ágar batata glicose (Aluka®) 2 %, acidificado
a pH 3,5. As placas foram incubadas a 25 ± 1 °C,
por 5 a 7 dias. O plaqueamento das alíquotas foi
realizado em duplicata e o resultado expresso
em unidades formadoras de colônias por grama
(UFC/g).
A determinação de coliformes a 35 °C
e coliformes a 45 °C foi realizada pela inoculação
de alíquotas de 1 mL de cada diluição previamente
preparada. Foram inoculadas em séries de
três tubos contendo 9 mL de caldo Lauril sulfato
triptose (Oxoid®), com tubo de Duharm invertidos
(teste presuntivo); em seguida os tubos foram
incubados a 35 ºC por 24 – 48 h. A partir dos
tubos com leitura positiva (turvação e formação
de gás), foram realizados os testes confirmativos
para coliformes totais em caldo Lactose Bile
Verde Brilhante (Himedia®) a 35 ºC por 24 – 48 h,
e, coliformes a 45 °C em caldo Escherichia coli
(Acumedia®) a 45 ºC por 24 – 48 h. Após o período
de incubação, realizou–se a leitura dos tubos
positivos e o número mais provável (NMP) foi
quantificado através da leitura na Tabela de
Hoskins15.
Para análise de Salmonella spp., 25 g de
amostras foram pré-enriquecidas em frascos
contendo 225 mL de água peptonada a 1%.
Após 24 h de incubação, as alíquotas foram
transferidas para 10 mL dos caldos de
enriquecimento, sendo estes o caldo Rappaport
Vassiliadis (Acumedia®) e caldo selenito-cistina
(Acumedia®). A partir desses caldos, foi feita a
repicagem sobre a superfície previamente seca
de placas com meio sólido seletivo para
Salmonella spp. Dessa forma foram obtidas
2 placas de Ágar Salmonella Shigella (Isofar®),
uma originária do caldo Rappaport Vassiliadis
(Isofar®) e outra originária do caldo selenito
cistina e 2 placas do segundo meio seletivo
Ágar Verde Brilhante (Isofar®), obtidas do mesmo
modo. As placas, invertidas, foram incubadas a
36 ± 1 ºC por 18 a 24 h. Em seguida, foram
selecionadas 3 a 5 colônias suspeitas por amostra.
As colônias suspeitas foram mantidas em
ágar PCA (Acumedia®) até a avaliação pelas
provas
bioquímicas.
Foram
interpretados
como positivos para Salmonella, as culturas
que apresentarem reações típicas nas provas
bioquímicas. Os resultados foram expressos
como presença ou ausência em 25 g16.
Análise dos dados
Os dados obtidos na avaliação das
condições higiênico-sanitárias por meio da lista
de verificação foram tabulados em planilhas
do Microsoft Excel® e analisados de forma
descritiva.
Os resultados das análises microbiológicas
foram comparados com o padrão nacional
estabelecido pela RDC 12/2001 para frutas e
hortaliças10. Para comparação foi considerado o
valor estabelecido para amostra indicativa.
Adequação das boas práticas das barracas das
feiras
Das cinco barracas avaliadas, 60 % (n = 3)
localizavam-se no município da Serra/ES e 40 %
(n = 2) em Vitória-ES. Todas as barracas avaliadas
comercializavam apenas frutas e hortaliças
orgânicas e possuíam de dois a três funcionários.
Em relação ao atendimento aos itens
propostos na lista de verificação, o percentual
de adequação das barracas variou de 50 a
64,51 %, sendo todas barracas classificadas
413
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
como Regular.
O bloco de Instalações e Utensílios
apresentou percentual de adequação de 53,84 a
62,53 %, sendo que todas as barracas foram
classificadas como Regular. O bloco que
apresentou maior percentual de inadequação
foi o bloco de abastecimento de água com 100 %
de inadequação para todas as barracas. Para o
bloco de Higiene dos manipuladores, o percentual
de adequação variou de 25 a 58,34 %, sendo
todas as barracas classificadas como Ruim.
O bloco com maior percentual de adequação
foi o de Higiene dos Alimentos, sendo que todas
as barracas avaliadas obtiveram 85,71 % de
adequação.
De acordo com Almeida Filho et al17, na
maioria das feiras livres, as condições higiênicas
de comercialização dos produtos alimentícios são
insatisfatórias, constituindo-se um importante
fator no processo de contaminação e proliferação
de doenças de origem alimentar.
Instalações e utensílios
As barracas 1, 2 e 4 apresentaram 46,16 %
de não conformidade nesse item. As barracas
eram de estruturas de madeira removíveis,
cobertas de lonas com as laterais abertas. Foi
observado que nas bancadas onde são expostos
os alimentos existiam frestas e as superfícies
eram cobertas por tecido. Resultado semelhante
foi observado por Agostinho18 que ao avaliar
barracas de feiras livres de Goiânia/GO
verificou que 121 (52,8 %) não se encontravam
em condições satisfatórias, com as bancadas
forradas com material de difícil higienização
e em estado de conservação inadequado.
Esses resultados indicam a possibilidade de
contaminação cruzada, pois as sujidades nas
superfícies favorecem a multiplicação bacteriana
e podem atrair pragas 11,19.
A limpeza e desinfecção são operações
fundamentais para a segurança dos alimentos.
Entretanto, muitas vezes são etapas realizadas
de forma inadequada, o que propicia o
desenvolvimento de micro-organismos em
superfícies e consequentemente torna-se locais
com grande potencial de contaminação20.
O acondicionamento do lixo nas duas
414
feiras era realizado em caixas plásticas vazadas
próximas às barracas, o que pode contribuir para
aproximação de vetores e pragas urbanas.
Segundo Correia e Roncada20, as feiras
livres apresentam problemas como falta de
higiene, estrutura precária de barracas,
comercialização de produtos não permitidos,
falta de segurança e desorganização. Todos
esses problemas comprometem a qualidade
dos produtos e colocam em risco a saúde do
consumidor.
Abastecimento de água
Em ambas as feiras não havia disponibilidade
de água potável, o que é considerado uma falha
grave, pois impossibilita os manipuladores a
realizarem a higienização correta de mãos e
utensílios utilizados durante a comercialização.
Hábitos
higiênicos
e
vestuário
dos
manipuladores
Com 75 %, a barraca 1 apresentou maior
percentual de não conformidade nesse item.
Foi observado uso de esmaltes nas unhas, a
manipulação dos alimentos sem a anti-sepsia
das mãos. Esse último ocorre pela a falta de
local apropriado para essa ação. O manuseio
do dinheiro e dos alimentos era realizado pela
mesma pessoa. Este fato pode contribuir para
contaminação dos alimentos. Nas feiras livres
não existiam banheiros químicos disponíveis,
sendo que quando necessário, era utilizado o
banheiro de um restaurante próximo ao local.
A resolução RDC 275/2002 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária12 determina que
todos os manipuladores da área de alimentos,
devem manter-se adequadamente higienizados.
Conforme constatado por Audi21, ao analisar
371 manipuladores, verificou-se que mais da
metade não obedeceu à legislação.
Higiene dos alimentos
Todas as barracas tiveram apenas 14,29 %
de inadequação nesse item, portanto, foi o bloco
melhor classificado. Observou-se que os feirantes
separam adequadamente cada tipo de produto,
os alimentos estavam em perfeitas condições
de higiene e não estavam acondicionados
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
juntamente com alimentos estragados e os
alimentos são embalados somente com sacolas
plásticas brancas, transparentes e próprias para
alimentos. Entretanto, os alimentos não estavam
protegidos contra insetos e poeiras. Segundo
Germano22, os alimentos vendidos nas feiraslivres estão expostos ao ar livre tendo maiores
possibilidades de sofrer alterações biológicas,
devido às ações dos diferentes organismos
atuando sobre eles. Isto se deve ao fato de
receber pouco controle da matéria prima ou
devido à manipulação inadequada podendo não
somente veicular micro-organismos patogênicos
como também propiciar o desenvolvimento
e a sobrevivência desses patógenos. As frutas
e hortaliças podem estar em contato com a
poluição urbana, longe da proteção de um
estabelecimento coberto e consequentemente
estão mais expostos à contaminação por microorganismos e insetos.
Análises químicas
Os valores médios de pH e acidez total
titulável estão dispostos na Tabela 1. Os valores
de pH dos produtos avaliados variaram de 3,38 a
6,39. Sabe-se que o pH é um fator intrínseco
importante para o desenvolvimento de microorganismos em alimentos. Amostras com valor
de pH mais baixo, como no caso do morango
e tomate cereja, podem ser mais suscetíveis
ao desenvolvimento de fungos filamentosos e
leveduras pois estes micro-organismos toleram
estas condições de pH23. Estes alimentos
apresentam naturalmente ácidos orgânicos em
sua composição24, o que possivelmente pode ter
contribuído para o baixo valor de pH observado.
Amostras de alface, cenoura, coentro,
couve, manjericão, pepino, rabanete e rúcula
apresentaram valores de pH superiores a 6.
Sabe-se que valores de pH mais próximos de 7
são mais propícios ao desenvolvimento de
bactérias,
principalmente
de
bactérias
patogênicas.23
Os valores de acidez total titulável variaram
de 0,6 a 6,8 mg de ácido cítrico/100 g de amostra.
A acidez total titulável é um parâmetro envolvido
com a apreciação do estado de conservação de
um produto alimentício, já que, na maioria das
Tabela 1. Valores médios de pH e acidez total titulável
de frutas e hortaliças orgânicas de feiras livres da Grande
Vitória/ES, 2015
Alimento
pH
Acidez Total Titulável
(%)
Agrião
5,73
6,8
Alface
6,14
1,9
Caqui
5,93
2,3
Cebolinha
5,97
2,5
Cenoura
6,03
1,3
Coentro
6,25
2,5
Couve
6,08
3,9
Manjericão
6,39
1,9
Morango
3,38
2,8
Pepino
6,25
0,6
Pimentão
5,97
1,3
Rabanete
6,28
1,9
Repolho
5,97
3,4
Rúcula
6,25
2,4
Salsa
5,92
2,5
Tomate cereja
4,31
1,7
vezes, a decomposição do alimento quase sempre
altera a concentração de íons de hidrogênio13,
além de influenciar as características sensoriais
dos alimentos. Esse parâmetro pode variar em
função do grau de maturação e das condições de
crescimento24.
Análises microbiológicas
Os resultados das amostras avaliadas
encontram-se descritos na Tabela 2.
A contagem de mesófilos aeróbios
nas amostras variou de 4,1 a 7,7 log UFC/g.
Resultado semelhante foi observado por Maffei
et al³ que observaram variação da contagem
desses micro-organismos de 5 a 7 log UFC/g.
Santos et al25 também encontraram resultados
semelhantes em frutas e hortaliças minimamente
processadas, com contagem total de mesófilos
aeróbios variando de 2,3 a > 9,8 log UFC/g.
Não está previsto na legislação brasileira o
padrão microbiológico para mesófilos aeróbios.
415
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
Tabela 2. Contagem total de aeróbios mesófilos, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 35 °C, coliformes a 45° C e presença
de Salmonella spp. de frutas e hortaliças orgânicas de feiras livres da Grande Vitória/ES, 2015
Mesófilos
Aeróbios
(log UFC/g)
Fungos
filamentosos e
leveduras
(log UFC/g)
Coliformes
a 35 °C
(NMP/g)
Coliformes
a 45°C
(NMP/g)
Salmonella spp.
(em 25 g )
Agrião
7,4
5,4
> 1,1 x 10³
<3
Ausência
Alface
5,6
Caqui
6,1
5,7
1,1 x 10³
<3
Ausência
< 10 est.
23
<3
Ausência
Cebolinha
6,4
4,3
> 1,1 x 10³
3,6
Ausência
Cenoura
6,0
5,7
> 1,1 x 10³
<3
Ausência
Coentro
6,5
6
> 1,1 x 10³
<3
Ausência
Couve
4,7
5,5
2,1 x 10²
<3
Ausência
Manjericão
5,5
4,4
4,6 x 10²
6,1
Ausência
Morango
4,5
5,9
9,3 x 10²
<3
Ausência
Pepino
6,4
< 10 est.
> 1,1 x 10³
<3
Ausência
Pimentão
4,9
4,0
6,1
<3
Ausência
Rabanete
5,5
4,7
4,3 x 10²
<3
Ausência
Repolho
4,1
4,6
<3
<3
Ausência
Rúcula
6,5
5,2
> 1,1 x 10³
<3
Ausência
Salsa
6,1
5,3
> 1,1 x 10³
1,2 x 10²
Presença
Tomate cereja
7,7
5,7
1,5 x 10²
<3
Ausência
Alimento
Entretanto, essa análise é importante, pois auxilia
na indicação de vida de prateleira e qualidade
microbiológica dos alimentos3,28. Os alimentos
com maior contagem foram tomate e agrião.
Esse resultado é corroborado pelo encontrado por
Maistro et al27 que detectaram a maior contagem
desses micro-organismos em amostras de agrião,
independentemente do sistema de empacotamento,
o que evidencia uma contaminação inerente deste
produto.
Para fungos filamentosos e leveduras,
a contagem variou de 4,0 a 6,0 log UFC/g.
Maffei et al³ e Oliveira et al28 também observaram
resultado semelhante para este grupo de microorganismos ao analisar qualidade de frutas
e hortaliças orgânicas. Apesar da legislação
brasileira não indicar limite para estes microorganismos em frutas e hortaliças, Ferreira et al29
recomendaram contagem inferior a 4 log UFC/g
para garantir a proteção à saúde do consumidor,
pois em contagens superiores pode haver
416
produção de micotoxinas. Além disso, a análise
deste grupo de micro-organismos é importante,
pois a alta contagem também está relacionada
à maior chance de deterioração do alimento.
Nas frutas, a contagem de coliformes a
35 °C variou de 23 a 9,3 x 10² NMP/g. O índice de
coliformes a 35 °C avalia as condições higiênicosanitárias gerais dos alimentos. Esse resultado
situa-se na faixa encontrada em outros estudos
com frutas, conforme verificado por Pinheiro
et al26 e Smanioto et al30 que encontraram
contagem de coliformes a 35 °C variando de
< 3 a 2,4 x 106 NMP/g e < 3 a 1,1 x 10³ NMP/g,
respectivamente. Segundo Pinheiro et al26, os
coliformes a 45 º C podem indicar contaminação
de origem fecal recente, sendo que a detecção
de elevado número pode estar relacionada à
possível presença de patógenos intestinais,
como E. coli e Salmonella spp. Segundo a RDC
12/200110, a contagem máxima de coliformes
45 °C para morangos é de 2 x 10³ UFC/g e para
São Paulo, 2015;74(4):410-9.
as demais frutas, 5 x 10² UFC/g. Visto que esses
micro-organismos não foram detectados nas
amostras de frutas, esses alimentos atendem
a legislação vigente. Resultado semelhante foi
observado por Smanioto et al30 que também
encontraram todas as amostras de frutas de
acordo com o padrão da legislação.
Para as hortaliças, a contagem de coliformes
a 35 °C variou de < 3 a > 1,1 x 10³ NMP/g.
Essa contagem foi menor do que as detectadas
por Arbos et al31 que encontraram variação
de < 3 a ≥ 2,4 x 10³ NMP/g em hortaliças
orgânicas. Os coliformes a 45 °C foram
encontrados em cebolinha, manjericão e salsa.
A contagem máxima de coliformes 45 °C em
hortaliças estabelecida pela legislação vigente é
de 1 x 10² UFC/g, portanto, a amostra de salsa
encontra-se com contagem acima do permitido
e consequentemente imprópria para o consumo.
Em estudos realizados por Maffei et al³, Arbos
et al31 e Abreu et al32, observou-se que hortaliças
orgânicas apresentavam contagem de coliformes
45 °C superior ao exigido pela legislação.
A presença de Salmonella spp. foi detectada
na amostra de salsa, o que está em desacordo
com o exigido pela legislação brasileira vigente10.
A presença deste patógeno é inaceitável em
alimentos devido ao alto risco para a saúde.
Resultados semelhantes foram encontrados por
Arbos et al31 que detectaram presença de Salmonella
em amostras de alface e cenoura provenientes
do cultivo orgânico. Outros estudos conduzidos
no Brasil, também detectaram a presença deste
patógeno em vegetais33-35. Em estudo realizado por
Maffei et al³ ao avaliar a qualidade microbiológica
de frutas e hortaliças orgânicas comercializadas
em Araraquara/SP não foi detectada a presença
de Salmonella spp. nas amostras. Machado et al35
ao avaliar frutas e hortaliças orgânicas submetidas
a diferentes processos de adubação também
não encontraram esse patógeno nas amostras.
Alimentos comercializados como orgânicos
devem atender a especificações exigidas para
a certificação, a qual não admite que o esterco
animal seja usado antes de sua correta
compostagem31.
Ao término do trabalho foram desenvolvidas
atividades de orientação com a finalidade de
esclarecer os cuidados higiênico-sanitários
adequados para a comercialização de alimentos
e as boas práticas. Além disso, é preciso que os
órgãos responsáveis fiscalizem as feiras e
contribuam para tornar o ambiente das feiras
mais adequado e sem riscos para a saúde do
consumidor.
CONCLUSÃO
As condições higiênico-sanitárias de venda
dos alimentos foram classificadas como regulares,
sendo as maiores inadequações vistas nos itens
de abastecimento de água e higiene dos
manipuladores, que podem favorecer a
contaminação dos alimentos. É necessário que
sejam feitas várias ações como disponibilização
de banheiros e locais para higiene de mãos,
instrução quanto aos materiais adequados para
construção das barracas e orientação geral sobre
as boas práticas na manipulação dos alimentos.
Apesar do baixo número de amostras
analisadas, a maioria mostrou-se em acordo com
o padrão microbiológico estabelecido pela
legislação vigente que estabelece o máximo de
100 UFC/g para coliformes a 45 °C e ausência
de Salmonella em 25 g da amostra. Apesar do
baixo número de amostras impróprias para o
consumo, são importantes ações que visem o
controle das possíveis fontes de contaminação
dos alimentos desde o campo até o momento da
comercialização.
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419
Qualidade microbiológica do alho (Allium sativum)
produzido e comercializado em mercados públicos
Microbiological quality of garlic (Allium sativum) produced and
sold in public markets
RIALA6/1676
Luiza Mayara dos Santos Fontenele1, Maria Liliane Ximendes Azevedo1, Francisco das
Chagas Cardoso Filho1*, Maria Christina Sanches Muratori2, Leonel Rômulo Souza de Sá3,
Maria Marlucia Gomes Pereira2
*Endereço para correspondência: 1Núcleo de Estudos, Pesquisa e Processamento de Alimentos,
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Piauí. Campus Ministro Petrônio Portela, Teresina,
PI, Brasil. CEP: 64049-550. Tel/Fax: 86 3215- 5754. E-mail: veteriná[email protected]
1
Pós-graduação em Ciência Animal, Universidade Federal do Piauí
2
Departamento de Morfofisiologia Veterinária, Universidade Federal do Piauí
3
Faculdade Associação de Ensino Superior do Piauí
RESUMO
Considerado um alimento funcional, o alho colabora na melhoria do metabolismo e na prevenção
de problemas de saúde. Seu principal composto, a alicina, é responsável pela maioria das propriedades
farmacológicas, antioxidantes e antibióticas, além de combater bactérias e fungos. Objetivou-se
avaliar a qualidade higiênica e sanitária do alho oriundo da microrregião de Picos/PI. Foram
coletadas 35 amostras de alho produzido em Picos e 15 amostras do alho importado exposto à
venda no mercado da cidade e encaminhadas ao Laboratório NUEPPA/UFPI. Para efetuar as
análises seguiu-se a Instrução Normativa 62. Com relação a coliformes totais e termotolerantes,
as amostras de alho não apresentaram diferença significativa. Em amostras de ambas as
procedências, foram encontrados os gêneros fúngicos Absidia spp, Alternaria spp, Aspergillus spp,
Chrysonilia spp, Cladosporium spp, Moniliella spp e Penicillium spp. As amostras produzidas em
Picos apresentaram condições higiênicas e sanitárias satisfatórias; e das importadas, apenas uma
apresentou condições insatisfatórias. No entanto, vale destacar a presença de gêneros fúngicos,
o que sugere maior atenção no armazenamento e conservação.
Palavras-chave. bactérias, bolores, condimentos, fungos toxígenos, micro-organismos.
ABSTRACT
Considered as a functional food, the garlic contributes for improving the metabolism and for
preventing the health problems. Allicin, its main compound, is responsible for the majority of
pharmacological, antioxidant and antibiotic properties, and for combating fungiand bacteria.
The objective of this work was to assess the hygienic and sanitary quality of garlic originated from
the micro-region of Picos/PI. For conducting this study, the following samples were collected:
35 garlic specimens produced in Picos, and 15 imported garlic samples for sale at the town
market and sent to the NUEPPA/UFPI Laboratory. The analyses were performed by following the
Normative Instruction 62. Regarding to the total and thermotolerant coliforms, the garlic samples
showed no statistical difference. The presence of fungi of the genus Absidia spp, Alternaria spp,
Aspergillus spp, Chrysonilia spp, Cladosporium spp, Moniliella spp and Penicillium spp were detected
in samples from the both sources. The samples produced in Picos showed satisfactory hygienic
and sanitary conditions. Among the imported garlic samples, only one showed unsatisfactory
conditions. Nevertheless, it is worth to remark the occurrence of different fungi genera in the analyzed
samples, which suggests that it needs a substantial attention in the foods storage and preservation.
Keywords. bacteria, molds, condiments, toxigenic fungi, microorganisms.
420
Fontenele LMS, Azevedo MLX, Cardoso Filho FC, Muratori MCS, Sá LRS, Pereira MMG. Qualidade microbiológica do alho (Allium sativum)
produzido e comercializado em mercados públicos. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):420-5.
INTRODUÇÃO
O alho é um alimento utilizado tanto na
cura de doenças como na culinária, podendo
ser usado de várias formas por possuir vários
nutrientes, destacando-se os altos teores de
zinco, selênio e alicina, óleo volátil sulfuroso
que caracteriza seu forte odor1.
Por ser considerado um alimento funcional,
o alho colabora para melhorar o metabolismo
e prevenir problemas de saúde. Seu principal
composto, a alicina é responsável pela maioria
das propriedades farmacológicas, antioxidantes e
antibióticas, contra bactérias, fungos e vírus2.
O Brasil é um dos países que mais consome
alho, sendo principalmente comercializado na
forma in natura, embora se observe crescimento
gradativo do consumo de pastas e outros
derivados do alho3. O consumo de alho pelos
brasileiros cresceu de 166 mil toneladas para
308 mil toneladas entre 1996 e 20124. Em várias
regiões do Nordeste há condições propícias ao
seu cultivo, desde que sejam supridas as
necessidades hídricas da cultura, por meio de
irrigação5.
Há
muito
tempo,
os
temperos
industrializados
vêm
sendo
amplamente
consumidos, principalmente pela população
urbana; entretanto, sua qualidade não pode ser
facilmente avaliada pelo consumidor no ato
da compra6. O uso dos condimentos estimulou
a importação, porém estes produtos podem
chegar ao consumidor com baixa qualidade
devido à perda de seus óleos essenciais voláteis,
à contaminação por micro-organismos ou
infestação por insetos7.
