Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos

Preservação e Prospecção de Recursos
Microbianos
Valéria Maia de Oliveira, Lara Durães Sette e Fabiana Fantinatti-Garboggini
DivisãodeRecursos Microbianos
Centro Pluridisciplinar dePesquisas Químicas,Biológicase Agrícolas(CPQBA)
UniversidadeEstadual deCampinas
CaixaPostal6171,CEP:13081-970,Campinas,SP.
E-mail:[email protected];[email protected]@cpqba.unicamp.br
Resumo
Os microrganismos são as entidades bióticas mais numerosas e antigas, capazes de
colonizar com sucesso cada nicho ecológico possível do planeta. Suas presença e
atividade são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos ecossistemas. Além
disso, os microrganismos representam uma importante fonte de recursos genéticos para
o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico sustentável. Estratégias
tradicionais de isolamento e seleção de microrganismos têm garantido o
desenvolvimento de novos fármacos e aplicações nas áreas de saúde, agricultura,
indústria e meio ambiente. Nos últimos anos, novas abordagens de trabalho, envolvendo
metodologias de bioinformática e biologia molecular, vêm permitindo a prospecção in
silico de informações a partir de dados genômicos em bases de dados e a análise de
microrganismos sem a necessidade de isolamento e cultivo, a partir da clonagem direta
de DNA de amostras ambientais (metagenoma). A devida caracterização e preservação
dos recursos microbianos são fatores de fundamental importância para o
desenvolvimento da bioeconomia no século 21. Neste contexto, as Coleções Biológicas
ou Centros de Recursos Biológicos desempenham papel relevante como centros de
conservação da biodiversidade e são responsáveis pela aquisição, caracterização,
autenticação, preservação e distribuição de material biológico com conformidade
assegurada.
Palavras chaves: Biotecnologia; diversidade microbiana; genômica; metagenômica;
Centros de Recursos Microbianos.
1
Introdução
À exceção de animais e plantas superiores, o conhecimento da diversidade
biológica em termos de riqueza de espécies, distribuição local e global, e função no
ecossistema, permanece ainda bastante incompleto.
A evolução das metodologias de biologia molecular aplicada ao estudo do meio
ambiente tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento
sobre a diversidade microbiana (1). Resultados de estudos independentes de isolamento
e cultivo, baseados em amplificação e seqüenciamento de fragmentos de genes do
operon ribossomal, demonstraram que apenas uma pequena fração dos microrganismos
(<10% em solos e <1% em ambientes aquáticos) é usualmente recuperada em estudos
baseados em isolamento e cultivo. A utilização das metodologias moleculares levou,
portanto, a uma drástica mudança na perspectiva da diversidade microbiana existente no
ambiente, sendo que um levantamento recente apontou como 53 o número de divisões
dentro do Domínio Bacteria, das quais aproximadamente 50% não possuem
representantes cultivados (2).
Frente à vasta diversidade representada pelos microrganismos ainda nãocultivados e às limitações de cultivo e manipulação de organismos extremófilos em
laboratórios (hipertermófilos, psicrófilos e barofílicos, entre outros), torna-se premente a
necessidade da adoção de novas estratégias para a exploração plena e preservação dos
recursos genéticos microbianos.
Os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a
diversidade microbiana são extensos (3) (4), entre outros, a melhor compreensão das
funções exercidas pelas comunidades microbianas nos ambientes e o conhecimento das
suas interações com outros componentes da biodiversidade. Os benefícios econômicos e
estratégicos estão relacionados com a descoberta de microrganismos potencialmente
exploráveis nos processos biotecnológicos para: novos antibióticos e agentes
terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e polímeros para aplicações
industriais e tecnológicas, biorremediação de poluentes e biolixiviação e recuperação de
minérios. Outros benefícios incluem o prognóstico e prevenção de doenças emergentes
em seres humanos, animais e plantas, e a otimização da capacidade microbiana para a
fertilização dos solos e despoluição das águas.
2
Exploração da Diversidade Microbiana
Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente e contribuem para a
estabilidade de ecossistemas, sendo também responsáveis pela ciclagem dos compostos
químicos, incluindo a degradação de poluentes ambientais. Apesar de sua grande
importância na manutenção da biosfera, estima-se que menos de 10% dos
microrganismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos (5). O
conhecimento da biodiversidade e bioprospecção de novos microrganismos tornaram-se
uns dos focos principais da era biotecnológica, visto que a utilização destes organismos
na busca de soluções nas áreas de alimento, saúde, meio ambiente e indústria vem
crescendo de forma acelerada no atual cenário mundial.
