Caracterização farmacognóstica e atividade - PPGCF

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA E AVALIAÇÃO
ANTIFÚNGICA DAS FOLHAS DE Chrysobalanus icaco (Lin)
EM ESPÉCIES DE Candida.
Ana Regina Maués Noronha Peres
2
BELÉM - PA
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA E AVALIAÇÃO
ANTIFÚNGICA DAS FOLHAS DE Chrysobalanus icaco (Lin)
EM ESPÉCIES DE Candida.
Autora: Ana Regina Maués Noronha Peres
Orientadora: Profª. Drª. Marcieni Ataíde de Andrade
Co-orientadora: Profª. Drª. Marta Chagas Monteiro
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, Área de
concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto
de Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Pará como requisito para obtenção do título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
BELÉM - PA
2012
3
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciências da Saúde – UFPA
Peres, Ana Regina Maués Noronha.
Caracterização farmacognóstica e avaliação antifúngica de Chrysobalanus icaco (Lin)
frente a espécies de Candida / Ana Regina Maués Noronha Peres; orientadora, Marcieni
Ataíde de Andrade; co-orientadora, Marta Chagas Monteiro — 2012.
111 fls.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde,
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia. Belém, 2012.
1. Farmacognosia – análise. 2. Plantas medicinais - Atividade antifúngica. 3. Chrysobalanus
icaco. 4. Candidíase. I.Título.
CDD:22. ed.: 615.321
4
FOLHA DE APROVAÇÃO
Ana Regina Maués Noronha Peres
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA E AVALIAÇÃO ANTIFÚNGICA DAS
FOLHAS DE Chrysobalanus icaco (Lin) EM ESPÉCIES DE Candida.
Dissertação
apresentada
Farmacêuticas
Mestre
ao
Programa
de
Pós-Graduação
em
Ciências
da
Universidade Federal do Pará para obtenção do título de
em Ciências
Farmacêuticas; Área de concentração: Fármacos e
Medicamentos
Aprovada em: 12/09/2012
Banca Examinadora
_________________________________________
Profª Drª Ana Cristina Baetas / UFPA
_________________________________________
Profª Drª Marta Chagas Monteiro / UFPA
Co-orientadora
_________________________________________
Profª Drª Marcieni Ataíde de Andrade / UFPA
Orientadora
5
DEDICATÓRIA
Deus, que toda honra e glória seja declarada a ti, pelo teu amor inigualável e
inesgotável, que tem sido meu alicerce em todas as horas e por toda minha vida.
Tudo o que tenho e que sou, que terei e virei a ser, devo somente a Ti, Senhor.
Ao meu amado esposo, Amiraldo Peres, por todo amor, carinho, paciência,
compreensão e apoio. Sua presença foi fundamental para a realização deste sonho.
Obrigada por estar ao meu lado, tua mão na minha mão, te amo.
Ao meu filho amado, Gustavo, meu presente de Deus, por ter entendido e suportado
minha ausência e me amado mesmo assim.
Aos meus pais, irmãos e toda família que torceram e me ajudaram na conquista de
mais uma vitória, amo profundamente vocês.
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por sua proteção e amparo. Sem sua presença e amor não conseguiria
transformar os espinhos em flores e as pedras do caminho em degraus para que
possa a cada dia, estar mais perto de Ti;
À minha família, pelo amor incondicional em momentos especiais quando estive
ausente;
Ao meu esposo, Amiraldo, que bom que você existe na minha vida. A sua torcida e
amor foram fundamentais para a realização deste projeto;
Ao meu filho Gustavo, louvo a Deus pela sua existência. A sua compreensão e
sacrifícios foram surpreendentes;
À minha orientadora, Profª Drª Marcieni Ataíde de Andrade, obrigada pela sugestão
do tema, pela orientação, respeito, paciência e sensibilidade em momentos críticos
da construção deste trabalho;
À minha co-orientadora, Profª Drª Marta Chagas Monteiro, obrigada pela atenção,
dedicação e ensinamentos dispensados. As suas críticas foram transformadoras em
minha vida;
À Universidade Federal do Pará e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, pelo incentivo e oportunidade de aprendizado e enriquecimento
profissional;
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da UFPA, pelos valiosos ensinamentos;
Ao Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa por ter cedido o LAFQ para realização de
parte deste trabalho, pelas orientações quanto às práticas laboratoriais. Obrigada
pela amizade;
À Profª Drª Roseane Maria Ribeiro Costa, por gentilmente de cedido o Laboratório
de Controle de Qualidade e Medicamentos;
À Profª Drª Maria Fâni Dolabela, por ter me adotado desde o início, pelas palavras
confortadoras e por ter me abençoado todas as vezes que nos encontrávamos
casualmente;
Aos professores, Drª Ana Cristina Baetas e Dr. Francisco Teixeira, por todas as
sugestões no momento da qualificação, que contribuíram grandemente na qualidade
deste trabalho;
7
À Profª Drª Maurimélia Mesquita, pelo carinho e contribuição na identificação das
espécies;
Ao farmacêutico e amigo, Jailton Nascimento, obrigado por tudo e principalmente
pela coragem, luta e otimismo. Sempre me lembrarei de você como um exemplo de
perseverança diante da vida e pedirei a Deus que lhe fortaleça a cada dia;
À Dayse Brandão, a sua amizade foi imprescindível nesta caminhada. Obrigada pela
sua disposição em me ajudar em meio a tantos compromissos;
Ao João Paulo de Bastos Silva por ter me auxiliado nos momentos mais difíceis. Se
Deus não lhe enviasse, esta jornada talvez não se cumprisse;
À Cliciane Melo e Maria Brasília, sentirei muitas saudades das conversas, do apoio,
da amizade. Que Deus abençoe as suas vidas, tanto quanto me abençoaram;
Aos meus pacientes, pessoas queridas e fiéis, que entenderam minha ausência
durante todo este período e que estão ansiosos pela minha volta. Obrigada pelo
carinho;
Aos amigos, que ganhei e que foram extremamente importantes na concretização
deste sonho;
Muito obrigada!
8
“Atingir o alvo é difícil, manter a posição é mais, avançar no alvo mais
ainda, contudo a fé em Deus nos faz vencer todas as etapas e chegar no
lugar que Ele projetou para nossas vidas”.
9
Autor desconhecido
RESUMO
PERES, A.R.M.N. Caracterização farmacognóstica e avaliação antifúngica das
folhas de Chrysobalanus icaco Lin em espécies de Candida. 2012. 111fls.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do
Pará, Belém, 2012.
Atualmente, a Candidíase tem se destacado dentre as infecções fúngicas, pela sua
alta incidência e mortalidade. Paralelamente, há maior registro de resistência
microbiana e de falhas terapêuticas apresentadas pelos antifúngicos disponíveis.
Chrysobalanus icaco Lin, espécie nativa da Amazônia, tem sido usado popularmente
em micoses, sem comprovação científica, por isso a importância de pesquisas que
avaliem suas propriedades antifúngicas. A análise farmacognóstica das folhas do
C. icaco indicou teores de perda por dessecação, de cinzas totais e de cinzas
insolúveis de 12,3%± 0,0288; 4,31%± 0,0001 e 1,67%± 0,0012, respectivamente. A
abordagem fitoquímica do extrato hidroalcoólico das folhas de C. icaco (EHCi)
revelou a presença de ácidos orgânicos, açúcares redutores, saponinas, catequinas,
depsídeos, fenóis, flavonóides, taninos, proteínas, purinas e aminoácidos. Na
análise por CLAE, o mesmo apresentou predomínio de flavonóides, com destaque
para Miricetina. Sua atividade antifúngica foi testada por microdiluição em caldo
frente à cepa ATCC 40175 de Candida albicans e onze isolados clínicos bucais de
Candida albicans, C. dubliniensis, C. parapsilosis e C. tropicalis. A CIM variou de
maior de 6,25 mg/mL a 1,5 mg/mL e a CFM, quando determinada, foi igual ou maior
que
6,25 mg/mL. O EHCi apresentou moderada atividade frente à cepa ATCC
40175 e fraca atividade antifúngica frente aos isolados clínicos bucais. Estes
resultados abrem perspectivas para novos estudos que investiguem frações e
substâncias de Chrysobalanus icaco com maior atividade frente a espécies de
Candida.
Palavras-chave: Análise farmacognóstica, Atividade antifúngica, Candidíase,
Chrysobalanus icaco.
10
ABSTRACT
PERES, A.R.M.N. Pharmacognostic antifungal and evaluation of leaves
Chrysobalanus icaco Lin in Candida species. 2012. 111fls. Dissertation
(Master’s degree) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Pará,
Belém, 2012.
Currently, Candidiasis has stood out among fungal infections, due to its high
incidence and mortality. In parallel, there is a greater record of microbial resistance
and therapeutic failures presented by antifungals available. Chrysobalanus icaco Lin,
a species native to the Amazon, has been popularly used in mycoses, without
scientific evidence, so the importance of research to evaluate their antifungal
properties. The analysis pharmacognostic of leaves of C. icaco indicated levels of
loss on drying, total ash and ash insoluble 12.3% ± 0.0288, 4.31% ± 1.67% ± 0.0001
and 0.0012, respectively. Phytochemical screening of the hydroalcoholic extract of
the leaves of C.icaco (EHCI) revealed the presence of organic acids, sugars,
saponins, catechins, depsídeos, phenols, flavonoids, tannins, proteins, amino acids
and purine. In HPLC analysis, it was dominated by the flavonoids, especially
Myricetin. Antifungal activity was tested by microdilution opposite strain ATCC 40175
Candida
albicans
and
eleven
clinical
isolates
of
oral
Candida
albicans,
C. dubliniensis, C. parapsilosis and C. tropicalis. The MIC ranged from greater than
6.25 mg / mL to 1.5 mg / mL and CFM, when determined, was equal to or greater
than 6.25 mg / mL. The EHCI showed moderate activity against the strain ATCC
40175 and the weak antifungal activity against clinical isolates mouth. These results
open new perspectives for studies that investigate fractions and substances
Chrysobalanus icaco with greater activity against Candida species.
Keywords:
Analysis
pharmacognostic,
Chrysobalanus icaco L; hydroalcoholic.
Antifungal
activity,
Candidiasis,
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Aspectos gerais de distribuição em arbusto
de
Chrysobalanus icaco L.....................................................
32
Figura 2 -
Aspecto das folhas de Chrysobalanus icaco L...................
34
Figura 3 -
Imagens dos frutos e semente de Chrysobalanus
icaco L.................................................................................
35
Figura 4 -
Imagens das flores de Chysobalanus icaco L......................
35
Figura 5 -
Estruturas químicas encontradas em Chrysobalanus
icaco L..................................................................................
37
Exsicata
de
Chrysobalanus icaco L
enviada
para identificação botânica...................................................
44
Tamisador usado para análise granulométrica
de
Chrysobalanus icaco L. com a indicação da posição
do número de cada tamis em mµ (micrômetros)............
46
Seqüência de passos da perda por dessecação pelo método
de gravimetria..........................................................................
48
Medição do pH de Chrysobalanus icaco L através
de potenciômetro de bancada...................................................
50
Figura 6 -
Figura 7 -
Figura 8 -
Figura 9 -
Figura 10 -
Seqüência de passos na determinação do teor de
cinzas totais.............................................................................
51
Figura 11 -
Seqüência para determinação do resíduo seco........................
53
Figura 12 -
Condições de armazenamento dos isolados de Candida sp ....
62
Figura 13 -
Ajuste do inóculo fúngico à escala 0,5 de McFarland.................
62
12
Figura 14 -
Diluição dos inóculos fúngicos em caldo Mueller Hinton...........
Figura 15 -
Esquema de diluições e concentrações finais de EHCi..............
Figura 16 -
Disposição de EHCi em triplicata nas concentrações
de 6,25 mg/mL (linha A); 3,12 mg/mL (linha B); 1,56 mg/mL
(linha C); 0,78 mg/mL (linha D); 0,39 mg/mL (linha E);
0,19 mg/mL (linha F); Cc: 200 μL de inoculo: controle de
crescimento; C+: Nistatina a 50.000 UI/mL e C-: DMSO a
2,5%...........................................................................................
64
Microdiluição da ATCC 40175 de Candida albicans após
uso de MTT...............................................................................
65
Análise granulométrica do pó das folhas de Chrysobalanus
icaco............................................................................................
69
Espectro de UV do pico 01, mostrando os máximos de
absorção característicos de flavonóides (253 e 355 nm)..............
78
Figura 17 -
Figura 18 -
Figura 19 -
63
64
Figura 20 -
Cromatograma do EHCi, mostrando pico de Miricetina (pico 01).. 79
Figura 21-
Padrão de crescimento de Candida tropicalis (C1) frente ao EHCi
a 6,25 mg/mL (A), ao Controle Negativo (B) e ao controle
positivo (C)....................................................................................... 82
Figura 22 - Padrão de crescimento de C. parapsilosis (C2): CIM igual
a 3,12 mg/mL(B) e CFM igual a 6,25 mg/mL (A).............................. 83
Figura 23 - Crescimento de C. parapsilosis (C10): CIM igual a 6,25 mg/mL(A)... 83
Figura 24 - Padrão de crescimento de C. parapsilosis (C4): CIM > que
6,25 mg/mL....................................................................................... 83
Figura 25a- Crescimento de C11 (C. dubliniensis), em três diferentes
concentrações expressas em
mg/mL..................................... 84
Figura 25b- A: Controle Negativo - DMSO a 2,5%; B: Controle positivo Nistatina 50.000 UI/mL para Candida dubliniensis.............................. 84
Figura 26 - Candida albicans (C5) frente ao EHCi com CIM > 6,25 mg/mL............ 85
Figura 27 - Candida albicans (C3) frente ao EHCi com CIM igual a 6,25 mg/mL
e CFM > 6,25 mg/mL............................................................................. 85
13
Figura 28 - Candida albicans (C7) frente ao EHCi com CIM igual a
3,12 mg/mL e CFM > 6,25 mg/mL................................................. 85
Figura 29 - Candida albicans (ATCC 40175) nas concentrações de 6,25 mg/mL
(A), 3,12 mg/mL (B) e 1,56 mg/mL (C); Controle negativo (C-):
DMSO a 2,5% (D) e controle positivo (C+): Nistatina a
50.000 UI/mL (E).................................................................................. 86
14
LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES
%
Porcentagem
Atm
Atmosfera
cm
Centimetros
D
Dextro
g
Grama
g/mL
Grama por mililitro
GL
Gay-Lousac
h
Hora
m
Metro
mg
Miligrama
min
Minuto
mg/Kg
Miligramas por quilograma
mg/mL
Miligramas por mililitro
mL
Mililitro
mm
Milímetros
mM
Milimolar
º
Grau
ºC
Graus celsius
p/p
Peso peso
p/v
Peso volume
ppm
Parte por milhão
rpm
Rotações por minuto
UFC/mL
Unidades formadoras de colônia por mililitro
α
Alfa
β
Beta
μg/mL
Micrograma por mililitro
μL
Microlitro
μm
Micrômetro
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Média e desvio padrão da densidade de massa e da densidade
relativa do decocto expressos em (g/mL) grama por mililitro, do
pó das folhas do Chrysobalanus icaco L......................................
Tabela 2 -
70
Média e desvio padrão da perda por dessecação do pó das
folhas do C. icaco obtida após um minuto, em porcentagem (%),
usando balança de infravermelho (Infratest)..................................
72
.
Tabela 3 - Média e desvio padrão expressos em grama (g) para o teor de
extrativos do pó das folhas do Chrysobalanus icaco L...................
74
Tabela 4 - Valores de CIM e CFM expressos em mg/mL para isolados orais e
ATCC 40175.......................................................................................
82
16
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 -
Resultados das reações indicativas da presença (+) ou a
ausência (-) de constituintes químicos de Chrysobalanus
icaco L.................................................................................
76
Quadro 2 - Classificação das espécies após identificação, segundo
ordem de coleta dos isolados orais.....................................
80
17
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO..................................................................................
20
2
REVISÃO DA LITERATURA............................................................
23
2.1
Aspectos Epidemiológicos das infecções por Candida..............
23
2.2
Agentes antifúngicos e a resistência dos microorganismos......
25
2.3
Plantas medicinais e suas propriedades antifúngicas.................
29
2.4
Chrysobalanus icaco Lin.................................................................
32
2.4.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS...........................................................
32
2.4.2 DESCRIÇÃO BOTÂNICA...................................................................
34
2.4.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA...................................................................
36
2.4.4 CARACTERÍSTICAS
ETNOFARMACOLÓGICAS
E
ATIVIDADES BIOLÓGICAS...............................................................
37
3
OBJETIVOS .......................................................................................
40
3.1
Objetivo Geral....................................................................................
40
3.2
Objetivos Específicos........................................................................ 40
4
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
41
4.1
Seleção da espécie vegetal...............................................................
41
4.2
Microrganismos..................................................................................