Os condimentos, sob o ponto de vista
microbiológico, em condições de umidade
e temperatura adequadas, podem favorecer
o desenvolvimento de fungos filamentosos ou
outros micro-organismos que propiciam a
deterioração do alimento e podem ocasionar
transtornos à saúde do consumidor. No entanto,
alguns condimentos apresentam atividade
antimicrobiana, o que pode ajudar na conservação
de alimentos, enquanto outros estimulam
o metabolismo microbiano e tornam mais
rápida a alteração e/ou síntese de toxinas8.
Desta
forma,
a
contaminação
fúngica
pode acarretar perdas econômicas, seja pela
alteração dos produtos, como pela redução
da sanidade devido a possível contaminação
por micotoxinas9, as quais correspondem a
produtos do metabolismo secundário de
alguns
fungos
toxígenicos;
micotoxinas
podem ser carcinogênicas, teratogênicas e/ou
imunossupressores, podendo causar efeitos tanto
em animais como em humanos que consomem
alimentos contaminados10.
Condimentos podem ser contaminados
na sua origem, estocagem, transporte ou
mesmo durante a manipulação, por esporos
bacterianos, bolores e leveduras. Por outro
lado, o armazenamento em galpões velhos,
úmidos, mal ventilados, com paredes cobertas
de bolores, propiciam a multiplicação das
espécies contaminantes e/ou a invasão por
novas espécies a partir do ambiente. A perda
de qualidade dos condimentos traduz-se por
diminuição das propriedades sensoriais como
cor, odor e sabor11.
Sabe-se que a contaminação, principalmente
por micro-organismos patogênicos representa
grande risco à saúde dos consumidores, devido
à possibilidade de toxinfecções de origem
alimentar.
Como
os
condimentos
são
adicionados a outras preparações, quando
estão contaminados acabam por elevar a carga
microbiana presente nestes outros alimentos12.
A estabilidade de alguns alimentos, diante
do possível ataque por micro-organismos,
deve-se a presença de substâncias naturais que
apresentam atividade antimicrobiana como a
alicina no alho. Por mais saborosos que sejam
os condimentos, sobretudo ao proporcionar
o incremento das propriedades sensoriais
dos alimentos, elas não são, de todo, isentas de
efeitos nocivos à saúde13.
Segundo
agricultores
locais,
poucos
municípios próximos a Picos ainda cultivam
alho e, considerando tratar-se de um condimento
produzido, comercializado e consumido no Brasil
aumenta a importância de estudos que avaliem
a qualidade microbiológica do alho produzido
no país, assim como do alho que chega de
fora do Brasil. No Piauí, parte da população
421
adquire seus alimentos nos mercados públicos,
onde os condimentos ficam expostos à venda em
caixotes de madeira ou de papelão empilhados,
de modo a permitir que o consumidor possa
tocar e cheirar o produto antes da compra,
prática que favorece que os alimentos entrem
em contato com propágulos fúngicos. Devido
à importância dos condimentos para a
alimentação local e por não haver estudos sobre
a possível contaminação fúngica neste produto
comercializado nos mercados públicos piauiense,
objetivou-se avaliar a qualidade higiênico-sanitária
de amostras de alho oriundas da microrregião
de Picos/PI.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletadas 35 amostras do alho
produzido na microrregião de Picos e 15 amostras
do alho importado e exposto a venda no mercado
da cidade de Picos/PI, entre os meses de fevereiro
a junho de 2013. Cada amostra apresentou
aproximadamente 100 gramas, tendo sido
devidamente acondicionadas em sacos plásticos
e encaminhadas ao Laboratório do Núcleo
de Estudos, Pesquisas e Processamento de
Alimentos do Centro de Ciências Agrárias, da
Universidade Federal do Piauí (NUEPPA/UFPI).
Para a realização das análises, seguiu-se
o descrito na Instrução Normativa 6214. Foram
pesadas assepticamente 25 g de cada amostra,
as quais foram transferidas para frasco contendo
225 mL de água peptonada a 0,1 %, formando
a diluição inicial (10-1). A partir desta diluição
inicial, foram preparadas diluições decimais
seriadas até 10-3. Alíquotas de 1,0 mL de cada uma
das três diluições foram transferidas para placas
de Petri (em duplicata) e adicionados 20 mL de
ágar padrão para contagem, para a enumeração
de bactérias mesófilas, seguido de incubação a
37 oC, por 48 h.
Para coliformes totais e termotolerantes,
alíquotas de 1,0 mL de cada uma das três
diluições foram transferidas para uma série de
3 tubos contendo o caldo Lauril Sulfato Triptose
(LST), seguido de incubação a 37 °C, por 48 h.
Decorrido o período de incubação, os tubos
que apresentaram turvação do meio e produção
422
de gás no interior dos tubos de Durham
foram considerados positivos e a partir destes,
transferiu-se uma alçada para tubos contendo
Caldo Bile Lactose Verde Brilhante e para tubos
contendo caldo EC, que foram incubados a 37 °C
e 45 °C respectivamente, durante 24 a 48 h.
Fez-se a contagem dos tubos positivos e negativos
e utilizou-se a tabela de NMP para calcular o
“Número Mais Provável” de coliformes por grama.
Para verificar a presença de Salmonella spp.
nas amostras, seguiu-se como descrito na
Instrução Normativa 6214. Foi realizada a
incubação a 37 oC por 24 h, de 25 g de cada
amostra adicionados a 225 mL de água
peptonada. O enriquecimento seletivo foi
realizado nos meios líquidos seletivos, caldo
Rappaport Vassiliadis e caldo selenito-cistina.
Para bolores e leveduras, foram adicionadas
alíquotas de 0,1 mL na superfície do meio de
cultivo Dichloran Rose Bengal Cloranfenicol
(DRBC)15, incubadas a 25 oC por sete dias,
sendo as contagens realizadas nas placas
que apresentaram entre 10 a 150 UFC16,17.
Após a contagem, as colônias de bolores
foram identificadas quanto ao gênero pelas
características macroscópicas e microscópicas,
fazendo-se a prevalência dos gêneros15.
Após a obtenção dos resultados foi realizada
análise de variância e teste de normalidade,
depois as médias foram comparadas pelo teste
Mann-Whitney (p < 0,05).
As condições de venda dos alimentos
nos mercados pesquisados eram precárias. O alho
era exposto em caixotes de madeiras e/ou caixas
de papelão empilhados, que permaneciam sob
luz direta do sol, e os consumidores tinham
livre acesso aos produtos, onde esses
eram comercializados a granel e podiam ser
manipulados pelos mesmos. Foi observada no
local a presença de animais como cães, gatos,
pombos e pequenos pássaros. Além do alho,
eram
comercializados
pimentas,
corantes
naturais, frutas e verduras.
Os resultados obtidos na contagem de
bactérias mesófilas, coliformes e fungos estão
representados na Tabela 1, onde se pode observar
que não houve diferença significativa na
contaminação entre o alho produzido em Picos
e o alho de importação. Com relação a fungos
filamentosos, houve diferença estatisticamente
significativa entre as amostras, onde o alho
produzido em Picos mostrou contagem maiores
em relação ao alho de importação.
Tabela 1. Contagem microbiana verificada no alho produzido e de importação, comercializados na microrregião de Picos, PI
Micro-organismo
Alho produzido em Picos
Alho importado
2,08ª ± 0,47
0,17ª ± 0,43
0,13 ª ±- 0,37
1,52ª ± 0,66
0,15ª ± 0,48
2,01ª ± 0,28
0,48 ª ± 0,83
0,26ª ± 0,65
0,93b ± 0,80
0,11ª ± 0,44
Bactérias Mesófilas (UFC/g)
Coliformes Totais (NMP/g)
Coliformes Termotolerantes (NMP/g)
Fungos Filamentosos (UFC/g)
Fungos Leveduriformes (UFC/g)
: letras iguais em coluna A, B: letras iguais em linhas, resultados semelhantes (p < 0,001). UFC/g: Unidade Formadora de Colônia por grama;
NMP/g: Número mais provável por grama
a, b
Quando presente em um alimento, as
bactérias aeróbias mesófilas indicam a qualidade
higiênica e sanitária na qual o alimento foi
processado, como as condições da matéria prima,
as condições higiênicas durante o processamento
a eficácia dos processamentos tecnológicos,
as condições sanitárias dos equipamentos e
utensílios, a vida de prateleira e o tempo de
armazenamento e distribuição dos alimentos.
Foram encontrados 9,2 x 102 UFC/g de
bactérias aeróbias mesófilas nos alhos produzidos
em Picos e 3,2 x 102 UFC/g em alho de
importação. Leite et al18, em amostras de temperos
caseiros, encontraram bactérias mesófilas em
maior quantidade nas amostras estudadas (3,5
x 103 UFC/g). Já Carvalho et al6, em amostras de
alho e sal comercializados em Juiz de Fora/MG,
observaram médias variando de 1,30 a 5,80,
valores semelhantes ao encontrados nas amostras
de alho produzido em Picos e de importação.
A salmonelose é um problema de saúde
pública comum e economicamente importante,
sendo considerada como o principal agente
envolvidos em surtos de origem alimentar
responsável por 35 % dos casos de DTA que
causaram internação. No Brasil, é a principal
causa de surtos, sendo as regiões sul e sudeste
as
que
mais
notificam
ocorrências19,20.
Nenhuma das amostras avaliadas neste estudo
apresentou ocorrência de Salmonella spp.,
indicando condições higiênica e sanitária
satisfatórias21. O mesmo resultado foi descrito por
Leite et al18 em amostras de temperos caseiros.
Foi detectada a presença de coliformes
em 11 amostras (22 %) analisadas, sendo em
maior quantidade em alho de importação.
A legislação vigente estabelece a tolerância para
amostra indicativa de até 10² NMP/g, portanto
os resultados obtidos para coliformes totais e
termotolerantes são considerados aceitáveis para
a maioria das amostras analisadas, com exceção
de apenas uma amostra que apresentou contagem
> 1100 (NMP/g), proveniente do alho de
importação21.
Leite et al18, em estudo com temperos
caseiros de Feira de Santana, observaram
contagens para coliformes fecais maiores que
0,3 NMP/g. Já Berbariet al22, em estudo com pasta
de alho, observaram contagens para coliformes
fecais maiores que 0,3 NMP/g em diversas
amostras e, para bolores e leveduras maiores
que 102UFC/g, sendo tais valores próximos aos
encontrado sem alho de importação, onde foram
observadas contagens para leveduras de 5,0 x 101
UFC/g e de bolores de 3,8 x 102 UFC/g, enquanto
que e nas amostras adquiridas no mercado de Picos,
foram observadas contagens de 1,3 x 102 UFC/g de
leveduras e 1,8 x 102 UFC/g de bolores. Silva et al23,
das 36 amostras de condimentos analisados,
28 (77,77 %) apresentaram resultados positivos
para fungos, onde verificou-se valores variando
de 8,6 × 103 a 1,3 × 105 UFC/g, não havendo
diferença significativa entre eles. Já Carvalho et
al6 em amostras de alho e sal comercializados em
423
Juiz de Fora/MG, observaram médias variando
de 1,00 a 4,36 UFC/g, valores semelhantes ao
encontrados nas amostras de alho produzido
em Picos e maiores quando comparados ao alho
de importação. Assim, a presença de fungos
viáveis e em índices elevados nos alimentos
indica condições higiênicas deficientes ou
multiplicação no produto durante estocagem.
Sendo considerados de grande importância na
determinação da qualidade da matéria-prima.
Os gêneros Aspergillus, Fusarium e
Penicillium são os mais importantes e os mais
frequentemente encontrados em alimentos,
além de serem potencialmente produtores de
micotoxina10. Tanto em amostras adquiridas nos
mercados de Picos PI, como nas amostras de
importação, foi possível isolar diversos gêneros,
entre os quais Aspergillus e Penicillium (Tabela 2).
Tabela 2. Gêneros fungicos encontrados no alho produzido e
de importação, comercializados na microrregião de Picos, PI
Gênero
Absidia spp.
Alternaria spp.
Aspergillus spp.
Chrysonilia spp.
Cladosporium spp.
Fusarium spp.
Moniliella spp.
Penicillium spp.
Total
Alho produzido
em Picos
6 (6,89 %)
11 (12,64 %)
19 (21,83 %)
5 (5,74 %)
21 (24,13 %)
6 (6,89 %)
3 (3,44 %)
16 (18,39 %)
87 (100 %)
Alho
importado
1 (4,54 %)
2 (9,09 %)
7 (31,81 %)
2 (9,09 %)
7(31,81 %)
0 (0,00 %)
1 (4,54 %)
2 (9,09 %)
22 (100 %)
Silva et al23, em amostras de condimentos
provenientes das feiras livres e dos supermercados
de Teresina/PI, observaram a ocorrência de
Aspergillus como gênero predominante, seguido
de Penicillium, e em menor quantidade Fusarium
e Absidia. Gêneros também encontrados por
Souza et al24, em amostras de condimentos
artesanais e industrializados de Recife/PE.
As condições de manipulação das amostras
podem ter influenciado na contaminação,
portanto, deve-se ter cuidado no armazenamento
e a manipulação desses produtos, assim como
medidas higiênicas devem ser implantadas para
424
reduzir a contaminação microbiana e aumentar
a segurança dos consumidores. Vale ressaltar
que embora a contagem possa ser considerada
baixa, foi observado um número significativo
de diferentes gêneros presente nas amostras,
o que requer uma maior atenção no seu
armazenamento, contribuindo para uma melhor
conservação do produto.
CONCLUSÃO
As amostras de alho analisadas proveniente
da microrregião de Picos-PI apresentaram
condições higiênicas e sanitárias satisfatórias.
Porém, uma amostra de alho importado
apresentou condições higiênicas e sanitárias
insatisfatórias. No entanto, vale destacar a
presença dos gêneros fúngicos encontrados,
sugerindo maior atenção no armazenamento e
conservação.
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425
Parâmetros de qualidade de polpas de frutas congeladas
Parameters of quality of frozen fruit
RIALA6/1677
Tânia Maria Neves CASTRO1, Pâmella Volpato ZAMBONI2, Silvia DOVADONI1, Adelino
CUNHA NETO1, Luiz José RODRIGUES1*
*Endereço para correspondência: 1Departamento de Alimentos e Nutrição (DAN), Faculdade
de Nutrição (FANUT), Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). Av. Fernando Corrêa
da Costa, 2367, Bloco CCBS I, Bairro Boa Esperança, Cuiabá, MT, Brasil. CEP: 78060-900.
Tel: 65 3615-8811. E-mail: [email protected]
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso (IFMT), Campus Bela Vista,
Cuiabá, MT
2
RESUMO
Neste trabalho foram avaliadas as qualidades microbiológica, física e química de polpas de
frutas congeladas de diferentes sabores e marcas, comercializadas no município de Cuiabá – MT.
O experimento foi conduzido em DIC, disposto em um arranjo fatorial 3 x 2, em amostras de
três marcas (X, Y e Z) de dois períodos de coletas (junho/2014 e outubro/2014), e em triplicata.
Foram realizadas análises de: coliformes a 35 oC e a 45 oC, Salmonella spp., fungos filamentosos e
leveduras, cor (L*a*b*), pH, acidez titulável, sólidos solúveis, ratio e vitamina C. Todas as amostras
de polpas de frutas congeladas analisadas, independentemente do sabor, da marca e do período de
coleta, não apresentaram contagens de coliformes a 35 oC e a 45 oC, tampouco houve isolamento
de Salmonella spp.; e baixas contagens de fungos filamentosos e leveduras foram detectadas. Houve
variações dos valores de cor (L*a*b*), pH, acidez titulável, sólidos solúveis, ratio e vitamina C entre
as marcas e os períodos de coletas em todas as amostras de polpas de frutas analisadas. Algumas
amostras de polpas demonstraram valores fora dos limites preconizados pela IN nº 1 de 7 de janeiro
de 2000 do MAPA, que indicaram padrões de identidade e de qualidade deficientes.
Palavras–chave. refrigeração, microbiota contaminante, parâmetros físicos e químicos.
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the microbiological, physical and chemical qualities
of frozen fruit pulp of different flavors and brands, marketed in the city of Cuiabá - MT.
The experiment was conducted in DIC, arranged by a 3 x 2 factorial scheme, using samples from
three brands (X, Y and Z) and from two sample collecting periods (June/2014 and October/2014)
and in triplicate. The following analyses were performed: coliforms at 35 oC and 45 45 oC, Salmonella,
yeasts and molds, color (L*a*b*), pH, titratable acidity, soluble solids, ratio and vitamin C.
All of the analyzed frozen fruit pulp samples, regardless of the flavor, the brand and the sampling
period, none of them showed coliforms at 35 oC and 45 oC, and no Salmonella either; and low counts
of filamentous fungi and yeasts were found. Variations on the color (L*a*b*), pH, titratable acidity,
soluble solids, ratio and vitamin C values were found among the brands and sampling periods of all
of the analyzed fruit pulps samples. Some samples showed values which did not follow the limits
prescribed by the NI nº 1 of 7 January 2000 of the MAPA, indicating unsatisfactory identity and
quality standards.
Keywords. refrigeration, microbial contaminants, physical and chemical parameters.
426
Castro TMN, Zamboni PV, Dovadoni S, Cunha Neto A, Rodrigues LJ. Parâmetros de qualidade de polpas de frutas congeladas. Rev Inst
Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):426-36.
INTRODUÇÃO
Apesar do crescimento do mercado de
polpas de frutas congeladas, a qualidade desses
produtos não acompanha essa tendência,
fato esse que vem alertando várias entidades
públicas e órgãos governamentais, na busca de
produtos mais saudáveis sob o ponto de vista
biológico e sem alterações pronunciadas em
suas características sensoriais, evidenciadas por
modificações nos seus parâmetros químicos
e bioquímicos, em virtude, provavelmente,
de problemas decorrentes de deficiências na
matéria-prima, no processamento e/ou no
armazenamento do produto1.
A produção de polpas de frutas
congeladas surge como excelente alternativa no
aproveitamento do excedente desses vegetais,
podendo ser elaborada nas épocas de safra e
permitindo a oferta das polpas nos períodos
de entressafra, evitando os problemas ligados
à sazonalidade.
De acordo com o Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), polpa é o
produto não fermentado, não concentrado ou
diluído, obtido pelo esmagamento de frutos
polposos2. Além disso, devem ser preparadas
com frutas sãs, limpas, isentas de matéria terrosa,
de parasitas e detritos de animais ou vegetal.
Não deverão conter fragmentos das partes não
comestíveis da fruta, nem substâncias estranhas
à sua composição normal, devendo ser observada
também a presença ou ausência de sujidades,
parasitas e larvas.
A conscientização do consumidor quanto
às vantagens de uma alimentação saudável
baseada em uma dieta rica em frutas, com alto
valor nutricional e ampla variedade de sabores,
têm incrementado a demanda de polpa de
frutas congeladas no mercado, além de embalagens
práticas congeláveis, dispensando uso de aditivos
químicos, preservando as propriedades originais
da fruta, igualando a alimentação saudável à
praticidade que os tempos modernos exigem3.
A qualidade da polpa congelada está
relacionada à preservação dos nutrientes e
às suas características microbiológicas, físicas,
químicas e sensoriais, que devem ser próximas
da fruta in natura, de forma a atender as
exigências do consumidor e da legislação vigente.
Tais características não podem ser alteradas pelos
equipamentos, utensílios, recipientes e embalagens
utilizadas durante o seu processamento e
comercialização4.
Os requisitos microbiológicos são alvos a
serem considerados na qualidade de polpas de
frutas congeladas, a fim de se avaliar a presença
de micro-organismos, condições de higiene em
que os alimentos são preparados, os riscos que
o alimento pode oferecer à saúde do consumidor
e a vida prateleira do produto.
O controle de qualidade, no que diz
respeito aos parâmetros físicos e químicos
de polpas de frutas congeladas, como cor, pH,
sólidos solúveis, acidez titulável e vitamina C,
também devem ser considerados, uma vez que
são muito importantes na padronização do
produto e na análise de alterações ocorridas
durante o processamento e o armazenamento.
A cadeia de frio para polpas de frutas
congeladas deve ser respeitada, de modo a
não comprometer a qualidade do produto,
preservando suas qualidades sensoriais (aroma,
cor, sabor e consistência), prevenindo o
desenvolvimento de microrganismos deteriorantes
e a ocorrência de reações químicas e enzimáticas
indesejáveis5.
Nesse contexto, o presente trabalho
teve como objetivo avaliar a qualidade
microbiológica, física e química de polpas de
frutas pasteurizadas e congeladas, coletadas em
diferentes períodos, de marcas processadas em
diferentes regiões do Brasil e comercializadas no
município de Cuiabá – MT.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção das amostras
Para a condução da pesquisa foram
amostradas diferentes marcas comerciais de
polpas de frutas pasteurizadas e congeladas,
provenientes de indústrias localizadas em três
estados do Brasil (Bahia, Mato Grosso e Paraná).
As amostras foram adquiridas, em triplicata, nos
meses de junho de 2014 (1ª coleta) e outubro de
2014 (2ª coleta), em diferentes estabelecimentos
427
comerciais da cidade de Cuiabá, Mato Grosso,
Brasil.
As amostras foram transportadas em
suas embalagens originais e íntegras, em caixa
térmica para o Laboratório de Tecnologia de
Alimentos, da Faculdade de Nutrição - FANUT,
da Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT,
Cuiabá – MT, sendo mantidas congeladas em
freezer vertical na temperatura de -18 oC, para
posteriores análises.
O experimento foi conduzido em
delineamento inteiramente casualizado (DIC),
disposto em um arranjo fatorial 3 x 2, ou seja,
3 níveis do fator marcas (X, Y e Z) e 2 níveis do
fator períodos de coletas (Junho/2014 e
Outubro/2014), com 3 repetições. As polpas de
frutas congeladas das diferentes marcas, foram
coletadas nos sabores acerola, goiaba e maracujá,
sendo que para resguardar a identidade das
empresas avaliadas, estas foram identificadas pelas
letras X, Y, e Z. Cada amostra foi identificada
quanto à origem, número do lote, data de fabricação
e data de validade, procurando reunir as mesmas
características em cada período de coleta. A parcela
experimental foi representada por 3 embalagens de
100 g, analisadas em sistema de pool (homogenato
das três amostras da parcela experimental,
de mesma marca, sabor, lote e coleta), perfazendo
um total de 54 amostras.
Previamente às análises, as amostras
foram descongeladas nas embalagens originais
do produto, em geladeira (2-5 ºC) por 18 horas,
em seguida, as amostras foram homogeneizadas
por agitação e deixadas em repouso para
estabelecer o equilíbrio com a temperatura
ambiente.
Assepticamente se retirou uma alíquota de
25 g de polpa que foram inclusas em 225 mL de
solução salina peptonada 0,1 % (p/v) esterilizada,
contida em saco plástico estéril para Stomacher
de 720 mL (Hexis Cientifica® S/A, Brasil) e
processadas em homogeneizador de amostras
Stomacher (Marconi®, Brasil), durante 60 segundos.
Posteriormente diluídas 10, 100 e 1000 vezes,
para análise de coliformes e fungos. Todas as
análises foram realizadas segundo a Internacional
428
Commission on Microbiological Specification for
Foods Method - ICMSF6 e Silva et al7.