A extraordinária atividade dos microrganismos está baseada em sua notável
diversidade metabólica e adaptabilidade genética (6), o que os torna uma importante
fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento
sustentável. São vários os exemplos que atestam a utilização de recursos microbianos
pelo homem em diversas atividades de importância sócio-econômica: na área industrial,
os microrganismos são empregados na produção de compostos comerciais ou para
transformação de substratos em produtos de maior valor agregado; na agropecuária,
destacam-se os microrganismos fixadores de nitrogênio e os empregados no controle
biológico de pragas e vetores; na área de alimentos, as linhagens microbianas são
empregadas na produção de bebidas, panificação, queijos, ácidos orgânicos, enzimas,
dentre outros; e na área ambiental, as perspectivas de recuperação do meio ambiente
através da biorremediação são bastante promissoras e dependentes de novos isolados.
A exploração dos microrganismos pela indústria gera bilhões de dólares a cada
ano (6). O valor dos microrganismos é geralmente avaliado pela potencial aplicação
direta nos processos biotecnológicos ou valor de mercado dos produtos derivados,
sendo muito menos contemplados os valores associados aos benefícios ambientais e
sociais decorrentes do tratamento de resíduos industriais e poluição ambiental.
O sucesso dos processos biotecnológicos está diretamente relacionado com a
diversidade dos microrganismos e das moléculas que eles produzem como resultado do
metabolismo primário e secundário, bem como com a conservação dos recursos
genéticos que eles fornecem (4). Conseqüentemente, o aumento da diversidade de
compostos químicos para os diferentes setores industriais está associado com a
3
exploração da diversidade microbiana e são muitos os benefícios científicos esperados
como resultado desta exploração (3) (4).
Resumidamente, um processo de busca e descoberta de produtos naturais a partir
dos recursos microbianos passa pela coleta de material biológico, pré-seleção e triagem
de materiais, seleção final do(s) melhor(es) candidato(s) a partir de uma lista reduzida
de opções e culmina com o desenvolvimento de um produto comercial ou processo
industrial (7). Entretanto, este processo vem sofrendo profundas alterações em função
das mudanças de modelos desencadeadas pelos avanços em biologia molecular,
genômica, metagenômica e bioinformática.
Impacto da Genômica na descoberta de novos produtos bioativos
A genômica corresponde à área da ciência que pesquisa e desenvolve tecnologia
para a investigação da estrutura e organização dos genes de um determinado organismo,
fornecendo um catálogo completo dos genes e das proteínas presentes no mesmo.
Assim, o objetivo atual é conhecer o conjunto de todos os genes de um organismo (isto
é, o genoma) e compreender as redes funcionais que se estabelecem entre as proteínas
por eles codificadas (isto é, o proteoma). Esta nova abordagem substitui a atitude
reducionista de analisar os genes um a um, predominante durante as últimas décadas do
século XX.
Atualmente, a análise genômica de microrganismos encontra-se em fase
exponencial, uma vez que muitos genomas de bactérias tanto patogênicas quanto nãopatogênicas foram seqüenciados e depositados nos bancos de dados juntamente com
suas informações associadas. Essas informações possibilitam a abertura de novas linhas
de pesquisa, tais como a genômica funcional e proteômica, que são mais informativas e
eficientes na compreensão da biologia dos microrganismos e suas relações com o meio
ambiente. Além disso, a análise comparativa de genomas bacterianos tem contribuído
para a identificação de novos mecanismos adaptativos e tem permitido inferências nos
aspectos evolutivos dessas formas de vida.
O primeiro organismo a ter seu genoma completamente seqüenciado foi a bactéria
Haemophilus influenzae, cujo trabalho foi concluído em 1995 por um grupo do TIGR
(The Institute for Genomic Research) nos Estados Unidos. A estratégia utilizada foi o
seqüenciamento genômico usando fragmentos aleatórios de DNA (Whole Genome
Shotgun Sequencing) (8) (9), eliminando assim, a necessidade de abordagens de
mapeamento genômico. Essa estratégia de seqüenciamento associada à área de
4
bioinformática, a qual desenvolve métodos computacionais de algoritmos que auxiliam
a montagem dos genomas, multiplicou o número de genomas disponíveis nos bancos de
dados nos últimos anos (10).
Em 2001, o Brasil entrou definitivamente na era genômica quando concluiu o
projeto de seqüenciamento da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa (11), causadora
do CVC (Citrus Variegated Chlorosis), ou amarelinho, em culturas de citrus (ONSAFAPESP). Este projeto congregou vários laboratórios dentro do estado de São Paulo,
contribuindo para a formação de competência profissional e infra-estrutura na área. A
este, seguiram-se outros, que igualmente contribuíram para que as pesquisas na área de
genômica se expandissem em nível nacional. Atualmente, o Brasil conta com vários
genomas seqüenciados e armazenados, entre eles, o genoma da bactéria Xylella
fastidiosa que causa a doença de Pierce nas videiras da Califórnia (12) (AEG-FAPESP);
os cosmídeos dos Projetos Genoma da Xanthomonas axonopodis pv citri (causa o
Cancro Cítrico) e os da bactéria Xanthomonas campestris pv campestris (ataca as
brássicas) (ONSA-FAPESP); os genomas das bactérias Chromobacterium violaceum
(13; 14) e Mycoplasma synoviae (15) (Genoma Nacionall – CNPq) e Mycoplasma
hyopneumoniae (15) (Rede Sul – CNPq); e as bibliotecas de clones ESTs do Genoma da
cana-de-açúcar (SUCEST-FAPESP); do Eucalipto (AEG-FAPESP); do café Coffea
robusta (AEG-FAPESP) e, mais recentemente, do bovino Bos indicus (AEG-FAPESP),
entre outros. Em seguida aos seqüenciamentos surgiram grupos de estudos de genoma
funcional com o objetivo de analisar as funções biológicas dos genes identificados e
gerar benefícios potenciais nas áreas da agricultura, saúde e biotecnologia.
A vasta quantidade de dados gerados por projetos na área genômica está
ocasionando uma verdadeira revolução, com grande potencial para o desenvolvimento
da biologia básica e aplicada. A comunidade científica está concentrada principalmente
em decifrar a informação genética contida na molécula de DNA, com o objetivo de
compreender a fisiologia dessas diferentes formas de vida, criando condições para
interferir nos processos biológicos em prol da agricultura e da medicina (10).
As análises comparativas iniciais das enzimas envolvidas na conservação de
energia em procariotos revelaram um perfil filogenético complexo, sugerindo que a
adaptação dos microrganismos a nichos especializados levou não só à perda de genes,
mas também à sua aquisição. Além disso, a análise comparativa dos diferentes genomas
de patógenos de plantas pode contribuir com informações importantes na elucidação de
mecanismos de instalação da doença em vegetais, identificação de novos agentes
5
envolvidos nesse processo e mecanismos específicos de interação entre patógenohospedeiro. No caso da bactéria Xylella fastidiosa, antes da elucidação da seqüência
completa, muito pouco era conhecido do mecanismo molecular de patogenicidade da
bactéria. Hoje, além dos genes relacionados com o metabolismo básico, vários genes
relacionados com a patogenicidade foram identificados, alguns deles nunca
anteriormente identificados em patógenos de plantas, trazendo novas inferências ao
processo de patogenicidade bactéria-planta (11).
A chamada “era pós-genômica” começou com a constatação de que os dados
trazidos pelo seqüenciamento das moléculas de DNA, embora relevantes, são limitados,
sendo imprescindível investigar tanto os processos de transcrição das informações
contidas no genoma quanto os seus produtos, as proteínas (16). Neste contexto, a
estratégia tecnológica denominada DNA microarray (microchip de DNA) veio
revolucionar a capacidade de coletar informação na área da genômica funcional. Após o
seqüenciamento do genoma de um determinado organismo, os DNA microarrays
permitem obter o perfil completo dos genes que são expressos em qualquer tipo celular
desse organismo. A técnica DNA microarray consiste na hibridização com RNAs
mensageiros (RNAm) em um suporte contendo milhares de seqüências de DNA
imobilizadas visando a identificação específica de genes, a comparação de genomas
diferentes e o monitoramento da expressão gênica (17).
Dentre as múltiplas aplicações do DNA microarray em investigação biomédica,
duas apresentam grande relevância em Microbiologia: a pesquisa de novas drogas e
novos métodos para diagnosticar microrganismos patogênicos. Até a última metade do
século passado, a procura de novas drogas terapêuticas iniciava-se com a identificação
da via bioquímica implicada num processo fisiopatológico. Uma vez identificadas as
potenciais enzimas alvo, procuravam-se então pequenas moléculas com capacidade de
se ligarem especificamente a essas enzimas, as quais pudessem interferir no seu
funcionamento. Atualmente, com a utilização da metodologia de DNA microarray a
indústria farmacêutica pode aumentar a precisão e eficácia na procura de novos
potenciais alvos, bem como, validar esses alvos (isto é, demonstrar que a utilidade
terapêutica está na interferência com a molécula alvo), otimizar os efeitos pretendidos e
reduzir a sua toxicidade. Por outro lado, os DNA microarrays também estão
revolucionando a área de Microbiologia, ao permitirem obter “impressões digitais” de
agentes patogênicos ainda desconhecidos ou difíceis de cultivar no laboratório e analisar
6
padrões de expressão em macrófagos humanos infectados com diversos agentes
patogênicos, virais ou bacterianos.
O seqüenciamento do genoma humano, aliado à genômica estrutural e funcional,
trouxe grande impacto na medicina, possibilitando a identificação de fatores de risco, de
prognóstico e de resposta ao tratamento do câncer e a customização de terapias,
permitindo a individualização dos tratamentos, com maior resolução e menor custo.
No passado, os bioquímicos destruíam as células, analisavam seus componentes,
isolavam-nos para determinar sua estrutura tridimensional na busca de saber como
funcionam. No futuro, com o conhecimento das partes e por meio da simulação
computacional de diferentes redes de genes, complexos protéicos e vias metabólicas,
será possível ter o conhecimento global de como o conjunto opera em sua dinâmica para
sobreviver às variações do meio.
Estas novas metodologias e estratégias têm a vantagem de serem aplicáveis no
estudo e caracterização de genes diversos, conhecidos ou não, incluindo a prospecção de
alvos em genomas de organismos ainda não cultiváveis ou de difícil cultivo em
laboratório. Assim, o ‘genoma’ estuda a molécula de DNA e a informação nela
armazenada sob a forma de genes. A transcrição do DNA para o RNA, o primeiro passo
do fluxo da informação genética, é investigada pelo estudo do ‘transcriptoma’, que dá
uma idéia da funcionalidade do genoma daquela célula. As proteínas expressas são
analisadas e identificadas pelo ‘proteoma’, enquanto o ‘metaboloma’ visa determinar os
metabólitos, os produtos finais dos diversos processos celulares e que podem englobar,
além dos nucleotídeos e aminoácidos, os açúcares, lipídios, esteróides e mais uma
infinidade de outras moléculas importantes para a manutenção da atividade biológica.
Metagenômica Microbiana: acesso à biodiversidade não cultivada
Do ponto de vista histórico, microrganismos cultiváveis do solo têm sido uma
fonte inestimável para a produção de compostos naturais com atividade biológica
importantes para a humanidade (7). Durante os últimos 50 anos, produtos derivados de
metabólitos secundários têm sido usados nas áreas médica, industrial e agrícola, como
os antibióticos, drogas anti-carcinogênicas, anti-fúngicos, agentes imunossupressores,
probióticos; enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, herbicidas,
inseticidas, promotores de crescimento, entre outros. Outras enzimas microbianas são
importantes para pesquisa acadêmica e desenvolvimento de aplicações biotecnológicas,
7
incluindo as enzimas de restrição e polimerases de ácidos nucléicos, as quais são
rotineiramente utilizadas na tecnologia do DNA recombinante.
Tradicionalmente, compostos com atividade biológica têm sido acessados por
métodos envolvendo isolamento e cultivo dos organismos a partir das amostras
ambientais, principalmente solo. Isolados e/ou produtos de fermentação passam por um
processo de triagem para as atividades desejadas. A maioria das enzimas utilizadas
industrialmente tem sido descoberta desta maneira. Apesar do sucesso desta abordagem,
várias limitações têm sido reconhecidas ultimamente, como algumas reações de
biotransformação e biocatalíticas, as quais ainda permanecem impraticáveis em função
de deficiências associadas às enzimas, tais como baixa taxa de expressão ou localização
intracelular. A descoberta de perfis de atividade novos freqüentemente requer novos
compostos e a estratégia de cultivo parece recuperar, na sua maioria, microrganismos
conhecidos.