41
4.3
Solventes, reagentes e soluções....................................................... 42
4.4
Equipamentos...................................................................................... 42
4.5
Procedimentos éticos......................................................................... 43
4.6
Coleta e identificação do material botânico...................................... 43
4.7
Preparo do material botânico............................................................. 44
4.8
Preparo do extrato hidroalcoólico..................................................... 45
4.9
Caracterização farmacognóstica ...................................................... 45
4.9.1
ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO PÓ................................................ 45
4.9.2
DENSIDADE APARENTE.....................................................................
4.9.3
DENSIDADE DE MASSA E DENSIDADE RELATIVA........................... 47
4.9.4
DETERMINAÇÃO DA PERDA POR DESSECAÇÃO............................ 48
47
18
4.9.4.1 Método Gravimétrico............................................................................... 48
4.9.4.2 Dessecação usando balança de infravermelho (Infratest)...................... 49
4.9.5
DETERMINAÇÃO DO pH................................................................... 49
4.9.6
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS TOTAIS............................ 50
4.9.7
DETERMINAÇÃO
DO
TEOR DE CINZAS INSOLÚVEIS EM
ÁCIDO................................................................................................ 51
4.9.8
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE EXTRATIVOS.............................. 52
4.9.9
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ESPUMA.................................... 52
4.9.10
DETERMINAÇÃO DO RESÍDUO SECO........................................... 53
4.9.11
ABORDAGEM FITOQUÍMICA........................................................... 53
4.9.11.1 Saponina espumídica........................................................................ 54
4.9.11.2 Ácidos orgânicos.............................................................................. 54
4.9.11.3 Açúcares redutores........................................................................... 54
4.9.11.4 Polissacarídeos................................................................................. 55
4.9.11.5 Proteínas e Aminoácidos................................................................... 55
4.9.11.6 Fenóis e Taninos................................................................................ 55
4.9.11.7 Flavonóides........................................................................................ 55
4.9.11.8 Alcalóides........................................................................................... 56
4.9.11.9 Glicosídeos cardiotônicos................................................................... 56
4.9.11.10 Purinas................................................................................................ 56
4.9.11.11 Catequinas.......................................................................................... 57
4.9.11.12 Sesquiterpenolactonas e outras lactonas........................................... 57
4.9.11.13 Esteróides e triterpenóides................................................................. 57
4.9.11.14 Carotenóides..................................................................................... 58
4.9.11.15 Depsídeos e depsidonas................................................................... 58
4.9.11.16 Derivados da Cumarina.................................................................... 58
4.9.11.17 Antraquinonas................................................................................... 59
4.10
Análise
do
EHCi
por Cromatografia
Líquida de
Alta
Eficiência (CLAE)............................................................................. 59
4.11
Obtenção dos Isolados Clínicos Orais........................................... 59
4.11.1
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO............................................................... 60
4.11.2
CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO.............................................................. 60
4.12
Atividade antifúngica de ECHi frente a isolados clínicos e
cepas ATCC de Candida spp........................................................
60
19
4.12.1
PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE (SE) DE EHCi.......................
61
4.12.2
PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA............................................
61
4.12.3
PREPARO DOS INÓCULOS FÚNGICOS........................................... 61
4.12.4 TÉCNICA
DE
MICRODILUIÇÃO
EM
PLACAS
PARA
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA........ 63
4.12.5 DETECÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA.(CIM)........ 65
4.12.6 CONTAGEM DA CONCENTRAÇÃO FUNGICIDA MÍNIMA.(CFM)...... 65
4.13
Análise Estatística.............................................................................. 66
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 67
5.1
Coleta e preparo da exsicata para identificação botânica............... 67
5.2
Preparo do material vegetal................................................................ 67
5.3
Processamento da amostra................................................................ 68
5.4
Preparo do extrato hidroalcoólico...................................................... 68
5.5
Caracterização farmacognóstica........................................................ 68
5.5.1
DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA DO PÓ...................................... 68
5.5.2
DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE....................................................... 69
5.5.2.1 Densidade Aparente............................................................................... 69
5.5.2.2 Densidade de Massa e Densidade Relativa pelo Método da
Picnometria............................................................................................. 70
5.5.3
DETERMINAÇÃO DE PERDA POR DESSECAÇÃO............................. 70
5.5.3.1 Perda por dessecação através de método gravimétrico......................... 71
5.5.3.2 Perda por dessecação através de Balança de Infravermelho
(Infratest)................................................................................................. 71
5.5.4 DETERMINAÇÃO DO pH DO EXTRATO............................................... 72
5.5.5
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS TOTAIS................................ 73
5.5.6
5.5.7
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS INSOLÚVEIS EM
ÁCIDO..................................................................................................... 74
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE EXTRATIVOS.................................... 74
5.5.8
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ESPUMA......................................... 75
5.5.9
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE RESÍDUO SECO............................... 75
5.6
Abordagem Fitoquímica....................................................................... 76
5.7
Análise do EHCi por CLAE................................................................... 78
5.8
Distribuição e identificação das leveduras......................................... 79
5.9
Atividade antifúngica do EHCi.............................................................. 81
6
CONCLUSÕES......................................................................................... 88
20
REFERÊNCIAS................................................................................................... 89
ANEXOS..............................................................................................................103
1 INTRODUÇÃO
A candidíase é uma infecção fúngica oportunista que tem tido uma maior
incidência nas três últimas décadas e cuja importância está relacionada a elevadas
taxas de mortalidade e morbidade (AMARAL e BARA, 2005; ZANARDI et al, 2008).
Esta doença tem sido responsável por cerca de 80% das infecções micóticas
hospitalares, considerada como a principal causa de micoses sistêmicas, com taxa
de mortalidade geral de candidemias estimada entre 40% a 60% (COLOMBO e
GUIMARÃES, 2003).
As espécies de Candida, responsáveis pelas variadas formas de
candidíases, vivem de forma comensal nas mucosas da boca e dos tratos digestivo,
genital e urinário, de indivíduos sadios, e podem desencadear infecções
oportunistas, em condições que comprometam o sistema imunológico ou em
pessoas com fatores predisponentes (COWEN et al, 2002; HEYDER e SILVA,
2004).
Dentre os sujeitos com alto risco de sofrer infecções fúngicas secundárias,
citam-se os transplantados, onco-hematológicos, imunodeprimidos, queimados,
portadores de doenças crônico-degenerativas, e recém-nascidos prematuros
(SIDRIM et al, 1998; MELLADO et al, 2002; VENKATESAN et al, 2005; GALVÁN e
MARISCAL, 2006; MASCHMEYER e HAAS, 2008; SABLE et al, 2008).
Os pacientes portadores do vírus da imunodeficiência adquirida (HIV),
imunodeprimidos ou submetidos à quimioterapia do câncer e transplante de órgãos
e de sangue, possuem maiores chances de apresentar candidíase oral; entretanto,
a mesma também tem sido evidenciada em portadores de próteses bucais,
pacientes em uso prolongado de antibióticos, além de pacientes especiais que
possuam dificuldades motoras e/ou cognitivas (CAVASSANI et al, 2002; SANTOS
et al, 2002; TANGA et al, 2003; CROCCO et al, 2004; MENEZES et al, 2006).
Em relação à maior susceptibilidade dos pacientes às infecções fúngicas,
houve aumento de fármacos disponíveis para o tratamento antifúngico, entretanto,
os mesmos possuem significativas limitações terapêuticas: baixa biodisponibilidade,
evidentes reações adversas, interações medicamentosas e desenvolvimento de
resistência pelos microorganismos (ORLANDO, 2005). Com isso, esses e outros
21
fatores apontam para a necessidade de desenvolvimento de novos antifúngicos que
ofereçam menor resistência por parte dos microrganismos, menos efeitos colaterais
e que promovam ainda, como marco diferencial, melhor acesso às populações que
vivem à margem do mercado consumidor de medicamentos convencionais (SILVA,
2003; CAMPAGNOLI et al, 2004).
Na Amazônia, constata-se que uma grande parte da população ainda possui
dificuldade de acesso a medicamentos e serviços de saúde, e que fatores tais
como ínfimas condições de higiene e precárias condições sócio-econômicas, tanto
quanto características climáticas da região, como elevada temperatura e umidade
relativa do ar, pluviosidade alta e densa mata florestal, contribuem para maior
susceptibilidade de sua população às infecções micóticas (ARAÚJO et al, 2008;
LACAZ, 1998; SILVA et al, 1981).
Especificamente na terapêutica antifúngica, há relatos do uso popular de
algumas plantas da região, tanto por motivos culturais quanto por razões sócioeconômicas (JARDIM et al, 2005; MARTINS et al, 2005). Mundialmente, existem
várias pesquisas que indicam atividade antifúngica de plantas medicinais, por isso,
ressalta-se a importância de mais estudos que determinem prováveis agentes
naturais profiláticos e terapêuticos para o tratamento das infecções fúngicas
(SMÂNIA, 2003; FENNER et al, 2006). Esta declaração também se fundamenta no
fato de que 25% das drogas provêm de plantas, sendo que das 252 drogas
consideradas básicas e essenciais pela Organização Mundial de Saúde (OMS),
11% são exclusivamente originárias de plantas (MORAIS e BRAZ-FILHO, 2007).
Entretanto no Brasil, comparada à ampla diversidade de espécies vegetais,
ainda há poucas pesquisas farmacológicas, fitoquímicas, etnofarmacológicas e
toxicológicas envolvendo plantas reconhecidas por suas propriedades terapêuticas
(HEINRICH, 2000; MACIEL et al, 2002; NIERO et al, 2002; ARAÚJO et al, 2004).
Além disso, observa-se ainda, que há um déficit de agentes antifúngicos em
relação à maior incidência de doenças fúngicas e à resistência oferecida pelos
microorganismos (SMÂNIA, 2003; MESA ARANGO et al, 2004). Estas evidências
incitam pesquisas para análise da atividade antifúngica de espécies vegetais que
contribuam com o desenvolvimento de alternativas terapêuticas de baixo custo,
melhor acesso, mais eficazes e com menos reações adversas (SILVA, 2003).
Dentro deste contexto, é imprescindível a avaliação in vitro da atividade
candicida de extratos vegetais brutos da região Amazônica, assim como a
22
determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida
mínima (CFM) destes extratos, com propósito de identificar seu potencial
antifúngico e contribuir para o desenvolvimento de novos medicamentos.
23
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Aspectos Epidemiológicos das infecções por Candida
A candidíase é considerada uma das infecções fúngicas mais frequentes que
acometem o ser humano; quando invasiva, é uma das principais causas de
mortalidade associada à micose em todo o mundo, ao se disseminar por via
hematogênica,
é
denominada
candidemia
e/ou
fungemia
(COLOMBO
e
GUIMARÃES, 2003; FURLANETO-MAIA et al, 2007; PFALLER e DIEKEMA, 2007).
Dentre os fatores que podem estar relacionados à epidemiologia de doenças
causadas por Candida sp, cita-se a região demográfica, as características da
população estudada, causas da infecção e sítio anatômico acometido (PFALLER e
DIEKEMA, 2007).
As espécies de Candida se apresentam como organismos comensais em
indivíduos saudáveis de diversas faixas etárias, e podem tornar-se patógenos
oportunistas, dando origem a infecções como a candidíase, que se caracteriza por
lesões mucosas superficiais até disseminações sistêmicas graves e invasivas,
potencialmente fatais em alguns pacientes (DE REPENTIGNY et al, 2000; CAMPISI
et al, 2002). Além disso, as candidíases podem estar envolvidas em lesões
endodônticas persistentes e lesões periodontais, onde a espécie mais isolada tem
sido C. albicans, seguida das espécies C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e
C. krusei (SUNDQVIST et al, 1998; SANT’ANA et al, 2002).
Ao longo da década de 1990, foram descobertas cerca de 200 espécies de
Candida, sendo que apenas 10% destas foram reconhecidas como agentes
etiológicos de infecções em seres humanos; das quais, oito foram consideradas
patogênicas: C. albicans, C. guilliermondii, C. kefyr, C. krusei, C. tropicalis,
C. parapsilosis, C. viswanathii e C. glabrata (KURTZMAN e FELL, 1998;
MCLNTYRE, 2001). Posteriormente, foram conhecidas novas espécies de Candida
causadoras de micoses superficiais ou invasivas em seres humanos, assim como
espécies emergentes como C. rugosa, C. famata, C. utilis, C. lipolytica,
24
C. norvegensis, C. inconspícua (COLEMAN RINALDI et al, 1998; DIGNANI et al,
2003).
Espécies como C. tropicalis, C. kefyr, C. glabrata, C. parapsilosis, além de
C. albicans, podem ser isoladas em até 80% das mucosas da cavidade oral,
vaginal, trato gastrintestinal e região retal de indivíduos sadios; quando patogênicas
e introduzidas por via intravenosa, podem invadir a corrente sanguínea, causando
tromboflebite, endocardite, infecções oculares e infecções em outros órgãos
(CAPOOR et al, 2005; LAUPLAND et al, 2005; BASSETTI et al, 2006). Na
candidíase vulvovaginal (CVV), cerca de 90% dos casos são atribuídos à
C. albicans, mas Candida glabrata e C. tropicalis têm se destacado como agentes
etiológicos (SOBEL, 1999).
No Brasil, há poucos registros de estudos relacionados à incidência do
gênero Candida em amostras clínicas de diversos sítios, comparada à importância
que as mesmas possuem. Nesse sentido, relatórios brasileiros sobre hospitais
públicos terciários da região Sudeste evidenciam que C. albicans é o principal
agente de candidemia (20-50%), seguido por C. parapsilosis (17-35%), C. tropicalis
(12-27%) e C. guilliermondii (2-10%). Sua maior patogenicidade estaria ligada ao
desenvolvimento de fatores de virulência como a troca fenotípica com alteração
morfológica celular, à capacidade de adesão a células hospedeiras e à atividade
lipolítica e proteolítica extracelular (NAGLIK et al, 2004; SCHALLER et al, 2005).
Além da patogenicidade também estar associada a fatores como o uso excessivo
de agentes antimicrobianos de amplo espectro, aumento da sobrevida, terapia
antineoplásica agressiva e à epidemia de AIDS (CHATTOPADHYAY et al, 2001;
MELO et al, 2004; YANG et al, 2005).
Outros estudos relatam que as fungemias estão relacionadas principalmente
às espécies não albicans (COLOMBO et al, 1999; BRITO et al, 2006). Em
pacientes hospitalizados, C. parapsilosis, que frequentemente é encontrada na
pele, está amplamente relacionada como causa de fungemias e onicomicoses.
Além de apresentar alta incidência em recém-nascidos internados em Unidade de
Terapia Intensiva (UTI), tendo como principais fatores de risco para sua
transmissão, o uso prolongado de cateteres e a aplicação de nutrição parenteral
(CLARK et al, 2004; BRILHANTE et al, 2005; CANO et al, 2005; DURÁN et al,
2005; SAN MIGUEL et al, 2005; VALLE et al, 2010).
25
Estudo realizado em hospital público terciário de Fortaleza reportou
C. parapsilosis como sendo a principal espécie não albicans isolada dos pacientes,
sendo que as espécies de Candida foram responsáveis por 72% das ocorrências
de fungemias nesse hospital (MEDRANO et al, 2006). Outra espécie de importância
é C. tropicalis, transmitida por via endógena e que parece ser mais virulenta que
C. albicans em pacientes neutropênicos, com neoplasias e doenças hematológicas
e infecção disseminada; apresentando altas taxas de mortalidade (KONTOYANNIS
et al, 2001; LEUNG et al, 2002; GOLDANI e MARIO, 2003).
As amostras clínicas mais cultivadas, como sangue, urina e escarro, indicam
Candida albicans como predominante; porém, C. tropicalis, C. parapsilosis,
C. glabrata e C. krusei, importantes patógenos oportunistas, aparecem com
prevalências cada vez mais altas (BAUMGARTNER et al, 1996; FLOONGLADDA et
al, 2002). Estudo realizado em um hospital público infantil de São Paulo, no período
entre 2005 e 2007, constatou que 62,12% das infecções eram ocasionadas por
Candida albicans e 37,88% por espécies não albicans. Candida albicans foi mais
prevalente em casos de candidúria (53,62%), enquanto que 71,43% espécies não
albicans prevaleceram em candidemia (FURLANETO-MAIA et al, 2007; VIANI e
PAULA, 2008).
Esta mudança no perfil epidemiológico de candidemia estaria relacionada
com o aumento de procedimentos médicos invasivos, bem como a profilaxia e uso
empírico de antifúngicos, como os azóis (COLOMBO et al, 2002; GOLDANI e
MARIO, 2003; ANTUNES et al, 2004; DURÁN et al, 2005). Contudo,
independentemente de sua etiologia pertencer ou não a espécies de Candida
albicans, as infecções causadas por estas, representam importante problema de
saúde pública (VALLE et al, 2010). Sua importância, também é conseqüência da
estreita relação que possui com a resistência a múltiplas drogas, com a evolução
clínica e seu potencial de letalidade, visto que as infecções fúngicas invasivas são
difíceis de diagnosticar, prevenir e tratar (COLOMBO, 2000; NUCCI e COLOMBO,
2002; SILVA, 2003; MORGAN et al, 2005).