Os coliformes, 35 ºC e 45 ºC, foram
determinados através de análise de tubos
múltiplos com séries de três tubos de caldo
lauril sulfato triptose (Himedia®, Mumbai, Índia),
análise presuntiva, confirmatória em caldo
verde brilhante bile a 2 %, e caldo Escherichia
coli (Himedia®, Mumbai, Índia), incubados pelo
período de 24/48 horas, e os resultados expressos
em log NMP.g-1, (ICMSF6 e Silva et al7).
A enumeração de fungos filamentosos
e leveduras foi realizada utilizando-se o
método contagem direta por plaqueamento
em profundidade e os resultados expressos em
log UFC.g-1.
Pesquisa de Salmonella spp. compreendeu
três fases: pré – enriquecimento em água
peptonada tamponada (Himedia®, Mumbai, Índia),
enriquecimento seletivo em caldo de RappaportVassiliadis (RV) de caldo tetrationato (TT),
(Himedia®, Mumbai, Índia), e o isolamento
diferencial em Rambach agar (Merck®, Alemanha),
e agar verde brilhante (Himedia®, Mumbai, Índia),
as colônias suspeitas Salmonella foram submetidas
a provas bioquímicas para identificação (ICMSF8
e Silva et al.9).
Análises físicas e químicas
Os valores das coordenadas de cor
das polpas de frutas foram determinados com o
auxílio do colorímetro Minolta, modelo CR-400,
com iluminante D65 e no sistema CIE L*a*b*.
As leituras dos valores L*, a* e b* foram feitas
de forma aleatória nos lados opostos das três
embalagens dos produtos de cada repetição.
As análises de acidez titulável (AT), pH e
sólidos solúveis (SS) foram realizadas na polpa
sem diluição e após o seu descongelamento.
A determinação de AT (% de ácido cítrico)
foi realizada por titulação com solução de
NaOH 0,1 N, utilizando como indicador a
fenolftaleína10. Os SS foram determinados por
refratometria, utilizando-se refratômetro digital,
marca RR 11 - Nr 1950111.
A determinação do ratio foi realizada pela
relação entre sólidos solúveis e acidez titulável,
feita por meio da operação algébrica de divisão de
valores encontrados para essas variáveis, segundo
a técnica estabelecida nas Normas Analíticas
do Instituto Adolfo Lutz10, sendo os resultados
expressos em números absolutos.
A determinação do teor de vitamina C
seguiu as recomendações do Instituto Adolfo
Lutz10, pelo método volumétrico de Tillmans,
com os resultados expressos em miligramas de
ácido ascórbico por 100 g de polpa de fruta.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o
auxílio do programa estatístico SISVAR 4.312.
Após a análise de variância dos resultados
obtidos, observou-se o nível de significância do
teste F. As médias dos tratamentos, quando
significativas, foram comparadas pelo teste de
Scott-Knott, a 5 % de probabilidade.
As 54 amostras avaliadas se apresentaram
dentro dos limites da Resolução RDC nº 12, de
02 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), que preconiza para
polpas de frutas congeladas, limite máximo de 5 x
102 NMP/g (2,7 ciclos log) para coliformes a 45 °C
e ausência de Salmonella spp. em 25 g do produto13,
independentemente do sabor, da marca e do período
de coleta.
A ausência da contagem de micro-organismos
do grupo dos coliformes e de Salmonella spp.
nas polpas de frutas está associada à qualidade
satisfatória do produto, que se dá, possivelmente,
por meio de adequada aplicação das técnicas
de processamento e/ou armazenamento. Outros
autores apresentaram resultados semelhantes13-15,
indicando que esse comportamento se deve
à manipulação correta da matéria prima no
processamento das polpas de frutas congeladas.
A RDC nº 12, de 2001 da ANVISA13,
não estabelece limites para fungos filamentosos
e leveduras, contudo, o MAPA, por meio da
Instrução Normativa nº 1, de 7 de janeiro de
2000, limita esses microrganismos numa
contagem de 2 x 103 UFC/g (log 3,30 UFC/g)
para polpa de fruta que sofreu tratamento térmico
e/ou conservada quimicamente4. Considerando
os valores encontrados para essa variável no
presente trabalho (Tabela 1), todas as amostras
analisadas estão dentro dos limites preconizados.
As baixas contagens de fungos filamentosos
e leveduras em alimentos frescos e congelados
são consideradas normais, enquanto que,
elevados valores representam, além do aspecto
deteriorante, que resulta em rejeição do produto
pelo consumidor, riscos à saúde pública devido
à possível produção de micotoxinas por algumas
espécies de fungos, podendo crescer e produzir
toxinas em alimentos submetidos a processos
tecnológicos, devido a sua resistência ao
calor, ao congelamento, alguns antibióticos e
irradiação15. É importante ressaltar ainda, que
estratégias de sanitização e condições adequadas
de temperatura na conservação das polpas
reduzem sua microbiota normal, além das
temperaturas de pasteurização, que controlam
o crescimento de alguns patógenos, acreditando
que essas ações influenciaram no controle da
microbiota das polpas de frutas analisadas
nesse trabalho. As polpas de frutas contêm
altos teores de água e de açúcares, o que
favorece o desenvolvimento microbiano, mas a
pasteurização mostrou-se eficiente em inibir o
crescimento de fungos filamentosos e leveduras.
As contagens de fungos filamentosos
e leveduras estavam abaixo do limite máximo
aceitável4, no entanto, podemos observar
nos resultados encontrados que estes microorganismos foram afetados significativamente
(p ≤ 0,05), pela interação períodos de coleta:
junho/2014 (outono) e outubro/2014 (inverno)
entre as marcas (X, Y e Z) das polpas de frutas
congeladas (Tabela 1). As polpas da marca
X, proveniente da região Sul, apresentaram
contagens maiores no 1° período de coleta,
sendo exceção a polpa de acerola com contagens
elevadas no 2° período. As polpas de frutas das
marcas Y e Z mostraram uma homogeneidade de
elevadas contagens no 1° período em relação ao
2º, marcas correspondentes às regiões CentroOeste e Nordeste, respectivamente. Observando
as contagens destes micro-organismos em
relação aos sabores, verifica-se que nas polpas
de goiaba e acerola produzidas pelo fabricante Y
429
Tabela 1. Valores médios de fungos filamentosos e leveduras (log UFC.g-1) de marcas de polpas de frutas congeladas coletadas em
diferentes períodos
Polpas de frutas
Acerola
Goiaba
Maracujá
CV (%)
MAPA***
Fungos filamentosos e leveduras (log UFC.g-1)
Períodos de coletas
Jun/2014
Out/2014
0,54bA
1,57cB
0,37aB
0,20bA
0,69cB
0,11aA
0,82bB
0,70cA
0,12aA
0,09bA
1,10cB
0,03aA
0,48aB
0,44cA
0,63bB
0,26bA
1,46cB
0,10aA
Marcas
X
Y
Z
X
Y
Z
X
Y
Z
3,82
Máximo de 2 X 103 UFC.g-1 (log 3,30 UFC.g-1)
*Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna, representam semelhança estatística entre as marcas (X, Y e Z), a 5 % de probabilidade,
pelo teste de Scott-Knott; **Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha, representam semelhança estatística entre os períodos de coleta
(Junho/2014 e Outubro/2014), a 5 % de probabilidade, pelo teste de Scott-Knott; ***MAPA, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
- Instrução Normativa nº 1, de 7/01/2000
foram detectadas baixas contagens, tanto no 1°,
quanto no 2o período de coletas (Tabela 1).
Segundo o CPTEC/INPE (Centro de Previsão do
Tempo e Estudos Climáticos/Instituto de Pesquisa
Espacial), na região nordeste, na estação do
outono há um aumento nas chuvas e diminuição
na temperatura, na primavera acontece à seca
e a manutenção de temperaturas elevadas nesta
região. Nas regiões sul e centro-oeste, no outono
apresentam baixos índices pluviométricos,
e baixas temperaturas, na primavera chuvas
intensas no centro-oeste e intermitentes no sul,
com uma elevação gradativa na temperatura
(CPTEC/INPE16). Talvez estes fatores associados
às condições de higiene ambiental influenciem
nas contagens, justificando assim os resultados
obtidos pelo fabricante Y nos produtos dos dois
períodos.
Análises físicas e químicas
A avaliação das coordenadas de cor,
por meio dos valores L*, a* e b*, foi afetada
significativamente pelas marcas das polpas de
frutas congeladas, não sendo influenciada pela
coleta, tampouco pela interação entre marcas
das polpas de frutas congelas e tempos de coleta
(p ≤ 0,05) (Tabela 2).
Na polpa de fruta congelada sabor acerola,
os valores de L*, a* e b* apresentaram-se
430
estatisticamente diferentes entre as marcas
X, Y e Z, com os maiores valores de L* e b*
encontrados na marca Z, proveniente da região
Nordeste, e maiores valores de a* na marca X,
advinda da região Sul. Já nas polpas de frutas
congeladas nos sabores goiaba e maracujá,
pôde-se observar comportamento semelhante,
sendo que os valores de L* e b* foram maiores
nas marcas Y e Z, não diferindo estatisticamente
entre si; e a marca Z apresentando o maior
valor da variável a*; com X e Y semelhantes
estatisticamente (Tabela 2).
A cor é um atributo de qualidade
importante tanto para frutos in natura quanto
aos produtos pós-processamento, sendo um fator
decisivo na escolha do produto pelo consumidor17.
A determinação instrumental da cor em polpas
de frutas congeladas, medida por meio dos
parâmetros L*, a* e b*, torna-se de grande valia
na avaliação de qualidade desses produtos,
sendo que variações nos valores desses parâmetros
podem representar diferenças, sobretudo, na
época de colheita e no estádio de maturação da
matéria-prima18.
Possivelmente, as diferenças encontradas
entre as marcas X, Y e Z nas polpas congeladas
nos sabores acerola, goiaba e maracujá, se devem
ao estádio de maturação desses frutos à época da
colheita, tendo relação direta com a cor do produto
Tabela 2. Valores médios de cor (valores L* a* e b*) de diferentes marcas de polpas de frutas congeladas
Polpas de frutas
Acerola
Goiaba
Maracujá
CV (%)
X
37,73b
40,70a
41,34a
4,22
L*
Y
35,43a
46,69b
49,36b
Z
46,04c
45,02b
50,86b
X
19,96c
16,19a
0,84a
7,97
Marcas
a*
Y
17,19b
15,38a
0,82a
Z
8,91a
20,50b
3,95b
X
20,15b
19,53a
33,04a
9,68
b*
Y
17,20a
23,51b
39,88b
Z
32,56c
24,94b
41,70b
*Médias seguidas da mesma letra, representam semelhança estatística entre as marcas (X, Y e Z), a 5 % de probabilidade, pelo teste de
Scott-Knott
final. A coloração dos vegetais pode pertencer a
três classes principais: carotenoides, antocianinas e
clorofila. Portanto, a coloração das frutas é resultante
dos pigmentos clorofila e carotenoides presentes
nos cloroplastos e cromoplastos, bem como
dos pigmentos fenólicos (antocianinas, flavonóis
e protocianinas) presentes nos vacúolos; no caso
da acerola, goiaba e maracujá, representado
principalmente, pelos carotenoides, presentes
por meio dos ésteres de xantofila e caroteno,
responsáveis pela cor amarela (coordenada b*)
das frutas maduras e as antocianinas que
conferem as cores vermelha e violeta (coordenada
a*), sendo que esses pigmentos podem estar
presentes em maiores teores em função do seu
estádio de maturação na colheita6,7.
Pereira et al15 e Benevides et al18, trabalhando
com a avaliação da qualidade de diferentes polpas
de frutas congeladas, observaram que as marcas
também promoveram diferenças significativas em
relação aos parâmetros L*a* e b* nos produtos,
vindo ao encontro dos resultados detectados no
presente trabalho. Esses autores ainda creditam
essa diferença entre as marcas, devido a possíveis
variações climáticas, no ponto de colheita,
resultando em diferenças nos teores pigmentos
presentes nos frutos.
Neves19, verificando a estabilidade de
polpa congelada de acerola, obteve valores de
L* variando de 36,79 a 47,50; a* de 6,59 a 14,20 e
b* 16,93 a 23,06. Pereira et al15, avaliando a cor
na polpa congelada de goiaba, encontrou valores
de L* variando de 47,89 a 45,82; a* de 22,79 a
15,47; e b* de 14,77 a 10,94, entre as marcas.
Vianna-Silva30, determinando a qualidade de
suco de maracujá, mostrou as coordenadas L* a*
e b* variando de 44,51 a 46,01; 4,38 a 7,94; 38,97
a 39,28, respectivamente. Baseado nesses autores,
os valores do presente trabalho se encontram
discrepantes para a polpa de goiaba na marca X
e polpa de maracujá em todas as marcas na
cor L*; para a polpa de acerola nas marcas X e Y
e polpa de maracujá em todas as marca na cor
a*; para a polpa de acerola na marca Z, polpa de
goiaba e de maracujá em todas as marcas para a
cor b*, o que corrobora para indicar diferenças
na matéria-prima, sobretudo, em relação ao índice
de maturidade.
As variáveis pH, acidez titulável (AT) e sólidos
solúveis (SS) foram afetadas significativamente
pela interação períodos de coleta (junho/2014 e
outubro/2014) e marcas (X, Y e Z) das polpas de
frutas congeladas (p ≤ 0,05) (Tabela 3). As polpas
congeladas nos sabores acerola, goiaba e maracujá
apresentaram maiores valores de pH, AT e SS
no 2o período de coleta quando comparados com
o 1o período, independentemente da marca
avaliada. No sabor acerola, nos 1o e 2o períodos
de coleta, os maiores valores de pH, AT e SS
foram apresentados pelas marcas Y, Z e X,
respectivamente, sendo que as demais marcas
foram semelhantes em cada variável, à exceção do
SS, que diferiram entre si em ambos os períodos.
Já no sabor goiaba, no 1º período de coleta, os
maiores valores de pH, AT e SS foram apresentados
pelas marcas X, Z e Y, respectivamente, enquanto
que, no 2o período de coleta, os maiores valores
dessas variáveis foram promovidos pelas marcas
X, X e Y, respectivamente, sendo que as outras
marcas foram diferentes em cada variável, à
exceção da AT, em que as marcas X e Y foram
semelhantes em ambos os períodos. Nas polpas
congeladas no sabor maracujá, as marcas Z, X e
X apresentaram os maiores valores de pH, AT e
SS, respectivamente, na 1a coleta, sendo que os
mesmos parâmetros avaliados na 2a coleta foram
431
majoritários nas marcas X para pH, X para AT e Y
para SS (Tabela 3).
As oscilações observadas nas variáveis pH,
acidez titulável e sólidos solúveis entre as marcas e
os períodos de coleta, podem indicar deficiências
quanto ao controle de qualidade da matéria-prima
utilizada nas indústrias de polpas. Essas diferenças
nos constituintes em polpas de frutas se devem
ainda, a procedência do fruto (solo, estação do ano,
sistema de produção, maturação) e ao manuseio
(transporte, acondicionamento, processamento e
armazenamento)18.
Alguns autores discorrem sobre importantes
variações na qualidade de polpas de frutas
congeladas, seja entre os períodos de coleta
das amostras, seja pelas marcas obtidas para
avaliação, cujos trabalhos apresentaram resultados
semelhantes aos encontrados na presente
pesquisa, para os valores de pH, AT e SS19,20,21.
A indústria de alimentos utiliza o efeito do
pH sobre os micro-organismos, para a preservação
dos alimentos. O grau de acidez dos alimentos tem
uma influência na determinação da microbiota
alterante, principalmente no que se refere aos
alimentos com baixo pH20. Assim, pode-se dizer
que os baixos valores de pH encontrados no
trabalho tenham contribuído sensivelmente para
as diminutas contagens de bolores e leveduras
e a ausência de bactérias (Salmonella sp. e
coliformes a 5 °C), averiguadas nas polpas de
frutas congeladas nos diferentes sabores.
A acidez é um parâmetro importante na
apreciação do estado de conservação de um
produto alimentício. Geralmente, um processo
de decomposição do alimento, seja por hidrólise,
oxidação ou fermentação, altera quase sempre
a concentração dos íons de hidrogênio, e por
consequência a sua acidez22.
Os ácidos orgânicos são produtos
intermediários do metabolismo respiratório
dos frutos e são muito importantes do ponto de
vista do sabor e odor. De forma geral, a acidez
diminui com o processo de maturação do fruto,
estando presentes em alimentos e influenciam o
sabor, odor, cor, estabilidade e a manutenção de
qualidade18.
Os sólidos solúveis são usados como índice
de maturidade de alguns frutos e indica a
quantidade de substâncias que se encontram
dissolvidas no suco, sendo constituídos por
compostos solúveis em água, que representam
substâncias, tais como: açúcares, ácidos, fenólicos,
vitaminas, orgânicos e pectinas18,23.
O teor de sólidos solúveis pode variar com
a quantidade de chuva durante a safra, fatores
climáticos, variedade, solo, tipo de processamento,
Tabela 3. Valores médios de pH, acidez titulável - AT (% de ácido cítrico) e sólidos solúveis – SS (%) de marcas de polpas de frutas
congeladas coletadas em diferentes períodos
Polpas de frutas
Acerola
PIQ***
X
Y
Z
X
Y
Z
Goiaba
PIQ***
Maracujá
PIQ***
Marcas
CV (%)
X
Y
Z
pH
3,2aA
3,7bA
3,3a A
2,80
4,02cA
3,92bA
3,64aA
3,50
2,80aA
3,09bA
3,38cA
2,70
Jun/2014
Out/2014
AT
SS
pH
AT
SS
0,69aA 7,17cA
3,6aB 0,8aB 8,14cB
0,74aA 7,00bA
3,9bB 0,96bB 7,10bB
1,02bA 6,46aA
3,6aB 1,12cB 6,92aB
0,80
5,50
2,80
0,80
5,50
0,40aA 8,50bA
4,29bB 0,45aB 9,17aB
0,42aA 9,53cA
4,38cB 0,48aB 9,83bB
0,74bA 8,17aA
3,92aB 0,98bB 11,00cB
0,40
7,00
3,50
0,40
7,00
2,74bA 10,67cA
3,32cB 3,19cB 11,67aB
2,52aA 10,50bA
3,20bB 3,04bB 15,33cB
2,57aA 10,33aA
3,12aB 2,68aB 13,33bB
2,50
11,00
2,70
2,50
11,00
pH= 3,82 AT=2,08 SS=4,06
*Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna, representam semelhança estatística entre as marcas (X, Y e Z), a 5 % de probabilidade,
pelo teste de Scott-Knott; **Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha, representam semelhança estatística entre os períodos de
coleta (Junho/2014 e Outubro/2014), a 5 % de probabilidade, pelo teste de Scott-Knott; ***PIQ, Padrão de Identidade e Qualidade - Instrução
Normativa nº 1, de 7/01/2000
432
além da adição eventual de água durante o
processamento, levando à diminuição dos teores
de sólidos solúveis no produto final23.
Baseado na Instrução Normativa nº 1 de
7 de janeiro de 2000 do MAPA2, que dispõe
sobre o Padrão de Identidade e Qualidade de
polpas de frutas, o pH das marcas X e Y do
2º período de coleta (Outubro de 2014) das polpas
no sabor goiaba, a acidez titulável das marcas X
e Y do 1º período de coleta (Junho de 2014) das
polpas no sabor acerola e os sólidos solúveis das
marcas X, Y e Z do 1º período de coleta das polpas
no sabor maracujá, mostraram-se fora dos limites
preconizados por essa legislação, que estabelece
valores na ordem de 3,5; 0,8 % de ácido cítrico e
11,0 %, para o pH da goiaba, a acidez titulável
da acerola e os sólidos solúveis do maracujá,
respectivamente, conforme Tabela 3. Contudo,
alguns autores15 salientam que, de maneira
geral, as polpas de frutas em relação ao pH,
devem apresentar essa variável abaixo de 4,5,
para garantir sua conservação sem a necessidade
de tratamento térmico muito elevado, para que
assim não coloque em risco a sua qualidade.
Como mencionado anteriormente, teores
de pH, AT e SS abaixo dos valores preconizados
pela legislação podem estar associados a uma
falta de padronização na maturação dos frutos.
A relação SS/AT (ratio) foi afetada
significativamente pelo fator isolado marcas
(X, Y e Z) das polpas de frutas congeladas (p ≤ 0,05)
(Tabela 4). A polpa de fruta no sabor acerola da
marca X apresentou maior valor de ratio quando
comparado com as demais marcas, que diferiram
entre si. Já para o sabor goiaba, os maiores valores
da variável foram representados pelas marcas X
e Y, estatisticamente semelhantes. Na polpa de
maracujá, as marcas Y e Z mostraram-se com o
ratio mais elevado (Tabela 4). Essas discrepâncias
entre as marcas dentro de uma polpa de fruta
no mesmo sabor mais uma vez ressaltam a não
conformidade da qualidade do produto21. Valores
de ratio afetados significativamente pelas marcas
das polpas de frutas congeladas, também foram
apresentados por diferentes pesquisadores 15,7.
O ratio é uma das melhores formas de
avaliação do sabor, maturação e palatabilidade
dos frutos, a qual ocorre, em grande parte, devido
Tabela 4. Valores médios de ratio (SS/AT) de diferentes marcas
de polpas de frutas congeladas
Polpas de frutas
Acerola
Goiaba
Maracujá
CV (%)
X
11,74c
21,48b
3,77a
8,28
Ratio (SS/AT)
Marcas
Y
8,21b
23,00b
5,10b
Z
6,69a
11,19a
5,30b
*Médias seguidas da mesma letra, representam semelhança
estatística entre as marcas (X, Y e Z), a 5 % de probabilidade, pelo
teste de Scott-Knott
ao balanço de ácidos orgânicos e açúcares, sendo
mais representativo que a mensuração destes
parâmetros isoladamente. Quando esses valores
são altos, significa que o fruto está em bom grau
de maturação, pois o mesmo aumenta quando
há decréscimo de acidez e alto conteúdo de SS,
decorrentes da maturidade18.
A relação SS/AT de frutas é um indicativo
usado para estabelecer o índice de colheita de
alguns frutos, indicando a doçura dos frutos
para seleção de uma melhor matéria-prima, ou
seja, quanto maior for à razão SS/AT, mais doces
serão as frutas18. Durante o amadurecimento
ocorre a degradação dos ácidos orgânicos, pois
há um aumento da concentração de enzimas
como as hidrolases (amilases, celulases, enzimas
pectinolíticas), peroxidases e catalase, reduzindo
assim a adstringência e o sabor ácido do fruto.
A relação entre teor de sólidos totais (representado
principalmente pelos açúcares) e a acidez da
fruta aumenta, promovendo o sabor doce
característico18.
Kader25 discorre sobre o ratio de diversas
frutas no estádio ideal de maturação, sendo
que os valores para acerola podem variar de 6,0
a 14,0 %; para a goiaba de 10,00 a 16,00 % e
maracujá de 3,0 a 6,0 %. Logo, as polpas de
frutas congeladas no sabor goiaba nas marcas
X e Y apresentaram índices de ratio acima dos
valores sugeridos como estádio ideal de maturação
para o fruto.
A vitamina C foi afetada significativamente
pela interação períodos de coleta (junho/2014
e outubro/2014) e marcas (X, Y e Z) das
polpas de frutas congeladas (p ≤ 0,05) (Tabela 5).
