Marcadores da Infecção por Chlamydia - PPGBAIP

Transcrição

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
MARCADORES DA INFECÇÃO POR CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CHLAMYDIA
PNEUMONIAE E DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA NA
FORMAÇÃO DA PLACA DE ATEROMA E PROGRESSÃO À DOENÇA
CARDÍACA.
NÚBIA CAROLINE COSTA DE ALMEIDA
Belém-Pará
2014
2
FORMAÇÃO DA PLACA DE ATEROMA E PROGRESSÃO À DOENÇA
CARDÍACA.
Tese apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará como
requisito parcial para a obtenção do
grau de Doutor em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profa. Dra. Marluísa de
Oliveira Guimarães Ishak
Belém-Pará
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca Virtual em Saúde do Instituto Evandro Chagas (BVS IEC)
Almeida, Núbia Caroline Costa de.
Marcadores da infecção por Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae e da
resposta imunológica e inflamatória na formação da placa de ateroma e progressão à
doença cardíaca / Núbia Caroline Costa de Almeida. - 2014
139 f.; 30 cm
Orientador: Profª. Drª. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak
Tese (Doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) –
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de
Pós-Graduação em Agentes Infecciosos e Parasitários, 2014.
1. Chlamydia. 2. Doença cardíaca. 3. Susceptbilidade. 4. Infecções I.
Ishak, Marluísa de Oliveira Guimarães, orient. II. Universidade Federal do
Pará. III. Título.
CDD: 616.92
1
FORMAÇÃO DA PLACA DE ATEROMA E PROGRESSÃO À DOENÇA CARDÍACA.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora:
Profa. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak
Laboratório de Virologia, UFPA
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Antônio Carlos Rosário Vallinoto
Prof. Dr. Ricardo Ishak
Profa. Dra. Maristela Gomes da Cunha
Laboratório de Imunologia, UFPA
Profa. Dra. Rosimar Neris Martins Feitosa
Prof. Dr. Juarez Antônio Simões Quaresma
Laboratório de Imunopatologia, NMT/UFPA(Suplente)
Belém, 20 de fevereiro de 2014
2
À minha família,
À profª. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak,
Ao profº. Dr. Ricardo Ishak
Ao grupo Pronex.
3
“Nada neste mundo faz sentido
se não tocarmos
o coração das pessoas.
Se a gente cresce com
os golpes duros da vida,
também podemos crescer
com os toques suaves da alma.”
Cora Coralina
4
AGRADECIMENTOS
Durante o desenvolvimento de um trabalho acadêmico, certamente contamos com
diferentes formas de apoio pelas quais eu tenho um profundo desejo de agradecer.
Agradeço primeiramente à minha orientadora profª. Dra. Marluísa de Oliveira
Guimarães Ishak, pela oportunidade e confiança entregue a mim para o desenvolvimento
deste trabalho. Ao profº Dr. Ricardo Ishak que além da impecável coordenação deste projeto,
direcionou este documento da melhor forma possível, colaborando, incentivando e corrigindo
com toda a dedicação.
Gostaria de agradecer a FAPESPA e ao CNPq pelo generoso financiamento do projeto
via Edital PRONEX. Ao Programa de Pós- Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários pelo apoio financeiro durante o período de execução do projeto.
Ao Hospital das Clínicas Gaspar Viana, ao Hospital da Ordem Terceira e ao Hospital
Beneficente Portuguesa, nossa sincera gratidão pela autorização e apoio na construção deste
trabalho, através dos cirurgiões Marco Antonio Ayin Fossa, Manuel Araújo Maneschy e
Marcelo Martins Zaninotto que disponibilizaram seu tempo para colaborar com a coleta de
amostras. Agradeço à Fundação HEMOPA pela autorização das coletas de doadores de
sangue.
Agradeço a todos os professores, alunos e funcionários do Laboratório de Virologia,
pelo incentivo e apoio durante este trabalho. Agradeço a colaboração fundamental de Sandra
Lima por todo o direcionamento estatístico deste projeto. Gostaria de registrar um
agradecimento especial à equipe de alunos do PRONEX incluindo Renata Hermes, Alice
Queiroz, Bárbara Santana, Suzanne Fernandes, Izete Machado, Samara Gomes, Larissa
Freitas, Érica Gomes, Felipe Bonfim e Ednelza Graça que com muita força de vontade,
solicitude e dedicação construíram comigo este trabalho, desde a coleta das amostras,
procedimentos laboratoriais até as difíceis reuniões técnicas e científicas.
Dedico o total agradecimento à minha família, pois ao lado deles: meu pai minha mãe,
minha irmã, meu filho e marido, eu fui descobrindo meus sonhos durante a vida. Obrigada
pela torcida e por sonharem comigo. Em especial, preciso eternizar meu agradecimento ao
Igor Brasil Costa que não mediu esforços para me apoiar com seu incentivo, confiança,
auxílio na padronização de técnicas, revisão e correção deste documento, em meus momentos
de extremo cansaço.
Não há nada que penetre mais suavemente no espírito do homem do que o exemplo.
Muito obrigada pelo exemplo de cada um de vocês.
5
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
8
LISTA DE FIGURAS
10
RESUMO
15
ABSTRACT
16
1
INTRODUÇÃO.....................................................................................
17
1.1
CHLAMYDIA TRACHOMATIS E CHLAMYDIA PNEUMONIAE.........
17
1.1.1
Histórico e Classificação........................................................................
17
1.1.2
Morfologia e Ciclo de Desenvolvimento...............................................
17
1.1.3
Organização Genômica..........................................................................
19
1.1.4
Resposta Imunológica e Manifestações Clínicas..................................
20
1.2
PROTEÍNA C REATIVA (PrtCR)...........................................................
22
1.3
FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF-α).......................................
23
1.4
INTERLEUCINA - 6 (IL-6).....................................................................
25
1.5
INTERLEUCINA - 8 (IL-8).....................................................................
26
1.6
INTERLEUCINA - 10 (IL-10).................................................................
26
1.7
ATEROSCLEROSE, INFECÇÕES POR C. TRACHOMATIS, C.
PNEUMONIAE E ASSOCIAÇÃO COM MARCADORES DE
RESPOSTA INFLAMATÓRIA...............................................................
28
1.8
OBJETIVOS.............................................................................................
37
1.8.1
Objetivo Geral.........................................................................................
37
1.8.2
Objetivos Específicos..............................................................................
37
2
MATERIAL E MÉTODOS..................................................................
38
2.1
POPULAÇÃO EXAMINADA...............................................................
38
2.2
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS............................................................
39
2.3
ENSAIOS SOROLÓGICOS PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS
PARA C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE....................................
39
2.3.1
Ensaio Imunoenzimático (EIE).............................................................
39
2.3.2
Microimunofluorescência (MIF)...........................................................
40
2.4
IDENTIFICAÇÃO DA INFECÇÃO POR C. TRACHOMATIS E C.
2.4.1
PNEUMONIAE.........................................................................................
41
Extração de DNA....................................................................................
41
6
2.4.2
PCR em Tempo Real..............................................................................
2.5
IDENTIFICAÇÃO DOS POLIMORFISMOS
MARCADORES
DA
RESPOSTA
41
GENÉTICOS DE
IMUNOLÓGICA
E
INFLAMATÓRIA....................................................................................
42
2.5.1
Extração de DNA....................................................................................
42
2.5.2
Identificação de Polimorfismo nos Genes da PrtCR, TNF-α e IL-6..
42
2.5.3
Identificação de Polimorfismo nos Genes de IL-8 e IL-10..................
46
2.6
DOSAGEM DE NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR E IL-6...............
47
2.7
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE mRNA de TNF-α, IL-8 e IL-10
PARA AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA................................
47
2.7.1
Seleção de Amostras...............................................................................
47
2.7.2
Extração de RNA Total..........................................................................
47
2.7.3
Transcrição Reversa para a Síntese de DNA Complementar
(cDNA).....................................................................................................
48
2.7.4
Teste de Eficiência dos Ensaios de PCR em Tempo Real...................
48
2.7.5
PCR em Tempo Real Quantitativo.......................................................
49
2.8
MÉTODOS ESTATÍSTICOS..................................................................
50
2.9
ASPECTOS ÉTICOS...............................................................................
51
3
RESULTADOS.......................................................................................
52
3.1
CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA.......................
52
3.1.1
Perfil demográfico e social dos pacientes com doença cardíaca e
dos indivíduos do grupo controle..........................................................
3.2
SOROPREVALÊNCIA
DE
ANTICORPOS
PARA
52
C.
TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE EM PACIENTES COM
DOENÇA CARDÍACA E NO GRUPO CONTROLE.............................
3.3
54
PRESENÇA DE DNA DE C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE
EM FRAGMENTOS TECIDUAIS DE PACIENTES COM DOENÇA
CARDÍACA.............................................................................................
3.4
55
CARACTERIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DE PrtCR, TNF-α,
IL-6, IL-8 e IL-10 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO
CONTROLE.............................................................................................
3.5
57
NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR EM PACIENTES CARDÍACOS
E GRUPO NO CONTROLE....................................................................
64
7
3.6
EXPRESSÃO GÊNICA DE TNF-α EM PACIENTES CARDÍACOS E
NO GRUPO CONTROLE........................................................................
3.7
NÍVEIS PLASMÁTICOS DE IL-6 EM PACIENTES CARDÍACOS E
3.8
79
EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-8 EM PACIENTES CARDÍACOS E
NO GRUPO CONTROLE. ......................................................................
3.9
73
86
EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-10 EM PACIENTES CARDÍACOS E
91
4
DISCUSSÃO...........................................................................................
96
4.1
PERFIL DEMOGRÁFICO E SOCIAL, SOROPREVALÊNCIA DE
ANTICORPOS E DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO DE
C.TRACHOMATIS E C.PNEUMONIAE EM PACIENTES COM
DOENÇA CARDIOVASCULAR EM BELÉM, PA...............................
4.2
POLIMORFISMO
DE
MARCADORES
DE
RESPOSTA
IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA...................................................
4.3
100
NÍVEIS PLASMÁTICOS E DE EXPRESSÃO GÊNICA DE
MARCADORES
5
96
DE
RESPOSTA
IMUNOLÓGICA
E
INFLAMATÓRIA....................................................................................
103
CONCLUSÕES.......................................................................................
107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................
109
APÊNDICES
132
ANEXOS
137
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Requisitos de amplificação de C. trachomatis e C. pneumoniae
por PCR em tempo real.....................................................................................
Página
41
Tabela 2 – Sequências dos iniciadores utilizados na amplificação dos genes
de PrtCR, TNF-α e IL-6....................................................................................
43
Tabela 3 – Protocolo de reação utilizada na amplificação dos genes de
PrtCR, TNF-α e IL-6.........................................................................................
43
Tabela 4 – Concentração de reagentes utilizados por reação para
amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6..............................................
44
Tabela 5 – Endonucleases de restrição utilizadas na análise de RFLP para
caracterização de polimorfismos de PrtCR, TNF-α e IL-6..............................
44
Tabela 6 – Ensaios utilizados para identificação de polimorfismos de região
promotora de IL-8 e IL-10................................................................................
46
Tabela 7 – Identificação dos ensaios utilizados para PCR em Tempo Real
Quantitativo.......................................................................................................
49
Tabela 8 – Identificação de iniciadores e sonda para amplificação do gene
referência GAPDH............................................................................................
49
Tabela 9 – Volumes (µL) de reagentes utilizados por reação na PCR em
Tempo Real Quantitativa..................................................................................
50
Tabela 10 – Características demográficas e sociais de pacientes cardíacos
atendidos em três unidades hospitalares e um grupo controle em Belém, PA..
53
Tabela 11 – Frequência de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae
entre pacientes e o grupo controle.....................................................................
54
Tabela 12 – Descrição dos resultados sorológicos para C. trachomatis em
pacientes cardíacos com amostras teciduais positivas para o DNA do
plasmídio críptico de C. trachomatis................................................................
55
Tabela 13 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR,
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em
Belém, PA.........................................................................................................
58
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para C.
trachomatis em pacientes cardíacos
e um grupo controle em Belém,
PA......................................................................................................................
60
9
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para C.
trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA...
61
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para C.
pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém,
PA......................................................................................................................
62
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para C.
pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém,
PA......................................................................................................................
63
10
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 – Representação esquemática da multiplicação da Chlamydia no
interior da célula hospedeira................................................................................
19
Figura 2 – Representação esquemática da localização do polimorfismo
rs2794521(−717 T>C) do gene da PrtCR............................................................
23
rs1800629 (−308 G>A) do gene do TNF-α.........................................................
24
rs1800795 (−174 G>C) do gene da IL-6.............................................................
25
rs4073 (−251 T>A) do gene da IL-8...................................................................
26
rs1800896 (−1082 A>G) do gene da IL-10.........................................................
27
Figura 7 – Representação esquemática dos estágios de desenvolvimento da
aterosclerose........................................................................................................
30
Figura 8 – Representação esquemática do papel da infecção por C.
pneumoniae na aterogênese.................................................................................
32
Figura 9 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de PrtCR......................
45
Figura 10 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de TNF-α...................
45
Figura 11 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de IL-6.......................
46
Figura 12 − Curva de amplificação de PCR em tempo real para C.
pneumoniae e C.trachomatis...............................................................................
56
Figura 13 – Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um
grupo controle em Belém, PA.............................................................................
64
Figura 14 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um
grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717
T>C), em Belém, PA...........................................................................................
65
T>C) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.......................
66
11
T>C) e a presença de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA..................
67
T>C) e a ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA..................
68
grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452
(−717T>C) e a presença de anticorpos para C. pneumoniae em Belém, PA......
69
T>C) e a ausência de anticorpos para C. pneumoniae em Belém, PA................
69
Figura 20 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à
revascularização (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou
ausência de anticorpos para o gênero Chlamydia em Belém, PA.......................
70
Figura 21 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à troca
de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de
anticorpos para o gênero Chlamydia em Belém, PA...........................................
71
grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para
C.trachomatis em Belém, PA..............................................................................
72
grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para
C.pneumoniae em Belém, PA..............................................................................
73
Figura 24 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes e um grupo controle
em Belém, PA......................................................................................................
74
Figura 25 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo
controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A)
em Belém, PA......................................................................................................
75
controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A)
e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA................................
76
Figura 27 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à
revascularização (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou
ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA......................................
77
12
Figura 28 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à troca
de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de
anticorpos para Chlamydia em Belém, PA..........................................................
77
controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para
78
79
Figura 31 – Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo
controle em Belém, PA........................................................................................
80
Figura 32 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo
controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795
(−174G>C) em Belém, PA..................................................................................
81
controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795
(−174G>C) e presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA...............
82
Figura 34 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre os pacientes submetidos à
revascularização do miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com
presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA..................
83
Figura 35 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes submetidos à troca de
válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de
anticorpos para Chlamydia em Belém, PA..........................................................
84
85
85
Figura 38 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo
controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs4073 (−251T>A) em
86
13
Belém, PA............................................................................................................
87
controle de acordo com o polimorfismo rs4073 (−251T>A) e a presença de
anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.........................................................
87
Figura 41 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a
revascularização do miocárdio (RM) e um do grupo controle de acordo com
resultado a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA
88
Figura 42 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a troca de
válvula (TV) e um grupo controle de acordo com resultado a presença ou
ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA......................................
89
90
Figura 44 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos em um grupo
90
91
controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800896
(−1082G>A) em Belém, PA................................................................................
92
controle de acordo com os genótipos para o polimorfismo rs1800896 (−1082
G>A) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA......................
93
Figura 48 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a
revascularização do miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com a
presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia...........................................
93
Figura 49 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a troca de
válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de
anticorpos para Chlamydia..................................................................................
94
C.trachomatis.......................................................................................................
95
14
C.pneumoniae......................................................................................................
95
15
RESUMO
As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte e são associadas
a fatores ambientais, comportamentais tradicionais, fatores bioquímicos, genéticos,
imunológicos e infecciosos. O presente estudo avaliou a influência de infecções bacterianas
(C. trachomatis e C. pneumoniae) e de marcadores imunológicos e inflamatórios (PrtCR,
TNF−α, IL−6, IL−8 e IL−10) em 159 pacientes internados para realização de revascularização
do miocárdio (RM), 71 pacientes com doença de válvula mitral e aórtica internados para
realização de troca de válvula (TV) e 300 indivíduos saudáveis. Dos grupos RM e TV foram
coletadas amostras de sangue no pré-operatório e fragmentos de tecido cardiovascular durante
a cirurgia e amostras de sangue do grupo controle, entre novembro de 2010 a outubro de
2012, em três hospitais em Belém, PA. A detecção de anticorpos para C.trachomatis e
C.pneumoniae foi realizada por um ensaio imunoenzimático e confirmada pela
microimunofluorescência. Os fragmentos de tecido (placa de ateroma, válvula cardíaca e aorta
ascendente) foram submetidos à qPCR para detecção de DNA das duas espécies de
Chlamydia. Foi realizada a análise de polimorfismo da região promotora de cada marcador e a
quantificação relativa da expressão gênica de TNF-α, IL-8 e IL-10. As PrtCR e IL-6, tiveram
a dosagem medida no plasma. A prevalência de anticorpos para C.trachomatis foi de 30,6%,
20,3% e 36,7% e para C.pneumoniae foi de 83,6%, 84,5% e 80,3% (RM, TV e controle,
respectivamente). A presença de DNA do plasmídio críptico de C.trachomatis foi detectada
em 7,4% das amostras, mas não o DNA da C. pneumoniae. O genótipo GG (rs1800795) de
IL-6 demonstrou ser um fator de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular e o
genótipo AA (rs4073) de IL-8 um fator de risco para o desenvolvimento de valvulopatias. A
presença de anticorpos para C. pneumoniae foi um fator adicional ao risco de doença
cardiovascular. A concentração plasmática de PrtCR e IL-6 foi maior em pacientes do que no
grupo controle, associadas a presença do genótipo TT e GG, respectivamente. A presença de
anticorpos para Chlamydia foi associada a uma maior secreção de PrtCR em pacientes com
valvulopatias, assim como a de IL-6 e a presença de anticorpos para C.trachomatis. TNF-α e
IL-8 apresentaram baixa expressão gênica em pacientes. A maior expressão de IL-10 foi
associada à presença dos genótipos GG e AG. A suscetibilidade genética do hospedeiro e
presença de marcadores de infecção bacteriana (Chlamydia) representam um maior risco para
o desenvolvimento de doenças cardiovasculares.
16
ABSTRACT
Cardiovascular diseases are a major cause of death and are associated with traditional
environmental, behavioral, biochemical, genetic, immunological and infectious factors. This
study evaluated the influence of bacterial infections ( C. trachomatis and C. pneumoniae ) and
immunological and inflammatory markers (PrtCR, TNF− α, IL−6 , IL−8 and IL−10 ) in 159
patients admitted to conducting coronary artery bypass grafting (CABG ), 71 patients with
mitral and aortic valve disease admitted to conducting valve replacement (VR ) disease and
300 healthy individuals. For CABG and RV group blood samples before surgery and
cardiovascular tissue fragments were collected during surgery and blood samples from the
control group between November 2010 and October 2012 in three hospitals in Belém, PA.
The detection of antibodies to C. trachomatis and C. pneumoniae was performed using an
enzyme-linked immunosorbent assay and confirmed by microimmunofluorescence. The
fragments of tissue (atheroma, heart valve and ascending aorta) were subjected to qPCR to
detect DNA of two species of Chlamydia. The polymorphism analysis of the promoter region
of each marker and the relative quantification of gene expression of TNF−α, IL−8 and IL−10
were measured. The PrtCR and IL−6 concentration were measured in plasma. The prevalence
of antibodies to C. trachomatis was 30.6 %, 20.3% and 36.7 % and C. pneumoniae was 83.6
%, 84.5 % and 80.3 % (CABG, RV and control, respectively). The presence of the cryptic
plasmid DNA from C. trachomatis was detected in 7.4% of the samples, but not the DNA of
the C. pneumoniae. The GG (rs1800795) genotype of IL−6 was shown to be a risk factor for
developing cardiovascular disease and AA genotype (rs4073) of IL−8 a risk factor for the
development of valvular heart disease. The presence of antibodies to C. pneumoniae is an
additional risk factor for cardiovascular disease. The plasma concentration of PrtCR and IL−6
was higher in patients than in the control group, associated with the presence of genotype TT
and GG, respectively. The presence of antibodies to Chlamydia was associated with an
increased secretion of PrtCR in patients with valvular heart disease, as well as IL−6 and the
presence of antibodies to C. trachomatis. TNF−α and IL−8 showed low gene expression in
patients. The increased expression of IL−10 was associated with the presence of the GG and
AG genotypes. Genetic susceptibility and the presence of markers of bacterial infections
(Chlamydia)
represent
a
higher
risk
for
developing
cardiovascular
diseases.
17
1. INTRODUÇÃO
1.1. CHLAMYDIA TRACHOMATIS E CHLAMYDIA PNEUMONIAE
1.1.1. Histórico e Classificação
Manifestações clínicas associadas a infecções por espécies de Chlamydia, como o
tracoma, são consideradas antigas (Schachter & Caldwel, 1980). Em 1907, Halberstaedter e
von Prowazek descreveram inclusões intracelulares em raspados de células de conjuntiva de
orangotangos infectados experimentalmente com material de tracoma (Halberstaedter & von
Prowazek apud Thygeson, 1971). A etiologia do tracoma foi descrita, finalmente, em 1957,
quando a espécie Chlamydia trachomatis foi recuperada a partir do cultivo de material
biológico de tracoma cultivado em ovos embrionados (Tang et al., 1957). Na década de 1980,
outra espécie foi identificada sendo associada à doenças respiratórias (Grayston et al., 1986;
Grayston et al., 1989). As duas primeiras cepas isoladas receberam os nomes TW183T e AR39 os quais originaram na época a denominação da bactéria (cepa TWAR). Posteriormente ela
foi reconhecida como uma espécie distinta e recebeu o nome Chlamydia pneumoniae (Saikku
et al., 1985; Grayston et al., 1986; Grayston et al., 1989).
A classificação taxonômica das clamídias ainda apresenta controvérsias devido à
diversas sugestões de alteração, dentre elas a divisão do gênero Chlamydia em outros dois
gêneros, o Chlamydia e Chlamydophila (Everett et al., 1999). Porém, a nova classificação
ainda não está oficialmente aceita (Schachter et al., 2001; Greub, 2010). A caracterização
clássica obedece à seguinte sequência: ordem Chlamydiales, que contém a família
Chlamydiaceae no qual está inserido um único gênero Chlamydia com quatro espécies
conhecidas: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci e
Chlamydia pecorum (Storz & Page, 1971; Moulder, 1984; Fukushi & Hirai, 1993).
