Inclusão molecular do (-)-borneol em β

IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
Inclusão molecular do (-)-borneol em β-ciclodextrina: preparação e caracterização
físico-química
Tatianny A. Andrade1 , Bruna M. H. Sousa 1 , Igor A. S. Trindade1 , Paula P. Menezes 1 , Grace Anne A.
Dória1 , Bruno S. Lima 1 , Francilene A. Silva 1 , Polliana B. P. Santos 1 , Lucindo J. Quintans-Júnior2 , Gabriel
F. Silva3 , Daniel P. Bezerra4 , Márcio Roberto Viana dos Santos 2 , Mairim R. Serafini1 , Adriano A. S.
Araújo 1*
1
Departamento de Farmácia, 2 Departamento de Fisiologia, 3 Departamento de Engenharia Química,
Universidade Federal de Sergipe, Sergipe, Brasil, 4 Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz, Fundação
Oswaldo Cruz, Bahia, Brasil.
*Autor correspondente. Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe -UFS, Av. Marechal
Rondon, s/n, São Cristóvão, Sergipe-Brasil. Tel.: +55-79-9192-4545; fax: +55-79-3212-6640. E-mail:
[email protected]
Resumo
O (-)-borneol é um monoterpeno com propriedade analgésica e anti-inflamatória bem descrita na
literatura, porém com baixa solubilidade. As ciclodextrinas (CDs) têm sido bastante utilizadas para
contornar este problema pela sua capacidade de formar complexos de inclusão com moléculas apolares e
torná-las mais solúveis, favorecendo a administração por via oral. Nesse sentido, o presente estudo
buscou preparar e caracterizar físico-quimicamente o (-)-borneol em β-CD pelos métodos da mistura
física (MF) e co-evaporação (CE). Para tal, foram utilizadas as técnicas de calorimetria exploratória
diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espect rofotometria de
absorção na região do infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e eficiência de
complexação utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os resultados obtidos na curva
DSC da CE mostraram-se diferentes da MF, apresentando dois eventos endotérmicos seguidos de
decomposição (28-150ºC e 302-357°C), enquanto a MF apresentou três eventos endotérmicos, tal qual a
curva da β-CD nas faixas de 34-145°C, 205-240°C e 293-347°C, sugerindo a não complexação por este
método. Na curva TG/DTG, o CE apresentou valor de perda de massa superior ao da MF (3,9 e 0,3%,
respectivamente) nas mesmas faixas de temperatura, sugerindo que o (-)-borneol complexado foi liberado
a partir de 140°C. Nos espectros de FTIR, foi observado nas bandas em 1010 cm-1 um aumento na
intensidade das mesmas, sobretudo no CE, essa modificação pode ser indicativa de que ocorreu a
formação do complexo de inclusão entre o monoterpeno e a β-CD. Além disso, a análise de MEV
demonstrou no método da CE uma tendência a amorfização do material em detrimento da MF que
apresentou uma morfologia semelhante a β-CD. Estes resultados corroboram com a eficiência de
complexação por CLAE.
Palavras-chave: (-)-Borneol, complexos de inclusão, ciclodextrinas, caracterização físico-química.
1. Introdução
Os terpenos são uma classe de compostos orgânicos de odor característico produzido por uma
variedade de plantas . Nesta classe encontra-se o (-)-borneol (C10 H17 OH) um monoterpeno alcoólico
presente nos óleos essenciais de numerosas plantas medicinais, incluindo a Valeriana Officinalis,
Matriacria Chamomilla, Lavandula Officinalis e mais comumente na Dryobalanops Aromatica [1,2].
Além disso, é amplamente utilizado na indústria alimentícia e cosmética, como aditivo e na produção de
perfumes, respectivamente. Apresenta também propriedades anti-inflamatórias, analgésicas,
antibacterianas e sedativas bem descritas na literatura [3]. Na perspectiva de conservar esse potencial
terapêutico, melhorar suas propriedades de solubilidade e na tentativa de diminuir o efeito tóxico causado
pelo monoterpeno a inclusão deste em ciclodextrina (CD) mostra-se promissora. As CDs são
oligossacarídeos cíclicos constituídos a partir de s ubunidades de α-D-glicopiranose ligadas entre si por
ligações α-1,4 glicosídicas. A molécula de α-CD compreende seis unidades de glicopiranose, enquanto βe γ-CD compreendem 7 e 8 unidades, respectivamente, dispostos em forma de anel [4]. O diâmetro da
cavidade central das CDs varia na seguinte ordem, α-CD (0,5–0,6 nm), β-CD (0,6–0,8 nm) e γ-CD 0,8–
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1,0 nm), por esta razão, os monoterpenos são facilmente incorporados a sua cavidade, uma vez que
apresentam baixo peso molecular, o qual é compatível com o tamanho da cavidade da CD, o que aumenta
as possibilidades de interação [5]. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi preparar e avaliar físicoquimicamente a complexação do (-)-borneol em β-CD, através das técnicas de calorimetria exploratória
diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espectrofotometria de
absorção na região do infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e eficiência de
complexação utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
2. Material e Métodos
2.1. Material
(-)-borneol (lote:#1414073V) e β-CD (lote:#041M1759V; pureza ≥ 97%) foram adquiridos da SigmaAldrich, EUA.
2.2.
Preparo das amostras
Mistura física (MF): A mistura mecânica foi preparada pela adição do (-)-borneol (154 mg) em um
cadinho contendo CD pulverizada (1135 mg) sob agitação manua l, na razão molar 1:1. A mistura
mecânica foi armazenada em recipientes de vidro hermeticamente fechado.
Co-evaporação (CE): A complexação por CE foi realizada por meio da adição de água (20 mL) a um
almofariz contendo CD (1135 mg) e (-)-borneol (154 mg) na proporção 1:1. A mistura foi submetida à
agitação magnética em 400 rpm, por 36 horas. Posteriormente a amostra foi transferida para um recipiente
e seca em um dessecador
2.3. Análise térmica
As curvas DSC e TG/DTG foram obtidas na faixa de temperatura entre 25 e 500°C e 25 e 900°C,
respectivamente, utilizando equipamento da Shimadzu DSC-60 e TGA-60, sob atmosfera dinâmica de
nitrogênio (100 mL/min), razão de aquecimento de 10°C/min, utilizando cápsula de alumínio (DSC) e
platina (TG/DTG) contendo aproximadamente 2 mg de amostra. Os equipamentos foram previamente
calibrados e/ou verificados antes dos ensaios no eixo de temperatura utilizando padrão de oxalato de
cálcio com pureza de 99,99%, no caso da TG, e índio metálico no caso do DSC.
2.4. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR)
Os espectros de infravermelho do (-)-borneol, β-CD, MF e CE foram obtidos na faixa espectral de
4000–500 cm−1 em pastilhas de KBr utilizando um Espetrômetro por Transformada de Fourier modelo
IRTracer-100 da Shimadzu a temperatura ambiente.
2.5. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras do (-)- borneol, β-CD, MF e CE foram montadas em stubs de alumínio, posteriormente
metalizados com feixes de ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico (JEOL modelo JSM-6390LV) em aceleração de voltagem de 8 kV.
2.6. Eficiência de complexação
A quantidade do (-)-borneol complexado foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE). Para tal, 5 mg de (-)-borneol, MF e CE foram dissolvidos separadamente em 5 mL de
acetonitrila. As soluções foram mantidas sob agitação constante durante 24 h, em segu ida centrifugadas
sob 3200 rpm durante 15 minutos a fim de remover a β-CD da solução e quantificar apenas o (-)-borneol
complexado, nas amostras obtidas por MF e CE, de acordo com metodologia descrita por Hill et al (2013)
[6]. O (-)-borneol foi o padrão para comparação com a MF e CE. As análises foram realizadas em um
cromatógrafo líquido Shimadzu, equipado com um degaseificador DGU-20ª3, um autosampler SIL-20A,
duas bombas (A e B) LC-20AD, detector de arranjo de diodos SPD-M20Avp (DAD) com uma interface
CBM-20A. Para tal, foi utilizada uma coluna analítica Phenomenex C18 de fase reversa de 250 x 4,6 mm
(5 mm de tamanho de partícula). A taxa de fluxo foi de 1 mL/min, tempo de corrida de 32 minutos e o
volume de injeção foi de 20 µL. O sistema gradiente de eluição foi realizado com uma fase móvel
constituída de Acetonitrila (B) / Água mili-q (A) (v/v) variando de 5 a 100% da concentração de B. Os
cromatogramas obtidos foram analisados em um comprimento de onda de 280 nm. As análises foram
realizadas em triplicatas.
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3. Resultados e Discussão
A Figura 1A mostra as curvas DSC do (-)-borneol, β-CD, MF e CE. A curva DSC do (-)-borneol
apresentou dois eventos endotérmicos, o primeiro na faixa de temperatura de 74-79°C característico de
fusão e o segundo na faixa de 130-192°C referente à decomposição. A curva DSC da β-CD apresentou
três eventos endotérmicos seguido de um evento exotérmico. Os eventos endotérmicos ocorreram nas
faixas de temperatura de 32-121°C, 205-240°C e 285-344°C. O primeiro pico endotérmico refere se à
desidratação da molécula, o segundo é característico de transformação de fase reversível da β-CD. Em
seguida observa-se a fusão da β-CD, seguida das etapas de degradação e eliminação de material
carbonáceo. A curva DSC da MF apresentou três eventos endotérmicos seguidos de decomposição. Os
eventos ocorreram nas seguintes faixas de temperatura: 34-145°C, 205-240°C e 293-347°C. O primeiro
pico refere-se a eliminação de água da β-CD e (-)-borneol, seguida da transição de fase da β-CD, fusão da
molécula hospedeira e a decomposição. A curva DSC da CE mostrou-se diferente da MF e das matériasprimas ((-)-borneol e β-CD) e apresentou dois eventos endotérmicos seguidos de decomposição
exotérmica. Os eventos endotérmicos ocorreram nas seguintes faixas: 28-150ºC e 302-357°C. Como
principais mudanças indicativas da formação de complexos determinados por DSC pode-se citar a
redução do evento endotérmico referente a eliminação de água e a ausência da transição de fase cristalina
do complexo obtido por CE.
B
A
Figura 1. Curvas DSC (A) e TG/DTG (B) do (-)-borneol, -CD, MF e CE obtidas em atmosfera
dinâmica de N2 (100 mL.min -1 ) e razão de aquecimento de 10°C.min -1 .
Na Figura 1B estão as curvas TG/DTG do (-)-borneol, β-CD, MF e CE e na Tabela 1, são
apresentados os percentuais de perdas de massa calculados a partir de faixas de temperatura específicas.
Através da análise dos dados, pode-se observar que o (-)-borneol é decomposto até 140 °C. A perda de
massa da -CD acontece em três etapas, sendo que no intervalo de 25 - 140°C foi observada uma perda
de massa de 12,4 %, atribuída a liberação de água da estrutura da -CD. Já na faixa de 120 e 280°C, não
ocorre perda de massa considerável, pois essa etapa correspon de à transição de fase descrita na curva
DSC para esta molécula. A partir de 280ºC, tem início o processo de decomposição térmica seguido de
formação de carbono elementar. Como já fora mencionado, a primeira etapa de perda de massa
corresponde à liberação de água, e no caso das amostras da MF e CE nessa faixa também pode ser
liberado o (-)-borneol adsorvido na superfície da β-CD, onde a MF tem um Δm=20,7% e CE, Δm=11,8%.