Todas as polpas de frutas, nos sabores acerola,
goiaba e maracujá, apresentaram teores de
433
vitamina C diferentes entre os períodos de coleta
em todas as marcas analisadas. Seguindo essa
mesma tendência, tanto no 1o período quanto
no 2o período de coleta, as marcas X, Y e Z
mostraram-se com valores de vitamina C
diferentes para as polpas congeladas de acerola,
goiaba e maracujá (Tabela 5).
As inúmeras diferenças nos teores de
vitamina C observadas entre os períodos de
coleta e as marcas das diferentes polpas de frutas
podem estar geralmente associadas a fatores
como influência ambiental (condições do solo,
clima, regime pluvial) e grau de maturação, entre
outros fatores pré e pós-colheita. Alguns autores
apresentaram resultados semelhantes25,26 aos
encontrados no presente trabalho, indicando
que os teores de ácido ascórbico podem variar
dependendo do cultivar, local e manejo.
A vitamina C ou ácido ascórbico está
distribuído na natureza em altas concentrações,
principalmente nas frutas cítricas, sendo que
seu teor difere com a variação da espécie, tipo
de tecido, grau de maturação e procedência.
Tabela 5. Valores médios de vitamina C (mg.100 g-1) de
marcas de polpas de frutas congeladas coletadas em diferentes
períodos
Polpas de
frutas
Acerola
PIQ***
Goiaba
PIQ***
Maracujá
PIQ***
CV (%)
Marcas
X
Y
Z
X
Y
Z
X
Y
Z
Vitamina C (mg.100 g-1)
Jun./2014
Out./2014
835,33aA
1187,33cB
949,00bB
754,00aA
1053,00cA
1196,33bB
800,00
800,00
21,28aB
19,95aA
35,26bB
24,45bA
28,00cA
34,45cB
40,00
40,00
8,97aA
10,55bB
16,38cB
13,20cA
11,66bB
5,85aA
NE
NE
3,82
*Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna,
representam semelhança estatística entre as marcas (X, Y e Z),
a 5 % de probabilidade, pelo teste de Scott-Knott;**Médias seguidas
da mesma letra maiúscula na linha, representam semelhança
estatística entre os períodos de coleta (Junho/2014 e Outubro/2014),
a 5 % de probabilidade, pelo teste de Scott-Knott;***PIQ, Padrão de
Identidade e Qualidade - Instrução Normativa nº 1, de 7/01/2000.
NE- Não Existe
434
É um antioxidante de muito fácil degradabilidade,
sendo reduzida desde o processamento e
obtenção das polpas de frutas e também durante
todo o armazenamento18.
De acordo com a Instrução Normativa
no 1 de 2000 do MAPA2, a marca Y do
2o período de coleta (Outubro de 2014) da
polpa no sabor acerola e todas as amostras
avaliadas da polpa no sabor goiaba estão fora
dos limites estabelecidos para a vitamina C,
< 800 mg.100 g-1 e < 40 mg.100 g-1, respectivamente,
indicando que essas amostras estão em desacordo
com os padrões de identidade e qualidade desses
frutos. Já para a polpa no sabor maracujá, a referida
legislação não traz qualquer menção sobre os
teores mínimo da variável (Tabela 5). Entretanto,
quando comparado com os teores de vitamina
C da polpa congelada de maracujá de diferentes
marcas encontradas por alguns autores23,27;
entre de 11,28 e 11,79 mg.100 g-1, os valores
encontrados são inferiores, mostrando que
houve degradação durante o processamento ou
a comercialização.
O ácido ascórbico é o nutriente mais
afetado pelo processamento de frutas, por isso sua
retenção é frequentemente usada como indicativo
da qualidade nutricional e até mesmo do estado
de conservação dos alimentos28. Algumas vezes,
até mesmo interações com outras substâncias
presentes no alimento contribuem para a
diminuição dos níveis de vitamina C. A destruição
desta, por exemplo, pode ser catalisada pela
lumiflavina, produto de degradação da vitamina
B2, que pode ser induzida pela presença de
aminas (pois reações de escurecimento ocorrem
com o ácido ascórbico de forma semelhante
às que ocorrem com a glicose e outros açúcares)
ou ainda pela presença de enzimas como a
ácido ascórbico oxidase27.
CONCLUSÃO
Todas as amostras de polpas de frutas
congeladas, independentemente da marca e
do período de coleta, apresentam reduzidas
contagens de micro-organismos, indicando
condições higiênico-sanitárias satisfatórias.
Observou-se inúmeras diferenças nos
parâmetros de cor (L*a*b*) e nos valores de pH,
acidez titulável, sólidos solúveis, ratio e vitamina C
entre as marcas e os períodos de coletas de todas
as amostras de polpas de frutas analisadas.
Algumas das amostras de polpas de frutas
se encontraram fora dos limites preconizados
pela Instrução Normativa no 1 de 7 de janeiro de
2000 do MAPA, indicando padrões de identidade
e qualidade deficientes, quer seja por fatores
relacionados com as condições da matéria-prima,
quer seja por fatores ligados aos transporte, ao
processamento e embalagem.
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Comunicação Breve/ Brief Communication
Detection of Leishmania (Viannia) braziliensis by PCR in
samples collected by scraping the lesion edges from patients
of an endemic area
Detecção de Leishmania (Viannia) braziliensis por PCR em
amostras coletadas por raspagem de bordas de lesões de pacientes
de uma área endêmica
RIALA6/1678
Aparecida Helena de Souza GOMES1, Izabel Madornado ARMELIN1, Vera Lucia PEREIRACHIOCCOLA2*
*Corresponding author: 2Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, Centro de Parasitologia
e Micologia, Instituto Adolfo Lutz. Av. Dr Arnaldo, 351, 8o andar, São Paulo, SP, Brazil.
CEP: 01246-000. Tel: 11 3068 2991. Fax: 3068 2890. E-mail: [email protected]
Centro de Laboratório Regional de Sorocaba, Instituto Adolfo Lutz
1
ABSTRACT
American cutaneous leishmaniasis (ACL) is an infectious disease caused by Leishmania. Their
diagnosis is performed in samples collected from the lesion biopsies, which has to be performed
by physicians. For simplifying the sample collection, this study proposes a minimally invasive
procedure, by scraping the lesion edges. Laboratory diagnosis by PCR was performed and compared
with the microscopic examination, by analyzing 28 samples collected from patients with suspicion
of ACL. Sample collected from the lesion edge with a sterile toothpick was divided into two aliquots.
One aliquot was analyzed under direct microscopy, and the second by PCR, by using two primer pairs
(one for Leishmania genus and other for L. (V.) braziliensis). Of 28 samples, 27 (96.43 %) showed
concordant results in both methodologies (eight positive and 20 negative). The PCR methodology
is an invaluable tool: (i) to determine the Leishmania species; (ii) to provide an alternative procedure
of sample collection, when an authorized professional is not available in the respective health
service;and (iii) to propose a minimally invasive procedure for collecting biological material.
Keywords. American cutaneous leishmaniasis, Leishmania (Viannia) braziliensis, PCR.
RESUMO
Leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa causada por Leishmania.
O diagnóstico é realizado em material de biópsias das lesões, cuja coleta é feita por médicos. Para
simplificar a coleta de amostra, este estudo propõe um procedimento minimamente invasivo,
realizando-se a raspagem das bordas da lesão. O diagnóstico por PCR foi comparado com o
exame microscópico,analisando-se 28 amostras coletadas de pacientes com suspeita de LTA. Cada
amostra, coletada da borda da lesão com um palito estéril, foi dividida em duas alíquotas. Uma foi
analisada pelo exame microscópico direto e a outra pela técnica de PCR, utilizando-se dois pares
de oligonucleotídeos (um específico para gênero Leishmania, e outro para L. (V.) braziliensis).
Das 28 amostras, 27 (96,43 %) apresentaram resultados concordantes em ambas as metodologias
(oito positivas e 20 negativas). A PCR em material de raspado da borda de lesões foi mais sensível
quando comparado com o exame direto. A metodologia de PCR apresenta vantagens para: (i)
determinar as espécies de Leishmania; (ii) oferecer um meio alternativo de coleta de amostras,
quando os serviços de saúde não têm o profissional autorizado para coletar o material de biópsia;
(iii) propor um procedimento minimamente invasivo de coleta de amostra biológica.
Palavras- chave. Leishmaniose cutânea americana, Leishmania (Viannia) braziliensis, PCR.
437
Gomes AHS, Armelin IM, Pereira-Chioccola VL. Detection of Leishmania (Viannia) braziliensis by PCR in samples collected by scrapingthe
lesion edges from patients of an endemic area. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):437-41.
Introduction
American cutaneous leishmaniasis (ACL)
is an infectious disease caused by protozoan
of the genus Leishmania that affects skin and
mucosa. According to World Health Organization
(WHO) 1- 1.5 million new human cases of
cutaneous forms occur yearly. From 2001 to
2011 around 270,500 cases were reported, with
an average of 27,500 new cases/year1,2. Around 3
to 5 % patients who develop cutaneous lesions
can also develop mucosal leishmaniasis1-3. In the
Sao Paulo State, the incidence is approximately
400 new cases/year4. Another considerable
problem is the urbanization of the infection.
Autochthonous cases have been described in
urban areas5. The incidence of peri-urban
and urban cases has been increasing.
Approximately 10 % of the population living in
endemic areas is at risk for acquiring the
infection5,6. ACL was also considered one of
the most common dermatological syndromes
diagnosed in travelers (or tourists) who had
visited endemic areas6.
Species such as L. (V.) braziliensis, L. (V.)
guyanensis and L. (L.) amazonensis can cause
ACL3,6. Such parasite diversity causes different
forms and manifestations, mainly in the skin and
mucous membranes and in the host immune
system6.
The traditional diagnosis of ACL is
performed using clinical, epidemiological and
laboratory methodologies. Considering the
laboratory techniques, biopsies from lesions are
normally processed for direct examination, after
Giemsa staining, “in vitro” culture, including
histopathological techniques, and more recently,
molecular methods as polymerase chain reaction
(PCR)7. Studies related the determination
of the infecting species can cooperate with
the epidemiological and preventive strategies.
Our group previously evaluated a PCR for
detecting L. (V.) braziliensis in clinical samples,
which has been shown to be highly sensitive
and specific7,8.
The human biopsy collection must be
performed only by physicians; in addition,
438
it is a complex and expensive procedure1,3,4.
Based on this, and in order to simplify the
sample collection for molecular ACL diagnosis,
the present study aimed to propose a minimally
invasive procedure, simple and fast sample
collection procedure using molecular and
parasitological methods.
Material and Methods
Patients and samples
This study was conducted analyzing
clinical samples from 28 patients with cutaneous
lesions living and attending public dermatology
clinics of Sorocaba Region, Sao Paulo State.
All patients analyzed in this study also lived
in these cities and were selected considering
epidemiological risk factors for cutaneous
leishmaniasis, such as close proximity to
other infected patients as well as signs or
symptoms of the disease. In the dermatology
clinics, a complete dermatological examination
was performed, and all patients presented
cutaneous lesions suggestive of leishmaniasis.
None of them had acquired the infection before
or had been treated with drugs for leishmaniasis.
Lesions were initially cleaned with antiseptics.
The borders of the lesions were scraped or
smears of material were obtained with the aid
of a sterile toothpick. One part of samples was
immediately added to a tube containing 1-2 mL
of a sterile 0.85 % NaCl for DNA extraction. The
other part of sample was distended directly on two
glass slides for parasitological test (microscopic
examination).
For negative control in PCR, DNA
was extracted from three biopsies with other
diseases and for positive control, from the
standard WHO strain, L. (V.) braziliensis
(MHOM/BR/1975/M2903). Promastigotes were
maintained by serial passages and grown at 24 ºC
in 199 medium supplemented with 10 % calf
serum and 0.25 % hemin 25. In the log curve
phase, 1 x 108 promastigotes were harvested,
and washed twice in phosphate-buffered
saline (pH 7.2) at 1,000 g for 10 min.
The parasite pellets were used for DNA extraction.
Ethical considerations
This study was performed according
to recommendations of the Human Ethics
Committee (CONEP-IAL, number 424.827) that
approved this study.
Microscopic method
Smears on glass slides
with methanol and stained
according to the WHO1,2.
of amastigotes was observed
with an immersion objective
1,000X).
were fixated
with Giemsa
The presence
microscopically
(magnification
Molecular diagnosis
DNA extraction
Clinical samples and Leishmania WHO
reference strain were crushed and digested,
until complete tissue lysis, in a lysis buffer
(This-HCl, 10 mM, pH 8.0; EDTA 10mM; SDS, 0.5 %;
N-laurilsarcozil, 0.01 %; proteinase K, 100 µg/mL)
by incubation in water bath at 56 °C. Next, DNA
molecules were extracted by QIAamp® DNA Mini
Kit (Qiagen), according to the manufacturer’s
instructions. DNA concentrations and purity
were determined by the NanoDrop ND1000®
(Thermo Scientific).
PCR, targets for Leishmania and internal controls
Leishmania spp. was identified by using
the primer set 150/1529, targeting a 120-base pair
(bp). PCR product from a conserved region of
kDNA minicircles. L. (V.) braziliensis complex
was determined by using the primer set LU-5A/
LB-3C
(5’-TTTATTGGTATGCGAAACTTC3 ’ / 5 ’ - C G T ( C / G)C C GAAC C C C G TGTC-3’)
targeting an amplified fragment of 146-149 bp
from the multicopy spliced leader RNA gene7,8,10.
These reactions were run following the same
conditions as described by Gomes et al7 and
Gomes et al8. To check PCR inhibitors, samples
were assayed by using a reference gene (β1-β2)11,
in the same conditions as previously described8.
The samples were tested in two replicates. Each
amplification run contained two negative controls
(ultra-pure water and a negative DNA sample
for Leishmania) and one positive control (DNA
extract of L. (V.) braziliensis promastigotes).
After thermal cycles, PCR products were
electrophoresed in 2 % agarose gel and stained
with ethidium bromide. DNA fragments were
visualized under UV illumination. The images
were analyzed by a Mini Bis Gel Imager and
Documentation (DNR Bio-Imaging Systems).
The size of fragments was based on comparison
with a 100-bp ladder.
Data Analysis
According analyses made in previous
studies7,8 and in the laboratory routine in our
laboratory, clinical and laboratory criteria were
used to establish the diagnosis. The samples were
considered positive when stained tissue smears
or PCR were positive. These values were used as
the “consensus laboratory criteria” against which
each individual diagnostic assay was compared8.
RESULTS AND DISCUSSION
During the study-period, the 28 patients
clinically suspected of having ACL referred to
the public dermatology clinics were diagnosed
by clinical, epidemiological and laboratorial
data. Parasites were identified by, at least one of
the methods employed The central objective of
this study was to investigate whether PCR or the
direct microscopic examination could determine
L. (V.) braziliensis in clinical material collected
by scraping the edges of the lesions, in case
physicians could not perform biopsies to collect
the material.
DNA extraction and PCR inhibitors were
evaluated by β1-β2 marker that amplified a PCR
fragment of human β-globulin gene. All DNA
samples had positive amplifications showing that
no substance present in DNA samples inhibited
the reaction. Leishmania determination was made
using two primer pairs: a 120 bp, specific for
Leishmania spp, and a 146-149 bp fragment from
the SL RNA gene of L. (V.) braziliensis complex.
As an illustration, Figure 1 shows the amplified
PCR products of all markers used in this study.
The overall laboratory results, showing each
individual diagnostic test for clinical samples of all
patients, are described in Table 1. Samples from the
28 patients presented the following results: eight
439
Figure 1. Amplified PCR products in two different target regions of Leishmania: 150/152, 120 bp (for Leishmania spp)
(A) and LU-5A/LB-3C, 146 to 149 bp (for L. (V.) braziliensis complex) (B). Β1-β2 primer pair was used as PCR control
and amplified a 140 bp fragment of human β-globulin gene (C). The amplified products were resolved in 2 % agarose gels stained
with ethidium bromide. Lane MM, 100 bp ladder
patients had positive results for PCR (with both
primer pairs), whereas parasites were detected
by parasitological methods in seven patients.
No parasites were shown in the other 20 samples
suggesting that patients may have other diseases.
These data suggest the possibility to
use PCR in dermal scrapings, since our data
showed concordance between parasitological and
molecular methodologies. The collection of dermal
scrapings is a methodology minimally invasive
if compared with skin biopsies. Previous studies
have equally described good sensitivity of PCR
when compared with direct microscopy in lesion
scrapings. In addition, sensitivity was similar to that
of DNA samples extracted from biopsies12,13.
In conclusion, this study showed the
possibility of PCR use in scraping of lesion
edges (i) to determine Leishmania species in
positive samples (ii) to use an alternative way of
collecting material, when biopsy procedures are
not available at the health services, and (iii) to use
a minimally invasive procedure.
Table 1. Comparison of parasitological and molecular
methods for L. (V.) braziliensis detection in scrapings of
lesions edge from patients with cutaneous lesions
1. World Health Organization - WHO. Leishmaniasis:
Fact sheet N° 375, updated January 2014. WHO;
2015. [Accessed September 2015]. Available at:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/
en/index.html.
Parasitological
PCR
440
Negative
Positive
Total
Negative
20
0
20
Positive
01
07
08
Total
21
07
28
ACKNOWLEDGMENTS
This study was supported by grants from the
FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de Sao Paulo, Brazil) 2011/13939-8, and
the CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico) 303489/2012-0 for Vera L.
Pereira-Chioccola.
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441
Importância da atuação do Laboratório de Saúde Pública
nas perícias judiciais relacionadas a matérias estranhas em
alimentos
Importance of the Public Health Laboratory on the expert advice
requested by the courts regarding foreign matter in food
RIALA6/1679
Sonia de Paula Toledo PRADO1*, Cristina Eico Yokosawa1, Roberta Ribeiro Costa Rosales2
*Endereço para correspondência: 1Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas, Centro
de Laboratório Regional de Ribeirão Preto, Instituto Adolfo Lutz. Rua Minas, 877,
Campos Elíseos, Ribeirão Preto, SP, Brasil. CEP: 14085-410. Tel: 16 3625-5046 - ramal 214.
Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica, Departamento de Biologia Celular e
Molecular, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
2
RESUMO
O Instituto Adolfo Lutz (IAL) atua de maneira relevante em processos judiciais realizando perícias
laboratoriais conhecidas como produção antecipada de provas. Este trabalho faz o relato da
investigação da suspeita de presença de cacos de vidro em vinho tinto, referente a um processo
judicial de município da região de Ribeirão Preto/SP. Em abril de 2013, uma amostra de vinho foi
encaminhada ao IAL-Ribeirão Preto para confirmação de corpo estranho e sua identificação pelo
Laboratório de Microscopia de Alimentos. Realizaram-se inicialmente as análises de dissolução
da amostra e o exame direto por microscopias estereoscópica e óptica. Constatou-se a presença
de borra no gargalo e de sedimento com cristais diversos no fundo das garrafas. Posteriormente,
os cristais foram encaminhados ao Departamento de Biologia Celular e Molecular da FMRP-USP
para quantificar e identificar a composição através do microscópio eletrônico de varredura Jeol
JSM-6610LV e do EDS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy). A ausência de sílica confirmou a
pesquisa negativa para caco de vidro, e a composição dos elementos encontrados sugeriu a presença
de sais de tartarato de cálcio e potássio no vinho. Apesar destes cristais não serem prejudiciais à
saúde, a alteração da aparência do produto pode causar rejeição pelo consumidor.
Palavras-chave. vinho, cristalização, microscopia, análise de alimentos, Laboratório de Saúde
Pública.
ABSTRACT
The Adolfo Lutz Institute (IAL) conducts laboratorial researches concerning the production of
early evidence driven by law-suit processes. This study reports an investigation for analyzing the
suspected presence of broken glass in a red wine, referring to a law-suit of city of Ribeirão Preto
region. In April 2013 a wine sample was sent to the Food Microscopy Laboratory of IAL-Ribeirão
Preto to confirm the presence of a foreign body and their identification. Analyses were made
by dissolving the sample and by examining under stereoscopic and optical microscopy. Dreg
was found in the bottle neck, and sediments containing crystals of varied sizes and shapes were
deposited on the bottom. These crystals were sent to the Department of Cellular and Molecular
Biology at Medical School of Ribeirão Preto-USP for identifying and quantifying them through the
scanning electron microscope JEOL JSM- 6610LV and EDS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy).
Silica was not detected, and this finding ruled out the presence of broken glasses. Analysis of the
found elements suggested the presence of calcium and potassium tartrate salts in this wine. Although
these crystals are not harmful to human health, they might change the wine aspect and cause
rejection by the consumers.
Keywords. wine, crystallization, microscopy, food analysis, Public Health Laboratory.
442
Prado SPT, Yokosawa CE, Rosales RRC. Importância da atuação do Laboratório de Saúde Pública nas perícias judiciais relacionadas a
matérias estranhas em alimentos. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):442-6.
INTRODUÇÃO
O Instituto Adolfo Lutz (IAL), Laboratório
Central de Saúde Pública do Estado de São
Paulo, juntamente com doze Centros de
Laboratório Regional espalhados estrategicamente
no Estado, lidera as ações laboratoriais de
vigilância sanitária, epidemiológica e ambiental.
Na área de alimentos, o IAL além de atender a
vários órgãos e participar de diversos programas,
atua em processos judiciais solicitados por juízes
e promotores, realizando perícias laboratoriais
conhecidas como produção antecipada de provas.
Essa análise, realizada comumente pela área
da Microscopia de Alimentos, visa salvaguardar
a existência e a eficiência de uma prova a ser
produzida que se encontra na iminência de
não mais poder se fazer presente, sendo o exame
pericial documentado em laudo uma importante
ferramenta para auxiliar a decisão do juiz e o
andamento do processo.
A segurança sanitária dos alimentos
ofertados para consumo da população é um dos
desafios da Saúde Pública e os perigos relacionados
à segurança alimentar são classificados em
microbiológicos, químicos e físicos.
Alguns perigos físicos que envolvem a
produção do vinho, principalmente durante o
recebimento das uvas, processamento e envase
incluem a presença de folhas, pedras, insetos,
peças soltas, partes de vedantes, borras finas,
fragmentos de rolhas e cacos de vidro que
podem ficar na garrafa1. Na vinificação, as borras
são partículas sólidas em suspensão presentes
nos mostos e nos vinhos, que podem causar
turvações ou depósito no fundo dos recipientes2.
No tocante à qualidade, aspectos como
aparência, aceitabilidade, aromas, sabor, cor e
componentes (álcool, acidez, entre outros) são
características sensoriais importantes para a
aceitação do consumidor. Referem-se a defeitos
que alteram o produto sem afetar a saúde do
consumidor3.
Por falta de conhecimento da tecnologia
de produção ou por fenômenos químicos, físicos
ou biológicos que podem alterar os alimentos
e bebidas, os consumidores eventualmente
confundem essas alterações com a presença de
corpos estranhos. Em outras ocasiões, devido
à dificuldade de visualização pelo tipo de
embalagem, a verdadeira natureza da matéria
estranha é supostamente confundida com partes
de animais e objetos diversos.
Em decorrência desses fatos é comum
a existência de processos judiciais com pedido
de indenização por danos morais. Essa análise
é conhecida por produção antecipada de
provas, sendo solicitada pelo juiz para evitar o
perecimento ou a perda do objeto de uma prova.