1.1.2. Morfologia e Ciclo de Desenvolvimento
As clamídias são bactérias intracelulares obrigatórias com DNA e RNA, imóveis,
Gram-negativo, possuindo membrana trilaminar contendo lipossacarídeos e diversas proteínas
de membrana com estrutura e função semelhantes às de Escherichia coli (Moulder, 1966).
Duas principais proteínas são relacionadas ao diagnóstico e à patogenia da infecção:
(1) o lipopolissacarídeo (LPS), constituído principalmente por ácido cetodeoxietanóico e (2) a
MOMP (Major Outer Membrane Protein), que pertence ao grupo de proteínas de membrana,
ricas em cisteína, representando 60% do peso da membrana externa. As pontes dissulfeto que
estabilizam estas proteínas conferem uma maior rigidez e resistência da bactéria contra
18
mecanismos de estresse oxidativo. A MOMP é um importante sítio antigênico e é a proteína
responsável pela diferença entre os sorotipos de clamídia, pois é espécie e sorotipo-específica;
por isso são utilizadas na sorotipagem (caracterização realizada através de painel de
anticorpos monoclonais) (Caldwell et al., 1981; Hatch et al., 1986; Stephens et al., 1987;
Kariagina et al., 2009).
Duas formas distintas ocorrem dentro do seu ciclo de desenvolvimento: os corpos
elementares (CE), que são estruturas de aproximadamente 300 nm, metabolicamente inativos
e representam a forma extracelular altamente infecciosa e os corpos reticulados (CR), que são
maiores do que os CE, medem de 800 a 1.200 nm e possuem DNA fibrilar difuso, alta
concentração de ribossomos e são as formas metabolicamente ativas de reprodução
intracelular, ainda que tenham baixa infectividade (Matsumoto, 1982).
A clamídia infecta comumente células colunares não ciliadas (conjuntiva e trato
urogenital) e macrófagos e o ciclo de desenvolvimento tem duas fases (Figura 1). Na
primeira, os CE extracelulares são internalizados por uma célula hospedeira através de
receptores de superfície (Hatch et al., 1984; Stephens et al., 2001; Wyrick, 2000). Estudos
apontam que a família Chlamydiaceae apresenta um sistema conservado de proteínas de
secreção tipo III que permite a transferência eficaz de proteínas efetoras em todas as fases do
seu ciclo mostrando um papel fundamental na entrada destas bactérias bem como sua
multiplicação na célula do hospedeiro (Slepenkin et al., 2005).
Aproximadamente oito horas após a entrada da bactéria, os CE se reorganizam em CR
e iniciam a replicação por divisão binária que caracteriza a segunda fase do ciclo. Em 24 a 72
horas, os CR retornam à forma de CE. O tempo de duração deste ciclo bifásico não é exato,
porém se caracteriza por divisões que ocorrem no interior de um vacúolo da célula parasitada,
formando as chamadas inclusões citoplasmáticas perinucleares (Figura 1). No final do ciclo,
os vacúolos contêm de 100 a 1.000 CE e na medida em que estes vacúolos ocupam quase todo
o citoplasma da célula hospedeira, pode ocorrer lise ou exocitose com liberação dos novos CE
no meio extracelular, iniciando um novo ciclo (Moulder, 1991; Wyrick, 2000).
A inclusão representa um mecanismo importante de escape da clamídia garantindo a
sua circulação e maior sobrevivência dentro da célula. Em células epiteliais infectadas por C.
trachomatis, não ocorre a fusão da inclusão com componentes lisossômicos, fato que levaria a
degradação da partícula bacteriana. Foi demonstrado que para ocorrer a liberação da bactéria,
as inclusões fundem com vesículas secretórias do Complexo de Golgi e são liberadas por
exocitose (Hogan et al., 2004).
19
Figura 1 – Representação esquemática da multiplicação da Chlamydia no interior da célula
hospedeira (Adaptado de http://www.chlamydiae.com/docs/biology/biol_devreg.as).
1.1.3. Organização Genômica
A clamídia possui um genoma constituído por um cromossomo circular que contém
1.042.519 pb das quais 58,7% correspondem a A+T (adenina e timina). Existe também um
elemento genético extracromossômico (plasmídio pCT) de 7.493 pares de bases (7.5 Kb). Os
resultados da análise do genoma da clamídia mostraram que existem 894 genes codificadores
de proteínas, e destas, são conhecidas os produtos de expressão de 604 (68%) (Stephens et al.,
1998).
Setenta genes representados no genoma da C. trachomatis não são representados no
genoma da C. pneumoniae. Estes genes estão organizados em blocos que contém entre 2 a 17
genes, além de 19 genes não agrupados dispersos pelo genoma. Destes 70 genes não
homólogos entre as duas espécies, 60 são classificados como possíveis áreas de codificação
de proteínas (Stephens et al., 1998). Os outros genes são referentes ao operon do triptofano
(trpA, trpB, trpR, trpC), dois genes protease thiol e quatro genes pertencentes a superfamília
da fosfolipase-D (Stephens et al., 1998; Kalman et al., 1999).
O plasmídio pCT foi isolado a partir de cepas de C. trachomatis sorotipo L2 e o seu
DNA foi detectado em todos os outros sorotipos da espécie. Este plasmídio é altamente
conservado e possui menos de 1% de variação na sequência nucleotídica (Thomas et al.,
1997, Palmer & Falkow, 1986). Estudos sugerem que a presença do plasmídio tem
importância no acúmulo de glicogênio no interior das inclusões, na capacidade de ativar a
resposta imunológica inata via TRL2 (Toll Like Receptor 2), um passo muito importante na
imunopatologia da infecção (Darville et al., 2003; O’Connell et al., 2007).
20
1.1.4. Resposta Imunológica e Manifestações Clínicas
A fase intracelular dentro do ciclo de desenvolvimento da clamídia influencia os tipos
de elementos do sistema imunológico estimulados durante uma infecção (Loomis &
Starnbach, 2002).
A patogênese é ocasionada primariamente, por uma resposta inflamatória que se inicia
e se propaga a partir das células infectadas (Stephens, 2003). A atração de células
inflamatórias como macrófagos e a subsequente liberação de citocinas pró-inflamatórias
parecem ser pontos fundamentais na resposta imunológica inata contra a Chlamydia
(Rasmussen et al., 1997; De Kruif et al., 2005). A resposta imunológica adaptativa se forma a
partir do reconhecimento de antígenos específicos da Chlamydia em infecções persistentes ou
repetidas (Loomis & Starnbach, 2002; Entrican et al., 2004).
O uso de cultura com células infectadas sugere que os mediadores da resposta
imunológica celular são os mais importantes nas infecções por Chlamydia e microorganismos intracelulares em geral (Ward, 1995, Entrican et al., 2004). Infecções em modelos
animais demonstraram que a ativação de células da linhagem T auxiliares 1 (Th1) possui um
papel central na eliminação da infecção sendo responsável também pelos danos teciduais
causados ao organismo. Enquanto o Fator de necrose tumoral α (TNF- α) e Interferon-γ (IFNγ) demonstram uma ação de controle da infecção, a produção de Interleucina-10 (IL-10)
antagoniza essa resposta diminuindo o número de células em apoptose, podendo levar a uma
infecção persistente (Cain & Rank, 1995; Geng et al., 2000; Shavlakadze & Gorgoshidze,
2010).
O processo de persistência da Chlamydia pode ser induzido por vários mecanismos
durante o seu ciclo de desenvolvimento. O tratamento com alguns antibióticos (por exemplo,
betalactâmicos) é um dos fatores relatados. A penicilina pode interferir na síntese de
peptideoglicanos alterando a estrutura da parede celular da bactéria. Consequentemente seu
ciclo de desenvolvimento ser torna mais lento devido à dificuldade de transição morfológica
do CR para o CE. O resultado disto é uma forma aberrante de CR que caracteriza a
persistência (Skilton et al., 2009). A forma aberrante pode também ser induzida pela presença
de alta quantidade de IFN-γ cujo papel principal é combater a infecção aguda através da
eliminação da célula infectada. Um dos efeitos do IFN-γ é diminuir a biodisponibilidade do
triptofano, aminoácido essencial dentro do ciclo de desenvolvimento das clamídias (Igietseme
et al., 1998; Xie et al., 2002).
21
A C.trachomatis é um dos agentes mais comuns de infecções sexualmente
transmissíveis (IST) e possui 19 variantes antigênicas caracterizadas pelos sorotipos: A, B, B a,
C, D, Da, E, F, G, Ga, H, I, Ia, J, Ja, K, L1, L2 , L2a e L3 (Morré et al.,1998). De acordo com o
sorotipo, as manifestações clínicas da infecção podem se apresentar de forma variada.
Os sorotipos A, B, Ba e C têm sido regularmente associados ao tracoma, doença que
leva à cegueira cerca de 500 milhões de pessoas no mundo (WHO, 2004). A doença ocorre
por infecções da conjuntiva e na sua forma aguda apresenta folículos e papilas conjuntivais. O
quadro clínico do tracoma se inicia com alterações inflamatórias agudas na conjuntiva e
córnea, manifestadas por lacrimejamento, secreção purulenta e hiperemia conjuntival. De
acordo com a gravidade e duração do processo inflamatório o quadro pode evoluir para cura
espontânea ou deixar cicatrizes conjuntivais (Jones, 1975; Behrens-Baumann, 2007).
Os sorotipos de D a K causam, aproximadamente, quatro milhões de novos casos de
IST nos Estados Unidos e 90 milhões de casos no mundo, sendo responsável por 30 a 50%
dos casos de uretrites não–gonocóccicas que podem levar à infertilidade (Honey &
Templeton, 2002; Manavi, 2006; Land et al., 2010). Estes mesmos sorotipos podem causar
infecções neonatais que são adquiridas durante a passagem do recém-nascido pelo canal de
parto e, a partir deste contato, pode ocorrer a infecção da conjuntiva ou da nasofaringe do
recém-nascido e subsequente conjuntivite neonatal, otite média, rinite ou pneumonia, dentre
outras manifestações (Schachter et al., 1986; Hammerschlag, 1993; Darville, 2005; Bekler et
al., 2012).
Os sorotipos L1, L2, L2a e L3 são responsáveis pela ocorrência do linfogranuloma
venéreo (LGV) o qual possui caráter endêmico em partes da África, Ásia, América do Sul e
Caribe, e é raro em países industrializados (Schachter & Caldwell, 1980; Schachter & Osoba,
1983; Collins, 2006).
A C. pneumoniae tem sido identificada nos últimos 20 anos como um importante
agente de infecções respiratórias com distribuição mundial e transmissão através das
secreções das vias aéreas (Agarwal & Chander, 2008). As manifestações clínicas relatadas
incluem pneumonia, bronquite, sinusite e asma (Saikku et al., 1985, Grayston et al., 1986)
sendo que a bactéria é responsável por aproximadamente 10% dos casos de pneumonia
adquirida em comunidade e 5% dos casos de faringite, bronquite e sinusite (Kuo et al., 1995;
Bergot, 2011).
A C. pneumoniae foi associada a quadros de artrite aguda com alguns pacientes
evoluindo para quadro crônico (Schumacher, 2000) e doenças cardiovasculares como infarto
do
miocárdio
e
aterosclerose (Saikku
et
al.,
1988,
Grayston,
2000).
Estudos
22
soroepidemiológicos têm associado doença arterio-coronariana com a presença de anticorpos
para C. pneumoniae (Saikku et al., 1988). Além disso, a bactéria já foi detectada na placa
aterosclerótica por meio de técnicas como a Reação em cadeia mediada pela polimerase
(PCR) e a imunocitoquímica (Kuo et al., 1995), e em outros estudos, isolada em cultura a
partir de ateromas (Gaydos & Quinn, 2000; Kuo & Campbell, 2000).
1.2. PROTEÍNA C REATIVA (PrtCR)
A mais precoce e fundamental fase da resposta imunológica do hospedeiro é a resposta
de fase aguda, onde existe uma rápida alteração na concentração de diversas proteínas
plasmáticas, incluindo a Proteína C Reativa (PrtCR) (Slazai, 2002). Esta foi inicialmente
descrita como uma proteína sérica que se ligava ao polissacarídeo C, um ácido teicóico de
Streptococcus pneumoniae (Tillet & Francis, 1930 apud Volanakis, 2001). A proteína,
composta por 224 aminoácidos (Woo et al., 1985), não é específica, sendo secretada pelos
hepatócitos geralmente sob influência de citocinas pró-inflamatórias, como a Interleucina-6
(IL-6) (Slazai, 2002).
A PrtCR pertence à família das pentraxinas, que reúne proteínas filogeneticamente
conservadas, assim chamadas por apresentarem cinco subunidades globulares idênticas. Estas
subunidades se ligam (de forma dependente de Ca+2) com alta afinidade a fosfolipídeos
bacterianos como a fosforilcolina (Anderson et al., 1978). Ela ainda pode funcionar como
opsonina de bactérias, protozoários e imunocomplexos, além de contribuir para ativação da
via clássica do complemento através da ligação com a proteína C1q (Volanakis, 1982). Esta
habilidade de reconhecer e mediar a eliminação de agentes infecciosos por meio do
recrutamento do sistema complemento e de células fagocíticas mostra que a PrtCR é um
importante constituinte da imunidade inata (Volanakis, 2001). Além disso, a proteína
desempenha um papel importante na eliminação de células apoptóticas e necróticas do
hospedeiro, contribuindo assim para a restauração do tecido lesado (Volanakis, 2001).
O gene codificador da PrtCR se localiza no cromossomo 1, na posição 1q23.2 (FloydSmith et al., 1986), apresenta 2.301 pb e abriga dois éxons sendo o éxon 1 com 166 pb e o
éxon 2 com 1.850 pb (Woo et al., 1985). Entre os dois éxons existe um íntron de 278 pb
(Woo et al., 1985) (Figura 2).
Vários polimorfismos de nucleotídeos (SNP, small nucleotide polymorphisms) no gene
da PrtCR têm sido descritos e se mostraram associados à mudanças na concentração sérica da
proteína, como por exemplo o polimorfismo −757T>C (rs3093059), −717T>C (rs2794521),
23
−409G>A (rs3091244) e −309C>T>A (rs3093062) localizados na região promotora do gene
(Zee, et al., 2002; Brull et al., 2003; Hage & Szalai, 2007). Além desses, existe o
polimorfismo +1059G>C (rs1800847) no éxon 2 e +1444C>T (rs1130864) na região 3’ não
traduzida (Zee et al., 2004; Balistreri et al., 2006). Assim como outros elementos da resposta
imunológica, a secreção exacerbada da PrtCR pode desempenhar efeitos potenciais de
resposta, como foi demonstrado em seu envolvimento no processo de aterogênese (Sinning et
al., 2006).
Um estudo avaliou os níveis séricos de PrtCR momentos antes e depois dos indivíduos
se submeterem à exercícios de longa duração e da mesma forma em indivíduos que se
submeteriam à cirurgia de revascularização do miocárdio. O grupo não só identificou dois
novos polimorfismos (−717/T>C e +1444/C>T) como encontrou níveis séricos maiores de
PrtCR em homozigotos para o alelo 1444*T quanto comparado aos indivíduos heterozigotos,
sugerindo que esta variante genética pode estimular o aumento dos níveis séricos da PrtCR,
influenciando no risco de doenças cardiovasculares (Brull et al., 2003).
Figura 2 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs2794521 (−717
T>C) do gene da PrtCR (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).
1.3. FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF-α)
O TNF foi primeiramente identificado como uma substância que causava necrose de
tumores “in vivo” e estava presente no plasma de animais tratados com LPS bacteriano, ou
endotoxinas (Makhatadze, 1998). Esta citocina é secretada principalmente por macrófagos e
monócitos tendo como característica a mediação da resposta inflamatória aguda por bactérias
Gram-negativo e outros agentes (Hajeer & Hutchinson, 2000).
O TNF-α é uma proteína com peso molecular de 17 (kD), composta por 157
aminoácidos e contém uma ponte dissulfídica ligada a dois resíduos de cisteína (Shalaby et
al., 1986; Makhatadze, 1998). O gene TNF-α está localizado no cromossomo 6, na região
6p23.1, ao lado de gene codificador do TNF-β, na região de classe III do Complexo de
Histocompatibilidade Principal (MHC) (Beutler & Cerami, 1988).
24
As funções biológicas do TNF-α são complexas e relacionadas à concentração da
citocina bem como ao tempo de exposição a ela (Barbara et al., 1996). Em infecções agudas,
a secreção local de TNF-α é claramente benéfica. Ocorre a expressão de moléculas de adesão
no endotélio vascular, além do recrutamento de neutrófilos e monócitos para os locais da
infecção (Barbara et al., 1996). Ocorre também um estímulo das células endoteliais e
macrófagos a secretarem quimiocinas que provocam quimiotaxia e recrutamento dos
leucócitos (Makhatadze, 1998). No entanto, uma exposição prolongada ao TNF-α pode ser
prejudicial. Altos níveis de proteínas circulantes são associados a choque tóxico induzido por
endotoxinas bacterianas (Tracey et al., 1986).
O TNF-α estimula a secreção de IL-1 e IL-6, o que leva a um aumento de temperatura,
sonolência e a liberação de glicocorticóide. Estas podem ser de curto prazo para combater
determinadas infecções, mas os seus efeitos em longo prazo podem ser prejudiciais (Hajeer &
Hutchinson, 2000).
O MHC é a região mais densa e polimórfica de todo o genoma e vários polimorfismos
têm sido identificados no interior e ao redor do gene do TNF-α. Estudos mostram que estes
polimorfismos estão envolvidos na alteração dos níveis de produção do TNF-α, o que pode ter
um grande impacto na resposta inflamatória do indivíduo (Hajeer & Hutchinson, 2000).
Os polimorfismos no gene do TNF-α estão mais associados à regulação da produção
da citocina e coincidem com as regiões de ligação dos fatores de transcrição. As alterações
mais investigadas estão nas posições -308G>A (rs1800629) e -238G>A (rs361525) da região
promotora (Wilson et al., 1992; Kroeger et al., 1997) (Figura 3). Estudos mostram que o alelo
-308*A possui uma atividade de transcrição maior quando comparada com o alelo -308*G
(Braun et al., 1996; Wu & McClain, 1997) Em contrapartida, o polimorfismo na posição -238
apresenta controvérsias, pois já foi mostrado que está associado com maior transcrição do
TNF-α (Huizinga et al., 1997), fato que não foi repetido posteriormente (Pociot et al., 1995).
G>A) do gene do TNF-α (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).
25
1.4. INTERLEUCINA - 6 (IL-6)
A IL-6 foi identificada em 1986 primeiramente como um fator de regulação de
linfócitos B, mas, em seguida, ela foi caracterizada por apresentar atividade multifuncional
tanto na resposta imunológica inata como na adquirida (Hirano et al., 1986; Kishimoto,
2005). Na imunidade inata a IL-6 estimula a síntese de proteínas de fase aguda (como a
PrtCR) pelos hepatócitos, contribuindo para os efeitos sistêmicos da inflamação (Brennan &
Mclnnes, 2008). Na imunidade adquirida, a IL-6 estimula efeitos de maturação e ativação dos
linfócitos T e B (Brennan & Mclnnes, 2008), além de estimular a maturação de macrófagos,
osteoclastos, condrócitos, células endoteliais e participar do controle do sistema
hematopoiético (Kishimoto, 2005).
A IL-6 é produzida por monócitos, macrófagos, linfócitos, fibroblastos e células
endoteliais em resposta a diversos micro-organismos e outras citocinas como TNF e IL-1
(Kishimoto, 2005). Sua produção exacerbada está associada a uma diversidade de doenças
autoimunes e inflamatórias e outras condições como a artrite reumatóide, artrite juvenil
sistêmica, diabetes tipo II, doença de Crohn, obesidade, aterosclerose e infarto agudo do
miocárdio (Ishihara & Hirano, 2002; Abeywardena et al., 2009; Vakili et al., 2011).
O gene da IL-6 possui 4.803pb e se localiza no cromossomo 7, posição 7p15, sendo
constituído por 5 éxons (Sutherland et al., 1988) (Figura 4). Existem alguns polimorfismos na
região promotora que apresentam associação com níveis alterados de transcrição do gene,
como o rs1800795 (−174G>C), o rs1800796 (−572G>C), e rs1800797 (−597C>A)
(Kelberman et al., 2004).
G>C) do gene da IL-6 (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).
26
A IL-8 pertence à família das quimiocinas (CXC) e é secretada por diversas células
como macrófagos, neutrófilos, células epiteliais e células endoteliais (Grimm et al., 1996).
Esta interleucina pró-inflamatória é responsável por mediar a ativação e migração dos
neutrófilos do sangue periférico para os tecidos onde se iniciou um processo inflamatório e
geralmente o seu estímulo acentua a inflamação nestes locais (Harada et al., 1994).
O gene da IL-8 apresenta 5.191pb, está localizado do cromossomo 4, posição q12-q13
e possui quatro éxons separados por tres íntrons (Mukaida et al., 1989) (Figura 5). Muitos
polimorfismos no gene têm sido detectados, como o da posição 781C>T (rs2227306) no
primeiro íntron e o -251T>A (rs4073) na região promotora, cujo alelo 251*A, em
homozigose, é associado a uma maior atividade transcricional do gene (Hull et al., 2000;
Hacking et al., 2004).
Por ser uma forte mediadora do processo inflamatório, a IL-8 tem sido associada a
diversos processos inflamatórios como doença respiratória aguda, pancreatite aguda, asma
brônquica, artrite idiopática juvenil, gastrite induzida por Helicobacter pylori e aterosclerose
(Gross et al., 1992; Fujishima et al., 1993; De Benedetti et al., 1999; Boisvert et al., 2000;
Bäckhed et al., 2003).
Figura 5 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs4073 (−251 T>A)
do gene da IL-8 (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).
A IL-10 se apresenta como uma citocina inibidora de diferentes tipos de reações
imunológicas, uma vez que possui a capacidade de bloquear a secreção de outras citocinas e
sua própria secreção (Moore et al., 1993). Ela representa um potente supressor da função de
células T, NK e, principalmente, macrófagos ativados. Esta ação sobre macrófagos está
direcionada para a inibição de citocinas como TNF, IL-12, IL-1, IL-6 e IL-8, além da inibição
de co-estimuladores e moléculas de MHC II nestas células (Moore et al., 2001; Couper et al.,
2008). Como consequência vai ocorrendo, gradativamente, um controle na liberação de
27
citocinas pró-inflamatórias, término de suas reações e o organismo retorna ao seu estado de
repouso à medida que a infecção vai sendo erradicada (Schumacher et al., 2005).