A alta taxa de “redescoberta” de produtos naturais, principalmente metabólitos
secundários, a partir de microrganismos que podem ser cultivados em laboratório nos
últimos 20 anos tem levado à idéia de que esta “fonte inestimável” de produtos naturais
se esgotou (18).
Por outro lado, nos últimos anos, estudos de diversidade microbiana empregando
microscopia e contagem de células têm revelado que podemos recuperar apenas cerca
de 1-10% dos microrganismos de uma amostra ambiental através do isolamento e
cultivo (19) (20) (21). Isto se deve basicamente às limitações inerentes às técnicas de
plaqueamento e cultivo, uma vez que todos os meios de cultura são seletivos em maior
ou menor extensão para os diversos grupos de microrganismos e, na maioria das vezes,
incapazes de reproduzir as condições encontradas no ambiente. Este é o caso de
microrganismos que vivem sob a forma de consórcios, onde uma espécie depende de
produtos do metabolismo de outras espécies para sua sobrevivência e multiplicação; de
microrganismos simbiontes, os quais vivem no interior de outros organismos e de
microrganismos extremófilos, como aqueles adaptados a condições extremas de
temperatura ou pressão, por exemplo.
Portanto, os genomas da microbiota total encontrada em uma comunidade,
chamados coletivamente de metagenoma (22), contêm muito mais informação genética
do que aquela verificada na diversidade microbiana cultivada.
Metodologias moleculares desenvolvidas nas últimas décadas foram otimizadas
e adaptadas para superar as limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de
8
populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos microrganismos, e
desencadearam uma série de estudos de ecologia microbiana que mudaram
drasticamente a perspectiva da diversidade microbiana. Estes métodos envolvem a lise
de células microbianas na matriz do solo, a extração dos ácidos nucléicos a partir desta
matriz e a análise de seqüências-alvo nas amostras mistas de DNA de organismos
diversos (metagenoma), utilizando para isso sondas ou primers grupo-específicos. Esta
estratégia foi adotada como ferramenta padrão para analisar a diversidade de muitos
ambientes diferentes, revelando a descoberta de novos grupos de organismos, nunca
antes cultivados (21) (23) (24). Entretanto, estas metodologias não nos permitem ter
acesso ao potencial metabólico destes novos organismos, uma vez que as etapas de
isolamento e cultivo são suprimidas dos estudos.
Uma estratégia molecular que oferece uma alternativa para a exploração do
potencial metabólico de microrganismos que não são recuperados por métodos baseados
em cultivo envolve o uso de vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome),
para clonagem de fragmentos grandes de DNA (20 a 300 kb) a partir de amostras
ambientais, e análise das complexas bibliotecas metagenômicas resultantes em busca
por novas atividades biológicas (22) (25) (26) (Figura 1).
Originalmente desenvolvidos para mapeamento cromossômico e análise do
genoma humano, os vetores BAC podem manter de maneira estável insertos de DNA
excedendo 300.000 pares de bases (27) e permitir a expressão de genes procarióticos em
um hospedeiro bacteriano heterólogo (28), isto é, uma linhagem de bactéria de uma
espécie diferente daquela de onde os genes foram originalmente clonados, a qual pode
ter sistemas de expressão e regulação gênicas diferentes.
Figura
1.
Construção
de
uma
biblioteca metagenômica. Fragmentos
grandes
de
DNA
obtidos
de
microrganismos não cultivados de
solo são ligados em vetores BAC e
transformados em células hospedeiras
de E. coli. Fonte: Osburne et al. (29).
(Reproduzido
com
permissão
da
American Society for Microbiology).
9
Bibliotecas BAC oferecem assim uma ferramenta poderosa para acessar de
maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente,
permitindo a análise de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de
microrganismos não-cultivados. Desta forma, a partir de uma biblioteca BAC de
metagenoma, uma variedade maior de compostos com atividade biológica de interesse
pode ser obtida simultaneamente, em comparação ao método tradicional de obtenção de
compostos naturais, baseado em isolamento, cultivo e triagem de linhagens puras de
microrganismos (Figura 2).