Assim, a ação cautelar visa assegurar a prova para
que, em momento oportuno, ela possa se fazer
valer no processo principal4. A produção da
prova não significa apenas a possibilidade das
partes de produzi-la para demonstrar a veracidade
das alegações apresentadas, mas sim, para
fundamentar na decisão sobre a situação fática
a ser tomada pelo julgador5.
Diante do exposto, este trabalho teve
como objetivo o relato da investigação de
suspeita da presença de cacos de vidro de uma
produção antecipada de provas e identificar
a natureza do corpo estranho em vinho tinto
de mesa referente a um processo judicial da Vara
Cível da Comarca de um município da região de
Ribeirão Preto/SP.
MATERIAL E MÉTODOS
Material
Em abril de 2013, uma amostra composta
por duas unidades fechadas de vinho tinto de
mesa, acondicionado em garrafa de vidro
lacrada, foi encaminhada pela Vara Cível de um
município da região de Ribeirão Preto/SP ao
Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas
do Centro de Laboratório Regional do Instituto
Adolfo Lutz de Ribeirão Preto, para a realização
de perícia de produção antecipada de provas
em ação de indenização por danos morais.
Foram solicitadas ao Laboratório de Microscopia
de Alimentos, a confirmação da presença
do corpo estranho (suspeita de caco de vidro),
a sua identificação e outras informações
requeridas pelo juiz através de quesitos
formulados pelas partes interessadas da referida
ação.
443
Métodos
Análise microscópica
As análises feitas inicialmente incluíram
a dissolução da amostra, filtração e exame direto
com auxílio dos microscópios estereoscópico
binocular (aumento de 7 a 40X) e óptico6.
Posteriormente, os cristais e resíduos foram
encaminhados ao Laboratório Multiusuário
de Microscopia Eletrônica do Departamento
de Biologia Celular e Molecular da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto-USP para
a confirmação da sua natureza, utilizando
microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM6610LV em baixo vácuo com voltagem de 25 kV
e o EDS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy)
Oxford. Os cristais foram presos em um suporte
com cola de carvão para a observação ao
microscópio, tendo sido feitas imagens de 30X e
500X de magnificação; o EDS quantificou e
identificou adequadamente a composição dos
cristais, sendo obtidos mapas e gráficos com
a distribuição dos elementos identificados na
superfície da amostra.
Figura 1. Distribuição dos elementos químicos identificados
na superfície dos cristais
A análise macroscópica constatou a
presença de borra no gargalo e de sedimento com
vários cristais de tamanhos e formatos diversos
depositados no fundo das garrafas de vinho.
A pesquisa para fragmento de vidro foi
considerada negativa.
Após a análise por microscopia de
varredura confirmou-se a ausência de sílica
(principal componente do vidro) nos referidos
cristais e, portanto, descartou-se a suspeita
inicial do material estranho tratar-se de
fragmentos de vidro. A composição dos principais
elementos encontrados (Ca = 67,74 %; O = 49,59 %;
C = 47,99 %; K = 0,68 %) e o EDS sugeriram a
presença de sais de tartarato de cálcio e potássio
no vinho, decorrentes do processamento da uva
(Figuras 1 e 2).
Um dos problemas mais frequentes que
deprecia o aspecto visual do vinho tinto e também
do suco de uva é a presença de depósito no fundo
do recipiente depois de engarrafado, devido à
precipitação do bitartarato de potássio (cremor
444
Figura 2. Cristais encontrados na amostra, observados em
microscópico eletrônico de varredura Jeol JSM-6610LV
de tártaro) e/ou o tartarato neutro de cálcio.
A formação desses cristais é consequência de
um excesso de bitartarato de potássio ou
de tartarato de cálcio, sais cuja solubilidade
diminui com a redução da temperatura7.
Esta precipitação tartárica em vinhos,
por cristalização espontânea em condições
naturais, é um fenômeno imprevisível e pode
ocorrer durante a vinificação, estágio, ou depois
de embalados. A ocorrer nesta última fase,
geralmente dão origem a reclamações dos
consumidores que associam a presença de um
precipitado com uma adulteração ou defeito do
vinho8.
De acordo com Larentis1, a presença
de cristais de tartarato pode ser considerada
um perigo físico, porém de baixa severidade e
risco, nos quais medidas preventivas devem ser
adotadas.
Para evitar o aparecimento desses cristais
utiliza-se como prática enológica a estabilização do
ácido tartárico ao vinho antes do engarrafamento.
O tratamento consiste em resfriar rapidamente
o vinho até -3 °C a -4 °C, por um período de
8 a 10 dias, o que provoca a insolubilidade e
precipitação dos sais para filtragem posterior2.
Este pode ser considerado um assunto
controverso, pois para muitos enólogos a
presença de cristais não é sinal de deterioração
nem tampouco defeito do vinho, podendo
indicar um processo de estabilização leve ou sua
ausência. Já as borras ocorrem naturalmente
com a evolução dos vinhos tintos e também
denotam pouca ou nenhuma estabilização e
filtração9.
O laudo pericial juntamente com as
respostas aos quesitos fundamentou a decisão
judicial, tornando a ação improcedente e
extinguindo o processo com resolução de mérito.
fundamental à proteção da saúde da população.
As investigações realizadas no Laboratório de
Saúde Pública (CLR – IAL de Ribeirão Preto)
elucidaram a verdadeira natureza do material
encontrado no vinho e auxiliaram o Poder
Judiciário no andamento do processo judicial que
tramitava na justiça por muitos anos, afastando
a hipótese inicial de presença de matéria estranha
(caco de vidro) com risco à saúde humana.
Apesar desses cristais não serem prejudiciais
à saúde humana, a alteração da aparência do
produto pode causar reação de rejeição por parte
de consumidores que desconhecem o processo
de fabricação dos vinhos. Estes cristais podem
ser confundidos com matérias estranhas como
fragmentos de vidro, inclusive produzindo um
ruído similar a esses quando deslocados dentro
da garrafa. Assim, sugere-se a inclusão de frase
no rótulo dos vinhos informando o consumidor
sobre a possibilidade da existência desses cristais
no fundo da embalagem.
Os dados do estudo irão suprir uma lacuna
no conhecimento da área e poderão ainda servir
como subsídio para incluir item específico sobre
o assunto na próxima revisão da legislação
relacionada à presença de matérias estranhas
macroscópicas e microscópicas em alimentos
e bebidas.
AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório Multiusuário de Microscopia
Eletrônica do Departamento de Biologia Celular
e Molecular da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto-USP.
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
As análises laboratoriais efetuadas pela
área da microscopia de alimentos comprovam
ou descartam a existência de matérias estranhas
indicativas de falhas das Boas Práticas e/ou
indicativas de risco à saúde humana, sendo
considerada uma prática de vigilância sanitária
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Avaliação das características físico-químicas da carne de perna
de avestruz (Struthio camelus) para produção de embutidos
Evaluation of physical-chemical characteristics of the meat of
ostrich (Struthio camelus) leg for sausage production
RIALA6/1680
Edvaldo Vasconcelos de CARVALHO FILHO1*, João Andrade da SILVA2
*Endereço para correspondência: 1Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Faculdade
de Ciências da Saúde do Trairi. Av. Rio Branco s/n°, Centro, Santa Cruz-RN, Brasil, CEP: 59200-000.
Universidade Federal da Paraíba (UFPB), Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA/CTDR/
UFPB), João Pessoa, PB, Brasil
2
RESUMO
A qualidade da carne de avestruz tem despertado o interesse de pecuaristas e consumidores,
tanto para consumo direto como para produção de embutidos. Neste estudo foram analisados
o rendimento e as características físico-químicas dos músculos de pernas de avestruzes
Gastrocnemius pars externa, Fibulares Longus e Gastrocnemius pars internus utilizados para
produzir embutidos. Foram determinadas a composição centesimal, cor objetiva pelo sistema
CIElab, pH, atividade de água, textura objetiva, capacidade de emulsificação e capacidade de
absorção de água. A carne da perna apresentou rendimento de 87,27 %. Houve diferença no músculo
do Gastrocnemius pars internus quanto à composição química. Após a trituração dos músculos,
a mistura apresentou capacidade de emulsificação média de 136,40 mL de óleo/0,5 g e capacidade
de absorção de água de 55,63 %. Este estudo mostra que a carne de perna de avestruz pode ser
utilizada para produção de embutidos.
Palavras-chave. rendimento, qualidade, capacidade de emulsificação, textura.
ABSTRACT
The quality of ostrich meat has been increased the interest of cattle breeders and consumers,
not only for direct consumption, but also for producing sausages. The objective of this study
was to analyze the yields and the physicochemical characteristics of the leg muscles of
ostriches Gastrocnemius pars external, Fibulares Longus and Gastrocnemius pars internus, for
producing sausages. The centesimal composition, objective color by CIElab system, pH, water
activity, objective texture, emulsification capacity and water-absorbing ability were determined.
The leg meat yield was of 87.27 %. Difference on the chemical composition was detected in
Gastrocnemius pars internus muscle. After the muscles comminution, the mixture showed the average
emulsification capacity of 136.40 mL of oil/0.5 g and the water absorption capacity of 55.63 %.
This study demonstrates the effectiveness of ostrich leg meat in producing sausage.
Keywords. yield, quality, emulsifying capacity, texture.
447
Carvalho Filho EV, Silva JA. Avaliação das características físico-químicas da carne de perna de avestruz (Struthio camelus) para produção
de embutidos. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):447-52.
INTRODUÇÃO
O avestruz (Ordem Struthioniformes,
Subgênero Struthiores, Família Struthocridae,
Gênero Struthio, Espécie camelus) é uma ave
corredora, incapaz de voar, pertencente ao grupo
das Ratitas. É a maior ave existente com altura
média, do chão até a cabeça, variando de 2,0 a
2,5 m, quando adulta pode pesar até 160 Kg1.
Diferente de outros animais, onde a carne
é vendida por partes ou porções, a carne de
avestruz é vendida por músculos que são divididos
em: músculos da perna (M. gastrocnemius, pars
interna, M. gastrocnemius, pars externa, M.
gastrocnemius, pars media, M. fibularis longus),
músculos da coxa (M. pubo-ischio femoralis,
M. flexor cruris medialis, M. iliofemoralis, M.
flexor cruris lateralis, M. iliofibularis, M. iliotibialis
lateralis, M. ambiens, M. iliotibialis cranialis,
M. iliofemoralis externus, M. femorotibialis medius)
e por fim o M. obturatorius medialis, localizado
na parte traseira do animal1.
O rendimento da carcaça fria de um
avestruz é de aproximadamente 51 %, não existindo
diferença no rendimento de carcaça, entre machos
e fêmeas, quando os animais têm idade e peso
semelhante1,2. A carne de avestruz apresenta
características físicas diferenciadas de outros
animais, depois de 24 horas do abate apresenta
pH alto (5,8-6,2). Esta característica influencia
na cor, umidade e vida de prateleira1.
A introdução da carne de avestruz no
atual e competitivo mercado global implica
no fornecimento de garantias nutricionais
adequadas para um determinado nicho de
consumidores em diversos países. As estratégias
para a introdução de novos produtos à base de
carne de avestruz devem concentrar-se na sua
qualidade superior, tanto do ponto de vista
nutricional como organoléptico sensorial, que
são determinados pela composição química
da carne3. Devido a constante busca dos
consumidores por novos produtos alimentícios,
considerados saudáveis, tem-se observado a
necessidade do desenvolvimento de produtos
utilizando os cortes da perna de carne de
avestruz que tenha baixo valor de mercado,
que permita a agregação de valor a carne e a
448
oferta de novos produtos cárneos com carne de
avestruz.
Assim, objetivou-se com este estudo
determinar o rendimento e as características
físicas e químicas da carne de perna de
avestruz, avaliando sua viabilidade para utilização
como matéria prima na produção de embutidos
cárneos.
MATERIAL E MÉTODOS
Material Experimental
As amostras da carne de avestruz
(Struthio camellus) provenientes do abate de
04 (quatro) machos com 14 meses de idade
foram adquiridas na cidade de Recife-PE,
provenientes da Cooperativa dos Criadores
de Avestruzes do Nordeste e transportadas
congeladas para o Laboratório de Bioquímica
dos Alimentos da Universidade Federal da
Paraíba. Foram avaliados os músculos da
perna: Muscularis gastrocnemius pars externa,
Muscularis fibulares longus e Muscularis
gastrocnemius pars internus de avestruz por
serem considerados por Feijó et al4 músculos
de textura mais dura e, consequentemente
apropriados para produção de embutidos.
Analises de qualidade da carne
Rendimento de cortes
O rendimento da carne da perna do avestruz
foi avaliado depois da desossa manual em mesa.
Foi calculado pelo peso da peça inteira, menos o
peso do osso.
Composição química
Na determinação da composição centesimal
foram avaliados a umidade, proteína, lipídio
e cinzas de acordo com as metodologias
descritas pela Association of Official Analytical
Chemists – AOAC5. As análises foram realizadas
em triplicata e os valores expressos em g/100 g.
pH
A determinação do pH foi realizada
potenciômetro Modelo Q400AS, calibrado
soluções padrão pH 7 e 4, utilizando-se 10
amostra homogeneizada com 100 mL de
com
com
g de
água
desionizada, em seguida, a suspensão foi filtrada
e realizada as leituras em triplicata, de acordo
com as metodologias descritas pela Association
of Official Analytical Chemists – AOAC5.
Atividade de água
A atividade de água foi determinada
em aparelho AQUA LAB CX-2, com alíquotas
pesando 20 g e em temperatura padronizada de
25 °C, com seis leituras para cada corte.
Determinação de cor objetiva sistema CIELab
Para a realização da análise de cor foram
cortados pedaços de carne de 2,5 cm de espessura
de cada músculo analisado. As medidas de
luminosidade (L*), da intensidade de vermelho/
verde (a*) e da intensidade de amarelo/azul (b*)
foram realizadas em colorímetro Minolta Modelo
GR10, (Osaka - Japão), sistema CIELab, para
a leitura dos parâmetros. O colorímetro foi
calibrado com placa de cerâmica branca e o
iluminante utilizado foi o D65, com ângulo
de 10º. Foram feitas duas medidas, em quatro
diferentes pontos do corte, anotando-se os valores
médios de L*, a* e b*, de acordo com a metodologia
descrita por Houben et al6.
Textura
A textura da carne dos três músculos
da perna de avestruz foi medida por meio da
força de cisalhamento, seguindo a metodologia
descrita por Solomon et al7, utilizando-se amostra
com peças medindo 3 cm de comprimento e
1,2 cm de diâmetro, sendo cisalhadas ao
longo do diâmetro. O cisalhamento foi feito
perpendicularmente
às
fibras
utilizando
texturômetro TA XT Express (Stable Micro
Systems®, 1997). Foram realizadas seis repetições
da força de cisalhamento para cada amostra e os
resultados foram expressos em quilograma força
(Kgf/cm2).
Capacidade de emulsificação
Para a determinação da capacidade de
emulsificação foram pesadas 25 g de carne
proveniente da cominuição dos músculos da
perna de avestruz e homogeneizadas em 100 mL
de solução de NaCl (1M) durante dois minutos.
Pesou-se 2,5 g dessa solução inicial e foram
adicionados 20 mL de água destilada e 10 mL
de óleo de soja. Em seguida, ocorreu o
emulsionamento em aparelho agitador mecânico
de médio torque (100 a 2200 rpm) com a adição
de óleo em uma velocidade de 0,3 mL/s até a
quebra da emulsão, com os resultados expressos
em mL de óleo/0,5 g de carne7.
Capacidade de absorção de água
A capacidade de absorção de água foi
determinada a partir da pesagem de 30 g de
carne moída, com a adição de 90 mL de água
destilada. Foram pesados 35 g da pasta obtida
e centrifugados por 15 minutos a 3000 rpm.
O sobrenadante foi desprezado, o tubo foi pesado
e a capacidade de absorção foi calculada da
seguinte forma: %CAA={[(PP–PC)–PS]/PC}*100,
em que: PP = peso da pasta, PC = peso da carne
na pasta e PS = peso do sobrenadante8, com os
resultados expressos em porcentagem.
Análise estatística
A avaliação estatística dos dados foi
realizada utilizando-se o software estatístico
SigmaStat® 3.1 (Systat software Inc.; Richmond,
Califórnia, EUA, 2005) aplicando-se a Análise
de Variância (ANOVA) para comparações entre
os músculos analisados. Quando a ANOVA
atestava a existência de diferença, utilizou-se o
Teste de Tukey ao nível de significância de 5 %.
Com a desossa manual da perna de
avestruz foi observado um rendimento médio,
87,27 % para carne e de 12,73 % para osso
(Tabela 1). Flemming et al9, avaliando o rendimento
de desossa de perna de cinco linhagens de frango
de corte mais criadas no Brasil, encontraram valores
de 77,30 % para linhagem Ross, 81,81 % para
Cobb, 75,88 % para Hubbard, 76,85 % para Arbor
Acres e 75,88 % para Isa Vedette.
Comparando-se os valores da desossa
manual realizada na perna de avestruz em nosso
estudo, e o reportado por diversos autores para
diversas linhagens de frango comercializadas no
449
Brasil, observamos que os valores de rendimentos,
na desossa manual da perna de avestruz são
superiores.
aos valores encontrados nesta pesquisa. Majewska
et al10 avaliaram a composição centesimal do
M. iliofibularis e encontraram uma umidade de
76,10 %, um pouco acima do registrado nesta
pesquisa, porém o percentual de lipídio foi
semelhante, qual seja 3,1 %.
Os valores de pH são apresentados na
Tabela 2. Carnes com esses valores de pH
variando entre 6,16 a 6,44 aproximam-se do
que é classificado como carne Dark, Firm and
Dry – DFD, que e considerada uma anomalia
advinda do processo de pré abate e que de forma
geral apresenta-se firme, seca, pegajosa e escura.
Polawska et al3, avaliando a média de pH
dos músculos de avestruz após 24 horas do abate,
classificou como uma carne de pH intermediário,
ou seja, pH médio variando entre 5,8 e 6,2,
com exceção dos músculos Ambiens, iliofibuaris
e Medial obturatorius, resultados semelhantes ao
encontrado nesta pesquisa (Tabela 2).
Balog et al2 avaliaram o processo de abate
de avestruzes e as características físicas e químicas
da carne, especificamente dos músculos
Gastrocnemius internus e Fibulares longus e
encontraram pH de 6,06 e 6,20 logo depois
do abate, semelhante aos resultados desta
pesquisa, principalmente no músculo Gastrocnemius
internus.
Tabela 1. Rendimento percentual médio de desossa manual
de perna de avestruz
Porção
Osso
Carne
Perna inteira
Rendimento
Peso (g)
EPM
%
625,00
15,00
12,73
4285,00
65,00
87,27
4910,00
80,00
100,00
EPM: Erro Padrão da Média
Foi observada diferença (p < 0,05) para
as análises de umidade, Resíduo Mineral Fixo e
Lipídeos (Tabela 2). Com relação ao percentual de
lipídios o músculo Fibulares longus (3,83 ± 0,06)
e o Gastrocnemius pars internus (4,41 ± 0,12)
apresentaram valores maiores que o Gastrocnemius
pars externa (2,50 ± 0,21).
Na avaliação da composição centesimal
da perna de avestruz, Feijó et al4 encontrou
umidade variando de 74,70 ± 0,10; 75,11 ± 1,52;
75,10 ± 0,35, resíduo mineral fixo - RMF 1,27 ±
0,01; 1,16 ± 0,20; 1,10 ± 0,22, lipídios 2,03 ± 0,01;
2,35 ± 0,09; 1,60 ± 0,60 e proteínas 23,80 ± 0,50;
21,94 ± 0,84; 22,20 ± 1,13, sendo semelhantes
Tabela 2. Composição centesimal dos músculos da perna de avestruz
Parâmetros
Gastrocnemiuspars
externa
Fibulares
longus
Gastrocnemius
parsinternus
Valor de p
Média
EPM
Média
EPM
Média
EPM
Umidade (g/100 g)
73,28a
0,25
72,58a
0,26
71,43b
0,26
<0,001
RMF (g/100 g)
0,93
0,011
a
0,90
0,05
0,77
Lipídios (g/100 g)
a
2,50
0,21
ab
3,83
Proteínas (g/100 g)
22,46
0,30
pH
a
6,16
Aa
0,99a
Textura (Kgf/cm2)
0,03
0,013
0,06
b
4,41
0,12
< 0,001
21,58
0,14
22,12
0,35
0,102
0,00
a
6,23
0,00
0,98a
6,53a±
0,55
L*
36,49
a*
b*
a
a
a
b
a
0,02
a
6,44
0,02
0,07
0,00
0,98a
0,00
0,07
5,14a
0,27
1,58b
0,22
< 0,001
0,70
36,12
0,78
36,78
2,54
0,93
7,58
1,18
6,18
0,23
a
6,95
0,39
0,33
5,94
0,64
5,14
0,06
b
5,67
1,07
0,66
a
a
a
a
a
a
a
Letras diferentes dentro da mesma linha indicam diferenças significativas (p < 0,05). RMF: Resíduo Mineral Fixo; EPM: Erro Padrão da Média;
Aa: Atividade de água
450
Os valores encontrados na determinação
da atividade de água nos músculos Muscularis
gastrocnemius pars externa, Muscularis fibulares
longus e Muscularis gastrocnemius pars internus
não apresentaram diferença significativa, variando
de 0,98 a 0,99. Esses resultados estão em
concordância com os encontrados por AllonsoCalleja et al11 que obtiveram valores médios de
0,995 em carne de avestruz resfriada e embalada
a vácuo.
Houve diferença (p < 0,05) nos valores de
textura nos músculos analisados. O Gastrocnemius
pars internus apresentou uma textura menor do
que os outros músculos estudados, o que pode ser
explicado por ser um músculo interno privado
de grandes contrações musculares, bem como de
atrito com o meio externo, diferente dos demais
músculos avaliados.
Marks et al12 avaliaram músculos de seis
carcaças de avestruzes quanto ao seu valor de
textura em intervalos de uma hora, um dia e uma
semana depois do abate, encontraram valores
de 10,1 kg/g, 10,0 kg/g, 10,0 kg/g, resultados
superiores aos encontrados neste experimento.
Houve diferença (p < 0,05) significativa em
relação ao parâmetro de cor b* entre os músculos
avaliados. Segundo Balog et al2, a carne de avestruz
apresenta uma coloração fortemente avermelhada,
isso ocorre devido ao alto teor de ferro, sendo
que alguns autores sugerem que dependendo da
alimentação e do procedimento de abate, podem
assumir colorações mais arroxeadas.
Majewska et al10, avaliando a cor do músculo
M. iliofibularis da coxa do avestruz, encontraram
valores para os parâmetros de cor L* 31,5–33,5,
a* 16,7–19,1 e b* 11,3–13,1 diferente dos resultados
encontrados nesta pesquisa. Hoffman e Fisher13,
avaliando a cor do M. iliofibularis, encontraram
L* 29,42, a* 5,48 e b* 3,51 semelhantes aos
encontrados nos músculos avaliados.
A carne de avestruz apresentou um valor
médio de capacidade de emulsificação 136,40 mL
de óleo/0,5 g. Em pesquisas realizadas por
Komiyama et al8, foi avaliada a capacidade
de emulsificação de carne de frango e o valor
médio encontrado foi 76,67 mL de óleo/0,5 g,
considerada esta carne pelos autores, uma boa
matéria-prima para produtos emulsionados.