2.2 Agentes antifúngicos e a resistência oferecida dos microorganismos
26
O aumento da sobrevida de muitos pacientes promoveu a maior
susceptibilidade dos mesmos a infecções causadas por organismos de baixa
virulência, ou considerados, não patogênicos. Logo, as infecções fúngicas têm
apresentado maior incidência e os fungos se apresentam cada dia, mais resistentes
às drogas comerciais (ALVES et al, 2006).
Concomitantemente, intensificou-se a busca por novas opções terapêuticas,
em virtude não só da resistência oferecida pelos microorganismos, mas pela
constatação de que os antifúngicos atualmente disponíveis possuem sérias
desvantagens, entre estas, baixo espectro de ação, pouca seletividade e alta
toxicidade, causando recidivas pelo efeito fungistático e não fungicida (REX et al,
2000; ZACCHINO et al, 2003; CHEN e SORREL, 2007).
Entre as principais classes de antifúngicos usados na terapêutica antifúngica,
citam-se os poliênicos, azóis, alilaminas, 5-fluorocitosina, griseofulvina, entre
outros. Especificamente no tratamento das candidíases, destacam-se: os polienos
e os azóis (SOBEL, 1999).
O principal representante da classe dos polienos é a Anfotericina B, com
ação fungicida, sendo a droga de primeira escolha no tratamento das infecções
causadas pelo gênero Candida, contudo apresenta efeitos tóxicos e requer
administração intravenosa; age nos esteróis, preferencialmente no ergosterol,
provocando alteração da integridade da membrana fúngica e desequilíbrio
osmótico, o que resulta na perda de potássio intracelular, magnésio, açúcares e de
outros metabólitos, promovendo a morte celular (GOODWIN et al, 1995; CHEN e
SORREL, 2007). Com intuito de melhorar a farmacocinética e diminuir a toxicidade
do fármaco, foram desenvolvidas formulações lipídicas (Ambisome® - Anfotericina
B lipossomal), que na sua formulação clássica apresenta estreito índice terapêutico
(RINDGEN et al, 1991).
A
Nistatina,
outro
representante
dos
poliênicos,
é
considerada
demasiadamente tóxica (McGINNIS e RINALDI, 1996). É um antifúngico
relativamente insolúvel na água e instável, usado no tratamento de infecções
causadas por Candida da mucosa, pele e trato intestinal; quando utilizada na forma
tópica, é a droga de eleição para o tratamento das infecções da cavidade oral
(YAGIELA, 1999; FARIAS et al, 2003). Pode causar leves e transitórios distúrbios
gastrointestinais, como náuseas, vómitos e diarreia, além de apresentar um sabor
amargo (FARIAS et al, 2003).
27
Os azóis marcaram uma nova era no tratamento de infecções por Candida
sp, sendo disponíveis para a administração oral, cujo mecanismo de ação é a
inibição da via biosintética do ergosterol na membrana da célula fúngica, em
diferentes
etapas
da
cascata
de
síntese,
inibindo
principalmente
a
14α-lanosteroldimetilase. A utilização de agentes antifúngicos azólicos foi uma das
alternativas encontradas para tratar infecções fúngicas, tanto superficiais quanto
sistêmicas, diminuindo a agressividade dos poliênicos. Seus representantes são:
cetoconazol,
miconazol,
fluconazol,
itraconazol,
voriconazol,
posaconazol,
ravuconazol (VERMITSKY et al, 2006; CHEN e SORRELL, 2007).
O cetoconazol foi o primeiro agente disponível para o tratamento de
candidíase mucocutânea, entretanto, foram identificadas falhas terapêuticas
associadas aos valores elevados da CIM; posteriormente, o fluconazol, solúvel em
água, com biodisponibilidade superior a 90% após administração oral, foi
amplamente usado nestas infecções, principalmente em pacientes soropositivos
para SIDA, portadores de candidíase orofaríngea (CHEN e SORRELL, 2007). Com
o amplo uso desses agentes antifúngicos, tem se observado um crescente aumento
na resistência a essas drogas, especialmente ao fluconazol em espécies de
Candida não albicans, comparada à Anfotericina B (ELLIS, 2002; KRCMERY e
BARNES, 2002).
A 5-fluorocitosina é um agente antifúngico com limitado espectro de atividade,
atua inibindo o metabolismo das pirimidinas, interferindo na biossíntese de DNA e
RNA (WEBSTER e WEBER, 2007). Deve ser utilizado em combinação com outros
agentes para prevenir o aparecimento de resistência e possui como reações
adversas mais comuns, a supressão da função da medula óssea, disfunção renal,
distúrbios gastrointestinais, erupção cutânea, entre outros (PICKERING, 2000).
A terbinafina é um composto fungicida sintético, representante das alilaminas
que inibe a biossíntese de ergosterol ao nível da escualeno epoxidase, o que
resulta no esgotamento do ergosterol e acumulação tóxica de escualeno,
provocando a inibição do crescimento e morte celular. A terbinafina não é
normalmente usada isoladamente, mas sim em combinação com outras drogas
para o tratamento de espécies de Candida resistentes; geralmente é bem tolerada
e só raramente ocorrem distúrbios gastrointestinais ou toxicidade cutânea
(RODRIGUEZ e PATRICK, 2001; WEBSTER e WEBER, 2007).
28
Antifúngicos mais recentes da classe das equinocandinas (caspofungina,
anidulafungina,
micafungina),
consideradas
por
alguns,
como
penicilinas
antifúngicas também têm sido empregadas em infecções fúngicas sistêmicas por
Candida sp. São substâncias provenientes dos fungos Aspergillus nidulans,
Aspergillus
syndowie,
Zalerion
arboricola,
considerados
como
fungicidas
lipopeptidicos cíclicos que atuam prevenindo a síntese da parede celular através da
inibição não competitiva da 1,3-β-D-glucanosintetase, que sintetiza um componente
estrutural importante da parede celular, o β-(1,3)-glucano, enzima que está ausente
nas células dos mamíferos e presente na maioria dos fungos (ANDRIOLE et al,
1998; STONE et al, 2002; ODDS et al, 2003). A caspofugina, ao reduzir a síntese da
1,3-β-D-glucanosintetase, provoca a perda de glucano na parede celular dos fungos,
o que resulta na fragilidade osmótica dos mesmos (RODRIGUEZ e PATRICK, 2001).
Em relação à sensibilidade das espécies de Candida aos agentes
antimicóticos, observa-se que C. albicans é sensível a todos os antifúngicos
sistêmicos, mas casos de resistência adquirida a azólicos são conhecidos em
pacientes que foram expostos a estes por períodos prolongados. Evidencia-se
ainda que C. dubliniensis tem mais facilidade em desenvolver resistência aos
azólicos em relação à C. albicans (SANGLARD e ODDS, 2002).
Os isolados clínicos de C. tropicalis e C. parapsilosis apresentam
sensibilidade à Anfotericina B e aos triazólicos. A espécie Candida glabrata
apresenta menor sensibilidade à Anfotericina B e ao fluconazol, sendo que 10%
das amostras desta espécie recuperadas no sangue apresentam resistência ao
fluconazol, possuindo maior ocorrência em pacientes idosos (GODOY et al, 2003).
A espécie C. krusei é naturalmente resistente ao fluconazol, e facilmente
encontrada em pacientes neutropênicos, expostos ao mesmo; Candida lusitaniae
possui ou desenvolve rapidamente resistência à Anfotericina B, mas é sensível aos
triazólicos (KRCMERY e BARNES, 2002).
São reportados casos de resistência in vitro de amostras clínicas da espécie
C. guilliermondii à Anfotericina B, assim como má resposta clínica de pacientes,
portanto existem dúvidas sobre a eficácia da Anfotericina B no tratamento de
infecções sistêmicas causadas por esta espécie (MERZ, 1984; HAZEN, 1995;
DIEKEMA et al, 2002; KRCMERY e BARNES, 2002; SANGLARD e ODDS, 2002;
GODOY et al, 2003; GOLDANI e MARIO, 2003).
29
A resistência de espécies de Candida tem tido ampla repercussão pela maior
ocorrência e por ter se estendido a vários antifúngicos de uso clínico, tais como,
polienos, fluoropirimidinas, azóis, equinocandinas e alilaminas (ARANGO et al,
2004). Dentre os mecanismos de resistência, destacam-se a superprodução de
enzimas, a utilização de vias metabólicas alternativas e a produção de bombas de
efluxo que expulsam o medicamento da célula fúngica (GOLDMAN et al, 2004;
FERREIRA et al, 2005; ESPINEL-INGROFF, 2008).
A crescente resistência dos microorganismos favorece a busca por
alternativas terapêuticas e dentro deste contexto os extratos vegetais com
comprovada atividade antimicrobiana, constituem-se em alternativas para a
descoberta de novos medicamentos antifúngicos, inclusive mais potentes e seguros
(LOGUERCIO et al, 2005).
2.3 Plantas medicinais e suas propriedades antifúngicas
O uso de plantas medicinais no tratamento das mais variadas doenças é
uma arte milenar que tem inúmeros registros, inclusive bíblicos, que indicam
relação direta com o início da existência humana (VEIGA JÚNIOR et al, 2005).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% da população
mundial utilizam alguma espécie de planta para melhoria ou tratamento de sinais
e/ou sintomas de processos patológicos (ANVISA, 2002).
Apesar de sua relevante e ampla utilização por todo o mundo, o uso
terapêutico de plantas, ainda caracteriza-se pelo empirismo, oferecendo riscos de
reações adversas em virtude do grande potencial toxicológico destas e das
interações relacionadas, contrariamente ao que grande parte da população mundial
acredita (FERRO, 2006).
Com relação às pesquisas de propriedades antifúngicas, destaca-se o
levantamento etnofarmacológico realizado por Fenner et al (2006) que identificou
409 espécies vegetais, distribuídas em 98 famílias, utilizadas no tratamento de
infecções fúngicas, contudo estudos farmacológicos que comprovem esta atividade
ainda são escassos (CARVALHO, 2007).
30
Relacionado às pesquisas de atividade anti Candida ou candicida, tem-se
observado maior registro de investigações quanto às propriedades terapêuticas de
óleos essenciais, extratos vegetais e frações (BERTINI et al, 2005; TAMPIERI et al,
2005; POZZATTI, 2007).
Entretanto, devido à complexidade dos mesmos, em virtude da variabilidade
de metodologias e a necessidade do controle de qualidade, é importante que mais
recursos financeiros e humanos sejam destinados a estas pesquisas, visando não
só o registro, mas a reprodutibilidade e aplicação das diversas propriedades destas
espécies com fins terapêuticos (KLEIN et al, 2009).
Estudos em óleos essenciais e extratos etanólicos de trinta e cinco plantas
foram analisados quanto à sua atividade frente a C. albicans, onde não foi
observada a efetividade de nenhum extrato, nas concentrações testadas. Já os
óleos de manjericão e orégano apresentaram concentrações inibitórias mínimas
(CIMs) maior que 2,0 mg/mL e o de tomilho, CIM igual a 2,0 mg/mL (DUARTE et al,
2005). Foi constatado em estudos de microdiluição em caldo, que o óleo essencial
de orégano na concentração de 0,25 mg/mL, possui efeito fungicida e capacidade
de inibir a formação de tubo germinativo de C. albicans e nas concentrações de
0,125 mg/mL e 0,0625 mg/mL, inibições de 75% e maiores que 50%,
respectivamente (MANOHAR et al, 2001).
Em estudos de susceptibilidade a diferentes espécies de Candida,
constatou-se que o óleo essencial de Melaleuca alternifólia (árvore do chá)
apresentou atividade com concentrações efetivas iguais, em cepas resistentes e
sensíveis de C. albicans e C. glabrata, ao fluconazol. Este mesmo óleo, também foi
ativo em espécies de C. lusitaniae, C. guillermondii, C. krusei e C. tropicalis
(VAZQUEZ et al, 2000). Acredita-se que sua atividade biológica está relacionada a
alterações provocadas na permeabilidade e fluidez da membrana citoplasmática
fúngica (COX et al, 2000; HAMMER et al, 2004).
A atividade fungicida do óleo essencial de Ocimum gratissimum L. foi
comprovada quando testado sobre quatro espécies de Candida (NAKAMURA et al,
2004). A Curcuma zedoaria apresentou atividade antifúngica in vitro sobre
leveduras de C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata, isoladas da cavidade bucal de
indivíduos HIV positivos (BERTINI et al, 2005).
Em testes com cepas de C. albicans, observou-se que Piptadenea
stipulacea e Byrsonima sericea foram efetivas em 83% das cepas, inclusive em
31
uma cepa resistente a todos os outros extratos (SOARES et al, 2006). A atividade
inibitória e fungicida sobre amostras de Candida, também foi comprovada para o
extrato alcoólico de Mentha piperita (MATOS et al, 2009).
O extrato etanólico das folhas de Schinus terebinthifolius apresentou
potencial atividade antimicótica contra C. glabrata e em análise fitoquímica
preliminar, este extrato indicou a presença de compostos biologicamente ativos,
tais como, saponinas, flavonóides, triterpenos, esteróides e taninos (JOHANN et al,
2007). A ação antimicrobiana dos vegetais e sua associação com a presença de
taninos, flavonóides e polifenóis, já foi anteriormente relatada (REIS, 2006).
Flavonóides, triterpenos, esteróides e taninos têm sido relatados como
constituintes de Chrysobalanus icaco e no extrato hexânico de folhas de C. icaco foi
revelada atividade antifúngica frente à Candida albicans (CASTILHO et al, 2000;
CHAUDHURI et al, 2002; FERNANDES et al, 2003).
Existem várias substâncias testadas e que apresentam atividade antifúngica
frente a espécies de Candida, entre elas, destacam-se: carvacrol, eugenol, timol,
trans-cinemaldeido. De Sorghum bicolor L., foi isolado o peptídio 30kDa, que
apresentou atividade contra C. albicans. Alicina e ajoeno, isoladas de Allium
sativum L, eucaliptol (1,8 cianol) de Eucalyptus globulus Labill, ezeamatina de
Zeamays L, são substâncias ativas contra diferentes gêneros de fungos, dentre
estes, espécies de Candida (MINCOFF et al, 2005; TAMPIERI et al, 2005).
A ação terapêutica do carvacrol e do eugenol frente à C. albicans, foi
avaliada in vitro em ratos imunodeprimidos, onde se observou CIMs de 6,5 mM e
12 mM, respectivamente, mostrando maior efetividade do carvacrol em relação ao
eugenol (CHAMI et al, 2004). A atividade do composto fenólico carvacrol frente a
espécies de Candida, também foi reportada em estudos que identificaram, após 48
horas de incubação, ação fungistática dos óleos essenciais de Origanum vulgare
(orégano), Ocimum basilicum (manjericão), Thymis vulgaris (tomilho) e Rosmarinus
officinalis (alecrim), com CIMs de 500 ppm para os dois primeiros, 1000 ppm e
5000 ppm para os dois últimos, respectivamente (TAMPIERI et al, 2005;
POZZATTI, 2007).
Estas evidências demonstram que as espécies vegetais e suas substâncias
constituem-se em alternativas promissoras para emprego na terapêutica moderna.
Portanto, torna-se imprescindível, o emprego de conhecimentos científicos que
validem ou não, os conhecimentos tradicionais, com o objetivo não só de resgate
32
do patrimônio cultural e garantia de qualidade no uso de plantas medicinais, mas
também como opção mais viável para o desenvolvimento sustentável e proteção
das espécies vegetais em extinção, com maior possibilidade de acesso às novas
terapêuticas medicamentosas (CAMPAGNOLI et al, 2004).
2.4 Chrysobalanus icaco Lin
2.4.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS
O Chrysobalanus icaco L (C. icaco) é originário do sul da Flórida, Caribe,
América Central, do noroeste tropical da América do Sul e África Ocidental, tendo
sido naturalizado e cultivado no Vietnã, Melanésia e Polinésia (FRANCIS, 2003;
KRUEL e PEIXOTO, 2004; BROWN, 2011).
Especificamente no Brasil, é muito encontrado nos estados do Pará, Ceará,
Maranhão, Pernambuco, Rio de Janeiro, Rio Grande do Norte; onde recebe várias
denominações como ajiru, ajuru, ajuru branco, cajuru, bajurú, goajuru, guajiru,
oajuru e abajeru (KRUEL e PEIXOTO, 2004). Nos países de língua inglesa,
comumente é chamado de coco-plum, icaque-ponne, pork-fat-apple e zicate; nos
de língua francesa, é chamado prunier de cacao (FRANCIS, 2003; KRUEL e
PEIXOTO, 2004).
C. icaco é uma espécie arbustiva, que varia de 1,5 a 3 metros de altura
(Figura 1, p. 32), encontrado nas zonas costeiras e litorais e que habita
preferencialmente dunas, em áreas de restinga (VARGAS, 1998; KRUEL e
PEIXOTO, 2004; FREITAS e LOCATELLI, 2009). Possui alta adaptabilidade a
condições ambientais e resistência à salinidade e a níveis baixos de umidade, fogo
e geadas moderadas (KRUEL e PEIXOTO, 2004).
33
Figura 1 - Aspectos gerais de distribuição em arbusto de Chrysobalanus icaco L.
