Espectrometria de Massas - GGTE

9/18/2012
QO427
Os princípios e o uso de LC-MS
em laboratórios de análises
orgânicas
Rosy Simas
Setembro 2012
Espectrometria
de Massas
1
9/18/2012
QUÍMICA ORGÂNICA
Defeito de Massa
Nenhum átomo (c/ exceção do 12C) tem
massa inteira
Diferença é chamada de defeito de massa
12C
● Nomina - Massa arredondada em 1 u:
H = 1, C = 12, Cl = 35
12.0000
13C
14C
13.0034
14.0032
●Média – Massa média dos isótopos:
H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532
●Mono isotópica - Massa do isótopo mais abundante:
H = 1.0078, C = 12.000, Cl = 34.9688
Resolução
Unitária
x Alta
Resolução
(a)
(a)
(b)
(b)
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+
C20H9+
C19H7N+
C13H19NC3O
+
202H9+
249
249 249.0700
m/z
m/z
C19HC720
N+
H9+
C13CH1919HN7N+
3O2+
0000
249.0580
249.1479
249.0700
249.0580
m/z
C13H19N3O2+
249.1479
m/z
2
9/18/2012
A importância da Altíssima Resolução
8
1. C27H11NS3
2. C28H12S3
3. C28H13S3
4. C31H13N2S
5. C33H15S
6. C32H14NS
7. C32H15NS
8. C32H15S
9. C33H16S
10. C33H17S
11. C30H21S2
12. C33H19N5S4
13. C33H20N2
14. C33H21N2
15. C34H22N
16. C34H23N
3
m/z
Medido Calculado
445.00485 445.00481
445.01297 445.01291
445.01741 445.01738
445.07954 445.07939
445.08487 445.08469
445.08764 445.08750
445.09214 445.09197
445.09580 445.09560
445.10024 445.10007
445.10472 445.10454
445.10809 445.10791
445.14587 445.14611
445.16525 445.16545
445.16979 445.16992
445.17799 445.17803
445.18258 445.18250
7
8
9
6
11
4 5
2
1
*
445.00
445.04
12
**
* *
445.08
445.12
14 15
13
16
*
445.16
445.20
m/z
Vantagens da Altíssima Resolução
m2- m1
459.3899
C30H53NS
C23H47
S
N
SH4/C3
C20H41
N
N
13CC
17H37
459.3695
13CC H N
31 46 2
N
C13H27
O
N
C16H33
S
3.4 mDa
135,000
C2H3/13CN 17.0 mDa
27,000
O/CH4
36.4 mDa
13,000
H12/C
93.9 mDa
5,000
459.3865
C33H49N
459.3501
C32H45NO
459.2960
C31H41NS
Sistema de Vácuo
Introdução
de amostra
Fonte de íons
Detector
Processador
de dados
Analisador
3
9/18/2012
Modos de inserção de amostra
Fontes de ionização
a- EI (Electron Ionization”)
b- CI (“Chemical Ionization”)
c- APCI (“Atmospheric Pressure Chemical Ionization”)
d- APPI (“Atmospheric Pressure Photo-Ionization”)
e- ESI (“Electrospray Ionization”)
f- MALDI (“Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization”)
g- DESI (“Desorption Electrospray”)
h – DART (Direct Analysis in real Time”)
i- EASI (Easy Ambiente Sonic-Spray Ionization)
API: ESI x APCI x APPI
4
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Ionização à Pressão
Atmosférica (API):
Vácuo
Introdução
de amostra
LC
API
Analisadores de
Massas
MS e MS/MS
Detector
Interface
MS
The happy “marriage”of the bird (MS) and the fish (LC analyte)
ESI (“Electrospray Ionization”):
■ Processo de transferência de íons em solução para a fase gasosa, introduzida
por Yamashita e Fenn em 1984.
ESI – Electrospray Ionization
John Fenn 1989 (Nobel 2002)
Compostos Polares e Pesados
Can Elephants fly ?
Formação do spray
em ESI positivo:
5
9/18/2012
ESI:
Desvatagens
Vantagens
•Utilizado para qualquer íon formado
•Melhor performance em fluxos baixo;
•Deve formar íons em solução;
em solução (±);
•Supressão iônica em condições de
•Confirmação de massa molecular;
alta salinidade;
•Determinação de altas massas
•Pode-se formar adutos iônicos;
moleculares;
•Compostos voláteis ou não voláteis;
•Usuários devem c onhecer química
de soluções (equilíbrio ácido-base,
•Analítos iônicos e polares ;
reações redox…);
•Baixa temperatura/baixa
•Compostos desconhecidos devem ser
fragmentação;
analisados nos modos positivo e
•Boa sensibilidade;
•Fluxos variam de nL/min a 1 mL/min.
negativo.
APCI (“Atmospheric Pressure Chemical
Ionization”):
T ~ 400-600 oC
Íons positivos
Íons negativos
Corrente na Corona
0.5-3 µA
1-5 µA
Voltagem na Corona
1-4 kV
1-4 kV
Probe de APCI:
Vaporizer
Probe Movement
Corona Needle
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APCI:
Vantagens
Desvantagens
• Informação de massa molecular;
• Fonte robusta;
• Pode ocorrer degradação térmica;
• Ruído químico em massas baixas;
• Ionização muito eficiente;
• Técnica não apropriada para
• Compatível com altos fluxos de LC
2.0 mL/min;
compostos de massa molecular com
relação m/z maior que 2000;
APPI (“Atmospheric Pressure PhotoIonization”)
APPI:
Vantagens
Desvantagens
 Compostos não polares;
 Difícil otimização;
 Mínima fragmentação;
 Dependente da estabilidade
 Não apresenta sinal para o
solvente ;
dopante;
 Necessário sistema de exaustão.
 Mínimo efeito de competição por
carga.
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9/18/2012
Analisadores
Magnéticos-Eletrostáticos (BE)
Quadrupolos (Qq)
 Íon-Traps 3D e Íon-Traps Lineares (QIT)
Tempos de Vôo (TOF)
Orbitraps
Ressonância Ciclotrônica de Íons (ICR)
Analisadores :
Quadrupolo
TOF
Ion trap
A importância do modo
de ionização
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9/18/2012
Noções em
Quantificação por
LC-MS/MS
Quantificação HPLC:
Realidade Atual
LC-MS
HPLC
TLC
- Extração
- Velocidade de análise
Cromatografia
em papel
- Limites detecção/quantificação
- Escopo de matriz
Preparo da Amostra
Concentração do analito de interesse e tipo de matriz:
Concentração do Analito: Porcentagem ? ppm? ppb? traços ?
Ultratraços ?...
• Matriz: Orgânica (animal ou vegetal) ?
• Matriz : Inorgânica ?
• Matriz : Mista ?
9
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HPLC

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Injetor
Bomba
Coluna
Registrador
Detector
Solvente
HPLC

SELETIVIDADE 
Capacidade de distinguir e não quantificar a substância dentro da análise.


= 16-4 = 12 = 1,5
12-4 8
= 20-4 = 16 = 2,0
12-4 8
12
4
16
20
Tempo
HPLC

EFICIÊNCIA
Baixa eficiência
Alta eficiência
0
tR(A)
tR(B)
Tempo
10
9/18/2012
HPLC

SIMETRIA
Comportamento da população de moléculas
a
b
10 %
S10 =

RESOLUÇÃO
b
a
HPLC
tR(B)
t
tR(A)
A
B
WA
R=
t
<W>
=
t
WA + W B
=
WB
2
t
WA + W B
Tempo
2
Pratos teóricos:
Número indicativo da
performance da coluna. É a
medida da largura do pico em
relação ao seu tempo de
retenção. É o parâmetro que
mais precisamente define a
qualidade de um sistema
cromatográfico
11
9/18/2012
HPLC

EFEITO DA TEMPERATURA SOBRE A SEPARAÇÂO
40 ºC
65 ºC
0
5
10
(min)
Reservatório de fase móvel e
preparo
Filtrar
sempre
Fase móvel: solvente
• Alto grau de pureza
• Dissolver a amostra sem decompor seus
componentes;
• Ter polaridade e viscosidade adequada
• Ser compatível com o detector
12
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Fase móvel- água
Bombas de alta pressão
Eluição
Fluxo constante = max. 400 bar ou 5800 psi
Isocrático = mesma composição de
FM
Gradiente = composição varia com
eluição;
Injetor Manual e
Automático
13
9/18/2012
Colunas Cromatográficas
•
•
•
•
•
Pré- colunas - proteção
Preparativas- > 10 mm
Convencional – 2-5 mm
Microbore – 1-2 mm
Capilar – 0.075-1 mm
9/18/2012
Condicionamento e limpeza de
coluna cromatográficas
• Coluna nova = mínimo 12 horas
• Coluna de uso ocasional = 2 horas
• Limpeza = 2 horas
Seqüência lógica de solventes
Fase estacionária
quimicamente ligada
• Fase normal (silica, amino, diol, ciano e nitro)
FEP=FMA
• Fase reversa ( Nalquil C18-C4, fenil)
FEA=FMP
14
9/18/2012
Fase Móvel:
• Normal= hexano, diclorometano (isopropanol,
acetato de etila)
• Reversa= metanol,acetonitrila, THF (água e
tampão)
Silanol e pH de 2 a 8
Detectores
•
•
•
•
•
Absorção: UV-VIS e DAD
Índice de refração
Fluorescência
Eletroquímico
MS????
DICAS: o que não fazer em HPLC
Lavar sistema tampão com orgânico puro
Injetar amostra que precipita na FM
Usar ácidos inorgânicos no sistema
Deixar a bomba trabalhar seca
Vedar conexões com fita teflon
Deixar o equipamento parado com
tampão
• Perder a paciência
•
•
•
•
•
•
15
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Modos de varredura – Q:
Full Scan ou TIC
Single ion Monitoring (SIM)
SIM
TIC
Q1
Fonte
Q1
Detector
Fonte
Detector
MRM
Multiple reaction monitoring
Q1
q2
Q3
Fonte
Detector
O que interessa neste modo de varredura
é o cromatograma.
SIM:
29Jan_33
2: SIR of 8 Channels ES+
411
5.91e4
Nicosulfuron, SIM
100
%
0
29Jan_36
2: SIR of 8 Channels ES+
411
5.65e4
100
%
0
29Jan_35
2: SIR of 8 Channels ES+
411
1.07e5
100
%
0
29Jan_32
2: SIR of 8 Channels ES+
411
8.72e4
100
%
0
29Jan_34
100
%
0
3.80
2: SIR of 8 Channels ES+
411
3.14e4
4.00
4.20
4.40
4.60
4.80
5.00
5.20
5.40
5.60
5.80
Tomate
Abacate
Limão
Uva passa
Farinha
Time
16
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MRM:
29Jan_27
2: MRM of 8 Channels ES+
411 > 182
7.95e3
Nicosulfuron, MRM
100
%
0
29Jan_30
2: MRM of 8 Channels ES+
411 > 182
1.05e4
100
%
0
29Jan_29
2: MRM of 8 Channels ES+
411 > 182
5.27e3
100
%
0
29Jan_26
2: MRM of 8 Channels ES+
411 > 182
8.36e3
100
%
0
29Jan_28
100
%
0
4.20
2: MRM of 8 Channels ES+
411 > 182
8.64e3
4.40
4.60
4.80
5.00
5.20
5.40
5.60
5.80
Tomate
Abacate
Limão
Uva passa
Farinha
Time
Comparando…
Fatores importantes

Modo de Ionização;

Coluna:
•Diâmetro e Fluxo
•Bombeamento

Fase Móvel: Pode afetar tanto a cromatografia
como o processo de ionização.
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Fluxo de LC para MS

APCI : 0.2 - 2 mL/min Não é necessário utilizar split.

ESI : 1 - 300 µL/min
Indicado
até
1
mL/min.
Geralmente utiliza-se split para
fluxos mais elevados de tal forma
que apenas 250 L/min seja
enviado ao espectrômetro de
massas.
Fluxo em LC:
O diâmetro interno da coluna analítica depende do
fluxo de LC
Fluxo
Coluna I.D.
0.5 - 2 mL/min
3.9 - 4.6 mm I.D.
0.1 - 0.3 mL/min
2 - 2.1 mm I.D.
40 - 50 µL/min
1 mm I.D.
< 10 µL/min
Colunas capilares
Solventes e aditivos :
Solventes
Aditivos
Água
Ácido Acético
Acetonitrila
Ácido Fórmico
Metanol
Hidróxido de Amônia
Isopropanol
Acetato de Amônia*
Formato de amônia*
(* = Podem ser utilizados como tampão. As
concentrações não devem exceder
10 mM.)
18
9/18/2012
Solventes:
n-Hexano
Ordem crescente
n-Heptano
de força de eluição
Éter etílico
Clorofórmio
Cloreto de metileno
Tetrahidrofurano
Diclorometano
Dioxano
Acetato de etila
Acetonitrila
n-Propanol
Etanol
Metanol
Adsorção
Modificadores:
•Substâncias agregadas à fase móvel, em pequena quantidade, para
desativação dos sítios de alta reatividade da sílica;
•Tempos de retenção mais estáveis, melhor capacidade de carga na
coluna, maior eficiência e menos cauda;
•A adição de Trietilamina (ou aminas de uma forma geral) na fase
móvel, diminui o encaudamento de analitos básicos, da mesma forma, a
adição de ácido acético (ou ácidos orgânicos de uma forma geral)
beneficia a análise de substâncias ácidas.
Efeito do ácido fórmico :
Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3)
100
F1
365
2.30e6
Raylo_1_007 Sm (Mn, 2x3)
7.52
100
Sem aditivos
Somente água
e acetonitrila
0.03%
Ácido
fórmico
%
%
0
6.00
F1
365
2.19e6
7.56
7.00
8.00
Time
9.00
6
6.00
7.00
8.00
Time
9.00
19
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Solventes e tampões não utilizados
•Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)
•Detergentes (supressão iônica)
•Ácidos inorgânicos (Sulfúrico, fosfórico, etc.)
Fragmentação na fonte
Fragmentação induzida pela voltagem do cone
Fragmentos
gerados por colisão
e íons não
fragmentados
Íons produzidos
por ESI ou APcI
N2
+
N2
+
+
+
+
+
+
+
N2
Íons que são acelerados
pela voltagem do cone
colidem com moléculas de
nitrogênio
Voltagem do cone elevada
Efeito da voltagem no espectro de MS:
Etalon 550 pg/ul, ES , FS positif , CV variables
Etalon 10 220 (12.126)
3: Scan ES+
2.81e4
214.36
100
60 V
%
241.40
96.03
174.16
89.34
103.44
110.23
131.73
145.55
125.55
0
Etalon 10 221 (12.162)
186.21 196.16
163.16
205.39
263.34
279.43
304.36
327.08 337.74 348.20
2: Scan ES+
4.19e4
241.39
100
40 V
%
98.15
0
Etalon 10 221 (12.144)
214.33
138.52
113.54
155.47
196.20205.30
174.02
223.16
249.44
264.53
282.41 291.95 303.39 312.82
330.71
343.97
1: Scan ES+
3.82e4
241.39
100
%
20 V
130.81
97.28 108.28
0
90
100
110
120
130
151.06
140
150
171.00 183.04
160
170
180
195.59 205.32
190
200
210
223.14 234.36
220
230
240
253.29 264.47
250
260
270
282.41 292.58
280
290
310.62
300
310
325.69
320
330
345.85
m/z
340
20
9/18/2012
Etapas do desenvolvimento:
 Experimentos de infusão para definir o método de ionização e otimizar
as condições de MS para a sensibilidade e seletividade necessária;
 Otimização de valores da energia do cone para cada íon precursor;
 Experimentos de MS/MS para determinação dos fragmentos a serem
monitorados em MRM e otimização da energia de colisão para cada
transição;
 Desenvolvimento do método de LC;
 Otimização das etapas de extração e preparação da amostra. Estudos
de recuperação e efeito de matriz;
 Criação do método para processamento de dados e quantificação.
UPLC versus HPLC MS
partículas de 1.7µm
Separações mais rápidas
 2-5x
Maior resolução
 Separação de metabólitos
 Redução nos efeitos de matriz
Maior sensibilidade
 LOQ 3x mais baixo
Validação de métodos
analíticos
21
9/18/2012
Validação: A Resolução para...
Complexidade da Amostra
Teor do Analito
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9/18/2012
Tipo de Análise
BROMATOLOGIA (VIA ÚMIDA: TITULAÇÃO, GRAVIMETRIA, KJELDHAL)
ANÁLISE INSTRUMENTAL
KARL FISCHER, ANCON, PHMETRO, POLARIMETRO
ESPECTRO UV/VIS, LECO, NIR
AAS,
ICP-OES, HPLC, GC, HGAAS, GFAAS
ICP-MS,RMN, MS
porcentagem (%)
ppm
ppb/ppt
nano (ng) / pico(pg) / fento(fg)
Lógica em validação
Antes de Validar...
Equipamentos e materiais: calibrados
Analistas: qualificados e treinados
Utilizar substâncias químicas de referência
oficiais  espécie com estabilidade e
natureza
confiáveis,
para
análises
quantitativas
e
qualitativas,
permite
comparação entre as espécies analisadas,
além de ser parâmetro de exatidão;
23
9/18/2012
FIGURAS DE MÉRITO
Aplicabilidade
Faixa de trabalho
Linearidade
Faixa linear de trabalho
Sensibilidade
Limite de detecção
Limite de determinação/quantificação
Precisão (repetitividade, precisão intermediária
e reprodutibilidade)
• Exatidão/Taxa de recuperação
• Seletividade
• Robustez
•
•
•
•
•
•
•
•
Frases de Albert Einstein
1879-1955 - Cientista
Obrigada a todos !!!!!
[email protected]
24