Desta forma, a carne de avestruz analisada
nesta pesquisa, apresenta boa capacidade de
formar emulsões, haja vista que apresentou uma
capacidade de emulsificação quase duas vezes
superior, qual seja, 136,40 mL de óleo/0,5 g,
podendo ser utilizada como matéria-prima na
elaboração de produtos emulsionados.
O que pode explicar esta superioridade da
carne de avestruz na capacidade de emulsificação
encontrada neste trabalho em relação à carne
de frango é que a carne de avestruz apresenta
um percentual de proteína superior ao da carne
de frango no músculo estudado. Sales e Hayes14
compararam a composição centesimal das
carnes de avestruz, boi e frango e também
encontraram teores de proteínas superiores na
carne de avestruz.
A capacidade de absorção de água pode ser
influenciada por diversos fatores, por exemplo,
o pH. A carne de avestruz apresentou valores
de capacidade de retenção de água média de
55,63 %. Komiyama et al8 avaliaram a capacidade
de absorção de água da carne de peito de frango
e encontraram valores médios de 57,74 %,
semelhante a média encontrada neste experimento.
No entanto, Sanfelice et al15 encontraram valores
de 64,54 % em peito de galinhas matrizes pesadas
em final de ciclo produtivo.
CONCLUSÃO
A carne de perna de avestruz apresenta
superior rendimento pós-desossa, em relação
a outras espécies de aves, bom percentual de
macronutrientes, baixa quantidade de gordura,
alta capacidade de emulsificação e absorção
de água, o que torna possível sua utilização como
matéria prima na fabricação de embutidos.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte
financeiro.
451
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Relato de Caso/ Case Report
Esporotricose em cão Yorkshire Terrier na cidade de São Paulo,
SP – Brasil: relato de caso
Sporotrichosis in Yorkshire Terrier dog in the city of São Paulo,
SP – Brazil: case report
RIALA6/1681
Fernanda Fidelis GONSALES1*, Juliana Mariotti GUERRA2, Danilo Gouveia WASQUES3,
Rodrigo Albegaria RÉSSIO4, Paulo Eduardo BRANDÃO5, Laura Yaneth VILLARREAL Buitrago6,
Natália Coelho Couto de Azevedo FERNANDES4
*Endereço para correspondência: 1Laboratório de Bacteriologia e Micologia. Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo (USP), Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87, Cidade
Universitária São Paulo, SP, Brasil. CEP: 05508 270. Tel: 11 3091-7655. E-mail: [email protected]
2
Núcleo de Anatomia Patológica, Centro de Patologia, Instituto Adolfo Lutz
3
Histopet, Patologia Veterinária
4
Núcleo de Patologia Quantitativa, Centro de Patologia, Instituto Adolfo Lutz
5
Laboratório de Biologia Molecular Aplicada e Sorologia. Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de
São Paulo
6
MSD Brasil
RESUMO
A esporotricose é uma micose subcutânea de implantação causada pelo fungo dimórfico
Sporothrix spp. que acomete seres humanos e animais, sendo rara em cães e com baixo potencial
zoonótico. O presente relato refere-se a um cão da raça Yorkshire Terrier, fêmea, com um ano
de idade, sem histórico de contato com felinos, que apresentou lesão cutânea em membro
torácico direito, resistente ao tratamento com antibiótico. A amostra obtida da biópsia excisional
da lesão foi enviada para realização de exame histopatológico (H&E, PAS e Grocott) e análise
imuno-histoquímica para a investigação de dermatozoonoses. Os resultados confirmaram o
diagnóstico de Sporothrix spp. O animal foi tratado com itraconazol (10 mg/kg/dia via oral durante
120 dias). Não foram observadas lesões após 11 meses do início do tratamento. Atualmente, a
esporotricose não é considerada como doença de notificação compulsória. Entretanto, é importante
conscientizar os profissionais veterinários quanto ao potencial zoonótico da doença, e quanto às
características clínicas, que podem ser sutis e semelhantes à outras dermatopatias comuns.
Palavras-chave. Sporothrix, cão, imuno-histoquímica, dermatite ocupacional, zoonose.
ABSTRACT
Sporotrichosis is an implantation or subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus
Sporothrix spp. that infects both humans and animals. Dogs are rarely affected and this
microorganism is considered as of low zoonotic potential. The present study reports a case of
sporotrichosis in a one year old female Yorkshire Terrier dog, with no history of previous contact
with cats. Histopathological and immunohistochemical analyses performed in the sample, collected
by means of the lesion biopsy, revealed a nodular dermatitis with intra-lesion Sporothrix spp.
The dog was treated with itraconazole (10 mg/kg/day for 120 days). No additional skin lesions were
detected, 11 months after starting the treatment. Currently, sporotrichosis has not been included
as a disease requiring the mandatory report. However, it is important to instruct the professionals
concerning the zoonotic potential of this disease, and on the clinical features which might be very
subtle and similar to those found in the most common skin diseases.
Keywords. Sporothrix, dog, immunohistochemistry, occupational dermatitis, zoonosis.
453
Gonsales FF, Guerra JM, Wasques DG, Réssio RA, Brandão PE, Villarreal LYB, et al. Esporotricose em cão Yorkshire Terrier na cidade de
São Paulo, SP – Brasil: relato de caso. Rev Inst Adolfo Lutz. São Paulo, 2015;74(4):453-7.
A esporotricose é uma micose subcutânea
de implantação1 causada pelo fungo dimórfico
Sporothrix spp. que acomete seres humanos e
animais2,3. Sporothrix schenckii tem distribuição
natural geográfica cosmopolita e tem sido
isolado como saprófita a partir do solo e de
vegetais4. A esporotricose é uma zoonose e o
felino doméstico é considerado a principal
fonte de infecção. A transmissão ocorre via
mordedura ou arranhadura do animal infectado.
Os indivíduos mais frequentemente acometidos
são donas de casa, médicos veterinários e
cuidadores de animais1. A esporotricose em
cães é considerada rara e com baixo potencial
zoonótico2,3,5, não sendo diretamente envolvidos
na transmissão da doença, devido a escassez
de células fúngicas em lesões e a ausência do
agente na cavidade bucal1. O conhecimento
atual da esporotricose canina é derivado de
alguns relatos de caso isolados1.
A esporotricose é considerada a micose
subcutânea mais importante em saúde pública
em diversos países5. No Brasil, os primeiros
casos de esporotricose zoonótica (Sporothrix
schenckii), transmitida por gato, foram relatados
pelo Instituto Evandro Chagas, Fiocruz, no Rio
de Janeiro, entre 1994 e 19971. Até a década de
1990, havia somente 12 casos relatados envolvendo
cães. Desde 1998, o número de casos de
esporotricose zoonótica no Rio de Janeiro
aumentou, exponencialmente, devido a uma
epidemia que, ainda hoje, afeta seres humanos e
animais domésticos1.
Em 2006, na região metropolitana do Rio de
Janeiro, foram diagnosticados 44 cães com a doença,
avaliados por um período de 5 anos. Atribuiu-se
aos gatos contactantes a responsabilidade pela
infecção deste elevado número de cães4.
A esporotricose é considerada a segunda
dermatose mais frequente entre felinos domésticos
atendidos em clínicas dermatológicas em São
Paulo: 18 a 21 % de todas as dermatoses de
gatos avaliados no Hospital Veterinário da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo - HOVET/FMVZ
USP, entre 1986 e 2007. No mesmo período,
entretanto, nenhum caso canino foi diagnosticado
neste hospital6.
454
O método de referência para o diagnóstico
dessa micose é o isolamento e identificação do
fungo em cultura. Contudo, frequentemente o
diagnóstico presuntivo é obtido por identificação
histológica em bloco de parafina, particularmente
quando a infecção fúngica não era suspeita no
momento da biopsia2,3.
O presente caso refere-se a um cão da raça
Yorkshire Terrier, fêmea, com 1 ano de idade,
proveniente da cidade de Nova York, Estados
Unidos, atendido em uma clínica veterinária na
cidade de São Paulo. O animal foi encaminhado
para atendimento veterinário com presença de
lesão cutânea nodular circular e alopécica,
medindo cerca de 2,5 cm de diâmetro, localizada
em membro torácico direito, com tempo de
evolução de 15 dias, segundo relato do tutor.
Apresentava-se em bom estado geral, sem outra
queixa. O quadro dermatológico teve início sete
meses após a chegada do animal no Brasil, com
crescimento lento durante 15 dias até o
momento da consulta. A cadela vivia em
regime domiciliado, em convívio com 4 animais
da mesma raça, contactantes e assintomáticos.
O animal realizava passeios monitorados
pelo tutor, nunca havendo contato com gatos.
Pelas características macroscópicas da lesão
(Figura 1), inicialmente, a suspeita clínica foi de
lesão bacteriana por provável causa traumática,
corroborada pela alta incidência da mesma em
cães residentes na área urbana de São Paulo.
Figura 1. Lesão cutânea nodular arredondada em membro
torácico direito de um cão da raça Yorkshire Terrier, fêmea,
com 1 ano de idade
Duas aplicações de cefovecina sódica (8 mg/kg
via subcutânea), em intervalo de 14 dias, foram
administradas ao animal. Após 1 mês do início
do tratamento, a lesão permaneceu inalterada.
Deste modo, optou-se pela realização de
biópsia excisional da lesão e o fragmento obtido
foi fixado em solução de formalina 10 % e
encaminhado para análise histopatológica. Por
não haver inicialmente suspeita de etiologia
fúngica, não foi realizada coleta de material
biológico para cultura. Nos cortes corados por
hematoxilina e eosina, observou-se dermatite
piogranulomatosa multifocal coalescente moderada
a severa, sugerindo os principais diagnósticos
diferenciais de síndrome do piogranuloma
estéril,
ou
dermatite
piogranulomatosa
associada a agentes infecciosos (Figura 2A).
Para esclarecimento etiológico, procedeu-se
colorações de ácido periódico de Schiff (PAS)
e Grocott-Gomori. Foram, então, evidenciadas,
ao centro dos piogranulomas, raras estruturas
arredondadas
diminutas
compatíveis
com
leveduras, sendo a principal suspeita de
esporotricose (Figura 2B). Para confirmação,
o material foi encaminhado ao Instituto Adolfo
Lutz para exame imuno-histoquímico para
investigação de dermatozoonoses. Para isto, foram
procedidos novos cortes histológicos em lâminas
silanizadas a 3 µm, recuperação antigênica em
panela de pressão (pH 6,0), bloqueio de
peroxidase endógena e incubação com anticorpos
primário anti-Sporothrix spp. (policlonal), antiCriptococcus spp. e anti-Histoplasma spp.
(policlonal). Posteriormente, incubou-se com
anticorpo secundário ligado a polímero e
procedeu-se revelação com 3,3’-diaminobenzidina
e contra-coloração com hematoxilina. Não foi
observada imunomarcação para Criptococcus s sp.
e Histoplasma spp., no entanto, notou-se marcação
acastanhada de estruturas arrendondadas no
centro dos piogranulomas compatíveis com
Sporothrix spp. (Figura 2C).
Com o estabelecimento do diagnóstico,
foi instituída terapia medicamentosa com
itraconazol (10 mg/kg/dia via oral, por 120 dias).
O animal respondeu bem à terapia, sem
aparecimento de novas lesões, mesmo após
11 meses do início do tratamento.
A
B
C
Figura 2. Fotomicrografia de pele de cão. (A) Reação
piogranulomatosa em derme profunda. Aumento de 20 x,
coloração por H&E. (B) Coloração histoquímica evidencia
presença de estruturas arredondadas positivas (seta). Aumento
de 1000 x, coloração de ácido periódico de Schiff (PAS). (C)
Imuno-histoquímica positiva para presença de antígenos antiSporothrix spp. (seta). Aumento de 40 x, contra-coloração com
hematoxilina
O presente relato difere da casuísta
observada no Brasil, por acometer animal
oriundo de uma área não considerada endêmica
para esporotricose (Zona Oeste de São Paulo);
por ser da espécie canina e não ter tido relato
de contato com gatos, considerados a principal
fonte de infecção para a esporotricose1. Em cães
a localização mais frequentemente observada da
esporotricose é o focinho, provavelmente, em
decorrência do hábito destes animais em farejar
o ambiente1. Testículos, cavidade bucal e mucosa
conjuntiva5, também são descritas como áreas
em que o fungo é encontrado.
Outra via de transmissão da esporotricose
inclui a inoculação do agente do solo ou vegetal
contaminado7. À parte tem sido relatada, em
outros Estados, como uma doença ocupacional,
contraída por profissionais de jardinagem ou
floricultura, em contato com material vegetal e
455
solo contaminado7. De fato, no presente caso
canino, esta parece ser uma hipótese mais
provável, já que não foi observado contato
do animal com felinos. Embora o cão fosse
mantido em regime domiciliado, era submetido
a eventuais passeios em ambiente externo,
sempre supervisionado de seus tutores. Não é
possível descartar a possibilidade de inoculação
por meio de contato com solo ou vegetal
contaminado em parques, praças ou jardins.
O presente caso exibiu lesão dérmica, com
infiltrado predominantemente piogranulomatoso,
exibindo raras células fúngicas. Esta observação,
vai de acordo com o relatado por Miranda et al8
que, em estudo de 86 cães com esporotricose no
Rio de Janeiro, observaram 89,5 % dos casos com
infiltrado piogranulomatoso, com presença de
poucas leveduras, recomendando a realização de
cortes seriados nos casos suspeitos3. Uma vez que
não se obteve amostra biológica sem fixador, não
foi possível isolamento fúngico e determinação
da espécie. Recentemente, houve mudança
na classificação taxonômica do Sporothrix.
A esporotricose sempre foi atribuída ao fungo
Sporothrix schenkii, única espécie considerada
patogênica para homem e animal, mas com
análises fenotípicas e genotípicas, atualmente
passam a ser pertencentes ao complexo Sporothrix
schenkii, 6 espécies crípticas8.
Apesar do itraconazol ser o medicamento de
primeira escolha9, terapias alternativas são
sugeridas para o tratamento da esporotricose.
Larsson et al6 sugerem, para os casos de
esporotricose em cães, a administração de
iodeto de sódio ou potássio a 20 % (40 mg/kg a
cada 8 horas, via oral, enquanto houver lesão,
e após a remissão da mesma, por mais 30 dias).
Souza et al10 relataram um caso de
esporotricose canina, cuja terapia instituída foi
a administração do itraconazol. O animal por
esse grupo relatado não apresentou efeitos
adversos ao uso do medicamento10.
A esporotricose não é doença de
notificação compulsória; entretanto, é importante
conscientizar profissionais veterinários quanto
ao potencial zoonótico da doença, e quanto às
características clínicas da doença, que podem
ser, como no presente caso, sutis e semelhantes
456
a outras dermatopatias comuns. O diagnóstico
correto da etiologia permite a conduta clínica
adequada, com administração de antifúngicos,
além do alerta para os contactantes, humanos
e animais, para evitar a exposição ao agente.
Por ser uma zoonose com número crescente
de casos relatados no Rio de Janeiro, os casos
suspeitos de esporotricose devem ser investigados
e reportados.
REFERÊNCIAS
1. Schechtman RC. Sporotrichosis: Part II. Skinmed.
2010;8(5):275–80.
2. Miranda LH, Quintella LP, Menezes RC, dos Santos
IB, Oliveira RVC, Figueiredo FB, et al. Evaluation
of immunohistochemistry for the diagnosis of
sporotrichosis in dogs. Vet J. 2011;190(3):408–11.
[DOI:10.1016/j.tvjl.2010.12.004].
3. Miranda LHM, Quintella LP, dos Santos IB,
Menezes RC, Figueiredo FB, Gremião IDF, et
al. Histopathology of canine sporotrichosis:
A morphological study of 86 cases from Rio de
Janeiro
(2001-2007).
Mycopathologia.
2009;168(2):79–87. [DOI: 10.1007/S11046-0099198-4].
4. Schubach TMP, Schubach AO, Okamoto T,
Barros MBL, Figueiredo FB, Cuzzi T, et al.
Canine sporotrichosis in Rio de Janeiro, Brazil:
clinical presentation, laboratory diagnosis and
therapeutic response in 44 cases (1998–2003).
Med Mycol. 2006;44(1):87–92.
5. Madrid IM, Mattei AS, Fernandes CG, de Oliveira
Nobre M, Meireles MC. Epidemiological findings
and laboratory evaluation of sporotrichosis:
a description of 103 cases in cats and dogs in
southern Brazil. Mycopathologia. 2012;173(4):265–
73. [DOI: 10.1007/s11046-011-9509-4].
6. Larsson CE. Esporotricose. Braz J Vet Res Anim
Sci. São Paulo. 2011;48(3):250–9.
7. Lopes JO, Alves SH, Mari CR, Brum LM,
Westphalen JB, Altermann MJ, et al. Epidemiologia
da esporotricose na região central do Rio
Grande do Sul. Rev Soc Bras Med Trop.
1999;
32(5):541-5.
[DOI:
10.1590/S003786821999000500012].
8. Cruz LCH. Complexo Sporotrhix schenkii.
Revisão de parte da literatura e considerações
sobre o diagnóstico e a epidemiologia. Vet Zootec.
2013; 20 (Edição Comemorativa): 08-28.
10. Souza NT, Nascimento ACBM, Souza JOT,
Santos FCGCA, Castro RB. Esporotricose canina:
relato de caso. Arq Bras Med Vet Zootec. 2009; 61(3):
572-6. [DOI:10.1590/SO102.09352009000300008].
9. Center for Disease Control and Prevention CDC.
U.S.A Department of Health & Human Service
(acesso 2016 Maio 16). Disponível em: [http://www.
cdc.gov/fungal/diseases/sporotrichosis/].
457
Resumos de teses e dissertações
Avaliação de diferentes vias de imunização com novo
adjuvante para Neisseria meningitidis em diferentes
linhagens de camundongos
Evaluation of different immunization routes with new adjuvant
for Neisseria meningitidis in different strains of mouse
RIALA6/1682
Brito LT. Avaliação de diferentes vias de imunização com novo adjuvante para Neisseria
meningitidis em diferentes linhagens de camundongos. São Paulo 2015. 110 p. [Dissertação
de Mestrado – Biotecnologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo,
USP]. Orientador: Elizabeth Natal De Gaspari.
Na primeira parte do estudo camundongos Swiss foram imunizados por diferentes vias de imunização
com OMVs de Neissera meningitidis com DDA-BF ou HA como adjuvantes . Os adjuvantes e diferentes
vias foram comparados quanto às respostas imunes por meio de ELISA, Immunoblot, HTT e análise
histopatológica. Os animais imunizados apenas com adjuvantes não produziram títulos de anticorpos.
Após única dose e decorridos 15 dias, a imunização com HA e antígeno apresentou títulos de IgG
mais altos em relação ao DDA-BF nas vias subcutânea, intraperitoneal e intramuscular. Após
2 doses e 66 dias, todas as vias exibiram títulos de IgG, sendo as que receberam o HA com OMVs
produziram títulos discretamente mais altos e ainda altos índices de avidez. O perfil da resposta
imune quanto ao padrão Th 1/Th 2 foi avaliado. Ambos adjuvantes promoveram a produção de IgG2a,
as respostas variaram de acordo com as vias de imunização utilizada. Enquanto as vias subcutânea
e intramuscular induziram títulos semelhantes de IgG2a para ambos adjuvantes, a via intraperitoneal
com DDA teve título mais alto. A produção de IgG1 foi modulada apenas por HA, sendo mais robusta
na via subcutânea, seguida pela intramuscular com valores muito próximos aos da intraperitoneal.
Camundongos isogênicos Balb/c H2d e C57Bl/6J H2b foram imunizados pela via subcutânea.
Foram avaliadas as produções de anticorpos do tipo IgG, IgG1 e IgG2a, bem como o índice de
avidez de IgG. De modo geral, os grupos de OMVs HA induziram maior produção de anticorpos
que OMVs DDA ou apenas OMVs, enquanto os controles HA, DDA e salina não apresentaram
níveis de anticorpos. Pelas técnicas utilizadas no estudo não observamos uma diferença significante
entre os dois adjuvantes utilizados independente da via e da linhagem de camundongos utilizados.
Palavras-chave. Neisseria meningitidis B, vesículas de membrana externa, DDA-BF, adjuvantes,
linhagens isogênicas, análise histopatológica
Tese disponível em: http://www.teses.usp.br
Rev Inst Adolfo Lutz. 2015; 74(4):458
458
Resumos de teses e dissertações
Imunogenicidade de antígenos de vesículas de membrana
externa (OMVs) de Neisseria meningitidis B associado a
lípide catiônico (DDA-BF)
Immunogenicity of Neisseria meningitidis B outer membrane
vesicles (OMVs) associated with cationic lipid (DDA-BF)
RIALA6/1683
Rinaldi FM. Imunogenicidade de antígenos de vesículas de membrana externa
(OMVs) de Neisseria meningitidis B associado a lípide catiônico (DDA-BF).
São Paulo 2014. 130 p. [Dissertação de Mestrado - Biotecnologia, Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo – USP]. Orientador: Elizabeth Natal De Gaspari.
Neisseria meningitidis é um diplococo Gram–negativo, aeróbio e encapsulado, causador mais
comum de meningite e septicemia. Este agente é o principal causador de infecções bacterianas invasivas
no mundo. Apesar de existirem 13 sorogrupos de N. meningitidis, apenas 6 são capazes de causar
infecção: A, B, C, W135, X e Y. O sorogrupo B difere dos outros sorogrupos patogênicos por sua
cápsula polissacáride ter composição idêntica ao ácido policiálico, presente em muitas glicoproteínas
humanas, particularmente encontrados no tecido cerebral fetal, e bioquimicamente homóloga com
a estrutura molecular de adesão do neurônio. Sendo assim, a cápsula polissacáride não pode ser
usada em vacinas conjugadas, pois pode causar autoimunidade, sendo pouco imunogênica. Doenças
meningocócicas causadas pelos sorogrupos A, C, Y e W135 podem ser prevenidas pelas vacinas que
contêm polissacarídeos capsulares específicos conjugados. Para que uma vacina seja eficaz contra o
sorogrupo B, é importante que esta abranja todos os sorotipos e seja capaz de promover imunidade
duradoura, principalmente em crianças abaixo de dois anos, as mais acometidas. Vacinas baseadas em
vesículas de membrana externa (OMVs, do inglês Outer Membrane Vesicles) de N. meningitidis B são
amplamente estudadas. No presente estudo, OMVs de meningococo B (B:4:P1.9) foram associadas
a um lipídio catiônico, o dioctadecildimetilamônio (DDA-BF) em preparação antigênica testada
em camundongos fêmeas não isogênicos, e comparamos os títulos de anticorpos IgG, IgG1, IgG2a e
IgG2b com os anticorpos produzidos por camundongos imunizados com a mesma OMVS associada
ao hidróxido de alumínio, por ELISA. As análises foram realizadas com soros de cada animal colhidos
individualmente, após 60 dias de imunização. A avidez dos anticorpos também foi analisada por ELISA.
Immunoblot e dot-ELISA avaliaram a reação específica entre a cepa homóloga usada na imunização e a
reação a antígenos cruzados com outras cepas de meningococo. A hipersensibilidade tardia (HTT) foi
comparada entre os dois grupos experimentais, após o desafio com cepa homóloga em uma das patas,
depois de 24 horas da injeção, após 14 dias da primeira dose de imunização.