A descoberta do efeito inibidor da IL-10 ocorreu ao se observar que havia um produto
que inibia a proliferação, função efetora e desenvolvimento de células T helper 1 (Th1) da
mesma forma que o IFN-γ inibia as células T helper 2 (Th2) (Fernandez-Botran et al., 1988,
Fiorentino et al., 1989). A regulação direta das respostas Th1 e TH2 pela IL-10 ocorre pela
limitação tanto da ativação como diferenciação dos linfócitos T, suprimindo a resposta próinflamatória. A relevância fisiológica, portanto, está na prevenção e limitação de reações
específicas e inespecíficas e, como resultado, a diminuição do dano tecidual (Couper et al.,
2008; Sabat et al., 2010).
O gene da IL-10 possui 5 éxons, totalizando aproximadamente 5,2 Kb de tamanho e
está localizado no cromossomo 1, posição 1q31-q32 (Kim et al., 1992) (Figura 6). O produto
codificado é um homodímero de 18 KDa que pertence ao grupo de citocinas com quatro
cadeias alfa-hélice e liga-se a um receptor de citocinas tipo II (Kim et al., 1992).
Dentro da região promotora foram descritos inúmeros polimorfismos funcionais
incluindo dois microssatélites dinucleotídicos de citosina e adenina localizado a
aproximadamente 4.000 pb anteriores ao início da transcrição;
e tres polimorfismos
bialélicos: −1082G>A (rs1800896), −819C>T (rs1800871) e −592C>A (rs1800872) (Turner
et al., 1997; Eskdale et al., 1998).
Westendorp et al. (1997), verificaram que 70% das alterações na produção de IL-10
em familiares e gêmeos univitelinos eram devido a componentes genéticos. Em outro estudo,
células mononucleares do sangue periférico foram estimuladas com Concanavalina-A, e como
resultado foi observada uma diferença na secreção de IL-10 em associação com a presença ou
ausência de uma adenina na posição −1082 da região promotora (Turner et al., 1997).
A>G) do gene da IL-10 (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).
28
Os genótipos referentes ao polimorfismo na região −1082 da IL-10 (AA, GA, GG)
correspondem, respectivamente, a níveis baixos, intermediários e altos na produção da
citocina, de forma independente dos outros polimorfismos citados (Eskdale et al., 1998;
Couper et al., 2008). A mudança de base pode levar a uma produção diminuída de até 30% da
proteína a partir de um estímulo definido (Turner et al., 1997).
1.7. ATEROSCLEROSE, INFECÇÕES POR C. TRACHOMATIS, C. PNEUMONIAE E
ASSOCIAÇÃO COM MARCADORES DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA
A aterosclerose é uma condição multifatorial caracterizada inicialmente como o
acúmulo de gordura (placas de ateroma) na parede das artérias (Schwenke et al., 1989). Este
processo pode ser desencadeado a partir de um dano no tecido endotelial promovendo um
processo inflamatório inicial que pode evoluir para lesões avançadas que obstruem a luz do
vaso resultando em processos agudos de isquemia que caracterizam a doença cerebrovascular,
vascular periférica e doença coronariana (Stary, et al., 1994, Stary et al., 1995, Zouridakis,
2004).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a doença coronariana é a principal
causa de morte em indivíduos a partir de 60 anos de idade no mundo e a segunda causa de
morte entre indivíduos de 15 a 59 anos de idade (WHO, 2004). Cerca de 3,8 milhões de
homens e 3,4 milhões de mulheres morrem a cada ano devido a esta doença (WHO, 2004).
Embora exista a influência de fatores genéticos, 80% a 90% das pessoas que morrem
de doença coronariana possuem um ou mais fatores de risco relacionados ao estilo de vida. As
taxas de mortalidade em geral podem ser afetadas pelas diferenças entre os países nos
principais fatores de risco que incluem taxa de colesterol no sangue, pressão sanguínea, o
tabagismo, obesidade, diabetes, sedentarismo e o tipo de dieta (Kiechl & Willeit, 1999; WHO,
2004; Nash et al., 2011).
Um dos principais fatores envolvidos no desenvolvimento da lesão aterosclerótica é a
lipoproteína de baixa densidade modificada pela oxidação (LDLox) (Van de Vijver et al.,
1998; Sun et al., 2000). Apesar disto, o processo de aterogênese não é mais considerado o
simples resultado de acúmulo de lipídeos na parede das artérias (Ross, 1999; Vigen et al.,
2005). As lesões ateroscleróticas são resultado de alterações oxidativas, hemodinâmicas,
bioquímicas e inflamatórias adicionadas a respostas celulares altamente específicas (Packard
& Libby, 2008; Galkina & Ley, 2009) (Figura 7). Observações fisiopatológicas em seres
29
humanos e animais mostram que a aterosclerose consiste em uma resposta a um dano tecidual
com enfoque para disfunção endotelial (Fan & Watanabe, 2003). O resultado final é o
acúmulo de células musculares lisas dentro da camada íntima do vaso, além de macrófagos,
fibras elásticas, colesterol e proteoglicanos (Packard & Libby, 2008; Galkina & Ley, 2009;
Nabel & Braunwald, 2012).
A Associação Americana do Coração e o Comitê de Lesões Vasculares aprovaram
uma classificação histológica das lesões ateroscleróticas em seis tipos. A lesão tipo I onde são
observadas poucas mudanças no tecido arterial e formação de um grupo pequeno e isolado de
macrófagos contendo gotículas de lipídeos (célula espumosa) (Figura 7A) (Stary, et al., 1994;
Nabel & Braunwald, 2012). A lesão tipo II é caracterizada pela observação de manchas,
pontos ou estrias de gordura que apresentam uma coloração amarela na superfície da camada
íntima (Stary, et al., 1994). A lesão tipo III é conhecida como intermediária, ou de transição,
ou pré-ateroma pois já podem ser visualizadas gotículas de lipídeos no meio extra-celular que
se acumulam entre as células do músculo liso promovendo o espessamento a camada íntima
(Stary, et al., 1994; Nabel & Braunwald, 2012) (Figura 7B). As lesões tipo IV, V e VI são
consideradas avançadas e denominadas de ateroma, onde já se observa uma intensa
desorganização da camada íntima devido a formação do núcleo lipídico bem definido (lesão
IV), podendo esta camada lipídica sofrer uma acúmulo de tecido conjuntivo fibroso (lesão V)
evoluindo para formação de fissuras, hematomas ou trombos (lesão VI) (Stary, et al., 1995)
(Figura 7C).
30
Figura 7 – Representação esquemática dos estágios de desenvolvimento da aterosclerose
(Adaptado de Nabel & Braunwald, 2012).
Os estímulos que iniciam e sustentam o processo inflamatório nos vasos ainda não
foram totalmente identificados. Vários estudos retrospectivos e transversais sustentam a
hipótese de que uma infecção local ou sistêmica crônica possa contribuir para o processo de
aterogênese (Rupprecht et al., 2001; Pinar et al., 2004; Nazmi et al., 2010). Os microorganismos mais relatados são alguns vírus da família Herpesviridae (Herpesvírus humano 1
e Herpesvírus humano 5), o Vírus da hepatite A; e bactérias como o Mycoplasma pneumoniae
31
e a Chlamydia pneumoniae (Davidson et al., 1998; Gaydos & Quinn, 2000; Bason et al.,
2003; Maia et al., 2009; Nazmi et al., 2010).
O primeiro estudo que apresentou associação entre a C. pneumoniae e doença arterial
coronariana foi realizado na Finlândia, onde Saikku et al., em 1988, mostraram que pacientes
com doença coronariana apresentavam maior quantidade de anticorpos contra a bactéria do
que o grupo controle. Em 1992, o grupo encontrou os mesmos resultados em outro estudo
caso-controle (Saikku et al., 1992).
Após estes estudos iniciais, a associação da C. pneumoniae com doenças de coronária,
carótida e doença arterial periférica tem sido descrita. Já foi mostrada, in vitro, a habilidade da
bactéria de infectar células do músculo liso, endoteliais e macrófagos humanos (Godzik et al.,
1995; Gaydos et al., 1996) e com base nisso, diversas metodologias têm sido empregadas para
se elucidar mecanismos de associação e patogênese dessas doenças como estudos
soroepidemiológicos, anatomo-patológicos, experimentais ou de demonstração direta da
bactéria nas paredes arteriais (Melnick et al., 1993; Kuo et al., 1995; Laitinen et al., 1997,
Costa, 2002; Reszka et al., 2008; Bayram et al., 2011).
Estudos em modelos animais têm demonstrado resultados que reforçam o papel da C.
pneumoniae como agente envolvido na patogênese da aterosclerose. Na Finlândia, após
inoculação intranasal de C. pneumoniae, coelhos brancos da Nova Zelândia apresentaram
lesões aórticas e foi observado que estas foram mais frequentes naqueles que receberam duas
inoculações sequenciais da bactéria (Laitinen et al., 1997).
As evidências mais importantes de associação têm sido os estudos de detecção de
componentes bacterianos nas placas de ateroma. Esta demonstração direta da bactéria tem
sido realizada por imunocitoquímica (que utiliza anticorpo monoclonal espécie-específico) e
pela reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR), além de microscopia eletrônica e
isolamento do organismo (Kuo et al., 1993; Reszka et al., 2008; Bayram et al., 2011).
A C. pneumoniae é raramente encontrada em artérias normais ou granuloma não
infeccioso e é relatada com mais frequência em ateromas do que em pulmão ou outros tecidos
no mesmo paciente (Campbell et al., 1998). Apesar da taxa de detecção variar de acordo com
a metodologia empregada, a C.pneumoniae é encontrada em muitas lesões (Gaydos & Quinn,
2000; Kuo & Campbell, 2000). Um estudo realizado no Alaska encontrou antígenos da
bactéria em artérias lesionadas de adultos jovens (grupo de baixo risco para aterosclerose)
reforçando o seu papel primário na patogênese da doença (Davidson et al., 1998).
A participação da C.pneumoniae no processo de formação da placa de ateroma pode
ocorrer por meio de indução da inflamação e oxidação do LDL colesterol conduzindo ao
32
dano, reparo e fibrose do tecido afetado (Vielma et al., 2004). Ao estabelecer uma infecção do
trato respiratório inferior, a bactéria infecta macrófagos alveolares e monócitos (Figura 8). Os
monócitos infectados atingem os vasos sanguíneos disseminando a infecção para tecidos
suscetíveis, incluindo as artérias (Ngeh et al., 2002), e produzem grande quantidade de
proteínas (como a HSP60-Heat Shock Protein - Proteína de Choque Térmico) que podem
induzir à secreção de fatores pró-coagulantes, citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão de
leucócitos e a expressão da metaloproteinase de matriz, a qual produz uma cascata
inflamatória crônica que pode contribuir para o processo de aterogênese (Kol et al., 1998; Kol
et al., 1999; Ngeh et al., 2002).
Figura 8 – Representação esquemática do papel da infecção por C. pneumoniae na
aterogênese
(Fonte:
http://www5.appliedbiosystems.com/tools/pathway/review.php?
pathway=C. pneumoniae Infection in Atherosclerosis).
33
O processo inflamatório decorrente da infecção pode induzir a elevação do nível sérico
de vários marcadores imunológicos que associados aos polimorfismos genéticos de cada
indivíduo podem influenciar na instabilidade ou progressão das placas ateroscleróticas (Byrne
& Kalayoglu, 1999). Johnston et al. (2001) estudaram a associação entre os níveis séricos da
PrtCR e a infecção por C. pneumoniae em placas de ateroma localizadas na carótida. Foi
observado que os níveis séricos da PrtCR foram maiores nos indivíduos com placas infectadas
por C. pneumoniae do que no grupo sem infecção, sugerindo que presença da bactéria pode
estimular o aumento da proteína e, como consequência, o risco de doença cardiovascular.
Com relação ao gene do TNF-α, a maioria das observações sugere que seus
polimorfismos levam a uma variação na sua produção, fato que pode ter importância na
suscetibilidade ou gravidade de certas afecções como artrite, doenças auto-imunes e
infecciosas em geral (virais, bacterianas e parasitárias) (Wilson et al., 1994; McGuire et al.,
1994; Nadel et al., 1996, Hohler et al., 1998). Desta forma, o TNF pode ter um papel
importante na patogênese das infecções por Chlamydia, pois sua secreção pode ser induzida
pelo lipopolissacarídeo destas bactérias (Fong, 2003). Estudos dos polimorfismos do TNF têm
encontrando associação com a suscetibilidade a infecções por Chlamydia. A secreção do
TNF-α pode ser exacerbada dependendo da presença dos alelos polimórficos e este efeito
pode intensificar o quadro inflamatório e a progressão da lesão, uma vez que esta citocina
apresenta um papel prejudicial nos quadros de infecções crônicas (Fong, 2003; Burton et al.,
2004; Faal et al., 2005).
Altas concentrações de mRNA de citocinas pró-inflamatórias incluindo o TNF- α tem
sido encontradas em conjuntivas de pacientes com tracoma cicatricial (Burton et al., 2004;
Faal et al., 2005). Um estudo realizado em Gâmbia mostrou que o alelo 308*A estava
presente em proporção maior nos pacientes com tracoma cicatricial do que na população
controle e esta associação aumentou para os casos de homozigose (Conway et al., 1997).
Neste mesmo estudo, também foi mostrada uma frequência maior do alelo –238*A nos
pacientes do que na população controle, porém, este resultado não foi estatisticamente
significante (Conway et al., 1997).
Atik et al. (2008) mostraram que os alelos –308*A do TNF–α e o +252*A do TNF-β
se apresentaram como fatores de risco para o desenvolvimento de triquíase em pacientes
apresentando tracoma, enquanto que Natividad et al. (2007) encontraram os mesmo resultados
para o alelo –308*A.
Tanto os polimorfismos como os níveis plasmáticos do TNF-α têm se apresentado
como um risco de desenvolvimento ou complicações de aterosclerose em alguns estudos
34
como o de Bittar et al. (2006), onde se observou que pacientes apresentando homozigose para
o alelo -308*A possuíam níveis mais altos da citocina no plasma e isto foi associado à efeitos
desfavoráveis em situações após a cirurgia cardíaca. Na Grécia, Kaperonis et al. (2006)
mostraram níveis maiores de TNF-α em pacientes com doença arterial periférica do que no
grupo controle, além de encontrarem uma prevalência de anticorpos anti-C. pneumoniae em
50% do grupo. Na Índia, Goswamim et al. (2009), encontrou uma diferença significante nas
concentrações plasmáticas de TNF-α entre indivíduos que apresentaram infarto agudo do
miocárdio e os controles e também uma correlação entre o TNF-α e a lipoproteína A
sugerindo uma associação entre a resposta inflamatória e dislipidemia influenciando na
patogênese da aterosclerose.
O aumento nos níveis séricos da IL-6 possui um papel potencial na patogênese da
aterosclerose (Abeywardena et al., 2009). Desta maneira, o polimorfismo da posição –174 é
um dos mais estudados devido ao aumento dos níveis séricos e sua associação com
manifestações da doença arterial coronariana (Brull et al., 2001; Myśliwska et al., 2006;
Abeywardena et al., 2009).
Antonicelli et al. (2005) relataram que o genótipo 174*G em homozigose é um fator
de risco para homens de idade avançada desenvolverem infarto agudo do miocárdio e angina
instável. Outro estudo, realizado por Giacconi et al. (2004), mostrou que pacientes com
aterosclerose e homozigotos para o alelo 174*G apresentaram um grau maior de inflamação
nas artérias e níveis mais elevados de TNF-α e, consequentemente, maior risco de rutura da
placa do que os com genótipo CC ou CG de IL-6.
Em modelos animais, macrófagos e células espumosas da placa de ateroma produzem
IL-8 e este mecanismo pode ser induzido pela quantidade de colesterol existente no interior
dos macrófagos (Wang et al., 1996). Estudos in vitro e in vivo mostram o aumento nos níveis
séricos da IL-8 em indivíduos com doença arterial coronariana e também como efeito adverso
após infarto agudo do miocárdio (Kanda et al., 1996; Dominguez-Rodriguez et al., 2006;
Vogiatzi et al., 2008).
Pieniazek et al. (2001) encontraram níveis de IL-8 significativamente altos no plasma
de pacientes com doença arterial coronariana que apresentaram anticorpos para C.
pneumoniae. No mesmo estudo também foram encontrados níveis mais altos de PrtCR nos
pacientes, porém, sem um resultado estatisticamente significante. Simonini et al. (2000)
encontraram altos níveis de expressão do mRNA da IL-8 em indivíduos submetidos à
aterectomia coronariana.
35
Vogiatzi et al. (2008) pesquisaram a influência dos polimorfismos da IL-8 na
suscetibilidade à doença arterial coronariana e mostraram que o haplótipo AA251TT781 foi
mais frequente em pacientes com síndrome coronária aguda do que naqueles com doença
coronariana estável, sugerindo que a diversidade genética da IL-8 pode influenciar nas
manifestações clínicas da doença.
Com relação ao processo de aterosclerose, ainda não está totalmente esclarecido se a
variabilidade genotípica da IL-10 pode influenciar diretamente no grau de inflamação
presente nos pacientes com doença cardiovascular. Uyemura et al. (1996) observaram a
expressão de IL-10 em algumas placas de ateroma acompanhada de um equilíbrio na secreção
de IL-12 e redução dos danos teciduais. As atividades inibitórias desta citocina ocorrem por
meio de vias de sinalização que agem tanto no silenciamento de fatores de transcrição como
na desestabilização de mRNA (fase pós-transcricional) dos componentes inflamatórios do
sistema imunológico (O'Farrell et al., 1998).
O fato de a IL-10 apresentar uma função de bloqueio da maioria das citocinas próinflamatórias chamou a atenção para a pesquisa cardiovascular. Estudos experimentais
observaram que a administração de IL-10 inibiu o desenvolvimento da aterosclerose em
camundongos, além de promover uma estabilidade de placas de ateroma em estágio avançado
(Caligiuri et al., 2003). Um intenso efeito anti-aterosclerótico foi observado no estudo de Von
der Thusen et al. (2001) quando descreveram que camundongos sem os receptores de LDL,
ao serem submetidos a uma hiper-expressão de IL-10 (seja endotelial ou sistêmica),
apresentaram um quadro de aterosclerose inibido.
Os achados de estudos experimentais são confirmados por alguns estudos in vitro que
mostram a IL-10 inibindo moléculas como CD18 e CD62-L, o que impede a adesão de
monócitos ao tecido endotelial. Esta adesão de monócitos é o primeiro passo para o
recrutamento e invasão da parede vascular por células do sistema imunológico (Girndt &
Kholer, 2003). Outra propriedade associada a IL-10 é o bloqueio de enzimas envolvidas com
a desestabilização da placa de ateroma como as metaloproteinases que são responsáveis por
degradar a matriz extracelular enfraquecendo os vasos e a placa (Lacraz et al., 1995).
Estudos em camundongos demonstram que a infecção por C. pneumoniae pode
estimular o aumento nos níveis de proteínas de fase aguda e citocinas como IL-10 em até 72h
após a infecção intranasal, contribuindo para a progressão de lesões ateroscleróticas
(Campbell et al., 2010). Schumacher et al. (2005) avaliaram a soropositividade para
Chlamydia em pacientes coronarianos e observaram que pacientes com anticorpos contra o
36
LPS de C.pneumoniae apresentaram altos níveis séricos de TNF-α, IL-10, IFN-γ e adesinas
enquanto paciente com anticorpos contra a MOMP não apresentaram elevação significante.
Todos estes achados sugerem uma influência dos polimorfismos genéticos da PrtCR,
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 no desenvolvimento da aterosclerose, assim como alguns estudos
associam também a infecção por Chlamydia como um fator associado a patogênese desta
doença, ainda que exista uma maior necessidade de avaliar de forma conjunta tanto a presença
destes polimorfismos, como a de marcadores de infecção pela bactéria com o objetivo de se
entender se este agente apresenta um papel causal ou de complicador no curso da
aterosclerose.
37
1.8. OBJETIVOS
1.8.1. Objetivo Geral
Investigar a participação da C. pneumoniae e da C. trachomatis e o perfil genético do
hospedeiro na etiologia da formação do ateroma em indivíduos com doença cardíaca.
1.8.2. Objetivos Específicos
- Descrever as características sociais e demográficas de pacientes com doença
cardíaca;
- Descrever e comparar a frequência de anticorpos contra C. trachomatis e C.
pneumoniae nos diferentes grupos populacionais estudados;
- Detectar a presença da infecção por C. trachomatis e C. pneumoniae em diferentes
tipos de amostras de pacientes apresentando doença cardíaca;
- Descrever os polimorfismos de região promotora dos genes de PrtCR, IL-6, TNF-α,
IL-8 e IL-10 nos diferentes grupos estudados;
- Buscar associação entre os diferentes genótipos encontrados com a presença de
anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae;
- Quantificar os níveis plasmáticos de PrtCR e IL-6, e os níveis de expressão gênica
de TNF-α, IL-8 e IL-10;
- Buscar associação entre os níveis plasmáticos, expressão gênica, perfil genotípico e a
presença de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae.
38
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. POPULAÇÃO EXAMINADA
Neste estudo transversal do tipo caso-controle, foi incluído um grupo de pacientes com
doença arterial coronariana apresentando quadro de obstrução arterial grave com ou sem
isquemia (infarto) e outro grupo de pacientes com quadro de valvulopatia cardíaca,
apresentando um quadro de sobrecarga de volume e pressão cardíaca. Os pacientes com
doença coronariana possuíam indicação para cirurgia de revascularização miocárdica e os
pacientes com valvulopatia possuíam indicação cirúrgica para implante de prótese valvular
(mitral ou aórtica).
Os critérios de inclusão dos pacientes foram: indivíduos internados com indicação
para um dos procedimentos cirúrgicos pela primeira vez e a ausência do uso de antibióticos.
Foram excluídos indivíduos com quadros clínicos dentro do interesse do projeto, porém sem
indicação para cirurgia, indivíduos indicados para cirurgia de repetição e os que estavam
submetidos a antibióticos no pré-operatório.
As amostras foram coletadas obedecendo aos cálculos de amostragem usando o
programa BioEstat versão 5.3 (Ayres et al., 2011), utilizando o cálculo para o tamanho
amostral para proporções (uma amostra), com poder de teste de 0,90 e nível alfa de 0,01. A
estimativa do estudo foi de incluir pelo menos 100 pessoas apresentando quadro de doença
arterial coronariana e foi obtido um total de 159 pacientes deste grupo. Para o grupo de troca
de válvula a estimativa de coleta era de 50 pacientes, sendo que foram obtidos 71 pacientes
deste grupo.