A distribuição dos indivíduos de C. icaco favorece a polinização cruzada
devido à proximidade uns dos outros. As flores de C. icaco possuem características
morfológicas dependentes de insetos para sua polinização e formação de frutos e
sementes, logo esta característica é determinante para sua distribuição (FREITAS e
LOCATELLI, 2009).
Suas
folhas
são
muito
conhecidas
popularmente
pela
propriedade
hipoglicemiante (CASTILHO et al, 2000; FRANCIS, 2003; AGUIAR, 2010). Em 100 g
de folhas desidratadas de C. icaco foram determinadas teor de umidade (10,46 ±
0,27 g), teor de proteínas igual a (10,53 ± 0,14 g) e teor para cinzas totais de (4,61 ±
0,13 g). Neste mesmo estudo, observou-se que as folhas de C. icaco se
apresentavam ricas em cálcio, magnésio, ferro, manganês, cromo e selênio; além de
apresentar alta concentração de fibra alimentar total, com maior proporção de fibras
solúveis, baixa concentração de lipídios e com perfil de aminoácidos não relevante
(AGUIAR, 2010).
Nas regiões litorâneas, o fruto de C. icaco é bastante consumido, mas no
restante do Brasil ainda precisa ser explorado quanto ao seu valor econômico.
Outro aspecto que merece ser ressaltado quanto ao C. icaco é que devido ao
desmatamento, começa a ocorrer o seu desaparecimento; seja pela exploração
inadequada da madeira ou devido a construções irregulares em áreas de restinga
(AGUIAR, 2010). Logo, existe uma necessidade iminente do conhecimento de suas
características e propriedades, prevenindo a sua extinção.
34
2.4.2 DESCRIÇÃO BOTÂNICA
Segundo Dalhgren (1982), Chrysobalanus icaco apresenta a seguinte
classificação botânica:
Tribo: Chrysobalaneae;
Família: Chrysobalanaceae;
Ordem: Rosales;
Superordem: Rosidae;
Subclasse Dicotiledônea;
A família Chrysobalanaceae tem ocorrência em regiões tropicais e
subtropicais, possui 17 gêneros e cerca de 450 espécies de hábito arbustivo e
arbóreo (BRUMMITT, 1992). No Pará, existem registros de que esta família é
constituída de 294 espécies, distribuídas em sete gêneros, alguns economicamente
importantes, para indústria madeireira, como Licania e Parinari.
Esta espécie é uma planta arbórea silvestre de porte médio, com altura
máxima de 3 metros, e ciclo de vida perenifólia. Seu tronco possui diâmetro de 15
cm a 30 cm e suas folhas, duras e ovais, de cor verde escuro brilhante na parte
superior (Figura 2, p.34), possuem comprimento até 4 cm e largura de 3 a 6 cm
(MATOS, 1999).
Figura 2 - Aspecto das folhas de Chrysobalanus icaco L.
35
O fruto de C. icaco é arredondado, com largura entre 2 e 5 cm, cor
diversificada entre o branco-creme, rosa e a púrpura, com pequenas variações para
o preto (Figura 3, p. 35). Apresenta polpa branca, um tanto esponjosa, adocicada ou
insípida; quando em maturação, é bastante adstringente. A composição centesimal
da polpa de abajeru revelou que este fruto apresenta baixa concentração de
proteínas, lipídios e calorias; sendo uma importante fonte de minerais, com atividade
antioxidante, como o selênio, cromo e cobre, além de outros de grande relevância,
como o ferro e o cálcio, contudo a biodisponibilidade dos mesmos ainda não é
conhecida (AGUIAR, 2010).
Sua semente é tipo noz (Figura 3, p. 35) constituída por uma casca dura e
uma amêndoa tenra (VARGAS et al, 2000). A germinação de suas sementes ocorre
entre 20 a 30 dias e sua forma de vida é classificada como heliófita ou higrófita.
Figura 3 - Imagens dos frutos e semente de Chrysobalanus icaco L.
Fonte: Aguiar, 2010.
As flores de C. icaco nascem em pequenos ramos auxiliares sendo
pequenas e de cor verde e branca (Figura 4, p. 35) São geralmente vistosas,
reunidas em inflorescência, bracteadas, com tubo floral desenvolvido (hipanto),
cinco sépalas, cinco pétalas, livres, cinco a numerosos estames, às vezes
dispostos unilateralmente, com filetes muitas vezes evidentes, excertos e coloridos,
ovário súpero, com estilete inserido na base, ou seja, ginobásico (PRANCE, 1979).
36
Figura 4 - Imagens das flores de Chysobalanus icaco L.
2.4.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA
A família Chrysobalanaceae, é composta por 17 gêneros e cerca de 450
espécies que apresentam flavonóides, diterpenóides, triterpenóides, esteróides e
taninos em sua composição química (BRACA et al, 2001; BRACA et al, 2002;
CHAUDHURI et al, 2002; FERNANDES et al, 2003; CASTILHO et al, 2005).
Os gêneros mais estudados do ponto de vista químico são: Chrysobalanus,
Couepia, Licania e Parinarium. Da Couepia paraensis já foram isolados sitosterol,
ácido
rutina,
oleanólico,
ácido
ácido
espinósico,
3-acetiloleanólico,
naringenina,
quercetina,
5-hidróxi-2,8-dimetil-6,7-dimetóxicromona
e
5-hidróxi-8-dimetil-6,7-desmetóxibenzopirano-4-ona (SANDUJA et al, 1983).
Da partição do extrato metanólico da Licania tomentosa foram isolados:
ácido betulínico, licanolídeo, ácido palmitoléico, mistura de ácido palmitoléico e
betulínico, ácido oleanólico, mistura de estigmasterol e sitosterol, lupeol, quercitrina,
entre outros (FERNANDES et al, 2003).
O fracionamento cromatográfico realizado por espectroscopia dos extratos e
das frações da partição do extrato metanólico de Chrysobalanus icaco possibilitou o
isolamento de uma série homóloga de hidrocarbonetos de C27 a C33; de mistura
de estigmasterol e sitosterol; de mistura estigmasterol, sitosterol e campesterol; de
ácido betulínico (5a); de ácido pomólico (5b); e de 7-metilkaempferol (CASTILHO et
al, 2000). Investigações fitoquímicas de extratos etanólicos obtidos das folhas de
C. icaco, têm relatado a presença de Miricetina (5c) e indicam a mesma como
37
provável marcador taxonômico da espécie (MENDEZ et al, 1995; FERNANDES et
al, 2003; BARBOSA et al, 2006).
O extrato aquoso e a tintura de C. icaco apresentaram rutina (5d) em sua
constituição
química,
quando
analisados
por
High
Performance
Liquid
Chromatograph com Detector de arranjo de Diodos (HPLC/DAD) (BARBOSA e
PERES, 2002). O extrato hidroalcoólico de C. icaco, ao ser analisado por
HPLC/DAD e Cromatografia Líquida de alta eficiência (CLAE), associado à
espectrometria de massa (MS), apresentou miricetina-3-glicuronídeo-O (miricitrina,
como constituinte majoritário), quercitrina, rutina e outros derivados menores de
miricetina (BARBOSA e PERES, 2002; BARBOSA et al, 2006).
As principais estruturas químicas já identificadas em Chrysobalanus icaco
encontram-se dispostas na Figura 5 (5a e 5b, p. 38 e 5c e 5d, p.37).
5a - Ácido betulínico
5c - Miricetina
5b - Ácido pomólico
5d - Rutina
Figura 5 - Estruturas químicas encontradas em Chrysobalanus icaco L: 5a - Ácido
5b - Ácido pomólico, 5c – Miricetina; 5d - Rutina.
betulínico;
38
2.4.4
CARACTERÍSTICAS
ETNOFARMACOLÓGICAS
E
ATIVIDADES
BIOLÓGICAS
A família Chrysobalanaceae compreende espécies com grande valor
terapêutico, entre estas, destacam-se os gêneros Chrysobalanus, Couepia, Licania
e Parinarium (SANDUJA et al, 1982; CASTILHO et al, 2000).
Espécies do gênero Parinari, são empregadas no tratamento da malária, na
medicina popular africana. No Brasil, as espécies Chrysobalanus icaco e Licania
rígida destacam-se por seus efeitos hipoglicemiantes e diurético, comprovados
farmacologicamente (LACET et al, 1983; PRESTA, 1986; PRESTA e PEREIRA,
1987 ; GESSLER et al, 1995).
Concernente à atividade biológica, as folhas do C. icaco possuem
características analgésicas e antiinflamatórias, com principais relatos relacionados
ao poder hipoglicemiante (CASTILHO et al, 2000; FRANCIS, 2003; AGUIAR, 2010).
Na Amazônia Oriental, as raízes e folhas desta espécie, são usadas popularmente
contra a disenteria e leucorréia (PRESTA e PEREIRA, 1987; JARDIM et al, 2005).
O extrato metanólico das folhas de C. icaco apresentou atividade
antimicrobiana e estudos toxicológicos do extrato aquoso de suas folhas
evidenciaram a presença de ação antioxidante (FERNANDES et al, 2003;
FERREIRA-MACHADO et al, 2004). A ação antioxidante já havia sido reportada em
outro gênero e atribuída aos flavonóides existentes na Licania licaniaeflora (BRACA
et al, 2002).
A atividade citotóxica de C. icaco foi comprovada através do isolamento do
ácido pomólico, substância extraída das folhas desta espécie, capaz de eliminar
80% a 90% das células cancerígenas, inclusive linhagens tumorais resistentes a
múltiplas drogas (MDR) (CASTILHO et al, 2000; GATTASS et al, 2003).
Extratos e frações de C. icaco e L. tomentosa apresentaram atividade
bacteriana frente à Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. O extrato
metanólico das folhas de C. icaco apresentou ainda, atividade antiangiogênica e
inibição da síntese protéica de células HeLa; além de ter sido evidenciada, a
atividade hipoglicemiante de extratos hexânico e metanólico e frações em acetato
de etila e butanol de C. icaco (CASTILHO et al, 2000).
39
Zuque et al (2004) ao analisar por disco difusão em ágar, os extratos
etanólico e hexano de Couepia glandiflora (Chrysobalanaceae) observaram que os
mesmos nas concentrações de 10000; 1000; 100; 50 e 25 mg/mL não foram ativos
sobre cepas (ATCC 10231) de C. albicans. Entretanto, a atividade antifúngica dos
extratos hexânicos de folhas de C. icaco e L. tomentosa, outras espécies da família
Chrysobalanaceae, apresentaram atividade frente à Candida albicans (CASTILHO
et al, 2000).
Estudos sugerem que a presença de diterpenos em C. icaco e espécies do
gênero Parinari, está associada à potencialidade no tratamento da SIDA e
propriedades antifúngicas, respectivamente (GUSTAFSON et al, 1991; GARO et al,
1997).
Todas estas evidências reforçam o grande potencial terapêutico que
espécies pertencentes à família Chrysobalanaceae, entre estas Chrysobalanus
icaco, podem apresentar frente a cepas ATCC e linhagens clínicas de Candida,
contribuindo para o desenvolvimento de novos antifúngicos.
40
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Determinar a atividade antifúngica do extrato hidroalcoólico das folhas de
Chrysobalanus icaco L (EHCi) frente à cepa ATCC e isolados clínicos de
Candida sp.
3.2 Objetivos Específicos
Caracterizar farmacognosticamente as folhas de C. icaco através de testes
físicos, químicos e físico-químicos;
Determinar a atividade antifúngica, obtendo valores de CIM para o extrato
hidroalcoólico das folhas de C. icaco frente a cepas ATCC e isolados clínicos orais
de espécies de Candida;
Determinar os valores de CFM do extrato hidroalcoólico das folhas de
C. icaco frente a cepas ATCC e a isolados clínicos orais de Candida spp.
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção da espécie vegetal
Há vários métodos usados na seleção de plantas para estudos botânicos,
fitoquímicos,
microbiológicos,
toxicológicos,
dentre
estes,
o
levantamento
etnofarmacológico tem se destacado (CALIXTO, 2000). No presente trabalho, a
escolha da espécie vegetal compreendeu um universo de plantas nativas da
Amazônia e foi baseada em relatos de uso popular em leucorréias e micoses,
assim como em evidências científicas de potencial biológico (PRESTA e PEREIRA,
1987; CASTILHO et al, 2000; FERNANDES et al, 2003; FERREIRA-MACHADO et
al, 2004; JARDIM et al, 2005).
Chrysobalanus icaco L foi escolhido pelas indicações etnofarmacêuticas e
atividades biológicas comprovadas na terapêutica antifúngica (CASTILHO et al,
2000; JARDIM et al, 2005). Entretanto, a ausência de dados concernentes ao C.
icaco que possam servir de base ou parâmetro para padronização de matériasprimas vegetais e controle de qualidade, conforme legislação vigente incita novos
estudos com esta espécie.
4.2 Microrganismos
42
Para a realização da pesquisa foram utilizadas cepa ATCC (American Type
Culture Collection) de Candida albicans (ATCC 40175) e onze (11) cepas de
isolados clínicos orais de Candida spp provenientes de pacientes atendidos na
Faculdade de Odontologia da UFPA. As cepas foram identificadas pelo Instituto
Evandro Chagas (IEC), sob a supervisão da Drª Maurimélia Mesquita. Para a
obtenção das amostras clínicas orais o projeto foi aprovado no Comitê de Ética do
Instituto de Ciências da Saúde, sob o parecer nº 060/11.
4.3 Solventes, reagentes e soluções
Acetato de etila, Acetona, Acetonitrila, Ácido acético glacial, Ácido bórico,
Ácido cítrico, Ácido clorídrico, Ácido clorídrico diluído, Ácido fosfórico, Ácido
sulfúrico, Ácido Trifluoroacético 0,5%, Ágar Sabouraud Dextrose (Himedia), Água
esterilizada, Caldo Mueller Hinton (Merck), Clorofórmio (Isofar), Diclorometano
(Isofar), Dimetilsulfóxido (Himedia), Etanol a 96° Gay-Lussac (GL) (Migako), Éter
etílico, Hexano, Hidróxido de amônio, Tolueno, Acetato de etila, Anidrido acético,
Sulfato de sódio, Metanol, Hidróxido de amônio.
Todos os solventes utilizados possuíam grau de pureza p.a. e eram da marca
Nuclear, quando não especificado. A água ultra-pura usada foi de procedência do
Laboratório de Fitoquímica (LAFQ) da UFPA.
Os Reativos de Kedde, Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Fehling A e B e as
soluções: solução de cloreto férrico 1% e 10%, lugol, nihidrina a 1%, ácido clorídrico
a 1%, ácido sulfúrico etanólico 12%, vanilina a 1%, carbonato de sódio a 25%,
formaldeído a 4%, o-dinitrobenzeno a 5%, hidroxilamina a 10%, solução metanólica
de hidróxido de potássio a 10%, solução aquosa de hidróxido de potássio 5%, HCl
1N, hidroxilamina a 10%, solução aquosa de vanilina a 1%, HCl 6N, peróxido de
hidrogênio concentrado (30%), lugol, foram preparados no LAFQ da UFPA
(BARBOSA et al, 2001).
43
4.4 Equipamentos
Agitador
magnético
com
aquecimento
(Fisatom
752A®),
Agitador
eletromagnético (Marconi®), Autoclave vertical (Phoenix®), Balança analítica
(Bioprecisa modelo FA 2104N), Balança analítica (Gehaka modelo AG 200),
Balança analítica (Gehaka modelo BK 600), Bomba de vácuo (Marconi), Câmara de
fluxo laminar (Veco®), Câmara de ultravioleta de 254 e 365nm (Warning), Capela de
exaustão (Quimis), Chapa de aquecimento (Quimis), Coluna cromatográfica
Lichrosfer 100 RP-8 (Agilent Technologies), Cromatógrafo a líquido (Merck-Hitachi),
Densitômetro (Densimat), Dessecador de vidros, Destilador de água, Estufa
bacteriológica (Fanem), Estufa de ar circulante (Fabbe®), Estufa MD 1.2 (Medicate),
Evaporador rotativo Laborata 4000 (Heidolph), Filtro de água ultra-pura (Milipore
Water Purification Systems), Geladeiras, Liofilizador (Christh Alpha®), Moinho de
facas de aço inoxidável, Mufla (Forlabo®), Pipeta calibrada de 100-1000 µL, Pipeta
calibrada de 20 e 40 µL, Potenciômetro (Micronal®), Tamisador vibratório
(Produtest®), Ultra-som (Maxiclean).
4.5 Procedimentos éticos
Conforme determinação legal expressa na Resolução nº 196/96 do Conselho
Nacional de Saúde, o projeto foi realizado de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisas envolvendo Seres Humanos, sendo submetido e
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) de Seres Humanos, do Instituto
de Ciências da Saúde (ICS) da UFPA, registro CAAE 0051.0.073.000-11 e parecer
nº 060/11(Anexo A).
Os objetivos e condições da pesquisa foram esclarecidos aos potenciais
participantes a fim de obter o seu consentimento para a realização da mesma
através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo B).
4.6 Coleta e identificação do material botânico
44
A referida espécie vegetal foi coletada no município de Salinópolis, Pará (0º
36’ 1, 76” S; 47º 18’ 11, 70” O), no dia 12 de outubro de 2010, pelo farmacêuticobioquímico Amiraldo Peres.