Palavras-chave. Neisseria meningitidis B, vesículas de membrana externa, DDA-BF, adjuvante, vacinas
meningocócicas, avidez.
Tese disponível em: http://www.teses.usp.br
Rev Inst Adolfo Lutz. 2015; 74(4):459
459
Colaboradores
COLABORADORES
Agradecimento aos relatores
O Corpo Editorial agradece a todos os relatores abaixo relacionados que, com seu trabalho voluntário e anônimo ao
longo de 2015 contribuíram para o bom andamento das atividades e elevação do nível dos artigos publicados pela
Revista.
•
Adriano Gomes da Cruz Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Departamento de Tecnologia de Alimentos. Campinas, SP
•
Alceu Afonso Jordão Junior Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento
de Clínica Médica. Ribeirão Preto, SP
•
Alcina Maria Liserre Instituto Adolfo Lutz, Centro de Alimentos, Núcleo de Microbiologia. São Paulo, SP
•
Alexandre Ribeiro Bello Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas, Laboratório
de Biologia Molecular. Rio de Janeiro, RJ
•
Alexandre Tourino Mendonça Universidade Vale do Rio Verde. Três Corações, MG
•
Alicia de Francisco Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de
Ciências e Tecnologia de Alimentos. Florianópolis, SC
•
Aline Martins de Carvalho Universidade de São Paulo, Faculdade de Saúde Pública. São Paulo, SP
•
Aline Sobreira Bezerra Universidade Federal de Santa Maria. Palmeira das Missões, RS
•
Amanda Bagolin do Nascimento Universidade Federal de Santa Catarina, Núcleo de Pesquisa de Nutrição em
Produção de Refeições. Florianópolis, SC
•
Ana Carolina Maisonnave Arisi Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias,
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos. Florianópolis, SC
•
Ana Flávia Santos Coelho Fundação Universidade Federal do Tocantins, Engenharia de Alimentos, Laboratório
de Microbiologia de Alimentos. Palmas, TO
•
Ana Lucia Frugis Yu Secretaria de Estado da Saúde do Estado de São Paulo, Coordenadoria de Controle de
Doenças, Centro de Vigilância Epidemiológica “Prof. Alexandre Vranjac”, Divisão de Doenças de Transmissão
Respiratória. São Paulo, SP
•
Ana Maria Centola Vidal Martins Centro Universitário de Rio Preto. São José do Rio Preto, SP
•
Ana Marta Ribeiro Machado Universidade Federal de São Carlos. São Carlos, SP
•
Ana Paula Guedes Frazzon Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de Biociências, Departamento
de Microbiologia. Porto Alegre, RS
•
Bruno Carius Garrido Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, Diretoria de Metrologia
Científica e Industrial, Divisão de Metrologia Química, Laboratório de Análise Inorgânica. Duque de Caxias, RJ
•
Carla da Silva Carneiro Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Faculdade de
Farmácia, Departamento de Produtos Naturais e Alimentos. Rio de Janeiro, RJ
460
Rev Inst Adolfo Lutz. 2015;74(4):460-7
Colaboradores
•
Carla Léa de Camargo Vianna Cruz Instituto de Tecnologia de Alimentos, Cereal/Chocotec. Campinas, SP
•
Carlos Cordeiro Universidade Federal do Pará, Faculdade de Engenharia de Pesca, Laboratório de Tecnologia do
Pescado. Bragança, PA
•
Cássia Aldrin de Mello Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e
Zootecnia. Cuiabá, MT
•
Cátia Regina Storck Centro Universitário Franciscano. Santa Maria, RS
•
Cecilia Cristina Marques dos Santos Instituto Adolfo Lutz, Centro de Laboratórios Regionais de São José do Rio
Preto, Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas. São José do Rio Preto, SP
•
Célia Maria Carvalho Pereira Araujo Romão Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde, Departamento de Microbiologia. Rio de Janeiro, RJ
•
Christian Mauricio Barreto Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de Ciência e Tecnologia de
Alimentos, Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada. Porto Alegre, RS
•
Christiane Soares Pereira Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Departamento de Bacteriologia.
Rio de Janeiro, RJ
•
Clarissa Damiani Universidade Federal de Goiás, Escola de Agronomia, Departamento de Tecnologia de
Alimentos. Goiânia, GO
•
Clícia Maria de Jesus Benevides Universidade do Estado da Bahia, Centro de Ciências da Saúde e dos Alimentos,
Departamento de Ciências da Vida. Salvador, BA
•
Cristiana Ferreira Jardim de Miranda Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG
•
Cyntia Maria Telles Fadel-Picheth Universidade Federal do Paraná, Departamento de Patologia Médica, Setor
de Ciências da Saúde. Curitiba, PR
•
Daiana Novello Universidade Estadual do Centro-Oeste do Paraná, Departamento de Nutrição. Guarapuava,
PR
•
Daisy Pontes Netto Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva. Londrina, PR
•
Daniel Granato Wageningen University, Institute of Food Safety. Wageningen, Holanda
•
Daniele Leal Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”. Piracicaba, SP
•
Delvio Sandri Universidade de Brasília. Brasília, DF
•
Dennis Armando Bertolini Universidade Estadual de Maringá, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de
Análises Clínicas. Maringá, PR
•
Diana Kolberg Instituto de Tecnologia de Pernambuco, Laboratório de Análises de Resíduos de Agrotóxicos e de
Produtos Alcoólicos – LabTox. Recife, PE
•
Edimir Andrade Pereira Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, PR
461
Colaboradores
•
Elayse Maria Hachich Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. São Paulo, SP
•
Eliana Fortes Gris Universidade de Brasília. Brasília, DF
•
Eliane Gil Rodrigues de Castro Universidade de São Paulo, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina,
Instituto da Criança, Centro de Assistência Toxicológica. São Paulo, SP
•
Eliete Caló Romero Instituto Adolfo Lutz, Centro de Bacteriologia, Núcleo de Doenças Entéricas e Infecções por
Patógenos Especiais. São Paulo, SP
•
Elisangela Elena Nunes Carvalho Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciências dos Alimentos.
Lavras, MG
•
Elizabeth A. Accioly Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Nutrição “Josué de Castro”,
Departamento de Nutrição e Dietética. Rio de Janeiro, RJ
•
Elton Nunes Britto Centro Universitário Nilton Lins. Manaus, AM
•
Elza Kimura Grimshaw Universidade Estadual de Maringá, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de
Farmácia e Farmacologia. Maringá, PR
•
Erika Madeira Moreira da Silva Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da Saúde. Vitória,
ES
•
Fabio Cristiano Brod Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Ciência e Tecnologia de
Alimentos, Laboratório de Biologia Molecular. Florianópolis, SC
•
Fernanda Barbosa dos Reis Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Ribeirão Preto,
SP
•
Fernanda Fidelis Gonsales Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. São
Paulo, SP
•
Fernando Mauro Pereira Soares Universidade Federal do Amazonas, Instituto de Saúde e Biotecnologia.
Coari, AM
•
Geraldo Arraes Maia Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, CE
•
Giselle Nobre Costa Universidade do Oeste do Paraná. Londrina, PR
•
Gladis Aver Ribeiro Universidade Federal de Pelotas, Instituto de Biologia, Departamento de Microbiologia e
Parasitologia. Capão do Leão, RS
•
Graça Maria de Castro Viana Universidade Federal do Maranhão, Centro de Ciências da Saúde, Departamento
de Patologia. São Luís, MA
•
Graciele da Silva Campelo Borges Universidade Federal da Paraíba, Centro de Tecnologia. João Pessoa, PB
•
Heitor Franco de Andrade Jr Universidade de São Paulo, Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, Laboratório
de Protozoologia. São Paulo, SP
•
Helena Keico Sato Secretaria de Estado da Saúde do Estado de São Paulo, Coordenadoria de Controle de Doenças,
Centro de Vigilância Epidemiológica “Prof. Alexandre Vranjac”. São Paulo, SP
462
Colaboradores
•
Herminia Yohko Kanamura Universidade Federal de Alfenas, Departamento Patologia e Parasitologia.
Alfenas, MG
•
Ilana Teruszkin Balassiano Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Zoonoses
Bacterianas, Serviço de Referência em Leptospirose. Rio de Janeiro, RJ
•
Ingrid Cabral Machado Instituto de Pesca, Centro Avançado da Pesquisa Tecnológica do Agronegócio do
Pescado Marinho. Santos, SP
•
Ismael Rockenbach de Miranda Universidade Federal da Paraíba, Centro de Tecnologia e Desenvolvimento
Regional, Departamento de Tecnologia de Alimentos. João Pessoa, PB
•
Jacinto da Costa Silva Neto Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Histologia e Embriologia.
Recife, PE
•
Jane Martha Graton Mikcha Universidade Estadual de Maringá, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de
Análises Clínicas. Maringá, PR
•
João Vicente Neto Escola Agrotécnica Federal de Cáceres. Cáceres, MT
•
Jorge Luiz Fortuna Universidade do Estado da Bahia, Departamento de Educação, Laboratório de Microbiologia.
Teixeira de Freitas, BA
•
José Aires Ventura Instituto Capixaba de Pesquisa Assistência Técnica e Extensão Rural. Vitória, ES
•
José Ângelo Wenceslau Góes Universidade Federal da Bahia, Escola de Nutrição. Salvador, BA
•
José Raniere Mazile Vidal Bezerra Universidade Estadual do Centro-Oeste do Paraná, Departamento de
Engenharia de Alimentos. Guarapuava, PR
•
Josefa Bezerra da Silva Instituto Butantan, Centro de Biotecnologia, Laboratório de Biotecnologia Molecular I.
São Paulo, SP
•
Juliana Mariotti Guerra Instituto Adolfo Lutz, Centro de Patologia, Núcleo de Patologia Quantitativa.
São Paulo, SP
•
Leyva Cecília Vieira de Melo Instituto Adolfo Lutz, Centro de Parasitologia e Micologia, Núcleo de
Enteroparasitas. São Paulo, SP
•
Lilian Viana Teixeira Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária, Departamento de
Tecnologia e Inspeção. Belo Horizonte, MG
•
Lívia de Lacerda de Oliveira Pineli Universidade de Brasília. Brasília, DF
•
Lizziane Kretli Winkelströter Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Ribeirão
Preto, SP
•
Lourdes Rehder de Andrade Vaz de Lima Instituto Adolfo Lutz, Centro de Imunologia. São Paulo, SP
•
Lúcia Maria Lopes de Almeida Guedes Diefenbach Laboratório Central de Saúde Pública do Rio Grande
do Sul, Divisão de Análise de Produtos, Seção de Microscopia e Triagem. Porto Alegre, RS
463
Colaboradores
•
Lúcia Rosa de Carvalho Universidade Federal Fluminense, Centro de Ciências Médicas, Faculdade de Nutrição.
Niterói, RJ
•
Luciana Maria Ramires Esper Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Farmácia, Departamento de
Bromatologia, Laboratório de Controle Microbiológico de Alimentos. Niterói, RJ
•
Luciana Pereira Lobato Universidade Federal de Sergipe. Lagarto, SE
•
Luciana Regina Meireles Jaguaribe Ekman Universidade de São Paulo, Instituto de Medicina Tropical de
São Paulo, Laboratório de Protozoologia. São Paulo, SP
•
Luciano José Quintão Teixeira Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Agrárias,
Departamento de Engenharia Rural. Alegre, ES
•
Luciléia Granhen Tavares Colares Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Nutrição “Josué de
Castro”, Departamento de Nutrição e Dietética, Laboratório de Pesquisa e Extensão em Sustentabilidade na
Produção de Refeições. Rio de Janeiro, RJ
•
Lucilene Granuzzio Camossi Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Piracicaba, SP
•
Luisa Patrícia Fogarolli de Carvalho Universidade José do Rosário Vellano, Faculdade de Ciências Médicas,
Hospital Universitário Alzira Velano. Alfenas, MG
•
Luiz Simeão do Carmo Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento
de Microbiologia. Belo Horizonte, MG
•
Marcelo Fabiano Gomes Boriollo Universidade José do Rosário Vellano. Alfenas, MG
•
Márcia Bittar Atui Instituto Adolfo Lutz, Centro de Alimentos, Núcleo de Morfologia e Microscopia. São
Paulo, SP
•
Márcia de Aguiar Ferreira Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária.
Brasília, DF
•
Marcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz, Centro de Laboratórios Regionais de Rio Claro, Núcleo
de Ciências Biomédicas. Rio Claro, SP
•
Marcia Helena de Rizzo Matta Fundação Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Centro de Ciências
Exatas e Tecnologia, Departamento de Química. Campo Grande, MT
•
Márcia Monks Jantzen Universidade Federal de Pelotas, Departamento de Ciência dos Alimentos. Pelotas, RS
•
Marcia Regina Beux Universidade Federal do Paraná, Centro Politécnico, Departamento de Patologia Básica,
Setor de Ciências Biológicas. Curitiba, PR
•
Marcondes Viana da Silva Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Departamento de Estudos Básicos e
Instrumentais, Núcleo de Estudos em Ciência de Alimentos. Itapetinga, BA
•
Marcone Augusto Leal de Oliveira Universidade Federal de Juiz de Fora, Instituto de Ciências Exatas,
Departamento de Química. Juiz de Fora, MG
•
Maria Auxiliadora de Brito Rodas Instituto Adolfo Lutz, Centro de Alimentos, Núcleo de Química, Física e
Sensorial. São Paulo, SP
464
Colaboradores
•
Maria Claudia Dantas Porfirio Borges Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública, Departamento de Microbiologia. Goiânia, GO
•
Maria da P. Spinola Miranda Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Departamento de Análises
Bromatológicas. Salvador, BA
•
Maria das Graças Xavier de Carvalho Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Saúde e Tecnologia
Rural, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Laboratório de Tecnologia e Inspeção de Leite. Patos, PB
•
Maria de Fátima Costa Pires Secretaria de Estado da Saúde do Estado de São Paulo, Coordenadoria de Controle
de Doenças, Programa de Pós Graduação em Ciências. São Paulo, SP
•
Maria Fernanda Rios Grassi Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador BA
•
Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Saúde, Departamento de Química, Laboratório de Alimentos e Contaminantes. Rio de Janeiro, RJ
•
Maria Luiza Bazzo Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de
Análises Clínicas, Laboratório de Biologia Molecular e Micobactérias. Florianópolis, SC
•
Maria Margareth Veloso Naves Universidade Federal de Goiás. Goiânia, GO
•
Maria Regina Branquinho Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde,
Departamento de Microbiologia, Setor de Biologia Molecular. Rio de Janeiro, RJ
•
Maria Regina Reis Amendoeira Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Toxoplasmose.
Rio de Janeiro, RJ
•
Maria Teresa de Alvarenga Freire Universidade de São Paulo, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos,
Departamento de Engenharia de Alimentos. Pirassununga, SP
•
Mauro Batista de Morais Universidade Federal de São Paulo, Departamento de Pediatria. São Paulo, SP
•
Monica Beatriz Alvarado Soares Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Departamento
de Tecnologia de Alimentos. Erechim, RS
•
Myrian Morato Duarte Fundação Ezequiel Dias, Laboratório de Biologia Molecular. Belo Horizonte, MG
•
Nancy da Rós Instituto Butantan, Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção. São Paulo, SP
•
Natália Coelho Couto de Azevedo Instituto Adolfo Lutz, Centro de Patologia, Núcleo de Anatomia Patológica.
São Paulo, SP
•
Natalia Paroul Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Departamento de Química. Erechim, RS
•
Nilcimelly Rodrigues Donato Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Educação e Saúde. Cuité,
PB
•
Patrícia Carla B. Trevizam Moraes Universidade Metodista de Piracicaba. Piracicaba, SP
•
Patrícia Yoshida Faccioli Martins Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Caprinos e Ovinos,
Área de Sanidade Animal. Sobral, CE
465
Colaboradores
•
Paula Dias Bevilacqua Universidade Federal de Viçosa, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento
de Veterinária. Viçosa, MG
•
Paulo Afonso Lopes Instituto Militar de Engenharia, Seção de Engenharia de Construção. Rio de Janeiro, RJ
•
Pedro Ysmael Cornejo Mujica Universidade Federal do Tocantins, Laboratório de Tecnologia de Carnes,
Pescados e Derivados. Palmas, TO
•
Priscila Cristina Bizam Vianna Universidade Federal do Triangulo Mineiro, Instituto de Ciências Tecnológicas
e Exatas, Departamento de Engenharia dos Alimentos. Uberaba, MG
•
Rafael Silva Cadena Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Laboratório
de Análise Sensorial. Campinas, SP
•
Raquel Gouvêa Universidade Federal Fluminense, Centro de Ciências Médicas, Departamento de Tecnologia de
Alimentos. Niterói, RJ
•
Regina Célia Rodrigues de Miranda Milagres Universidade Federal de Viçosa, Centro de Ciências Biológicas,
Departamento de Nutrição e Saúde. Viçosa, MG
•
Renata Alexandra Moreira das Neves Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da
Saúde, Departamento de Saúde Coletiva e Nutrição. Natal, RN
•
Renata Golin Bueno Costa Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais, Centro Tecnológico Instituto de
Laticínios Cândido Tostes. Juiz de Fora, MG
•
Renato Souza Cruz Universidade Estadual de Feira de Santana, Departamento de Tecnologia. Feira de
Santana, BA
•
Ricardo Ishak Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biomédicas, Laboratório de Virologia.
Belém, PA
•
Ricardo Targino Moreira Universidade Federal da Paraíba, Centro de Tecnologia, Departamento de Tecnologia
de Química e de Alimentos. João Pessoa, PB
•
Rinaldini Coralini PhilippoTancredi Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde, Escola de Nutrição. Rio de Janeiro, RJ
•
Rita de Cássia Coelho de Almeida Akutsu Universidade de Brasília, Departamento de Nutrição. Brasília, DF
•
Roberto Carlos Fernandes Barsotti Instituto Adolfo Lutz, Centro de Laboratórios Regionais de Santos, Núcleo
de Ciências Químicas e Bromatológicas. Santos, SP
•
Roberto Christ Vianna Santos Centro Universitário Franciscano, Laboratório de Pesquisa em Microbiologia
Clínica. Santa Maria, RS
•
Rodrigo Caciano de Sena Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, Diretoria de Metrologia
Científica e Industrial, Divisão de Metrologia Química, Laboratório de Análise Inorgânica. Duque de Caxias, RJ
•
Rodrigo Costa da Silva Mississippi State University, College of Veterinary Medicine, Pathobiology and Population
Medicine, Comparative Platelet Investigation Laboratory and Molecular Diagnosis Laboratory. Mississipi, USA
•
Ruth Estela Gravato Rowlands Instituto Adolfo Lutz, Centro de Alimentos, Núcleo de Microbiologia. São Paulo, SP
466
Colaboradores
Rósea de Cássia Vieira Cardoso Universidade Federal da Bahia, Escola de Nutrição, Departamento de Ciência
dos Alimentos. Salvador, BA
•
Sabrina Neves Casarott Universidade Estadual Paulista, Campus de São José do Rio Preto. São José do Rio
Preto, SP
•
Sheila Araujo Teles Universidade Federal de Goiás, Faculdade de Enfermagem e Nutrição, Departamento de
Enfermagem. Goiânia, GO
•
Sidney Augusto Vieira Filho Universidade Federal de Ouro Preto, Escola de Farmácia, Departamento de
Farmácia. Ouro Preto, MG
•
Silvana Gonçalves Brito de Arruda Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória, Núcleo
de Nutrição. Vitória de Santo Antão, PE
•
Silvia Helena Govoni Brondi Centro de Desenvolvimento de Indústrias Nascentes. São Carlos, SP
•
Simone Baldini Lucheis Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, Gabinete da Coordenadoria,
Departamento de Descentralização do Desenvolvimento. Bauru, SP
•
Soraia Vilela Borges Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciência dos Alimentos. Lavras, MG
•
Sueli Blanes Damy Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina, Departamento de Cirurgia, Disciplina de
Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental. São Paulo, SP
•
Tiane Martin de Moura Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Nutrição. Pelotas, RS
•
Valéria Adriana Pereira Martins Instituto Adolfo Lutz, Centro de Medicamentos, Cosméticos e Saneantes,
Núcleo de Ensaios Físicos e Químicos em Medicamentos. São Paulo, SP
•
Vanda de Sá Lirio Coordenação de Vigilância em Saúde, Subgerência de Laboratório de Controle de Qualidade
em Saúde, Seção Técnica de Microscopia Alimentar. São Paulo, SP
•
Vanessa Aparecida Marcolino Instituto Federal do Paraná. Paranavaí, PR
•
Vera Lúcia Arroxelas Galvão de Lima Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Ciências
Domésticas. Recife, PE
•
Victor Eduardo Arrúa Arias Centro de Referência da Saúde da Mulher Hospital Pérola Byington, Núcleo de
Patologia. São Paulo, SP
•
Vivianne Montarroyos Padilha Universidade Federal de Pernambuco. Recife, PE
•
Wagner Wollinger Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, Divisão de Metrologia Química.
Duque de Caxias, RJ
Agradecimento especial pela revisão do inglês
Dra. Mirthes Ueda
467
Instruções Aos Autores
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
A Revista do Instituto Adolfo Lutz (RIAL), iniciada em 1941, é uma publicação trimestral com a missão de divulgar
resultados de investigações científicas relacionadas às ações de promoção à saúde, prevenção e controle de agravos
e doenças de interesse em saúde pública, além de incentivar a produção de artigos científicos nas áreas de vigilância
epidemiológica e sanitária e de proporcionar a atualização e aprimoramento de profissionais da área em âmbito
nacional e internacional.
A RIAL é inter e multidisciplinar, arbitrada, aberta a contribuições de autores nacionais e estrangeiros. Publica
prioritariamente pesquisas originais com contribuições relevantes na área laboratorial em saúde pública, realizadas
com rigor científico e que possam ser replicadas e generalizadas.
Política Editorial
Editada nos formatos impresso e eletrônico, a RIAL tem interesse por trabalhos originais em todas as áreas laboratoriais
em saúde púbica. São também publicadas outras contribuições inéditas, desde que sobre temas atuais e importantes –
revisões de literatura, comunicações breves e notas científicas – além de resumos de teses e dissertações.
Os manuscritos devem destinar-se exclusivamente à RIAL, não sendo permitida sua apresentação simultânea a outro
periódico. As contribuições podem ser apresentadas em português ou inglês.
Os manuscritos submetidos são analisados inicialmente pelos editores quanto ao atendimento aos padrões da RIAL e
às normas para o envio dos originais. Aqueles manuscritos selecionados são encaminhados para avaliação por pares
externos de área pertinente, sempre de instituições distintas àquela da origem do manuscrito, sendo garantido o
anonimato e a confidencialidade durante todo o processo de avaliação. Após receber os pareceres, o Corpo Editorial,
que detém a decisão final sobre a publicação ou não do texto, avalia a aceitação do texto sem modificações, a recusa
ou a devolução ao autor com as sugestões apontadas pelos relatores.
Os manuscritos submetidos devem atender à política editorial da RIAL e às Instruções aos Autores, que seguem os
Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedica Journals: Writing and Editing for Biomedical Publication
(http://www.icmje.org) , além dos critérios éticos da pesquisa humana e animal.
Os autores devem explicitar em MÉTODOS que a pesquisa foi conduzida dentro dos padrões exigidos pela Resolução
466 de 12 de dezembro de 2012 do Ministério da Saúde – Conselho Nacional da Saúde, em caso de ética humana, e
pela Lei Federal 11.794 de 08 de outubro de 2008, pela Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais
para fins Científicos e Didáticos - DBCA de 2013 e pelas Resoluções Normativas N° 12, N° 13 e N° 14 no caso
de experimentação animal. A pesquisa deverá ser aprovada por comissão de ética humana (CEP) reconhecida pela
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) – vinculada ao Conselho Nacional de Saúde (CNS), bem como
registro dos estudos de ensaios clínicos em base de dados, conforme recomendação aos editores da Lilacs e Scielo,
disponíveis em: http://bvsmodelo.bvsalud.org/site/lilacs/homepage.htm. No caso de experiemntação animal o projeto
deverá ser aprovado por Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) reconhecida pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal do Ministério de Ciência e Tecnologia e Inovação (CONCEA). O nome da base
de dados, sigla e/ou número do ensaio clínico, assim como o número do processo e o nome da comissão de ética
que aprovou o projeto, deverão ser colocados ao final do RESUMO. Nos casos de ensaios envolvendo animais, estes
deverão atender a Lei Federal 9605 contra crimes ambientais, a Lei federal 6638/76 e a Lei 11.794/08, que normatiza
a utilização de animais em pesquisa científica. Os autores deverão ter em seu poder todos os documentos referentes a
este procedimento, que poderão ser solicitados em qualquer momento pelos editores.
Os autores serão responsáveis por reconhecer e revelar conflitos financeiros, de interesse comercial e/ou associativo,
relacionados ao material de trabalho ou outros que possam influenciá-los, apresentando uma declaração sobre a
existência ou não de tais conflitos. Os relatores também devem revelar aos editores qualquer conflito que possa influir
ou impedir as suas avaliações.
468
Os manuscritos publicados são de propriedade da RIAL. A transferência de direitos autorais será solicitada após a
aprovação do manuscrito para publicação.
Informações Gerais
Os manuscritos submetidos à publicação na RIAL devem ser apresentados de acordo com as Instruções aos Autores.
São aceitos manuscritos nos idiomas: português e inglês.
O manuscrito deve ser encaminhado em formato eletrônico (e-mail) ou impresso, aos cuidados do editor-chefe da
RIAL, no seguinte endereço:
Revista do Instituto Adolfo Lutz (RIAL)
Núcleo de Acervo
Av. Dr. Arnaldo, 355 - Cerqueira César - São Paulo - SP - Brasil - CEP: 01246-000
Ou por meio eletrônico em [email protected]
Pormenores sobre os itens exigidos para apresentação do manuscrito estão descritos a seguir.
1. Categoria De Artigos
1.1 Artigos Originais: Incluem estudos relacionados à prevenção e controle de agravos e à promoção à saúde. Devem
ser baseados em novos dados ou perspectivas relevantes para saúde pública. Cada artigo deve conter objetivos e
hipóteses claras, desenho e métodos utilizados, resultados, discussão e conclusões.
Informações Complementares:
● Devem ter até 20 laudas impressas, excluindo resumos, tabelas, figuras e referências.
● As tabelas, figuras, gráficos e fotos, limitadas a 05 no conjunto, devem incluir apenas os dados imprescindíveis. As
figuras não devem repetir dados já descritos em tabelas. Devem ser apresentadas em arquivo separado.
● As referências bibliográficas, limitadas a 40, devem incluir apenas aquelas estritamente pertinentes e relevantes à
problemática abordada. Deve-se evitar a inclusão de número excessivo de referências numa mesma citação. Citações de
documentos não publicados e não indexados na literatura científica (teses, relatórios e outros) devem ser evitadas.
● Os resumos em português e em inglês (abstract) devem ter até 200 palavras, com a indicação de 3 a 6 palavras-chave
(keywords).
A estrutura dos artigos originais de pesquisa é a convencional: Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão e
Conclusão, embora outros formatos possam ser aceitos, mas respeitando a lógica da estrutura de artigos científicos.
1.2 Artigos de Revisão: Dedicados à apresentação e à discussão de temas de interesse científico e de relevância para
a saúde pública. Devem apresentar formulação clara de um objeto científico de interesse, argumentação lógica, crítica
teórico-metodológica dos trabalhos consultados e síntese conclusiva. Devem ser elaborados por pesquisadores com
experiência no campo em questão ou por especialistas de reconhecido saber.
Informações complementares:
469
● Os resumos em português e em inglês (abstract) devem ter até 200 palavras, com a indicação de 3 a 6 palavras-chave
(keywords).
1.3 Comunicações Breves: São relatos sucintos destinados à rápida divulgação de eventos significativos no campo da
pesquisa de interesse em saúde pública e que não comportam uma análise mais abrangente.
● Os resumos em português e em inglês (abstract) devem ter até 200 palavras e devem ter entre 3 a 6 palavras-chave
(keywords).
● Sua apresentação deve acompanhar as mesmas normas exigidas para artigos originais.
1.4 Notas Científicas: São relatos sucintos destinados à rápida divulgação de eventos relevantes de uma pesquisa
experimental que justifique a publicação de resultados parciais.
● As tabelas, figuras, gráficos e fotos, limitadas a 02 no conjunto, devem incluir apenas os dados imprescindíveis.
As figuras não devem repetir dados já descritos em tabelas. Devem ser apresentadas em arquivo separado.
● As referências bibliográficas, limitadas a 10, devem incluir apenas aquelas estritamente pertinentes e relevantes
à problemática abordada. Deve-se evitar a inclusão de número excessivo de referências numa mesma citação.
Citações de documentos não publicados e não indexados na literatura científica (teses, relatórios e outros)
devem ser evitadas.
● Os resumos em português e em inglês (abstract) devem ter até 200 palavras e devem ter entre 3 a 6 palavraschave (keywords).
● Sua apresentação deve acompanhar as mesmas normas exigidas para artigos originais, porém na forma de
texto único.
1.5 Relatos de Caso: São textos que contemplam principalmente a área médica, em que o resultado é anterior
ao interesse de sua divulgação ou a ocorrência dos resultados não é planejada.
470
● Os resumos em português e em inglês (abstract) devem ter até 200 palavras e devem ter entre 3 a 6 palavras-chave (keywords).
● Devem apresentar Introdução, Relato de caso, Discussão e Conclusão, na forma de texto único.
1.6 Resumos de Teses e Dissertações: São aceitos resumos de teses e dissertações até um ano após a defesa.
● Devem ter até 400 palavras e devem ter entre 3 a 6 palavras-chave (keywords).
● Sua apresentação deve conter o nome do autor e do orientador, título do trabalho em português e em inglês, nome
da instituição em que foi apresentado, área de concentração e ano da defesa.
2. Apresentação do manuscrito: Os textos devem ser redigidos em processador de texto Word for Windows 2003
ou compatível, no formato A4, espaço duplo, fonte Times New Roman, tamanho 12. Devem ser evitados arquivos
compactados. A estrutura do manuscrito deve estar em conformidade com as normas do Sistema Vancouver – Título;
Autores e Instituições; Resumo e Abstract; Introdução; Material e Métodos; Resultados; Discussão; Conclusão;
Agradecimentos; Referências; Tabelas; Figuras e Fotografias.
2.1 Página de Identificação: Deve constar:
Título em português e em inglês: O título deve ser conciso, completo e conter informações. Se o manuscrito for
submetido em inglês, deve ser fornecido um título em português.
Autores: De acordo com o International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), são considerados
autores aqueles que contribuíram substancialmente para a concepção e planejamento, ou análise e interpretação
dos dados; contribuíram significativamente na elaboração do rascunho ou na revisão crítica do conteúdo e
participaram da aprovação da versão final do mesmo. Somente a aquisição de financiamento, a coleta de dados
ou supervisão geral de grupos de pesquisa não justificam autoria – maiores esclarecimentos sobre autoria
podem ser encontrados na página do ICMJE (http://www.icjme.org). Deve constar o nome completo, sem
abreviações e com último sobrenome em caixa alta (exemplo: Ana Maria Camargo da SILVA) e o e-mail do
autor responsável. O autor responsável para troca de correspondência deve estar assinalado com asterisco (*) e
apresentar também o endereço completo.
Afiliação: Deve ser indicada a instituição à qual cada autor está afiliado, na seguinte ordem de hierarquias
institucionais de afiliação: laboratório, setor, seção, serviço, divisão, departamento, instituto, faculdade e
universidade.
Financiamento da pesquisa: Se a pesquisa foi subvencionada, indicar o tipo de auxílio, o nome da agência
financiadora e o respectivo número do processo.
471
Apresentação prévia: Quando baseado em tese ou dissertação, indicar o nome do autor, título, ano, nome do programa
de pós-graduação e instituição onde foi apresentada. Quando apresentado em evento científico, indicar o nome do
evento, local e ano da realização.
2.2 Preparo do manuscrito:
Resumo/Abstract: Todos os textos deverão ter resumos em português e inglês, dimensionados para ter até 200
palavras. Como regra geral, o resumo deve incluir objetivos do estudo, principais procedimentos metodológicos,
principais resultados e conclusões.
Palavras-chave/keywords: Devem ser indicados entre 3 a 6 descritores do conteúdo, extraídos do vocabulário
Descritores em Ciências da Saúde (DeCS) da Bireme (disponível em http://www.bireme.br) nos idiomas português e
inglês. Em inglês, com base no Medical Subject Headings (MeSH).
Caso não sejam encontrados descritores adequados para a temática do manuscrito, poderão ser indicados termos não
existentes nos conjuntos citados.
Estrutura do texto:
A) Introdução: Deve ser breve, relatando o contexto e a justificativa do estudo, apoiados em referências pertinentes
ao objetivo do manuscrito, sintetizando a importância e destacando as lacunas do conhecimento abordadas. Não deve
incluir dados ou conclusões do estudo em referência
B) Material e Métodos: Os procedimentos adotados devem ser descritos claramente, bem como as variáveis
analisadas, com a respectiva definição, quando necessária, e a hipótese a ser testada. Devem ser descritas a
população e a amostra, instrumentos de medida, com a apresentação, se possível, de medidas de validade
e conter informações sobre a coleta e processamento de dados. Deve ser incluída a devida referência para
os métodos e técnicas empregados, inclusive os métodos estatísticos; métodos novos ou substancialmente
modificados devem ser descritos, justificando as razões para seu uso e mencionando suas limitações.
Os critérios éticos da pesquisa devem ser respeitados; os autores devem explicitar que a pesquisa foi conduzida dentro
de padrões éticos e foi aprovada por comitê de ética, indicando o nome do comitê de ética, número e data do registro.
C) Resultados: Devem ser apresentados em uma sequência lógica, iniciando-se com a descrição dos dados
mais importantes. Tabelas e figuras devem ser restritas àquelas necessárias para argumentação e a descrição
dos dados no texto deve ser restrita aos mais importantes. Os gráficos devem ser utilizados para destacar os
resultados mais relevantes e resumir relações complexas. Dados em gráficos e tabelas não devem ser duplicados
nem repetidos no texto. Os resultados numéricos devem especificar os métodos estatísticos utilizados na
análise.
D) Discussão: A partir dos dados obtidos e resultados alcançados, os novos e importantes aspectos observados
devem ser interpretados à luz da literatura científica e das teorias existentes no campo. Argumentos e provas
baseadas em comunicação de caráter pessoal ou divulgadas em documentos restritos não podem servir de
apoio às argumentações do autor. Tanto as limitações do trabalho quanto suas implicações para futuras
pesquisas devem ser esclarecidas. Incluir somente hipóteses e generalizações baseadas nos dados do trabalho.
As conclusões podem finalizar esta parte, retomando o objetivo do trabalho ou serem apresentadas em item
separado.
E) Agradecimentos: Este item é opcional e pode ser utilizado para mencionar os nomes de pessoas que, embora
não preencham os requisitos de autoria, prestaram colaboração ao trabalho. Será preciso explicitar o motivo
do agradecimento, por exemplo, consultoria científica, revisão crítica do manuscrito, coleta de dados etc. Deve
haver permissão expressa dos nomeados e o autor responsável deve anexar a Declaração de Responsabilidade
pelos Agradecimentos. Também pode constar desta parte apoio logístico de instituições.
472
2.3 Citação no texto: A exatidão das referências é de responsabilidade dos autores. Devem ser indicadas pelo seu
número na listagem, na forma de expoente, sem uso de parênteses, colchetes e similares. Nos casos em que há citação
do nome do autor, o número da referência deve ser colocado a seguir do nome do autor. Trabalhos com dois autores
devem fazer referência aos dois autores ligados por “e”. Nos outros casos apresentar apenas o primeiro autor (seguido
de et al, em caso de autoria múltipla).
Exemplos: Nos Estados Unidos e Canadá, a obrigatoriedade da declaração dos nutrientes no rótulo do alimento é
mais antiga e foram desenvolvidos métodos hidrolíticos, como o AOAC 996.061, de extração e determinação da GT
por cálculo a partir dos AG obtidos por cromatografia gasosa com detector de ionização em chama (GC/DIC)2,3.
Segundo Chang et al31 , o aumento do tamanho das partículas resulta numa redução da área de superfície conferindo
uma melhora na retenção e estabilidade das mesmas.
2.4 Referências: Listadas ao final do texto, devem respeitar a quantidade definida para cada categoria de artigos aceitos
pela RIAL. As referências devem ser normalizadas de acordo com o estilo Uniform Requirements for Manuscripts
Submitted to Biomedical Journals: Writing and Editing for Biomedical Publication, numeradas consecutivamente na
ordem em que foram mencionadas a primeira vez no texto.
Os títulos de periódicos devem ser referidos de forma abreviada, de acordo com o Medline, disponível no endereço
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals. Para consultar periódicos nacionais e latino-americanos:
http://portal.revistas.bvs.br/main.php?home=true&lang=pt.
No caso de publicações com até seis autores, citam-se todos; acima de seis, citam-se os seis primeiros, seguidos da
expressão latina “et al”. Referências de um mesmo autor devem ser organizadas em ordem cronológica crescente.
Exemplos:
Artigos de periódicos:
Aued-Pimentel S, Zenebon O. Lipídios totais e ácidos graxos na informação nutricional do rótulo dos alimentos
embalados: aspectos sobre legislação e quantificação. Rev Inst Adolfo Lutz. 2009;68(2):121-6.
Weihrauch JL, Posati LP, Anderson BA, Exler J. Lipid conversion factors for calculating fatty acids contents of foods. J
Am Oil Chem Soc. 1977;54:36-40.
Hennington EA. Acolhimento como prática interdisciplinar num programa de extensão. Cad Saude Coletiva [Internet].
2005;21(1):256-65. Disponível em:
[http://www.scielo.br/pdf/csp/v21n1/28.pdf].
Livros:
Ringsven MK, Bond D. Gerontology and leadership skills for nurses. 2ª ed. Albany (NY):Delmar Publishers;1996.
Lopez D, organizador. Estudos epidemiológicos qualitativos. São Paulo: James Martim; 2009.
Institute of Medicine (US). Looking at the future of the Medicaid program. Washington (DC): The Institute; 1992.
Foley KM, Gelband H, editors. Improving palliative care for cancer. Washington: National Academy Press 2001[acesso
2003 Jul 13]. Disponível em: [http://www.nap.edu/catalog.php?record_id=10149].
Capítulos de livro:
Wirdh L. História da Epidemiologia. In: Lopez D, organizador. Estudos epidemiológicos qualitativos. São Paulo: James
Martim; 2009.p.64-76.
473
Dissertações, teses e monografias:
Santos EP. Estabilidade química da manteiga da terra [dissertação de mestrado]. Bananeiras (PB): Universidade
Federal da Paraíba;1995.
Moreschi ECP. Desenvolvimento e validação de métodos cromatográficos e avaliação da estabilidade de vitaminas
hidrossolúveis em alimentos [tese de doutorado]. São Paulo (SP): Universidade de São Paulo; 2006.
Trabalhos de congressos, simpósios, encontros, seminários e outros:
Barboza et al. Descentralização das políticas públicas em DST/AIDS no Estado de São Paulo. III Encontro do Programa
de Pós-Graduação em Infecções e Saúde Pública; agosto de 2004; São Paulo: Rev Inst Adolfo Lutz. p. 34 [resumo 32-SC].
Dados eletrônicos:
Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo – SABESP. O que fazemos/Qualidade da água. [acesso 2008 Set 17].
Disponível em: [http://www.sabesp.com.br/CalandraWeb/CalandraRedirect/?temp=4&proj=sabesp&pub=T&db=&doci].
Legislação:
Brasil. Ministério da Saúde. Resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001. Aprova o Regulamento Técnico sobre Padrões
MicrobiológicosparaAlimentos.DiárioOficial[da]RepublicaFederativadoBrasil.Brasília,DF,10jan.2001.Seção1,nº7-E.p.45-53.
Autoria institucional:
Instituto Adolfo Lutz (São Paulo - Brasil). Métodos físico-químicos para análise de alimentos: normas analíticas do
Instituto Adolfo Lutz. 4ª ed. [1ª ed. digital]. São Paulo (SP): Instituto Adolfo Lutz; 2008. Disponível em: [http://www.
ial.sp.gov.br/índex.php?option=com_remository&Itemid=7&func=select&orderby=1&Itemid=7].
Organización Mundial de la Salud – OMS. Como investigar el uso de medicamentos em los servicios de salud.
Indicadores seleccionados del uso de medicamentos. Ginebra; 1993. (DAP. 93.1).
Patente:
Larsen CE, Trip R, Johnson CR, inventors: Novoste Corporation, assignee. Methods for procedures related to
eletrophysiology of the heart. US patent 5,529,067. 1995 Jun 25.
Casos não contemplados nesta instrução devem ser citados conforme indicação do Committee of Medical Journals
Editors (Grupo Vancouver), disponível em: http://www.cmje.org. Referências a documentos não indexados na
literatura científica mundial, em geral de divulgação circunscrita a uma instituição ou a um evento (teses, relatórios de
pesquisa, comunicações em eventos, dentre outros) e informações extraídas de documentos eletrônicos, não mantidas
permanentemente em sites, se relevantes, devem figurar no rodapé das páginas do texto onde foram citadas.
2.5 Números de figuras e tabelas: A quantidade de figuras e tabelas de cada manuscrito deve respeitar a quantidade
definida para cada categoria de artigos aceitos pela RIAL. Todos os elementos gráficos ou tabulares apresentados serão
identificados como figura ou tabela, e numerados sequencialmente a partir de um, e não como quadros, gráficos etc.
A) Tabelas: Devem ser redigidas em processador de texto Word for Windows 2003 ou compatível e serem apresentadas
em arquivos separados, numeradas consecutivamente com algarismos arábicos, na ordem em que foram citadas no
texto. A cada uma deve-se atribuir um título breve, não se utilizando traços internos horizontais ou verticais. As notas
explicativas devem ser limitadas ao menor número possível e colocadas no rodapédas tabelas e não no cabeçalho ou
título. Se houver tabela extraída de outro trabalho, previamente publicado, os autores devem solicitar formalmente
autorização da revista que a publicou, para sua reprodução.
474
B) Figuras: As ilustrações (fotografias, desenhos, gráficos etc.) devem ser citadas como Figuras, apresentadas em
arquivos separados e numeradas consecutivamente com algarismos arábicos na ordem em que foram citadas no texto.
Devem conter título e legenda apresentados na parte inferior da figura. Só serão admitidas para publicação figuras
suficientemente claras e com qualidade digital que permitam sua impressão, preferencialmente no formato vetorial.
No formato JPEG, a resolução mínima deve ser de 300 dpi. Figuras em cores serão publicadas quando for necessária
à clareza da informação e os custos deverão ser cobertos pelos autores. Se houver figura extraída de outro trabalho,
previamente publicado, os autores devem solicitar autorização, por escrito, para sua reprodução.
3. Declarações e documentos solicitados: Em conformidade com as diretrizes do International Committee of Medical
Journal Editors, são solicitados alguns documentos e declarações do(s) autor(es) para a avaliação de seu manuscrito.
Observe a relação dos documentos abaixo e, nos casos em que se aplique, anexe o documento ao processo. O momento
em que tais documentos serão solicitados é variável:
Documento/declaração
Quem assina
Quando anexar
Carta de Apresentação
Todos
Submissão
Responsabilidade pelos Agradecimentos
Autor responsável
Aprovação
Todos
Aprovação
Transferência de Direitos Autorais
A carta de Apresentação do manuscrito, assinada por todos os autores, deve conter:
● Um parágrafo declarando a responsabilidade de cada autor: ter contribuído substancialmente para a concepção e
planejamento ou análise e interpretação dos dados; ter contribuído significativamente na elaboração do rascunho ou
na revisão crítica do conteúdo; e ter participado da aprovação da versão final do manuscrito. Para mais informações
sobre critérios de autoria, consulte a página do ICMJE (http://www.icjme.org).
● Um parágrafo contendo a declaração de potenciais conflitos de interesses dos autores.
● Um parágrafo contendo a declaração que o trabalho não foi publicado, parcial ou integralmente, em outro periódico.
Todos os autores devem ler, assinar e enviar documento transferindo os direitos autorais. O artigo só será liberado
para publicação quando esse documento estiver de posse da RIAL.
4. Verificação dos itens exigidos na submissão:
1. Nome e instituição de afiliação de cada autor, incluindo e-mail e telefone do autor responsável.
2. Título do manuscrito, em português e inglês.
3. Texto apresentado em letras Times New Roman, corpo 12, em formato Word ou similar (doc, txt, rtf).
4. Resumos em dois idiomas, um deles obrigatoriamente em inglês.
5. Carta de Apresentação assinada por todos os autores.
6. Nome da agência financiadora e número(s) do processo(s).
475
7. No caso de artigo baseado em tese/dissertação, indicar o nome da instituição/Programa, grau e o ano de defesa.
8. Referências normalizadas segundo estilo Vancouver, ordenadas pela citação no texto e numeradas, e se todas estão
citadas no texto.
9. Tabelas numeradas sequencialmente, com título e notas, e no máximo com 12 colunas, em formato Word ou similar
(doc, txt, rtf).
10. Figura no formato vetorial ou em pdf, ou tif, ou jpeg ou bmp, com resolução mínima 300 dpi.
5. Revisão da redação científica: Para ser publicado, o manuscrito aprovado é submetido à revisão da redação científica,
gramatical e de estilo. A RIAL se reserva o direito de introduzir alterações nos originais, visando a manutenção da
homogeneidade e qualidade da publicação, respeitando, porém, o estilo e as opiniões dos autores. Inclusive a versão
em inglês do artigo terá esta etapa de revisão.
6. Provas: Após sua aprovação pelos editores, o manuscrito será revisado quanto à redação científica. O autor
responsável pela correspondência receberá as provas gráficas para revisão por correio eletrônico em formato pdf
(portable document format). O prazo máximo para a revisão da prova é de dois dias. É importante cumprir os prazos
de revisão para garantir a publicação no fascículo programado. Atrasos nesta fase poderão resultar em remanejamento
do artigo para fascículos subsequentes.
7. Publicação e distribuição: Os artigos serão publicados em ordem cronológica de aprovação. As datas de recebimento
e de aprovação do artigo constarão obrigatoriamente no mesmo.
É permitida a reprodução, no todo ou em parte, de artigos publicados na RIAL, desde que sejam indicados a origem
e o nome do autor, de conformidade com a legislação sobre os direitos autorais.
A Revista do Instituto Adolfo Lutz é distribuída gratuitamente a entidades governamentais, culturais ou em permuta
de periódicos nacionais ou estrangeiros.
476

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