Na segunda etapa (140-280°C) observa-se que a MF e CE apresentaram perda de massa de 0,3 e 3,9%
respectivamente. Assim, o CE apresentou valor superior ao da MF, sugerindo que um percentual maior de
(-)-borneol foi liberado a partir de 140°C. Desta maneira, é possível inferir que o (-)-borneol foi
complexado na cavidade da β-CD sobretudo pelo método da CE, uma vez que necessitou de uma
temperatura mais elevada para ser decomposto, quando comparado com a sua forma livre (primeira
etapa).
Tabela 1: Percentuais de perdas de massa obtidas por TG das amostras do (-)-borneol, -CD, MF e CE.
Amostra
(-)-borneol
-ciclodextrina
M istura física
Co-evaporado
m1 (%)
25-140°C
97,3
12,4
20,7
11,8
m2 (%)
140-280°C
0,4
0,3
3,9
m1 (%)
280-400°C
65,1
71,3
82,7
m1 (%)
400-900°C
22,1
7,7
1,6
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A Figura 2 apresenta o espectro de FTIR de (-)-borneol β-CD, MF e CE. No espectro que corresponde
ao (-)-borneol é possível observar uma banda larga compreendida entre 3488-3182 cm-1 que está
relacionado ao grupo funcional OH. A banda encontrada na região espectral de 2944-2866 cm-1
corresponde ao modo de es tiramento CH2 -CH3 ligado a carbono primário ou secundário. É possível
observar outra banda na região de 1453 cm-1 que está relacionada à deformação CH2 . A região de
absorção observada em 1394-1340 cm-1 está relacionada à deformação angular CH3 . As bandas
observadas em 1139, 1109 e 1056 cm-1 estão relacionadas à C-O de álcoois. O espectro de infravermelho
da β-CD pura mostra uma banda larga com o máximo de absorção a cerca de 3341 cm-1 , devido as
vibrações do alongamento dos diferentes grupos hidroxila O-H da β-CD. A banda em 1647 cm-1 , está
relacionada com as vibrações desses grupos O-H. O espectro apresenta outras bandas, principalmente a
2926 cm-1 (vibrações C-H e de alongamento dos grupos CH e CH2 ), em 1411, 1368, 1335, 1301 e 1246
cm-1 devido as vibrações de alongamento C-H, e em 1154, 1080 e 1027 cm-1 são atribuídas as vibrações
do alongamento C-O, das ligações entre os grupos de éter e hidroxila. Finalmente faixas típicas da região
1000-700 cm-1 , pertencentes as vibrações das ligações C-H e as vibrações do esqueleto C-C no anel de
glicopiranose, também estão presentes. Resultados semelhantes foram obtidos por Sambasevam et al
(2013) [7] e Menezes et al (2014) [8]. Na análise das bandas que representam a MF e CE, é possível
observar algumas diferenças quando comparado com os espectros da β-CD e (-)-borneol, essa mudança
pode ser atribuída a afinidade do (-)-borneol pela β-CD. Nas bandas em 1010 cm-1 observa-se um
aumento na intensidade quando comparadas com (-)-borneol, principalmente pelo método da CE. Es ta
banda é característica do grupamento O-H presente na molécula hóspede, além disso, a banda na faixa
espectral de 2.900 cm-1 , descrita no espectro do (-)-borneol, apresentou-se com maior intensidade no
espectro do CE, demonstrando a presença do monoterpeno no complexo de inclusão.
A Figura 3 apresenta as fotomicrografias do (-)-borneol, β-CD, MF e CE nos aumentos de 600x e
1000x. Na imagem, é possível observar a alteração na forma da amostra obtida por CE, quando
comparada com a MF, a qual apresenta a mesma morfologia dos cristais de β-CD. Dessa forma, o aspecto
característico de amorfização da CE evidencia a formação do complexo de inclusão por este método,
conforme já fora sugerido pelos resultados anteriores.
Figura 2: Espectros de infravermelho do (-)borneol, β–CD, mistura física (MF) e coevaporado (CE).
Figura 3. Fotomicrografias do (-)-borneol, β-CD,
mistura fisica (MF) e co-evaporado (CE), sob
aceleração de voltagem de 8kV.