De seu ramo mais representativo, contendo parte florida, frutos, sementes e
parte mediana da planta, foi preparada uma exsicata para facilitar a identificação da
espécie (Figura 6, p. 44).
A identificação da espécie foi realizada por profissional especialista da área
botânica, em órgão de referência, em comparação com exemplares de exsicatas já
disponíveis no acervo do herbário.
Figura 6 - Exsicata de Chrysobalanus icaco L enviada para identificação botânica.
4.7 Preparo do material botânico
45
Após coleta, a espécie vegetal foi lavada em água corrente, com posterior
desinfecção, usando gazes estéreis embebidas em solução hidroalcoólica a 70%.
Após este procedimento, as folhas de C. icaco foram submetidas à secagem prévia
por cinco dias, à temperatura ambiente, sobre bancadas previamente limpas e
revestidas com papel absorvente. O processo de secagem foi finalizado em estufa
com circulação de ar forçado a 40 ºC, durante dois dias. Concluída a secagem, as
folhas foram pesadas novamente e trituradas em moinho de facas para a obtenção
da droga pulverizada.
4.8 Preparo do extrato hidroalcoólico
Duzentos gramas da droga vegetal pulverizada foram submetidos à
maceração por sete dias em solução hidroalcoólica a 70% (600 mL).
Posteriormente, o macerado obtido foi filtrado e a torta residual submetida à nova
maceração (remaceração) em solução hidroalcoólica a 70% (600 mL) por seis dias.
Após filtração, o remacerado foi reunido ao macerado formando o extrato
hidroalcoólico de C. icaco e submetido à secagem em estufa à temperatura média
de 45 ºC para eliminação do solvente orgânico e excesso de água.
Ao final,
obteve-se o extrato bruto hidroalcoólico de Chrysobalanus icaco (EHCi) que foi
armazenado em congelador sob baixa temperatura.
4.9 Caracterização farmacognóstica
4.9.1 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO PÓ
Vinte e cinco gramas da droga vegetal pulverizada foram dispostos
uniformemente no tamis superior, obedecendo à sequência: 1.700, 710, 250, 180,
46
150, 125 µm e coletor. O tamisador (Figura 7, p.46) foi acionado por 15 minutos
(min), em escala cinco de vibração.
Após o término deste tempo, utilizando um pincel adequado, a amostra foi
removida da superfície superior de cada malha para um papel impermeável e
pesada, inclusive o pó retido no coletor.
Figura 7 - Tamisador usado para análise granulométrica de
Chrysobalanus icaco L. com indicação da posição do número
de cada tamis em mµ (micrômetros).
O percentual retido em cada tamis foi obtido utilizando o seguinte cálculo
(FARMACOPÉIA, 2010):
% Retida pelo tamis =
P1
P2.100
(1)
47
Onde:
P1 = Peso da amostra retida em cada tamis (em gramas);
P2 = Soma dos pesos retidos em cada tamis e no coletor (em gramas);
100 = Fator de porcentagem.
4.9.2 DENSIDADE APARENTE
Em uma proveta de 25 mL, devidamente aferida, foi colocado o pó vegetal,
tendo o cuidado de remover as partículas de ar que se formam entre o pó da planta
e a proveta, este procedimento foi realizado até completar o volume de 15 mL. Em
seguida, a proveta foi pesada, obtendo-se a massa de pó pela diferença de pesos.
Em seguida, dividiu-se o peso do pó pelo volume (15 mL) obtendo-se a densidade
aparente. Este procedimento foi realizado em triplicata, com média e desvio padrão
calculado (LACHMAN et al, 2001).
4.9.3 DENSIDADE DE MASSA E DENSIDADE RELATIVA
Utilizou-se picnômetro limpo e seco, com capacidade de 5 mL, previamente
calibrado. A calibração consistiu na determinação da massa em triplicata do
picnômetro vazio e da massa de seu conteúdo com água recentemente destilada e
fervida a 26 °C. A amostra foi transferida para o picnômetro e a temperatura
ajustada para 26 °C, o excesso da substância foi removido quando necessário, e o
peso da amostra determinado através da diferença de massa do picnômetro cheio e
vazio.
A densidade de massa (p) de uma substância é a razão de sua massa por
seu volume a 20 °C (FARMACOPÉIA, 2010). A densidade de massa da substância
(pt) em uma determinada temperatura (t) foi calculada a partir de sua densidade
relativa (d tt) pela fórmula:
pt = d(água) x d tt + 0,0012
Como a temperatura utilizada foi 26 ºC, a fórmula foi expressa por:
(2)
48
p26 = 0,99678 x d26 + 0,0012
(3)
A densidade relativa foi determinada através da razão entre a massa da
amostra líquida e a massa de igual volume de água, ambas a 26 °C, conforme
equação 4:
d26 = massa(substância)
massa(água)
4.9.4 DETERMINAÇÃO DA PERDA POR DESSECAÇÃO
(4)
4.9.4.1 Método gravimétrico
Foi realizado em triplicata, onde dois gramas do pó das folhas do C. icaco
foram transferidos para pesa-filtro chato previamente dessecado durante 30 minutos
nas mesmas condições a serem empregadas na determinação. Após resfriamento
em dessecador, os pesa-filtros, com a amostra foram tampados e pesados,
posteriormente os mesmos foram balançados brandamente para distribuir as
amostras de maneira mais uniforme possível. As amostras foram secadas em estufa
a 105 ºC por 2 horas, com retirada das tampas dos pesa-filtros, deixando-as
também dentro da estufa (Figura 8, p.48).
Figura 8 - Seqüência de passos da perda por dessecação pelo método de gravimetria. A:
após dessecação dos pesa-filtros em estufa, obtenção do peso do pesa-filtro sem a
amostra; B: pesagem do pesa-filtro com 2g do pó das folhas de C. icaco; C: colocação dos
pesa-filtros abertos com a amostra em estufa para dessecação; D: após retirada da estufa,
armazenamento em dessecador para posterior pesagem.
49
Após resfriamento em dessecador, os pesa-filtros tampados foram pesados.
Esta operação foi repetida até peso constante, ou seja, a diferença de peso do
material vegetal entre duas pesagens consecutivas não deveria ultrapassar 0,5 mg;
a porcentagem de perda por dessecação foi dada segundo equação 5
(FARMACOPÉIA, 2010):
Pu–Ps x100
Pa
(5)
Onde: Pa = peso da amostra;
Pu = peso do pesa-filtro retido contendo a amostra antes da dessecação;
Ps = peso do pesa-filtro retido contendo a amostra antes da dessecação.
4.9.4.2 Dessecação usando balança de infravermelho (Infratest)
Após a retirada da umidade do equipamento, cerca de um grama da
substância foi pesado e distribuído uniformemente no coletor de alumínio contido
dentro do aparelho. Como não havia monografia da espécie em estudo, utilizou-se o
tempo de um minuto, à temperatura de 105 ºC, sugerido pela Farmacopéia Brasileira
(2010). Decorrido o tempo, o valor da umidade em percentual que apareceu no
display do aparelho, foi anotado. Este procedimento foi repetido em triplicata,
calculando as médias e desvios padrões das três determinações.
4.9.5 DETERMINAÇÃO DO pH
O pH foi determinado com auxílio de potenciômetro com ajuste automático de
temperatura, devidamente padronizado com soluções tampões pH 4 e pH 7,
segundo Normas Técnicas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2008). O pó das folhas de
C. icaco foi primeiramente disperso e homogeneizado em água ultra-pura,
resultando em uma solução a 1% (FARMACOPÉIA, 2010), ou seja, na proporção de
50
1:1 (m/v). A seguir, o eletrodo do potenciômetro foi introduzido e após a
estabilização dos valores no painel, os resultados foram expressos em valores reais
de pH (Figura 9, p.50).
Figura 9 - Medição do pH de Chrysobalanus icaco L através de potenciômetro de
bancada.
4.9.6 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS TOTAIS
Este procedimento baseou-se na Farmacopéia Brasileira (2010). Foi
calcinado previamente o cadinho de porcelana em mufla a 600 ºC, o mesmo foi
resfriado em dessecador por trinta minutos e seu peso determinado em balança
analítica. Foram pesados exatamente 3 g do material vegetal triturado, os quais
foram submetidos à calcinação em mufla, à temperatura de 600 ºC, por três horas.
Foi deixado em dessecador para arrefecimento durante 30 minutos e pesagem
posterior. A porcentagem de cinzas em relação à droga seca ao ar foi expressa
pela média de três determinações e a sequência de passos para a determinação do
teor de cinzas totais encontra-se ilustrado abaixo (Figura 10, p.51).
51
Figura 10 - Seqüência de passos na determinação do teor de cinzas totais. A:
dessecação dos cadinhos; B: pesagem do cadinho sem a amostra; C: pesagem do cadinho
com 3 g da amostra; D: colocação em mufla nas condições especificadas; E: colocação em
dessecador, F: pesagem das amostras após colocação em mufla e dessecador.
4.9.7 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS INSOLÚVEIS EM ÁCIDO
O resíduo obtido na determinação de cinzas totais foi fervido durante 5
minutos com 25 mL de ácido clorídrico a 7% (p/v) em cadinho coberto com vidro de
relógio. A seguir lavou-se o vidro de relógio com 5 mL de água quente, juntando a
água de lavagem ao cadinho. Recolheu-se o resíduo insolúvel em ácido, sobre papel
de filtro, isento de cinza, lavando-o com água quente até que o filtrado se mostrasse
neutro. O papel de filtro contendo o resíduo foi transferido para o cadinho original,
secado sobre chapa quente e incinerado a cerca de 500 ºC até peso constante
52
(FARMACOPÉIA, 2010). A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido em relação
à droga seca ao ar foi calculada com base na média de três determinações.
4.9.8 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE EXTRATIVOS
Segundo Mello e Petrovick (2000), cerca de 1 g do pó das folhas, exatamente
pesado, foi submetido à decocção com 100 mL de água, durante 10 min. Após o
resfriamento, o volume foi completado a 100 mL. A solução obtida foi filtrada em
papel de filtro e os primeiros 20 mL foram desprezados. Do restante do filtrado,
pesou-se uma alíquota equivalente a 20 g, em pesa-filtro previamente tarado e
evaporou-se até secura em banho de água, em agitação constante. O resíduo foi
colocado em estufa, à temperatura de 105 ºC por 3 h. Em seguida, resfriado em
dessecador e pesado. O teor de extrativos foi calculado em massa percentual, pela
média de três determinações segundo a equação:
TE= GxFDx100
M
Onde:
(6)
TE = teor de extrativos (%; m/m);
G = massa de resíduo seco (g);
M = massa da amostra (g);
FD = fator de diluição (5).
4.9.9 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ESPUMA
Foi pesado 1 g do material vegetal reduzido a pó fino (malha de 180 μm), e
transferido para erlenmeyer contendo 50 mL de água fervente. Mantido em
temperatura moderada durante 30 minutos. A seguir, resfriado, filtrado para balão
volumétrico de 100 mL. Em seguida o volume foi completado, através do filtro, até
100 mL. O decocto obtido foi distribuído em 10 tubos de ensaio com tampa (16 mm
de diâmetro por 16 cm de altura), em série sucessiva de 1, 2, 3, até 10 mL, e o
53
volume do líquido foi ajustado em cada tubo a 10 mL com água. Os tubos foram
tampados e agitados com movimentos verticais por 15 segundos, com duas
agitações por segundo. Foram deixados em repouso por 15 minutos e a altura da
espuma medida (FARMACOPÉIA, 2010).
O índice de espuma foi calculado em triplicata, segundo a equação: 1000/A,
sendo A o volume em mililitros, do decocto usado para preparação da diluição, em
virtude dos tubos de número nove terem apresentado 1 cm de altura da espuma.
4.9.10 DETERMINAÇÃO DO RESÍDUO SECO
Em placas de petri medindo aproximadamente 50 mm em diâmetro e 30 mm
de altura, foram dispostos 0,5 g de extrato seco finamente pulverizado, em cada
uma das três amostras utilizadas (Figura 11, p.53). Os mesmos foram colocados em
estufa a 105 °C por 3 horas, em seguida armazenados em dessecador por trinta
minutos (FARMACOPÉIA, 2010). Após pesagem, o resíduo seco foi calculado em
porcentagem sobre a massa e obtido a média e desvio padrão das três
determinações.
Figura 11 - Seqüência para determinação do resíduo seco: A- colocação em placas de
petri; B- aquecimento em estufa por 3 horas; C- dessecação; D- pesagem.
4.9.11 ABORDAGEM FITOQUÍMICA
54
Essa análise tem como objetivo a caracterização de diferentes classes de
princípios ativos através de reações químicas. Foi realizada segundo as orientações
contidas no Manual do LAFQ (BARBOSA et al, 2001). Todos os ensaios foram
realizados em triplicata, sempre com a presença de um tubo (branco) contendo
apenas o meio e os reativos usados em cada teste, para fins de comparação da
interferência da cor do extrato.
4.9.11.1 Saponina espumídica
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi dissolvida em 5 mL de água
destilada, e em seguida diluída para 15 mL, então agitou-se verticalmente a
solução em tubo fechado, vigorosamente, por 2 min. Quando a camada de espuma
permaneceu estável por mais de meia hora o resultado foi considerado positivo
para saponina.
4.9.11.2 Ácidos orgânicos
Dissolveu-se alguns miligramas do extrato seco em 5 mL de água destilada.
Filtrou-se quando necessário. Transferiu-se 2 mL para um tubo de ensaio e
adicionou-se gotas do Reativo de Pascová. Quando houve descoloração do reativo,
a reação foi considerada positiva.
4.9.11.3 Açúcares redutores
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi dissolvida em 5 mL de água
destilada; filtrou-se quando necessário. Adicionou-se 2 mL do reativo de Fehling A
e 2 mL do reativo de Fehling B. A mistura foi aquecida em banho maria em ebulição
55
por 5 min. O aparecimento de um precipitado vermelho tijolo indicou a presença de
açúcares redutores.
4.9.11.4 Polissacarídeos
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi dissolvida em 5 mL de água
destilada; filtrou-se quando necessário. Adicionou-se duas gotas de Lugol. O
aparecimento de coloração azul foi o indicativo de resultado positivo.
4.9.11.5 Proteínas e Aminoácidos
Dissolveu-se 15 mg do extrato alcoólico em 3 mL de água destilada, quando
necessário, o mesmo foi filtrado. Adicionou-se 0,5 mL de solução aquosa de
Nihidrina a 1%, aqueceu-se até a ebulição. O aparecimento de coloração violeta
persistente indicou reação positiva.
4.9.11.6 Fenóis e Taninos
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi dissolvida em 5 mL de água
destilada; filtrou-se quando necessário e adicionou-se uma ou duas gotas de
solução alcoólica de FeCl 3 a 1%. Qualquer mudança de coloração ou formação de
precipitado indicou reação positiva quando comparado ao teste em branco (água +
sol. de FeCl3 a 1%). Coloração inicial entre o azul e o vermelho determinou a
presença de fenóis, quando o teste em branco foi negativo. Precipitado escuro de
tonalidade azul indicou a presença de taninos pirogálicos (hidrolisáveis) e verde, a
presença de taninos catéquicos (condensados).
4.9.11.7 Flavonóides
56
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi dissolvida em 10 mL de
metanol; filtrou-se se necessário. Adicionou-se cinco gotas de HCl concentrado e
raspas de magnésio. O surgimento da coloração rósea a vermelha na solução
indicou reação positiva.
4.9.11.8 Alcalóides
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi tratada com 5 mL de solução
de HCl a 5%; filtrou-se quando necessário. Separou-se quatro porções de 1 mL em
tubos de ensaio e adicionou-se gotas dos reativos abaixo:
a) Reativo de Bouchardat: Resultado positivo quando houve formação de
precipitado laranja avermelhado.
b) Reativo de Dragendorff: Resultado positivo em caso de formação de
precipitado vermelho tijolo.
c) Reativo de Mayer: Resultado positivo se houve formação de precipitado
branco.
4.9.11.9 Glicosídeos cardiotônicos
Uma alíquota de 25 mg dos extratos secos foi dissolvida em 5 mL de
metanol; filtrou-se quando necessário. Separou-se duas porções de 2 mL cada e
adicionou-se duas gotas do reativo de Kedde. Coloração azul ou violeta indicou
reação positiva.
4.9.11.10 Purinas
57
Numa cápsula de porcelana, juntou-se cerca de 5 mg do extrato seco, com
três gotas de solução de HCl 6N e duas gotas de H 2O2 concentrado (30%).
Evaporou-se em banho maria. Após formação de um resíduo corado de vermelho,
juntou-se três gotas de solução de NH4OH 6N. O surgimento de coloração violeta
indicou reação positiva.
4.9.11.11 Catequinas
Dissolveu-se 15 mg do extrato seco em 3 mL de metanol. Filtrou-se quando
necessário. Adicionou-se um mililitro de solução aquosa de Vanilina a 1% e 1 mL
de HCl concentrado. O surgimento de uma coloração vermelha intensa determinou
reação positiva.