Foi formado um grupo controle com 300 indivíduos doadores de sangue oriundos do
Centro de Hemoterapia e Hematologia do Pará – Fundação HEMOPA com finalidade de
comparar a freqüência da presença de anticorpos, dos polimorfismos, os níveis plasmáticos e
a expressão gênica. O grupo de doadores de sangue foi pareado por sexo e idade com o grupo
de pacientes do estudo e durante o exame clínico os indivíduos não apresentavam histórico e
sintomas sugestivos de doença cardíaca.
Todos os indivíduos do estudo (pacientes e controle) tomaram conhecimento sobre o
projeto e aqueles que concordaram em participar do estudo assinaram um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, TCLE (Apêndice 01). O grupo de pacientes ainda
respondeu um questionário epidemiológico para obtenção de informações cadastrais,
demográficas, socioeconômicas e comportamentais (Apêndice 02).
39
2.2. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras de pacientes foram coletadas em tres hospitais da cidade de Belém:
Fundação Hospital das Clínicas Gaspar Viana, Hospital da Ordem Terceira e Hospital
Beneficente Portuguesa. O período de coleta destas amostras foi de novembro de 2010 a julho
de 2012. O grupo controle foi coletado no período de junho a outubro de 2012.
Para ambos os grupos (pacientes e controle), foi coletada uma amostra de sangue (10
mL) por punção venosa, utilizando tubos a vácuo com anticoagulante (EDTA), com a
finalidade de dosagens bioquímicas, quantificação de linfócitos T CD4+ e TCD8+, detecção
de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae, análise de polimorfismos, dosagens
plasmáticas e da expressão de mRNA de marcadores da resposta inflamatória.
Fragmentos de placa de ateroma, artéria aorta, bem como da válvula cardíaca foram
obtidos de determinados pacientes quando possível, durante o procedimento cirúrgico. Dos
159 pacientes submetidos à revascularização do miocárdio, foi possível coletar placas de
ateroma de 20 indivíduos (12,6%), através de endarterectomia de coronária. Foi possível
coletar fragmentos de aorta de outros 35 indivíduos (22%) durante o processo de anastomose
proximal da aorta ascendente. Dos 71 pacientes submetidos à troca de válvula, foi possível
coletar 26 fragmentos de válvula (36,6%), totalizando uma coleta total de 81 fragmentos de
tecido (35,2%). Tanto as amostras de sangue (pacientes e controle) como os fragmentos
cirúrgicos dos pacientes foram encaminhadas ao Laboratório de Virologia do Instituto de
Ciências Biológicas da UFPA, conservadas em um total de 1,2 mL de conservante de material
genético RNAlater® (Invitrogen, EUA), e estocadas a -70 oC até o momento do uso.
2.3. ENSAIOS SOROLÓGICOS PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS PARA C.
TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE
2.3.1. Ensaio Imunoenzimático (EIE)
Para a detecção de anticorpos anti-C. trachomatis e anti-C. pneumoniae foi utilizado o
ensaio imunoenzimático indireto qualitativo, do tipo ELISA – NovaLisa TM - Chlamydia
trachomatis IgG e IgM (NovaTec Immundiagnostica GmbH, Germany) e para Chlamydia
pneumoniae o teste -
NovaLisa TM - Chlamydia pneumoniae IgG e IgM (NovaTec
Immundiagnostica GmbH, Germany) de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio de
C. trachomatis utiliza antígenos purificados do sorotipo L2 (cepa 434) aderidos ao fundo da
placa. O ensaio de C. pneumoniae utiliza antígenos purificados da cepa TWAR-183.
40
2.3.2. Microimunofluorescência (MIF)
Uma amostragem de pacientes (35%) teve seus plasmas submetidos à confirmação do
resultado do ELISA através da MIF, em diluição inicial de 1:8 em solução salina tamponada.
Para realização da técnica, as lâminas foram preparadas no Laboratório de Virologia,
utilizando-se como antígenos, corpúsculos elementares e quinze sorotipos C. trachomatis e
antígeno da C. pneumoniae (Washington Research Foundation, Seatle, Washington, USA). O
teste seguiu uma metodologia padronizada e aplicada anteriormente (Ishak & Ishak, 2001).
Volumes de 0,1mL de suspensões de gema de ovo foram adicionado a iguais volumes
de suspensões antigênicas e homogeneizadas em vórtex com o objetivo de facilitar a fixação
da suspensão de antígeno sobre a lâmina e a visualização do material ao microscópio. Para
elaboração das lâminas, foi utilizado um molde com quinze pontos divididos, com um
espaçamento mínimo de 5 mm de distância, para orientar a distribuição dos antígenos. Com o
auxílio de uma pena para tinta nanquim (Hunt Artist’s Pens 104 n 9404), cada um dos quinze
antígenos foi distribuído sobre a lâmina e após 30 minutos de secagem, a temperatura
ambiente, as lâminas foram fixadas em acetona, durante 15 minutos, em temperatura
ambiente.
Após o preparo, o soro diluído a 1:8 foi depositado sobre cada um dos sorotipos; as
lâminas, então, foram incubadas a 37 °C, em câmara úmida, durante 30 minutos e após esse
período foram lavadas em PBS por quatro vezes por 5 minutos e em seguida lavadas tres
vezes em água destilada por 1 minuto. Após a lavagem, foi realizada a adição do conjugado
(previamente titulado), com atividade específica anti-IgG/IgM humana, acrescido com
isotiocianato de fluoresceína (FITC). Em seguida, as lâminas foram incubadas novamente e
sequencialmente submetidas a um novo ciclo de lavagens e montagem, utilizando glicerina
tamponada (pH 9,0). As lâminas foram visualizadas em microscópio de fluorescência
(Olimpus BX41, Brasil) e as amostras que mostraram fluorescência clara, nítida e esverdeada
frente a qualquer um dos sorotipos foram consideradas positivas. Foi levando em
consideração o número de CE apresentando fluorescência e a intensidade da mesma.
41
2.4. IDENTIFICAÇÃO DA INFECÇÃO POR C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE
2.4.1. Extração de DNA
Para a extração de DNA a partir dos fragmentos teciduais obtidos por cirurgia, foi
utilizado o kit de extração de ácido nucléico QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany)
seguindo as instruções do fabricante.
2.4.2. PCR em Tempo Real
A presença de C. pneumoniae e C. trachomatis nos 81 fragmentos de tecido foi
pesquisada por meio da técnica de PCR em tempo real utilizando o kit Real Time Q-PCR
Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnostic, Italy). Para o kit de detecção de C. trachomatis, foi
feita uma reação de amplificação específica para a região do plasmídeo inerte (cryptic
plasmid) (cerca de 7-10 cópias/célula). Para a C. pneumoniae foi feita uma reação para uma
região específica do gene ompA. Todas as reações foram acompanhadas de um controle
positivo para cada espécie, controle negativo, além de um controle interno de β-globina. Os
parâmetros de amplificação aceitáveis do kit estão demonstrados na Tabela 1. O aparelho
utilizado nas reações foi o Step One PLUS Sequence Detector (PE Applied Biosystems,
Foster City, CA, E.U.A.) seguindo o protocolo do fabricante.
Tabela 1 – Requisitos de amplificação de C. trachomatis e C. pneumoniae por PCR em
tempo real.
Ciclo limiar da amostra
C. trachomatis
C. pneumoniae
(FAM)
Indeterminado
Determinado
B- globina
(VIC)
Adequação
da amostra
DNA de
C. trachomatis
Resultado do teste
C.
pneumoniae
CT>35/indeterminado
Inadequada
Inválido
---
CT≤35
Adequada
Válido, Negativo
Não detectado
CT>35/indeterminado
Adequada
Válido, Positivo
Presente
CT≤35
Adequada
Válido, Positivo
Presente
42
2.5. IDENTIFICAÇÃO DOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE MARCADORES DA
RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA
2.5.1. Extração de DNA
Todas as amostras de sangue foram submetidas à extração de DNA a partir de
leucócitos do sangue periférico. O método utilizado foi o de fenol-clorofórmio, cujo protocolo
foi adaptado (Sambrook & Russell, 2006), seguindo as etapas de lise celular, precipitação de
proteínas, precipitação e hidratação do DNA (Apêndice 3).
2.5.2. Identificação de Polimorfismo nos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6
Para a análise de polimorfismos dos genes do PrtCR, TNF-α e IL-6, foi utilizada a
PCR convencional seguida de análise de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),
em que o produto amplificado foi submetido a uma incubação com endonucleases de restrição
com posterior visualização e comparação dos tamanhos de fragmentos gerados. Foram
selecionadas para investigação regiões promotoras de cada gene. Para a PrtCR foi selecionado
o SNP rs2794521 (−717T>C); para o TNF-α foi selecionado o polimorfismo rs1800629
(−308G>A); para a IL-6 foi selecionado o polimorfismo rs1800795 (−174G>C).
As reações de amplificação foram adaptadas a partir de informações prévias (Allen et
al., 2000; Brull et al., 2003; Olomolaiye et al., 1998; Vogiatzi et al., 2008) (Tabelas 2, 3 e 4).
As amplificações foram realizadas no equipamento termociclador da Mastercycler Personal,
Eppendorf. Cada produto amplificado foi submetido à digestão enzimática com suas
respectivas endonucleases de restrição (Tabela 5) e foram visualizados após eletroforese (100
V/45 minutos) em gel de agarose a 3%, em tampão TAE 1x (TAE 40x estoque – TrisBase 1,6
M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água desionizada), contendo 5 µL de
brometo de etídio (10mg/mL), mediante a utilização de transiluminador com fonte de luz
ultra-violeta.
43
Tabela 2 – Sequências dos iniciadores utilizados na amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α
e IL-6.
Sistema
Sequência dos iniciadores
PrtCR -717
F: 5'-ACTGGACTTTTACTGTCAGGGC-3'
R: 5': -ATTCCCATCTATGAGTGAGAACCT-3'
TNF-α -308
F: 5'- AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT -3'
R: 5'- TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG -3'
IL-6 -174
F: 5′-TTGTCAAGACATGCCAAGTGCT-3′
R: 5'-GCCTCAGAGACATCTCCAGTCC-3'
Tabela 3 – Protocolo de reação utilizada na amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6.
Sistema
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
Nº de Ciclos Etapa Final
Etapas 2-4
PrtCR -717
TNF-α -308
IL-6 -174
95°C
95°C
60°C
72°C
5 min
30 seg
40 seg
1 min
95°C
94°C
53°C
72°C
5 min
30 seg
30 seg
50 seg
95°C
95°C
59°C
72°C
5 min
30 seg
45 seg
45 seg
40 ciclos
72°C
10 min
30 ciclos
72°C
10 min
35 ciclos
72°C
10 min
44
Tabela 4 – Concentração de reagentes utilizados por reação para amplificação dos genes de
PrtCR, TNF-α e IL-6.
Reagentes
TNF-α
PrtCR
IL-6
Tampão
1x
1x
1x
MgCl2
1,5mM
1,5mM
1,5mM
DNTP
200µM
200µM
200µM
Primer
Direto
Primer
Reverso
Taq
200nM
200nM
200nM
200nM
200nM
200nM
1,5U
2,5U
1,5U
DNA
100ng
100ng
100 ng
Tabela 5 – Endonucleases de restrição utilizadas na análise de RFLP para caracterização de
polimorfismos de PrtCR, TNF-α e IL-6.
Sistema
PrtCR
TNF-α
IL-6
Enzima
BstUI
NcoI
NlaIII
Genótipo
Fragmentos gerados
TT
297 e 244pb
CT
541, 297 e 244pb
CC
541pb
GG
87 e 20pb
AG
107, 87 e 20pb
AA
107pb
GG
169pb
GC
169, 87 e 80pb
CC
87 e 80pb
45
As Figuras 9, 10 e 11 demonstram os padrões de migração dos fragmentos após
amplificação, tratamento com enzimas de restrição e eletroforese, para os polimorfismos
genéticos de PrtCR, TNF-α e IL-6, respectivamente.
Figura 9 − Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de PrtCR. (A): Produto da PCR de
PrtCR em gel de agarose a 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2-4) Produto
amplificado apresentando 541 pb. (B): Produto de RFLP de PrtCR em gel de agarose 3%. 1)
Marcador de peso molecular de 100 pb; 2) Padrão de migração para o genótipo TT ; 3) Padrão
de migração para o genótipo CT; 4) Padrão de migração para o genótipo CC.
Figura 10 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de TNF-α. (A): Produto da PCR de
TNF-α em gel de agarose a 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2-4) Produto
amplificado apresentando 107 pb. (B): Produto de RFLP de TNF-α em gel de agarose 3%. 1)
Marcador de peso molecular de 50 pb; 2) Padrão de migração para o genótipo GG ; 3) Padrão
de migração para o genótipo AG; 4) Padrão de migração para o genótipo AA.
46
Figura 11 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de IL-6. (A): Produto da PCR de IL6 em gel de agarose a 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2-4) Produto amplificado
apresentando 169 pb. (B): Produto de RFLP de IL-6 em gel de agarose 3%. 1) Marcador de
peso molecular de 50 pb; 2) Padrão de migração para o genótipo GG ; 3) Padrão de migração
para o genótipo GC; 4) Padrão de migração para o genótipo CC.
2.5.3. Identificação de polimorfismo nos genes de IL-8 e IL-10
Para as citocinas IL-8 e IL-10, a metodologia utilizada para a caracterização dos
polimorfismos foi a PCR em Tempo Real usando ensaios pré-fabricados TaqMan® SNP
Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.) (Tabela 6). Para IL-8 foi
selecionado o SNP rs4073 (−251T>A). Para a IL-10 foi selecionado o polimorfismo
rs1800896 (−1082A>G). As reações ocorreram no aparelho StepOnePLUS™Real-Time PCR
System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As temperaturas seguiram as orientações
do fabricante: 10 minutos a 95 °C, 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C, em um total de 40
ciclos.
Tabela 6 – Ensaios utilizados para identificação de polimorfismos de região promotora de
IL−8 e IL−10.
Sistema
IL-8
IL-10
Identificação do SNP (rs)
rs4073
rs1800896
Identificação do ensaio
C_11748116_10
C_1747360_10
47
2.6. DOSAGEM DE NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR E IL-6
Todas as dosagens foram realizadas em amostra de plasma, os quais foram
descongelados apenas no momento do uso. A dosagem de PrtCR foi realizada nas 230
amostras de pacientes (159 de RM e 71 de TV) e em 196 indivíduos do grupo controle
selecionados aleatoriamente, por meio do método de imunoturbidimetria utilizando-se o kit
PCR-U hs DiaSys® em sistema automatizado Architect c8000/Abbott®. Os testes foram
realizados no Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário João de Barros
Barreto da UFPA, Belém, Pará.
A dosagen de IL-6 foi realizada em 33 amostras dos pacientes (19 de RM e 14 de TV)
e em 28 indivíduos do grupo controle em duplicata por meio de um ELISA do tipo sanduíche,
utilizando-se o kit Human IL-6 ELISA (Novex®, Life Technologies) que utiliza anticorpos
monoclonais específicos para IL-6 aderidos no fundo de cada poço da placa. Os testes foram
realizados no Laboratório de Virologia da UFPA, obedecendo as instruções do fabricante.
Todas as amostras foram selecionadas seguindo os critérios descritos na seção 2.7, exceto a
dosagem de PrtCR.
2.7. QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE mRNA de TNF-α, IL-8 e IL-10 PARA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
2.7.1. Seleção de amostras
A quantificação relativa de mRNA de TNF-α, IL-8 e IL-10 foi feita a partir de uma
seleção de amostras, obedecendo critérios de presença de anticorpos para Chlamydia e o
perfil genotípico dos polimorfismos (amostras não-probabilísticas selecionadas por cotas). As
amostras foram categorizadas inicialmente em: 1) positivas apenas para C. trachomatis; 2)
positivas apenas para C. pneumoniae; 3) positivas para ambas as espécies; 4) negativas para a
presença de anticorpos para Chlamydia. Em cada um destes grupos foram selecionadas tres
amostras de cada genótipo, de forma aleatória, com o auxílio do programa BioEstat 5.3
(Ayres et al., 2011).
2.7.2. Extração de RNA Total
O RNA foi extraído a partir da camada leucocitária do sangue periférico utilizando-se
o kit de Extração de RNA Total RNA purification kit (Norgen, Biotek Corporation®, Canadá)
seguindo as instruções do fabricante.
48
A concentração do RNA extraído (ng/µL) foi obtida por análise no fluorímetro
QubitTM Quantitation Platform (Invitrogen®, EUA) de acordo com as especificações do
fabricante. A integridade do RNA foi observada em gel de agarose a 1% corado com brometo
de etídio. Após a verificação da concentração e integridade as amostras de RNA total tiveram
sua concentração igualadas a 60ng/µL para posterior síntese de cDNA.
2.7.3. Transcrição Reversa para a Síntese de DNA Complementar (cDNA)
O RNA extraído foi convertido em cDNA utilizando o kit High Capacity cDNA
Reverse Transcription with RNAse Inhibitor (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
Para cada reação foi utilizado o equivalente a 1µg do RNA total, 2µL de 10X RT Buffer, 0,8
µL de 25X dNTP Mix (100nM), 2µL de 10X RT Random Primer, 1 µL de MultiScribeTM
Reverse Transcriptase, 1 µL de RNaseOUTTM e 3,2 µL de água ultra-pura, totalizando um
volume final de 20 μL.
A reação ocorreu em termociclador da Mastercycler Personal, Eppendorf, com
programação para um ciclo de 10min a 25 °C seguido de duas horas a 37 °C, com temperatura
final de 85 °C por 5min. O cDNA foi posteriormente estocado a -20 °C até o momento do
uso.
2.7.4. Teste de Eficiência dos Ensaios de PCR em Tempo Real
A avaliação dos níveis de expressão dos genes de interesse ocorreu por meio da
quantificação relativa do mRNA de cada gene, utilizando-se como método a PCR em Tempo
Real. A quantificação relativa da expressão dos genes estudados foi feita utilizando-se o
método de CT comparativo ou ∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001). Neste tipo de quantificação
são verificados os níveis de expressão gênica de uma determinada amostra em relação à outra
amostra (denominada de referência) (Livak & Schmittgen, 2001), sendo necessária a seleção
de um gene normalizador como referência de expressão constitutiva entre as diferentes
amostras testadas. Neste estudo, o gene de referência selecionado foi o Gliceraldeído-3fosfato desidrogenase (GAPDH).
Foram utilizados os ensaios Taqman® Gene Expression Assay (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA) que são pré-fabricados e contém iniciadores e sondas específicos para
cada gene (Tabela 7). Os iniciadores e sondas para o gene GAPDH estão representados na
Tabela 8. Os ensaios foram submetidos a uma validação onde foi possível observar que a
eficiência das amplificações tanto dos genes alvos como do gene referência foram
49
aproximadamente iguais, condição que funciona como um requisito que para permitir o uso
do método CT comparativo na população examinada.
Para o cálculo da eficiência foi utilizada a equação E= 10(−1/slope), onde “E” representa
a eficiência; e slope representa um fator que mede a taxa de aumento do amplicon a cada ciclo
durante a fase exponencial de amplificação.
Tabela 7 – Identificação dos ensaios utilizados para PCR em Tempo Real Quantitativo.
Sistema
TNF-α
IL-8
IL-10
Método
TaqMan Gene Expression
Assays
Assays
Assays
Especificação do Método
Hs00174128_m1
Hs00174103_m1
Hs00174086_m1
Tabela 8 – Identificação de iniciadores e sonda para amplificação do gene referência
GAPDH.
Sistema GAPDH
Sequência nucleotídica
Iniciador Direto
5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
Iniciador Reverso
5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
Sonda
5’-(F)-CAAGCTTCCCGTTCT CAGCC-(T) -3
2.7.5. PCR em Tempo Real Quantitativo
Os ensaios de expressão dos genes alvos e do gene referência, tanto dos pacientes
como do grupo controle, foram realizados em poços separados (singleplex), conforme
protocolo estabelecido pelo fabricante, sendo que cada amostra foi testada em triplicata.
Foram considerados valores de CT válidos somente naqueles em que o desvio padrão foi
encontrado nas triplicatas foi menor que 0,5. As reações ocorreram no aparelho
StepOnePLUS™Real-Time PCR System (Appllied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A
tabela 9 demonstra os volumes utilizados em cada reação tanto para a amplificação dos genes
alvos como para amplificação do GAPDH. As condições de termociclagem estabelecidas pelo
50
fabricante foram: um ciclo de 2 min a 50 °C seguido de 10 min a 95 °C, e mais 40 ciclos de
95 °C por 15 seg e 60 °C por 1min.
Tabela 9 – Volumes (µL) de reagentes utilizados por reação na PCR em Tempo Real
Quantitativa.
Reagentes
TNF-α
IL-8
IL-10
GAPDH
Água
10,5
10,5
10,5
9,5
TaqMan® Master Mix
15
15
15
15
Ensaio
(Primer+Sonda)
Primer Direto
1,5
1,5
1,5
-
-
-
-
1,0
Primer Reverso
-
-
-
1,0
Sonda
-
-
-
0,5
DNA
3,0
3,0
3,0
3,0
Total
30 µL
30 µL
30 µL
30µL
As análises de quantificação relativa pelo método de CT comparativo foram feitas
utilizando a equação RQ: 2-∆∆CT onde o ∆CT de uma determinada amostra, bem como da
amostra referência é:
∆CT: CT Gene de interesse - CTGAPDH
Portanto, o ∆∆CT: ∆CT da amostra - ∆CT da amostra referência. As análises foram
feitas no software Step One TM vs.2.0 (Appllied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
2.8. MÉTODOS ESTATÍSTICOS
Todas as informações obtidas por meio do questionário epidemiológico foram
inseridas em um banco de dados criado no programa Microsoft Acess vs. 2007. Para comparar
os resultados sorológicos entre os diferentes grupos examinados foi realizado o teste de Quiquadrado. Para avaliar se as frequências genotípicas estavam dentro da uma distribuição
normal foi realizado o cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A comparação entre os
diferentes genótipos de marcadores pró e anti-inflamatórios e os marcadores sorológicos de
51
infecção por C. trachomatis e C. pneumoniae foi feita pelo do Teste Odds Ratio. Para associar
os níveis plasmáticos, de expressão gênica de marcadores pró e anti-inflamatórios com os
marcadores sorológicos de infecção por C. trachomatis e C.pneumoniae foram utilizados os
testes não paramétricos Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Foram consideradas associações
significantes aquelas com valor de p<0,05. Todos os testes foram efetuados por meio do
programa BioEstat 5.3 (Ayres et al., 2011).
2.9. ASPECTOS ÉTICOS
O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de
Hemoterapia e Hematologia do Pará – Fundação Hemopa e obedeceu as resoluções vigentes
196/1996 e 347/2005, ambas do Conselho Nacional de Saúde, conforme cópia de parecer em
anexo (Anexo 01). Todas as amostras foram obtidas mediante a assinatura de um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 01).
52
3. RESULTADOS
3.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA
3.1.1. Perfil demográfico e social dos pacientes com doença cardíaca e grupo controle
O grupo de pacientes coronarianos indicados para revascularização miocárdica (RM)
(n=159) foi constituído de 109 homens e 50 mulheres, enquanto o grupo submetido à cirurgia
para troca de válvula mitral ou aórtica (TV) (n=71) foi formado por 30 homens e 41 mulheres
(Tabela 10). A faixa etária do grupo RM variou de 36 a 79 anos, com média de 60,4 anos. No
grupo de TV, a idade variou de 14 a 80 anos, com média de 45,6 anos.
A maioria dos pacientes de RM (69,9% - 107/153) declarou seu estado civil como
casado. Para o grupo de TV, a maior frequência foi de solteiros (44,9% - 31/69) (Tabela 10).
Em ambos os grupos foi observado que a maior frequência possuía nível fundamental
incompleto (49,7% - 78/157 e 48,6% - 34/70, respectivamente) e a maioria relatou ser
paraense, (79,2% - 118/149 e 75,7% - 53/70, respectivamente). A renda familiar variou de
menos de um salário mínimo até quatro ou mais salários, sendo que a maioria foi incluída em
uma faixa de um a tres salários (Tabela 10).
O grupo controle foi constituído de 150 (50%) homens e 150 (50%) mulheres com
idade que variou de 24 até 68 anos com média de 40,3 anos.
53
Tabela 10 – Características demográficas e sociais de pacientes cardíacos atendidos em três
unidades hospitalares e um grupo controle em Belém, PA.
Características demográficas e
sociais
Revascularização
Miocárdica
(RM)
n=159
n (%)
Troca de
Válvula
(TV)
n=71
n (%)
Grupo
Controle
n=300
n(%)
Sexo
Masculino
Feminino
109 (68,5)
50 (31,5)
30 (42,3)
41 (57,7)
150(50,0)
150(50,0)
Faixa etária
<40 anos
41 a 50 anos
>51 anos
4 (2,5)
21 (13,2)
134 (84,3)
28 (39,5)
16 (22,5)
27 (38,0)
182(60,7)
72(24,0)
46(15,3)
Estado civil
Solteiro
Casado
Divorciado/Viúvo
Sem informação
20 (13,1)
107 (69,9)
26 (17)
6
31 (44,9)
28 (40,6)
10 (14,5)
2
---------
Escolaridade
Não alfabetizado
Alfabetizado
Fundamental
incompleto
Fundamental
completo
Médio incompleto
Médio completo
Superior incompleto
Superior completo
Sem informação
10 (6,4)
16 (10,2)
7 (10)
3 (4,3)
-----
78 (49,7)
34 (48,6)
---
20 (12,7)
4 (5,7)
---
10 (6,4)
19 (12,1)
0 (0,0)
4 (2,5)
2
9 (12,9)
11 (15,7)
1 (1,4)
1 (1,4)
1
-----------
Pará
Outros
Sem informação
118 (79,2)
31 (20,8)
10
53 (75,7)
17 (24,3)
1
-------
<1 salário
1 a 3 salários
≥ 4 salários
Sem informação
22 (14,5)
108 (71)
22 (14,5)
7
18 (26,1)
50 (72,5)
1 (1,4)
2
---------
Naturalidade
Renda
familiar
*Não considerado para o cálculo estatístico
54
3.2. SOROPREVALÊNCIA DE ANTICORPOS PARA C. TRACHOMATIS E C.
PNEUMONIAE EM PACIENTES COM DOENÇA CARDÍACA E NO GRUPO
CONTROLE
A soroprevalência de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae foram obtidas
por ELISA e confirmadas pela MIF, onde se observou total concordância entre as técnicas
descartando a possibilidade de reações cruzadas. Os resultados sorológicos estão
demonstrados na Tabela 11. Os casos com sorologia indeterminada foram excluídos na
realização de testes estatísticos.
A presença de anticorpos (IgG e/ou IgM) para C. trachomatis foi observada em
30,6% (48/157) dos pacientes submetidos à revascularização. Os pacientes submetidos à troca
de válvula apresentaram uma prevalência de 20,3% (14/69). No grupo controle foi observada
uma prevalência de 36,7% (103/281) que mostrou uma frequência de anticorpos
significativamente maior quando comparado aos pacientes com valvulopatias (p=0,014).
A prevalência de anticorpos (IgG e/ou IgM) para C. pneumoniae foi de 83,6%
(133/159) entre os pacientes submetidos à revascularização, 84,5% (60/71) entre os pacientes
de troca de válvula. O grupo controle apresentou uma prevalência de 80,3% (237/295).
Tabela 11 – Frequência de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae entre pacientes e
o grupo controle.
C. trachomatis
C. pneumoniae
Resultados
Sorológicos
RM
n=159
n(%)
TV
n=71
n(%)
Controle
n=300
n(%)
p1
p2
p3
Positivo
48(30,6)
14(20,3)
103(36,7)
0,2383
0,014
0,1516
Negativo
109(69,4)
55(79,7)
178(63,3)
Indeterminado*
02(1,2)
02(2,8)
19(6,3)
Positivo
133(83,6)
60(84,5)
237(80,3)
0,4596
0,5240
0,9757
Negativo
26(16,4)
11(15,5)
58(19,7)
Indeterminado*
-
-
05(3,3)
* Não considerado para cálculo estatístico
RM= Revascularização Miocárdica; TV= Troca de Válvula; p1= RM vs. Controle; p2= TV vs.
Controle; p3= RM vs. TV
55
3.3. PRESENÇA DE DNA DE C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE EM
FRAGMENTOS TECIDUAIS DE PACIENTES COM DOENÇA CARDÍACA
Dentre as 81 amostras de fragmentos de tecido submetidas a PCR em tempo real, não
foi observada detecção de DNA de C. pneumoniae em nenhuma das amostras, entretanto, o
DNA do plasmídio críptico de C. trachomatis foi detectado em seis amostras (7,4%).
Dentre as seis amostras, quatro eram provenientes de fragmentos de aorta e duas de
válvula mitral (Tabela 12). Não foi detectada a presença de DNA em placas de ateroma. A
comparação entre os resultados moleculares e sorológicos é observada na tabela 12. As curvas
de amplificação dos controles e amostras tanto para o gene da β-globina como para o alvo das
clamídias está representado nas Figuras 12.
Tabela 12 – Descrição dos resultados sorológicos para C. trachomatis em pacientes cardíacos
com amostras teciduais positivas para o DNA do plasmídio críptico de C. trachomatis.
Paciente
Amostra
Resultado Sorológico
C. trachomatis IgG
C.trachomatis IgM
Resultado (qPCR)
RM
Aorta
positivo
negativo
positivo
RM
Aorta
positivo
negativo
positivo
RM
Aorta
positivo
negativo
positivo
RM
Aorta
negativo
positivo
positivo
TV
V. Mitral
negativo
positivo
positivo
TV
V. Mitral
positivo
negativo
positivo
RM= Revascularização Miocárdica; TV= Troca de Válvula
56
Figura 12 – Curva de amplificação de PCR em tempo real para C. pneumoniae e
C.trachomatis. (A): Controle positivo para C.pneumoniae e C.trachomatis, respectivamente.
(B): Amostras negativas para C.trachomatis com amplificação do controle interno de
β−globina. (C): Amostras negativas para C.pneumoniae com amplificação do controle interno
de β−globina. (D): Amostras positivas para C.trachomatis.
57
3.4. CARACTERIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DE PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10
EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO CONTROLE
A distribuição da frequência de genótipos e alelos nos tres grupos investigados é
apresentada na Tabela 13. As frequências genotípicas tanto da população de pacientes (RM e
TV) como do grupo controle estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,01); exceto o
polimorfismo de IL-6 (rs1800795) em que os dois grupos de pacientes cardíacos apresentaram
uma quantidade maior do genótipo GG em relação aos demais (p<0,0001). A frequência
observada de genótipo GC foi menor do que a frequência esperada (p<0,0001).
A análise de Odds Ratio (OR) mostra que para IL-6, existe um número muito maior do
genótipo GG nos grupos RM e TV quando comparado com o grupo controle (84,28%,
84,51% e 69%, respectivamente) e esta diferença indica que portadores do alelo G em
homozigose apresentam duas vezes mais chances de desenvolver doença cardíaca
(coronariana e valvulopatia) do que os portadores de outros genótipos. Observa-se ainda uma
diferença na distribuição do genótipo heterozigoto (GC) entre os mesmos grupos
(RM=11,95%, TV=9,86% e Controle=28,33%) que, apararentemente, protege o indivíduo e
diminui as chances de desenvolvimento de doença cardíaca (valores de OR menores que 1 e
significância estatística) (Tabela 13).
A distribuição dos genótipos para o polimorfismo de IL-8 (rs4073) mostrou uma
frequência proporcional maior do genótipo AT no grupo controle e que foi estatisticamente
significante (p=0,0200) quando comparado com o grupo de TV (50%, 33,80%,
respectivamente). A comparação de frequências do genótipo AA entre os grupos TV
(28,17%) e RM (15,09%) também se mostrou estatisticamente significativa (p=0,0318).
58
Tabela 13 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, Il-8 e IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em
Belém, PA.
Perfil Genotípico e
Alélico
PrtCR rs2794521 (T>C)
TT
CT
CC
*T
*C
TNF-a rs1800629 (G>A)
GG
AG
AA
*G
*A
IL-6 rs1800795 (G>C)
GG
GC
CC
*G
*C
IL-8 rs4073 (T>A)
TT
AT
AA
*T
*A
IL-10 rs1800896 (A>G)
Revascularização
(n:159)
n (%)
Troca de válvula
(n:71)
n (%)
Controle
(n:300)
n (%)
98 (61,64)
54 (33,96)
7 (4,40)
250 (78,62)
68 (21,38)
41 (57,75)
29 (40,84)
1 (1,41)
111 (78,17)
31 (21,83)
112 (70,44)
43 (27,04)
4 (2,52)
267 (83,96)
51 (16,04)
OR (p1)
OR (p2)
OR (p3)
189 (63,00)
103 (34,33)
8 (2,67)
481 (80,17)
119 (19,83)
0,9435 (0,8524)
0,9836 (0,9811)
1,6809 (0,4719)
0,9096 (0,6392)
0,8026 (0,4939)
1,0463 (0,9711)
1,3206 (0,3720)
0,8859 (0,6768)
1,1755 (0,6809)
0,7448 (0,3923)
3,2237 (0,4501)
0,9739 (0,9881)
50 (70,42)
20 (28,17)
1 (1,41)
120 (84,51)
22 (15,49)
222 (74,00)
69 (23,00)
9 (3,00)
513 (85,5)
87 (14,5)
0,8373 (0,4808)
1,2410 (0,3977)
0,8344 (0,9985)
0,8879 (0,6008)
0,8366 (0,6429)
1,3129 (0,4457)
0,4619 (0,7360)
0,9250 (0,8660)
1,0009 (0,8779)
0,9453 (0,9867)
1,8065 (0,9661)
0,9598 (0,9923)
134 (84,28)
19 (11,95)
6 (3,77)
287 (90,25)
31 (9,75)
60 (84,51)
7 (9,86)
4 (5,63)
127 (89,44)
15 (10,56)
207 (69,00)
85 (28,33)
8 (2,67)
499 (83,17)
101 (16,83)
2,4081 (0,0006)
0,3433 (0,0001)
1,4314 (0,7107)
1,8739 (0,0049)
2,4506 (0,0135)
0,2767 (0,0020)
2,1791 (0,3693)
1,7137 (0,0852)
0,9827 (0,8792)
1,2408 (0,8125)
0,6569 (0,7725)
1,0935 (0,9196)
59 (37,11)
76 (47,80)
24 (15,09)
194 (61,01)
124 (38,99)
27 (38,03)
24 (33,80)
20 (28,17)
78 (54,93)
64 (45,07)
96 (32,00)
150 (50,00)
54 (18,00)
342 (57,00)
258 (43,00)
1,2538 (0,3187)
0,9157 (0,7258)
0,8099 (0,5105)
1,1802 (0,2707)
1,3040 (0,4065)
0,5106 (0,0200)
1,7865 (0,0779)
0,9194 (0,7237)
0,9615 (0,9887)
1,7932 (0,0667)
0,4533 (0,0318)
1,2837 (0,2618)
79 (49,69)
32 (45,07)
164 (54,67)
0,8189 (0,3581)
0,6804 (0,1854)
1,2035 (0,6141)
AA
63 (39,62)
29 (40,85)
109 (36,33)
1,1499 (0,5542)
1,2099 (0,5682)
0,9504 (0,9768)
AG
17 (10,69)
10 (14,08)
27 (9,00)
1,2105 (0,6751)
1,0504 (0,9379)
0,7303 (0,6054)
GG
221 (69,5)
93 (65,49)
437 (72,83)
0,8498 (0,3219)
0,7079 (0,1015)
1,2004 (0,4570)
*A
97 (30,5)
49 (34,51)
163 (27,17)
*G
n= número de indivíduos analisados; OR= valor de Odds Ratio; p1: valor de p da Revascularização vs. Grupo Controle; p2: valor de p da Troca de válvula vs. Controle; p3: valor de p da
Revascularização vs. Troca de válvula.
59
A tabela 14 mostra a comparação de genótipos e alelos levando em consideração os
diferentes grupos (RM, TV e controle) e a distribuição dos grupos de acordo com a presença
de anticorpos para C. trachomatis.
O genótipo GG de IL-6 apresentou frequência significativamente maior no grupo de
pacientes de RM quando comparados ao grupo controle (89,58%, 69,90%, respectivamente,
p=0,0148). Em contrapartida, o genótipo GC foi significativamente maior em sua frequência
no grupo controle do que no grupo de RM (28,16%, 6,25%, respectivamente, p=0,0043). A
frequência do alelo G foi significativamente maior no grupo de RM quando comparado com o
de TV (92,71%, 75%, respectivamente, p=0,0235).
A comparação entre indivíduos que não apresentavbam evidência de infecção prévia
por C. trachomatis, mostrou que o genótipo GG de IL-6 permaneceu em frequência
significativamente maior em pacientes do que no grupo controle (81,65%, 89,09% e 68,54%,
p=0,0211 e p=0,0045, respectivamente), enquanto este último grupo permaneceu
apresentando frequência significativamente maior do genótipo heterozigoto (14,68%, 7,27%,
28,65%, p=0,0101e p=0,0021, respectivamente) (Tabela 15). O genótipo AA de IL-8 mostrou
frequência significativamente maior nos pacientes submetidos a TV quando comparado aos
demais grupos (12,85%, 30,91% e 16,86%, p=0,0377). De forma contrária, o genótipo
heterozigoto estava em menor frequência no grupo de TV quando comparado aos demais
grupos (48,62%, 30,91% e 51,15%, p=0,0134 e p=0,0457).
A distribuição genotípica e alélica dos grupos de acordo com a presença de anticorpos
para C. pneumoniae está representada na tabela 16. O genótipo GG de IL-6 demonstrou
frequência significativamente maior no grupo de pacientes quando comparado com o grupo
controle (84,96%, 85,00% e 68,78%, p=0,0009 e p=0,0193, respectivamente), indicando um
risco duas vezes maior de desenvolvimento de doença cardíaca na presença de marcadores de
infecção prévia por C. pneumoniae. O genótipo GC foi significativamente maior em sua
frequência no grupo controle do que no grupo de RM e TV (11,28%, 8,83% e 28,69%,
p=0,0002 e p=0,0019).
O genótipo AT de IL-8 apresentou frequência significativamente maior no grupo
controle quando comparado com a o grupo de TV (49,37%, 30%, p=0,0109) enquanto o
genótipo AA teve maior frequência no grupo de TV do que no grupo de RM (30%, 15,79%,
p=0,0373). A comparação entre indivíduos que não apresentavam evidência de infecção
prévia por C.pneumoniae não demonstrou diferenças estatisticamente significantes entre os
diferentes grupos (Tabela 17).
60
Tabela 14 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para
C.trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.
Perfil Genotípico e
Alélico
TT
CT
CC
*T
*C
TNF-a rs1800629 (G>A)
GG
AG
AA
*G
*A
IL-6 rs1800795 (G>C)
GG
GC
CC
*G
*C
IL-8 rs4073 (T>A)
TT
AT
AA
*T
*A
IL-10 rs1800896 (A>G)
Revascularização
C. trachomatis +
(n:48)
n(%)
Troca de válvula
C. trachomatis +
(n:14)
n(%)
População Controle
C. trachomatis +
(n:103)
n(%)
31 (64,58)
14 (29,17)
3 (6,25)
76 (79,17)
20 (20,83)
7 (50,00)
7 (50,00)
0 (0,00)
21 (75,00)
7 (25,00)
35 (72,91)
11 (22,91)
2 (4,16)
81 (84,38)
15 (15,63)
OR (p1)
OR (p2)
OR (p3)
65 (63,11)
35 (33,98)
3 (2,91)
165 (80,1)
41 (19,9)
1,0661 (0,9952)
0,8000 (0,6879)
2,2222 (0,5959)
0,9442 (0,9732)
0,5846 (0,5137)
1,9429 (0,3813)
0,7455 (0,7059)
1,8235 (0,5004)
0,4118 (0,2592)
1,2667 (0,8338)
12 (85,71)
2 (14,29)
0 (0,00)
26 (92,86)
2 (7,14)
81 (78,64)
19 (18,45)
3 (2,91)
181 (87,86)
25 (12,14)
0,7312 (0,5693)
1,3144 (0,6730)
1,4493 (0,9304)
0,7459 (0,5153)
1,6296 (0,7931)
0,7368 (0,9924)
1,7956 (0,6450)
0,4487 (0,5292)
1,7838 (0,7452)
0,4154 (0,4032)
43 (89,58)
3 (6,25)
2 (4,17)
89 (92,71)
7 (7,29)
9 (64,29)
3 (21,43)
2 (14,28)
21 (75,00)
7 (25,00)
72 (69,90)
29 (28,16)
2 (1,94)
173 (83,98)
33 (16,02)
3,7028 (0,0148)
0,1701 (0,0043)
2,1957 (0,8036)
2,4253 (0,0573)
0,7750 (0,9055)
0,6959 (0,8335)
8,4167 (0,1094)
4,0058 (0,2622)
4,7770 (0,0641)
0,2444 (0,2394)
0,2609 (0,4606)
4,2381 (0,0235)
16 (33,33)
23 (47,92)
9 (18,75)
55 (57,29)
41 (42,71)
5 (35,71)
7 (50,00)
2 (14,29)
17 (60,71)
11 (39,29)
30 (29,13)
51 (49,51)
22 (21,36)
111 (53,88)
95 (46,12)
1,2167 (0,7390)
0,9380 (0,9935)
0,8497 (0,8782)
1,1481 (0,6671)
1,3519 (0,8461)
1,0196 (0,8020)
0,6136 (0,7931)
1,3227 (0,6320)
0,9000 (0,8766)
0,9200 (0,8676)
1,3846 (0,9898)
0,8680 (0,9161)
23 (47,92)
6 (42,86)
57 (55,34)
0,7425 (0,4991)
0,6053 (0,5529)
1,2267 (0,9765)
AA
19 (39,58)
7 (50,00)
39 (37,86)
1,0752 (0,9820)
1,6410 (0,5615)
0,6552 (0,6986)
AG
6 (12,50)
1 (7,14)
7 (6,80)
1,9592 (0,3942)
1,0549 (0,6058)
1,8571 (0,9383)
GG
65 (67,71)
19 (67,86)
153 (74,27)
0,7263 (0,2949)
0,7263 (0,2949)
0,9932 (0,8298)
*A
31 (32,29)
9 (32,14)
53 (25,73)
*G
61
Tabela 15 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para
C.trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.
Perfil Genótipico e
alélico
TT
CT
CC
*T
*C
TNF-a rs1800629 (G>A)
GG
AG
AA
*G
*A
IL-6 rs1800795 (G>C)
GG
GC
CC
*G
*C
IL-8 rs4073 (T>A)
TT
AT
AA
*T
*A
IL-10 rs1800896 (A>G)
Revascularização
C. trachomatis −
(n:109)
n(%)
Troca de válvula
C. trachomatis −
(n:55)
n(%)
C. trachomatis −
(n:178)
n(%)
66 (60,55)
39 (35,78)
4 (3,67)
171 (78,44)
47 (21,56)
32 (58,18)
22 (40,00)
1 (1,82)
86 (78,18)
24 (21,82)
77 (70,64)
30 (27,52)
2 (1,84)
184 (84,40)
34 (15,60)
OR (p1)
OR (p2)
OR (p3)
117 (65,73)
56 (31,46)
5 (2,81)
290 (81,46)
66 (18,54)
0,8002 (0,4476)
1,2138 (0,5317)
1,3181 (0,9544)
0,8280 (0,4383)
0,7254 (0,3907)
1,4524 (0,3127)
0,6370 (0,9398)
0,8155 (0,5331)
1,1032 (0,9018)
0,8357 (0,7212)
2,0571 (0,8649)
1,0153 (0,9296)
37 (67,27)
17 (30,91)
1 (1,82)
91 (82,73)
19 (17,27)
124 (69,66)
48 (26,97)
6 (3,37)
296 (83,15)
60 (16,85)
1,0479 (0,9657)
1,0285 (0,9730)
0,5358 (0,6908)
1,0970 (0,7803)
0,8952 (0,8663)
1,2116 (0,6907)
0,5309 (0,8905)
0,9708 (0,9657)
1,1706 (0,7926)
0,8488 (0,7873)
1,0093 (0,5421)
1,1299 (0,8177)
89 (81,65)
16 (14,68)
4 (3,67)
194 (88,99)
24 (11,01)
49 (89,09)
4 (7,27)
2 (3,64)
102 (92,73)
8 (07,27)
122 (68,54)
51 (28,65)
5 (2,81)
295 (82,87)
61 (17,13)
2,0426 (0,0211)
0,4284 (0,0101)
1,3181 (0,9544)
1,6715 (0,0595)
3,7486 (0,0045)
0,1953 (0,0021)
1,3057 (0,8905)
2,6364 (0,0168)
0,5449 (0,3149)
2,1935 (0,2646)
1,0095 (0,6674)
0,6340 (0,3791)
42 (38,53)
53 (48,62)
14 (12,85)
134 (62,84)
81 (37,16)
21 (38,18)
17 (30,91)
17 (30,91)
59 (53,64)
51 (46,36)
57 (32,02)
91 (51,12)
30 (16,86)
205 (57,58)
151 (42,42)
1,3307 (0,3183)
0,9048 (0,7722)
0,7270 (0,4555)
1,2185 (0,3031)
1,3111 (0,4949)
0,4277 (0,0134)
2,2070 (0,0377)
0,8521 (0,5351)
1,0149 (0,8994)
2,1155 (0,0457)
0,3294 (0,0099)
1,4300 (0,1645)
54 (49,54)
25 (45,46)
96 (53,93)
0,8683 (0,5478)
0,7118 (0,3444)
1,1782 (0,7422)
AA
44 (40,37)
21 (38,18)
67 (37,64)
1,1215 (0,7373)
1,0233 (0,9309)
1,0960 (0,9195)
AG
11 (10,09)
9 (16,36)
15 (8,43)
1,2197 (0,7910)
2,1261 (0,1502)
0,5737 (0,3649)
GG
152 (69,72)
71 (64,55)
259 (72,75)
0,8625 (0,4930)
0,6818 (0,1248)
1,2650 (0,4100)
*A
66 (30,28)
39 (35,45)
97 (27,25)
*G
62
Tabela 16 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para
C.pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.
Perfil Genótipico e alélico
TT
CT
CC
*T
*C
TNF-a rs1800629 (G>A)
GG
AG
AA
*G
*A
IL-6 rs1800795 (G>C)
GG
GC
CC
*G
*C
IL-8 rs4073 (T>A)
TT
AT
AA
*T
*A
IL-10 rs1800896 (A>G)
Revascularização
C. pneumoniae +
(n:133)
n(%)
Troca de válvula
C. pneumoniae +
(n:60)
n(%)
C. pneumoniae +
(n:237)
n(%)
79 (59,40)
48 (36,09)
6 (4,51)
206 (77,48)
60 (22,52)
35 (58,33)
24 (40,00)
1 (1,67)
94 (78,33)
26 (21,67)
93 (69,92)
37 (27,82)
3 (2,26)
223 (83,71)
43 (16,29)
OR (p1)
OR (p2)
OR (p3)
155 (65,40)
75 (31,65)
7 (2,95)
385 (81,22)
89 (18,78)
0,7740 (0,2999)
1,2198 (0,4497)
1,5523 (0,6265)
0,7937 (0,2564)
0,7406 (0,3853)
1,4400 (0,2833)
0,5569 (0,9174)
0,8358 (0,5575)
1,0450 (0,9850)
0,8471 (0,7196)
2,7874 (0,5738)
0,9496 (0,9503)
45 (75,00)
14 (23,33)
1 (1,67)
104 (86,67)
16 (13,33)
174 (73,42)
54 (22,78)
9 (3,80)
402 (84,81)
72 (15,19)
0,8418 (0,5495)
1,3061 (0,3404)
0,5846 (0,6188)
0,9288 (0,8059)
1,0862 (0,9326)
1,0314 (0,9349)
0,4294 (0,6768)
1,1642 (0,7132)
0,7750 (0,5818)
1,2664 (0,6327)
1,3615 (0,7795)
0,7979 (0,5735)
113 (84,96)
15 (11,28)
5 (3,76)
242 (90,91)
24 (9,09)
51 (85,00)
5 (8,33)
4 (6,67)
107 (89,17)
13 (10,83)
163 (68,78)
68 (28,69)
6 (2,53)
394 (83,12)
80 (16,88)
2,5650 (0,0009)
0,3159 (0,0002)
1,5039 (0,7276)
2,0474 (0,0045)
2,5726 (0,0193)
0,2259 (0,0019)
2,7500 (0,2358)
1,6712 (0,1370)
0,9971 (0,8330)
1,3983 (0,7142)
0,5469 (0,6046)
1,2251 (0,7095)
46 (34,59)
66 (49,62)
21 (15,79)
158 (59,47)
108 (40,53)
24 (40,00)
18 (30,00)
18 (30,00)
66 (55,00)
54 (45,00)
75 (31,64)
117 (49,37)
45 (18,99)
267 (56,33)
207 (43,67)
1,1421 (0,6433)
1,0103 (0,9514)
0,8000 (0,5290)
1,1342 (0,4637)
1,4400 (0,2833)
0,4396 (0,0109)
1,8286 (0,0916)
0,9476 (0,8736)
0,7931 (0,5739)
2,2985 (0,0169)
0,4375 (0,0373)
1,1970 (0,4845)
68 (51,13)
30 (50,00)
136 (57,38)
0,7769 (0,2928)
0,7426 (0,3770)
1,0462 (0,9916)
AA
52 (39,10)
23 (38,33)
80 (33,76)
1,2599 (0,3595)
1,2199 (0,6074)
1,0327 (0,9532)
AG
13 (9,77)
7 (11,67)
21 (8,86)
1,1143 (0,9168)
1,3585 (0,6766)
0,8202 (0,8854)
GG
187 (70,45)
83 (69,17)
352 (74,26)
0,8204 (0,2818)
0,7775 (0,3122)
1,0552 (0,9164)
*A
79 (29,55)
37 (30,83)
122 (25,74)
*G
63
Tabela 17 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para
C.pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.
Perfil Genótipico e
alélico
TT
CT
CC
*T
*C
TNF-a rs1800629 (G>A)
GG
AG
AA
*G
*A
IL-6 rs1800795 (G>C)
GG
GC
CC
*G
*C
IL-8 rs4073 (T>A)
TT
AT
AA
*T
*A
IL-10 rs1800896 (A>G)
Revascularização
C. pneumoniae−
(n:26)
n(%)
Troca de válvula
C. pneumoniae −
(n:11)
n(%)
C. pneumoniae−
(n:58)
n(%)
19 (73,08)
6 (23,08)
1 (3,84)
44 (84,62)
8 (15,38)
6 (54,55)
5 (45,45)
0 (0,00)
17 (77,27)
5 (22,73)
19 (73,08)
6 (23,08)
1 (3,84)
44 (84,62)
8 (15,38)
OR (p1)
OR (p2)
OR (p3)
31 (53,45)
26 (44,83)
1 (1,72)
88 (75,86)
28 (24,14)
2,3641 (0,1460)
0,3692 (0,0980)
2,2800 (0,8538)
1,7500 (0,2824)
1,0452 (0,7927)
1,0256 (0,7701)
−
1,0818 (0,8963)
2,2619 (0,4737)
0,3600 (0,3332)
−
1,6176 (0,6712)
5 (45,45)
6 (54,55)
0 (0,00)
16 (72,73)
6 (27,27)
44 (75,86)
14 (24,14)
0 (0,00)
102 (87,93)
14 (12,07)
0,8636 (1,0000)
0,9429 (0,8638)
−
0,7549 (0,7327)
0,2652 (0,0938)
3,7714 (0,0938)
−
0,3660 (0,1268)
3,2571 (0,2180)
0,2500 (0,1376)
−
2,0625 (0,3850)
21 (80,77)
4 (15,38)
1 (3,85)
46 (88,46)
6 (11,54)
9 (81,82)
2 (18,18)
0 (0,00)
20 (90,91)
2 (09,09)
41 (70,69)
15 (25,86)
2 (3,45)
97 (83,62)
19 (16,38)
1,7415 (0,4821)
0,5212 (0,4360)
1,1200 (0,5857)
1,5017 (0,5615)
1,8659 (0,6969)
0,6370 (0,8726)
−
1,9588 (0,5831)
0,9333 (0,7004)
0,8182 (0,7818)
−
0,7667 (0,9206)
13 (50,00)
10 (38,46)
3 (11,54)
36 (69,23)
16 (30,77)
3 (27,27)
6 (54,55)
2 (18,18)
12 (54,55)
10 (45,45)
19 (32,76)
31 (53,45)
8 (13,79)
69 (59,48)
47 (40,52)
2,0526 (0,2072)
0,5444 (0,3010)
0,8152 (0,9469)
1,5326 (0,3011)
0,7697 (0,9959)
1,0452 (0,7927)
1,3889 (0,9299)
0,8174 (0,8453)
2,6667 (0,3615)
0,5208 (0,5895)
0,5870 (0,9887)
1,8750 (0,3456)
11 (42,31)
2 (18,18)
25 (43,10)
0,9680 (0,8648)
0,2933 (0,2240)
3,3000 (0,3038)
AA
11 (42,31)
6 (54,55)
27 (46,55)
0,8420 (0,9012)
1,3778 (0,8749)
0,6111 (0,7476)
AG
4 (15,38)
3 (27,27)
6 (10,35)
1,5758 (0,7680)
3,2500 (0,2983)
0,4848 (0,7004)
GG
33 (63,46)
10 (45,45)
77 (66,38)
0,8797 (0,8476)
0,4221 (0,1045)
2,0842 (0,2391)
*A
19 (36,54)
12 (54,55)
39 (33,62)
*G
64
3.5. NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR EM PACIENTES CARDÍACOS E GRUPO NO
CONTROLE
A figura 13 mostra a distribuição dos níveis plasmáticos nos pacientes (159 de RM e
71 de TV) e 196 indivíduos da população controle. A comparação estatística (valores de
mediana de cada grupo no interior do box) demonstrou que os dois grupos de pacientes
apresentam concentrações da proteína em quantidades significativamente maiores do que na
população controle (p<0,05).
Figura 13 – Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle em
Belém, PA.
A comparação dos níveis plasmáticos de PrtCR, de acordo com os genótipos do
polimorfismo rs2794521 (−717T>C) mostra que pacientes de RM e TV portadores do
genótipo TT possuem níveis maiores quando comparados com os portadores do genótipo TT
e CT na população controle (p<0,05). O genótipo CC em determinadas análises se apresentou
com frequência insuficiente para a realização de análise estatística, razão pela qual sua
descrição não é feita em algumas figuras a seguir.
65
Figura 14 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de
acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C), em Belém, PA. TT:
genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.
As figuras 15 até a 19 mostram a comparação estatística das variáveis: níveis
plasmáticos, os grupos estudados (RM, TV e Controle), o perfil genotípico, além da presença
ou ausência de anticorpos para o gênero e espécies de Chlamydia.
A figura 15 mostra a comparação dos níveis plasmáticos dentre os diferentes grupos
levando em consideração o perfil genotípico e a presença de anticorpos para o gênero
Chlamydia. A concentração de PrtCR foi significativamente maior no grupo de RM e TV do
que no grupo controle (p<0,05). Os indivíduos com genótipo TT (RM e TV) apresentaram
níveis significativamente maiores da proteína quando comparados com os indivíduos do
grupo controle portadores do genótipo TT e CT (p<0,05).
66
acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a presença de anticorpos
para Chlamydia em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto, CC:
genótipo alterado.
A figura 16 mostra a concentração de PrtCR distribuída por genótipo e levando em
consideração a presença de anticorpos para C.trachomatis. O grupo de RM portador de
genótipo TT apresentou uma maior concentração da proteína do que o grupo controle
(p<0,05). O mesmo ocorre para o genótipo TT quando se comparamos o grupo de TV e
controle. Além disso, foi observada diferença estatisticamente significante entre o genótipo
CT do grupo de TV e o genótipo TT e CT do grupo controle (p<0,05).
67
acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a presença de anticorpos
para C.trachomatis em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto.
Ao comparar as variáveis anteriores de acordo com a ausência de anticorpos para C.
trachomatis, a diferença entre o genótipo TT do grupo RM e TV permanecem
estatisticamente significantes em relação ao genótipo TT e CT do grupo controle (Figura 17).
68
acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a ausência de anticorpos
para C.trachomatis em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto.
Os níveis plasmáticos de PrtCR foram comparados entre os grupos de acordo com a
presença ou ausência de anticorpos para C. pneumoniae (Figura 18 e 19, respectivamente). O
genótipo TT dos grupos RM e TV apresentaram uma concentração significativamente maior
da proteína em relação aos genótipos TT e CT do grupo controle (p<0,05) (Figura 18). Ao
analisar as variáveis dentre os grupos sem anticorpos para C.pneumoniae, houve diferença
estatisticamente significante entre o grupo de RM e TV portador do genótipo TT e o grupo
controle portador do genótipo TT e CT (p<0,05) (Figura 19).
69
acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717T>C) e a presença de anticorpos
para C.pneumoniae em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto, CC:
genótipo alterado.
acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a ausência de anticorpos
para C.pneumoniae em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto.
70
As figuras 20 até a 23 mostram as comparações entre os grupos de acordo com a
presença ou ausência de anticorpos para o gênero e espécies de Chlamydia sem levar em
consideração o perfil genotípico.
Na figura 20 o grupo de RM com e sem anticorpos para Chlamydia apresentou níveis
de PrtCR maiores do que o grupo controle, com resultados estatisticamente significantes
(p<0,05).
Figura 20 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à revascularização
(RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para o gênero
Chlamydia em Belém, PA.
A figura 21 compara o grupo de TV e controle. O grupo de TV com anticorpos para
Chlamydia apresentaram níveis significativamente maiores da proteína em relação ao grupo
controle. A mesma diferença significante se observa entre o grupo de TV com sem anticorpos
e o controle (p<0,05).
71
Figura 21 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à troca de válvula (TV)
e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para o gênero
A comparação entre os grupos de acordo com a presença ou ausência de anticorpos
para C. trachomatis estão demonstradas na figura 22. Tanto na presença como ausência de
anticorpos, o grupo de RM apresenta concentrações significativamente maiores de PrtCR do
que o grupo controle. O grupo de TV com anticorpos para C.trachomatis apresentou diferença
estatisticamente significante em relação ao grupo controle (p<0,05). Porém esta significância
estatística é perdida quando a comparação é feita entre o grupo TV sem anticorpos para C.
trachomatis e o grupo controle.
72
Figura 22 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle de
acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.
A figura 23 demonstra a comparação dos grupos de acordo coma presença ou ausência
de anticorpos para C.pneumoniae. O grupo de RM com e sem anticorpos para C.pneumoniae
apresentou níveis de PrtCR significativamente maiores do que o grupo controle (p<0,05). O
grupo de TV com anticorpos para C.pneumoniae apresentou diferença estatisticamente
significante quando comparado ao grupo controle (p<0,05). Não houve diferença
estatisticamente significante entre o grupo sem anticorpos para C.pneumoniae e o controle.
73
Figura 23 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle de
acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA.
3.6. EXPRESSÃO GÊNICA DE TNF-α EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO
CONTROLE
A quantificação do mRNA de TNF- α foi realizada em 22 amostras do grupo de RM,
17 amostras do grupo de TV e 28 amostras do grupo controle. A figura 24 demonstra que o
grupo controle apresentou uma expressão significativamente maior de TNF- α do que os dois
grupos de pacientes, sendo que a comparação com os indivíduos de RM resultou em
resultados estatisticamente significantes (p<0,05).
74
Figura 24 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes e um grupo controle em Belém, PA.
RQ: valor de quantificação relativa.
A figura 25 demonstra a comparação dos níveis de expressão de TNF-α entre os
grupos de acordo com o perfil genotípico para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A). O
genótipo AA, por se apresentar em frequência insuficiente para análise estatística, foi somado
com o genótipo heterozigoto (AG). O grupo controle portador do genótipo AG e AA
apresentou expressão significativamente maior do que os grupos de RM e TV portadores do
genótipo GG (p<0,05).
75
Figura 25 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo controle de
acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A) em Belém, PA. RQ: valor
de quantificação relativa, GG: genótipo selvagem, AG: genótipo heterozigoto, AA: genótipo
alterado.
Ao comparar a expressão e perfil genotípico entre os grupos de acordo com a presença
de anticorpos para Chlamydia, os níveis de mRNA do TNF-α permanecem significativamente
maiores em portadores dos genótipos AG/AA do grupo controle (p<0,05) (Figura 26).
76
acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A) e a presença de anticorpos
para Chlamydia em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, GG: genótipo selvagem,
AG: genótipo heterozigoto, AA: genótipo alterado.
Na figura 27, a comparação entre os grupos de RM e controle ocorre de acordo com a
presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia. O grupo controle, com e sem anticorpos
apresentou níveis de expressão significativamente maiores quando comparado com o grupo
RM (p<0,05).
Na figura 28, a comparação com o grupo TV demonstra que na ausência de anticorpos
para Chlamydia, o grupo controle mostra uma maior quantificação de mRNA do que o grupo
RM (p<0,05).
77
Figura 27 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à revascularização (RM)
e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em
Belém, PA.
Figura 28 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à troca de válvula (TV) e
um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em
Belém, PA.
78
As figuras 29 e 30 representam a comparação da expressão de TNF-α de acordo com a
presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis e C.pneumoniae, respectivamente. Na
figura 29 as amostras do grupo controle sem anticorpos para C.trachomatis apresentaram
níveis significativamente maiores de expressão do que o grupo de RM e TV com anticorpos
para a espécie (p<0,05). Na figura 30 um resultado estatisticamente significante é observado
entre o grupo controle com anticorpos para C.pneumoniae e os grupos de RM e TV (p<0,05).
79
3.7 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE IL-6 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO
CONTROLE
A dosagem dos níveis plasmáticos foi realizada em 19 amostras de pacientes de RM,
14 amostras de pacientes de TV e 28 amostras de grupo controle (Figura 31).
As
comparações entre os diferentes grupos (mediana no interior do box) demonstrou que as
concentrações de IL-6 foram significativamente maiores no grupo de pacientes (RM e TV) do
que no grupo controle (p<0,05).
80
Figura 31 – Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em
Belém, PA.
A figura 32 demonstra a comparação dos níveis de IL-6 de acordo com os diferentes
genótipos para o polimorfismo rs1800795 (−174G>C). O genótipo CC se apresentou com
frequência insuficiente para a realização de análise estatística, razão pela qual foi unido ao
genótipo GC com o objetivo de aumentar a amostragem para a análise estatística. Ao inserir a
variável genótipo na comparação foi observado que existiu uma maior concentração de IL-6
no plasma de pacientes de RM portadores do genótipo GG quando comparado com o grupo
controle portador do genótipo GG e também dos genótipos GC/CC(p<0,05). Para o grupo de
TV, os indivíduos portadores dos genótipos GC/CC apresentaram maiores níveis da citocina
do que o grupo controle portador do genótipo GG (p<0,05).
81
Figura 32 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de
acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795 (−174G>C) em Belém, PA. GG:
genótipo selvagem, GC: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.
A Figura 33 demonstra a comparação entre os diferentes grupos (RM, TV e controle)
de acordo com o perfil genotípico e presença de anticorpos para Chlamydia. O grupo de RM e
o de TV, ambos portadores do genótipo GG mostraram concentrações significativamente
maiores de IL-6 do que o grupo controle portador do mesmo genótipo (p<0,05).
82
Figura 33 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de
acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795 (−174G>C) e presença de anticorpos
para Chlamydia em Belém, PA. GG: genótipo selvagem, GC: genótipo heterozigoto, CC:
genótipo alterado.
A figura 34 representa a comparação dos níveis plasmáticos de IL-6 entre o grupo de
RM e controle, levando em consideração a presença ou ausência de anticorpos para
Chlamydia. Houve diferença estatisticamente significante entre o grupo de RM e o grupo
controle com anticorpos para Chlamydia, onde os pacientes apresentaram uma concentração
significativamente maior de IL-6 do que os controles (p<0,05). Resultado semelhante foi
encontrado quando comparamos o mesmo grupo de pacientes com o grupo controle sem
anticorpos para Chlamydia. Adicionalmente, ao comparar o grupo de RM e controle sem
anticorpos para Chlamydia, houve diferença estatisticamente significante (p<0,05).
83
Figura 34 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre os pacientes submetidos à revascularização do
miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com presença ou ausência de anticorpos para
A comparação dos níveis plasmáticos de IL-6 entre o grupo de TV e controle de
acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia estão representados na
Figura 35. De forma semelhante ao grupo de RM (Figura 34), os pacientes de TV com
anticorpos para Chlamydia apresentaram níveis significativamente maiores da citocina do que
o grupo controle com e sem anticorpos para Chlamydia (p<0,05). Os pacientes sem anticorpos
para Chlamydia demonstraram uma acentuada redução nos níveis plasmáticos de IL−6, razão
pela qual não foram observados resultados estatisticamente significativos.
84
Figura 35 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes submetidos à troca de válvula (TV) e
um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em
Belém, PA.
As figuras 36 e 37 representam a comparação das concentrações de IL-6 dentre os
grupos e de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis e C.
pneumoniae, respectivamente. Na figura 36 o grupo de RM sem anticorpos para
C.trachomatis possui maiores concentrações de IL-6 do que o controle (p<0,05). O grupo de
TV com anticorpos mostrou níveis plasmáticos significativamente maiores do que o grupo
controle com e sem anticorpos para C.trachomatis (p<0,05).
Na figura 37 o grupo de RM com e sem anticorpos para C.pneumoniae apresentaram
maior concentração da citocina em relação ao grupo controle, com resultado estatisticamente
significante (p<0,05). Não houve diferença estatisticamente significante entre o grupo de TV
e o controle.
85
Figura 36 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de
Figura 37 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de
86
3.8. EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-8 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO
CONTROLE.
A quantificação do mRNA de IL-8 foi realizada em 27 amostras do grupo de RM, 21
amostras do grupo de TV e 32 amostras do grupo controle. A figura 38 demonstra que o
grupo controle apresentou uma expressão significativamente maior de IL-8 do que os dois
grupos de pacientes, com resultados estatisticamente significantes (p<0,05).
Figura 38 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em
Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa.
Na figura 39 os níveis de expressão foram comparados levando em consideração o
perfil genotípico para o polimorfismo rs4073(−251T>A). O grupo controle apresentou níveis
significativamente maiores de mRNA de IL-8 do que pacientes. Esta diferença foi observada
entre os genótipos TT e AA do grupo controle e os genótipos TT do grupo de RM (p<0,05).
Na figura 40 a comparação ocorre de acordo com o perfil genotípico e a presença de
anticorpos para Chlamydia, onde podemos verificar que o grupo controle com genótipo AT
apresentou níveis significativamente maiores de expressão do que o grupo RM e TV com
genótipo TT (p<0,05).
87
Figura 39 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de
acordo com genótipos para o polimorfismo rs4073 (−251T>A) em Belém, PA. RQ: valor de
quantificação relativa, TT: genótipo selvagem, AT: genótipo heterozigoto, AA: genótipo
alterado.
acordo com o polimorfismo rs4073 (−251T>A) e a presença de anticorpos para Chlamydia
em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, TT: genótipo selvagem, AT: genótipo
heterozigoto, AA: genótipo alterado.
88
Na figura 41 avaliamos os níveis de mRNA de IL-8 entre os grupos de acordo com a
presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia. O grupo controle com anticorpos para
Chlamydia apresentou níveis maiores do que os pacientes de RM (p<0,05). Na figura 42 não
foi observada diferença estatisticamente significante entre o grupo de TV e controle.
Figura 41 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a revascularização do
miocárdio (RM) e um do grupo controle de acordo com resultado a presença ou ausência de
anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.
89
Figura 42 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a troca de válvula (TV) e
um grupo controle de acordo com resultado a presença ou ausência de anticorpos para
As figura 43 e 44 demonstram a comparação da expressão de IL-8 entre os diferentes
grupos de acordo com a presença e ausência de anticorpos para a C.trachomatis e
C.pneumoniae, respectivamente. Na figura 43, o grupo de TV e grupo controle sem anticorpos
para C.trachomatis mostraram expressão significativamente maior do que o grupo de RM
(p<0,05). Na figura 44 o grupo controle com anticorpos para C.pneumoniae apresenta
diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo de RM. Adicionalmente,
o grupo de TV com anticorpos para C.pneumoniae mostrou uma expressão maior de IL-8
quando comparado com o grupo de RM sem anticorpos (p<0,05).
90
Figura 44 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos em um grupo controle de
91
3.9. EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-10 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO
CONTROLE.
A quantificação do mRNA de IL-10 foi realizada em 27 amostras do grupo de RM, 20
amostras do grupo de TV e 33 amostras do grupo controle. A figura 45 demonstra a
distribuição dos níveis de expressão relativa, onde não se observa diferença estatisticamente
significante.
Figura 45 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em
Belém, PA.
A figura 46 demonstra uma diferença estatisticamente significante quando se compara
os níveis de expressão da citocina com o perfil genotípico para o polimorfismo rs1800896
(−1082A>G). O grupo de RM com genótipo AG apresentou níveis de expressão
significativamente maiores do que o grupo controle com genótipo AA (p<0,05). O grupo de
TV com genótipo GG também demonstrou maior expressão quando comparado com o grupo
controle portador do genótipo AA (p<0,05).
92
acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800896 (−1082G>A) em Belém, PA. RQ: valor
de quantificação relativa, AA: genótipo selvagem, AG: genótipo heterozigoto, GG: genótipo
alterado.
A figura 47 mostra a associação dos níveis de expressão de IL-10 com o perfil
genotípico e a presença de anticorpos para Chlamydia. Os genótipos AG e GG foram somados
para se obter um número amostral significativo para análise estatística. Os níveis de expressão
entre os grupos se mostraram iguais, não havendo resultado estatisticamente significante. De
forma semelhante, não foi observada diferença estatisticamente significante nas figuras 48 e
49, onde os níveis de expressão foram comparados de acordo com a presença ou ausência de
anticorpos para Chlamydia.
93
acordo com os genótipos para o polimorfismo rs1800896 (−1082 G>A) e a presença de
anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, AA: genótipo
selvagem, AG: genótipo heterozigoto, GG: genótipo alterado.
Figura 48 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a revascularização do
miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos
para Chlamydia.
94
Figura 49 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a troca de válvula (TV) e
um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia.
As figuras 50 e 51 mostram a comparação da expressão de acordo com a presença ou
ausência de anticorpos para C.trachomatis e C.pneumoniae, respectivamente. Não foram
observadas diferenças significantes entre os níveis de expressão para IL-10 nestes grupos.
95
acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis.
acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae.
96
4. DISCUSSÃO
4.1. PERFIL DEMOGRÁFICO E SOCIAL, SOROPREVALÊNCIA DE ANTICORPOS E
DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO DE C.TRACHOMATIS E C.PNEUMONIAE EM
PACIENTES COM DOENÇA CARDIOVASCULAR.
De acordo com a OMS, dentre um total de 16,7 milhões de mortes por ano devido a
doenças cardiovasculares, quase a metade destas mortes é em decorrência da doença arterial
coronariana, seguida de outras condições como o acidente vascular cerebral, doença cardíaca
hipertensiva, inflamatória e reumática (WHO, 2004).
Os fatores de risco para o desenvolvimento da doença arterial coronariana estão
divididos em modificáveis e não-modificáveis. Os fatores modificáveis incluem, dentre
outros, hipertensão, diabetes, tabagismo, sobrepeso, hipercolesterolemia. Os fatores não
modificáveis incluem o sexo, idade, etnia e herança genética (Gifford, 1993; WHO, 2004;
Safford et al., 2012). O surgimento das doenças cardiovasculares aumenta de acordo com o
avanço da idade, devido ao processo natural de envelhecimento celular que favorece o
surgimento alterações vasculares (Kovacic et al., 2011). Estas doenças também se apresentam
de forma mais frequente entre homens, particularmente quando as mulheres se encontram em
fase de pré-menopausa, pois a presença do estrógeno parece desempenhar um papel protetor
para o sexo feminino (Gifford, 1993; Clarkson et al., 2007). Outro fator que pode estar
relacionado a um maior risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares é a condição
socioeconômica da população, aqui incluídos a renda familiar, o nível de escolaridade e o tipo
de ocupação. A baixa renda, por exemplo, pode limitar o acesso a educação e aos cuidados
médicos de qualidade que auxiliam na conscientização e prevenção primária contra a doença
arterial coronariana. Dessa forma, o baixo nível socioeconômico pode interferir na realização
de práticas preventivas como o exercício físico, a alimentação de qualidade e exames médicos
anuais (Kaplan & Keil, 1993; Maynard et al., 2012).
Os pacientes coronarianos submetidos a revascularização do miocárdio (RM) deste
estudo apresentaram características epidemiológicas, em geral, concordantes com o relatado
na literatura (Virmani et al., 1991; Clarkson et al., 2007; Clark et al., 2009; Ruff
& Braunwald, 2011). A maioria pertenceu ao sexo masculino, idade média de 60,4 anos, com
baixo nível de escolaridade (sem conclusão do ensino fundamental) e baixa renda (1 a 3
salários). Todo o ciclo que costuma cercar os pacientes com doença coronariana se repetiram,
uma vez que a baixa escolaridade associada a baixa renda, não permitem, por vezes, o
97
entendimento adequado das maneiras básicas de proteção e cuidados associados com a
prevenção de doenças cardíacas.
O grupo de indivíduos submetidos à troca de válvula (TV) foi composto em sua
maioria por mulheres, idade média de 45,6 anos, estado civil solteiro, com baixo nível de
escolaridade (sem conclusão do ensino fundamental) e baixa renda (1 a 3 salários). Indivíduos
portadores de valvulopatia apresentam característica epidemiológica diferente, devido à
diversidade de fatores desencadeantes da doença tais como, desordens congênitas ou por uma
variedade de doenças adquiridas no decorrer da vida, como a febre reumática. (Fernandes et
al., 2012). A doença atinge indivíduos jovens, em idade reprodutiva e ativos para o trabalho,
representando um grande prejuízo socioeconômico em países em desenvolvimento (Okello et
al., 2012).
A prevalência de anticorpos contra C.trachomatis não é muito relatada em portadores
de doenças cardíacas. Em contrapartida, este agente é alvo de muitos estudos envolvendo
grupos como mulheres e homens sexualmente ativos, principalmente apresentando
anormalidades no sistema reprodutor, uma vez que a C. trachomatis é uma das principais
bactérias transmitidas através da via sexual (WHO, 2005). A soroprevalência pode variar de
4% a 10% em grupos de mulheres grávidas saudáveis (Salmani et al., 2011), 25% em
profissionais do sexo (Cravioto et al., 2003), 50% em mulheres com histórico desfavorável na
gravidez até 68% em mulheres apresentando infertilidade (Sharma et al., 2002). Os resultados
do presente estudo apontam uma soroprevalência de 30,6% no grupo de RM, 20,3% no grupo
de TV e 36,7% no grupo controle. Estes dados demonstram que independente da presença de
doença cardíaca, a população do estado do Pará apresenta uma alta exposição à C.
trachomatis que pode ser decorrente tanto da transmissão sexual como do contato com as
variantes causadoras do tracoma, que são endêmicas nesta região (Ishak & Ishak, 2001; Costa,
2002, Feitosa, 2010).
Estudos soroepidemiológicos tanto de C. trachomatis como de C. pneumoniae são
difíceis para comparação devido a diferenças nos grupos populacionais estudados, mas
principalmente devido aos diferentes tipos de técnicas sorológicas empregadas, variações no
cut-off estabelecido etc.
A C. pneumoniae possui uma ampla disseminação no mundo devido sua transmissão
ocorrer através do contato com gotículas contaminadas das vias respiratórias. As estimativas
apontam que mais de 50% da população adulta e entre 10 a 20% de crianças apresentem
anticorpos contra a bactéria (Blasi et al., 1998; Koh et al., 2002; Burillo & Bouza, 2010).
98
O presente estudo demonstrou uma prevalência de anticorpos de 83,6% para o grupo
de RM, 84,5% para o grupo de TV e 80,3% para o grupo controle, dados estes considerados
semelhantes em outros grupos populacionais. Na Espanha, indivíduos com mais de 15 anos de
idade mostraram 75% de prevalência (Bellido-Casado et al., 2006). Em Singapura, homens
entre 18 e 69 anos apresentaram uma prevalência de 75% enquanto as mulheres 68,5% no
mesmo estudo (Koh et al., 2002). Na Índia, os pacientes coronarianos apresentam prevalência
de 76% (Argawal et al., 2007). Os dados de prevalência do presente estudo superam também
os dados relatados no Japão onde Myashita et al. (2002) analisando por dez anos as oscilações
de prevalência, observou a menor de 59% e a mais alta de 73,3%, sendo considerada uma
região de alta exposição.
De forma diferente deste estudo, no México foi observado que há uma associação
entre a soroprevalência de C. pneumoniae e a doença arterial coronariana, pois o grupo de
pacientes apresentou 94,3% de anticorpos contra apenas 37% do grupo controle (Elorriaga et
al., 2002). Thom et al. (1998) demonstraram uma prevalência de 67% em pacientes cardíacos
contra 48% na população controle afirmando que indivíduos com anticorpos anti
C.pneumoniae possuem 2,6 vezes mais risco de adquirir doença cardiovascular do que
indivíduos sem anticorpos. Não foi possível encontrar esta associação no presente estudo, pois
a população controle apresentou uma alta soroprevalência assim como a de pacientes (RM e
TV) demonstrando que nossa região apresenta uma maior disseminação bacteriana
independente dos grupos, assim como em outras regiões como Israel onde 74% de adultos
saudáveis para doenças respiratórias apresentaram anticorpos anti-C.pneumoniae (Ben
Yaakov et al., 2002). Estes dados também se assemelham ao de Sotiropoulos et al. (2006) que
também encontraram alta prevalência no grupo controle (86%) e pacientes coronarianos
(91%). O estudo de Meza-Junco et al. (2004) ressalta a grande e variada distribuição de
C.pneumoniae entre diferentes populações quando observou 70,5% de prevalência em seu
grupo controle e 66,3% em seus pacientes cardíacos.
Outras doenças cardiovasculares se tornaram alvo de pesquisas para associação com
Chlamydia, como as doenças de válvulas cardíacas. Os principais estudos não possuem como
foco a soroprevalência, mas sim a busca direta da bactéria no tecido valvular. A prevalência
de anticorpos anti-C.pneumoniae deste estudo são maiores do que o estudo de Turgeman et al.
(2006) que avaliou pacientes com diferentes níveis de estenose de válvula aórtica,
encontrando 42% de prevalência de IgG no grupo com grau moderado ou grave da doença. O
presente estudo encontrou uma prevalência concordante com o estudo de Atar et al. (2007)
99
que encontraram 84% de soropositividade para C.pneumoniae em pacientes com doença de
válvula aórtica e mitral.
A maioria dos estudos que afirma uma associação entre Chlamydia e doença cardíaca
utiliza metodologias de detecção de antígenos ou DNA no tecido cardíaco, como o trabalho de
Juvonen et al. (1998) que detectou 53% das válvulas aórticas contendo marcadores de
infecção por C.pneumoniae em indivíduos com idade avançada. No Brasil, Higuchi et al.
(2005) identificaram antígenos bacterianos nas válvulas apontando uma participação no
processo de calcificação deste tecido. O presente estudo, através de biologia molecular, não
identificou a presença de C.pneumoniae nos fragmentos de válvula, aortas e placas de
ateroma, concordando com os estudos que através de diferentes métodos, como biologia
molecular e cultura, não identificaram a presença de C.pneumoniae em tecidos
cardiovasculares mesmo em populações com alta prevalência de anticorpos (Andreasen et al.,
1998; Ong et al., 2001; Rose et al., 2002; Vainio et al., 2002; Ferrari et al., 2005; Satpathy et
al., 2008). Zhang et al. (2003) estudaram amostras de biópsia para detecção de C.pneumoniae
por imunohistoquímica e, apesar de ter encontrado marcação positiva, afirmaram que a sua
presença nas paredes de artéria coronária não estavam associadas a uma progressão na lesão
da camada íntima, existindo então uma associação limitada entre a bactéria e a patogênese da
aterosclerose. A partir dos dados de biologia molecular, não foi possível estabelecer uma
associação entre a infecção por C.pnemoniae e a patogênese da aterosclerose. Os diferentes
resultados encontrados na literatura dificultam uma associação consenso de Chlamydia
pneumoniae como um agente causal no desenvolvimento ou complicações das doenças
cardiovasculares.
Em contrapartida, o presente estudo é o primeiro que apresenta a amplificação de
DNA de C. trachomatis em amostras de tecido cardiovascular. Ainda que as células
endoteliais e do músculo cardíaco possam não ser um alvo natural para a infecção da C.
trachomatis, a bactéria pode alcançar a região por meio de monócitos/macrófagos infectados,
uma vez que estas células podem ser infectadas in vitro, apresentando inclusões intracelulares
características da multiplicação bacteriana. Análises de rRNA primário de C.trachomatis
demonstraram microrganismos viáveis e metabolicamente ativos no interior das inclusões
(Koehler, et al., 1997; Sun et al., 2012)
Apesar das aparentes diferenças no tropismo celular entre as espécies, tanto a C.
trachomatis, C.psittaci como C.pneumoniae já foram associadas com a manifestação de
miocardites sendo capazes de provocar infecção produtiva nas células endoteliais e do
músculo cardíaco resultando em danos significativos para o coração tanto em modelos
100
experimentais como em estudos humanos (Gaydos et al.,, 1996; Bachmaier et al., 1999;
Schinkel et al., 2000; Wang et al., 2002).
Alguns relatos de caso sustentam as afirmações anteriores como casos de
endocardite associada à infecção por C. trachomatis em paciente com resultado de cultura
negativa (Brearley & Hutchinson, 1981). Mavrogeni et al. (2008) documentaram um caso de
miocardite causada por C.trachomatis em paciente com histórico de prostatite. Dan et al.
(1987) descreveram o isolamento de C.trachomatis a partir de biópsia de fígado em um
paciente apresentando febre alta e prolongada.
4.2. POLIMORFISMO DE MARCADORES DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA E
INFLAMATÓRIA
A distribuição alélica e genotípica da PrtCR, TNF-α e IL-10 não foram associadas ao
risco de desenvolvimento de doença cardiovascular após diferentes comparações entre
pacientes e controle, levando em consideração os resultados sorológicos para C.trachomatis e
C.pneumoniae. Apesar dos polimorfismos selecionados para este estudo serem os de maior
associação com doenças crônicas como a aterosclerose, diversos outros marcadores
(imunológicos, inflamatórios e bioquímicos) estão sendo identificados e associados com risco
baixo, moderado ou alto doença cardiovascular (Hage & Szalai et al., 2007; Perry et al.,
2009; Karaca et al., 2011; Nair et al., 2013). É importante considerar a condição multifatorial
destas doenças, cujo início e a evolução de lesões cardíacas e vasculares não dependem
somente de uma predisposição genética, mas também dos fatores ambientais envolvidos
(sedentarismo, fumo, tabagismo, hiperlipidemia etc) (Nash et al., 2011; Kiechl & Willeit,
1999; WHO, 2004).
De acordo com os resultados deste e de outros estudos, o polimorfismo de região
promotora rs1800795 (−174G>C) de IL-6 pode representar um fator de risco para doenças
cardiovasculares alterando os níveis de transcrição do gene, bem como os níveis plasmáticos
da citocina (Fishman et al., 1998; Shibata et al., 2002; Giacconi et al., 2004; Antonicelli et
al., 2005).
Este polimorfismo foi identificado pela primeira vez em um estudo com caucasianos
em Londres onde foi encontrada uma frequência do alelo G em torno de 60% e o alelo C em
torno de 40% (Fishman et al., 1998). Ao contrário, o presente estudo apresentou uma
frequência do alelo G muito maior nas tres populações estudadas (RM: 90,25%; TV: 89,44%;
Controle: 83,17%) e o alelo C em menor frequência (RM: 9,75%; TV: 10,56%; Controle:
101
16,83%) (Tabela 14). Ao comparar estas frequências com outras registradas em estudos na
população global, foi observada uma distribuição alélica heterogênea. Africanos e asiáticos
possuem uma frequencia alélica semelhante a do presente estudo, com frequência do alelo G
igual a 95,8% e 95,7%, respectivamente. Em contrapartida, europeus e norte-americanos
apresentam uma frequência do alelo G menor (46,5% e 35,3%, respectivamente) (SNP-NCBI,
2013). Estas diferenças podem ser decorrentes da contribuição genética de diferentes etnias
(africanos, ameríndios e europeus) na formação da população paraense (Santos et al., 2010).
Outros estudos apontam o alelo C foi associado com maiores níveis plasmáticos de IL-6
(Brull et al., 2001; Niu et al., 2012), tornando o papel do polimorfismo ainda controverso,
inclusive em estudos de metanálise (Yin et al., 2013).
Indivíduos portadores do genótipo GG (IL-6) possuem, neste estudo, um risco duas a
tres vezes maior de desenvolvimento de doença cardiovascular (doença coronariana e
valvulopatia) do que o indivíduo portador dos outros genótipos. Existem muitas associações
entre o genótipo GG e um maior risco de desenvolvimento de patologias diversas (Sarcoma
de Kaposi, hiperlipidemia, deficiência de crescimento em portadores de doença de Chron etc)
(Foster et al., 2000; Fernandez-Real et al., 2002; Sawczenko et al., 2005), incluindo doenças
cardiovasculares (Olivieri et al., 2002; Giacconi et al., 2004; Antonicelli et al., 2005). Assim
como no presente estudo, Myśliwska et al., em 2006 associaram o genótipo GG a um maior
risco de obstrução coronária. Do mesmo modo que na aterosclerose, a presença de uma lesão
no tecido das válvulas cardíacas pode estimular o processo inflamatório caracterizado por
ativação de macrófagos, linfócitos, infiltração de lipoptoteínas, acúmulo de cálcio, mediante a
secreção exacerbada de diversas citocinas pró-inflamatórias incluindo a IL-6 (Mazzone et al.,
2004).
O genótipo GC apresentou uma frequência significativamente maior na população
controle, representando um fator de proteção contra a doença cardiovascular (RM:11,95%;
TV:9,86%; Controle:28,33%). A presença do alelo C, que influencia em uma menor atividade
transcricional do gene da IL-6, pode trazer uma resposta mais equilibrada no que diz respeito
à secreção da citocina (Fishman et al., 1998), contrariando a resposta exacerbada inerente ao
alelo G. O papel do genótipo GC como protetor pode explicar o fato de somente os pacientes
(RM e TV) apresentarem suas frequências genotípicas em desequilíbrio de Hardy-Weinberg,
uma vez que a frequência observada de GC nos referidos grupo se mostrou menor do que a
esperada.
Em relação a IL-8, foi demonstrada uma frequência maior do genótipo AA na
população de TV quando comparada com a de RM (28,17% vs. 15,09%, respectivamente),
102
apresentando resultado estatisticamente significante (p=0,0318). Quando o grupo TV foi
comparado com a população controle para o mesmo genótipo, o resultado se aproximou
daquele considerado estatisticamente significante (p=0,07). Estes resultados são coerentes
com estudos que demonstram uma maior atividade transcricional do gene no grupo de
pacientes portadores do genótipo AA (Hull et al., 2000; Wang et al., 2012).
Da mesma forma que ocorreu para IL-6, o genótipo heterozigoto de IL-8 se mostrou
em maior frequência na população controle do que nos pacientes de TV (50% vs. 33,80%,
respectivamente), representando um papel de proteção contra o desenvolvimento de
valvulopatias (p=0,02). Isto ocorreu possivelmente devido a um equilíbrio na secreção da
quimiocina por conta da presença do alelo T que é associado a uma menor atividade
transcricional do gene (Hull et al., 2000; Wang et al., 2012). O papel da IL-8 no
desenvolvimento de valvulopatias pode ser explicado pelo processo inflamatório
característico em tecido cardíaco com lesões. Além da secreção de proteínas quimiotáticas de
monócitos (MCP-1), moléculas de adesão, fatores de crescimento de fibroblastos, as células
neste tecido podem estimular a quimiotaxia de neutrófilos através da secreção de IL-8
(Harada et al., 1994). Portanto o genótipo AA, neste estudo, mostrou se como um fator de
risco para o surgimento de valvulopatias.
Os resultados mostram também a persistência do genótipo GG de IL-6 como fator de
risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular, independentemente do resultado
sorológico para C.trachomatis. Ainda que não seja observado de imediato o papel do genótipo
GC como fator de proteção tanto para doença coronariana como para valvulopatias
(informação que ficou parcialmente oculta na tabela 15), o aumento do tamanho amostral
evidenciado na tabela seguinte é suficiente para confirmar a observação.
Com relação a IL-8, dentre as amostras que apresentavam anticorpos para
C.trachomatis, foi observada uma perda na significância estatística, porém ao comparar as
amostras sem anticorpos, o genótipo AA demonstra novamente maior frequência no grupo de
TV do que no de RM e controle, assim como o genótipo AT se mostra mais frequente no
grupo controle.
Ao observar as mesmas análises relacionadas à presença de anticorpos para
C.pneumoniae, os resultados do genótipo GG de IL-6 e AA de IL-8 permanecem semelhantes
aos encontrados com C.trachomatis, reforçando a associação descrita anteriormente. Ao
retirar a variável soropositividade para C.pneumoniae, as frequências perdem sua
significância estatística, portanto, sugerindo que o histórico de infecção por C.pneumoniae
103
pode se comportar como um fator sinérgico influenciando na associação descrita com
polimorfismo de IL-6 e IL-8.
Com base nas comparações realizadas, é possível sugerir que o perfil genótípico de
IL−6 e IL−8 podem influenciar na suscetibilidade à doença cardiovascular de forma
independente da presença de marcadores de infecção por C.trachomatis. Entretanto, esta
associação é perdida ao comparar os grupos soronegativos para C.pneumoniae, nos
permintindo sugerir um papel sinérgico dos marcadores de infecção por esta bactéria,
acentuando os mecanismos de resposta imunológica através de estímulos inflamatórios
específicos. O perfil genético individual, para IL-6 e IL-8, pode se comportar com um fator de
risco para o desenvolvimento da doença cardiovascular, através da indução de diferentes
efeitos biológicos destas citocinas no organismo.
4.3. NÍVEIS PLASMÁTICOS E DE EXPRESSÃO GÊNICA DE MARCADORES DE
RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA
O presente estudo não encontrou evidências de suscetibilidade genética associada a
PrtCR, levando em consideração os resultados do polimorfismo rs2794521 (−717T>C).
Apesar de o fator genético ser importante, ele é incapaz de influenciar de forma isolada os
níveis de PrtCR (Kathiresan et al., 2006; Hage & Szalai et al., 2007). A avaliação dos níveis
plasmáticos deste estudo reforçam a participação da PrtCR como fator de risco para a doença
cardiovascular. Tanto o grupo de RM como de TV apresentaram níveis plasmáticos maiores
do que o grupo controle, funcionando como um fator preditor de eventos coronários (angina
instável, estável, infarto agudo do miocárdio) e valvulares (Galante et al., 2001; Ridker et al.,
2002; Sinning et al., 2006).
O risco para doença cardíaca deve ser avaliado não só em populações adultas e com
comportamentos de risco, mas também em indivíduos com idade precoce (crianças e
adolescentes), pois estes grupos já demonstram um risco futuro, de acordo com a análise de
vários biomarcadores, como a PrtCR (Namburi et al., 2013). A interação da PrtCR com
células vasculares e cardíacas tem sido alvo de muitos estudos que buscam descrever o
mecanismo exato que explique sua alta sensibilidade e efeito inflamatório imediato. Foi
observado que altos níveis da proteína desencadeiam efeitos pro-inflamatórios através da
expressão de moléculas de adesão intercelular e vascular, citocinas, proteínas quimiotáticas,
fatores de coagulação, bem como o aumento da captação de LDL colesterol pelos macrófagos
(Venugopal et al., 2005; Peng et al., 2013).
104
A comparação dos níveis plasmáticos de PrtCR, com o perfil genético e a presença de
anticorpos para o gênero ou as espécies de Chlamydia, mostrou uma concentração dos níveis
plasmáticos significativamente maior nos grupos de pacientes portadores do genótipo TT do
que no grupo controle. Estes dados são semelhantes ao estudo de Chen et al. (2005), que
observaram o alelo T em maior frequência entre indivíduos com doença arterial coronariana e
infarto agudo do miocárdio do que nos controles. Isto pode ser explicado através do estudo de
Wang et al. (2009) que demonstraram uma atividade transcricional maior do gene de PrtCR
na presença do alelo T do que do alelo C. Pode-se sugerir que a presença do alelo T pode estar
associada a um aumento nos níveis plasmáticos de PrtCR promovendo um risco no
desenvolvimento de doença cardiovascular.
Ao analisar os níveis plasmáticos de PrtCR em relação a presença de anticorpos para o
gênero Chlamydia, pode ser observado que mesmo nos grupo soronegativos ainda são
encontrados níveis plasmáticos significativamente maiores no grupo de pacientes (RM e TV)
do que no grupo controle. Entretanto, quando se estratificou a comparação em nível de
espécie, os níveis da proteína em pacientes de TV sem anticorpos para C.trachomatis e
C.pneumoniae se torna bastante reduzido quando comparado com o grupo com anticorpos.
Portanto, a presença de marcadores de infecção pelas duas espécies pode funcionar como um
estímulo transcricional, juntamente com outros fatores, influenciando na maior secreção de
PrtCR em pacientes com valvulopatias (Skowasch et al., 2009).
Em relação a IL-6, os pacientes cardíacos possuem níveis da citocina maiores do que o
grupo controle, confirmando sua contribuição no processo inflamatório sistêmico relacionado
à doença. Os resultados encontrados correspondem ao esperado, uma vez que a IL-6
desempenha uma importante ação na indução da resposta de fase aguda, através da ativação
de proteínas do sistema complemento, outras citocinas próinflamatórias, diferenciação de
linfócitos B com formação de anticorpos, ativação de linfócito T e diferenciação de
macrófagos, bem como atividades relacionadas a sintomas locais como ativação de células
endoteliais, proliferação de sinoviócitos dentre outras células (Ishihara & Hirano, 2002;
Abeywardena et al., 2009; Vakili et al., 2011). Além de todas estas propriedades, é
importante ressaltar o papel da IL-6 no estímulo de outras proteínas de fase aguda, incluindo a
PrtCR cujos níveis plasmáticos também se mostraram significativos nos pacientes deste
estudo (Castell et al., 1990).
Ao analisar os níveis plasmáticos de IL-6 de acordo com o perfil genotípico de
pacientes e controles, foi observado que os portadores do genótipo GG de RM e TV
apresentaram concentrações maiores da citocina do que no grupo controle. Estes dados são
105
concordantes com resultados anteriormente descritos para o polimorfismo onde a frequência
do genótipo GG foi maior no grupo de pacientes (Giacconi et al., 2004; Antonicelli et al.,
2005).
Estes dados reforçam o estudo de Fishman et al., 1998, pois além de descreverem o
polimorfismo referido, avaliaram a atividade transcricional dos diferentes alelos após
exposição ao LPS in vitro. Foi observado que o gene portador do alelo G possui uma
atividade transcricional maior do que o gene portador do alelo C.
Os altos níveis de IL-6 nos pacientes de RM independem da presença de anticorpos
anti-Chlamydia, uma vez que uma diferença estatisticamente significante ainda é observada
mesmo entre o grupo sem anticorpos e o grupo controle. Entretanto, quando a comparação
ocorre entre o grupo de TV e o controle, se observou um padrão de associação diferente. O
grupo com anticorpos para Chlamydia apresentou níveis plasmáticos tres vezes mais elevados
da citocina do que o grupo sem anticorpos, ocorrendo uma perda na significância estatística
deste último grupo quando comparado com o controle. Estes dados são reforçados ao
subdividir a análise em nível de espécie, o grupo de TV apresenta significância estatística
apenas nas amostras positivas para C.trachomatis. Esta relação não é observada no grupo de
RM e TV quando testamos a soropositividade para C.pneumoniae. Portanto, é possível sugerir
que a presença de C.trachomatis pode acentuar a resposta imunológica em pacientes com
valvulopatia através do aumento nos níveis plasmáticos de IL−6 (Mazzone et al., 2004; Vats
et al., 2007).
O presente estudo analisou o perfil de expressão gênica de tres marcadores: TNF-α,
IL-8, IL-10. Para os genes do TNF-α e IL-8, foi observada uma baixa expressão entre os
pacientes cardíacos, quanto comparamos com o perfil genotípico e sorológico da população
controle. Mesmo apresentando uma atividade pro-inflamatória, é possível compreender que
estes marcadores possam apresentar uma baixa expressão, pois o controle da resposta
imunológica depende de diversos mecanismos de sinalização celular, incluindo o fato de
algumas vias de ativação de IL-8 depender da atividade do TNF- α agindo como ativador
pluripotente da inflamação (Vlahopoulos et al., 1999). Uma citocina com baixa expressão
pode deixar de estimular a expressão de outra através da interação entre diferentes fatores de
transcrição (Antoniv & Ivashkiv, 2011). Já foi demonstrado que o TGF-β1, uma citocina com
propriedades antiinflamatórias, participa inibindo a migração de neutrófilos para o tecido
lesionado através da inibição da expressão de IL-8 (Smith et al., 1996). O papel da IL-10,
como uma citocina imunossupressora, já está bem estabelecido podendo agir inibindo a
106
expressão do TNF-α, IL-8 e outras citocinas através da desestabilização do mRNA (Rajasingh
et al., 2006; Yilma et al., 2012).
A IL-10 é identificada como um fator de imunomodulação, inibindo diversas respostas
como a produção de citocinas com perfil Th1, e em outros momentos, agindo como
estimuladora de outras respostas celulares (linfócitos B, linfócitos T, células endoteliais etc)
(Couper et al., 2008). A análise dos níveis de expressão da IL-10 de acordo com o perfil
genotípico demonstrou uma maior expressão gênica relacionada aos genótipos GG e AG.
Estes resultados são reforçados pelo estudo de Turner et al. (1998), que observaram uma
variação na secreção da citocina de acordo com o perfil genotípico. Summers et al., 2000
observaram uma baixa produção de IL-10 entre o grupo portador do alelo A. Desta forma, o
presente estudo descreveu uma associação significante entre a expressão de IL-10 e o perfil
genotípico que nos permite sugerir que, mesmo com níveis basais de expressão, a citocina
pode influenciar na inibição de outros marcadores como TNF-α e IL-8 (Turner et al., 1997;
Eskdale et al., 1998).
Nas últimas décadas as informações mostram que os fatores de risco comportamentais
e ambientais não contribuem de forma isolada para o desenvolvimento das doenças
cardiovasculares. A patogênese da aterosclerose e valvulopatias se desenvolve por meio de
diversos mecanismos que, agindo sinergicamente, contribuem para evolução e desfechos
desfavoráveis, como o aumento da incidência das doenças e morte (Vigen et al., 2005).
Este trabalho faz parte de um projeto maior, que em seu final, poderá elucidar diversos
mecanismos envolvidos na evolução das doenças cardíacas. Ainda que este estudo não
apresente uma importância clínica em curto prazo, estes resultados são de extrema relevância
para a melhor compreensão da suscetibilidade genética, interação entre os biomarcadores pró
e antiinflamatórios, controle de expressão gênica e o papel de agentes infecciosos como
potencializadores da inflamação. Estes e outros marcadores imunogenéticos, de estresse
oxidativo, vasculares e inflamatórios auxiliam na identificação apropriada dos reais fatores de
risco, nos permitindo visualizar a natureza específica da doença cardiovascular.
A partir deste conhecimento, é importante levar em consideração a investigação
genética e o aprofundamento da pesquisa de uma etiologia infecciosa das doenças cardíacas
analisadas no presente estudo. Desta forma, podem ser criadas novas estratégias preventivas;
por exemplo, o agrupamento de pacientes de acordo com seus fatores de risco individuais
direcionando a abordagens terapêuticas tanto em nível de prevenção primária como
secundária, através da administração diferencial de fármacos, controle da evolução clínica e
aumento da sobrevida de pacientes com doenças cardiovasculares.
107
5 CONCLUSÕES
(i) Os pacientes com doença arterial coronariana deste estudo foram em sua maioria homens,
com (média de idade de 60,4 anos, casados, com nível fundamental incompleto,
paraenses, e renda até tres salários mínimos;
(ii) Os pacientes com valvulopatias foram em sua maioria mulheres, com média de idade de
45,6 anos, solteiros, com nível fundamental incompleto, paraenses, e renda até tres
salários mínimos;
(iii) A prevalência geral de anticorpos para C.trachomatis foi relativamente maior no grupo
controle, apontando uma disseminação igual entre pacientes cardíacos e indivíduos
saudáveis da cidade de Belém;
(iv) A prevalência geral de anticorpos para C.pneumoniae foi semelhantes entre os grupos
analisados, mostrando uma alta exposição à C.pneumoniae na cidade de Belém;
(v) Não houve associação entre a alta soroprevalência de C.pneumoniae e a presença da
bactéria em tecidos e placas, uma vez que não foi detectada a presença de DNA da
bactéria em tecido vascular e cardíaco;
(vi) O DNA do plasmídio críptico de C.trachomatis foi encontrado em 7,4% das amostras,
demonstrando pela primeira vez na nossa região a possibilidade de novas perspectivas
sobre a etiologia da doença cardiovascular;
(vii) Os polimorfismos para os gene de PrtCR, TNF-a e IL-10 não demonstraram associação
com o desenvolvimento de doença cardiovascular;
(viii) A análise do polimorfismo rs1800795(−174G>C) de IL-6 demonstrou que o genótipo
GG foi associado a um risco duas a tres vezes maior no desenvolvimento de doença
cardiovascular, quando comparado com outros genótipos;
(ix) A análise do polimorfismo rs1800795(−174G>C) de IL-6 demonstrou que o genótipo GC
(heterozigoto) foi associado a uma proteção no desenvolvimento de doença
cardiovascular, quando comparado com outros genótipos;
108
(x) A análise do polimorfismo rs4073(−251T>A) de IL-8 demonstrou que o genótipo AA foi
associado a um risco duas vezes maior no desenvolvimento de doença de válvula
cardíaca, quando comparado com outros genótipos;
(xi) A análise do polimorfismo rs4073(−251T>A) de IL-8 demonstrou que o genótipo AT foi
associado a uma proteção no desenvolvimento de doença de válvula cardíaca, quando
comparado com outros genótipos;
(xii) A suscetibilidade genética de IL-6 e IL-8 ocorreu de forma independente dos resultados
sorológicos para C.trachomatis, porém a presença de anticorpos para C.pneumoniae
demonstrou ser um fator adicional ao risco de doença cardiovascular;
(xiii) Os níveis plasmáticos de PrtCR foram mais elevados nos pacientes do que no grupo
controle, e uma maior concentração foi associada a presença do genótipo TT,
reforçando o papel desta proteína como marcador de processos inflamatórios e risco a
doença cardiovascular;
(xiv) A presença de anticorpos para C.trachomatis e C.pneumoniae pode estimular uma
maior secreção de PrtCR em pacientes do doença de válvula cardíaca;
(xv) Os níveis plasmáticos de IL-6 foram mais elevados nos pacientes do que no grupo
controle, e uma maior concentração foi associada à presença do genótipo GG,
ressaltando o papel desta citocina na indução das respostas pró-inflamatórias,
possivelmente estimulando a secreção de proteínas de fase aguda (PrtCR).
(xvi) A presença de anticorpos para C.trachomatis pode estimular uma maior secreção de IL-6
em pacientes com doença de válvula cardíaca;
(xvii) As citocinas TNF-α e IL-8 mostraram uma baixa expressão gênica entre os pacientes
cardíacos;
(xviii) Os níveis de expressão gênica de IL-10 não se mostraram diferentes entre pacientes e
grupo controle, entretanto, estão associados a uma maior atividade transcricional para os
genótipos GG e AG de pacientes;
109
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132
APÊNDICE 1
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA
QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO
1. Projeto:
Prontuário n°:
Protocolo n°:
Data da coleta de dados:
2. Nome:
3. Endereço
4. Município:
5. Município de residência anterior (<05 anos no endereço atual):
6. Data da coleta de amostra:
7. Nascimento: ___ / ____/ ____
8. Sexo:
1. Masculino
Idade:
2. Feminino
9. Naturalidade:
10. Estado civil:
11. Naturalidade do pai:
Naturalidade da mãe:
12. Naturalidade do avô:
Naturalidade da avó:
13. Profissão: ____________
1-3
c) 4-7
Renda familiar (salários): _______
d) 8-10
a) < 1
e) > 10
ESCOLARIDADE
14. a) Não alfabetizado
b) Alfabetizado
c) Ens. Fundamental incompleto
d) Ens. Fundamental completo
e) Ens. Médio incompleto
f) Ens. médio completo
g) 3º grau incompleto
h) 3º grau completo
INFORMAÇÕES CLÍNICAS
15. Foi obeso na infância 1. Sim
16. Há pessoas obesas na família
2. Não
1. Sim
2. Não Quantas?
17. Apresenta acúmulo de gordura na região abdominal?
1. Sim
2. Não
18. Possui histórico familiar de ataque cardíaco, infarto do miocárdio?
19. Peso atual:____________ altura:_________ Pressão arterial:_________
b)
133
20. Consumo de bebida alcoólica? 1. Sim
21. Hábitos de tabagismo 1. Sim
2. Não
22. Pratica alguma atividade física?
1.Sim
2. Não
Quantos cigarros por dia?______
2. Não
Qual?__________
INFORMAÇÕES LABORATORIAIS
HDL:_________ LDL:_________ Colesterol total:__________ Triglicerídeos:__________
Está usando alguma medicação: _______ Qual?____________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
25. A medicação foi tomada hoje? ______ Qual o horário?__________
25. Já apresentou alguma doença respiratória (pneumonia, bronquite, etc.)?______
26. Já apresentou hipertensão?
1. Sim
27. Já apresentou hiperlipidemia?
28. É diabético?
1. Sim
2. Não
1. Sim
2. Não
2. Não
29. Possui hábitos saudáveis de alimentação? (frutas, verduras, legumes, fibras)
1. Sim
2. Não
30. Evita o consumo de refrigerantes, frituras, e comidas gordurosas?
1. Sim
2. Não
COMPORTAMENTO SEXUAL
( ) Homossexual
( ) Heterossexual
( ) Bissexual
Números de parceiros: ________
Uso de camisinhas: 1. Sempre
História de IST: 1. Sim
Qual frequência:
2. Às vezes 3. Nunca
2. Não
Quais: ______________
134
APÊNDICE 2
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1. Estou sendo convidado(a) a participar de uma pesquisa sobre “A participação da
Chlamydia pneumoniae e C.trachomatis na geração de doença cardíaca”, que está sendo
desenvolvida pela Universidade Federal do Pará e pela Universidade do Estado do Pará.
2. Para que eu decida em participar ou não da pesquisa me foram prestadas as seguintes
informações:
3. O pesquisador responsável é o Prof. Dr. Ricardo Ishak, Biomédico, Professor Titular da
Universidade Federal do Pará.
4. O objetivo da pesquisa é o de aumentar o conhecimento vigente acerca da infecção
bacteriana e o aparecimento de doença vascular e cardíaca no hospedeiro.
5. Durante a pesquisa o paciente deverá responder a um questionário, depois será submetida
a coleta de sangue para exame de laboratório; a placa de ateroma usada no projeto será
àquela removida por meio do processo cirúrgico de rotina.
6. Essa pesquisa não oferece riscos; as práticas são de uso rotineiro e apenas uma pequena
quantidade de sangue (10mL) será coletada para a detecção de anticorpos, marcadores da
resposta inflamatória, imunológica e marcadores genéticos da bactéria e do hospedeiro.
7. Na colheita de material biológico serão utilizados materiais esterilizados descartáveis,
como agulhas, seringas, que não oferecem risco para o sujeito da pesquisa; os
procedimentos cirúrgicos obedecerão as práticas rotineiras de cirurgia cardíaca.
8. Ninguém é obrigado a participar da pesquisa, assim como poderá deixar a pesquisa no
momento que quiser, pois não haverá prejuízo pessoal por esta causa.
9. Não haverá nenhum tipo de despesas para participação da pesquisa, assim como não
haverá nenhuma forma de pagamento para participação.
10. O grande benefício desta pesquisa para todos os que participam, ou não, é possibilitar um
melhor entendimento sobre o processo que leva à formação da placa de ateroma e a
doença cardíaca seguindo-se às infecções por bactérias do gênero Chlamydia.
11. A participação na pesquisa é sigilosa, isto significa que, somente os pesquisadores ficarão
sabendo de sua participação. Os dados utilizados na pesquisa terão uso exclusivo neste
trabalho, sem a identificação individual do participante.
____________________________
Assinatura do Pesquisador Responsável
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente
esclarecido(a) acerca do conteúdo da mesma, assim como seus riscos e benefícios. Declaro
que, por minha livre vontade, aceito participar da pesquisa cooperando com a coleta de
material para exame. Belém, ____ / _____ / _____
Prontuário:______________
Protocolo:_________
Assinatura:______________________________________
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Virologia,
Fone: (91) 3201-7587 e-mail: [email protected]
135
APÊNDICE 3
Extração do DNA
Foi utilizado o método de extração de DNA total a partir de células
mononucleadas do sangue periférico, de acordo com o protocolo do método FenolClorofórmio. O procedimento segue as etapas:
- LISE DE HEMÁCIAS (Solução A: Cloreto de Amônio [1.0M], EDTA [0.1M], H2O
destilada; Solução B: Bicarbonato de Amônio [1.0M], H2O destilada).
1.
Em um tubo de 2mL adicionar 300 μL de sangue e 900 μL de solução de lise de
hemácias.
2.
Agitar por inversão por 20 minutos.
3.
Centrigugar (14.000 rpm) por 3 minutos.
4.
Descartar o sobrenadante e acrescentar 900 μL de lise de hemácias novamente.
5.
6.
Centrigugar (14.000 rpm) por 3 minutos.
7.
Descartar o sobrenadante.
- LISE DE LEUCÓCITOS (Tris-HCl [100mM], EDTA [20mM], NaCl [200mM], SDS
0,5 %, H2O destilada).
1.
Acrescentar ao pellet 500 μL de lise de leucócitos.
2.
Agitar no vortex até dissolver o pellet.
3.
Incubar em banho-maria (55ºC) por 30 minutos.
- PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS (Acetato de Amônio [7,5M], H2O destilada).
1.
Acrescentar 200 μL de Solução de Precipitação de Proteínas.
2.
Agitar brevemente no vortex.
3.
Levar ao banho maria (55ºC) por 30 minutos.
4.
Centrifugar (14.000 rpm) por 10 minutos.
5.
Transferir o sobrenadante para um tubo de 2ml limpo. (Descartar o tubo com o
precipitado de proteínas).
6.
Adicionar 500 μL de Fenol-Clorofórmio álcool isoamílico.
7.
8.
Centrifugar (14.000 rpm) por 10 minutos.
9.
Transferir o sobrenadante para um tubo de 2mL limpo.
10. Acrescentar ao sobrenadante 1,5mL de Isopropanol (2-propanol).
11. Visualizar o pellet de DNA. (Verificar conforme a quantidade de DNA formado a
quantidade de H2O para hidratá-lo).
136
12. Centrifugar (14.000 rpm) por 10 minutos.
13. Desprezar o sobrenadante.
14. Adicionar 200 μL de Etanol a 70% lavando a parede do tubo.
15. Desprezar o etanol e deixar secando até evaporar completamente o álcool.
16. Adicionar H2O para hidratá-lo.
137
ANEXO 1

Marcadores da Infecção por Chlamydia - PPGBAIP

Transcrição

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