Figura 2. Comparação esquemática das estratégias de cultivo (esquerda) e metagenoma (direita) para
obtenção de novos compostos com atividade biológica. Com a estratégia de cultivo, apenas uma fração da
diversidade microbiana existente pode ser obtida em cultura pura. Os microrganismos não cultivados só
podem ser acessados através de seus genomas. Assim, com a estratégia de metagenoma, os genomas de
todos os microrganismos em um dado habitat são isolados e clonados em hospedeiros para subseqüente
seleção e expressão do composto de interesse Fonte: Lorenz et al. (30). (Reproduzido com permissão da
Elsevier).
10
A viabilização das bibliotecas metagenômicas como um método para seleção de
novos compostos de interesse só é possível, no entanto, quando uma abordagem
integrada é usada, combinando metodologias de triagem de alto desempenho (highthroughput) recém-desenvolvidas, como ensaios enzimáticos miniaturizados (em
microplacas) associados a leitores de placa e tecnologia de hibridização em microarrays
de DNA, com seqüenciamento em larga escala e a bioinformática. Esta última envolve o
desenvolvimento e o emprego de bases de dados e programas de análise de seqüências
de DNA e proteínas para acelerar a análise funcional e comparativa dos genes ou
operons clonados.
A estratégia BAC abre, portanto, perspectivas para a descoberta de novos
produtos naturais. Os genes requeridos para a biossíntese de muitos antibióticos e outros
metabólitos geralmente estão agrupados, juntamente com genes para auto-resistência, e
são comumente grandes e difíceis de clonar usando-se estratégias convencionais. Com a
estratégia BAC é possível clonar uma via biossintética inteira em um plasmídio BAC,
permitindo a captura, expressão e detecção de produtos naturais a partir de uma
biblioteca construída de DNA ambiental. Ainda, a produção de tais compostos em um
sistema geneticamente definido como aquele de E. coli torna a manipulação dos genes
clonados mais fácil.
Rondon et al. (26) mostraram que clones BAC, obtidos utilizando DNA
genômico originado diretamente de solo agrícola (metagenoma), podiam expressar
várias funções biológicas em E. coli, incluindo a produção de amilases, lipases e
antibacterianos. Além disso, os autores demonstraram que as seqüências que codificam
para estes produtos eram novas, corroborando a hipótese de que bibliotecas BAC de
DNA ambiental fornecem uma inestimável fonte de genes novos. Utilizando a mesma
biblioteca BAC, Gillespie e colaboradores (31) conseguiram a expressão e o isolamento
de compostos pigmentados com atividade antibiótica de amplo espectro, designados
Turbomicina A e B.
A expressão e o isolamento de pequenas moléculas antimicrobianas a partir de
bibliotecas de DNA do solo também foram obtidos por MacNeil et al. (32), que
demonstraram a expressão de uma família de moléculas pequenas relacionadas à
indirubina, uma molécula pigmentada com propriedades anti-leucêmicas.
Outros estudos de triagem de bibliotecas metagenômicas permitiram a detecção
de genes de quitinase (33), 4-hidroxi butirato desidrogenase (34), lipase (35), protease
(36), sintases policetônicas (37) (38) e nitrilases (39). Um amplo estudo conduzido
11
recentemente por Voget et al. (40), combinando uma estratégia dependente de cultivo
com triagem de biblioteca metagenômica e seqüenciamento, resultou na identificação de
vários genes que codificam enzimas com valor biotecnológico, incluindo agarases,
celulases, uma alfa-amilase, pectato liases e lipases.
Os avanços recentes obtidos na busca por atividade biológica fazem da clonagem
de metagenoma e triagem dos clones resultantes para produção de compostos naturais
uma tecnologia oportuna e factível. As metodologias high-throughput tornam viável o
teste de milhares de clones requeridos para cobrir o metagenoma do solo. A
sensibilidade dos ensaios modernos para atividade biológica, particularmente aqueles
conduzidos em nanoescala, fornece um meio para identificar clones que produzem ou
exportam pequenas quantidades de uma molécula ativa. Inclusive, o uso de E. coli como
célula hospedeira estende o poder desta estratégia, uma vez que esta bactéria é
comumente usada em fermentação industrial e, portanto, métodos sofisticados que
facilitam a produção em batelada, separações, assim como o processamento
downstream, já estão bem estabelecidos. Isto significa que muitos dos estágios de
desenvolvimento para a produção comercial de compostos úteis já foram realizados
antes dos genes serem clonados, oferecendo uma vantagem sobre os produtos naturais
derivados diretamente de organismos “selvagens” que podem ser difíceis de manipular
para propósitos industriais.
Os métodos desenvolvidos para a descoberta de novas vias de síntese de produtos
naturais a partir de microrganismos de solo vem sendo atualmente utilizados para outros
habitats, tais como a microbiota de insetos ou animais marinhos (41), os quais são tidos
como uma fonte promissora de novos compostos mas freqüentemente difíceis de serem
reproduzidos em laboratório.
Os primeiros esforços na construção de bibliotecas metagenômicas a partir de
ambientes brasileiros, visando à bioprospecção microbiana, tiveram início recentemente
no Brasil em alguns poucos grupos de pesquisa. Entretanto, ainda não foram registrados
resultados concretos na obtenção de atividades biológicas ou produtos naturais com
potencial
para
aplicação
tecnológica.
Alguns
dos
projetos
atualmente
em
desenvolvimento na linha de metagenômica incluem um convênio firmado entre a
Petrobras e o CPQBA e um projeto financiado pela Fapesp (no. Processo 04/01794-1),
os quais têm como objetivos a implementação da metodologia de construção de
bibliotecas metagenômicas e a subseqüente exploração da microbiota presente em
amostras de lodo de efluentes de refinarias petróleo e em sedimentos impactados com
12
hidrocarbonetos, respectivamente. A triagem destas bibliotecas metagenômicas
permitirá a obtenção de clones, ou consórcios destes, que apresentem alta eficiência de
degradação de um ou vários compostos aromáticos recalcitrantes e que possam ser
utilizados em tratamentos complementares de efluentes de refinarias de petróleo e em
processos de biorremediação de áreas contaminadas. Ainda, estes projetos propõem
analisar a diversidade de genes de degradação de hidrocarbonetos ou compostos
aromáticos recalcitrantes nas bibliotecas metagenômicas, contribuindo para o
conhecimento sobre as vias catalíticas utilizadas na degradação de compostos do
petróleo.
A bioprospecção genômica microbiana é uma estratégia inovadora na área de
microbiologia do petróleo que poderá gerar tecnologia de grande impacto econômico
para os setores de exploração e processamento de petróleo no país.
Uma revisão recente sobre os estado da arte da metagenômica microbiana foi
elaborada por Oliveira e Manfio (42), que apontam esta abordagem como uma
tecnologia de ponta altamente eficiente para a descoberta de novas enzimas para o
mercado tecnológico.
Importância dos Centros de Recursos Microbianos na Biotecnologia
A biotecnologia é reconhecida como uma das mais promissoras tecnologias para
o século 21, devido às suas características de inovação e impacto na busca e descoberta
de recursos biológicos industrialmente exploráveis e pela importância frente a
problemas globais tais como: doenças, nutrição e poluição ambiental (43).
O material biológico representa um novo insumo tanto no ambiente da pesquisa
e desenvolvimento quanto nos processos produtivos, cujo tratamento requer a
implementação de um sistema que permita assegurar, para todos os efeitos, que um
dado material biológico mantenha as características nele identificadas ou a ele
atribuídas. Neste contexto, as coleções biológicas são essenciais para o suporte ao
desenvolvimento da biotecnologia, provendo insumos, material biológico certificado e
informações associadas (44).
Como infra-estrutura fundamental na conservação da biodiversidade e
distribuição de recursos genéticos (Figura 3), as coleções de serviço merecem atenção
especial (45). A operação e o gerenciamento de coleções microbiológicas de serviço
requerem capacitação técnica especializada e infra-estrutura específica, além de
cuidados especiais com relação às práticas de controle de qualidade, biossegurança e
13
autenticação de seus acervos (46). Coleções de serviço, que possuem acervos
abrangentes e curadoria profissional, com sistemas de informação que permitem rastrear
as condições de processamento, conformidade dos produtos e registros do material
biológico distribuído, são potenciais candidatas ao status de Centro de Recursos
Biológicos (CRBs), uma nova categoria proposta no cenário internacional e que contém
a seguinte definição: “...são partes essenciais da infra-estrutura de apoio às ciências da
vida e biotecnologia, atuando como provedores de serviços, repositórios de células
vivas e genomas de organismos e informação relacionada à hereditariedade e funções
de sistemas biológicos.” (definição adotada no Workshop “Biological Resource
Centres”, Tokyo 1999).
Dentre as funções e serviços prestados por CRBs, destacam-se: (i) Centros de
Recursos Genéticos (conservação e arquivo da diversidade biológica e variabilidade
genética; provisão de insumos par a biotecnologia; distribuição de material de referência
para controle de qualidade/competitividade industrial; seleção e triagem de material
biológico para uso industrial; aplicações diversas nas áreas de saúde, agricultura, meio
ambiente e educação), (ii) Centros de Informação (organização e provisão de dados
taxonômicos e tecnológicos sobre material biológico; disponibilização da informação
sobre acervo par ensino, pesquisa, inovação tecnológica, (iii) Centros de Treinamento
(preservação de material biológico; bioinformática e informática para biodiversidade;
biossistemática e taxonomia, assim como (iv) Centros de Serviços Especializados
(caracterização taxonômica e/ou tecnológica de material biológico; controle de
qualidade de material biológico e testes de desafio; depósito de material biológico
inclusive para fins patentários) (47).
A procura por material biológico em coleções reconhecidas se deve
principalmente ao fato de que estas coleções possuem como procedimentos de rotina a
realização de testes de controle de qualidade e autenticação do material. Existem
coleções microbiológicas importantes localizadas no mundo inteiro, as quais atuam
como centros de excelência em conservação ex situ e taxonomia microbiana, como por
exemplo: ATCC (Estados Unidos), BCCM (Bélgica), CBS (Holanda), CFBP (França),
DSMZ (Alemanha), ICMP (Nova Zelândia) e JCM (Japão). No Brasil, país megadiverso, detentor de cerca de 20% da diversidade global, o sistema existente de coleções
de serviço é ainda bastante incipiente, em razão da falta de uma política adequada (45).
Entretanto, o Brasil se destaca no quadro internacional por apresentar elevada
capacitação institucional quando comparado com outros países em desenvolvimento. Na
14
área da saúde, o exemplo da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) é significativo na
medida em que congrega, no Instituto Oswaldo Cruz, 11 centros de referência
nacionais, 5 centros colaboradores da Organização Mundial da Saúde e 14 coleções de
culturas, sendo 10 setoriais e 4 institucionais. No setor agrícola, a Coleção de Culturas
de Bactérias Diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, vem contribuindo com
importantes avanços
relacionados com a elucidação dos mecanismos de fixação
biológica de nitrogênio e aplicações tecnológicas. Ainda, a Coleção de Culturas de
Fitobactérias do Laboratório de Bacteriologia Vegetal do Instituto Biológico de São
Paulo mantém um acervo que constitui a maior fonte de linhagens bacterianas
fitopatogênicas oriundas de áreas tropicais (48). A Coleção Brasileira de
Microrganismos de Ambiente e Indústria (CBMAI), estabelecida no CPQBA em 2002,
com o respaldo institucional da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), foi
estruturada para atuar como uma Coleção de Serviço, visando atender à demanda da
comunidade acadêmica e industrial, oferecendo serviços especializados para o setor.
Atualmente, existe no cenário internacional um conjunto de ameaças concretas ao
trânsito de material biológico e, portanto, a devida preservação e fornecimento de
material biológico certificado por Coleções de Serviço e/ou Centros de Recursos
Biológicos é de grande relevância para o desenvolvimento biotecnológico em nosso
país.
Figura 3. A bactéria Chromobacterium violaceum CBMAI 534 produtora de violaceína com
propriedades farmacológicas (à esquerda) e o fungo filamentos Beauveria felina CBMAI 739 produtor de
destruxinas com potencial aplicação no controle biológico de insetos (à direita).
15
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Endereço para correspondência
Divisão de Recursos Microbianos
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA)
Universidade Estadual de Campinas
Caixa Postal 6171, CEP: 13081-970, Campinas, SP.
E-mail: [email protected]; [email protected] e
[email protected]
Data de Recebimento: 04/07/2006
Data de Aprovação: 11/09/2006
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