4.9.11.12 Sesquiterpenolactonas e outras lactonas
Dissolveu-se 15 mg do extrato seco em 3 mL de metanol; filtrou-se quando
necessário. Adicionou-se 12 gotas da solução alcoólica de Cloridrato de
Hidroxilamina a 10% e 2 gotas de solução metanólica de KOH a 10%. A mistura foi
aquecida suavemente em banho maria por 2 min. Após esfriamento, a solução foi
acidificada HCl 1N. Adicionou-se ainda uma gota de FeCl 3 a 1%.O aparecimento de
coloração violeta indicou reação positiva.
4.9.11.13 Esteróides e triterpenóides
Dissolveu-se 25 mg do extrato seco em 10 mL de Clorofórmio. Em seguida,
filtrou-se em carvão ativado, o filtrado obtido foi transferido para tubo de ensaio
seco.
Adicionou-se 1 mL de Anidrido Acético, agitou-se suavemente e
acrescentou-se cuidadosamente 3 gotas de H2SO4 concentrado, seguida de
58
agitação. Quando houve rápido desenvolvimento de cores do azul evanescente ao
verde persistente, foi indicação de reação positiva.
4.9.11.14 Carotenóides
Dissolveu-se 5 mg do extrato seco em 3 mL de Clorofórmio. Esta solução foi
filtrada quando necessário, e a este filtrado foi adicionado algumas gotas de Ácido
Trifluroacético. O surgimento de cor azul foi indicativo de reação positiva.
4.9.11.15 Depsídeos e Depsidonas
Dissolveu-se 15 mg do extrato seco em 5 mL de Éter Etílico. Esta solução foi
filtrada quando necessário, e todo o Éter foi evaporado em banho maria, a seguir
foram adicionados a este resíduo, 3 mL de Metanol. Posterior à solubilização, foram
adicionadas três gotas de solução de FeCl 3 a 1%. O aparecimento de cor verde,
azul ou cinza, indicou reação positiva.
4.9.11.16 Derivados da Cumarina
Dissolveu-se 15 mg do extrato seco em 5 mL de Éter Etílico, concentrou-se
em banho maria até 0,5 mL. Em papel filtro, foram aplicadas gotas da solução
etérea, de modo a formar duas manchas de aproximadamente 1 cm de diâmetro
cada. A uma destas, juntou 1 gota de solução de NaOH a 1N. Cobriu-se a metade
da mancha com papel escuro, e a outra metade foi exposta à luz ultravioleta. A
seguir comparou-se; quando ocorreu fluorescência azul na parte exposta da
mancha, isto foi indicativo de reação positiva.
59
4.9.11.17 Antraquinonas
Dissolveu-se 15 mg do extrato seco em 5 mL de Tolueno. Filtrou-se quando
necessário e adicionou-se 2 mL de solução de NH4OH a 10%, agitando-se
suavemente. O surgimento de coloração rósea, vermelha ou violeta na fase aquosa,
indicou reação positiva.
4.10 Análise do EHCi por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
As amostras foram solubilizadas em metanol grau HPLC obtendo-se uma
concentração final de 01 mg/mL, filtrando-se em seguida sobre membrana de
politetrafluoretileno (PTFE) com poros de 0,22 μm de diâmetro. Para esta etapa foi
utilizado um cromatógrafo marca MERCK-ITACHI® (Alemanha), modelo LaChrom
7000 com detector de UV com arranjo de diodos (CLAE-DAD) qualificado, coluna
Lichrosfer RP 18 com 4,5mm de diâmetro, com fluxo de 0,8 mL/min em sistema
gradiente de Água/Acido trifluoroacético 0,5% e Acetonitrila/Ácido Trifluoroacético
0,5% em gradiente, sendo que os cromatogramas foram registrados em 220, 230,
250, 300, 350 e 400 nm, volume de injeção fixo de 20 μL, com tempo de análise de
32 min.
4.11 Obtenção dos Isolados Clínicos Orais
Após autorização do Comitê de Ética (Anexo A), isolados clínicos foram
coletados da cavidade bucal de indivíduos submetidos a tratamento clínico
odontológico na Faculdade de Odontologia da UFPA. A coleta das amostras foi
realizada através de swab estéril passado levemente no palato, mucosa jugal e
60
borda posterior da língua de cada paciente e armazenado em tubo de ensaio
contendo 2 ml de solução fisiológica estéril a 10%.
A seguir, as amostras foram semeadas em placas estéreis contendo ASD
com cloranfenicol a 0,02% e incubadas por 24 a 48 horas em estufa a 35ºC.
Posteriormente, as amostras positivas para Candida foram transferidas para tubos
inclinados estéreis contendo ASD e encaminhadas ao Instituto Evandro Chagas
(IEC), para identificação quanto às espécies.
Todos os pacientes selecionados assinaram o TCLE (Anexo B) e foram
submetidos a questionário e exame clínico oral, realizado por Cirurgiã-Dentista,
com registro em ficha de anamnese odontológica (Anexo C).
4.11.1 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Pacientes de ambos os sexos, na faixa etária entre 18 e 59 anos, que não
possuíam diagnóstico de Diabetes ou doenças imunossupressoras, não usuários de
antibioticoterapia recente e/ou imunossupressora nos últimos dois meses, não
usuários de drogas; não portadores de próteses bucais, sem candidíase
diagnosticada clinicamente, e que assinem o TCLE.
4.11.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Crianças, gestantes, indígenas, pacientes acima de 59 anos, ou que
apresentem quaisquer dos critérios expostos no subitem 5.8.1.
4.12 Atividade antifúngica do (EHCi) frente a isolados clínicos e cepas ATCC
de Candida spp.
61
Os testes de sensibilidade in vitro para fungos são empregados sempre que
se deseja o controle da terapêutica antimicótica e a busca por alternativas, entre
estas, o uso de extratos vegetais com atividade biológica (OLIVEIRA et al, 2006).
4.12.1 PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE (SE) DE EHCi
Para a constituição da solução estoque, 1000 mg do EHCi foram colocados
em frascos estéreis de vidro e dissolvidos em 20 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) a
10%, dentro de câmara de fluxo laminar e posteriormente levados ao Vórtex por
sessenta segundos. As soluções estoques do EHCi ficaram na concentração inicial
de 50 mg/mL e foram armazenadas sob refrigeração a - 20 ºC. Antes de serem
utilizadas, eram retiradas do refrigerador, deixadas em bancada até temperatura
ambiente (28 a 30 °C) para execução dos ensaios microbiológicos.
4.12.2 PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura utilizados foi o caldo Mueller Hinton (MERCK, Alemanha)
e ágar Sabouraud dextrose (HIMEDIA, Índia). Estes meios foram preparados a partir
de uma base desidratada disponível comercialmente e conforme as instruções do
fabricante.
4.12.3 PREPARO DOS INÓCULOS FÚNGICOS
62
Para
o
preparo dos inóculos
foram utilizadas 12
cepas, sendo uma
cepa
de
albicans
40175)
Candida
(ATCC
obtida
a
partir da coleção do
Instituto Nacional de
Controle
de
Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz (INCQS/FIOCRUZ – Rio de Janeiro)
e onze (11) cepas de isolados clínicos de Candida spp, oriundos da cavidade oral de
pacientes atendidos na Faculdade de Odontologia da UFPA. As cepas foram
mantidas em ágar Sabouraud dextrose, à temperatura ambiente, no Laboratório de
Microbiologia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Pará/UFPA
(Figura 12, p.62).
Figura 12 - Condições de armazenamento dos isolados de
Candida sp.
63
Após o período de incubação, 3 a 4 colônias dessas leveduras foram
transferidas para tubo estéril contendo 1 mL de solução salina estéril (9,0 g/L NaCl;
salina a 0,9%). Quando necessário, realizou-se ajustes para o alcance da
concentração desejada de aproximadamente 1x10 6 UFC/mL, correspondente a
escala 0,5 de McFarland (Figura 13, p.62).
Figura 13 - Ajuste do inoculo fúngico à escala 0,5 de McFarland:
A - inoculo sem ajuste; B - tubo 0,5 da escala de McFarland e
C - inoculo ajustado.
Em seguida, realizou-se uma diluição com meio Mueller Hinton, de 1:100,
seguida de 1:20, obtendo um concentração final de aproximadamente 5,0x10 2 a
2,5x103 células por mL (Figura 14, p.63). Posteriormente, o inoculo foi mantido em
estufa a 35 °C por 2 h, a fim de estimular o crescimento exponencial da levedura.
64
Figura 14 - Diluição dos inóculos fúngicos em caldo Mueller Hinton.
4.12.4 TÉCNICA DE MICRODILUIÇÃO EM PLACAS PARA DETERMINAÇÃO DA
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
A atividade antifúngica do EHCi foi determinada pela técnica de microdiluição
em caldo segundo a Norma M27-A2 do CLSI (NCCLS, 2002) com modificações,
conforme Quadros et al (2011). A atividade antifúngica se baseou na determinação
da CIM e CFM, usando placas de poliestireno de 96 poços. A CIM foi considerada a
concentração capaz de inibir pelo menos 50% do crescimento do microrganismo. A
CFM foi definida como a menor concentração do extrato capaz de inibir 99 a 100%
do crescimento fúngico.
Após a preparação do inóculo, foram adicionados 100 µL da suspensão de
cada isolado de Candida spp, aos poços. Posteriormente, adicionou-se nos poços
100 µL das soluções padronizadas de EHCi na concentração inicial de 6,25 mg/mL,
até a concentração de 0,19 mg/mL (Figura 15, p.64).
65
Figura 15 - Esquema de diluições e concentrações finais de EHCi.
Em seguida, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24 horas, e após esse
tempo, 20 μL de 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium (MTT)
foram acrescentados aos poços, para identificação da CIM. Para a obtenção da
Concentração Fungicida Mínima (CFM), 10 µL das amostras foram semeados em
ágar Sabouraud dextrose e incubados por mais 24 horas a 37 ºC para posterior
leitura das Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Todos os ensaios foram
realizados em duplicata. Para o controle positivo, foi utilizado o antifúngico
comercial Nistatina (50.000 UI/mL) e como controle negativo, foi utilizada a solução
de DMSO com concentração inicial de 2,5% (Figura 16, p.64).
Figura 16-Disposição de EHCi em triplicata nas concentrações de 6,25 mg/mL(linha
A);3,12 mg/mL (linha B), 1,56 mg/mL (linha C); 0,78 mg/mL; 0,39 mg/mL (linha D); 0,19
mg/mL (linha E); Cc: 200 μL de inoculo: controle de crescimento; C+: Nistatina a
50.000 UI/mL e C-: DMSO a 2,5%.
4.12.5 Detecção da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
66
A CIM50 foi estipulada a partir da menor concentração do EHCi capaz de
impedir o crescimento de pelo menos 50% do microrganismos avaliado (efeito
fungistático). Esse efeito foi observado pela técnica da contagem das UFCs em
placas de petri, e por microdiluição em caldo com coloração por MTT (Figura 17,
p.65), como descrito na Norma M27-A2 do CLSI (NCCLS, 2002) e por Quadros et
al (2011).
Figura 17 - Microdiluição da ATCC 40175 de Candida albicans após uso de MTT.
4.12.6 Contagem da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A CFM é a menor concentração de um agente microbiano capaz de matar 99
a 100% dos microrganismos testados (efeito fungicida). A CFM foi obtida a partir da
técnica de contagem das UFC, sendo considerada a menor concentração do extrato
que resultou em nenhum crescimento ou no crescimento de no máximo três
colônias placas (99,9% de morte), conforme descrito por Quadros et al (2011).
4.13 Análise estatística
67
Análise descritiva comparativa utilizando os softwares Excel - MICROSOFT e
BioStatic 5.0.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
68
5.1 Coleta e preparo da exsicata para identificação botânica
A identificação botânica correta da matéria-prima vegetal é imprescindível em
qualquer pesquisa com plantas medicinais. Consiste na comparação da espécie
vegetal em questão com uma espécie existente em uma coleção e/ou com
descrições e ilustrações encontradas na literatura.
No presente estudo optou-se em coletar a espécime vegetal no seu habitat
natural, evitando possíveis erros de identificação e maior controle das variáveis que
podem interferir na qualidade final da droga vegetal.
A exsicata, contendo caule, folhas, flores e frutos foi preparada obedecendo
ao estabelecido no Manual do LAFQ da UFPA (BARBOSA et al, 2001) e enviada,
juntamente com informações adicionais (local da coleta, data e hora da coleta, nome
do coletor), ao Herbário da EMBRAPA. O material botânico enviado foi comparado
com exsicatas depositadas no herbário da EMBRAPA e identificado como
Chrysobalanus icaco Lin, pela pesquisadora Silvane Tavares Rodrigues, com tombo
de número NID: 40/2011(Anexo D).
5.2 Preparo do material vegetal
As folhas do C. icaco, após desinfecção, foram submetidas à secagem em
temperatura ambiente por 5 dias e posteriormente em estufa sob temperatura
adequada, por 2 dias. Este procedimento foi realizado com monitoramento diário e
teve como finalidade a retirada de água, impedindo reações de hidrólise e de
crescimento microbiano, promovendo a redução de volume e peso do material
vegetal usado, assim como facilitou a moagem, etapa subseqüente à secagem.
A moagem foi realizada em moinho de facas apropriado para o material
vegetal em questão (SONAGLIO et al, 2003).
5.3 Processamento da amostra
69
Partindo de um total de dois quilogramas e trezentos gramas (2.300 g) de
folhas frescas de C. icaco, após lavagem, secagem e trituração, foi obtido um
quilograma e cento e sessenta gramas (1.160 g) de pó, representando um
rendimento de 50,43% deste pó em relação à planta fresca.
5.4 Preparo do extrato hidroalcoólico
Partindo-se de um macerado em álcool 70 ºGL constituído de duzentos
gramas (200 g) do pó das folhas do C. icaco, concentrado em evaporador rotativo a
baixa pressão, com posterior secagem em estufa, resultou em 32,49 g de extrato
bruto. Um rendimento de 16,24% em relação à droga vegetal seca (pó) e 8,19% em
relação à planta fresca.
5.5 Caracterização farmacognóstica
5.5.1 DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA DO PÓ
A pulverização da matéria prima vegetal representa na maioria das vezes o
insumo indispensável para obtenção de preparações intermediárias e o rendimento
do processo extrativo quanto aos constituintes químicos de interesse na droga; está
diretamente relacionada ao grau de pulverização da mesma (SILVA JÚNIOR,
2006).
A determinação granulométrica mostra-se ainda como um importante método
para a determinação do tamanho de partículas, onde o mesmo é definido
aproximadamente ao tamanho do orifício do tamis em que ficou retida a maior parte
do material, servindo de parâmetro imprescindível para a caracterização e controle
de qualidade do pó vegetal (FOUST, 2000; LACHMAN et al, 2001).
Segundo a Farmacopéia Brasileira (2010), o pó obtido das folhas do C. icaco
foi classificado como pó moderadamente grosso, pois após análise em triplicata do
70
percentual médio retido em cada tamis, observou-se que o pó passou quase que
em sua totalidade pelo tamis de abertura nominal de 710 µm (mesh), e menos de
40% pelo tamis de 250 µm (60 mesh), conforme ilustrado na Figura 18.
Figura 18 – Análise granulométrica do pó das folhas de Chrysobalanus icaco.
5.5.2 DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE
5.5.2.1 Densidade Aparente
A densidade aparente do pó das folhas de C. icaco, com média e desvio
padrão, foi de 0,4573 g/mL ± 0,1074 g/mL. A densidade aparente é importante no
processo de manipulação correta de fitoterápicos e constitui-se numa exigência
estabelecida pela RDC nº 48 (ANVISA, 2004).
5.5.2.2 Densidade de massa e densidade relativa pelo método de picnometria
71
A densidade é uma propriedade física importante e pode ser utilizada para
distinguir um material puro de um impuro (ou de ligas desse metal), pois a
densidade dos materiais que não são puros (misturas) é uma função da sua
composição, podendo ser utilizada na identificação e no controle de qualidade de
um determinado produto industrial, bem como ser relacionada com a concentração
de soluções (HAWKES, 2004).
Os valores para densidade de massa e densidade relativa de C. icaco,
obtidas através do método do picnômetro, estão descritas na Tabela 1 (p.70).
Tabela 1 - Média e desvio padrão da densidade de massa e da densidade relativa
do decocto expressos em (g/mL) grama por mililitro, do pó das folhas do
Chrysobalanus icaco L.
Parte da espécie
Densi Densidade de massa
Densidade relativa
Média
Desvio padrão
1,01068 g/mL
± 0,00052 g/mL
1,01305 g/mL
± 0,00004 g/mL
5.5.3 DETERMINAÇÃO DE PERDA POR DESSECAÇÃO
Este teste estabelece parâmetro para a conservação do extrato e controle
microbiológico do mesmo; o excesso de água pode ocasionar hidrólise dos
constituintes da espécie vegetal e/ou favorecer o crescimento de enzimas, fungos e
bactérias (OLIVEIRA, 1991; SHARAPIN, 2000; SIMÕES et al, 2007).
