CONFOCAL+Superresolu..

• Princípios da Microscopia Confocal
• TIRF, 2P, Spinning Disk, Deconvolução
• Microscopia óptica em alta resolução:
PALM, STORM, SIM, STED, etc.
Princípio da microscopia confocal
• Idéia de Marvin Minsky em 1955 que seria poderia se obter
imagens de planos focais únicos em amostras biológicas, por
meio de varredura de iluminação pontual.
• Somente em 1987, John White, Brad Amos e Mick Fordham no
MRC Laboratory of Molecular Biology em Cambridge, com a
evolução dos laseres, microeletrônica e mecânica, desenvolveram
o primeiro aparelho batizado de MRC-500 que foi
comercializado pela BioRad.
• A partir daí a metodologia se popularizou com o aparecimento
de vários sistemas, evoluindo para a metodologia de multi-fóton,
TIRF, STEC, PALM, STORM etc.
Marvin Minsky – US Patent 3,013,467
[…] This high degree of selectivity
afforded by the optical system results
in a minimum of blurring, increase in
signal-to-noise ratio, increase in
effective resolution, and the possibility
of high resolution light microscopy
through unusually thick and highlyscattered specimens.
M. Minsky, 1957
Princípio da
microscopia
confocal
A microscopia confocal emprega luz entre UV e IR e baseiase na varredura da amostra ponto a ponto.
Caminho da
luz no
microscópio
confocal
Luz fora do plano focal é barrada
na abertura
Luz no plano focal atinge o PMT
Série – Z e reconstrução tridimensional: pólen de hibisco
Microscopia confocal: formação de imagens
Imagens são
digitalizadas em 8
bits (escala de
cinza) em 3 canais,
RGBea
sobreposição com
sistema de pseudocores permite
identificar colocalização
Processamento de imagens 3D
y
y
z
y
z
x
Na microscopia confocal você pode ´cortar´sua amostra e visualizar
num plano apenas ou também fazer ‘cortes’ virtuais no eixo y
“Pilotando” um confocal
http://www.olympusconfocal.com/java/confocalsimulator/index.html
http://www.olympusconfocal.com/java/crossoversimulator/index.html
Microscopia de TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence)
VSV-GFP saindo do Golgi:
TIRF - M. Cecília Fernandes, Yale U.
Wide-field vs confocal vs 2-p
Drawing by P.
D. Andrews, I.
S. Harper and
J. R. Swedlow
Confocal vs 2-p
Confocal vs 2-p
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/multiphoton/excitationbleaching/index.html
Confocal vs 2-p
Discos de Nipkow
http://www.diycalculator.com/popup-h-console.shtml
Ann. NY Acad. Sci, 1986
Princípio do Confocal de Petráň
Yokogawa Head
Yokogawa Head: arquitetura
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spinningdisk/yokogawa/index.html
Yokogawa Head: varredura x aquisição
Comparação: Spinning-Disk x LSCM
Spinning-Disk
Promastigota de L. major (DdRed) entrando em vacúolo de L.
amazonensis marcado com Lysotracker (verde). Fernando Real - DMIP
Deconvolução
Point Spread Function
Deblurring and image restoration.
a) RAW image
b) Nearest neighbour deblur
c) Wiener filter
d) Interative blind filter
Microscopias de Alta Resolução
Com câmeras de alta sensibilidade (p.ex: EMCCD, EB-CCD, I-CCD) ou PMTs
• FIONA – Fluorescence Imaging with One
Nanometer resolution – Calculate Centroid
with MetLAB
• SHREC – Single Molecule High Resolution
Co-Localization – Localization of centroids
with nanometer accuracy
• PALM (PhotoActivatable Light
Microscopy & STORM (Stochastic
optical reconstruction Microscopy)
• Structured illumination - SIM
(semelhante ao Apotome da Zeiss)
SIM-OMX (Applied Precision)
• STED – Stimulated Emission
Depletion
Resolução em um sistema de microscopia de Luz:
Equação de Abbe

R=
2n NA
onde R = distância entre dois pontos na amostra (difratando
a luz incidente), n é o índice de refração do meio e NA a
abertura numérica da objetiva.
Resolução ‘máxima’ lateral (x, y)
• Para uma objetiva de N.A. 1.4 e com  = 488 nm,
a resolução lateral teórica (R) de um bom
microscópio de luz é da ordem de R= 212.63 nm
ou cerca de 0,2 m.
• Em comprimentos de onda maiores, a resolução
diminui de acordo com a mesma fórmula.
Normalmente, em um microscópio confocal, a resolução
axial (x-z) é cerca de 2-3 vezes pior que a lateral.
R=1, 77 x / NA2
PALM
STORM
STORM
Huang et al., Science 319: 810-813 2008
STORM – Anti-Tubulina +
Conjugado - Cy3-Cy5
SIM – HeLa + TCT
4π
4π
http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/4Pi.htm
4π
4 π e ME de complexos
de poros nucleares
JCS 123, 2010
STED = Stimulated Emission Depletion
Stimulated emission
Arranjo do STED
Confocal
STED
Esferas
fluorescentes
de 0,1 m :
aumento da
resolução
AXIAL
Confocal
STED
S. cerevisiae
E. coli
Resultado:
aumento da
resolução AXIAL
Microtúbulos
Microscópio em 2011
• Leica SP5 Tandem Scanner,
• 4 detectores de fluorescência, sendo dois PMT e
dois detectores híbridos HyD.
• Detector para iluminação transmitida;
• Cinco laseres: diodo 405, Argônio (excitação em
azul), diodo 561 (excitação em amarelo), HélioNeônio 594 (excitação em laranja) e Hélio-Neônio
633 (excitação em vermelho). Total de nove
linhas de lasers disponíveis: 405nm, 458nm,
476nm, 488nm, 496nm, 514nm, 561nm, 594nm e
633nm.
• AOBS:
AOBS Acousto-Optical Beam
• Objetivas: HC PL APO 10x/0.40 CS
– HC PL APO 20x/0.70 IMM CS -BL (imersão a água,
óleo ou glicerina)
– Objetiva HCX PL APO 40x/1.25-0.75 CS -BL (imersão
a óleo)
– Objetiva HCX PL APO 63x/1.40-0.60 CS -BL (imersão
a óleo)
– Objetiva HCX PL APO 63x/1.20 CORR W CS -BL
(imersão a água)
– Objetiva HCX PL APO 100x/1.44 CORR CS (imersão
a óleo)