Na Figura 4 estão apresentados os cromatogramas do (-)-borneol, MF e CE demonstrando que o (-)borneol livre teve uma concentração de 11,2 ± 0,64 mAU (Tabela 2), enquanto MF e CE apresentaram
concentrações de 48,2 ± 0,23 e 68,1 ± 3,72 mAU, respectivamente. De acordo com Hill et al (2013) [6], a
etapa de centrifugação, garante a sedimentação da β-CD, de forma que a quantificação se dá apenas para
o (-)-borneol complexado. Dessa forma, os resultados obtidos demonstram que o CE apresentou uma
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maior eficiência de complexação em detrimento da MF, e este valor pode estar relacionado a afinidade do
(-)-borneol pela cavidade da β-CD.
Tabela 2: Concentração do (-)-borneol puro e (-)-borneol presente nas amostras de MF e CE.
Amostra
Concentração do pico obtido por CLAE (mAU)
(-)-borneol
11,2 ± 0,64
MF
48,2 ± 0,23
CE
68,1 ± 3,72
* O tempo de retenção foi de 20 min para todas as amostras.
Figura 4: Cromatogramas do (-)-borneol, MF e CE obtidos em 280nm.
4. Conclusão
Os estudos preliminares por análise térmica, FTIR, MEV e CLAE mostram claras dife renças entre os
complexos preparados por MF e CE para o (-)- borneol. Novos estudos por RMN e validação do método
de doseamento por CLAE deverão ser realizados com a finalidade de confirmar a complexação e a
eficiência dos métodos.
5. Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES, CNPq, e FAPITEC/SE pelo suporte financeiro nesta pesquisa. Nós
agradecemos também a Dra. Maria Lúcia Vieira Moreno, Dr. Cláudio Pereira Figueira e a Profa. Adriana
Lanfredi Rangel pelas imagens da MEV obtidas no Centro de Pesquisa Gonç alo Moniz da Fundação
Oswaldo Cruz, Salvador.
6. Referências
[1] Broitman SA, Wilkinson IV J, Cerda S and Branch SK. Effects of monoterpenes and mevinolin on
murine colon tumor CT-26 in vitro and its hepatic‘‘metastases" in vivo. In: Research AIfC, editors.
Dietary phytochemicals in cancer prevention and treatment. London: Plenum Press, 1995. pp. 111-30401
[2] Santos FA, Rao VSN. Antiinflammatory and antinociceptive effects of 1,8-cineole a terpenoid oxide
present in many plant essential oils. Phytother Res 2000;14:240–4.
[3] Buchbauer G, Jirovetz L, Jager W, Plank C, Dietrich H. Fragrance compounds and essential oils with
sedative effects upon inhalation. J Pharm Sci 1993;82:660– 4.
[4] Marques HMC. A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles. Flavour Frag. J.
2010;25: 313–326.
[5] Tafazzoli M, Ghiasi M. Structure and conformation of α-, β- and γ-cyclodextrin in solution:
Theoretical approaches and experimental validation. Carbohydr. Polym. 2009;78:10–15.
[6] Hill LE, Gomes C, Taylor TM. Characterization of beta-cyclodextrin inclusion complexes containing
essential
oils (trans-cinnamaldehyde, eugenol, cinnamon bark, and clove bud extracts) for antimicrobial delivery
applications. LWT - Food Sci. Technol. 2013; 51:86-9.
[7] Sambasevam KP, Mohamad S, Sarih NM, Ismail NA. Synthesis and Characterization of the Inclusion
Complex of β-cyclodextrin and Azomethine. Int. J. Mol. Sci. 2013;14:3671-3682.
[8] Menezes PP, Serafini MR, Quintans -Júnior LJ, Silva GF, Oliveira JF, Carvalho FMS et al. Inclusion
complex of (-)-linalool and b-cyclodextrin. J Therm Anal Calorim. 2014;115:2429– 37.