5.5.3.1 Perda por dessecação através de gravimetria
A média da perda de água por dessecação no pó das folhas do C. icaco foi
12,3%, com desvio padrão de ± 0,029, como a referida espécie ainda não
72
apresenta monografia publicada, utilizou-se como parâmetro aceitável aquele que
está de acordo com a especificação da Farmacopéia Brasileira (1988), onde este
resultado pode variar de 8 a 14%. Com base nos resultados obtidos, constata-se
que é possível manter a qualidade da droga vegetal, desde que armazenada
adequadamente,
evitando
com
isso
contaminação
e
decomposição
dos
constituintes químicos.
Aguiar (2010) ao determinar a perda por dessecação de folhas de C. icaco
obteve valores médios de 10,46% ± 0,27. Esta variabilidade pode ter ocorrido em
virtude do tempo e local distintos da coleta da espécie, da forma de
armazenamento da espécie, que foram diferentes nos estudos em questão.
5.5.3.2 Perda por dessecação através de Balança de Infravermelho (Infratest)
Este tipo de análise é essencial uma vez que pode oferecer informações
importantes com referência ao armazenamento da droga vegetal. A água residual
encontrada na droga vegetal seca está diretamente relacionada com o seu correto
armazenamento, que pode acarretar na perda do material por contaminação
microbiana ou degradação por ação enzimática dos constituintes químicos
(SIMÕES et al, 2007).
A média e o desvio padrão das três determinações da perda por dessecação
do pó das folhas do C. icaco obtidas através do Infratest, durante 1 minuto podem
ser visualizadas na tabela 2 (p. 72).
Tabela 2 - Média e desvio padrão da perda por dessecação do pó das folhas de C.
icaco obtida após um minuto, em porcentagem (%), usando balança de
infravermelho (Infratest).
Parte da espécie
Média (%)
Desvio padrão
Folha de C. icaco
1,33
± 0,321
73
O limite máximo de umidade para drogas vegetais é de 14% (SIMÕES et al,
2007) por isso constatou-se que o pó das folhas do C. icaco analisado apresentou
resultado satisfatório, pois em um minuto apresentou média de perda de
dessecação de 1,3% e após estabilização do processo de perda de água,
apresentou média de 12,3%.
5.5.4 DETERMINAÇÃO DO pH DO EXTRATO
Nas plantas são encontradas várias substâncias de caráter ácido,
principalmente orgânicos, pertencentes a diversos grupos: aromáticos, terpenóides,
heterocíclicos, que podem ser encontrados na forma de sais, ésteres, lactonas; nos
lipídeos, na forma de essências e resinas (COUTO, 2005).
Uma parte destes ácidos encontra-se também no estado livre, solubilizados
no citoplasma, portanto, podem ser identificados e caracterizar determinado extrato
vegetal, como de caráter ácido e básico, auxiliando nos parâmetros físico-químicos
da droga vegetal (FRANCO e LANDGRAF,1996).
A medida de pH influencia no desenvolvimento de microorganismos, na
atividade enzimática, na maturação de vegetais, no emprego da temperatura em
tratamentos térmicos, no uso de conservantes químicos, no controle de processos
de lavagem, na escolha da embalagem na qual será acondicionado o produto, entre
outros (CHAVES, 1993; CECCHI, 2003).
O valor obtido pela média de três determinações para o pH do extrato aquoso
a 1% de C. icaco foi 5,8 ± 0,001, um pouco superior ao encontrado por Aguiar (2010)
que obteve valor de 5,18 ± 0,001 para a decocção das folhas de C. icaco. Esta
variação pode ser em virtude dos diferentes locais de coleta, clima distinto e até ao
próprio grau de maturação da espécie (COUTO, 2005).
Contudo, apesar da diferença de pH obtidos nos dois estudos, observa-se
segundo Franco e Landgraf (1996) que ambos são considerados de baixa acidez,
pois apresentam pH superior a 4,5.
5.5.5 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS TOTAIS
74
A determinação de cinzas totais visa determinar a quantidade de substâncias
residuais não voláteis, isentas de carbono, entre estas, as derivadas de tecido
vegetal (cinzas fisiológicas) e as de material estranho (cinzas não fisiológicas),
entre estes, areia e terra (LEITE et al, 2009). O valor obtido para o teor de cinzas
totais, a partir da média das três determinações do pó das folhas de C. icaco foi de
4,31% ± 0,0001. O percentual obtido corresponde aos constituintes minerais e
organometálicos da planta ou de substâncias de origem terrosa (SIMÕES et al,
2007; VIGO et al, 2004).
Quando o teor de cinzas totais é muito alto, há indícios de contaminação por
areia e terra, proveniente de tratamento inadequado na colheita, higienização e
processamento do material vegetal, logo o mesmo, constitui-se, dentro de certos
limites, em um parâmetro de identificação e pureza, contudo há necessidade de
estabelecer a variação aceitável para o mesmo (NAVARRO et al, 2008; LEITE et al
2009).
Não foi encontrada monografia da planta para a preconização de valor
aceitável e tomando como base o limite geral determinado pela Farmacopéia
Brasileira (2000) que é de 14%, observa-se que o valor de cinzas totais obtidos
para o pó das folhas de C. icaco está compatível com a legislação estabelecida
(NAVARRO et al, 2008).
Aguiar (2010), ao analisar as folhas de C. icaco encontrou valor de 4,61% ±
0,13 para teor de cinzas totais; semelhante ao encontrado no presente estudo.
Estes
resultados
sugerem
que
houve
correta
colheita,
higienização
e
processamento do material vegetal usado nos referidos estudos.
5.5.6 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS INSOLÚVEIS EM ÁCIDO
As cinzas insolúveis em ácido constituem o resíduo remanescente após
fervura de cinzas totais ou sulfatadas com ácido clorídrico diluído após filtragem;
75
lavagem e incineração. O método destina-se à determinação de sílica e constituintes
silícicos da droga (FARMACOPÉIA, 2000).
A média e desvio padrão da porcentagem de cinzas insolúveis em ácido para
o EHCi, em relação à droga seca ao ar, foi 1,67% ± 0,0012. Este resultado
encontra-se dentro do máximo permitido, que é 3%, estipulado pela Farmacopéia
(2000) e sugere que as amostras não foram contaminadas por material estranho.
Não há monografia da planta, nem foi encontrado nenhum trabalho para
comparações. Portanto, este valor obtido para cinzas insolúveis, além de ser o
primeiro, constitui-se em um parâmetro para o controle de qualidade da referida
droga vegetal.
5.5.7 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE EXTRATIVOS
A determinação do teor de extrativos é um método quantitativo usado para
determinar constituintes extraíveis da droga vegetal, que pode ser considerado como
uma característica própria, assim como pode auxiliar na avaliação da qualidade
dessa droga vegetal. O teor de extrativos de C. icaco usando ácido clorídrico foi
realizado em triplicata, com média e desvio padrão dispostos na Tabela 3 (p.74).
Tabela 3 - Média e desvio padrão expressos em grama (g) para o teor de extrativos
do pó das folhas do Chrysobalanus icaco L.
Parte da espécie
Folhas de C. icaco
Média
1,3 g
5.5.8 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ESPUMA
Desvio padrão
± 0,001 g
76
Conforme a classificação existente na Farmacopéia Brasileira (2010), se em
qualquer um dos tubos, a altura da espuma medida for um centímetro, a diluição do
material vegetal nesse tubo (A) é o índice observado. Como no presente estudo, o
tubo de número nove apresentou um centímetro de altura de espuma, o índice de
espuma encontrado foi de 111,11 cm ± 0,0013. Não foi encontrado nenhum registro
para o índice de espuma das folhas de C. icaco para comparar com o resultado
obtido neste estudo, portanto o mesmo se constitui no primeiro valor relatado para
índice de espuma desta espécie.
Observa-se ainda, que o índice de espuma não varia com a sazonalidade,
logo se isto puder ser estendido a todas as espécies vegetais, este pode se
constituir em um parâmetro usado na determinação de qualidade da droga vegetal
(CHICOUREL et al, 1997/1998; BORELLA et al, 2006).
5.5.9 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE RESÍDUO SECO
A média encontrada de resíduo seco do extrato de C. icaco após o
procedimento foi de 0,4863 g, com desvio padrão de ± 0,0023 g, o que corresponde
em porcentagem de massa a uma média de 97% de extrato residual. Este resultado
indica que o extrato em estudo pode ser considerado extrato seco, visto que
apresentou teor de resíduo seco acima de 95%, mínimo estabelecido pela
Farmacopéia Brasileira (2010).
5.6 Abordagem Fitoquímica
77
Essa análise teve como objetivo o conhecimento de grupos químicos, tais
quais: cumarinas, heterosídeos, fenólicos simples, saponinas, taninos, alcalóides,
flavonóides, antocianidinas (BARBOSA et al, 2001). No presente estudo, a
abordagem fitoquímica apresentou os resultados dispostos abaixo (Quadro 1, p.76).
Reagentes
Classe
de
detectadas
substâncias
Folhas
(*)
+
Saponinas
+
Reativo de Pascová
Ácidos Orgânicos
+
Reativo de Fehling
Açúcares Redutores
IND
Lugol
Polissacarídeos
+
Nihidrina
Proteínas e Aminoácidos
+
Cloreto Férrico
Fenóis e Taninos
+
HCL concentrado e raspas Flavonóides
de Magnésio
Bouchardat
Alcalóides
Dragendorf
Alcalóides
Mayer
Alcalóides
+
NH4OH 6N
Purinas
Nitroprussiato de Sódio e
Glicosídeos Cardíacos
NaOH 2N
+
Vanilina e HCL
Catequinas
concentrado
+
Na2CO3 a 25%,
Sesquiterpenolactonas
Formaldeído a 4% e
O-dinitrobenzeno a 5%
+
Anidrido Acético e Ácido
Esteróides e Triterpenóides
Sulfúrico Concentrado
+
Ácido Trifluoroacético
Carotenóides
+
Cloreto férrico a 1%
Depsídios e Depsidonas
NaOH 1N
Derivados da Cumarina
NH4OH a 10%
Antraquinonas
Quadro 1 - Resultados das reações indicativas da presença (+) ou ausência (-) de
constituintes químicos de Chrysobalanus icaco L.
Legenda: (*): Método espumídico; IND: indeterminado.
No presente estudo, o extrato das folhas do C. icaco apresentou resultado
positivo para saponinas espumídicas. Estas substâncias são constituintes químicos
que possuem propriedade de redução da tensão superficial da água, o que lhes
conferem ação detergente e emulsificante (CORNÉLIO et al, 2003).
As saponinas são metabólitos vegetais, glicosídeos esteróides ou terpenos
policíclicos, que na sua forma estrutural possuem uma parte lipofílica (triterpeno ou
esteróide) e outra hidrofílica (açúcares), esta característica determina suas
78
propriedades já citadas; às saponinas, também tem sido relatada atividade
antifúngica (BORELLA et al, 2006).
Nos testes fitoquímicos realizados, o extrato das folhas do C. icaco,
apresentou testes positivos para flavonóides, fenóis e taninos. O amplo espectro de
ação antimicrobiana de espécies vegetais já foi associado à maior quantidade de
polifenóis e flavonóides totais encontrados nas mesmas (REIS, 2006; GUEDES
et al, 2009).
Os flavonóides são compostos bioativos que podem atuar como antioxidantes
moduladores da atividade enzimática, reguladores de respostas inflamatórias e
imune do organismo humano, entre outros; e estar associados com a redução do
risco de câncer e doenças cardiovasculares (AGUIAR, 2010). Os resultados
encontrados através da abordagem fitoquímica realizada no presente estudo
confirmam a presença de flavonóides no EHCi. Em outros estudos já houve a
identificação desta classe de substâncias, inclusive com a possibilidade de que a
Miricetina, um dos flavonóides encontrados, possa funcionar como marcador
taxonômico (MENDEZ et al, 1995; FERNANDES et al, 2003; BARBOSA et al, 2006).
A abordagem fitoquímica realizada para o extrato hidroalcoólico de C. icaco
indicou também a presença de proteínas e aminoácidos, purinas, depsídeos e
depsidonas, catequinas, esteróides e triterpenóides. Estes resultados corroboram
com o isolamento de diterpenos e triterpenos, assim como, com a assertiva de que
o metabolismo especial da família Chrysobalanaceae caracteriza-se pela presença
de diterpenóides, triterpenóides, esteróides, flavonóides e taninos (FERNANDES
et al, 2003; CASTILHO et al, 2005).
A análise das substâncias químicas presentes no extrato das folhas de
C. icaco sugere ausência de alcalóides, antraquinonas, glicosídeos cardíacos,
polissacarídeos. Contudo, a mesma não possui caráter autolimitante, há
necessidade de testes mais específicos para determinação e até mesmo,
isolamento de substâncias presentes no EHCi. Esta afirmativa apoiá-se no fato de
que o teor de constituintes vegetais é determinado por vários fatores, dentre estes,
a época da coleta, o clima, o tipo de extrato obtido, a constituição do solo e a idade
da planta (COUTO, 2005).
5.7 Análise do EHCi por CLAE
79
Após a interpretação dos cromatogramas obtidos por CLAE, observaram-se
espectros de UV com máxima de absorção entre 253 e 355 nm, constatando o
predomínio de flavonóides na composição do extrato hidroalcoólico de C. icaco
(Figura 19). A identificação de flavonóides foi realizada através da comparação de
tempos de retenção de padrões analíticos.
Figura 19: Espectro de UV do pico 01, mostrando os máximos de absorção
característicos de flavonóides (253 e 355 nm).
Observou-se ainda, no cromatograma abaixo (Figura 20) um pico predominante,
com absorbância de 1300 mAU e tempo de retenção de 12 minutos que corresponde à
Miricetina, já detectada em estudos anteriores, onde foi sugerido que a presença desta
substância poderia ser usada como marcador fitoquímico (MENDEZ et al, 1995;
FERNANDES et al, 2003; BARBOSA et al, 2006).
Padrão
2000
DAD-353 nm
006C.icaco.met
11-5-2016 17-23-27.dat
2000
Área
tempo de retenção
Nº Pk
mA
U
1500
1500
1000
1000
mA
U
80
Figura 20: Cromatograma do EHCi, mostrando pico de Miricetina (pico 01).
5.8 Distribuição e identificação das leveduras
Em virtude das espécies de Candida serem microrganismos comensais da
cavidade bucal, e à variabilidade clínica das candidíases, não se trabalhou com
indivíduos sintomáticos, pois para padronização do grupo em estudo, seria
necessário um tempo maior e exames complementares para confirmar o diagnóstico
clínico do tipo de candídiase.
De um universo de 50 pacientes entrevistados, 29 (58%) encontravam-se
dentro dos critérios de inclusão do presente estudo. Dentre os 29 pacientes
selecionados, apenas 20 (68,96%) apresentaram culturas positivas para leveduras,
grupo este, constituído por mulheres com idade variando entre 32 e 51 anos.
Após bacterioscopia com coloração de GRAM, apenas em 12 (41,37%), foi
confirmada a presença de leveduras; destas, uma cepa foi descartada após teste de
viabilidade, perfazendo um total de onze cepas enviadas para identificação.
As cepas usadas no presente estudo, após teste de viabilidade, foram
nomeadas em C1 a C11, para os isolados orais de Candida spp. Os isolados orais
foram identificados pelo IEC através do sistema VITEK II.
81
Em relação ao sistema VITEK II (bioMérieux) usado na identificação das
espécies de Candida, não há dúvidas de que é um método seguro mesmo quando
comparado aos testes moleculares, com resultados disponíveis ao fim de
aproximadamente 18 horas (PEREIRA, 2010). Consiste em um método automático
que executa testes de identificação e susceptibilidade usando cartas de leveduras
YST®, baseadas em métodos bioquímicos conhecidos; as cartas possuem 46 testes
bioquímicos que medem a utilização de fonte de carbono, da fonte de azoto e a
atividade enzimática (PEREIRA, 2010).
Habitualmente, tanto em indivíduos sadios ou não, Candida albicans tem sido
a mais isolada (KRCMERY e BARNES, 2002; MANO et al, 2004). Entretanto, no
presente estudo, 63,64% dos isolados foram identificados como Candida não
albicans e 36,36% como Candida albicans (Quadro 2, p.80). A mudança de perfil
epidemiológico das Candídiases, onde espécies não albicans têm prevalecido, já foi
relatada em outros estudos, tendo sido associada com o aumento de procedimentos
médicos invasivos, bem como a profilaxia e uso empírico de antifúngicos, como os
azóis (COLOMBO et al, 2002; GOLDANI e MARIO, 2003; ANTUNES et al, 2004;
DURÁN et al, 2005).
Isolado Oral
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
Quadro 2 - Classificação das
isolados orais.
Espécie
Candida tropicalis
Candida parapsilosis
Candida albicans
Candida parapsilosis
Candida albicans
Candida albicans
Candida albicans
Candida parapsilosis
Candida parapsilosis
Candida parapsilosis
Candida dubliniensis
espécies após identificação, segundo ordem de coleta dos
82
5.9 Atividade antifúngica do EHCi
Para a determinação da CIM de EHCi foi usada a técnica de microdiluição em
caldo segundo a norma M27-A2 (NCCLS, 2002), com modificações (QUADROS
et al, 2011). Atualmente, este ensaio quantitativo tem sido usado com mais
frequência, visando à padronização dos ensaios microbiológicos para fins de
comparação posterior (OSTROSKY et al, 2008). Citam-se como vantagens da
microdiluição, a possibilidade de usar tanto amostras hidrossolúveis como
lipossolúveis, ser quantitativa, usar menor quantidade de extrato, além, de
apresentar maior sensibilidade comparada a outros métodos (TRABULSI, 1999;
OSTROSKY et al, 2008).
O
emprego
em
conjunto
da
solução
do
sal
de
tetrazólio
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide (MTT) auxilia na melhor
visualização da atividade fúngica, visto que, ao reduzir o sal de tetrazólio a cristais
de MTT – formazan, através da ação mitocondrial da succinil desidrogenase, ocorre
alteração de cor, de amarela para azul (MOISMANN, 1983). Contudo, no presente
estudo o uso do MTT para análise visual, não apresentou resultados conclusivos, o
que pode ser atribuído à coloração e composição do EHCi, por conseguinte, foi
usada a leitura das unidades formadoras de colônias, para determinação da CIM e
CFM. Este método tem sido empregado em outros estudos, onde a CIM e CFM não
pode ser avaliada pela análise visual com MTT.
A dificuldade na interpretação visual da microdiluição tem sido atribuída à
deposição de compostos nos poços e à alta prevalência de clorofila, em alguns
extratos vegetais (ELOFF, 1998). No presente estudo, a deposição de compostos foi
contornada através da homogeneização de cada poço pela pipetagem prévia à
leitura dos resultados; já a desclorofilação sugerida em outros trabalhos, não foi
realizada no presente estudo, ficando como prerrogativa para os trabalhos
subseqüentes que visem à atividade antimicrobiana de Chrysobalanus icaco.
A identificação da espécie com os valores de CIM e CFM dos onze isolados
orais e da ATCC 40175, encontram-se especificadas na Tabela 4 (p.82).
83
Tabela 4 - Valores de CIM e CFM expressos em mg/mL para isolados
orais e ATCC 40175.
Cepa
Espécie
CIM
CFM
C1
C. tropicalis
> 6,25
ND
C2
C. parapsilosis
3,12
6,25
C3
C. albicans
6,25
> 6,25
C4
C. parapsilosis
> 6,25
ND
C5
C. albicans
> 6,25
ND
C6
C. albicans
> 6,25
ND
C7
C. albicans
3,12
> 6,25
C8
C. parapsilosis
> 6,25
ND
C9
C. parapsilosis
> 6,25
ND
C10
C. parapsilosis
6,25
> 6,25
C11
C. dubliniensis
6,25
> 6,25
C12
C. albicans
< 1,56
1,56
(ATCC 40175)
CIM - concentração inibitória mínima; CFM- concentração fungicida mínima; ND- não
determinado.
O EHCi apresentou CIM maior que 6,25 mg/mL frente à Candida tropicalis
(Figura 21, p. 82). A CFM frente a esta mesma espécie não foi determinada, sendo
maior que 6,25 mg/mL.
A
B
6,25 mg/mL
C
C-
C+
Figura 21: Padrão de crescimento de Candida tropicalis (C1) frente ao EHCi a 6,25 mg/mL (A),
ao Controle Negativo (B) e ao Controle positivo (C).
84
Nos ensaios microbiológicos de EHCi frente à Candida parapsilosis, a CIM foi
de 3,12 mg/mL (Figura 22, p.83) em 20% das amostras clínicas (C2), igual a 6,25
mg/mL (C10) em 20% (Figura 23, p.83) e maior que 6,25 mg/mL (C4, C8 e C9) em
60% dos isolados (Figura 24, p.84). A CFM não foi determinada para a maioria dos
isolados de C. parapsilosis; sendo igual a 6,25 mg/mL em C2.
A
B
6,25 mg/mL
C
3,12 mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 22: Padrão de crescimento de C. parapsilosis (C2): CIM igual a 3,12 mg/mL(B) e CFM
igual a 6,25 mg/mL (A).
A
B
C
6,25 mg/mL
3,12 mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 23: Crescimento de C. parapsilosis (C10): CIM igual a 6,25 mg/mL (A).
B
A
6,25 mg/mL
C
3,12 mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 24: Padrão de crescimento de C. parapsilosis (C4): CIM > que 6,25 mg/mL.
85
Quando testado frente à Candida dubliniensis (C11), o EHCi apresentou CIM
igual a 6,25 mg/mL e CFM maior que 6,25 mg/mL, quando comparados ao controle
positivo e negativo (Figuras 25a e 25b, p.84).
B
A
6,25 mg/mL
C
3,12 mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 25a - Crescimento de C11 (C. dubliniensis), em três diferentes concentrações
expressas em mg/mL.
A
B
C-
C+
Figura 25b – A: Controle Negativo - DMSO a 2,5%; B: Controle positivo - Nistatina 50.000
UI/mL para Candida dubliniensis.
Em isolados orais de Candida albicans, a CIM foi maior que 6,25 mg/mL (C5 e
C6), igual a 6,25 mg/mL (C3) e igual 3,12 mg/mL (C7). Essa variação pode ser
observada nas figuras 26, 27 e 28, respectivamente (p.85). A CFM não foi
identificada, sendo maior que 6,25 mg/mL para todas as cepas clínicas de Candida
albicans.
A
B
C
86
A
B
C
3,12 mg/mL
6,25mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 26 - Candida albicans (C5) frente ao EHCi com CIM > 6,25 mg/mL.
A
B
C
3,12 mg/mL
6,25 mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 27 - Candida albicans (C3) frente ao EHCi com CIM igual a 6,25 mg/mL e CFM > 6,25
mg/mL.
A
B
6,25 mg/mL
C
3,12 mg/mL
1,56 mg/mL
Figura 28 - Candida albicans (C7) frente ao
EHCi com CIM igual a 3,12 mg/mL e CFM > 6,25
mmmg
mg/mL.
3,12 mg/mL
mg/mL
Para a ATCC 40175 de Candida albicans obteve-se CIM menor que
1,56 mg/mL e CFM igual a 1,56 mg/mL em comparação aos seus controles positivo
e negativo (Figura 29, p.86). A análise destes resultados evidencia que a CIM da
cepa ATCC foi menor, quando comparada aos isolados clínicos de Candida
albicans; o que coaduna com evidências de que as cepas ATCC exibem menor
variabilidade genética, portanto, geralmente são mais sensíveis (LACAZ et al, 2002)
87
A
B
6,25mg/mL
C
3,12mg/mL
#
1,56mg/mL
#3
C-_
+
C-
C+
_+
Figura 29 - Candida albicans (ATCC 40175) nas concentrações de 6,25 mg/mL(A),
3,12 mg/mL (B) e 1,56 mg/mL (C); (C-): DMSO a 2,5% (D) e (C+): Nistatina
a 50.000 UI/mL (E).
A atividade antifúngica de C. icaco frente à Candida albicans já havia sido
relatada em estudos usando o extrato hexânico das folhas desta espécie vegetal e
de Eugenia randiflora, outra espécie da família Chrysobalanaceae (CASTILHO et al,
2000). Entretanto, não foram citados valores de CIM e CFM, nem o método
empregado e parâmetros usados na análise antifúngica (CASTILHO et al, 2000).
Em ensaios posteriores, os extratos metanólico, hexânico e frações a
50 mg/mL de C. icaco não foram ativos frente à Candida albicans, quando aferidos
através do método de disco difusão (CASTILHO e KAPLAN, 2011).
A falta de padronização de testes de suscetibilidade antimicrobiana tem sido
um dos entraves encontrados para a realização e comparação desse tipo de estudo
(HOOD et al, 2003).
Não existe um consenso em relação ao nível de inibição aceitável para
produtos naturais quando comparados aos antibióticos padrões, tanto que alguns
autores consideram somente resultados similares aos antibióticos, enquanto outros
88
consideram com bom potencial mesmo aqueles com níveis de inibição superiores
(DUARTE et al, 2005)
No presente estudo, a atividade antifúngica foi classificada em forte quando
CIM até 0,5 mg/mL, moderada (entre 0,5 mg/mL e 1,5 mg/mL) e fraca quando maior
do que 1,5 mg/mL (ALIGIANNIS et al, 2001; SARTORATTO et al, 2004). Logo, o
EHCi apresentou fraca atividade em todas as espécies de Candida usadas nos
ensaios microbiológicos, com exceção para a ATCC 40175, onde o mesmo foi
moderadamente ativo.
A ação fungistática de EHCi determinada nestes ensaios não implica que o
mesmo não possua substâncias em sua composição que apresentem ação
fungicida; portanto há necessidade de que se investigue a atividade antifúngica de
partições ou substâncias isoladas de EHCi, entre estas, flavonóides, taninos e
saponinas, que apresentam grande potencial antimicrobiano (REIS, 2006; GUEDES
et al, 2009).
A necessidade de novos ensaios que determinem a CIM e CFM de
substâncias isoladas desta droga vegetal, assim como, outros ensaios que avaliem o
EHCi em maiores concentrações paralelos a ensaios toxicológicos e investigações
sobre o seu mecanismo de ação são imprescindíveis na viabilidade de uso seguro
de Chrysobalanus icaco na terapêutica antifúngica, visto que a maioria dos
antifúngicos convencionais possuem ação fungistática e têm sido usados no
tratamento de infecções fúngicas.
89
7 CONCLUSÕES

Com base em dados, Farmacopéicos e não Farmacopéicos constata-se que as
análises qualitativas e quantitativas de autenticidade e pureza do pó das folhas
de C. icaco, estão em acordo com os parâmetros de qualidade estabelecidos
para drogas vegetais;

A droga vegetal apresenta teor de perda por dessecação dentro dos parâmetros
estabelecidos pela Farmacopéia Brasileira, indicando que os procedimentos de
colheita e pós-colheita são adequados e garantem boa conservação e secagem
eficiente da matéria-prima vegetal;

Os resultados obtidos na abordagem fitoquímica confirmam o grande potencial
terapêutico do EHCi;

O
extrato
hidroalcoólico
de
Chrysobalanus icaco
apresentou
atividade
antifúngica moderada frente à cepa ATCC de C. albicans e fraca atividade
antifúngica nos isolados clínicos orais de C. albicans, C. dubliniensis,
C. tropicalis e C. parapsilosis.

Chrysobalanus icaco pode ser usado na terapêutica antifúngica frente à Candida
spp, desde que ensaios toxicológicos determinem o seu emprego seguro;

Os resultados da atividade antifúngica EHCi frente à Candida spp, usando a
microdiluição em caldo, são pioneiros e abrem perspectivas para novos estudos
que investiguem a ação biológica de substâncias isoladas a partir do mesmo.
90
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104
ANEXOS
105
ANEXO A
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA DO ICS DA UFPA
106
ANEXO B
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Título: Caracterização Farmacognóstica e Avaliação Antifúngica do Extrato
Hidroalcoólico de Chrysobalanus Icaco Lin em espécies de Candida.
Pesquisadoras:
Ana Regina Maués Noronha Peres
Marcieni Ataíde de Andrade
Marta Chagas Monteiro
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de
Farmácia da UFPA
Introdução
Você receberá informações sobre a presente pesquisa para que possa decidir
em participar ou não da mesma, por isso leia atentamente e não deixe de esclarecer
qualquer dúvida aos pesquisadores responsáveis pelo estudo.
Propósito
Ao decidir pela participação neste estudo, você estará contribuindo na coleta de
uma pequena amostra de sua saliva para que sejam realizados experimentos que
avaliem a atividade de algumas plantas medicinais, o que pode favorecer o
desenvolvimento de novos medicamentos no combate a alguns fungos, como a
Candida.
107
ANEXO B
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Descrição
Serão incluídos no presente estudo indivíduos que possuam de 18 a 59 anos,
ambos os sexos, não sejam usuários de próteses bucais (dentaduras), nem tenham
utilizado terapia prolongada com antibióticos e/ou imunossupressores, por isso é
importante que os participantes informem todos os medicamentos dos quais faz uso.
Os indivíduos participantes também serão submetidos ao exame clínico intrabucal,
realizado por uma cirurgiã-dentista, para assegurar que os mesmos não possuam
diagnóstico clínico de candídíase oral.
Custo e pagamento
Não haverá nenhum custo adicional para o voluntário, nem pagamento pela sua
participação. Todo o material necessário para o desenvolvimento desta pesquisa será
de responsabilidade dos pesquisadores.
Sigilo
Ao indivíduo participante deste estudo é garantida a manutenção de sigilo sobre
os seus dados cadastrais e sua identidade no ato de publicação verbal ou escrita deste
trabalho, assegurada pelos pesquisadores responsáveis pela execução do mesmo.
Direito de se retirar da pesquisa
O voluntário pode recusar-se ou desistir de participar em qualquer momento,
desde que antes da publicação dos resultados da pesquisa, não sendo passível de
nenhuma punição e/ou prejuízo.
108
ANEXO B
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Desconforto, riscos e benefícios
As amostras de saliva serão coletadas através de swabs orais que não
causarão nenhum desconforto ou risco para o participante. Em se tratando de
benefícios, a sua participação pode colaborar na compreensão da atividade de
algumas plantas medicinais frente a infecções bucais causadas por fungos que
afetam grande parte da população mundial.
Linguagem acessível e esclarecimentos
Todo participante deverá estar em condições de autonomia plena e boa
saúde geral. Os esclarecimentos e informações fornecidos ao voluntário sobre a
forma como o trabalho será realizado e seus objetivos serão feitos em uma
linguagem clara e acessível.
Consentimento voluntário
O voluntário deve certificar-se de que leu e entendeu o exposto acima, bem
como esclareceu todas as suas dúvidas. Uma cópia do termo de consentimento
livre e esclarecido (TCLE) ficará sobre a sua responsabilidade e a outra será
arquivada junto aos documentos da pesquisa. A assinatura deste termo significa
concordância em participar voluntariamente como doador de pequena amostra de
material biológico (saliva) para realização desta pesquisa.
Contato: Instituto de Ciências da Saúde
Faculdade de Farmácia da UFPA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Telefone:(91) 3201-7754. Entrar em contato com Drª Marcieni Ataíde
de Andrade.
109
ANEXO B
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Eu,
nascido
_________________________________________________________
(a)
em
_____/_____/_______,
___________________________________,
__________________________
e
na
portador
(a)
cidade
de
de
RG
CPF_____________________________
residente em _____________________________________________________, nº
_______, estado civil ____________________ desejo participar da pesquisa
“Caracterização
Farmacognóstica
e
Avaliação
Antifúngica
do
Extrato
Hidroalcoólico de Chrysobalanus Icaco Lin em espécies de Candida” e tenho
amplo conhecimento que o presente estudo tem como objetivo favorecer a
pesquisa, o diagnóstico e o tratamento. Concordo que fotografias intrabucais, assim
como material biológico (saliva) constituem propriedade da Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal do Pará/UFPA, a qual dou plenos direitos de retenção e
uso para quaisquer fins de ensino, pesquisa, divulgação em jornais e/ou revistas
científicas. Declaro também ter lido e entendido a carta de informação e consinto a
minha participação no estudo.
_____________________________________________________________
Assinatura - Data: _____/_____/_____.
110
ANEXO C
FICHA DE ANAMNESE ODONTOLÓGICA
Dados Pessoais
Nome:______________________________________________________________
Data de nascimento:__/__/____ Idade:_____________ Sexo: _________________
Endereço:___________________________________________________________
Cidade:____________________ Estado:___________ Telefone:________________
História Médica
Diabetes: ( ) Sim
(
Hipertensão: ( ) Sim
Asma: ( ) Sim
(
) Não
(
) Não
) Não
Soropositivo para HIV: ( ) Sim
Lúpus: ( ) Sim
(
(
) Não
) Não
Fez cirurgia:
Tipo:
É usuário de drogas? ( ) Sim
Tempo:
(
) Não
Toma algum medicamento:
Qual?:
Tempo:
Fez uso recente de algum medicamento:
Qual?:
Tempo:
Toma chá constantemente:
Qual(is)?:
História Odontológica
Faz tratamento odontológico com frequência:
Qual?:
Condição dos tecidos moles bucais:
Lesões em mucosa jugal?
Tipo:
Lesões em palato mole?
Tipo:
Lesões em palato duro?
Tipo:
Lesões em assoalho de língua?
Tipo:
111
ANEXO C
FICHA DE ANAMNESE ODONTOLÓGICA
Lesões na língua?
Tipo:
Lesões na úvula?
Tipo:
Condição dos tecidos duros bucais:
(
) Desdentado total
(
) Desdentado total com prótese
(
) Desdentado parcial
(
) Desdentado parcial com prótese
(
) Implantes dentários
(
) Aparelho ortodôntico fixo
(
) Aparelho ortodôntico removível
(
) Sangramento Gengival
(
) Perda de inserção clínica
Total de dentes com perda de inserção clínica:
Total de dentes ausentes:
112
ANEXO D
LAUDO DE IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA