Tese de Mestrado - Marcos Teixeira

Marcos André Machado Lima Teixeira
Lançamento de uma biblioteca de
referência de DNA barcodes para
poliquetas de estuários de Portugal e
do mar profundo da Peninsula Ibérica
Tese de Mestrado
Mestrado em Ecologia
Trabalho realizado sob a supervisão do
Professor Doutor Filipe Costa
Trabalho realizado sob a orientação da
Doutora Ascensão Ravara
Outubro de 2013
DECLARAÇÃO
Nome: Marcos André Machado Lima Teixeira
Endereço eléctrónico: [email protected]
Telefone: 917974620
Número do Bilhete de Identidade: 13243951
Título da Tese: Lançamento de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas
de estuários de Portugal e do mar profundo da Peninsula Ibérica
Orientador(es): Doutor Filipe Costa e Doutora Ascensão Ravara
Ano de Conclusão: 2013
Designação do Mestrado: Mestrado em Ecologia
De acordo com a legislação em vigor, não é permitida a reprodução de qualquer parte
desta tese
Universidade do Minho, ___/___/______
Assinatura: ________________________________________________
Agradecimentos
Um agradecimento especial ao meu orientador, Doutor Filipe Oliveira Costa, não só pela
oportunidade de realização de uma tese de mestrado dentro da temática do DNA barcoding,
uma área que desde que me foi apresentada me despertou um enorme interesse, entusiasmo e
motivação para aplicar todo o meu poder de trabalho, mas também pela paciência,
companheirismo, disponibilização, apoio e conhecimento transmitidos ultimando na realização
desta tese.
Aos meus co-orientadores Sara Ferreira e Jorge Lobo por me ensinarem como trabalhar
corretamente num laboratório, pela amizade e apoio demonstrado. Nunca esquecerei a ajuda
prestada no meu primeiro passo para a vida profissional e espero que no futuro, possamos
voltar a trabalhar juntos. À Doutora Ascensão Ravara por toda a disponibilidade e dedicação na
passagem de conhecimento sobre a taxonomia de poliquetas.
Gostava também de agradecer, aos meus pais e irmã por fazerem de mim o que sou hoje, que
com muito sacrifício, foi possivel oferecerem-me a oportunidade de me licenciar e de obter o
grau de mestre em Ecologia, possibilitando toda esta minha aventura que foi a vida académica
na Universidade do Minho.
A todos os meus colegas de laboratório (Mónica, Artur, Adriana, Soraia, Hugo, Nuno, Ana Sofia e
Rita) por todos os momentos de sal e risada, apoio incansável, conselhos e discussões de
trabalho, aumentando exponencialmente o meu rendimento, realçando a importância da
convivência e do trabalho de grupo nos objectivos a atingir.
Um forte e sincero agradecimento à minha turma de mestrado, por partilharem comigo esta
viagem curta mas cheia de sucessos e de bons momentos para mais tarde recordar.
Este trabalho foi financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional de Factores de
Competitividade - COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT "Fundação para a Ciência e
a Tecnologia (FCT)” no âmbito dos projetos FCOMP-01-0124-FEDER-015429 e PEstC/BIA/UI4050/2011. A sequenciação no BIO (Biodiversity Institute of Ontario) foi financiado
pelo iBOL (International Barcode of Life Project) através do Canadian Centre for DNA Barcoding,
a partir do Ontario Genomics Institute (2008-OGI-ICI-03), Genome Canada, Ontario Ministry of
Research and Innovation e pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada.
iii
Lançamento de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de
estuários de Portugal e do mar profundo da Peninsula Ibérica
Resumo
Os invertebrados bentónicos, como os poliquetas, são importantes indicadores de qualidade
ambiental sendo também um elo relevante nas cadeias tróficas. A taxonomia, com base nos
caracteres morfológicos desta classe é difícil, demorada, e muitas vezes requer um
conhecimento especializado que nem sempre está disponível. Este trabalho pretende contribuir
para a implementação de uma biblioteca de referência de DNA barcodes (citocromo oxidase I
(COI)) de poliquetas de modo a melhorar e facilitar futuras identificações taxonómicas, podendo
mais tarde, em conjunto com bibliotecas de outros organismos bentónicos, ser usada em
estudos de monitorização, utilizando a sequenciação de segunda geração. Com recurso a DNA
barcodes não publicados e gerados por equipas de projectos de investigação LusoMarBoL e
BestBarcode, foram compiladas bibliotecas de poliquetas de duas comunidades distintas,
nomeadamente de estuários e zonas costeiras de Portugal e do mar profundo da Península
Ibérica. Em conjunto com os 26 DNA barcodes de poliquetas de estuários obtidos no âmbito
deste estudo, a primeira biblioteca totalizou 31 espécies e 71 sequências, enquanto a segunda
englobou 37 espécies e 66 DNA barcodes. Aos alinhamentos das sequências destas duas
bibliotecas foram adicionadas sequências homólogas da mesma família ou género disponíveis
em bases de dados públicas, por forma a permitir a sua análise conjunta. Os valores médios das
divergências intra-específicas e congenéricas do conjunto dos DNA barcodes dos poliquetas de
estuários foi de 0,52% (0 a 2,82%) e 20,53% (12,03 a 27,58%) respetivamente, enquanto para
os poliquetas do mar profundo foram de 0,61% (0 a 2,63%) e 20,10% (7,36 a 31,77%)
respetivamente. Estes valores estão dentro da gama de variação reportada em outros estudos de
DNA barcodes de poliquetas. Nas árvores construídas pelo método Neighbour-joining, 79% e 73%
das espécies agruparam-se em clados monofiléticos de baixa divergência, no caso dos
poliquetas de estuário e do mar profundo, respetivamente. Paralelamente foram detetadas várias
incongruências taxonómicas relevantes, bem como divergências intra-específicas relativamente
elevadas, evidenciando a necessidade de uma revisão taxonómica em vários taxa.
Palavras-chave: DNA barcodes, Poliquetas, COI-5P, Portugal, estuário, mar profundo, Península
Ibérica
v
Launching a DNA barcodes reference library for estuarine polychaetes in Portugal
and deep sea polychaetes in the Iberian Peninsula
Abstract
Marine benthic invertebrates, such as the polychaetes, are important environmental indicators
and an important link in the marine trophic chains. The taxonomy based on morphological
characteristics for this class is difficult, time consuming and often requires specialized knowledge
that is not always available. This work aims to contribute to the implementation of a reference
library of DNA barcodes (cytochrome c oxidase (COI)) of polychaetes in order to improve and
facilitate future taxonomic identifications, and latter to be used in monitoring studies using the
next generation sequencing., together with other benthic organisms libraries. Using the
unpublished DNA barcodes, generated by the research teams from the projects LusoMarBoL and
BestBarcode, libraries for two distinct polychaete communities were compiled, including
estuaries and coastal areas of Portugal and the deep sea of the Iberian Peninsula. Together with
the 26 DNA barcodes from estuarine polychaetes obtained in this study, the first library had 31
species and 71 sequences, while the second comprised 37 species and 66 DNA barcodes.
Homologous sequences of the same family or genus searched in public databases were added to
the sequence alignments of these two libraries, in order to enable their joint analysis. The
average values of intraspecific and congeneric divergences for the estuarine polychaetes were
0,52% (0 to 2,82%) and 20,53% (12,03 to 27,58%) respectively, whereas for deep sea
polychaetes were 0,61% (0 to 2,63%) and 20,10% (7,36 to 31,77%) respectively. These values
are within the range of variation reported in other studies examining DNA barcodes of
polychaetes. In the Neighbor-joining trees, 79% and 73% of the species grouped in monophyletic
taxonomic congruent clades with low divergence, in the case of estuarine and deep sea
polychaetes respectively. Concurrently, were also detected several relevant taxonomic
ambiguities, as well as considerable genetic divergence, indicating the need for a taxonomic
revision in several of the studied taxa.
Keywords: DNA barcodes, polychaetes, COI-5P, Portugal, estuary, Iberian Peninsula, deep sea
vii
Índice Geral
Agradecimentos .............................................................................................................................. iii
Resumo ........................................................................................................................................... v
Abstract ..........................................................................................................................................vii
Índice de figuras ...............................................................................................................................xi
Índice de tabelas ............................................................................................................................. xii
Capítulo 1
Introdução geral
1.1. Motivação para novas abordagens na identificação de espécies ................................................. 3
1.2. DNA barcoding ...................................................................................................................... 7
1.3. Iniciativa Barcode of Life (BOLI) ............................................................................................ 12
1.4. Classe Polychaeta................................................................................................................ 15
1.5. Objectivos gerais e estrutura da tese ..................................................................................... 19
Referências ................................................................................................................................ 21
Capítulo 2
Contribuição para a construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para
poliquetas estuarinas portuguesas
2.1. Introdução .......................................................................................................................... 33
2.2. Metodologia ........................................................................................................................ 35
2.2.1. Procedimento geral ....................................................................................................... 35
2.2.2. Recolha e processamento das amostras ......................................................................... 37
2.2.3. Identificação taxonómica ............................................................................................... 38
2.2.4. Extração de DNA, amplificação e sequenciação ............................................................... 39
2.2.4.1. Protocolo CBMA/IMAR ........................................................................................... 39
- Amostragem de tecido: ...................................................................................................... 39
- Extração de DNA: .............................................................................................................. 39
- Amplificação dos DNA barcodes por meio de PCR: ............................................................... 40
- Purificação dos produtos de PCR e sequenciação................................................................. 41
2.2.4.2. Protocolo BIO......................................................................................................... 41
2.2.5. Análise dos dados ........................................................................................................ 42
2.2.5.1. Edição e alinhamento de sequências ....................................................................... 42
2.2.5.2. Distâncias genéticas e construção de árvores filogenéticas ........................................ 42
2.2.5.3. Comparação das identificações originais com a alocação das espécies através do
sistema BIN (Barcode Index Number) .................................................................................... 44
2.2.5.4. Sistema de classificação dos DNA barcodes das bibliotecas de referência .................. 44
2.3. Resultados .......................................................................................................................... 46
2.3.1. Biblioteca de referência de DNA barcodes de poliquetas de estuário ................................. 46
2.3.2. Divergências nucleotídicas intra e interespecíficas congenéricas ....................................... 49
ix
2.3.3. Árvore filogenética nucleotídica de DNA barcodes ............................................................ 52
2.3.4. Árvore filogenética aminoacídica de DNA barcodes .......................................................... 58
2.3.5. Sistema BIN (Barcode Index Number) ............................................................................ 59
2.3.6. Sistema de classificação................................................................................................ 64
2.4. Discussão ........................................................................................................................... 66
2.4.1. Amplificação e sequenciação do marcador molecular COI-5P ........................................... 66
2.4.2. Performance dos DNA barcodes na diferenciação de espécies de poliquetas ..................... 67
2.4.3. Evidência de unidades taxonómicas ocultas e espécies putativas ...................................... 72
2.4.4. Classificação das sequências COI .................................................................................. 74
Referências ................................................................................................................................ 76
Capítulo 3
Análise de sequências COI para construção de uma biblioteca de referência de DNA
barcodes de poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
3.1. Introdução .......................................................................................................................... 87
3.2. Metodologia ......................................................................................................................... 90
3.2.1. Extração de DNA, amplificação e sequenciação ............................................................... 91
3.2.2. Análise dos dados ......................................................................................................... 91
3.3. Resultados .......................................................................................................................... 92
3.3.1. Biblioteca de referência de DNA barcodes de poliquetas do mar profundo ......................... 92
3.3.2. Divergências nucleotídicas intra e interespecíficas ........................................................... 92
3.3.3. Árvore filogenética nucleotídica de DNA barcodes ............................................................ 96
3.3.4. Árvore filogenética aminoacídica de DNA Barcodes ........................................................ 101
3.3.5. Sistema BIN (Barcode Index Number)........................................................................... 102
3.3.6. Sistema de classificação .............................................................................................. 107
3.4. Discussão .......................................................................................................................... 109
3.4.1. Performance dos DNA barcodes na diferenciação de espécies de poliquetas ................... 109
3.4.2.Classificação das sequências COI ................................................................................. 112
Referências .............................................................................................................................. 114
Capítulo 4
Conclusão geral
.................................................................................................................................................. 121
Anexos
...................................................................................................................................................125
Índice de figuras
Figura 1.1 - Esquematização do DNA mitocondrial com referência ao COI.............................................8
Figura 1.2 - Estruturas morfológicas básicas dos poliquetas................................................................16
Figura 1.3 - Partes anteriores (cabeça) dos poliquetas, com foco nos orgãos nucais............................17
Figura 2.1 - Metodologia geral utilizada para a prática do DNA barcoding............................................37
Figura 2.2 - Locais de amostragem de espécimes de poliquetas de estuário........................................38
Figura 2.3 - Ciclo de PCR correspondentes aos primers COI-2.............................................................41
Figura 2.4 - Metodologia usada para obtenção dos resultados desta tese............................................43
Figura 2.5 - Número de sequências COI (BOLD + GenBank) usadas para construção
de árvores NJ e respetivo cálculo das distâncias nucleótidicas........................................................47-48
Figura 2.6 - Histograma com o “barcoding gap” no género Nepthys....................................................51
Figura 2.7 - Histograma com o “barcoding gap” no género Hediste.....................................................51
Figura 2.8 - Árvore NJ de nucleótidos.............................................................................................53-54
Figura 2.9 - Sub-árvore NJ de nucleótidos focando a família Maldanidae.............................................56
Figura 2.10 - Sub-árvore NJ de nucleótidos focando a espécie Hediste diversicolor..............................57
Figura 2.11 - Sub-árvore NJ de nucleótidos focando as espécies Perinereis cultrifera
e Nereis zonata.....................................................................................................................................57
Figura 2.12 - Sub-árvore NJ de nucleótidos focando a família Glyceridae.............................................58
Figura 2.13 - Árvore NJ de aminoácidos.............................................................................................59
Figura 2.14 - Gráfico com as classificações de fiabilidade taxonómica.................................................64
Figura 2.15 - Gráfico com sequências similares de Hediste diversicolor usando a
ferramenta do BOLD-IDS.......................................................................................................................74
Figura 3.1 - Locais de amostragem de espécimes de poliquetas do mar profundo
(Norte da Peninsula Ibérica)..................................................................................................................90
Figura 3.2 - Locais de amostragem de espécimes de poliquetas do mar profundo
(Sul da Peninsula Ibérica)......................................................................................................................90
Figura 3.3 - Histograma com o “barcoding gap” das distâncias intra e interespecíficas globais............95
Figura 3.4 - Histograma com o “barcoding gap” das distâncias intra e interespecíficas globais
sem as ambiguidades taxonómicas.......................................................................................................95
Figura 3.5 - Árvore NJ de nucleótidos.............................................................................................97-98
Figura 3.6 - Sub-árvore NJ de nucleótidos focando a família Phyllodocidae........................................100
Figura 3.7 - Sub-árvore NJ de nucleótidos focando as famílias Spionidae e
Poecilochetidae...................................................................................................................................101
Figura 3.8 - Árvore NJ de aminoácidos.............................................................................................102
Figura 3.9 - Gráfico com as classificações de fiabilidade taxonómica.................................................107
xi
Índice de tabelas
Tabela 2.1 - Primers usados para amplificação dos segmentos de COI-5P..........................................40
Tabela 2.2 - Número de DNA barcodes analisados, distribuídos pelos projectos na BOLD....................46
Tabela 2.3 - Divergências médias, mínimas e máximas globais dos géneros de poliquetas
abordados........................................................................................................................................... 49
Tabela 2.4 - Divergências médias, mínimas e máximas intra e interespecíficas dos géneros
mais representativos da biblioteca COI em estudo.................................................................................50
Tabela 2.5 - Lista de espécies e respetivos espécimes e que a) agruparam em clados
monofiléticos com menos de 3% de divergência nucleótidica, b) que evidenciaram
incongruências taxonómicas ou c) representadas apenas por uma sequência..................................55-56
Tabela 2.6 - Resumo do número de registos e de BINs totais..............................................................60
Tabela 2.7 - BINs taxonomicamente concordantes.........................................................................60-62
Tabela 2.8 - BINs Singletons..........................................................................................................62-63
Tabela 2.9 - BINs taxonomicamente discordantes...............................................................................63
Tabela 2.10 - Lista de espécies com as classificações de fiabilidade taxonómica.................................65
Tabela 3.1 - Primers usados para amplificação dos produtos de PCR.................................................91
Tabela 3.2 - Divergências médias, mínimas e máximas globais dos géneros de poliquetas
presentes apenas no projecto BOLD analisado......................................................................................93
Tabela 3.3 - Divergências médias, minimas e máximas globais dos géneros totais de
poliquetas abordados............................................................................................................................94
Tabela 3.4 - Lista de espécies e respetivos espécimes e que a) agruparam em clados
monofiléticos com menos de 3% de divergência nucleótidica, b) que evidenciaram
incongruências taxonómicas ou c) representadas apenas por uma
sequência).....................................................................................................................................99-100
Tabela 3.5 - Resumo do número de registos e de BINs totais............................................................103
Tabela 3.6 - BINs taxonomicamente concordantes.....................................................................103-105
Tabela 3.6 - BINs taxonomicamente discordantes.............................................................................105
Tabela 3.7 - BINs Singletons......................................................................................................106-107
Tabela 3.9 - Lista de espécies com as classificações de fiabilidade taxonómica.................................108
Capítulo 1
Introdução geral
Capítulo 1
Os efeitos da maioria dos stressores antropogénicos nos ecossistemas globais, incluindo o
elevado aumento da concentração de CO2, poluição, perda de habitat e fragmentação levam a
que hajam sérias preocupações sobre o nosso meio ambiente. No entanto, o papel da
biodiversidade em manter a função, resiliência e recuperação dos ecossistemas só pode ser
abordada se a mesma biodiversidade for primeiramente identificada (Sutherland et al., 2006).
Os estudos ecológicos fornecem informações de base para muitas outras disciplinas biológicas,
desempenhando um papel fundamental na divulgação da abundância de uma série de erros
conceituais e metodológicos. Embora negligenciado e subestimado, este processo em cascata,
origina problemas taxonómicos triviais que afetam hipóteses e ideias, mas logo muda para um
problema mais prático afetando o nosso conhecimento sobre a natureza, bem como a estrutura
e funcionamento dos ecossistemas e da eficiência de programas de saúde humana (Bortolus,
2008). No final do século XX, tornou-se evidente que a biodiversidade existente era muito maior
do que a infraestrutura operacional e recursos humanos disponíveis para o seu estudo (Costa &
Antunes, 2012), havendo portanto, uma necessidade crítica de se delinear as espécies mas,
mais importante, porque a maioria das questões da Biologia Evolutiva, Ecologia, Biologia de
Conservação ou Biogeografia, dependem em parte, desses inventários de espécies e dos
conhecimentos das mesmas (Dayrat, 2005; Savage, 1995).
1.1. Motivação para novas abordagens na identificação de espécies
Taxonomia é a disciplina biológica que identifica, descreve, classifica e nomeia espécies
existentes e extintas, assim como outros níveis taxonómicos (Padial et al., 2010). É portanto,
responsável pela organização das fundações do conhecimento sobre a diversidade biológica, no
qual outras disciplinas dentro das ciências biológicas dependem (Costa & Antunes, 2012).
Os taxonomistas foram capazes de construir um código de regras consistente de modo a
organizar a taxonomia, como por exemplo o International Code of Zoological Nomenclature ou o
International Code of Botanical Nomenclature. No entanto, apenas recentemente, é que
iniciativas para criar um registo online centralizado de espécies animais foi proposto e
implementado (p.e. ZooBank [http://zoobank.org/]; Polaszek, 2005). Fazendo recurso a estas
ferramentas e recorrendo a estruturas importantes de armazenamento de coleções de
espécimes biológicos como os herbários e museus de história natural (Costa & Antunes, 2012),
3
Introdução geral
os taxonomistas têm conseguido descrever e a nomear milhares de espécies por ano (cerca de
15000 a 20000, contando apenas os animais) (Padial et al., 2010).
Apesar do sucesso da ciência taxonómica, os recursos e abordagens disponíveis estão
ainda longe de poderem fazer frente a uma tarefa de tremenda complexidade e de escala
massiva como é o caso da catalogação de toda a diversidade biológica. Recentemente, esse
problema, foi finalmente reconhecido e assimilado pela comunidade científica como
“impedimento taxonómico” (Rodman & Cody 2003).
O impedimento taxonómico manifesta-se graças a dois grandes desafios presentes na
taxonomia. Esses desafios estão intimamente ligados a dois resultados que a comunidade
científica e a sociedade esperam dessa ciência. Por um lado, fornecer rigor empírico para as
hipóteses de espécies e estabilidade nos respectivos nomes, o que requer um trabalho
cuidadoso e muitas vezes demorado e penoso na identificação das espécies. Por outro lado,
uma aceleração no ritmo da descrição de espécies, com o perigo de ocorrerem hipóteses
errôneas para as mesmas dando, como consequência, origem a nomes instáveis (Padial et al.,
2010).
Reconhece-se então, um desafio quantitativo, devido ao grande número de organismos no
planeta que ainda não foram descobertos, nem descritos (Costa & Carvalho, 2007). De acordo
com Chapman (2009), o número total estimado de espécies (quer procariotas, quer eucariotas)
existentes no mundo é aproximadamente de 11 milhões. No entanto, apenas 1,9 milhões de
espécies são formalmente conhecidas, sendo que esse número é também uma estimativa, pois
muitos dos nomes propostos para as mesmas são sinónimos devido à redundância das
descrições (Patterson et al., 2010) e também pelo facto de não existir qualquer repositório
central que contabilize todas as novas espécies descritas (Costa & Antunes, 2012). Estes
números são motivo para reflexão pois não só demonstram que somos essencialmente
ignorantes sobre uma grande porção da diversidade biológica, mas também que nem mesmo
sabemos exatamente e com precisão o pouco que fomos capazes de descrever, o que põe em
causa a veracidade daquilo que realmente se sabe.
O outro desafio tem um carácter qualitativo, que é chegar a um consenso científico sobre
a categoria base – a espécie - em torno da qual é construída a taxonomia e, assim, melhorar a
sua definição (Padial et al., 2010). Como se pode imaginar, esse problema tem sido um duelo
conceptual que tem vindo a estimular a fragmentação da comunidade taxonómica levando,
portanto, a dificuldades operacionais (Padial et al., 2010; Costa & Antunes, 2012). Tal
4
Capítulo 1
fragmentação tem sido também provocada pela inabilidade de encontrar um critério universal
para o reconhecimento de espécies. Desde Lineu, que as caraterísticas morfológicas e
anatómicas têm sido usadas como traços primários para o estabelecimento da fronteira entre
espécies, especialmente para animais e plantas. O problema é que as nuances morfológicas que
permitem a discriminação entre espécies são muitas vezes tão obscuras que apenas um
pequeno número de especialistas possui a capacidade e o conhecimento para as conseguir
distinguir com algum sucesso (Matzen da Silva et al., 2011; Costa & Antunes, 2012). Devido à
enorme diversidade morfológica entre os organismos, os taxonomistas foram forçados a
aumentar a especialização num taxa especifico. O isolamento dos taxonomistas dentro da
comunidade ciêntifica no seu taxa alvo, e a automização de toda a disciplina era inevitável. O
número de especializações cresceu significativamente mas a capacidade de troca de informação
diminuiu. Os problemas com a fragmentação estendem-se também à literatura taxonómica
científica (Moritz 2002; Knapp et al., 2007), criando problemas operacionais graves. Isto levou a
uma situação em que ser um taxonomista significava dominar a história, fontes e detalhes da
literatura sobre um grupo taxonómico particular (Costa & Antunes, 2012).
O problema do impedimento taxonómico ocorre em paralelo com o que muitos afirmam
ser um declínio gradual do impacto da taxonomia na área científica global e no suporte da
sociedade (Godfray & Knapp 2004; Wheeler et al., 2004; Boero 2010).
Muito já foi discutido sobre as soluções e fontes para o impedimento taxonómico (Rodman
& Cody, 2003; Godfray & Knapp, 2004; Lyal & Weitzman, 2004; Raven, 2004; Wheeler et al.,
2004; Agnarsson & Kuntner 2007; de Carvalho et al., 2007; Evenhuis 2007; Knapp et al, 2007),
sendo que de momento a maioria dos biólogos evolutivos concordam que as espécies são
linhagens de populações ou meta-populações
que evoluem
separadamente, com
desentendimentos a permanecerem apenas sobre onde, é que ao longo do continuum de
divergência, se separam as linhagens de modo a serem reconhecidas como espécies distintas
(Hey, 2006; Mallet, 2008). Esse consenso emergente, levou a uma rediscussão sobre
delimitação de espécies, que é fundamental para catalisar a integração de novos conhecimentos
e métodos na biologia de populações, na filogenia e noutras disciplinas evolutivas em taxonomia
(Sites & Marshall, 2004; Tan et al., 2009). Os taxonomistas percebem agora, que o que importa
para o estudo de assuntos de especiação, importa também para a taxonomia, e que as espécies
serão melhor delimitadas se soubermos o que causou a sua origem e o que determinou o seu
trajecto evolutivo. Como exemplos ilustrativos, a descoberta e descrição de três espécies de
5
Introdução geral
aranhas de alçapão da Califórnia (Bond & Stockman, 2008) necessitou de inferências sobre a
origem assim como da estrutura genética e de um grau de permutabilidade ecológica de
linhagens divergentes, e uma recente revisão taxonómica de pássaros cardeais (Davalos &
Porzecanski, 2009) envolveu a reconstrução da história filogenética, populacional e biogeográfica
das linhagens.
Uma consequência dessa tendência é que, após mais de 250 anos de predominância da
morfologia comparativa na descoberta de espécies, novos métodos e dados moleculares, estão a
conquistar um grande espaço dentro da taxonomia (Padial et al, 2010). Apesar de muitos
taxonomistas terem recebido com grande entusiasmo as perspetivas desta nova taxonomia
(Knapp, 2008; Vogler & Monaghan, 2007; Wilson, 2003; Wilson, 2004, Dayrat, 2005) outros são
mais céticos (Valdecasas et al., 2005; Wheeler, 2008). Apesar de tudo, a opinião geral é que
agora é o momento para construir uma “taxonomia integrativa”, que possa acomodar novos
conceitos e métodos (Dayrat, 2005; Will et al., 2005; Schlick-Steiner et al., 2010). Um número
considerável de estudos já adoptou este novo termo (p.e. Glaw et al., 2010; Lumley & Sperling,
2010; Fonseca et al., 2008; Cardoso et al., 2009; Gibbs, 2009).
No entanto, não existe consenso sobre o que uma taxonomia integrativa deveria ser,
sendo que as grandes discordâncias dizem respeito ao grau de congruência que diferentes
caracteres devem demostrar para considerar uma população ou um grupo de populações como
uma espécie separada.(Padial et al., 2010). Por exemplo, alguns taxonomistas vêm a
congruência entre caracteres moleculares e morfológicos, como um requesito necessário
(Dayrat, 2005; Meier, 2008; Cardoso et al., 2009), enquanto que para outros (de Queiroz, 2007;
Schlick-Steiner et al., 2010; Padial et al., 2009) a força de integração reside em evitar qualquer
seleção à priori de combinações de caracteres, destacando-se portanto, dois conceitos diferentes
da Taxonomia Integrativa: "integração por congruência" e a "integração por acumulação",
respetivamente (Padial et al., 2010).
A taxonomia precisa de ser uma ciência pluralística para que possa melhorar o ritmo da
descoberta e descrição das espécies e de desenvolver novos protocolos de modo a produzir o
tão requesitado inventário da vida num futuro não muito distante.
6
Capítulo 1
1.2. DNA barcoding
As limitações inerentes dos sistemas de identificação com base na morfologia e do
número limitado de taxonomistas, tendo em conta a biodiversidade abismal do nosso planeta,
sinalizam a necessidade de uma nova abordagem para o reconhecimento de taxa. Sistemas de
identificação com base no microgenoma dos organismos, o qual permite a discriminação da vida
através da análise de um pequeno segmento do genoma, representam uma abordagem
extremamente promissora para o diagnóstico da diversidade biológica (Tautz et al., 2003). De
facto, existe um número considerável de estudos no qual sistemas de identificação com base no
DNA, tem sido aplicados a organismos superiores (p.e. Brown et al., 1999; Bucklin et al., 1999;
Trewick, 2000; Vincent et al., 2000).
O DNA barcoding proposto por Hebert et al. (2003a) é a mais recente aposta da
comunidade ciêntifica para revitalizar a taxonomia e tem sido particularmente útil em sistemas
marinhos (Radulovici et al., 2010). O termo “DNA barcoding” é de uso recente na literatura, cuja
definição senso stricto, corresponde à identificação rápida, barata e precisa de organismos ao
nível das espécies, a partir de uma região curta e padronizada de DNA (como uma etiqueta), de
uma região acordada no genoma. “DNA barcoding” sensu lato é menos restritivo, abordando a
identificação de qualquer nível taxonómico utilizando qualquer fragmento de DNA (Costa &
Antunes, 2012).
O sistema ideal de DNA barcoding deve ter em conta alguns critérios para que reúna as
condições necessárias de modo a que se torne uma prática viável e responda portanto às
limitações da taxonomia convencional (Valentini et al., 2008). Para isso, a região do gene
sequenciado deve ser quase idêntica entre indivíduos da mesma espécie, mas diferente entre as
espécies (Carr et al., 2011). Ao aplicar o conceito de MOTU (Molecular Operational Taxonomic
Units), os taxa podem ser identificados através da identidade das sequências. A identidade da
sequência não precisa corresponder à identidade do OTU (Operational Taxonomic Units) que é
medida por outros modelos (biológicos ou morfológicos). Esta abordagem permite a atribuição
de espécies putativas para grupos que surgem a partir de dados que indiquem divergência
molecular permitindo assim testar grupos de espécies sob vários cenários (Costa et al., 2009).
O DNA barcoding difere, em vários aspectos, das abordagens e ferramentas de
identificação taxonómicas convencionais, sobre os quais oferece várias vantagens tais como
permitir a comparação directa de espécimes com uma biblioteca de referência global assim
7
Introdução geral
como a identificação de espécies a partir de fragmentos, e de qualquer fase de vida, criando
assim uma chave mestra universal num formato que reduz a ambiguidade (Costa & Carvalho,
2007).
Para os animais, a região do gene proposto para o código de barras é composto por 658
pares de bases e codifica o citocromo c oxidase 1 (COI-5P) do DNA mitocondrial (figura 1.1)
(Hebert et al., 2003).
Figura 1.1. Esquema genérico do genoma mitocondrial animal com indicação da localização do COI e restantes
genes. As bandas a negro referem-se a genes de RNAt.
O genoma mitocondrial animal é melhor alvo para análise quando comparado com o
genoma nuclear, uma vez que este não tem intrões, contém uma exposição limitada à
recombinação e possui uma herança haplóide (Saccone et al., 1999).
Os trabalhos filogenéticos realizados no passado têm usado como recurso os genes
mitocondriais que codificam o DNA ribossomal (12S, 16S), mas o seu uso em análises
taxonómicas mais amplas é limitado pela prevalência de inserções e deleções o que complica os
alinhamentos das sequências (Doyle & Gaut 2000). Os 13 genes codificantes de proteínas na
mitocôndria animal são alvos mais interessantes uma vez que os indels (que na sua maioria
levam a uma mudança na grelha de leitura) são raros. Existem, portanto, vários marcadores
moleculares possíveis, mas o gene da citocromo oxidase 1 (COI), tem duas vantagens que
merecem destaque. A primeira, é que os primers universais para este gene são bastante
robustos, permitindo a “recolha” do gene, de representantes da maioria ou de até mesmo todos
os filos animais (Folmer et al., 1994). A segunda razão, é que o COI parece possuir um sinal
filogenético de maior gama quando comparado com qualquer outro gene mitocondrial. Tal como
8
Capítulo 1
outros genes codificadores de proteínas, a terceira posição dos nucleótidos num codão mostram
uma alta incidência de substituições de bases, levando a uma taxa de evolução molecular 3
vezes maior do que os genes ribossomais 12S ou 16S (Knowlton & Weigt 1998). A evolução do
COI é rápida o suficiente para permitir não só a distinção entre espécies, mas também de
grupos filogenéticos dentro da mesma espécie (Cox & Hebert 2001; Wares & Cunningham
2001).
Para as plantas, o COI não é o mais indicado, e muitas estratégias têm sido propostas,
com base em uma região única no cloroplasto (Kress et al., 2005) ou de uma combinação de
diferentes regiões (Kress & Erickson 2007).
Como consequência, o DNA barcoding torna o sistema taxonómico de Lineu mais
acessível, com benefícios não só para os ecologistas ou biólogos, pois permitirá também um
acesso fácil aos nomes e atributos biológicos de quaisquer espécies existentes no planeta a
qualquer indivíduo desde crianças em idade escolar a qualquer amante da natureza (Hebert &
Gregory, 2005). Além de atribuir espécimes para espécies conhecidas, o DNA barcoding vai
acelerar o ritmo da descoberta de espécies, ao permitir que os taxonomistas tenham acesso a
um elevado número de amostras independentemente da sua condição, aos quais podem detetar
os taxa divergentes que poderão representar novas espécies (Tautz et al., 2003).
Várias vertentes ligadas à biologia ganham agora a habilidade de identificar espécies
usando dados públicos de barcodes, que agem como mais uma ferramenta que tenta
compensar os poucos peritos, que ainda existem em taxonomia. Em ecologia, por exemplo,
Smith et al. (2007) usou o DNA barcoding para distinguir generalistas de especialistas ecológicos
e Hajibabaei et al. (2006) descobriu novos padrões na fidelidade de plantas hospedeiras entre as
Lepidoptera tropicais usando a mesma ferramenta. Robins et al. (2007) usou o DNA barcoding
para estudar as histórias biogeográficas de algumas espécies de rato, com o objetivo de
compreender a sua relação com a história da migração humana. O DNA barcoding está também
a tornar-se numa técnica comum para detetar e gerir espécies de interesse para a sociedade
(Miller, 2008). Assefa et al. (2007) utilizaram dados com DNA barcodes para identificar
correctamente espécies de insectos/lagartas que constituem uma notória praga agrícola,
utilizando amostras de larvas encontradas em canas de açúcar. Timm et al. (2007) publicou
dados de DNA barcoding junto com dados morfológicos de espécies de pragas de mariposas
africanas que colocam em risco as culturas de frutas. Greenstone et al. (2005) utilizou esta
ferramenta em ovos e larvas de modo a explorar as relações predador-presa entre aranhas e
9
Introdução geral
carabídeos, podendo esses dados serem usados no controle biológico de pragas. Dawnay, et al.
(2006) validou os protocolos laboratoriais utilizados nos DNA barcodes, abrindo a porta para o
uso de dados de DNA barcoding para análise forense. Uma série de agências do governo dos
EUA estão também agora a testar esta técnica como um instrumento regulatório para a proteção
ambiental, segurança alimentar e conservação (Miller, 2008).
O DNA barcoding permite também a comparação rápida de múltiplos taxa de amplas
regiões geográficas e possuem um enorme potencial para a avaliação de coesão genética e para
a deteção de padrões biogeográficos de larga escala (Carr et al., 2011), indo portanto além da
taxonomia, tornando-se assim uma ferramenta bastante pertinente. Com esta melhoria nas
condições de trabalho, esta ferramenta oferece aos taxonomistas a oportunidade de expandir e
eventualmente completar, um possível inventário global da diversidade da vida (Hebert et al.,
2003a).
Os taxonomistas não são os únicos a beneficiar desta ferramenta, já que a técnica pode
ser útil para cientistas de outros campos como a ciência forense, biotecnologia e dieta animal
(Chase et al., 2005). Devido aos avanços em tecnologias de sequenciação e computacional, as
sequências de DNA têm se tornado a fonte principal de informação no avanço do nosso
conhecimento e compreensão das relações genéticas e evolutivas (Valentini et al., 2008). A
filogenética molecular e a genética de populações são outras duas disciplinas que beneficiaram
do avanço da tecnologia e do desenvolvimento do DNA barcoding. Esses dois ramos da biologia
focam-se em diferentes níveis de organização. Estudos na filogenética molecular lidam com as
relações evolutivas entre um grupo de organismos que descendem de um ancestral comum,
enquanto que a genética populacional lida com variações dentro e à volta de populações de uma
mesma espécie. Por comparação o DNA barcoding ocupa um termo médio já que procura uma
cobertura compreensiva das espécies, mas focando na sua identificação em vez das suas
relações (Hajibabaei et al., 2007). O DNA barcoding é portanto um sistema mais atualizado,
rápido, automatizável, simples e preciso em comparação com a taxonomia tradicional.
Esta metodologia apresenta, no entanto, algumas desvantagens. A principal limitação é o
facto de ser baseado num sistema de identificação com recurso a um só locus. Mesmo se várias
regiões a partir do DNA destes organelos forem sequenciadas, esta ainda é uma abordagem
com um só locus porque os diferentes genes do DNA mitocondrial ou cloroplastidial se
encontram ligados e é sabido que sequências idênticas de DNA mitocondrial ou cloroplastidial
podem estar presentes em diferentes espécies que se encontrem relacionados devido a
10
Capítulo 1
introgressão, ou talvez devido a linhagens incompletas desde a época em que ocorreu
especiação (Ballard & Whitlock, 2004). Outras desvantagens tais como cópias nucleares de
fragmentos de DNA mitocondrial e cloroplastidial que poderão ser amplificadas em algumas
circunstâncias (Zhang & Hewitt, 1996), o uso de diferentes pontos de divergência para distinguir
a variação de sequências intra de interespecifica (Hebert et al., 2003b) assim como a
heteroplasmia (Kmiec et al., 2006) poderá também confundir o sistema de identificação
causando vários problemas estatísticos (Vences et al., 2005).
Além destas limitações, foram igualmente apresentadas algumas críticas globais em
relação à metodologia do DNA barcoding, considerando a técnica como uma “caricatura” da
taxonomia real (Lipscomb et al., 2003). Porém, a proposta do DNA barcoding é contribuir com
dados moleculares que, em conjunto com os morfológicos, poderão aprimorar o processo de
identificação de espécies, não substituíndo portanto as abordagens taxonómicas convencionais
(Costa et al., 2007). O DNA barcoding irá sim amplificar a escala e sucesso da ciência da
biodiversidade ao melhorar o acesso a identificações ao nível de espécie. Um sistema
automatizado baseado em DNA irá libertar os taxonomistas das suas rotinas de identificações,
permitindo-lhes direcionar os seus esforços na obtenção de novas coleções, descrições e
avaliações das relações taxonómicas. Alguns opositores ao DNA barcoding têm argumentado que
as identificações de rotina são apenas uma pequena parte do trabalho de um taxonomista
(Lipscomb et al., 2003; Wheeler, 2004; Will & Rubinoff, 2004), enquanto outros elogiaram o
potencial da utilidade de sistemas de identificação automatizados, mas apenas se baseados na
morfologia (Gaston & O'Neill, 2004; Wheeler, 2004). Hebert & Gregory (2005), no entanto,
defendem que a identificação das espécies são um passo limitante na velocidade para muitos
investigações ecológicas e de biodiversidade, bem como para a pesquisa taxonómica, sendo que
o DNA barcoding permitirá aliviar não só a carga de trabalho nos taxonomistas mas também
preencher uma necessidade atual, com importantes benefícios para a taxonomia e para a
ciência da biodiversidade.
A implementação global dos DNA barcodes como método de identificação de espécies não
retirará aos taxonomistas o seu papel na liderança da associação, integração e interpretação de
conhecimentos sobre a variação de estado dos caracteres que delimitam as espécies e
respetivas implicações para a taxonomia superior. Como observado anteriormente, o seu
trabalho em novas comunidades de organismos, pode ser muitas vezes acelerado pelos
resultados obtidos com DNA barcodes, permitindo uma abordagem à posteriori no
11
Introdução geral
reconhecimento de espécies. Os taxonomistas irão também continuar a retirar vantagens de
outras abordagens moleculares e morfológicas para explorar relações taxonómicas mais
profundas (Hebert & Gregory, 2005).
Miller (2007) atribuíu à metodologia do DNA barcoding um papel importante no
“renascimento da taxonomia”. Na sua visão, o rápido crescimento das base de dados
moleculares proporciona aos taxonomistas uma lingua franca, na qual podem descrever, discutir
e delinear espécies e as fronteiras entre as mesmas. Desta forma, o DNA barcoding está
figurativamente a colocar toda a diversidade de organismos vivos sobre a mesa, de modo a que
os investigadores a possam examinar e fazer as respetivas comparações (Miller, 2008).
Não é esperado que a tecnologia seja a única solução para os problemas de taxonomia,
mas pode melhorar muitas das suas ineficiências operacionais e revitalizar toda a disciplina
transportando-a para um novo nível de impacto quer na comunidade científica, quer na maneira
como se traduz em serviços para a sociedade (Costa & Antunes, 2012).
1.3. Iniciativa Barcode of Life (BOLI)
A seleção natural, um mecanismo de mudança evolutiva proposta por Darwin, quando
este observou os padrões geográficos e temporais na diversificação morfológica e
comportamental entre espécies, possui agora, revelado pelos últimos desenvolvimentos
científicos, um nível mais fundamental da complexidade biológica através da variabilidade das
sequências de DNA (Costa & Carvalho, 2007).
Embora os projecto genómicos que têm vindo a ser feitos, tenham produzido resultados
impressionantes na biologia molecular, estes apenas têm como alvo algumas espécies. Por outro
lado, a BOLI (Barcode of Life Initiative), propõe uma abordagem horizontal para a genómica ao
examinar pequenos segmentos padronizados do genoma para toda a vida eucariótica. Um
projecto ambicioso que conta com a ferramenta do DNA barcoding para identificar não só as
espécies conhecidas mas também as que aindas estão por descobrir (Costa & Antunes, 2012).
Desde a sua criação na Universidade de Guelph em 2003, a BOLI tem reunido um
impulso considerável com uma participação internacional bastante ativa, capturando a atenção
da comunidade científica, agências governamentais e o público geral. Graças ao investimento
em infraestruturas de pesquisa e em recursos humanos, em 2008 já foram obtidas informações
12
Capítulo 1
em DNA barcodes para mais de 333000 espécimes, representando mais de 35 mil espécies.
Tais informações refletem um avanço rápido nos dados moleculares, que prometem contribuir
na nossa habilidade de identificar e descobrir espécies e gerir os seus impactos económicos e
sociais (Miller, 2008), sendo que atualmente mais de 180000 espécies foram formalmente
identificadas com dados moleculares (animais, plantas e fungos) correspondendo a mais de dois
milhões de DNA barcodes, o que demonstra o enorme progresso nesta area (BOLD, 2013).
Uma vez que esteja completamente implementado, este sistema irá revolucionar o acesso
à informação biológica, através da disponibilização gratuita de um enorme banco de dados de
sequências online, com impactos na investigação, política, controlo de pestes e doenças,
segurança alimentar, gestão de recursos, conservação, e muitas outras áreas nas quais a
sociedade interage com a biodiversidade selvagem. Como o bem estar de um ecossistema tem
impatos críticos nas economias nacionais e com a crescente globalização do comércio e
alterações climáticas, as nações estão a enfrentar uma exposição sem precedentes a novas
espécies que podem ameaçar a agricultura, sivicultura e pescas. Um sistema DNA barcodes vai
habilitar um diagnóstico rápido de espécies invasoras, permitindo assim que os esforços de
quarentena e erradicação comecem anos antes, com reduções maciças no custo e um aumento
das chances de sucesso (Costa & Antunes, 2012).
A mesma estratégia extende-se a uma seleção óptima de planos de controlo para pragas
com impacto nos diversos sectores de recursos naturais e terá um papel fundamental na
regulação do comércio de espécies em perigo de extinção ou protegidas (Rubinoff, 2005).
A BOLI vai não só alargar a nossa compreensão da evolução e especiação de formas
variadas, mas também facilitar a quantificação da diversidade biológica, revelando espécies
crípticas e permitindo uma pesquisa rápida da diversidade taxon em grupos que até agora tem
recebido pouca análise morfológica. A facilitação de uma atribuição de estádios da história de
vida de espécies conhecidas e o fornecimento de uma estimativa das idades das espécies é
também mais uma das vantagens que a BOLI permitirá (Costa & Carvalho, 2007). A conjugação
do método de DNA Barcoding com os métodos de sequenciação de segunda geração, vai
permitir captar a estrutura e dinâmica de comunidades complexas, com grau de detalhe sem
precedentes, podendo aumentar, exponencialmente, a taxa de descoberta de espécies e
contribuir para melhorar a forma como se preserva a biodiversidade (Costa & Antunes, 2012).
Uma iniciativa internacional de apoio ao desenvolvimento de código de barras de DNA, o
Consórcio para o Código de Barras da Vida (CBOL, http://barcoding.si.edu), tem vindo a
13
Introdução geral
promover padrões globais e também a coordenar a investigação em DNA Barcoding. O
secretariado do CBOL está localizado no Museu Nacional de História Natural em Washington DC
(EUA). Desde a sua criação em 2004, mais de 125 instituições (museus, herbários, zoos,
institutos de investigação em biodiversidade, universidades, organizações de conservação,
agências governamentais e companhias privadas) provenientes de mais de 40 países
englobando os 6 continentes, passaram a ser membros da iniciativa ao assinar um memorando
de cooperação acordando depositar toda a informação envolvendo DNA barcodes num
repositório público (Marshal, 2005; Ward et al., 2009). O BOLD (Barcode of Life Data Systems,
http://www.barcodinglife.org) foi projectado para registrar não apenas sequências de DNA de
vários indivíduos por espécie, mas também informação taxonómica completa, local e data de
coleta, e imagens de amostras (Ratnasingham & Hebert 2007). Repositórios públicos de
genomas (nomeadamente o GenBank of the National Center for Biotechnology Information
(NCBI), o European Molecular Biology Laboratory (EMBL) e o DNA Data Bank of Japan (DDBJ))
fornecem também acesso livre aos dados de DNA barcoding. Para evitar a dispersão de
informação taxonómica, as soluções informáticas permitem a interação entre bases de dados e a
criação
de
bases
de
dados
integradas,
tais
como
a
Catalogue
of
Life
(http://www.catalogueoflife.org/, resultante da fusão entre a Integrated Taxonomic Information
System (ITIS) e a Species 2000) ou a World Register of Marine Species (WoRMS,
http://www.marinespecies.org/), as quais fornecem acesso centralizado a dados taxonómicos.
Relativamente ao acesso à informação sobre biodiversidade, a criação da Encyclopedia of Life
(EoL) em 2008 foi um desenvolvimento importante e um dos mais influentes para o futuro
(Wilson, 2003), que visa oferecer um conjunto global de informação detalhada e compreensível
de todas as espécies conhecidas do planeta.
No âmbito do CBOL, foram também criados vários projetos de referência de modo a
focalizar o esforço de investigação em grupos taxonómicos específicos, como é o caso do “ All
Birds Barcoding Initiative” (ABBI, http://www.barcodingbirds.org/) que em 2007 já tinha 11433
espécimes com DNA barcodes, representando mais de 2000 espècies de aves e do “All Fish
Barcoding Initiative” (FISH-BOL, http://www.fishbol.org/) que em 2008 já tinha obtido DNA
barcodes para 23000 espécimes representando 4300 espécies de peixes (Miller, 2008). Todos
estes desenvolvimentos irão provavelmente aumentar o uso do DNA barcoding por ecologistas
(Valentini et al., 2008).
14
Capítulo 1
Os métodos atuais para biomonitorização de ecossistemas seguem uma abordagem
tradicional limitada, com uma amostragem de escala local, seguida por um longo período de
processamento e enumeração de unidades taxonómicas, o que pode levar meses ou até mesmo
anos, e muitas vezes são gerados dados com baixa precisão taxonómica (Baird & Hajibabaei,
2012). Num contexto mais tardio, com a ascenção de técnicas paralelas de sequenciação
massivas, as bibliotecas de referência de DNA barcodes irão permitir um monitoramento
ambiental mais sofisticado que explorará os organismos vivos como integradores de mudança
ambiental ou como avisos preventivos de dano (Costa & Antunes, 2012).
1.4. Classe Polychaeta
Os primeiros poliquetas foram formalmente nomeados por Lineu (1758) e a partir dessa
altura, milhares destes organismos têm vindo a ser descritos. Segundo Rouse & Pleijel (2001), o
número de espécies aceites chega a 9000, no entanto, mais alguns milhares foram nomeados,
sendo atualmente considerados inválidos. É certo que ainda há muitos mais poliquetas para
serem descritos e que estes representam, sem sombra de dúvida, um componente importante
na diversidade de animais marinhos. Tal facto é exemplificado em estudos sobre a variedade de
poliquetas em pequenas áreas. Por exemplo, Grassle (1974), encontrou 1441 poliquetas num
unico pedaço de coral que pesava apenas alguns quilos. Esses poliquetas foram separadas em
103 grupos nominais de espécies as quais representavam dois terços de toda a macrofauna
coletada. Estudos mais recentes sobre a diversidade de poliquetas do mar profundo mostraram
um padrão similar, nomeadamente na dominância em termos de indivíduos e taxa (p.e. Grassle
& Macioleck, 1992; Patterson et al., 1998). O mais impressionante nesses estudos foram o
número de poliquetas ainda não descritos que foram encontrados (p.e. 64% por Grassle &
Maciolek, 1992). Claramente, ainda existe muito trabalho a ser feito em apenas documentar a
diversidade de poliquetas e descrever formalmente os taxa (Rouse & Pleijel, 2001).
Os poliquetas, tal como os restantes membros do filo Annelida, possuem duas regiões
pré-segmentais, o prostomium e o peristomium, com apêndices sensoriais e/ou usados para a
alimentação, um tronco segmentado (metastomium), o qual se pode diferenciar nas regiões
torácica e abdominal e um pigídio pós-segmental (figura 1.2). Típicamente, cada segmento
15
Introdução geral
possui um par de parápodes associados a sedas. No entanto, existe uma considerável variação
morfológica nesta classe, refletindo a diversidade de estilos de vida encontrados nestes animais.
Figura 1.2. Visão geral das estruturas morfológicas básicas dos poliquetas. A: Típico poliqueta com váriás
modificações nos cirros dorsais. B: Parte anterior (cabeça) mostrando probóscide evertido. C: Parápode básico. D:
Zona tóracica e abdmonial de um poliqueta da família Sabellida. Adaptado de Hayward & Ryland, 1995.
Os orgãos nucais, um par de estruturas quimiosensitivas na margem póstero-lateral do
prostomium, são aparentemente a única caraterística (sinapomorfia) que distingue os poliquetas
dos restantes anelídeos (Rouse & Fauchald, 1995). A morfologia dos orgãos nucais varía desde
“loops” bem desenvolvidos projetados posteriormente, a poços ou sulcos quase impercetíveis
(figura 1.3). Os maiores orgãos nucais podem ser encontrados nas famílias Amphinomidae e
Euphrosinidae, onde as dobras ciliadas na carúncula representam as ditas estruturas (figura
1.3A). Muitas das caraterísticas distintivas entre os poliquetas encontram-se ausentes ou
16
Capítulo 1
reduzidas em animais mais pequenos e intersticiais o que torna obscuras as suas afinidades
com a respetiva família (Glasby et al., 2000).
Figura 1.3. Partes anteriores (cabeça) dos poliquetas, mostrando os orgãos nucais. A: Orgãos nucais bem
desencolvidos compreendendo uma banda ciliar continua adjacente à caruncula, vista dorso-lateral de Eurythoe
complanata (Amphinomidae); apenas um loop do orgão nucal é mostrado. B: Orgãos nucais com forma de cone
evertido, vista dorsal de Glycera convoluta (Gliceridae). C: Orgão nucais dorso-laterais pequenos, quase
imperceptiveis, vista dorsal de Brania subterranea (Syllidae). D: Orgãos nucais postero-laterais em forma
decrescente, vista dorsal de Gyptis propinqua (Hesionidae). E: Orgãos nucais na margem de extensões nucais,
vista dorsal de Notophylum foliosum (Phylodocidae). F: Poços nucais, vista dorso-lateral da Stygocapitella
subterranea (Parergodrilidae); apenas um poço nucal é mostrado. As setas indicam os orgãos nucais. Car –
carúncula. Reproduzido de Glasby et al., 2000.
Os poliquetas exibem uma grande variedade de estratégias reprodutivas as quais podem
ser sexuadas ou assexuadas. São típicamente dióicos, mas muitas espécies são hemafroditas.
Os gâmetas são proliferados a partir do epitélio germinal que se encontra anexado aos septos
dos segmentos anteriores. Na maioria dos casos, os gâmetas são libertados no celoma onde se
desenvolvem, mas ocasionalmente, todo o desenvolvimento dos gâmetas ocorre apenas no
epitélio germinal. Na altura da desova, os gâmetas são normalmente libertados para o exterior
via gonodutos, no entanto em algumas espécies, sua libertação é feita por rotura da parede do
corpo, levando à morte do animal. Os poliquetas exibem ainda uma grande variedade na
periodicidade da desova, podendo esta ocorrer em intervalos de apenas algumas semanas ou de
um ano, uma única vez no seu ciclo de vida (monotélicos) ou ao longo de vários anos
(politélicos). Depois da fertilização, segue-se um estádio larvar com incubação e desenvolvimento
17
Introdução geral
direto num estádio juvenil ou com larvas trocóforas de vida livre. A reprodução assexuada é
também variável. Em algumas espécies, o animal divide-se em segmentos individuais ou em
vários fragmentos em que cada um dos quais se diferencia num novo indivíduo (Glasby et al.,
2000).
A maioria dos poliquetas vive em ambientes marinhos e estão bem representados em
todo o tipo de habitats bênticos, desde sedimentos estuarinos lodosos ou arenosos, a recifes de
corais e substractos rochosos, bem como nos sedimentos finos de mar. Também ocorrem em
ambientes pelágicos como meroplankton e holoplankton. Algumas famílias estão também
representadas em ambientes de água doce. Algumas espécies, incluindo alguns Nereides e os
Stygocapitella vivem em vegetação que se encontra na costa marítima e nas margens dos rios.
Nestes casos, os ambientes são normalmente húmidos, muitas vezes completamente alagados,
portanto a natureza terrestre desses taxa é mais aparente do que real. Poliquetas parasitas são
também conhecidos e podem ser encontradas em várias famílias como a Oenonidae e
Sabellidae (Glasby et al., 2000).
Os poliquetas possuem um papel importante nas cadeias tróficas dos respectivos
ecossistemas assim como na nitrificação, desnitrificação e redução total de nitrato através dos
buracos criados pela sua locomoção no sedimento (Kristensen et al., 1985), muitas espécies
podem também ser utilizadas como biomarcadores da qualidade ambiental e possuem um peso
económico considerável na industria da pesca ao servirem de isca de peixe sendo já proposta a
criação de aquacultura da espécie Hediste diversicolor (uma das mais usadas como isca) de
modo a aliviar a pressão ambiental causada pelo excesso de demanda para que se possa ter um
rendimento sustentável ótimo de iscas de peixe (Scaps, 2002).
Hipóteses sobre a filogenia de poliquetas, foram praticamente nulas durante grande parte
do século XX. Tal situação pode ser explicada pelo facto de os investigadores que trabalharam
com esses organismos terem ficado ocupados apenas na sua descrição desconsiderando a
evolução do grupo. Segundo Rouse & Pleijel (2001), o estudo de Weitheide (1977), sobre a
evolução do Microphthalmus, providenciou o primeiro estudo de poliquetas usando a sistemática
filogenética (cladística). Nos anos 80 e 90, começaram a aparecer os primeiros artigos sobre os
relacionamentos dentro de grupos particulares de poliquetas como foram os casos de ten Hove
(1984) nos Serpulidae, Paxton (1986) nos Onuphidae, Fitzhugh (1987, 1989) em estudos sobre
os Nereididae e Sabelidae respectivamente, e Pleijel (1991) na familia Phyllodocidae. Uma
18
Capítulo 1
perspetiva filogenética como força motriz na revisão da sistemática de poliquetas tem sido
fundamental e irá sem dúvida alguma continuar a ser praticada.
1.5. Objectivos gerais e estrutura da tese
A presente tese teve por objectivo:
1. Contribuir para a construção de uma biblioteca de DNA barcodes (COI-5P) para
identificação de poliquetas de dois ecossistemas distintos, nomeadamente os estuários de
zonas costeiras portuguesas, e do mar profundo da Península Ibérica. No caso do
primeiro grupo pretende-se com esta compilação melhorar e facilitar futuras identificações
taxonómicas e utilizar este recurso como biblioteca de referência em estudos de
monitorização, com recurso à sequenciação de segunda geração, em conjunto com
bibliotecas de outros organismos bentónicos. No caso da biblioteca de referência de DNA
barcodes de poliquetas do mar profundo pretende-se dar um contributo significativo para o
conhecimento de comunidades de organismos ainda debilmente estudadas e de difícil
acesso, acelerando o processo de catalogação destes organismos e facilitando o futuro
reconhecimento de espécimes.
2. Confrontar as identificações com base na morfologia com as unidades moleculares
operacionais (MOTUs) derivadas da análise dos DNA barcodes, no intuito de rever e
clarificar as ambiguidades taxonómicas emergentes, bem como detetar potenciais
espécies não-descritas de poliquetas. Pretendeu-se sobretudo diagnosticar ambiguidades
na delimitação de espécies que deverão ser sujeitas a exame detalhado em estudos
futuros, complementando estas observações com dados morfológicos e moleculares
adicionais, dados ecológicos e biogeográficos, conduzindo a hipóteses de espécies que
serão sujeitas a validação.
3. Pesquisar sequências homólogas de COI-5P em bases de dados públicas (BOLD e
GenBank) e em função do resultado atribuir uma cotação de fiabilidade taxonómica a cada
associação espécie/DNA barcode da biblioteca de referência de modo a permitir o
19
Introdução geral
refinamento contínuo em linha com o aumento da disponibilidade de dados públicos e
com a natureza iterativa das questões taxonómicas.
Esta tese de mestrado encontra-se estruturada em 4 capítulos. No primeiro capítulo foi
feito o enquadramento e fundamentação do estudo, bem como uma introdução geral ao tema do
DNA barcoding envolvendo a revisão do estado atual dos conhecimentos sobre esta metodologia.
Neste primeiro capítulo são ainda apresentados os objetivos e estrutura global da tese. No
segundo capítulo é apresentado o estudo referente à compilação da biblioteca de DNA barcodes
de poliquetas de estuários de Portugal. Nele são apresentados os resultados da compilação das
sequências de COI obtidas no âmbito deste estudo em conjunto com as sequências COI não
publicadas e geradas pelo conjunto de equipas de investigadores da Centro de Biologia
Molecular e Ambiental (CBMA), Universidade do Minho, do Instituto do Mar (IMAR) e do Centro
Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR). O terceiro capítulo consiste num
primeiro contributo para a compilação de uma biblioteca de referência de DNA barcodes de
poliquetas do mar profundo da Península Ibérica. Foram utilizadas sequências de COI não
publicadas geradas pelo CESAM (Centro de Estudos do Ambiente e do Mar) da Universidade de
Aveiro, com o capítulo 4 a fazer uma conclusão geral dos resultados obtidos sintetizando os
contributos desta tese com uma apreciação das limitações existentes e sugestão de
necessidades de investigação mais prementes.
20
Capítulo 1
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Capítulo 2
Contribuição para a construção de uma
biblioteca de referência de DNA barcodes para
poliquetas estuarinas portuguesas
Capítulo 2
2.1. Introdução
As zonas intertidais dos habitats estuarinos possuem um elevado número de
invertebrados bentónicos, sendo os poliquetas uma das classes mais representativas (Sutherland
et al., 2006). Os estuários são um corpo de água costeiro semifechado que possui uma ligação
livre com o mar aberto em que a água salgada se dilui de forma mensurável com a água doce
proveniente da drenagem continental (Day et al., 1989). Do ponto de vista biológico, têm sido
considerados dos ecossistemas mais produtivos, representando áreas vitais de alimentação e
reprodução para muitas espécies animais (Lyra, 2007). Mas tal como as lagoas costeiras, estão
sujeitos a múltiplas pressões associadas maioritariamente ao despejo de resíduos, exploração de
recursos naturais e atividades recreativas (McLusky & Elliott, 2004). Os poliquetas, são
importantes indicadores de qualidade ambiental nesse tipo de ecossistemas (Sutherland et al.,
2006), sendo também um elo importante na cadeia alimentar e de importância económica para
a pesca em vários países europeus ao servirem como iscas de peixe (Gilleta & Torresanib,
2003). No entanto, são pouco estudados quando comparados com outros taxa de importância
ecológica semelhante (Quijón & Snelgrove. 2005).
A correta gestão dos ecossistemas marinhos é uma questão que parece ganhar mais
ímpeto com a aplicação da Directiva 2000/60/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 23
Outubro de 2000, a qual estabelece um quadro de ação comunitária no domínio da política da
água, que exige a elaboração de planos de gestão das bacias hidrográficas para cada região
hidrográfica, a fim de se atingir um bom estado ecológico e químico, e que contribuirá para a
atenuação dos efeitos das inundações. Estudos sobre estes anelídeos podem contribuir para
esse objetivo, no entanto, a identificação das espécies deste grupo funcional com base em
caracteres morfológicos reveste-se de grande dificuldade (Coull, 1999). A dependência de um
grupo de especialistas específicos para identificação da classe, a existência de espécies crípticas
ou ocultas (Knowlton 1993; Jarman & Elliott 2000), o recurso a chaves dicotómicas incompletas,
a ocorrência de diferentes estágios de vida com diferentes caraterísticas, a recolha de espécimes
degradados ou com lesões no corpo causados pelas técnicas de amostragem (Knowlton, 1993)
e ainda a plasticidade fenotípica bem como a variabilidade genética dos caracteres empregados
para o reconhecimento de espécies, são alguns dos exemplos que faz com que a correta
identificação taxonómica destes e de outros organismos seja uma tarefa extremamente difícil e
por vezes impossível (Rouse & Pleijel 2001; Hebert et al., 2003).
33
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
A abordagem taxonómica tradicional é portanto um método ultrapassado e pouco eficaz,
especialmente quando se lida com poliquetas (Westheide & Schmidt, 2003; Nygren & Pleijel,
2010; Nygren et al., 2011). De modo a responder a essa limitação, vários estudos examinaram
a variação em sequências de DNA mitocondrial confirmando a ferramenta do DNA barcoding
como uma análise viável na discriminação de espécies de poliquetas (por exemplo: Barroso et
al., 2010; Bleidorn et al., 2006; Nygren & Pleijel, 2011; Glover et al., 2005; Rice et al., 2008;
Olson et al., 2009; Pleijel et al., 2009; Carr et al., 2011), em alguns casos, com as diferenças
morfológicas, ecológicas e comportamentais a serem detetadas depois de um exame mais
aprofundado dos taxa divergentes (Hebert et al. 2004; Smith et al. 2006). Alguns desses estudos
revelaram ambiguidades bastante interessantes como a descoberta de espécies de poliquetas
que se presumiam ser cosmopolitas, mas que na realidade eram espécies crípticas como foram
os casos da Eurythoe complanata (Barroso et al., 2010) e Syllis gracilis (Maltagliati et al., 2000).
Os ecossistemas estuarinos portugueses parecem possuir uma biodiversidade
considerável em poliquetas. Facto esse que se reflete no enorme número de famílias de
poliquetas que podem ser encontradas nesses habitats. Espécies como os da tabela T1 (em
anexo) são apenas alguns exemplos que se podem vislumbrar neste canto da Peninsula Ibérica
sendo a Hediste diversicolor (Nereididae) uma das espécies mais comuns em Portugal e na
Europa (Smith, 1977; Ozoh & Jones, 1990; Alla et al., 2006). Esta diversidade torna os estuários
portugueses um ponto ideal para contribuir no enriquecimento de uma biblioteca de referência
de DNA barcodes para esta classe de organismos que poderá ser usada em estudos de
biomonitorização em grande escala com recurso a técnicas de sequênciação massivas como a
sequenciação de segunda geração. Para tal, será primeiro necessário validar e construir a
respetiva biblioteca fazendo uma confrontação das identificações com base na morfologia com
as unidades moleculares operacionais (MOTUs) obtidas, no intuito de rever e clarificar as
ambiguidades taxonómicas emergentes.
34
Capítulo 2
2.2. Metodologia
Os resultados originais apresentados neste capítulo resultam da compilação de
sequências não publicadas e respetivos metadados, geradas pelo trabalho conjunto de equipas
de investigadores da Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA), Universidade do Minho,
do Instituto do Mar (IMAR) e do Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental
(CIIMAR), no âmbito dos projetos LusoMarBoL (PTDC/MAR/69892/2006) e BEstBarcode
(PTDC/MAR/113435/2009) financiados pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). A
compilação apresentada inclui um conjunto de sequências por nós geradas no âmbito desta
tese. A extração de DNA, amplificação, sequenciação e alinhamento de sequências de parte dos
espécimes foi realizada no Biodiversity Institute of Ontario (doravante designado por BIO),
University of Guelph, Canadá, no âmbito de um projecto iBOL (International Barcode of Life).
2.2.1. Procedimento geral
A metodologia global para a construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes
encontra-se esquematizada na figura 2.1. Este procedimento integra-se no processo taxonómico
global de inventariação da biodiversidade, que se constitui como um processo recursivo em que
frequentemente é necessário regressar às etapas iniciais ou complementar o procedimento com
passos ulteriores além dos descritos.
O processo inicia na colheita de espécimes dos grupos taxonómicos e ecossistemas alvo.
Em alternativa à colheita de espécimes em meio natural, poder-se-ía recorrer a espécimes
arquivados em coleções de história natural. Contudo, a maioria dos espécimes já existentes em
coleções não foram preservados de forma ótima para a obtenção de um extrato de DNA de
qualidade. Por outro lado, muitas espécies ainda não estão presentes nas coleções e só podem
ser obtidas diretamente a partir do meio natural. Após a recolha, os espécimes deverão ser
cuidadosamente identificados em laboratório com base nos caracteres morfológicos e com
recurso a chaves taxonómicas e monografias especializadas. Todos os espécimes são registados
em tabelas contendo um conjunto de campos padronizados (taxonomia, detalhes do espécime,
dados de coleta e informação dos “vouchers”), juntamente com as respetivas fotografias e
35
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
anotações, que serão submetidas à base de dados BOLD DataSystems (Ratnasingham & Hebert,
2007).
De cada espécime é retirado um pequeno pedaço de tecido para extração do respetivo
DNA e o espécime arquivado temporariamente até posterior depósito numa coleção biológica.
No caso de espécimes de pequenas dimensões poderá ser necessário utilizar a totalidade do
organismo para obtenção do extrato de DNA. Nestas situações deverá ser guardado um indivíduo
da mesma espécie, recolhido na mesma data e local para posterior depósito na coleção
biológica.
Posteriormente à extração de DNA é realizada a amplificação do respetivo DNA barcode
de cada indivíduo - que corresponde a 658 pares de bases da região da extremidade 5’ da subunidade 1 do gene mitocondrial do citocromo c oxidase (COI-5’) - por meio da reação em cadeia
da polimerase (“polymerase chain reaction”), doravante designada por “PCR”. O sucesso da
amplificação é verificado através de gel de agarose, e os produtos de PCR obtidos serão sujeitos
a purificação e sequenciação bi-direccional.
Após a edição e alinhamento das sequências, as mesmas e os respetivos cromatogramas
são submetidos à base de dados BOLD. Será também feita uma confrontação com as
identificações efetuadas com base na morfologia de acordo com abordagens descritas em maior
detalhe na secção 2.2.5.
36
Capítulo 2
Ecossistemas estuarinos
Espécime
Identificação
taxonómica
Amostra tecido
Fotografia
Informação disponível
online/ DNA Barcodes
Extração DNA
PCR
Electroforese
Purificação e
Sequenciação
Figura 2.1. Esquema simplificado referente à metodologia global utilizada no DNA barcoding
2.2.2. Recolha e processamento das amostras
No âmbito dos projetos LusoMarBoL e BEstBarcode foram organizadas múltiplas
campanhas de colheita de organismos em ecossistemas costeiros portugueses, através das
quais se recolheram os exemplares de diferentes espécies de poliquetas para integrar na
biblioteca de referência. Foram incluídos neste estudo espécimes recolhidos nomeadamente nos
estuários dos rios Minho, Lima, Tejo, Sado e Mira e na Ria de Aveiro (figura 4).
37
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
As amostragens foram efetuadas com o auxílio de corers na zona entre-marés ou por meio
de dragas de amostragem de sedimento a partir de um barco. No laboratório, foi feita a triagem
dos organismos presentes nos sedimentos utilizando crivos de 500 µm. Os poliquetas isolados
dos sedimentos foram individualizados em tubos de plástico e preservados numa solução de
etanol a 98% .
Figura 2.2. Localização geográfica da amostragem dos espécimes de poliquetas de estuário. Estuários dos rios
Minho, Lima, Tejo, Sado, Mira (Estuários do Alentejo) e na Ria de Aveiro.
2.2.3. Identificação taxonómica
Os espécimes foram fotografados e examinados individualmente e identificados
morfológicamente até a nível taxonómico mais baixo possível, com recurso a uma lupa,
microscópio e chaves dicotómicas disponíveis na literatura taxonómica especializada (Fauvel,
1927; Hayward & Ryland, 1995). Além da classificação taxonómica, os metadados associados a
cada espécime, tais como coordenadas GPS do local de amostragem, data de recolha,
profundidade e outras anotações do local de colheita, foram inseridos numa tabela de campos
padronizados e posteriormente submetidos à base de dados BOLD. A cada espécime foi
atribuído um número de registo único, ao qual se encontra associada a informação recolhida,
assim como as fotografias, sequências COI-5’ e respetivos cromatogramas.
38
Capítulo 2
2.2.4. Extração de DNA, amplificação e sequenciação
A extração de DNA, amplificação da região COI-5’ e sequenciação foi realizada de acordo
com dois protocolos distintos que serão a seguir detalhados, consoante se efetuaram no CBMA
ou IMAR, ou no BIO.
2.2.4.1. Protocolo CBMA/IMAR
- Amostragem de tecido:
A amostragem de tecidos que serviram como base para a extração foi feita, tendo sempre
em conta o uso de material esterilizado de modo a evitar contaminações, principalmente ao nível
de tecidos de outros espécimes, que mais tarde poderão originar erros graves. Também é de
grande importância a correta etiquetagem de modo a evitar trocas nas identificações.
Para cada espécime, foram usados dois microtubos de 1,5 ml respetivamente
identificados, um com um pequeno pedaço de tecido para extração e outro com o restante corpo
da poliqueta para arquivar na coleção de museu. Para os organismos cujas dimensões eram
demasiado pequenas foi usado o espécime inteiro para a extração. Houve também casos em
que não foi possivel preservar os espécimes para a coleção de museu, pois os mesmos foram
utilizados num estudo externo a esta tese envolvendo pirosequenciação. De seguida, esterilizouse a pinça e bisturi através da imersão em álcool e conseguinte flamejamento no Bico de
Bunsen usando uma caixa de petri para colocar a amostra. Sempre que possível, cortou-se um
pedaço de tecido para extração sendo posteriormente cortado em pedacinhos ainda mais
pequenos de modo a facilitar a digestão dos tecidos durante o processo de extração.
- Extração de DNA:
Para a extração de DNA, foram testados vários protocolos diferentes entre eles o kit
E.Z.N.A Moluscos (Omega Bio-tek), Chelex (Dry Release) e NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel).
O protocolo que apresentou melhores resultados foi o E.Z.N.A. com digestão dos tecidos pelo
método overnight, sendo portanto, esse o escolhido para a maioria das extrações efectuadas.
39
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
- Amplificação dos DNA barcodes por meio de PCR:
As amplificações foram feitas em reações com um volume total de 25 μl, contendo cada
reação 2,5 μl de 10x Buffer, 2,5 μl de MgCl2 (25mM), 0,5 μl de dNTPs (10mM), 1,5 μl de cada
primer (10mM), 0,2 μl de Taq polymerase (Thermo Scientific) e 2 a 8 μl de extrato de DNA,
perfazendo com água ultra pura. Os primers LoboF1 (5’-KBTCHACAAAYCAYAARGAYATHGG-3’) e
LoboR1 (5’-TAAACYTCWGGRTGWCCRAARAAYCA-3’) foram os principais primers utilizados neste
estudo para amplificar o segmento de 658 bp do gene COI. Alternativamente, foram também
utilizados outros conjuntos de primers (tabela 2.1). O ciclo térmico do PCR para os primers
Lobo consistiu em 1 ciclo de 1 minuto a 94 ºC; 5 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 1,5 minutos a
45 ºC e 1 minuto a 72 ºC; 45 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 1,5 min a 51 ºC e 1 min a 72 ºC
e um ciclo final de 5 minutos a 72 ºC. O ciclo térmico para os primers COI-2 encontra-se na
figura 2.3.
O sucesso da amplificação foi verificado por electroforese dos produtos de PCR a 90 V
por 30 minutos em gel de agarose a 1%, corado com GelRed (Biotium).
Tabela 2.1.Primers usados para amplificação dos segmentos de COI-5P a partir de extractos de DNA de poliquetas.
Primers
Sequências
LOBOF1
5’-KBTCHACAAAYCAYAARGAYATHGG-3’
LOBOR1
5’- TAAACYTCWGGRTGWCCRAARAAYCA-3’
COI-2 F1
(C_VF1LFt1)
COI-2 R1
(C_VR1LRt1)
40
LepF1_t1
5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’
VF1_t1
5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCACAAAGACATTGG-3’
VF1d_t1
5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCACAARGAYATYGG-3’
VF1i_t1
5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCAIAAIGAIATIGG-3’
LepRI_t1
5’-CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’
VR1d_t1
5’-CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA-3’
VR1_t1
5’-CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’
VR1i_t1
5’-CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGICCIAAIAAICA-3’
Referência
Lobo et al.,
2013
Ivanova et al.,
2007
Capítulo 2
Ciclo PCR COI-2
Figura 2.3. Ciclo de PCR correspondente aos respetivos primers utilizados (COI-2).
- Purificação dos produtos de PCR e sequenciação
Os produtos de PCR que apresentaram bandas claras e definidas foram submetidos a
purificação pelo método de precipitação tripla com isopropanol e enviados para sequenciação
bidireccional num fornecedor externo de serviços de sequenciação (STABVida ou Macrogen).
2.2.4.2. Protocolo BIO
O DNA foi extraído de cada espécime utilizando o protocolo de extração automatizada com
recurso a fibra de vidro (Ivanova et al., 2006). A região DNA barcode correspondente a um
segmento de 658 bp do gene COI foi subsequentemente amplificada sob as seguintes condições
térmicas: 1 ciclo de 1 minuto a 94 ºC; 5 ciclos de 40 segundos a 94 ºC, 40 segundos a 45 ºC e
1 minuto a 72 ºC, seguido de 35 ciclos de 40 segundos a 94 ºC, 40 segundos a 51 ºC, e 1
minuto a 72 ºC com uma extensão final de 5 minutos a 72 ºC. As amplificações foram feitas em
reações de 12,5 μl contendo 6,25 μl 10% trehalose, 2 μl água ultrapura, 1,25 μl Buffer 10x,
0,0625 μl MgCL2 (50 mM), 0,125 μl de cada primer (10 mM, usando os primers poliLCO e
poliHCO de Carr et al. (2011)), 0,0625 μl dNTPs (10 mM), 0,06 μl de Platinum Taq polymerase,
e 2 μl de extrato de DNA (10–50 ng).
Os produtos de PCR foram visualizados num gel de agarose a 1,2% E-Gel® (Invitrogen) e
sujeitos a uma sequenciação bidirecional usando os primers poliLCO e poliHCO e o kit de
41
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
sequenciação BigDye® Terminator v.3.1 Cycle (Applied Biosystems, Inc.) num sequenciador
capilar ABI 3730 seguindo as instruções do fabricante.
Os dados das sequências (amostras e dados da colheita, sequências, imagens dos
espécimes, e cromatogramas) foram submetidas à base dados Barcode of Life Data Systems
(BOLD, http://www.barcodinglife.org; Ratnasingham & Hebert, 2007).
2.2.5. Análise dos dados
2.2.5.1. Edição e alinhamento de sequências
Os cromatogramas, foram editados individualmente com recurso ao software MEGA5
(Tamura et al., 2007), e as respetivas sequências alinhadas usando o método ClustalW
(Thompson et al., 1994) implementado no mesmo software. As sequências nucleotídicas foram
traduzidas e o alinhamento cuidadosamente examinado para detetar a ocorrência de eventuais
inserções, deleções ou codões stop. Uma pesquisa de sequências homólogas na base de dados
GenBank foi também realizada, para tentar encontrar sequências da mesma família ou género
que possam ser adicionadas ao alinhamento como meio de comparação e obtenção de
resultados mais fiáveis (tabela T3 em anexo).
2.2.5.2. Distâncias genéticas e construção de árvores filogenéticas
Os padrões de variabilidade intra e inter-específica congenérica dos DNA barcodes do
conjunto das sequências compiladas, foram determinados pelo cálculo das distâncias genéticas
entre pares de sequências usando o modelo de substituição nucleotídica K2P (Kimura two-
parameter). Escolhemos este modelo por ser o mais vulgarmente utilizado em estudos de DNA
barcodes e consequentemente permitir comparação direta entre estudos. Esta análise foi
complementada com o cálculo do quociente entre as divergências inter e intraespecífica, sendo
denominado por taxonomic resolution ratio (TRR).
No intuito de rever e clarificar possíveis ambiguidades taxonómicas (etapas do esquema
da figura 2.4), bem como de detetar potenciais espécies não-descritas de poliquetas, foi feita
42
Capítulo 2
uma confrontação das identificações com base na morfologia com as unidades taxonómicas
moleculares operacionais (MOTUs) obtidas. Para este efeito, foram construídas árvores
filogenéticas pelo método Neighbour-joining (NJ; Saitou & Nei, 1987) usando o modelo de
substituição nucleotídica K2P (Kimura two-parameter). Foram igualmente produzidas árvores NJ
a partir de sequências traduzidas (aminoácidos), usando o modelo de substituição amino-acídica
de Jones-Taylor-Thornton (JTT). O grau de suporte dos nós das árvores foi determinado pelo
método bootstrap, tendo-se efectuado 1000 réplicas de bootstrap para ambas as árvores. Com
base no conjunto extenso de DNA barcodes de poliquetas analisados por Carr et al. (2011),
classificámos como uma unidade taxonómica molecular operacional (MOTUs) todos os grupos
monofiléticos da árvore NJ compreendendo sequências com distâncias nucleotídicas não
superiores a 3%. Um método operacional necessário de modo a evitar a subestimação da
habilidade de descriminação de espécies por parte do COI tendo em conta não só fenómenos de
hibridização introgressiva, mas também a possibilidade de ocorrência de espécies crípticas e de
especiação recente de espécies. Para além disso, esta medida permite assinalar casos
específicos para discussão e futuros estudos mais aprofundados
Hipótese de partida:
Espécies conhecidas
DNA Barcode
Clarificação de ambiguidades
Revisão da
correspondência ou da
identidade das espécies
Atribuições
taxonómicas e Sistema
de classificação dos
DNA barcodes
Árvores NJ e cálculo das
distâncias
intraespecíficas e
congenéricas
Sistema BIN
Figura 2.4. Esquema da metodologia global de verificação taxonómica implementada no âmbito da criação de bibliotecas de
referência de DNA barcodes (segundo Costa & Carvalho, 2007). A etapa evidenciada a cor laranja não foi efetuada neste estudo
43
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
2.2.5.3. Comparação das identificações originais com a alocação das
espécies através do sistema BIN (Barcode Index Number)
Foi recentemente implementado um algoritmo na base de dados BOLD que agrupa todas
as sequências aí depositadas em “cestos” (BINs; Ratnasingham & Hebert, 2013), com base nas
distâncias nucleótidicas. Estes BINs correspondem na prática a unidades taxonómicas
operacionais, numa abordagem semelhante a outras já existentes como por exemplo as que
estabelecem MOTUs (Molecular operational taxonomic units, Blaxter et al., 2005). Petende-se
que os BINs agrupem as sequências de tal forma que espécimes cujas sequências pertençam
ao mesmo BIN, possuem uma grande probabilidade de serem da mesma espécie
(Ratnasingham e Hebert, 2013).
O sistema BIN proporciona assim a possibilidade de confrontar a divisão das unidades
taxonómicas putativas derivadas das análises moleculares com as identificaçãoes taxonómicas
originais baseadas na morfologia. Deste modo utilizámos a ferramenta de análise dos BINs
disponibilizada na base de dados BOLD para identificar congruências e ingongruências entre os
BINs existentes nos nossos dados. Na análise da composição dos BINs tomámos em
consideração a possivel existência de sinónimos através da consulta da base de dados da
WoRMS (http://www.marinespecies.org/).
2.2.5.4. Sistema de classificação dos DNA barcodes das bibliotecas de
referência
Usando a pesquisa de sequências homólogas de COI-5P em bases de dados públicas
(GenBank) previamente efetuada e tendo em conta também os resultados obtidos pelo sistema
BIN, foi atribuída uma cotação com 5 graus de fiabilidade taxonómica a cada associação espécie
/DNA barcode da biblioteca de referência, conforme proposto em Costa et al (2012). Este
sistema de classificação funciona como uma ferramenta de verificação final da congruência
taxonómica das bibliotecas de referência, nomeadamente assegurando a validade da associação
entre o nome da espécie e o conjunto de DNA barcodes que a diagnosticam.
Ao implementarmos este método aos nossos dados apenas alterámos a divergência
patrística máxima (divergência entre 2 sequências medida directamente numa árvore
filogenética) para 3%, de acordo com os padrões de variabilidade intraespecífica de COI-5P
44
Capítulo 2
conhecidos em poliquetas (Carr et al., 2011). Os 5 graus de fiabilidade taxonómica
correspondem a:
Nível A - Concordância externa: sequência agrupa com DNA barcodes da mesma espécie
disponíveis em bases de dados públicas (obtidos por outros investigadores em projectos
autónomos), formando um clado monofilético com divergência patrística máxima de 3%;
Nível B - Concordância interna: sequência com correspondência interna apenas na nossa
biblioteca (pelo menos 3 sequências), formando um clado monofilético com divergência
patrística máxima de 3%;
Nível C - Concordância sub-óptima: apesar de formarem um grupo monofilético,
apresentam divergência intraespecífica >3% (dentro da nossa biblioteca ou
comparativamente a sequências públicas);
Nível D - Dados insuficientes: baixo número de espécimes analisados (1 ou 2);
Nível E - DNA barcodes discordantes: DNA barcodes da espécie sob escrutínio agrupam
no mesmo clado com sequências de outras espécies disponíveis em bases de dados
públicas (e.g. erro de morfo-identificação ou parafília).
45
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
2.3. Resultados
2.3.1. Biblioteca de referência de DNA barcodes de poliquetas de estuário
No âmbito deste estudo e dos projetos LusoMarBol e BEstBarcode foram recolhidos e
analisados 482 espécimes de poliquetas provenientes de pelo menos 6 estuários diferentes em
Portugal sendo identificadas mais de 70 espécies (Anexo/tabela T2). Desta coleção, foram
obtidos 71 DNA barcodes distribuídos por vários projectos na BOLD (tabela 2.2). A esta
compilação foram adicionadas 229 sequências COI-5P de poliquetas obtidas a partir do
GenBank.
Das 26 sequências geradas no âmbito exclusivo desta tese, 23 possuem 658 pb sendo
que as restantes 3 variam entre os 547 e 634 pb. Não foram encontrados quaisquer codões
STOP, nem inserções ou deleções após o alinhamento. Estas sequências correspondem a 6
ordens, 8 famílias e 16 espécies das quais 1 identificada apenas até à familia. Em termos
globais (sequências não publicadas + GenBank), e como demonstrado na figura 2.5, este estudo
fez recurso a DNA barcodes pertencentes a 7 ordens, 18 famílias e 87 espécies. O conjunto das
71 sequências da BOLD aqui analisadas, constituem um contributo inicial de 31 espécies (sendo
que 4 identificadas apenas até ao género e 5 até á familia), para a construção de uma biblioteca
de referências de DNA barcodes de poliquetas estuarinas reportadas na fauna marinha
portuguesa.
Tabela 2.2. Sequências de DNA barcodes de poliquetas analisadas neste estudo. Espécie, local de colheita,
número de sequências e projecto BOLD ou referência associada.
Projecto BOLD
Polychaeta of Alentejo [PCALE]
Polychaeta of University of Minho
[SFPOM]
Enhanced primers for amplification
of DNA barcodes from a broad
range of marine metazoans [LOBO]
Polychaeta of Portugal [MPCPT]
46
Nº. De
sequências
9
2
3
14
17
2
Local
Estuário do Sado
Estuário do Mira
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
Estuário do Lima
Estuário do Lima
10
Estuário do Sado
4
3
7
Estuário do Sado
Estuário do Minho
Estuário do Lima
Referência
Dados não
publicados
LusoMarBoL /
BEstBarcode
Lobo et al., 2013;
Este estudo
Este estudo
Capítulo 2
Glyceridae
(Phillodocida)
Nephtyidae
(Phillodocida)
Polynoidae
(Phillodocida)
Sigalionidae
(Phillodocida)
Phyllodocidae
(Phillodocida)
Syllidae
(Phillodocida)
Nereididae
(Phillodocida)
Glycera nana
Glycera capitata
Glycera trydactila
Glycera sp.
Glycera alba
Nephtys cirrosa
Nephtys longosetosa
Nephtys sp.
Nephtys hystricis
Nephtys hombergii
Micronephthys minuta
Bipalponephtys neotena
Harmathoe impar
Harmathoe imbricata
Harmathoe glabra
Lepidonotus clava
Lepidonotus squamatus
Polynoidae
Sthenelais boa
Phyllodoce maculata
Phyllodocidae
Eumida elektra
Eumida alkyone
Trypanosyllis zebra
Syllis sp.
Syllis elongata
Perinereis vallata
Perinereis cultrifera
Perinereis longidonta
Perinereis sp.
Perinereis brevicirris
Nereis Zonata
Nereididae
Perinereis falklandica
Pseudonereis variegata
Platynereis sp.
Platynereis nadiae
Perinereis gualpensis
Hediste atoka
Hediste diversicolor
0
5
10
BOLD
15
20
25
30
GenBank
Figura 2.5. Número de sequências COI (BOLD + GenBank) distribuídas pelas diferentes espécies (com referência
á família e ordem taxonómicas) abordadas neste trabalho.
47
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
Spionidae
(Spionida)
Arenicolidae
(Capitellida)
Maldanidae
(Capitellida)
Orbinidae
(Orbiniida)
Oweniidae
(Sabellida)
Sabellaridae
(Sabellida)
Terebellida
(Terebellidae)
Cirratulidae
(Terebbellida)
Ampheratidae
(Terebellida)
Onuphidae
(Eunicida)
Eunicidae
(Eunicida)
Spio sp.
Scolelepis squamata
Scolelepis sp.
Spionidae
Scolelepis foliosa
Arenicola marina
Axiothella rubrocinta
Euclymene santandarensis
Euclymene robusta
Axiothella constricta
Maldanidae
Praxillella affinis pacifica
Euclymene zonalis
Praxillella praetermissa
Orbinidae
Naineris quadricuspida
Scoloplos acutus
Scoloplos armiger
Owenia fusiformis
Galathowenia oculata
Phragmatopoma californica
Phragmatopoma caudata
Sabellaria alveolata
Terebellidae
Polycirrus medusa
Pista maculata
Polycirrus sp.
Cirratulus cirratus
Cirriformia tentaculata
Ampharete labrops
Asabellides sp.
Ampharete sp.
Ampharetidae
Alkmaria romijni
Onuphys elegans
Diopatra marocensis
Diopatra neapolitana
Diopatra cuprea
Marphysa californica
Marphysa brevitentaculata
Marphysa viridis
Marphysa sp.
Marphysa sanguinea
Lysidice collaris
Palola viridis
0
2
BOLD
4
6
8
10
GenBank
Figura 2.5. Número de sequências COI (BOLD + GenBank) distribuídas pelas diferentes espécies (com referência á
família e ordem taxonómicas) abordadas neste trabalho (continuação).
48
Capítulo 2
2.3.2. Divergências nucleotídicas intra e interespecíficas congenéricas
As distâncias médias globais intra e interespecíficas (K2P), considerando todas as
espécies e géneros de poliquetas em estudo, encontram-se na tabela 2.3. O valor médio da
divergência intraespecífica (dentro da espécie) foi de 3,15% (variação entre 0 – 33,27%),
enquanto que a divergência média interespecífica congenérica atingiu o valor de 21% (variação
entre 8,21–30,26%). Após a remoção das espécies que apresentavam ambiguidades
taxonómicas de acordo com os nossos critérios de análise (ver 2.2.5 dos Métodos), as
divergências médias intra e interespecífica diminuem para 0,60% (variação entre 0 – 2,82%) e
20,53% (variação entre 12,03 – 27,58%) respetivamente. Neste último cenário é possível
observar a “barcoding gap” (Bucklin et al, 2010) que se concretiza pelo padrão geral de valores
comparativamente baixos da divergência intraespecífica, e pelo facto da distância mínima
congenérica ser superior à divergência intraespecifica máxima.
Como também é demonstrado na tabela 2.3, foi excluído um número significativo de
sequências desta análise pois tratavam-se de espécies representadas apenas por um espécime,
ou apenas identificadas ao nível da família ou género, não tendo sido nestes casos encontradas
sequências homólogas no GenBank para servirem de termo de comparação.
Tabela 2.3. Divergências médias, mínimas e máximas globais dos géneros de poliquetas abordados neste estudo,
calculadas pelo modelo K2P. A métrica TRR consiste no quociente entre as divergências médias inter e
intraespecíficas.
Distância
intraespecífica*
Distância
interespecífica
congenérica*
Sequências
(BOLD +
GenBank)
Taxa
Distância
mínima (%)
Distância
média (%)
Distância
máxima (%)
254 (49+ 205)
57
0
2,85
33,27
178 (35 + 143)
47
0
0,60
2,82
210 (48 + 162)
19
8,21
20,8
30,26
99 (22 + 77)
11
12,03
20,53
27,58
TRR
7,29
34,21
*Encontra-se também, realçado a negrito, o mesmo calculo das distâncias nucleotídicas mas sem as ambiguidades
taxonómicas encontradas na árvore filogenética.
Na tabela 2.4, estão detalhadas as distâncias intra e interespecíficas em alguns dos
géneros mais bem representados nos nossos dados. Os géneros Nepthys, Diopatra, Perinereis e
49
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
Scolelepis não aparentam ter quaisquer incongruências taxonómicas. Pelo contrário, os géneros
Hediste, Praxilella, Glycera e Euclymene demonstram taxas de divergência intra e
interespecíficas mal delimitadas e sobrepostas. Tal facto, torna-se ainda mais evidente na figura
2.7 pela ausência da “barcoding gap” no género Hediste, quando comparada ao género Nephtys
na figura 2.6 onde é visível essa caraterística.
Tabela 2.4. Divergências médias, mínimas e máximas intra e interespecíficas de géneros representativos da
biblioteca COI em estudo, calculadas segundo o modelo K2P.
Género
Nephtys
Género
Diopatra
Género
Perinereis1
Género
Scolelepis
Género
Hediste
Género
Praxillella
Genero
Glycera
Género
Euclymene
Taxa
Distância
mínima
(%)
Distância
média (%)
Distância
máxima
(%)
9
2
0,17
0,72
1,95
Interespecífica
13
5
18,65
21,6
24,69
Intraespecífica
13
3
0
0,17
0,38
Interespecífica
13
3
20,48
21,6
22,49
Intraespecífica
27
6
0
0,20
1,22
Interespecífica
27
6
18,56
23,1
27,86
Intraespecífica
6
2
0
0,54
2,52
Interespecífica
7
3
22,47
24,7
27,58
Intraespecífica
54
2
0
6,6
15,27
Interespecífica
54
2
11,62
14,71
17,80
Intraespecífica
7
2
0,31
7,96
28,28
Interespecífica
7
2
22,74
23,7
28,28
Intraespecífica
11
3
0
10,1
26,71
Interespecífica
15
5
8,21
22,3
30,26
Intraespecífica
8
3
0
6,64
17,73
Interespecífica
8
3
19,39
23,4
26,56
Tipo de
divergência
Sequências
usadas
Intraespecífica
1 – Exclusão da espécie Perinereis falklandica no cálculo das divergências nucleotídicas
50
Freq. Relativa
Capítulo 2
Nephtys
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Divergência nucleotídica (%)
Freq. Relativa
Figura 2.6. Divergências nucleotídicas intra (a amarelo) e interespecíficas (a vermelho) no género Nepthys.
Resultados demonstraram uma baixa divergência dentro das espécies e uma alta divergência dentro do género
resultando na formação da “barcoding gap”, bastante comum na maior parte dos grupos, quando há sucesso na
descriminação de espécies através do marcador molecular COI (Bucklin et al, 2010).
Hediste
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Divergência nucleotídica (%)
Figura 2.7. Divergências nucleotídicas intra (a amarelo) e interespecíficas (a vermelho) no género Hediste.
Resultados demonstraram taxas de divergência intra e interespecíficas mal delimitadas e sobrepostas resultando na
ausência da “barcoding gap”.
51
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
2.3.3. Árvore filogenética nucleotídica de DNA barcodes
Através da análise da árvore NJ nucleotídica (figura F1 em anexo, com os respetivos
MOTUs) e respetiva versão compactada na figura 2.8 é possível observar que no total das 87
espécies abordadas, 20 estão representadas por uma única sequência de COI, impossibilitando
a análise da divergência intraespecífica e congruência taxonómica nesses casos. Entre as 67
espécies restantes, 79% agruparam em clados monofiléticos com baixa divergência (MOTUs com
<3% de divergência intraespecífica) correspondentes às respetivas morfo-espécies e famílias,
sendo as relações evolutivas entre os mesmos congruentes. As excepções a este padrão, foram
o caso dos clados correspondentes a Perinereis falklandica e Pseudonereis variegata, Harmathoe
imbricata, Praxilella praetermissa e Euclymene robusta (figura 2.9), Syllis elongata, Alkmaria
romijni, Glycera alba e Glycera trydactila (figura 2.12), Marphysa sanguinea, Cirratulus cirratus,
Hediste diversicolor (figura 2.10), Hediste atoka e a única espécie a representar a família
Sigalionidae (MOTU 32: Sthenelais boa) que agrupou no mesmo clado que a família Polynoidae.
Pela análise da árvore NJ de nucleótidos, e considerando apenas os contributos originais
desta tese, composto por 71 DNA barcodes/31 espécies, observaram-se 8 espécies
representadas por uma única sequência (ver tabela 2.5). Entre as restantes 23 espécies, 70%
agruparam em clados monofiléticos de baixa divergência, e 30% apresentaram ambiguidades
taxonómicas.
As figuras 2.9 a 2.13 correspondem a seções da árvore NJ, que merecem particular
destaque na discussão dos resultados, onde se realçam algumas das incongruências e
pormenores mais relevantes.
52
Capítulo 2
100
Hediste diversicolor
99
Hediste atoka
24
99
100
Platynereis sp.
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705198.1| CHILE
39
17
BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705185.1| CHILE
100
MOTU 16
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705197.1| CHILE
63
Nereididae
57 BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705184.1| CHILE
16
Perinereis gualpensis
100
100
100
15
18
Platynereis nadiae
Perinereis longidonta
83
Perinereis sp.
100
100
Perinereis vallata
65
100
Perinereis brevicirris
38
60
Perinereis sp.
23
100
Nereis sp.
100
99
Glycera sp.
BLAST Glycera alba - GenBank: JN852946.1| SWEDEN
98
Glyceridae
100
Glycera nana
97
100
Glycera capitata
100
Harmathoe imbricata
100
55
37
8
BLAST Harmothoe glabra - GenBank: JN852929.1| SWEDEN
SFP4 - 001|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
87
100
LMBSAP29-001|Polynoidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 30
BLAST Harmothoe impar - GenBank: JN852930.1| SWEDEN
53 32
Polynoidae
SFP4 - 002|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 31
BLAST Lepidonotus clava - GenBank: JN852934.1| SWEDEN
100
100
70
Lepidonotus squamatus
100
100
18
Sthenelais boa (Sigalionidae)
Phragmatopoma caudata
85
80
Phragmatopoma californica
Sabellaridae
100
Sabellaria alveolata
100
LPCSED3|Scolelepis foliosa| PORTUGAL (Estuario do Lima)
43
100
Spionidae
47
6
76
80
BLAST Spionidae - GenBank: HM375492.1| CANADA
Scolelepis sp.
100
100
97
Spionidae
Scolelepis squamata
BLAST Spionidae - GenBank: HM375486.1| CANADA
60
100
Spio sp.
100
100
Polycirrus sp.
70
BLAST Terebellidae - GenBank: HM417788.1| RUSSIA
80
Terebellidae
55
Polycirrus medusa
100
Pista maculata
100
38
SFP1 - 001|Alkmaria romijni| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 44 (Ampharetidae)
100
SFP22 - 003|Ampharetidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
100
100
8
63
52
Eumida alkyone
Eumida elektra
100
Phyllodocidae
Phyllodoce maculata
100
Phyllodocidae
100
100
Ampharetidae
48
96
Ampharetede
sp.COI
- GenBank:
HQ023432.1|
Figura 2.8. Árvore NJ compactada66criada a partir deBLAST
sequências
de poliquetas
deCANADA
estuários de Portugal
97
83
AmphareteFoi
sp. utilizado o modelo de evolução K2P e
Ampharetidae
em conjunto com sequências publicadas
no GenBank.
o teste de
100
100
Ampharete
labrops a localização das diferentes famílias.
Bootstrap com 1000 replicações.
As chavetas laterais
mostram
100
Asabellides sp.
100
93
100
94
10
Galotwenia oculata
Owenia fusiformis
100
100
Owenidae
53
100
Micronephtys minuta
Bipalponephtys neotena
100
63
BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
Nephtyidae
Terebellidae
80
55
Polycirrus medusa
100
Pista maculata
100
38
SFP1 - 001|Alkmaria romijni| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
100 poliquetas
SFP22 - 003|Ampharetidae
| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Biblioteca de referência de DNA barcodes para
de estuários portugueses
100
100
8
63
52
MOTU 44 (Ampharetidae)
Eumida alkyone
Eumida elektra
100
Phyllodocidae
Phyllodoce maculata
100
Phyllodocidae
100
100
Ampharetidae
48
96
66
97
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023432.1| CANADA
83
Ampharete sp.
Ampharetidae
100
100
Ampharete labrops
100
Asabellides sp.
100
93
100
94
Galotwenia oculata
Owenidae
Owenia fusiformis
10
100
100
Micronephtys minuta
100
Bipalponephtys neotena
100
BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
63
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
57
43
Nephtyidae
BLAST Nephtys sp. - GenBank: HQ024111.1| CANADA
100
24
25
Nephtys longosetosa
Nephtys hombergii
100
100
Arenicola marina (Arenicolidae)
100
Euclymene santanderensis
28
RR91|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
24
34
40
RR127|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
34
7
RR74|Leiochone leiopygos| PORTUGAL (Estuario do Sado)
Axyothela rubrocincta
100
RR70|Praxillella praetermissa| PORTUGAL (Estuario do Sado)
78
100
80
52
8
Praxillella affinis pacifica
Maldanidae
BLAST Maldanidae - GenBank: HM473461.1| CANADA
BLAST Maldanidae - GenBank: EU835661.1| AUSTRALIA
BLAST Maldanidae - GenBank: HQ023889.1| CANADA
16
RR89|Axyothela constricta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
9
100
Praxillella praetermissa
26
100
100
60
Euclymene zonalis
100
Diopatra cuprea
BLAST Onuphis elegans - GenBank: GQ497525.1| USA
100
26
75
Onuphidae
Diopatra marocensis
Diopatra neopolitana
100
100
Marphysa sp.
86
Marphysa sanguinea
28
100
BLAST Marphysa viridis - GenBank: GQ497553.1| USA
100
44
BLAST Marphysa brevitentaculata - GenBank: GQ497548.1| USA
47
Eunicidae
BLAST Marphysa californica - GenBank: GQ497552.1| USA
100
39
Lysidice collaris
Pallola viridis
100
100
58
99
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM473343.1| CANADA
100
9
Cirratulus cirratus
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM417794.1| RUSSIA
100
Cirratulidae
Cirratulus cirratus
100
Cirriformia tentaculata
100
100
99
Scoloplos armiger
100
16
Scoloplos acutus
Orbinidae
100
46
Naineris quadriscupida
100
RR97|Orbinidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903793.1| SPAIN
99
26
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903790.1| SPAIN
100
95
99
Syllis sp.
Syllis sp.
Syllidae
100
SS18|Trypanosyllis zebra| PORTUGAL (Estuario do Sado)
100
75
Syllis elongata
100
OUTGROUP (Oligochaeta)
100
0.05
Figura 2.8. Árvore NJ compactada criada a partir de sequências de COI de poliquetas de estuários de Portugal
em conjunto com sequências publicadas no GenBank. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de
Bootstrap com 1000 replicações. As chavetas laterais mostram a localização das diferentes famílias (continuação).
54
Capítulo 2
Tabela 2.5 Espécies de poliquetas cujas sequências COI foram geradas no âmbito dos projetos de investigação
associados a esta tese (LusoMarBoL e BestBarcode), e que a) agruparam em clados monofiléticos com menos de
3% de divergência nucleótidica, b) que evidenciaram incongruências taxonómicas ou c) representadas apenas por
uma sequência.
Espécime
LMBSAP29-001
SFP4-001
SFP4-002
SFP6-002
SFP18-001
SFP18-002
SFP18-003
SFP18-004
SFP16-001
LMBP18-2
SFP20-002
SFP20-003
SFP20-1
SFP20-2
SFP24-001
SFP24-005
SFP24-002
SFP24-003
SFP26-001
SFP26-002
SFP26-003
RR074
LPCSED3
RR097
SFP27-001
LMBLP16-001
LMBSAP16-002
LMBSAP16-003
LMBSAP16-004
SFP13-001
LMBLP4-001
LMBLP4-002
SFP21-2
LMBSAP24-001
LMBSAP24-002
SS1
SS2
SFP5–001
SFP5–002
SFP5-003
RR101
RR111
LMBLP7-001
LMBSST13-001
RR089
RR078
RR090
RR116
Espécie
correspondente
Polynoidae (espécie 1)
Polynoidae (espécie 2)
Polynoidae (espécie 3)
Diopatra neapolitana
Perinereis sp.
MOTUs
(<3%)
x
Incongruências
taxonómicas
Sequência
única
x
x
x
x
Perinereis cultrifera
Platynereis nadiae
x
Syllis sp. (espécie 1)
x
Syllis sp. (espécie 2)
x
Owenia fusiformis
x
Leiochone leiopygos
Scolelepis foliosa
x
x
x
Orbiniidae
Nephtys hombergii
x
Nepthys sp.
Sabellaria alveolata
x
Nereididae
x
Nereis zonata
Glycera sp. (espécie 1)
x
Glycera sp. (espécie 2)
x
Glycera alba
Glycera tridactyla
Phyllodocidae
x
x
Axiothella constricta
Euclymene
santandarensis
x
x
55
100
58 BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023458.1| CANADA
93
99 BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672574.1| RUSSIA
100
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672611.1| RUSSIA
MOTU 53
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672578.1| RUSSIA
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
SFP26 - 001|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
94
SFP26 - 003|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
SFP26
fusiformis| PORTUGAL
(Ria de
Aveiro)
Tabela 2.5 Espécies de poliquetas cujas sequências
COI- 002|Owenia
foram geradas
no âmbito
dos
projectos de investigação
39
Owenidae
BLAST
Owenia
fusiformis - GenBank:
DQ319473.1|
FRANCE
associados a esta tese (LusoMarBoL e BestBarcode),
e
que
a)
agruparam
em
clados
monofiléticos
com menos de
53
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319471.1| FRANCE
MOTU 54
3% de divergência nucleótidica, b) que evidenciaram
71 incongruências taxonómicas ou c) representadas apenas por
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319469.1| FRANCE
uma sequência (continuação).
30
100
Espécie
correspondente
Espécime
LMBP23-1
11
LMBP23-2
LPTSED16,
MSSED 5
MSSED7
64
MESED4
L1SED3957
42
SFP6-001
SFP7-001
22
SFP7-003
SFP1-001
25
SFP22-003
RR091
RR127
RR070
SFP28-001
LMBSAP23-001
LMBSAP27-001
SS18
21
19
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319459.1| FRANCE
MOTUs
(<3%)
Incongruências
taxonómicas
Sequência
única
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319457.1| FRANCE
35 BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319458.1| FRANCE
42 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672399.1| RUSSIA
Cirriformia tentaculata
x
100 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672310.1| CANADA
MOTU 55
BLAST Micronephthys minuta - GenBank: HQ024378.1| CANADA
100
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672455.1| RUSSIA
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672457.1| RUSSIA
100
MOTU 56
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672458.1| RUSSIA
40
BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
Hediste diversicolor
x
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
BLAST Nephtys sp. - GenBank: HQ024111.1| CANADA
47 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023586.1| CANADA
Nephtyidae
100 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: GU672313.1| CANADA
MOTU 57
BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023590.1| CANADA
- 001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Alkmaria
90 SFP27romijni
x
56 BLAST Nephtys hombergii - GenBank: GU179410.1| PORTUGAL
Ampharetidae
SFP13 - 001|Nephtys sp.| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Euclymene
robusta hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
x
LMBSAP16-004|Nephtys
100
MOTU 58
LMBSAP16-001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
PraxillellaLMBSAP16-002|Nephtys
praetermissa hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
x
52
Sthenelais
boa
x
49 LMBSAP16-003|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
Marphysa
sanguinea
x
BLAST
Arenicola
marina
GenBank:
JQ950326.1|
FRANCE
63
54Marphysa
BLAST Arenicola
sp.marina - GenBank: JQ950327.1| FRANCE
67 BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487320.1| NETHERLANDS
Trypanosyllis
zebra
60
97
x
x
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487319.1| NETHERLANDS
MOTU 59 (Arenicolidae)
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487321.1| NETHERLANDS
100
BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023443.1| CANADA
100 BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023449.1| CANADA
81 BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023442.1| CANADA
43 RR78|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
5
100
RR116b|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 60
RR90|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
28
39
RR91|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
22
35
RR127|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
32
RR74|Leiochone leiopygos| PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Axiothella rubrocincta - GenBank: HM473325.1| CANADA
MOTU 61
100 BLAST Axiothella rubrocincta - GenBank: HM473326.1| CANADA
RR70|Praxillella praetermissa| PORTUGAL (Estuario do Sado)
78
90 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
100
5
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
MOTU 62
Maldanidae
79
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473649.1| CANADA
52
BLAST Maldanidae - GenBank: HM473461.1| CANADA
BLAST Maldanidae - GenBank: EU835661.1| AUSTRALIA
BLAST Maldanidae - GenBank: HQ023889.1| CANADA
16
RR89|Axyothela constricta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
10
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672285.1| CANADA
99
100
25
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672610.1| CANADA
MOTU 63
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672356.1| CANADA
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: GU672589.1| RUSSIA
100
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024016.1| CANADA
100
85
MOTU 64
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024015.1| CANADA
82 BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428893.1| WESTERN EUROPE
Diopatra cuprea - COI
GenBank:
WESTERN
EUROPE de
Figura 2.9. Parte da árvore100NJBLAST
de sequências
de FJ428892.1|
poliquetas
provenientes
diversos
locais geográficos com
MOTU
65
BLAST
Diopatra cuprea
- GenBank:
detalhe na família63Maldanidae. Foi
utilizado
o modelo
deFJ428894.1|
evoluçãoWESTERN
K2P e EUROPE
o teste de Bootstrap com 1000 replicações.
BLAST Onuphis
- GenBank:famílias
GQ497525.1|
As linhas laterais mostram a localização
daselegans
diferentes
e USA
os MOTUs representam grupos monofiléticos com
Diopatra marocensis - GenBank: FJ646632.1| PORTUGAL
62 BLAST
<3% de divergência intraespecífica.
Realçado
a verde encontram-se as sequências desenvolvidas por este trabalho,
27
100 BLAST Diopatra marocensis - GenBank: GQ456165.1| PORTUGAL
MOTU 66
presentes na BOLD.
BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ428915.1| WESTERN EUROPE
Onuphidae
SFP6 - 002|Diopatra neopolitana| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
73
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428951.1| WESTERN EUROPE
100
56
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428834.1| WESTERM EUROPE
31
4
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428848.1| WESTERN EUROPE
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: GQ456164.1| PORTUGAL
6
40 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: JQ950321.1| PORTUGAL
25 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: EU878539.1| PORTUGAL
LMBSAP27-001|Marphysa sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 67
81 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603847.1| JAPAN
MOTU 12
100 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603852.1| JAPAN
54
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603849.1| JAPAN
80
96
Nereididae
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603869.1| JAPAN
Capítulo 2
MOTU 13
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603844.1| JAPAN
100 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603855.1| JAPAN
38
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603856.1| JAPAN
50 MSSED7|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
BLAST Hediste atoka
- GenBank: AB603867.1| JAPAN
MOTU 14
100 83 L1SED39|Hediste
diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 1
18
BLAST
Hediste atoka
- GenBank:
AB603864.1|
SFP6
- 001|Hediste
diversicolor|
PORTUGAL
(RiaJAPAN
de Aveiro)
99
20
BLAST
Hediste
diversicolor
A - GenBank:
FJ030976.1|
44 BLAST
Hediste
atoka - Genbank:
AB603859.1|
JAPANFINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030979.1| FINLAND
97
3
64 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473626.1| CANADA
55 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030977.1| FINLAND
MOTU 2
100 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473629.1| CANADA
MOTU 15
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030981.1| FINLAND MOTU 2
BLAST Platynereis
GenBank: HM473621.1|
BLAST Hediste
diversicolorsp.
A -- GenBank:
FJ030984.1|CANADA
FINLAND
9
8
41
BLAST Pseudonereis
variegata
- GenBank:
HQ705198.1|
CHILE
MESED4|Hediste
diversicolor|
PORTUGAL
(Estuario
do Minho)
7
BLAST
Hediste
diversicolor
A - GenBank:
BLAST
Perinereis
falklandica
- GenBank:FJ030975.1|
HQ705185.1|FINLAND
CHILE
100
MOTU 16
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030963.1| FINLAND
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705197.1| CHILE
63
MSSED5|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
MOTU 3
56 BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705184.1| CHILE
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030974.1| FINLAND
1515
14
15
39
BLAST
Perinereis
gualpensis
- GenBank:
HQ705186.1|
CHILE
BLAST
Hediste
diversicolor
A - GenBank:
FJ030972.1|
FINLAND
33
Nereididae
MOTU 4
BLAST
Hediste diversicolor AB - GenBank: FJ030994.1| FINLAND MOTU 17
100 BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705188.1| CHILE
BLAST
Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030968.1| FINLAND
99
54
99
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705187.1| CHILE
LPTSED16|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
33 SFP20-1|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 5
98 SFP7 - 003|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
46 SFP20 - 002|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
96 SFP7 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 18
100 SFP20-2|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Hediste
diversicolor B - GenBank: FJ030990.1| FINLAND
100
Hediste- 003|Platynereis
diversicolor B -nadiae|
GenBank:
FJ030986.1|
FINLAND
PORTUGAL
(Estuario
do Lima)
78 BLAST SFP20
99
98
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030987.1| FINLAND
MOTU 6
100 BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705191.1| CHILE
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030985.1| FINLAND MOTU 19
19
BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705190.1| CHILE
100
16
83
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030988.1| FINLAND
MOTU 7
LMBSCt12-003|Perinereis
PORTUGAL
(Estuario doFINLAND
Sado)
98 BLAST
Hediste diversicolor Bsp.|
- GenBank:
FJ030989.1|
60
BLAST SFP17
Hediste- diversicolor
- GenBank:
FJ030993.1|
FINLAND
003|PerinereisB sp.|
PORTUGAL
(Estuario do
Lima)
100
BLAST
Hediste
diversicolor
B
GenBank:
FJ030991.1|
FINLAND
100
SFP17 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
51 Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030992.1| FINLAND
80 BLAST
MOTU 20
MOTU 8
SFP17 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
86 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603887.1| JAPAN
99
73
Perinereis vallata - GenBank: HQ705192.1| CHILE
91 BLAST
BLAST
Hediste atoka - GenBank: AB603878.1| JAPAN
Figura 2.10. Parte da árvore
NJ99 de
sequências
COI- GenBank:
de poliquetas
provenientes
de diversos locais geográficos com
71 BLAST
BLAST
Perinereis
HQ705193.1|
CHILE
Hediste
atoka - vallata
GenBank:
AB603876.1|
JAPAN
detalhe na espécie Hediste diversicolor
(Nereididae).
Foi
utilizado
o
modelo
de
evolução
K2P e o teste de Bootstrap
41
BLASTBLAST
Hediste
atoka - GenBank:
AB603877.1|
JAPANCHILE
Perinereis
vallata - GenBank:
HQ705196.1|
100 laterais mostram a localização das diferentes famílias e os MOTUs representam
com 1000 replicações. As 89linhas
MOTU 21
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603874.1| JAPAN
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676180.1| INDIAMOTU 9
grupos monofiléticos com56 <3%
deHediste
divergência
intraespecífica.
Realçado a verde encontram-se as sequências
BLAST
atoka - GenBank:
AB603884.1| JAPAN
BLAST Perinereis
vallata
-que
GenBank:
JX676159.1|
INDIA
58
desenvolvidas por este trabalho,
enquanto
que
as
estão
sublinhadas
a azul, são as restantes sequências
BLAST
Hediste
atoka
GenBank:
AB603875.1|
JAPAN
100
94
BLAST
Perinereis
vallata
GenBank:
JX676143.1|
INDIA
desenvolvidas no âmbito dos projetos
LusoMarBoL
e BestBarcode,
presentes
na BOLD
BLAST Hediste
atoka - GenBank:
AB603883.1| JAPAN
67 37
BLAST
Perinereis
brevicirris
- GenBank:JAPAN
JX503025.1| SOUTH KOREA
BLAST Hediste
atoka
- GenBank:
AB603880.1|
100
BLAST 100
Hediste
atoka
- GenBank:
AB603885.1|
BLAST
Perinereis
brevicirris
- GenBank:JAPAN
JX503024.1| SOUTH KOREA
MOTU 10
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503026.1| SOUTH KOREA
87 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603862.1| JAPAN
60
99
26
MOTU 22
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603886.1| JAPAN
100
SFP18 - 003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
99
54
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603860.1| JAPAN
MOTU 11
SFP18
- 001|Perinereis
PORTUGAL
(Estuario do Lima)
BLAST Hediste
atoka
- GenBank: sp.|
AB603861.1|
JAPAN
100
BLAST Hediste
atoka- 001|Perinereis
- Genbank: AB603868.1|
JAPAN
SFP16
sp.| PORTUGAL
(Estuario do Lima)
46
atoka
- GenBank: sp.|
AB603853.1|
56 BLAST Hediste
SFP18
- 004|Perinereis
PORTUGALJAPAN
(Estuario do Lima)
56
81 BLAST Hediste
atoka - GenBank: AB603847.1| JAPAN
LMBP18-2|Perinereis cultrifera PORTUGAL (EstuarioMOTU
do Lima)
12
31
100 BLAST Hediste
atoka - GenBank: AB603852.1| JAPAN
MOTU 23
Nereididae
21 SFP18 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603849.1| JAPAN
23
MOTU 13
BLAST Hediste
atoka - GenBank:
AB603844.1|
JAPAN
SS2|Nereis
zonata| PORTUGAL
(Estuario
do Sado)
atoka - GenBank: AB603855.1| JAPAN
100 BLAST Hediste
100 LMBSAP24-002|Nereididae | PORTUGAL (Estuario
38
MOTU 24
do Sado)
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603856.1| JAPAN
94 LMBSAP24-001|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603867.1| JAPAN
MOTU 14
83
18
Nereididae
PORTUGAL
(Estuario
do Sado)
BLAST Hediste
atoka -zonata|
GenBank:
AB603869.1|
JAPAN
43 SS1|Nereis
80
96
PORTUGALJAPAN
(Estuario do Lima)
46 SFP5
BLAST Hediste
atoka- 003|Glycera
- GenBank:sp.|
AB603864.1|
99
Lima)
Figura 2.11. Parte da árvore NJ de sequências COI de poliquetasdoprovenientes
de diversos locais geográficos
MOTU 25
100
BLAST
Platynereis
sp.
GenBank:
HM473626.1|
CANADA
64
RR101|Glycera
alba| PORTUGAL
(Estuario
do Sado) o modelo de evolução K2P e o teste de
com detalhe nas espécies Perinereis
cultrífera
e Nereis
zonata.
Foi utilizado
100 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473629.1| CANADA
MOTU 15
Bootstrap com 1000 98replicações.
As linhas
lateraistridactyla|
mostram
a localização
das diferentes famílias e os MOTUs
RR111|Glycera
PORTUGAL
(Estuario do Sado)
BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473621.1| CANADA
representam grupos monofiléticos com SFP5
<3%- 001|Glycera
de divergência
intraespecífica.
sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima) Realçado a verde encontram-se as
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705198.1| CHILE
41
sequências desenvolvidas por
este
trabalho,
enquanto
que
as que
estão sublinhadas a azul, são as restantes
BLASTfalklandica
Glycera alba- GenBank:
- GenBank:
JN852946.1|
SWEDEN
BLAST Perinereis
HQ705185.1|
CHILE
100
97
MOTU
16
sequências desenvolvidas
no BLAST
âmbito
dos
projetos
LusoMarBoL
e
BestBarcode,
presentes
na BOLD.
Pseudonereis
variegata
CHILE
BLAST Glycera
nana- -GenBank:
GenBank: HQ705197.1|
HQ932551.1| CANADA
57 SFP5
44 BLAST Hediste
PORTUGAL
(Estuario
atoka- 002|Glycera
- Genbank: sp.|
AB603859.1|
JAPAN
63
15
100
56 BLAST Perinereis
falklandica - GenBank: HQ705184.1| CHILE
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932562.1| CANADA
96
MOTU 26
Glyceridae
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705186.1| CHILE
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932532.1| CANADA
100
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705188.1| CHILE
MOTU 17
BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024310.1| CANADA
93
99 BLAST
Perinereis
gualpensis - GenBank: HQ705187.1| CHILE
100
BLAST Glyceranadiae|
capitataPORTUGAL
- GenBank: HQ024311.1|
(Estuario do CANADA
Lima)
33 SFP20-1|Platynereis
46 SFP20 - 002|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Glycera capitata - GenBank: HM473749.1| CANADA
100
100
SFP20-2|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672482.1| RUSSIA
79
MOTU 18
MOTU
27
57
SFP18 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
SFP16 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
46
MOTU 23
SFP18 - 004|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
56
Biblioteca de referência de DNA barcodes para 31poliquetas
de estuários
portugueses
LMBP18-2|Perinereis
cultrifera
PORTUGAL (Estuario do Lima)
21 SFP18 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
23
43 SS1|Nereis zonata| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SS2|Nereis zonata| PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 24
100 LMBSAP24-002|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
94 LMBSAP24-001|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
46 SFP5 - 003|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
57 SFP5 - 002|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 25
100 RR101|Glycera alba| PORTUGAL (Estuario do Sado)
98
RR111|Glycera tridactyla| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SFP5 - 001|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Glycera alba - GenBank: JN852946.1| SWEDEN
97
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932551.1| CANADA
100
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932562.1| CANADA
96
MOTU 26
Glyceridae
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932532.1| CANADA
93 BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024310.1| CANADA
100
BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024311.1| CANADA
100 BLAST Glycera capitata - GenBank: HM473749.1| CANADA
MOTU 27
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672482.1| RUSSIA
79
76 BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672465.1| RUSSIA
9
68 BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672489.1| RUSSIA
41 BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473415.1| CANADA
100
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473408.1| CANADA
MOTU 28
BLAST
Harmothoe imbricata
- GenBank:
HM473424.1|
CANADA
Figura 2.12. Parte da árvore100NJ de
sequências
COI de
poliquetas
provenientes
de diversos locais geográficos
BLAST
Harmothoe imbricata
- GenBank:
HQ024044.1| CANADA
com detalhe na família
Glyceridae.
Foi
utilizado
o
modelo
de
evolução
K2P
e
o
teste
de Bootstrap com 1000
54
MOTU 29
100 BLASTaHarmothoe
imbricatadas
- GenBank:
HQ024056.1|
CANADAe os MOTUs representam grupos
replicações. As linhas
laterais
mostram
localização
diferentes
famílias
38
BLAST Harmothoe
glabra - GenBank: JN852929.1|
Polynoidae
monofiléticos com <3% de divergência
intraespecífica.
RealçadoSWEDEN
a verde encontram-se
as sequências
- 001|Polynoidae
| PORTUGAL
(Ria desublinhadas
Aveiro)
desenvolvidas por 88este trabalho, SFP4
enquanto
que as
que estão
a azul, são as restantes sequências
| PORTUGAL (Estuario
do Sado) na BOLD
desenvolvidas no âmbito dos projetos
LusoMarBoL e BestBarcode,
presentes
100 LMBSAP29-001|Polynoidae
MOTU 30
BLAST Harmothoe impar - GenBank: JN852930.1| SWEDEN
51
SFP4 - 002|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
32
MOTU 31
100 BLAST Lepidonotus clava - GenBank: JN852934.1| SWEDEN
100 SFP28 - 001|Sthenelais boa| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 32 (Sigalionidae)
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY839587.1| SWEDEN
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473448.1| CANADA
2.3.4. Árvore filogenética
aminoacídica de DNA barcodes
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473445.1| CANADA MOTU 33 (Polynoidae)
71
100
100 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473444.1| CANADA
97
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172736.1| USA
A figura 2.13 apresenta
a árvore
NJ em
radiação
baseada
aminoacídicas
100
BLAST
Phragmatopoma
caudata
- GenBank: DQ172741.1|
USA nas
MOTUsequências
34
16
com as diferentes84 ordens representadas
por diferentes cores (árvore completa em estrutura de
BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172688.1| USA
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172755.1| USA
Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172704.1| USA
100
79
cladograma disponibilizada
emBLAST
anexo
na figura F2).
MOTU 35
Sabellaridae
60 BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172683.1| USA
SFP21-2 das
Sabellaria
alveolata| PORTUGAL
do Lima)
De notar que a maioria (57%)
ordens,
e das (Estuario
famílias
dentro de cada ordem, formaram
LMBLP4-001|Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Tejo)
MOTU 36
grupos monofiléticos. As exceções
mais evidentes
a este (Estuario
padrão,
são os casos dos membros da
36 LMBLP4-002|Sabellaria
alveolata| PORTUGAL
do Tejo)
100
40
ordem Eunicida
e Sabellida que BLAST
se Spionidae
separaram
em dois grupos distintos, com cada grupo a
- GenBank: GU672502.1| RUSSIA
LPCSED3|Scolelepis foliosa| PORTUGAL (Estuario do Lima)
63
BLAST Spionidae - GenBank: HQ024464.1| CANADA MOTU 37
corresponder a uma45família em ambos
os casos. Nos membros da ordem Phyllodocida também
100
5
BLAST Spionidae - GenBank: GU672476.1| RUSSIA
BLAST Spionidae - GenBank:
CANADA
se observa uma77 discrepância,
nomeadamente
nosHM375492.1|
membros
da família Syllidae que se encontra
75
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024461.1| CANADA
entre as ordens Eunicida e Orbiniida,
e bastante
afastada
da restantes
famílias da mesma
BLAST Scolelepis
sp. - GenBank: HQ024462.1|
CANADA
MOTU 38
100
ordem.
58 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024460.1| CANADA
Spionidae
99 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
97
100
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473679.1| CANADA
MOTU 39
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
BLAST Spionidae - GenBank: HM375486.1| CANADA
60
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023791.1| CANADA
100
100
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023788.1| CANADA
MOTU 40
53 BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023790.1| CANADA
58
100 BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024452.1| CANADA
100
68
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024453.1| CANADA
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024451.1| CANADA
BLAST Terebellidae - GenBank: HM417788.1| RUSSIA
MOTU 41
Capítulo 2
Ordem Phyllodocida
Ordem Sabellida
Ordem Spionida
Ordem Capittelida
Ordem Eunicida
Ordem Orbiniida
Ordem Terebellida
OUTGROUP (Oligochaeta)
0.05
Figura 2.13. Árvore NJ em radiação de sequências COI traduzidas (aminoácidos) de poliquetas provenientes de
diversos locais geográficos. Foi utilizado o modelo de evolução Jones-Taylor-Thornton (JTT) e o teste de Bootstrap
com 1000 replicações.
2.3.5. Sistema BIN (Barcode Index Number)
Na tabela 2.6 encontram-se resumidos os números de BINs, e dos registos
taxonomicamente concordantes, discordantes e de BINs com apenas um membro (singletons)
para os 71 DNA barcodes em estudo. Duas sequências COI não tiveram um BIN atríbuído,
devido a uma troca de identidade dos espécimes no projecto da BOLD. A atribuição taxonómica
de Nereididae aos espécimes LMBSAP24-001 e LMBSAP24-002 foi feita após construção da
árvore filogenética. Nas tabelas 2.7, 2.8 e 2.9 estão detalhadas as espécies que pertencem a
BINs concordantes, representadas por uma única sequência, e os BINs que apresentam
discordâncias, respetivamente.
59
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
Tabela 2.6. Resumo do número de BINs e registos taxonómicamente concordantes, discordantes e BINs com
apenas um membro (Singletons). Em 71 registos da biblioteca de 71 DNA barcodes analisada, 69 tiveram a
atribuição de um BIN, representando um total de 35 BINs.
N.º BINs
N.º Registos
Taxonómicamente concordantes:
19
48
Taxonómicamente discordantes:
1
6
Singletons:
15
15
Tabela 2.7. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonómicamente concordantes. Pode-se observar
também o número de membros e a distância máxima (p-dist) dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a
distância nucleótídica (p-dist) até ao membro do BIN mais próximo.
Espécimes
Identificação
morfológica
RR078
Euclymene santandarensis
RR116
Euclymene santandarensis
RR090
Euclymene santandarensis
RR101
Glycera alba
SFP5-002
Glycera sp.
SFP5-003
Glycera sp.
LPTSED16
Hediste diversicolor
SFP7-001
Hediste diversicolor
SFP7-003
Hediste diversicolor
MSSED7
Hediste diversicolor
L1SED39
Hediste diversicolor
SFP6-001
Hediste diversicolor
LMBP23-1
Cirriformia tentaculta
LMBP23-2
60
Cirriformia tentaculata
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
BOLD:ACG0681
(0.31%)
3
BOLD:AAY5542
(0.15%)
3
BOLD:AAY5198
(1.22%)
3
group sp. A AA-2008
2.53%
BOLD:ABZ5903
(0.48%)
3
group sp. A AA-2008
2.17%
BOLD:ACI2312
(0.95%)
2
Distância ao membro
do BIN mais próximo
Euclymene sp.
16.53%
Glycera tridactyla
2.44%
Hediste diversicolor
Hediste diversicolor
Cirriformia filigera
20.38%
Capítulo 2
Tabela 2.7. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonómicamente concordantes. Pode-se observar
também o número de membros e a distância máxima (p-dist) dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a
distância nucleótídica (p-dist) até ao membro do BIN mais próximo (continuação).
Espécimes
Identificação
morfológica
SS01
Nereis zonata
SS02
Nereis zonata
LMBP18-2
Perinereis cultrifera
SFP18-001
Perinereis sp.
SFP18-002
Perinereis sp.
SFP18-003
Perinereis sp.
SFP18-004
Perinereis sp.
SFP16-001
Perinereis sp.
SFP6-002
Diopatra neapolitana
SFP20-1
Platynereis nadiae
SFP20-2
Platynereis nadiae
SFP20-002
Platynereis nadiae
SFP20-003
Platynereis nadiae
LMBLP7001
LMBSST13001
SFP21-2
LMBLP4001
LMBLP4002
SFP1-001
Phyllodocidae
Phyllodocidae
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
BOLD:ACH5486
(0.96%)
2
BOLD:AAY5413
(0.96%)
6
BOLD:AAX9469
(1.8%)
85
BOLD:ABY1368
(0.48%)
4
BOLD:AAY5110
(0.16%)
2
Eumida
longicornuta 15.22%
BOLD:AAY7553
(0%)
3
Sabellariidae
19.46% (
BOLD:AAY8419
(0%)
2
BOLD:AAY5218
(0%)
2
Distância ao membro
do BIN mais próximo
Hediste diversicolor
20.22%
Nereididae
15.97%
Diopatra dentata
3.93%
Platynereis dumerilii
17.01%
Sabellaria alveolata
Sabellaria alveolata
Sabellaria alveolata
Alkmaria romijni
SFP22-003
Ampharetidae
LMBSAP23001
Marphysa sanguinea
Enchytraeidaegen sp.
19.61%
Marphysa sanguinea
2.35%
61
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
Tabela 2.7. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonómicamente concordantes. Pode-se observar
também o número de membros e a distância máxima (p-dist) dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a
distância nucleótídica (p-dist) até ao membro do BIN mais próximo (continuação).
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
Distância ao membro
do BIN mais próximo
BOLD:AAY5414
(0%)
4
Perinereis longidonta
Espécimes
Identificação
morfológica
SFP17-001
Perinereis sp.
SFP17-002
Perinereis sp.
SFP17-003
Perinereis sp.
LMBSCt12003
Perinereis sp.
SFP4-002
Polynoidae
BOLD:AAY7885
(0.85%)
2
LMBSAP29001
Polynoidae
BOLD:AAY5847
(0.96%)
4
SFP26-001
Owenia fusiformis
SFP26-002
Owenia fusiformis
BOLD:AAY9554
(0.8%)
31
SFP26-003
Owenia fusiformis
SFP24-001
Syllis sp.
BOLD:AAY5331
(0.33%)
2
BOLD:AAY5332
(0.33%)
2
SFP24-005
Syllis sp.
SFP24-002
Syllis sp.
Syllis sp.
SFP24-003
15.03%
Lepidasthenia sp.
6.63%
Harmothoe cf. impar
12.68%
Owenia cf. mirrawa
14.66%
Typosyllis adamanteus
kurilensis
15.03%
Syllis sp.
17.66%
Tabela 2.8. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs com apenas um membro (Singletons). Pode-se observar
também a distância nucleótídica até ao membro do BIN mais próximo.
62
Espécimes
Identificação
morfológica
BIN
RR089
Axiothella constricta
BOLD:ACG0776
RR091
Euclymene robusta
BOLD:ACG1021
RR127
Euclymene robusta
BOLD:ACG1020
RR074
Leiochone leiopygos
BOLD:ACG0717
Distância ao membro
do BIN mais próximo
Praxillella affinis
12.16%
Euclymene sp.
15.57%
Euclymene sp.
12.68%
Euclymene sp.
15.89%1
Capítulo 2
Tabela 2.8. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs com apenas um membro (Singletons). Pode-se observar
também a distância nucleótídica até ao membro do BIN mais próximo (continuação)
Espécimes
Identificação
morfológica
BIN
RR097
Orbiniidae
BOLD:ACG0076
Distância ao membro
do BIN mais próximo
Haploscoloplos
elongatus
21.94%
RR070
Praxillella praetermissa
Scolelepis foliosa
LPCSED3
Glycera tridactyla
RR111
BOLD:ACF9830
BOLD:ACG1122
BOLD:ACG1165
Heteroclymene robusta
14.29%
Scolelepis daphoinos
15.57%
Glycera sp.
2.44%
Hediste diversicolor
MESED4
Hediste diversicolor
BOLD:ACG1109
group sp. A AA-2008
2.17%
MSSED5
Hediste diversicolor
BOLD:ACG1110
group sp. A AA-2008
1,99%
SS18
Trypanosyllis zebra
BOLD:ACH7277
SFP4-001
Polynoidae
Hediste diversicolor
BOLD:AAY7884
SFP5-001
Glycera sp.
BOLD:AAY5541
SFP28-001
Sthenelais boa
BOLD:AAZ0896
LMBSAP27001
Marphysa sp.
BOLD:AAY5846
Syllis gracilis
14.95%
Harmathoe sp.
14.61%
Glycera alba
19.74%
Polynoidae
20.06%
Marphysa sanguinea
4.64%
Tabela 2.9. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonómicamente discordantes com indicação do nivel
taxonómico em que a incongruência ocorre. Pode-se observar também o número de membros e a distância máxima
dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a distância nucleótídica até ao membro do BIN mais próximo.
Espécimes
LMBLP16-001
LMBSAP16-002
LMBSAP16-003
LMBSAP16-004
SFP27-001
SFP13-001
Identificação
morfológica
Nepthys
hombergii
Nepthys
hombergii
Nepthys
hombergii
Nepthys
hombergii
Nephtys
hombergii
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
Nível do confito
taxonómico
BOLD:AAH7451
(4.42%)
70
Género:
Nephys [69],
Aglaophamus [1]
Distância
ao membro
do BIN mais
próximo
Nephtys
hombergii
14.52%
Nephtys sp.
63
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
2.3.6. Sistema de classificação
De acordo com os resultados da figura 2.14 e mais detalhado na tabela 2.10 com a
classificação individual das sequências COI para cada espécie da biblioteca de 71 DNA barcodes
aqui analisada, conclui-se que 39% das sequências COI correspondentes a 21 espécies de
poliquetas (apenas os espécimes identificados até ao nível taxonómico de espécie foram
contabilizados) possuem uma elevada fiabilidade nas identificações morfológicas (níveis A+B). As
restantes 61% (níveis C+D+E), possuem divergências intra-específicas elevadas (14,3%), dados
insuficientes (33,3%) ou DNA barcodes incongruentes (14,3%).
E
14%
A
15%
B
24%
D
33%
C
14%
Figura 2.14. Representação gráfica da classificação atribuída a DNA barcodes correspondentes a 21 espécies
analisadas neste trabalho, pelos diferentes níveis de qualidade do sistema de fiabilidade taxonómica proposto por
Costa et al. (2012). Níveis: A- Concordância externa; B- Concordância interna; C- Concordância sub-óptima; DDados insuficientes; E- DNA barcodes discordantes.
64
Capítulo 2
Tabela 2.10. Atribuição das classificações de fiabilidade taxonómica (A a E) aos DNA barcodes correspondentes a
21 espécies de poliquetas estuarinas de Portugal, de acordo com o sistema de classificação proposto por Costa et
al. (2012).
Identificação taxonómica
Classificação
Axiothella constricta
D
Euclymene robusta
D
Euclymene santandarensis
B
Leiochone leiopygos
D
Praxillella praetermissa
E
Glycera alba
C
Glycera tridactyla
C
Scolelepis foliosa
D
Cirriformia tentaculata
D
Hediste diversicolor
C
Nereis zonata
B
Perinereis cultrífera
B
Platynereis nadiae
B
Sabellaria alveolata
B
Trypanosyllis zebra
E
Alkmaria romijni
D
Diopatra neapolitana
A
Marphysa sanguinea
E
Nephtys hombergii
A
Owenia fusiformis
A
Sthenelais boa
D
65
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
2.4. Discussão
O desenvolvimento de uma biblioteca de DNA barcodes robusta para qualquer grupo
taxonómico de um determinado local ou habitat, exige o levantamento de um elevado número de
DNA barcodes de forma a assegurar a representatividade tanto da diversidade sistemática da
região como da variabilidade intraespecífica. Este estudo gerou 26 novas sequências COI,
avaliando também 45 outras sequências de poliquetas de estuário portuguesas, correspondendo
a 31 espécies, sendo que 9 foram identificadas apenas até ao género ou familia. Trata-se de um
número relativamente pequeno comparativamente com a amostragem feita neste estudo (tabela
T2, em anexo) e com a aparente biodiversidade dessa classe de anelídeos em Portugal (tabela
T1, em anexo). Algumas das razões de carácter técnico que motivam esta discrepância serão
discutidas mais abaixo. De qualquer modo, com o estudo presente pretendeu-se apenas
desenvolver a etapa inicial de criação de um sistema de identificação de espécies de poliquetas
mais rigoroso e auditável.
Teóricamente, tendo em conta vários estudos realizados, seriam suficientes entre uma a
três sequências de uma determinada espécie para que seja feita uma identificação viável e
rigorosa, independentemente do local de recolha do espécime (Moritz & Cicero 2004;
Dasmahapatra & Mallet 2006; Ward et al. 2008). Este nível de amostragem poderá ser
suficiente a um nível regional, contudo, ao nível continental, o número necessário de espécimes
e populações a analisar deverá ser muito superior (Bergsten et al., 2012). Contudo, os mesmos
DNA barcodes têm contribuído para revelar a existência provável de muito mais espécies dos
que as que foram até agora diagnosticadas em quase todos os grandes grupos de organismos,
entre as quais numerosas espécies crípticas, que têm vindo a ser detetadas com uma frequência
crescente à medida que se vulgariza a utilização de métodos moleculares (Costa & Carvalho
2010).
2.4.1. Amplificação e sequenciação do marcador molecular COI-5P
A dificuldade de amplificação de DNA barcodes especialmente em invertebrados
marinhos, incluindo os poliquetas, com os primers mais comumente utilizados (p.e. Folmer,
1994), levou à procura de primers alternativos. Este trabalho contribuíu para testar uma
66
Capítulo 2
abordagem alternativa com recurso a um par de primers degenerados situados exatamente
sobre a mesma zona de hibridização que os primers Folmer (Lobo et al., 2013). Estes primers
revelaram taxas de sucesso de amplificação muito superiores em vários grupos de organismos
marinhos, incluindo os poliquetas. No entanto, nos testes efetuados inicialmente, as condições
de realização do PCR, tanto a nível de concentrações de reagentes e qualidade do reagentes
(p.e. Taq polimerase), como a nível ciclo de PCR e temperatura de hibridização, não estavam
ainda optimizadas.
Entre as sequências geradas no âmbito desta tese, foram apenas testados dois conjuntos
de primers (LoboF1/LoboR1 e o cocktail COI-2 descrito em Ivanova et al. 2007). De um modo
geral observou-se que o sucesso da amplificação alternava entre estes primers dependendo do
género/espécie do poliqueta do qual provinha o extrato de DNA. Por outro lado, nas amostras
processadas no BIO, as taxas de sucesso de amplificação foram relativamente modestas
utilizando os primers específicos para poliquetas poliLCO/HCO (Carr et al. 2011). Estas
dificuldades na obtenção de elevadas taxas de sucesso na amplificação de poliquetas poderão
derivar da grande variabilidade na região de hibridização do primer nesta classe, que apresenta
distâncias relativamente elevadas nas sequências de COI entre os seus membros (como
demonstrado pelas distâncias médias congenéricas). Desde modo, atendendo às soluções
atualmente disponíveis, sugerimos a utilização de vários pares de primers alternativos de forma
sequencial para amplificação de DNA barcodes de comunidades poliquetas de elevada
diversidade. A disponibilidade de um maior leque de primers alternativos, poderia aumentar
consideravelmente o número de amplificações e futuras sequências disponíveis.
2.4.2. Performance dos DNA barcodes na diferenciação de espécies de
poliquetas
No geral, considerando não só as análises de divergência nucleotídicas, mas também as
reconstruções filogenéticas (figura 2.8 e figura F1, em anexo), todos os indicadores
apresentados confirmam a capacidade do COI em demarcar e diferenciar diferentes níveis
taxonómicos. Podem-se encontrar facilmente padrões de organização dos espécimes sendo
evidente o agrupamento destes em clados coincidentes com níveis taxonómicos bem definidos
como espécie e género ou a partilha de um ancestral comum em clados de niveis taxonómicos
mais profundos como a família ou mesmo a ordem como se observa na árvore NJ de
67
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
aminoácidos (figura 2.14 com maior detalhe na figura F2, em anexo). Nesta árvore de
aminoácidos é evidenciada a redundância no código genético (diferentes nucleótidos a
produzirem os mesmos amino-ácidos) ao nível do género e espécie. Entre as famílias estudadas
este facto é particularmente evidente no caso da família Nereididae, onde espécies claramente
distintas quando analisadas a nível nucleotídico possuem exatamente a mesma sequência
amino-acídica. Apesar desses pormenores, a árvore baseada nas sequências de aminoácidos
apresentou maior resolução para as filogenias mais profundas, recuperando os traços de
ancestralidade mais profundos e agrupando monofiléticamente a maioria das ordens. Devido a
possuir taxas de substituição nucleótidicas comparativamente rápidas, o gene COI, tem
tendência a perder os traços evolutivos mais antigos, sendo mais adequado a reconstrução
filogenéticas mais recentes, descriminando de forma mais efetiva níveis taxonómicos mais baixos
como o género e espécie. No entanto, tem-se verificado que, pelo menos em alguns organismos
como os crustáceos (Costa et al., 2007; Costa et al., 2009), é possivel recuperar a
ancestralidade a um nível mais profundo (família, ordem) utilizando as sequências de
aminoácidos dos DNA barcodes. Verificámos alguma capacidade idêntica em várias espécies de
poliquetas analisadas no presente estudo, embora com as exceções já anotadas nos resultados.
No caso dos estudos efetuados em crustáceos (Costa et al., 2007) alguns dos grupos
incongruentes incluíam famílias de formas parasitas que apresentam padrões e ritmos de
evolução peculiares. A análise mais detalhada das caraterísticas ecológicas e demográficas dos
grupos de poliquetas mais divergentes poderá fornecer algumas pistas para as bases biológicas
dessa divergência. Importa realçar ainda que, segundo o WoRMS (http://www.marinespecies
.org/), as ordens Capitellida e Orbiniida são consideradas “nomen dubium” não sendo usadas
atualmente, tendo como consequência que as famílias Maldanidae, Arenicolidae e Orbiniidae
não estarem incluídas em nenhuma ordem. No entanto, para poder agrupar todos os espécimes
ao mesmo nível taxonómico optou-se pela utilização desse taxa.
O nível de resolução taxonómica observado ao nível da espécie (TRR cerca de 30x, tabela
2.3), está dentro da gama de valores observados em outros grupos animais (ex: Costa et al.,
2009; Hebert et al., 2003b). As divergências intraespecíficas e interespecíficas congenéricas
observadas neste capítulo estão também dentro da gama de variação reportada em outros
estudos de DNA barcodes de poliquetas [0,35% e 16,8%, respetivamente no estudo de Carr et al.
(2011) com as diferenças dentro do género a serem ligeiramernte superiores no capítulo desta
tese (20,1%)]. Quando comparadas as divergências interespecíficas congenéricas observados em
68
Capítulo 2
poliquetas com outros grupos taxonómicos, verifica-se que os poliquetas se intregram no grupo
que apresenta no geral valores maiores. Por exemplo, as divergências interespecíficas
congenéricas médias em vertebrados como os peixes são de 8,4% (Ward, 2009), e nas aves é
de 5,54% (Ward, 2009), enquanto em invertebrados marinhos, como os anfípodes é de cerca de
26% (Costa et al., 2009), o que se aproxima mais dos 20,8% encontrados nos poliquetas neste
estudo.
A aparente incapacidade dos DNA barcodes para discriminarem sem ambiguidade 21%
das 67 espécies passíveis de análise, requer um exame mais detalhado. Em estudos de DNA
barcoding podem existir razões biológicas ou operacionais para a ocorrência de discrepâncias
entre as identificações morfológicas originais e os resultados evidenciados pelas sequências. As
razões biológicas resultam típicamente da existência de múltiplas unidades biológicas
independentes dentro do que é considerado uma morfo-espécie, ou da efetiva incapacidade das
sequências de discriminarem espécies que divergiram recentemente ou que ainda hibridizam.
Por outro lado, as justificações operacionais resultam típicamente de erros nas identificações
com base na morfologia, erros de etiquetagem ou da contaminação cruzada entre amostras
(Hebert et al., 2003a; Hebert et al., 2003b).
Parte das discrepâncias observadas virá provavelmente confirmar a enorme dificuldade
que há na identificação taxonómica desta classe de anelídeos, muitas delas possivelmente
evidenciadas pela confrontação com dados moleculares, e sem os quais não seriam notadas.
Algumas discrepâncias com origem provável em erros de identificação estão patentes em
sequências depositadas no GenBank (usadas como base de comparação em relação aos
espécimes deste estudo), como são exemplo os espécimes identificados como Perinereis
falklandica e Pseudomereis variegata, que se agrupam no mesmo MOTU (#16), ou o caso das
duas sequências de Trypanosyllis zebra que, em conjunto com o espécime da mesma espécie
identificado neste trabalho (SS18), não agruparam no mesmo MOTU, ocorrendo cada um numa
posição diferente na árvore NJ sugerindo 3 espécies distintas. Outros exemplos onde dados do
GenBank demonstram incongruências, podendo até haver a ocorrência de espécies ocultas,
podem ser encontrados nas espécies Harmothoe imbricata (MOTUs 28 e 29), Syllis elongata
(MOTUs 79 e 80), Cirratulus cirratus (MOTU 71 e 72), Hediste atoka (MOTUs 9-14) e Hediste
diversicolor (MOTUs 1-8), onde se dividem pelo menos em dois MOTUs, o que contribui
significativamente na disparidade de resultados encontrados nas tabela de divergências
69
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
nucleótidícas e nos MOTUs diferenciados na árvore NJ de nucleótidos, revelando a necessidade
de uma revisão taxonómica nos DNA barcodes públicos disponíveis para os poliquetas.
Em relação às 31 espécies, correspondentes aos 71 DNA barcodes originais integrados
nesta tese, foram encontradas incongruências em 7 espécies (tabela 2.5). Entre estas, merece
um realce especial o caso do poliqueta Hediste diversicolor (Nereididae) que se encontra
distribuído por 8 MOTUs distintos, todos incluíndo membros desta espécie, o que sugere a
possibilidade da ocorrência de espécies ocultas (discutido em maior profundidade no ponto
2.4.3). O espécime inicialmente identificado como membro da família Ampharetidae (SFP28001), agrupou no MOTU 44 com o espécime SFP1-001 identificado como a espécie Alkmaria
romijni, mas estes por seu lado, não se agruparam com as sequências da mesma família
obtidas a partir do GenBank. Pelo contrário, agruparam num clado distante, sugerindo diferentes
ancestrais, mais próximos da familia Terebellidae. Foram pesquisados pelo menos 2 géneros
diferentes da familia Ampharetidade (MOTU 49-52), o que aumenta a probabilidade de um
equívoco nas identificações taxonómicas originais ou então uma possível contaminação das
amostras.
Por outro lado, não foram detetadas ambiguidades taxonómicas em 16 espécies
podendo-se até, em alguns casos, usar esta ferramenta molecular para descobrir a identidade de
espécimes identificados apenas até à família ou género como são exemplo os espécimes SFP18-
001, SFP18-002, SFP18-003 e SFP18-004 identificados como Perinereis sp., delimitados no
MOTU 23 (figura 2.11) que poderão pertencer à espécie Perinereis cultrifera (Nereididae), caso a
identificação do espécime LMBP18-2 esteja correta. Infelizmente, não foi possivel encontrar
sequências homólogas no GenBank ou até mesmo na BOLD para que se possam retirar
conclusões definitivas.
Estes 71 DNA barcodes foram também sujeitos a uma análise pelo sistema BIN. De
recordar que o BOLD é um ambiente de trabalho em constante atualização, cujos registos
taxonómicos incluem dados publicados e não publicados. Os utilizadores desta plataforma
poderão encontrar trabalhos taxonómicos discordantes, especialmente entre os registros não
publicados, mas a “regra da maioria” é uma forma útil de avaliar a validade de uma
identificação em particular (Ratnasingham & Hebert, 2013). Tendo presentes estes factos, e
considerando o número de singletons (tabela 2.8), e o facto de entre os BINs concordantes
(tabela 2.7) apenas 21,05% destes possuírem sequências provenientes de outros estudos, podese concluir que grande parte das sequências obtidas para esta tese são únicas dentro da base
70
Capítulo 2
de dados da BOLD, realçando o estado ainda incipiente de completitude das bibliotecas de DNA
barcodes nesta classe de invertebrados.
Nos casos onde foi encontrado um número elevado de membros por BIN, foi possivel
aumentar a confiança nas identificações taxonómicas feitas para esses espécimes. São exemplo
as sequências COI pertencentes às espécies Diopatra neopolitana e Owenia fusiformis com 31 e
85 membros respetivamente. Apesar da espécie Nepthys hombergii pertencer a um BIN
discordante (tabela 2.9), a discrepância tem origem em apenas 2 identificações discordantes (1
dentro do BIN e 1 outra no BIN mais próximo) entre 68 sequências concordantes, pelo que
aplicando a regra da maioria, é provável que os dois membros discordantes resultem de erro de
identificação, de etiquetagem ou de contaminação.
De realçar também os 4,42% na divergência intraespecífica do BIN: “BOLD:AAH745”
correspondente à espécie Nepthys hombergii, assim como o baixo valor (1.99%) na distância
nucleotídica do BIN: “BOLD:ACG1110” (Hediste diversicolor) em relação ao seu respetivo BIN
mais próximo. De acordo com Ratnasingham & Hebert (2013), tais situações, embora raras,
podem ocorrer devido ao algoritmo utilizado para grupamento dos DNA barcodes em BINs. O
algoritmo RESL (Refined Single Linkage) utiliza o método de “Markov Clustering” (MCL), que
permite que agrupamentos cujos membros apresentem uma elevada variação nas suas
sequências mas que não possuam descontinuidade, permaneçam como uma única OTU. Por
outro lado, no caso de agrupamentos cuja variação nas sequências apresente claras divisões
internas, estes são distribuídos por dois ou mais BINs, mesmo se a divergência for inferior a
2,2% (limite definido para diferenciar OTUs no algoritmo RESL). O MCL permite assim separação
dos conjuntos de sequências que possam ser negligenciados por um valor fixo (Ratnasingham &
Hebert, 2013).
Apesar de agruparem no mesmo MOTU (#25) e apresentarem uma distância média de
apenas 2,44%, as espécies Glycera tridactyla e Glycera alba, amostradas nos estuários do Lima
e do Sado (figura 2.12), foram alocadas a BINs independentes. Contudo, é evidente na árvore NJ
a presença de um espécime classificado igualmente como G. alba e proveniente da Suécia, que
não agrupa com os seus putativos consespecíficos de Portugal. O número limitado de espécimes
disponíveis não nos permite contudo fazer qualquer inferência adicional sobre o motivo desta
discrepância. Na família Maldanidade (figura 2.9), a espécie Euclymene robusta (espécimes
RR091 e RR127) está representada por apenas dois espécimes, ambos recolhidos no estuário
do Sado, mas divergindo entre si 17,7%. Este valor comparativamente muito elevado de
71
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
divergência intraespecífica sugere que os dois espécimes em apreço pertençam a unidades
taxonómicas simpátricas independentes, conforme sugerido também pelo seu agrupamento em
BINs distintos.
2.4.3. Evidência de unidades taxonómicas ocultas e espécies putativas
A introdução de ferramentas moleculares na sistemática tem permitido um nível mais fino
na resolução taxonómica e demonstrou que muitos taxa externamente homogéneos, incluíndo
aqueles presumivelmente bem conhecidos, ecológicamente relevantes e abundantes,
representam complexos de espécies crípticas (Carr et al, 2011).
Observando a árvore filogenética (figura 2.8), em conjunto com a análise do “barcoding
gap” (figura 2.7) e os valores de divergência intra e interespecíficas (tabela 2.4), é evidente um
padrão de variação anormal entre os membros do género Hediste. A espécie Hediste
diversicolor, uma das mais representadas nos estuários amostrados neste estudo (tabela T2, em
anexo), apresentou uma divergência intraespecífica comparativamente elevada [5,45% (variação
entre 0,4 – 11,2%)], ultrapassando em muito o limite empírico de 3% atríbuído a cada MOTU. Os
espécimes sequenciados, foram identificados até á espécie usando várias chaves dicotómicas
(p.e. Hayward & Ryland, 1995; Fauvel, 1927), e em todos os casos, devido á sua
homogeneidade externa, os aspectos morfológicos convergiram apenas para uma única solução
possivel.
A espécie Hediste diversicolor é um taxon amplamente utilizado como organismo modelo
em estudos ecológicos e em testes de monitorização ambiental e testes toxicológicos (Ozoh,
1992). No entanto, se estes testes forem realizados num “pool” de duas ou mais espécies
diferentes, os resultados obtidos poderão ser questionáveis (Audzijonyte et al., 2008). Apesar
deste taxon ser geralmente considerado como uma única espécie, já foram reportadas indícios
de profundas subdivisões moleculares em diferentes escalas geográficas. Rohner et al. (1997),
descreveu diferenças diagnosticantes em três loci de aloenzimas entre dois tipos genéticos de
Hediste encontrados ambos no Mar Báltico e no Mar do Norte. Esses dados foram de encontro a
diferenças similares encontradas previamente entre duas amostras de Hediste diversicolor
provenientes de dois estuários do Mar do Norte. Além disso, foi igualmente relatada uma
divergência de 6,6% na sequência do gene mitocondrial citocromo B (CytB) entre amostras do
Atlântico Noroeste e do Atlântico Nordeste – Mediterrânico (Breton et al. 2003). Esta distância é
72
Capítulo 2
bem mais elevada do que a típica divergência intraespecifica (COI) encontrada em animais
(Hebert et al., 2003b) e em particular nos poliquetas (Carr et al., 2011).
Para avaliar de forma decisiva o significado biológico e sistemático da diversidade nesta
espécie, Audzijonyte et al. (2008) realizaram uma pesquisa molecular de ambos os caracteres
nucleares co-dominantes (aloenzimas) e da diversidade de sequências de DNA mitocondrial
(COI), em populações em todo o litoral norte, leste e sul do Mar Báltico, definindo os resultados
tendo em conta a informação já existente. O estudo providenciou evidência conclusiva da
(co)existência de duas espécies crípticas reprodutivamente isoladas dentro do Mar Báltico, com
base numa distribuição estritamente correlacionada de quatro caracteres de diagnóstico, cada
um codificado por um locus nuclear presumivelmente independente. Segundo os autores, em
organismos diplóides, o diagnóstico de aloenzimas co-dominantes fornecem uma identificação
inequívoca, uma vez que os híbridos recentes seriam vistos como heterozigotos ou despistados
por deteção de desiquílibrio cito-nuclear entre loci, o que não foi observado. O isolamento
reprodutivo estável foi corroborado pela ocorrência comum das duas espécies em simpatria (em
mais de metade das amostras estudadas), bem como em alopatria. As sequências de COI
relativas a este estudo encontram-se em destaque na árvore filogenética da figura 2.10. Como se
pode observar, estas dividem-se em dois grupos distintos: Hediste diversicolor A e B.
As sequências de Hediste diversicolor obtidas neste trabalho evidenciaram uma enorme
variabilidade intraespecífica, mas não o suficiente para se agruparem com a linhagem B do
estudo de Audzijonyte et al. (2008). A divergência intraespecifica para a espécies A (excluindo a
linhagem introgressiva AB e íncluíndo as sequências deste trabalho) atinge um valor médio de
3,16% (variação entre 0,21 – 5,49), enquanto que para a espécie B atinge um valor de 4,61%
(variação entre 0,18 – 7,78).
Um facto interessante, é que durante a pesquisa de sequências similares de Hediste
diversicolor no BOLD-IDS (ferramenta da BOLD, que permite a identificação de espécies através
da leitura de uma sequência de DNA inserida pelo utilizador, retornando uma identificação
taxonómica até ao nível da espécie, caso seja possivel, mediante uma lista decrescente de
percentagens de similaridade molecular) foram encontrados mais de 50 resultados que variavam
entre 0 a 9% em termos de divergência intraespecífica para essa espécie (figura 2.15), sugerindo
a necessidade de um maior número de estudos sobre a eficácia do COI nesta espécie/complexo
de espécies crípticas em relação a outros marcadores moleculares.
73
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
Resultados como os encontrados nesta tese e noutros estudos (ex: Audzijonyte et al.
(2008) acima mencionado) ou em trabalhos com a mesma temática (ex.: Virgilio et al. (2009))
sugerem que a aplicação do COI para a discriminação do complexo de espécies de Hediste
diversicolor terá algumas limitações. Além de possível ocorrência de hibridização introgressiva
neste grupo de espécies, os padrões de divergência intra e interespecífica poderão não ser
suficientes na delimitação de espécies. Por exemplo, e como já foi referido, a linhagem B de
Hediste diversicolor compreende espécimes com uma distância intra-linhagem especifica quase
tão profunda como a divergência por linhagens ou espécies vizinhas putativas. Usando o limite
empírico de 3% para delimitação de MOTUs aqui adotado para os poliquetas, implica só na
linhagem B a ocorrência de 4 MOTUs - e portanto do mesmo número de espécies potenciais, o
que contraria a análise através de aloenzimas (Audzijonyte et al, 2008), ou 5 MOTUs/espécies
potenciais na linhagem A. Um padrão semelhante pode ser encontrado nas sequências da
espécie Hediste atoka obtidas a partir do GenBank (Tosuji & Sato, 2010; fig. 2.8, com mais
detalhe na figura F1 em anexo), o que poderá sugerir que este género de poliquetas apresenta por algum motivo ainda não compreendido - um padrão de evolução e diversificação molecular
muito peculiar comparativamente a outros taxon de poliquetas.
Figura 2.15. Número de resultados similares após comparações entre as sequências de Hediste diversicolor deste
estudo com a base de dados da BOLD, usando a ferramenta BOLD-IDS.
2.4.4. Classificação das sequências COI
Os sistemas de identificação biológicos não são estáticos, estando continuamente a serem
revistos e atualizados (incluindo as bases de dados taxonómicas) de acordo com as mudanças
74
Capítulo 2
na taxonomia alfa e como tal, as bibliotecas de DNA barcodes devem também seguir esta
tendência e acomodar protocolos de curadoria de dados e respetiva revisão de modo a garantir a
sua validade (Costa et al., 2012). Usando o sistema de classificação proposto por Costa et al.
(2012) e tendo em conta os resultados e discussão apresentados, a classificação dos DNA
barcodes para as espécies de poliquetas desenvolvidos por esta tese podem ser encontradas na
tabela 2.10 ou de forma mais resumida na figura 2.15. De notar que este sistema de
classificação não deverá ser confundido com o “barcode keyword” usado para destacar DNA
barcodes que seguem uma norma comunitária de qualidade dos dados associados às
sequências de DNA barcodes submetidas a qualquer uma das bases de dados que integram o
International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC). Apesar de o “barcode
keyword” ser um ativo operacional valioso para o controlo de qualidade de dados associados aos
DNA barcodes, este não incorpora qualquer estimativa, mesmo empírica, da sua congruência
taxonómica, nomeadamente da validade da associação entre o nome de uma espécie e o
conjunto de sequências similares de COI que a identificam.
Para implementação deste sistema de classificação, foram utilizados apenas os
espécimes identificados até à espécie na comparação dos respetivos DNA barcodes com aqueles
disponíveis em bases de dados públicas (BOLD e GenBank). Concluiu-se que das 21 espécies de
poliquetas, apenas 14,3% apresentaram DNA barcodes externamente congruentes de nível A. As
espécies cuja classificação foi de nível B (23,8%) poderão ser promovidas a nivel A caso sejam
disponibilizadas sequências correspondentes obtidas por outros investigadores podendo
aumentar assim a classificação global das sequências aqui analisadas. Alternativamente poderão
ser alocadas ao nível E caso se venha a provar ambiguidades taxonómicas em comparação com
outros estudos. Os espécimes de nível C (14,3%), necessitarão de ser explorados com
marcadores moleculares alternativos. A espécie poderá ser confirmada como descrita
inicialmente, ou poderá exigir uma revisão taxonómica de acordo com o padrão de divergência
revelado por outros marcadores. Em 14,3% (nível E) das espécies será necessária uma profunda
revisão taxonómica nas identificações originais. De realçar que também não houveram dados
comparativos em 28,6% (nível D) das espécies, demonstrando bem a fase bastante incipiente
que se encontra a biblioteca de referência global de DNA barcodes para poliquetas.
75
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas de estuários portugueses
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84
Capítulo 3
Análise de sequências COI para construção de
uma biblioteca de referência de DNA Barcodes
de poliquetas do mar profundo (Península
Ibérica)
Capítulo 3
3.1. Introdução
As formas de vida que habitam as profundezas do oceano para além da plataforma
continental são ainda pouco conhecidas. As amostras de sedimentos do mar profundo contêm,
tipicamente, representantes de vários filos, sendo a maioria destes animais pequenos, vivendo
abaixo da superficie dos sedimentos. A recolha de amostras biológicas do fundo oceânico é
extremamente díficil devido às elevadas profundidades (superiores a 1 Km), as quais são
inacessíveis aos mergulhadores. Antes do uso de submersíveis tripulados, as amostras eram
recolhidas “às cegas” usando amostradores suspensos na extremidade de um cabo a partir de
embarcações. Mesmo com os submersíveis, o processo de remoção manual dos animais dos
sedimentos é longo e laborioso. É díficil impedir que os animais morram durante a colheita e
processamento, e daí o baixo número de espécies observadas e fotografadas vivas. Depois de
amostrados, os espécimes são díficeis de identificar pois são muito poucos os biólogos treinados
na taxonomia em espécies de mar profundo (Ray & Grassle, 1991).
Um dos taxa dominantes do fundo oceânico são os poliquetas (Cosson et al., 1997). Estes
podem ser encontradas num vasto leque de habitats das profundezas do mar como os canhões
submarinos, corais de profundidade, vulcões de lama e fontes hidrotermais (Rouse & Pleijel,
2001). Os espécimes utilizados para obtenção das sequências COI foram recolhidos nos três
primeiros tipos de habitats, cada um dos quais com a sua respetiva importância ecológica.
As comunidades de corais de profundidade fornecem habitat para muitas espécies de
vertebrados e invertebrados, incluindo alguns peixes comercialmente importantes e populações
de crustáceos. Alguns têm níveis de diversidade biológica comparável aos recifes de águas
rasas. São altamente suscetíveis à perturbação por muitas das atividades antropogénicas no
fundo do mar. As atividades de dragagem em particular, já causaram uma destruição
considerável nessas comunidades por todo o mundo. Devido à sua extrema longevidade e
crescimento lento, a recuperação é provável que esteja na ordem de décadas ou mesmo séculos
(Roberts & Hirshfield, 2004). Os corais de águas profundas estão presentes desde os 60-6000
metros de profundidade (Cairns & Stanley, 1981), mas a maioria dos exemplares são
encontrados entre os 500-2000 metros. Este intervalo de profundidade faz destes corais de
águas frias ideais para estudos de massas de água intermédias e pouco profundas. O grande
potencial destes corais deriva do facto de a densidade de esqueletos de coral não estarem
sujeitos à bioturbação (conjunto de processos realizados por organismos que movimentam, por
87
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
exemplo, os componentes do solo) e o facto de os esqueletos poderem ser datados por técnicas
de “Uranium-series” (Cheng et al., 1995; Goldstein et al., 1996; Smith et al., 1997). Assim, os
corais de profundidade podem fornecer registos de idade com resoluções temporais geralmente
não atingíveis em sedimentos do fundo do mar, sendo por isso um novo arquivo de taxas de
circulação profunda ao acoplar as idades “Uranium-Series” com datação por Carbono14 (Adkins
& Boyle, 1997; Mangini et al., 1998).
Os canhões submarinos estão entre as formas de relevo mais espetaculares encontrados
ao longo de plataformas continentais e encostas, desempenhando um papel importante no
transporte de sedimentos e matéria orgânica desde a costa até às bacias profundas. Assim que
chegam aos canhões, os materiais são transportados através de ressuspensão pelas correntes
tidais e por eventos episódicos violentos incluindo depressões e fluxos de turbidez (Vetter &
Dayton, 1999). Distúrbios a partir de correntes periódicas intensas, transporte de detritos,
quedas de sedimentos e fluxos de turbidez, são mais suscetíveis de afetar os animais nos
canhões submarinos do que nas típicas plataformas continentais e encostas. Por outro lado, os
detritos transportados e acumulados nos canhões submarinos também podem ser utilizados
como alimento e habitat pela fauna bentónica, com a maior parte do carbono orgânico disponível
para os bentos a poder chegar como fluxo ao longo do fundo do mar ao invés da “chuva de
detritos” a partir das águas superficiais (Vetter & Dayton, 1998).
Nas últimas décadas foram descobertas comunidades de animais bentónicos associadas
com fontes frias em vários pontos das margens continentais ativas e passivas dos oceanos
Pacífico e Atlântico (Sibuet & Olu, 1998; Sibuet & Olu-Le Roy, 2002). Os vulcões de lama,
estruturas geológicas onde lama e fluido escorrem pelo fundo do mar, são um dos ambientes
mais comuns que favorecem o seu desenvolvimento. Este tipo de vulcanismo é um fenômeno
tipicamente conduzido por sedimentos pressurizados em zonas de subdução e por tectonismo
de sal em margens passivas (Milkov, 2000; Bohrmann et al., 2002). Grandes quantidades de
metano são frequentemente libertados na superfície dos vulcões de lama (MacDonald et al.,
2000; Charlou et al., 2003). O metano é produzido através da degradação biológica da matéria
orgânica nos sedimentos superiores ou através da migração de gás termogênico de depósitos de
hidrocarbonetos mais profundos. Nas fontes frias, consórcios de archae e bactérias utilizam este
metano para produzir sulfuretos no sedimento por processos quimioautotróficos (Masuzawa et
al., 1992; Pancost et al., 2000), enquanto que as bactérias simbióticas transformam o metano
ou sulfureto promovendo a síntese de substâncias orgânicas que sustentam elevadas produções
88
Capítulo 3
em biomassa de invertebrados de grande tamanho (Fiala-Médioni & Felbeck, 1990; Fisher,
1990).
A vastidão remota do fundo oceânico pode criar a ilusão de que esteja a salvo de
perturbações antropogénicas que ameaçam atualmente diversos ambientes terrestres e de
águas pouco profundas. Aliás, esse mesmo facto poderá incentivar a utilização desses
ambientes como áreas de deposição de resíduos. Um caso sério que levanta preocupações é o
efeito potencial da acumulação de compostos tóxicos que foram encontrados nos sedimentos do
mar profundo. Muito pouco se sabe sobre a tolerância dos organismos do mar profundo ao
aumento gradual de químicos antropogénicos que poderá provocar a difusão de mudanças
drásticas nesse ambiente caso estas ocorram. Medições dos poluentes, descrição das
comunidades do mar profundo de várias partes do oceano e estudos in situ dos níveis de
toxicidade são urgentemente necessários. O estabelecimento de estações de monitorização de
longo prazo para melhor entender as interações dos organismos do mar profundo com o seu
ambiente natural e vigiar os potenciais efeitos da poluição, são fundamentais para providenciar
informação para uma gestão sustentável dos recursos oceânicos (Ray & Grassle, 1991). O DNA
barcoding poderá ter um papel importante ao facilitar a identificação e diagnóstico de espécies
pouco conhecidas, como os poliquetas e outros organismos do mar profundo (ex: Knox et al.,
2012). Deste modo, o estudo reportado neste capítulo teve por objetivo iniciar a compilação de
DNA barcodes de poliquetas de dois locais do mar profundo da Penínusla ibérica, com vista à
criação de uma biblioteca de referência que facilite a identificação e reconhecimento de espécies
deste grupo e contribua para o aprofundamento do conhecimento destas comunidades do mar
profundo ainda pobremente descritas.
89
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
3.2. Metodologia
As sequências COI dos poliquetas de mar profundo foram obtidas no âmbito do projeto
LusoMarBoL e de vários projetos de investigação internacionais (HERMES, HERMIONE,
CHEMECO, SWIMGLO, e o programa TTR), estando depositadas na plataforma informática do
BOLD no projecto “Deep Sea Polychaetes (DEEP)” de Marina R. Cunha e Ascensão Ravara
(UA/CESAM). A localização geográfica dos locais de amostragem dos espécimes está patente
nos mapas das figuras 3.1 e 3.2, correspondendo a amostras recolhidas a profundidades que
variaram entre os 215 e 3861 metros.
Figura 3.1. Localização geográfica da amostragem dos espécimes de poliquetas do mar profundo. Golfo de
Cádiz (Oceano Atlântico) e Mar de Alborão (parte mais ocidental do Mar Mediterrânio).
Figura 3.2. Localização geográfica da amostragem dos espécimes de poliquetas do mar profundo. Golfo da
Biscaia no nordeste atlântico.
90
Capítulo 3
3.2.1. Extracção de DNA, amplificação e sequenciação
A extração de DNA, amplificação, sequenciação e alinhamento de sequências de parte dos
espécimes foi realizada no BIO, de acordo com o protocolo detalhado no capítulo 2 (secção
2.2.4). Para os restantes espécimes foi utilizado o seguinte protocolo:
- A extração do DNA foi efectuada com o kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) seguindo o
protocolo do fornecedor. Foi amplificado um segmento COI de 600 bp usando os primers da
tabela 3.1. A reação de amplficiação (PCR) continha 1 μL de cada primer (10 μM), 2 μL de
extrato de DNA e puReTaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Biosciences), perfazendo com
água ultrapura numa mistura total de 25 μL. O ciclo térmico consistiu nos seguintes passos: 96
ºC por 120s seguido de 45 ciclos (94ºC⁄ 30s, 48 ºC⁄ 30s, 72ºC⁄ 60s) e terminando com uma
extensão final a 72ºC por 480s. Os produtos PCR foram purificados com o kit QIAquick PCR
Purification (Qiagen). Os produtos de PCR purificados foram enviados para um fornecedor de
serviços (Macrogen Inc.) para sequenciação bidirecional, num sequenciador ABI 3730XL DNA
Analyser (Applied Biosystems).
Tabela 3.1. Primers usados para amplificação dos fragmentos de COI-5P a partir de extractos de DNA de
poliquetas
Primer
Sequência
Referência
LCO1490 (F1)
GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
Folmer et al. (1994)
COI-E (R1)
TATACTTCTGGGTGTCCGAAGAATCA
Bely & Wray (2004)
3.2.2. Análise dos dados
A análise dos dados e construção das árvores filogenéticas dos DNA Barcodes consistiu
num procedimento idêntico ao seguido do capítulo 2 desta tese (secção 2.2.5), envolvendo todas
as análises de distâncias nucleóticas e de árvores NJ ali referidas, bem como a avaliação dos
resultados com recurso ao sistema BIN e ao sistema de classificação dos DNA barcodes das
bibliotecas de referência proposto por Costa et al. (2012). As acessões das sequências obtidas a
partir do GenBank podem ser encontradas na tabela T4, em anexo.
91
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
3.3. Resultados
3.3.1. Biblioteca de referência de DNA barcodes de poliquetas do mar
profundo
Neste capítulo foram examinadas 200 sequências COI de poliquetas, entre as quais 66
correspondem a sequências originais não publicadas, que se encontram depositadas na BOLD
no projecto “Deep Sea Polychaetes”, da responsabilidade de Marina R. Cunha e Ascensão
Ravara (UA/CESAM). Estas sequências pertencem a poliquetas do mar profundo recolhidas em
zonas próximas à Península Ibérica, nomeadamente no Mar de Alborão (Mar Mediterrânico), no
Golfo de Cadiz e no Golfo da Biscaia (Oceano Atlântico). As restantes 134 sequências
correspondem a espécimes da mesma espécie, género ou família recolhidas e adicionadas ao
alinhamento após pesquisa no GenBank, e com origem de diversas zonas do planeta.
Dentro das 66 sequências “Deep Sea”, que poderão vir a ser utilizadas para uma futura
biblioteca de referência, 46 possuem 658 pb sendo que as restantes 20 variam entre os 572 e
644 pb. Não foram encontrados quaisquer codões STOP, nem inserções ou deleções após o
alinhamento. Estas sequências correspondem a 6 ordens, 17 famílias e 37 espécies das quais
10 identificadas apenas até ao género ou família. No global (sequências Deep Sea + GenBank),
este estudo envolveu sequências de COI pertencentes a 6 ordens, 19 familias e 85 espécies de
poliquetas.
3.3.2. Divergências nucleotídicas intra e interespecíficas
As divergências intraespecíficas e congenéricas globais, obtidas através do modelo K2P
usando a ferramenta do BOLD (“Distance Summary”), dos géneros de poliquetas pertencentes
apenas às 66 sequências “Deep Sea”, encontram-se na tabela 3.2. O valor médio da divergência
intraespecífica (dentro da espécie) foi de 6,709% (variação entre 0 – 30,662%), enquanto que a
divergência congenérica (dentro do género) atingiu o valor de 21,24% (variação entre 0 –
31,769%). Dentro da família os valores mínimo e máximo variaram entre 0,317 e 32,653
respetivamente, com a distância média a ficar-se pelos 24,58%. Estes resultados sugerem
alguma discordância entre as identificações taxonómicas originais e os dados moleculares.
92
Capítulo 3
Tabela 3.2. Divergências médias, minimas e máximas globais de poliquetas do projecto “Deep Sea Polychaetes”
da BOLD, calculadas pelo modelo K2P. A métrica TRR consiste no quociente entre as divergências médias inter e
intraespecíficas. Foi usada a opção “Distance Summary” do BOLD para a criação desta tabela.
Dentro da
espécie
N.º
espécimes
N.º
taxa
N.º
Comparações
Distância
mínima
(%)
Distância
média
(%)±Erro
padrão
Distância
máxima
(%)
35
10
63
0
6.709
±0.174
30.662
31.769
32.653
Dentro do
género
20
5
26
0
21.24
±0.409
Dentro da
família
26
4
51
0.317
24.58
±0.084
TRR
3,166
Na tabela 3.3, encontram-se as divergências intraespecíficas e congenéricas globais (K2P)
dos géneros de poliquetas correspondentes a todas as sequências analisadas (Deep Sea +
GenBank). O valor médio da divergência intraespecífica foi de 3,87% (variação entre 0 –
37,88%), enquanto que a divergência congenérica atingiu o valor de 20,25% (variação entre 7,36
– 31,77%). De realçar que, após a remoção das ambiguidades taxonómicas observadas na
árvore filogenética nucleotídica (figura 3.5), a taxa média de divergência intra e interespecífica
passou a ser de 0,61% (variação entre 0 – 2,63%) e 20,10% (variação entre 7,36 – 31,77%)
respetivamente, verificando-se assim um padrão geral de valores baixos na divergência dentro da
espécie com a distância mínima dentro do género a ser superior à divergência intraespecífica
máxima.
Muitas sequências não poderam ser incluídas na análise pois não foram encontradas no
GenBank sequências homólogas para servirem como suporte da análise intra e interespecífica, e
também devido ao facto de haver espécimes identificados apenas ao nível da família ou género
(tabela 3.3).
93
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
Tabela 3.3. Divergências médias, minimas e máximas globais a partir da análise do conjunto de 200 sequências
de 85 poliquetas examinadas neste estudo, englobando sequências originais de espécies de poliquetas do mar
profundo (projecto Deep Sea da BOLD) e sequências publicadas disponíveis no GenBank, calculadas pelo modelo
K2P. A métrica TRR consiste no quociente entre as divergências médias inter e intraespecificas.
Divergência
intraespecífica
*
Divergência
congenérica *
Sequências
(Deep Sea +
Genbank)
Taxa
Distância
mínima (%)
Distância
média (%)
Distância
máxima (%)
172 (46 + 126)
58
0
3,87
37,88
130 (21 + 109)
45
0
0,61
2,63
148 (44 + 104)
24
7,36
20,25
31,77
100 (24 + 76)
17
7,36
20,10
31,77
TRR
5,23
32,95
*Encontra-se também, realçado a negrito, o mesmo calculo das distâncias nucleotídicas mas sem as ambiguidades taxonómicas
encontradas na árvore filogenética.
Foram criados histogramas da distribuição das frequências das distâncias K2P entre
pares de sequências para o conjunto global de espécies em análise (Deep Sea + GenBank) e
compararam-se os resultados sem (figura 3.3) e com (figura 3.4) remoção das incongruências
taxonómicas. Os resultados demonstram a ausência de barcoding gap (figura 3.3) com taxas de
divergência intra e interespecíficas mal delimitadas e sobrepostas. No caso da análise efetuada
excluindo as ambiguidades taxonómicas (figura 3.4) observou-se a ocorrência de um intervalo
(barcoding gap), substanciado numa divergência baixa e de distribuição estreita dentro da
espécie não sobreposta à distribuição entre espécies do mesmo género com distâncias
claramente superiores.
94
Freq. (%)
Capítulo 3
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839
Divergência nucleotídica (%)
Freq. (%)
Figura 3.3. Histograma da distribuição das distâncias nucleotídicas intra (a amarelo) e interespecificas congenéricas
(a vermelho) para o conjunto de poliquetas aqui analisado. Resultados demonstraram taxas de divergência intra (a
amarelo) e inter (a vermelho) específicas mal delimitadas e sobrepostas resultando na ausência da “barcoding gap”.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Divergência nucleotídica (%)
Figura 3.4. Histograma da distribuição das distâncias nucleotídicas intra (a amarelo) e interespecificas
congenéricas (a vermelho) para o conjunto de poliquetas aqui analisado, após remoção de ambiguidades
taxonómicas detetadas na árvore filogenética. Os resultados mostram uma distribuição estreita e não superior a 2%
das divergências dentro das espécies, não sobreposta com a distribuição das distâncias entre espécies
congenéricas, de valor muito superior, resultando na formação da “barcoding gap”.
95
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
3.3.3. Árvore filogenética nucleotídica de DNA barcodes
Através da análise da árvore NJ nucleotídica (figura F3, em anexo com os respetivos
MOTUs, versão colapsada na figura 3.5) é possível observar que das 85 espécies abordadas, 22
estão representadas por uma única sequência, impossibilitando análises adicionais. Entre as 63
espécies restantes, 73% agruparam-se em clados monofiléticos com baixa divergência (MOTUs
com <3% de divergência intraespecífica) correspondentes às respetivas morfo-espécies e
famílias, sendo as relações evolutivas entre os mesmos congruentes. As excepções a este
padrão, foram o caso dos clados correspondentes a Pterolysippe vanelli, Nicolea venustula,
Pareurythoe borealis, Sthenelais boa, Fimbriosthenelais zetlandica, Marphysa sanguinea,
Neoamphitrite robusta, Nereis pelágica, Eunoe oerstedi, Harmothoe rarispina, Leocrates
atlanticus, Harmothoe evei, Eunereis longissima, Poecilochaetus japonicus (figura 3.6)
e
Phyllodoce cf. madeirensis (figura 3.7). Entre os 66 DNA barcodes originais não publicados
correspondentes a 37 espécies, 16 espécies possuem apenas uma sequência impossibilitando
análises e conclusões adicionais (tabela 3.4), Nas restantes 21 espécies, 43% agruparam em
clados monofiléticos de baixa divergência, e 57% apresentaram ambiguidades taxonómicas.
Nas figuras 3.6 e 3.7 pode-se observar seções em destaque da árvore NJ, que realçam
em detalhe algumas das incongruências.
96
Capítulo 3
100
Nereis vexillosa
65
Allita virens
79
100
Nereididae
PGC00029 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
65
Nereis pelágica
83
100
19
CHEP0011 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Glycera southeastatlantica
100
81
54
1
Glycera dibranchiata
Glyceridae
Glycera tesselata
100
BLAST Arabella semimaculata - GenBank: AY838866.1| USA
65
82
BLAST Arabella iricolor - GenBank: GU362693.1| CHINA
Oenonidae
PGC00078 Tainokia sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Nereymira woodsholea
98
8
Nereymira punctata
100
1
Hesionidae
BLAST Leocrates chinensis - GenBank: DQ442565.1| FRANCE
51
75
Leocrates atlanticus
100
100 PGC00036 Fimbriosthenelais zetlandica| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
55
Sigalionidae
PGC00035 Sthenelais boa| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00016 Panthalis oerstedi| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY894321.1| USA
100
35
66
28
Acoetidae
Sigalionidae
Lepidasthenia sp.
Polynoidae
Lepidonotus squamatus
100
BLAST Lepidasthenia elegans - GenBank: JN852933.1| SWEDEN
49
100
Arctonoe vitatta
100
85
Arctonoe pulchra
Polynoidae
100
54 33
CHEP0005 Subadyte pellucida| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Lepidasthenia berkeleyae - GenBank: HM473443.1| CANADA
PGC00072 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
67
30
1
Polynoidae
PGC00027 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
63
84
Hesionidae
Harmathoe evei
PGC00034 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Harmathoe imbricata
39
BLAST Harmothoe fragilis - GenBank: HM473407.1| CANADA
44
100
Polynoidae
Eunoe oerstedi
46
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HM473428.1| CANADA
100
33
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024058.1| CANADA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024356.1| CANADA
64
100
Eunoe depressa
100
100
77
Prionospio steenstrupi
Prionospio sp.
0 32
100
100
Spionidae
Scolelepis sp.
93
Scolelepis squamata
100
4
PAS00002 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
55
100
49
Poecilochaetidae
Poecilochaetus japonicus (Poecilochaetidae)
Malacocerus fuliginosus (Spionidae)
100
13
PGC00039 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
100
77
Spionidae
100
Hyalionecia tubicola longibrachiata
Spionidae
91
tubicola|
ATLANTIC OCEAN
of Cadiz)locais
Onuphidae
Figura 3.5. Árvore
NJ de sequênciasPGC00049
COI deHyalinoecia
poliquetas
provenientes
de (Gulf
diversos
geográficos. Foi utilizado o
Nothria conchylega
modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap
com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a localização das
100
diferentes famílias.
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
99
2
83
48
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
PGC00077 Marphysa bellii| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
100
65
PBB00008 Eunice sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
40
83
97
Eunice norvegica
Eunice vittata
BLAST Eunice harassii - GenBank: GQ497535.1| USA
Eunicidae
93
Scolelepis squamata
100
PAS00002 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
4
55
100
Poecilochaetidae
Poecilochaetus japonicus (Poecilochaetidae)
Biblioteca de referência 49
de DNA barcodes para poliquetas
do mar
profundo
(Península Ibérica)
Malacocerus
fuliginosus
(Spionidae)
100
13
PGC00039 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Spionidae
Spionidae
100
Hyalionecia tubicola longibrachiata
100
77
91
PGC00049 Hyalinoecia tubicola| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Onuphidae
Nothria conchylega
100
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
99
2
83
48
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
PGC00077 Marphysa bellii| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Eunice norvegica
100
65
PBB00008 Eunice sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
40
Eunicidae
Eunice vittata
BLAST Eunice harassii - GenBank: GQ497535.1| USA
83
BLAST Eunice antarctica - GenBank: GQ497532.1| USA
66
100
7
Eunice pennata
99
Hermodice carunculata
100
72
67
Amphinomidae
BLAST Pareurythoe borealis - GenBank: JN086550.1| MEDITERRANEAN SEA
PGC00001 Pareurythoe borealis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Lumbrineris fragilis
61
10
52
PGC00011 Lumbrineris gracilis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PBB00004 Lumbrineridae| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
91
42
Lumbrineridae
Lumbrineris tetraura
49
Ninoe nigripes
100
PGC00012 Lumbrineridae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
Lumbrineridae
Praxillella affinis pacifica
32
30
PAS00012 Maldanidae| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
Maldanidae
Maldane sarci
100
100
Pista cristata
37
32
Pista maculata
15
Terebellidae
100
Nicolea zoostericola
100
CHEP0003 Nicolea venustula| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
69
42
PGC00044 Pterolysippe vanelli| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PBB00003 Polycirrus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
Ampharetidae
Terebellidae
Amphitrite cirrata
83
31
Terebellidae
PGC00045 Amphitrite cf. cirrata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100 PGC00047 Neoamphitrite| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
CHEP0010 Neoamphitrite affinis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
52
100
15
Polycirrus medusa
Terebellidae
100
Polycirrus eximius
62
21
CHEP0013 Polycirrus norvegicus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
20
Amphitrite figulus
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473492.1| CANADA
100
53
Neoamphitrite robusta
100
100
83
Natsushima bifurcata
Nautiliniellidae
100
Natsushima sp.
100
Vigthorniella ardabilia (Chrysopetalidae)
100
Ampharete labrops
100
89
100
50
Ampharete sp.
Ampharetidae
100
BLAST Eclysippe vanelli - GenBank: JX423766.1| NORWAY
100
89
97
Eumida notata
Eumida kelaino
100
100
95
42
100
OUTGROUP (Oligochaeta)
100
Phyllodoce medipapillata
Phyllodocidae
PAS00011 Phyllodoce madeirensis| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
Phyllodoce cf. madeirensis
100
0.05
Figura 3.5. Árvore NJ de sequências COI de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi utilizado o
modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a localização das
diferentes famílias (continuação).
98
Capítulo 3
Tabela 3.4. Espécies, cujas sequências COI foram desenvolvidas pelo grupo UA/CESAM, que agruparam em clados
monofiléticos com menos de 3% de divergência nucleótidica, espécies que evidenciaram incongruência taxonómicas
ou com uma só sequência (Singleton).
Espécime
Espécie
correspondente
PGC0029
CHEP0011
Eunereis longíssima
PGC00022
PGC00023
PGC00021
CHEP0009
PGC00078
PBB00005
PGC00075
PGC00026
PGC00074
PGC00025
PBB00006
PGC00027
PGC00036
PGC00035
PGC00016
PAS00007
PAS00008
PBB00002
CHEP0005
PGC00072
PAS00009
PGC00073
PGC00034
PGC00038
PGC00040
PGC00041
PGC00042
PGC00043
PGC00039
PAS00002
PAS00001
PAS00003
PBB00001
PGC00049
PGC00077
PGC00076
PBB00008
PGC00002
PGC00003
PBB00007
PBB00009
PBB00010
PGC00001
PGC00011
Glycera tesselata
MOTUs
(<3%)
Incongruências
taxonómicas
x
x
Tainokia sp.
x
Leocrates atlanticus
x
Fimbriosthenelais
zetlandica
Sthenelais boa
Panthalis oerstedi
Lepidasthenia sp.
Lepidasthenia cf.
brunnea
Subadyte pellucida
x
x
x
x
Harmathoe evei
Spionidae (espécie 1)
x
x
x
Spionidae (espécie 2)
Poecilochaetus
japonicus
x
Poecilochaetus sp.
Hyalinoecia tubicola
Marphysa bellii
Eunice norvegica
Eunice sp.
x
Eunice vittata
x
Eunice pennata
x
Pareurythoe borealis
Lumbrineris gracilis
Sequência
única
x
x
x
x
x
x
99
100 BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA
29
MOTU 38
Terebellidae
49 BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: HQ024409.1| CANADA
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU670826.1| RUSSIA
MOTU 39
100
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas
do mar profundo (Península Ibérica)
100 BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU672559.1| RUSSIA
66
100 CHEP0003 Nicolea venustula| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
39
Terebellidae
MOTU 40
PGC00044 Pterolysippe vanelli| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Ampharetidae
Tabela 3.4. Espécies, cujas sequências
COIPolycirrus
foram
grupo UA/CESAM, que agruparam
PBB00003
sp.| NEdesenvolvidas
ATLANTIC (Bay of Biscay)pelo
Terebellidae
agruparam em clados monofiléticos com
menos
de
3%
de
divergência
nucleótidica,
espécies que evidenciaram
BLAST
Amphitrite
cirrata
GenBank:
HQ024485.1|
CANADA
77
100 só
incongruência taxonómicas ou com uma
sequência
(Singleton)
(continuação).
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ023920.1| CANADA MOTU 41
29
cirrata| ATLANTIC OCEAN
(Gulf of Cadiz)
EspéciePGC00045 Amphitrite cf.MOTUs
Incongruências
MOTU 42
100 PGC00047 Neoamphitrite| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
correspondente
(<3%)
taxonómicas
Espécime
PGC00012
PBB00004
PAS00012
PAS00004
PAS00005
PAS00006
CHEP0003
PGC00044
PBB00003
PGC00045
PGC00047
CHEP0010
CHEP0013
PGC00071
PAS00011
PGC00030
PGC00031
PGC00032
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ932561.1| CANADA
82
Sequência
única
x
x
x
CHEP0010 Neoamphitrite affinis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Lumbrineridae (espécie
1)
BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672483.1| RUSSIA
Lumbrineridae100(espécie
2)
MOTU 43
BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672524.1| RUSSIA
Maldanidae
15
50
84 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024197.1| CANADA
Pista cristata
Terebellidae
x
100 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024199.1| CANADA
21 62
MOTU 44
BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024200.1| CANADA
Nicolea venustula
x
83 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023984.1| CANADA
Pterolysippe vanelli
19
100
Polycirrus sp.BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023970.1| CANADA MOTU 45
x
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023978.1| CANADA
Amphitrite cf. cirrata
x
100
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473492.1| CANADA
Neoamphitrite
sp.
BLAST
Neoamphitrite
robusta
GenBank:
HM473490.1|
CANADA
53
Neoamphitrite
affinis
x
MOTU 46
100 BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473491.1| CANADA
Polycirrus norvegicus
x
Natsushima bifurcata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100 PGC00071
Natsushima bifurcata
x
BLAST Natsushima bifurcata - GenBank: JF304492.1|ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
84
Phyllodoce madeirensis
x
CHEP0013 Polycirrus norvegicus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 47
BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304496.1| COSTA RICA
100
Phyllodoce cf. madeirensis
MOTU 48
x
100 BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304497.1| COSTA RICA
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555061.1| NE ATLANTIC
100 BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555064.1| NE ATLANTIC
MOTU 49 (Chrysopetalidae)
54 BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555059.1| NE ATLANTIC
64 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473292.1| CANADA
100 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473290.1| CANADA
48
MOTU 50
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473291.1| CANADA
88
Ampharetidae
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ024261.1| CANADA
100
MOTU 51
100 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
BLAST Eclysippe vanelli - GenBank: JX423766.1| NORWAY
75 BLAST Eumida notata - GenBank: HM358713.1| PORTUGAL (Madeira)
100 BLAST Eumida notata - GenBank: HM358712.1| PORTUGAL (Madeira)
98
MOTU 52
BLAST Eumida notata - GenBank: HM358708.1| SWEDEN
89
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358686.1| SWEDEN
100
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358690.1| SWEDEN
MOTU 53
79 BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358688.1| SWEDEN
91 BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473581.1| CANADA
100
100 BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473577.1| CANADA
Phyllodocidae
MOTU 54
BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473582.1| CANADA
PAS00011 Phyllodoce madeirensis| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
95
PGC00032 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
42
100
PGC00030 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 55
100 PGC00031 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
OUTGROUP (Oligochaeta)
100
Figura 3.6. Parte da árvore NJ de sequências COI de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos com
detalhe na família 0.05
Phyllodocidae. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000
replicações. As linhas laterais mostram a localização das diferentes famílias e os MOTUs representam grupos
monofiléticos com <3% de divergência intraespecífica. Realçado a azul, são as sequências COI do projecto de
Marina R. Cunha e Ascenção Ravara.
100
Nautiliniellidae
100 BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473740.1| USA
100
MOTU 17
Polynoidae
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473743.1| USA
46
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HQ024019.1| CANADA
34
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HM473428.1| CANADA
100
Capítulo 3
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024058.1| CANADA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024356.1| CANADA
65
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473732.1| USA
99
100 BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473733.1| USA
MOTU 18
68 BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473731.1| USA
31 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672273.1| CANADA
100 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672268.1| CANADA
MOTU 19
BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672264.1| CANADA
77
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212789.1| EASTERN MEDITERRANEAN
100 BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212792.1| EASTERN MEDITERRANEAN
MOTU 20
57 BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212788.1| EASTERN MEDITERRANEAN
32
Spionidae
63 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672370.1| CANADA
100 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672153.1| CANADA
1
MOTU 21
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672198.1| CANADA
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
95
100
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
MOTU 22
99 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473679.1| CANADA
41 PGC00041 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
4
31 PGC00038 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100 PGC00040 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 23
Spionidae
PGC00043 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
34 PGC00042 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00039 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PAS00002 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
12
Poecilochaetidae
98 PAS00001 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
100
54
PBB00001 Poecilochaetus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
MOTU 24 (Poecilochaetidae)
PAS00003 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432012.1| GERMANY
48
100
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432015.1| GERMANY
MOTU 25 (Spionidae)
48 BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432014.1| GERMANY
81
100
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219838.1| NEW ZEALAND
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219804.1| NEW ZEALAND
MOTU 26
76 árvore NJ de
Figura 3.7. Parte da
sequências
COI
de poliquetas
provenientes
BLAST
Hyalinoecia tubicola
longibranchiata
- GenBank: JX219817.1|
NEW ZEALANDde diversos locais geográficos
com detalhe nas famílias
SpionidaePGC00049
e Poecilochetidae.
Foi OCEAN
utilizado
o modelo de evoluçãoOnuphidae
K2P e o teste de
Hyalinoecia tubicola| ATLANTIC
(Gulf of Cadiz)
92
Bootstrap com3 1000 replicações. As linhas
laterais
a localização
das diferentes famílias e os MOTUs
BLAST Nothria
conchylegamostram
- GenBank: HM473514.1|
CANADA
BLAST
Nothria
- GenBank: HM473519.1|
CANADA MOTU
27
representam grupos monofiléticos com
<3%
deconchylega
divergência
intraespecífica.
Realçado
a azul, são as sequências
100
Nothria conchylega
- GenBank: HM473517.1| CANADA
COI do projecto de Marina R. Cunha 54e BLAST
Ascenção
Ravara.
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
99
49
83
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
PGC00077 Marphysa bellii| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00076 Eunice norvegica|ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
MOTU 28
100
64
BLAST Eunice norvegica - GenBank: GQ497541.1| USA
PBB00008 Eunice sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
3.3.4. Árvore filogenética100aminoacídica
de OCEAN
DNA(GulfBarcodes
PGC00003 Eunice vittata| ATLANTIC
of Cadiz)
Eunicidae
40
MOTU 29
PGC00002 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Eunice harassii - GenBank: GQ497535.1| USA
82
BLAST Eunice
- GenBank: GQ497532.1|
USA
A figura 3.8 apresenta
a árvore
NJ antarctica
em radiação
baseada
nas sequências aminoacídicas
68
PBB00007 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
PBB00009 Eunice pennata|juntamente
NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
coloridas de acordo com a ordem98 taxonómica,
com a numeração indicativa das
MOTU 30
68
PBB00010 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
Hermodice carunculata
- GenBank: KC017577.1| ATLANTIC
respetivas famílias. Observaram-se
descrepâncias
com OCEAN
muitas famílias a não formarem
91 BLASTalgumas
8
100
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017550.1| ATLANTIC OCEAN
MOTU 31
73
grupos coesos, dispersando-se
dentro
da mesma
ordemSAOtaxonómica
das ordens
BLAST
Hermodice carunculata
- GenBank: KC017598.1|
TOME AND PRINCIPE com exceção
Amphinomidae
68
BLAST Pareurythoe borealis - GenBank: JN086550.1| MEDITERRANEAN SEA
Capitellida e Amphinomida. A maioria
incongruências
deveu-se
a exceções correspondentes
PGC00001das
Pareurythoe
borealis| ATLANTIC OCEAN (Gulf
of Cadiz)
98 BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: GU672570.1| RUSSIA
a ordens representadas por uma
única
são exemplo
as ordens Spionida,
100 BLAST
Lumbrineris família,
fragilis - GenBank: como
HQ023882.1| CANADA
MOTU 32
60
12
BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: GU672337.1| CANADA
Terebellida e Eunicida.
A figura F4
(em anexo) apresenta a mesma árvore em formato de
53
PGC00011 Lumbrineris gracilis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
cladrograma.
PBB00004 Lumbrineridae| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
Lumbrineridae
100 BLASY Lumbrineris tetraura - GenBank: GU362689.1| CHINA
92
MOTU 33
BLAST Lumbrineris tetraura - GenBank: EU352318.1| CHINA
50
40
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024127.1| CANADA
100 BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024159.1| CANADA
MOTU 34
60 BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024144.1| CANADA
PGC00012 Lumbrineridae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Lumbrineridae
101
60 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
100 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473651.1| CANADA
32
29
MOTU 35
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
PAS00012 Maldanidae| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672597.1| RUSSIA
Maldanidae
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
1 - Acoetidae
11 - Glyceridae
2 - Polynoidae
12 - Phyllodocidae
3 - Sigalionidae
13 - Ampharetidae
4 - Nereididae
14 - Chrysopetalidae
5 - Hesionidae
15 - Nautiliniellidae
6 - Oenonidae
16 - Maldanidae
7 - Lumbrineridae
17 - Terebellidae
8 - Spionidae
18 - Onuphidae
9 - Poecilochaetidae
19 - Eunicidae
14
15
10 - Amphinomidae
13
8
10
11
12
7
8
9
16
7
Ordem Phyllodocida
6
5
Ordem Amphinomida
4
17
2
1
18
Ordem Capittelida
2
3
Ordem Spionida
Ordem Eunicida
19
Ordem Terebellida
OUTGROUP (Oligochaeta)
0.05
Figura 3.8. Árvore NJ em radiação de sequências COI traduzidas (aminoácidos) obtidas a partir de 200 espécimes
de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. As cores correspondem às ordens e a numeração às
famílias. Foi utilizado o modelo de evolução Jones-Taylor-Thornton (JTT) e o teste de Bootstrap com 1000
replicações.
3.3.5. Sistema BIN (Barcode Index Number)
Na tabela 3.5 pode-se encontrar um resumo com o número de BINs e dos registos
taxonómicamente concordantes, discordantes e de BINs com apenas um membro (Singletons,
BINs com apenas um membro). Nas tabelas 3.6, 3.7 e 3.8 estão listados os espécimes que
102
Capítulo 3
pertencem a BINs concordantes, discordantes e singletons, respetivamente. Entre os 11 BINs
concordantes, apenas 3 incluem sequências externas a esta tese, enquanto nos 4 BINs
discordantes, 3 integram apenas sequências deste estudo.
Tabela 3.5. Resumo do número de BINs e registos taxonomicamente concordantes, discordantes e BINs com
apenas um membro (Singletons). Em 66 registos, 66 tiveram a atribuição de um BIN, representando um total de 38
BINs.
N.º BINs
N.º Registos
Taxonomicamente concordantes:
11
34
Taxonomicamente discordantes:
4
9
Singletons:
23
23
Tabela 3.6. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonomicamente concordantes. Pode-se observar
também o número de membros e a distância máxima (p-dist) dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a
distância nucleótídica (p-dist) até ao membro do BIN mais próximo.
Espécimes
Identificação
morfológica
PBB00002
Lepidasthenia cf. brunnea
PAS00008
Lepidasthenia sp
PAS00007
Lepidasthenia sp
PAS00004
Pista cristata
PAS00005
Pista cristata
PAS00006
Pista cristata
PGC00073
Harmothoe evei
PAS00009
Harmothoe evei
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
Distância ao membro do
BIN mais próximo
BOLD:AAZ1167
(0%)
3
Polynoidae
18.65%
BOLD:AAY9740
(1.99%)
4
BOLD:AAY9841
(0.31%)
2
Loimia bermudensis
18.33%
Harmothoe evei
13.16%
103
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
Tabela 3.6. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonomicamente concordantes. Pode-se observar
também o número de membros e a distância máxima (p-dist) dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a
distância nucleótídica (p-dist) até ao membro do BIN mais próximo (continuação).
Espécimes
Identificação
morfológica
PAS00003
Poecilochaetus japonicus
PAS00001
Poecilochaetus japonicus
PBB00001
Poecilochaetus sp.
PGC00003
Eunice vittata
PGC00002
Eunice vittata
PGC00022
Glycera tesselata
PGC00021
Glycera tesselata
PGC00023
Glycera tesselata
CHEP0009
Glycera tesselata
PGC00074
Leocrates atlanticus
PGC00075
Leocrates atlanticus
PGC00026
Leocrates atlanticus
PGC00025
Leocrates atlanticus
PBB00006
Leocrates atlanticus
CHEP0001
Leocrates atlanticus
PBB00005
Leocrates atlanticus
PBB00011
Leocrates atlanticus
PGC00031
Phyllodoce cf. madeirensis
PGC00030
Phyllodoce cf. madeirensis
PGC00049
Hyalinoecia tubicola
104
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
Distância ao membro do
BIN mais próximo
BOLD:AAZ0009
(1.13%)
3
Spionidae
17.82%
BOLD:AAZ1158
(0.17%)
2
BOLD:AAY0666
(0.63%)
4
Glyceridae
11.72%
BOLD:AAX5533
(0.64%)
8
Hesionidae
18.71%
BOLD:AAZ0051
(0%(
2
Phyllodoce cf. madeirensis
4.84%
BOLD:AAZ1192
(0.15%)
4
Eunice americana
20.11%
Hyalinoecia sp.
15.13%
Capítulo 3
Tabela 3.6. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonomicamente concordantes. Pode-se observar
também o número de membros e a distância máxima (p-dist) dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a
distância nucleótídica (p-dist) até ao membro do BIN mais próximo (continuação).
Espécimes
Identificação
morfológica
PGC00040
Spionidae
PGC00042
Spionidae
PGC00038
Spionidae
PGC00041
Spionidae
PGC00043
Spionidae
PGC00071
Natsushima bifurcata
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
Distância ao membro do
BIN mais próximo
BOLD:AAZ0828
(0.31%)
5
Spionidae
15.25%
BOLD:AAZ1431
(0.32%)
2
Natsushima sp. MTA-2011
11.23%
Tabela 3.7. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs taxonomicamente discordantes com indicação do nivel
taxonómico em que a incongruência ocorre. Pode-se observar também o número de membros e a distância máxima
dos mesmos dentro de cada BIN, assim como a distância nucleótídica até ao membro do BIN mais próximo.
Espécimes
Identificação
morfológica
CHEP0003
Nicolea venustula
PGC00044
Pterolysippe
vanelli
PGC00045
Amphitrite cf.
cirrata
PGC00047
Neoamphitrite sp.
PGC00036
Fimbriosthenelais
zetlandica
PGC00035
Sthenelais boa
PBB00010
Eunice pennata
PBB00009
Eunice pennata
PBB00007
Eunice pennata
BIN
(Distância
máxima)
Membros
totais por
BIN
Nível do
conflito
taxonómico
Distância ao
membro do BIN
mais próximo
BOLD:AAX647
1
(0%)
2
Família:
Ampharetidae [1],
Terebellidae [1]
Terebellidae
16.78%
BOLD:AAZ063
1
(0%)
2
BOLD:AAZ089
7
(0.32%)
BOLD:AAY350
0
(2.32%)
Gènero:
Neoamphitrite [1],
Amphitrite [1]
Género:
2
Sthenelais [1],
Fimbriosthenelais
Onuphis
pseudoiridescens
15.24%
Polynoe sp.
19.52%
[1]
Espécie:
4
Eunice pennata
[3], Eunice
antarctica [1]
Eunice americana
16.67%
105
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
Tabela 3.8. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs com apenas um membro (Singletons). Pode-se observar
também a distância nucleótídica até ao membro do BIN mais próximo.
Espécimes
Identificação
morfológica
BIN
Distância ao membro
do BIN mais próximo
PGC00012
Lumbrineridae
BOLD:AAZ1566
PBB00004
Lumbrineridae
BOLD:ACI3757
Lumbrineridae
18.46%
PAS00012
Maldanidae
BOLD:AAZ0723
Maldanidae
9.77%
PGC00039
Spionidae
BOLD:AAZ0829
Spionidae
15.41%
PGC00076
Eunice norvegica
BOLD:AAZ1157
PGC00029
Eunereis longissima
BOLD:AAZ1159
CHEP0011
Eunereis longissima
BOLD:AAY3565
Metaphire sp.
20.32%
Eunice norvegica
2.25%
Nereis elitoralis
10.1%
Simplisetia cf.
erythraensis DH1
16.92%
Polynoidae
13.32%
PGC00072
Harmothoe evei
BOLD:AAY9840
PGC00034
Harmothoe evei
BOLD:AAY9839
PGC00027
Leocrates atlanticus
BOLD:AAY9695
PGC00011
Lumbrineris gracilis
BOLD:AAZ1565
PGC00016
Panthalis oerstedi
BOLD:ACG5400
PGC00001
Pareurythoe borealis
BOLD:AAZ1399
PGC00032
Phyllodoce cf.
madeirensis
BOLD:AAZ0052
Phyllodoce cf.
madeirensis
BOLD:AAZ1549
Phyllodoce cf.
madeirensis
PAS00011
Phyllodoce madeirensis
Malmgreniella sp.
12.89%
Harmothoe evei
13.96%
Lumbrineridae
16.58%
Ophelina sp.
20.22%
Chloeia pinnata
16.92%
4.84%
12.46%
106
PAS00002
Poecilochaetus japonicus
BOLD:AAZ0010
PBB00008
Eunice sp.
BOLD:ACI3672
CHEP0010
Neoamphitrite affinis
BOLD:AAX6153
PGC00077
Marphysa bellii
BOLD:ACI3688
CHEP0013
Polycirrus norvegicus
BOLD:AAY2865
Poecilochaetus serpens
18.3%
Eunice norvegica
10.27%
Polycirrus sp.
16.85%
Marphysa regalis
17.74%
Polycirrus eximius
17.66%
Capítulo 3
Tabela 3.8. Tabela cujos espécimes agruparam em BINs com apenas um membro (Singletons). Pode-se observar
também a distância nucleótídica até ao membro do BIN mais próximo (continuação)
Espécimes
Identificação
morfológica
BIN
PBB00003
Polycirrus sp.
BOLD:ACI3835
CHEP0005
Subadyte pellucida
BOLD:AAW1704
PGC00078
Tainokia sp.
BOLD:ACI3694
Distância ao membro
do BIN mais próximo
Amaeana occidentalis
16.85%
Polynoe sp.
15%
Arabella semimaculata
16.05%
3.3.6. Sistema de classificação
Após análise das comparações com sequências similares de COI-5P presentes em bases
de dados públicas (BOLD e GenBank), atribuíram-se 5 níveis de fiabilidade taxonómica aos DNA
barcodes (Costa et al., 2012) correspondentes a 23 espécies de poliquetas do projecto “Deep
Sea Polychaetes” aqui analisadas, de acordo com os critérios sumarizados na secção 2.2.5.4 do
Freq. (%)
capítulo 2 desta tese.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
A
B
C
D
E
Nível taxonómico
Figura 3.9. Representação gráfica da classificação atribuída aos DNA Barcodes pertencentes a 23 espécies
presentes no projecto da BOLD de Marina R. Cunha e Ascensão Ravara, pelos diferentes níveis de qualidade do
sistema de fiabilidade taxonómica proposto por Costa et al., 2012. Níveis: A-Concordância externa; B-Concordância
interna; C-Concordância sub-óptima; D-Dados insuficientes; E-DNA barcodes discordantes.
107
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
Verificou-se que em 13% dos DNA barcodes das espécies analisadas neste trabalho
possuem um grau de fiabilidade elevado da identificação taxonómica (níveis A+B), enquanto as
restantes 87%, possuem dados insuficientes ou DNA barcodes incongruentes (D+E) (figura 3.9 e
tabela 3.9). Neste conjunto de dados não foram encontradas espécies com divergências intraespecíficas comparativamente elevadas (nível C).
Tabela 3.9. Atribuição das classificações de fiabilidade taxonómica (A a E) aos DNA Barcodes correspondentes a 23
espécies de poliquetas do mar profundo de acordo com o sistema de classificação proposto por Costa et al (2012).
108
Espécie
Classificação
Fimbriosthenelais zetlandica
D
Hyalinoecia tubicola
A
Neoamphitrite affinis
D
Nicolea venustula
D
Pterolysippe vanelli
D
Panthalis oerstedi
D
Phyllodoce madeirensis
D
Subadyte pellucida
D
Eunice pennata
E
Marphysa bellii
D
Sthenelais boa
D
Eunereis longissima
D
Glycera tesselata
B
Leocrates atlanticus
E
Harmothoe evei
E
Poecilochaetus japonicus
E
Eunice norvegica
D
Eunice vittata
D
Pareurythoe borealis
D
Lumbrineris gracilis
D
Pista Cristata
A
Polycirrus norvegicus
D
Natsushima bifurcata
D
Capítulo 3
3.4. Discussão
3.4.1. Performance dos DNA barcodes na diferenciação de espécies de
poliquetas
De acordo com a árvore NJ nucleotídica obtida neste estudo (Figura F3, em anexo), e à
semelhança do observado no capítulo 2, é possivel identificar fácilmente padrões de organização
dos espécimes em clados coincidentes com níveis taxonómicos inferiores, como a espécie e
género. Também se observou em diversos casos o agrupamento de espécimes a partilha de um
ancestral comum situado a niveis taxonómicos mais profundos como a família ou mesmo a
ordem, como se observa na árvore NJ de aminoácidos em radiação (figura 3.8). No entanto, ao
contrário do observado nos poliquetas de estuário, observou-se algumas discrepâncias num
grande número de famílias que não formaram grupos monofiléticos com excepção das ordens
Capitellida e Amphinomida. Estas duas ordens são as que possuem um menor número de
membros representados, pertencentes apenas a uma família, o que poderá justificar também
essa situação. Os membros da ordem Phyllodocida dividiram-se em três clados a partir de
ancestrais distintos, com as famílias Chrysopetalidae e Nautiliniellidae a distanciarem-se
bastante, agrupando-se num quarto clado com mais de 41% de divergência aminoacídica em
relação aos restantes membros da mesma ordem. Facto curioso, é que os três primeiros clados
observados correspondem grosso modo à subdivisão em subordens dos Phyllodocida:
Aphroditiformia (Acoetidae, Polynoidae, Sigalionidae), Nereidiformia (Nereididae, Hesionidae) e
Phyllodociformia (Phyllodocidae) aparecendo juntamente com os Glyceriformia (Glyceridae).
Excepção à regra foi mesmo a família Chrysopetalidae que também pertence à subordem
Nereidiformia. Estes casos são um exemplo de alguma capacidade das sequências de aminoácidos de reconstrução de filogenias mais profundas, ao nível da ordem e outros grau da
hierarquia taxonómica adjacentes. A ordem Spionida, representada apenas pela famíla
Spionidae, dividiu-se em dois clados distintos assemelhando-se aos dados observados na árvore
NJ nucleotídica. A ordem Eunicida repartiu-se em três clados com a família Oenonidae e
Lumbrineridae a possuirem uma enorme distância em termos de aminoacidos em relação ás
restantes famílias da mesma ordem. De notar que um membro de uma espécie da família
Lumbrineridae [espécime Lumbrineridae (PGC00012)] agrupou junto da família Oenonidae
possuindo mais de 13% de distância aminoacídica em relação aos restantes elementos da
mesma família e apenas 6,35% em relação aos membros da família Oenonidae. Tendo em conta
109
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
a grande semelhança morfológica entre estas duas famílias, uma determinação mais atenta do
referido espécime (o qual foi identificado apenas ao nível de família) poderá eventualmente
reposicioná-lo na família Oenonidae. Por último, a ordem Terebellida encontra-se separada em
dois clados derivados de ancestrais distintos, e representados pelas famílias Ampharetidae e
Terebellidae com 20,98% de distância aminoacídica entre ambas. A árvore filógenética de
sequências COI traduzidas (aminoácidos) em cladograma da figura F4 em anexo, permite
confirmar que grande parte das susbstituições nucleóticas ocorrem são sinónimas, uma vez que
um grande número de espécies próximas, facilmente distinguíveis pelas sequências
nucleotídicas são idênticas nas sequências amino-acídicas.
Considerando não só as análises de divergência nucleotídicas, mas também a árvore NJ
nucleótidica, todos os indicadores apresentados confirmam a capacidade do COI em demarcar e
diferenciar os níveis taxonómicos de espécie e género. A confirmação dessa afirmação pode ser
feita através da ocorrência de grupos monofiléticos com <3% divergência (MOTUs), englobando
todos os espécimes de de cada morfo-espécie, não havendo sobreposição em 73% dos casos. O
nível de resolução de espécies observado (TRR cerca de 30x, tabela 3.3), está dentro da gama
observada em outros grupos animais (Costa et al., 2009; Hebert et al., 2003). As divergências
intra e interespecíficas congenéricas observadas neste capítulo estão também dentro da gama
de variação reportada em outros estudos de DNA barcodes de poliquetas [0,35% e 16,8%,
respetivamente no estudo de Carr et al. (2011) com as diferenças dentro do género a serem
ligeiramernte superiores neste estudo (20,1%)]. Através desta ferramenta foi possível a deteção
de ambiguidades taxonómicas, que tendo em conta a enorme dificuldade na identificação
taxonómica com base na morfologia nesta classe, muito provavelmente não seriam detetadas
sem estes dados moleculares (Bortolus, 2008; Hebert et al., 2003), à semelhança do que
aconteceu no capítulo 2 com os poliquetas de estuário. O gráfico da figura 3.3 da seção dos
resultados, referente às divergências nucleotídicas intra e interespecíficas médias nos géneros
abordados (que incluía as sequências que demonstravam ambiguidades taxonómicas),
demonstrou isso mesmo com taxas de divergência intra e interespecíficas mal delimitadas e
sobrepostas resultando na ausência da “barcoding gap” que auxiliado pela árvore NJ
nucleótidica, sinaliza a necessidade de uma revisão taxonómica em muitas das morfo-espécies e
DNA barcodes aqui examinados.
Em relação às 37 espécies, correspondentes aos 66 DNA barcodes originais (Deep Sea)
integrados neste estudo, 16 possuíam uma só sequência, facto que, tal como no capítulo 2,
110
Capítulo 3
demonstra a fase incipiente desta biblioteca de sequências COI para estes organismos. Neste
conjunto de espécies foram encontradas incongruências entre as identificações morfológicas e
os DNA barcodes obtidos em 12 das mesmas (tabela 3.4). Entre estas é exemplo o poliqueta
Phyllodoce madeirensis (espécime: PAS00011) que apesar de formar um grupo monofilético
[Phyllodoce cf. madeirensis (PGC00031, PGC00030, PGC00032)], apresenta divergências
superiores a 3% entre os seus espécimes. Devido ao atual estado de incerteza no estatuto destas
espécies e conhecidas dificuldades no seu diagnóstico, a potencial ocorrência de ambiguidades
na comparação com a informação molecular já seria de certo modo antecipada. Os espécimes
PGC00031 e PGC00030 agruparam no MOTU 55 (figura 3.6), em contraste com o espécime
PAS00011 (Phyllodoce madeirensis) cujo DNA barcode se diferencia em mais de 13%, sugerindo
tratar-se de espécie distinta, tal como o espécime PGC00032 da mesma espécie que apresentou
uma distância nucleotídica de 5,13% ao MOTU 55 (Hebert et al., 2003a; Hebert et al., 2003b).
Devido ao baixo número de sequências disponíveis, não é possivel concluir mais sobre a
potencial diversidade oculta dentro desta morfo-espécie. Olhando para as distâncias em termos
de aminoácidos, estes espécimes possuem todos menos de 2% de divergência, confirmando a
sua proximidade filogenética.
No caso das espécies Nicolea venustula (espécime: CHEP0003) e Pterolysippe vanelli
(espécime: PGC00044) encontrados no MOTU 40, apresentaram um conflito taxonómico ao
nível da família (Terebellidae e Ampharetidae respetivamente). Após pesquisa no WoRMS
(http://www.marinespecies.org/), descobriu-se que a sequência do GenBank pertencente à
espécie Eclysippe vanelli (Ampharetidae), que foi utilizada na construção da árvore NJ, era um
sinónimo não aceite da espécie Pterolysippe vanelli, agrupando esta última num clado
correspondente à família Ampharetidae junto com outras espécies da mesma família (MOTU 50
e 51) sugerindo que o erro na identificação taxonómica possa estar no espécime PGC00044
(Pterolysippe vanelli), que agrupou em clados relacionados com a família Terebellidae.
Estes 66 DNA barcodes foram também sujeitos a uma análise pelo sistema BIN,
observando-se um número elevado de Singletons (60,53%) e um reduzido número de sequências
pertencentes a outros estudos dentro dos BINs concordantes (tabela 3.6) e discordantes (tabela
3.7) assim como um baixo número de sequências dentro dos respetivos BINs realçando uma vez
mais a fase incipiente em que este projeto para a construção de uma biblioteca de referência de
DNA barcodes para poliquetas do mar profundo se encontra. Apenas 10,53% dos BINs,
correspondentes às espécies Eunice pennata, Pista cristata, Hyalinoecia tubicola e Natsushima
111
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
bifurcata, possuíam sequências externas em relação aos DNA barcodes em estudo neste
capítulo, sendo que o BIN pertencente à espécie Eunice pennata é discordante, havendo conflito
com a espécie Eunice antartica.
Dentro dos BINs discordantes encontram-se incongruências ao nível da espécie, género e
até mesmo ao nível da família. Pode-se observar também que muitos espécimes identificados
para a mesma espécie foram atríbuídos diferentes BINs, como é o caso das espécies Harmathoe
evei, Leocrates atlanticus, Eunereis longíssima, Phyllodoce cf. madeirensis e Poecilochaetus
japonicus. No caso dos nove espécimes identificados como Leocrates atlanticus, oito
(PGC00074, PGC00075, PGC00026, PGC00025, PBB00006, CHEP0001, PBB00005,
PBB00011) agruparam no MOTU 9, com apenas um (PGC00027) a sair deste padrão,
aparecendo no meio do clado da família Polynoidae e com um BIN próprio. Este resultado,
dificilmente explicável por razões evolutivas, sugere a ocorrência de uma falha operacional por
contaminação cruzada de amostras ou erro de etiquetagem.
3.4.2.Classificação das sequências COI
Após análise das classificações dos DNA barcodes de acordo com o seu grau de
consistência taxonómica, verificou-se que apenas 8,7% dos DNA barcodes foram congruentes
externamente (nível A). Contudo, este valor aparentemente baixo resulta em grande parte
número reduzido de espécimes observado por espécie, e não da ocorrência de um elevado grau
de incerteza taxonómica. De facto, os DNA barcodes de cerca de 70% das espécies foram
inerentemente classificadas com grau nível D, devido ao pequeno número de sequências
disponíveis (< 3). Neste contexto de número insuficiente de sequências, a proporção relativa de
DNA barcodes dos vários graus A a E presentes na biblioteca é apenas provisória, e sofrerá
grande alteração à medida que novas sequências forem obtidas e os DNA barcodes de grau D
forem reclassificados num dos restantes graus. Em acréscimo, os DNA barcodes cuja
classificação foi de nível B (4,3%) poderão ser re-classificados para nivel A caso sejam
disponibilizadas sequências correspondentes obtidas por outros investigadores, ou então
despromovidos ao nível E caso se venha a provar uma identificação taxonómica incorreta em
comparação com outros estudos. Nenhum dos DNA barcodes demonstrou uma elevada
divergência intraespecífica que justificasse a atribuição do nível C, com excepção dos espécimes
112
Capítulo 3
identificados como Phillodoce cf. madeirensis. No entanto, como neste caso a identificação
original é reportadamente dúbia (cf.), optou-se por excluir essas sequências nos resultados da
tabela 3.9. Finalmente, os resultados presentes, apesar de baseados num reduzido de
sequências, permitiram desde já detetar incongruências em 17,4% das espécies (nível E),
motivando assim a verificação das identificações e, se esta for insuficiente, a análise
pormenorizada de cada incongruência com recurso a diversas fontes de evidência.
113
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
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116
Capítulo 3
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117
Biblioteca de referência de DNA barcodes para poliquetas do mar profundo (Península Ibérica)
polychaete communities in Qingdao, China. Chinese Journal of Oceanology and
Limnology 28: 899-910.
118
Capítulo 4
Conclusão geral
Capítulo 4
A abordagem DNA barcoding providência uma ferramenta eficiente para avaliações
rápidas na riqueza de espécies, em grupos onde muitas espécies ainda aguardam descrição.
Este estudo contribui para confirmar a utilidade desta abordagem molecular na deteção de
potenciais espécies ocultas, como é o caso do possivel complexo de espécies crípticas de
Hediste diversicolor e outros aqui tratados, criando ao mesmo tempo um suporte taxonómico
detalhado que contribuirá positivamente em futuras investigações taxonómicas. Particulamente
importante é a deteção de incorreções taxonómicas nas identificações morfológicas originais
que, na ausência de de qualquer sistema de verificação alternativo, molecular ou outro, são
suscetiveis de serem ignoradas e se perpetuarem nos estudos futuros. Na nossa opinião uma
biblioteca de referência de DNA barcodes universal irá, sem dúvida, revitalizar a ciência da
taxonomia e transportá-lo a um novo nível de influência, quer na arena científica global, quer na
maneira que se traduz em serviços para a sociedade, proporcionando aos taxonomistas uma
lingua franca, na qual podem descrever, discutir e delinear espécies e as fronteiras entre as
mesmas.
Os dados desta tese sinalizaram o estado ainda muito incipiente das bibliotecas de
referência de DNA barcodes, quer para os poliquetas de estuário, quer para os de mar profundo.
A análise à fiabilidade taxonómica das 44 espécies de poliquetas (mar profundo e de estuário)
cujas sequências COI possuíam uma identificação taxonómica até nível de espécie, revelou a
necessidade de uma revisão taxonómica a 16% destas, não havendo quaisquer dados de
comparação para 52% das mesmas. Nas 32% espécies restantes apenas 5 tinham suporte de
comparação com estudos externos a este trabalho, sendo portanto necessário a aquisição de
mais dados moleculares sobre certas espécies de modo a que se possa fazer uma análise mais
profunda à qualidade dos DNA Barcodes aqui analisados. Ficou também aqui evidenciada a
necessidade de recorrer a um leque variado de primers para amplificar DNA barcodes e
comunidades diversas de poliquetas, já que o sucesso da amplificação alterna entre diferentes
tipos de primers, dependendo do género/espécie do poliqueta sob análise. Finalmente, ressalta
ainda a utilidade da implementação de um sistema de classificação dos DNA barcodes em
bibliotecas de referência, como por exemplo o sistema proposto por Costa et al. (2012), pois
permite o refinamento contínuo em linha com o aumento da disponibilidade de dados públicos e
da natureza iterativa das evidências taxonómicas. No entanto, a utilidade de um sistema de
classificação tal como o proposto, poderá tornar-se eficaz apenas se for globalmente
implementado. Em relação à estrutura final de um sistema de classificação comparativo e
121
Conclusão geral
padronizado, é necessário que a respetiva utilidade e acessibilidade a dados de DNA barcodes
de referência seja feita através de uma comunidade diversificada de utilizadores.
Num futuro não muito distante, graças a estudos como o desta tese, será possivel utilizar
os poliquetas de estuário em conjunto com bibliotecas de outros organismos bentónicos, em
estudos de biomonitorização de grande escala com recurso a técnicas de sequenciação de alto
débito, como a sequenciação de segunda geração, ou então facilitar a identificação e descrição
de comunidades de organismos pouco conhecidas, como os poliquetas de mar profundo. Para
tal, é necessário um maior investimento e esforço na aquisição de um maior número de
sequências COI para esta classe de anelídeos para que se possa fazer as respetivas
comparações morfológicas e moleculares de modo a validar uma biblioteca de referência de
DNA barcodes que ainda se encontra numa fase de desenvolvimento algo incipiente.
122
Anexos
Anexo/Tabela T1. Pequena checklist de poliquetas estuarinas portugueses, feita através da consulta de bibliografia
disponível ao público.
Famílias
Espécies
Locais
Referências
Amage adspersa (Grube,
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Mondego
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
Estuário do Guadiana
Estuário do Douro
Estuário de Alvor
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuário do Guadiana
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Chainho et al., 2006
Rodrigues et al., 2006
Nunes et al., 2008
Condea et al., 2013
Mucha et al., 2005
Carpenter, 2004
Nunes et al., 2008
Amaral & Costa., 1999
Condea et al., 2013
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Tejo
Estuário do Guadiana
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Salgado et al., 2007
Condea et al., 2013
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Guadiana
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
Estuário do Mondego
Estuário do Tejo
Ria Formosa
Estuário do Tejo
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Condea et al., 2013
Rodrigues et al., 2006
Nunes et al., 2008
Chainho et al., 2006
Rodrigues et al., 2006
Gamito, 2006
Rodrigues et al., 2006
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Salas et al., 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Tejo
Estuário do Guadiana
Silva et al., 2006
Condea et al., 2013
Estuário do Tejo
Silva et al., 2006
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
1863)
Amage gallasii Marion, 1875
Alkmaria romijni Horst, 1919
Ampharetidae
Melinna palmata Grube,
1870
Paraonidae
Paradoneis lyra (Southern,
1914)
Capitella capitata (Fabricius,
1780)
Capitella minima Langerhans,
1881
Heteromastus filiformis
Capitellidae
(Claparède, 1864)
Mediomastus fragilis
Rasmussen, 1973
Notomastus latericeus Sars,
1851
Mediomastus fragilis
Rasmussen, 1973
Notomastus latericeus Sars,
1851
Chaetozone setosa
Malmgren, 1867
Cirriformia tentaculata
(Montagu, 1808)
Chaetozone caputesocis
Cirratulidae
(Saint-Joseph, 1894)
Cirratulus cirratus (O. F.
Müller, 1776)
Aphelochaeta marioni (SaintJoseph, 1894)
Caulleriella alata (Southern,
1914)
Caulleriella bioculata
(Keferstein, 1862)
125
Anexo/Tabela T1. Pequena checklist de poliquetas estuarinas portugueses, feita através da consulta de bibliografia
disponível ao público (continuação).
Famílias
Espécies
Websterinereis glauca
(Claparède, 1870)
Alitta virens
(M. Sars, 1835)
Nereididae
Hediste diversicolor (O.F.
Müller, 1776)
Glycera tridactyla Schmarda,
1861
Glycera fallax Quatrefages,
1850
Goniada emerita Audouin &
Glyceridae
Milne-Edwards, 1833
Goniada norvegica Örsted,
1845
Glycera alba (O.F. Müller,
1776)
Glycera unicornis Savigny in
Lamarck, 1818
Nephtys caeca (Fabricius,
1780)
Nephtys cirrosa (Ehlers,
1868)
Nephtys hystricis McIntosh,
1900
Nephtyidae
Nephtys hombergii Savigny in
Lamarck, 1818
Nephtys longosetosa Örsted,
1842
Aglaophamus pulcher (Rainer,
1991)
Micronephthys minuta (Théel,
1879)
Chaetopteridae
126
Spiochaetopterus costarum
(Claparède, 1869)
Locais
Referências
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Guadiana
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
Estuário do Tejo
Estuário do Mira
Estuário do Mondego
Estuário do Guadiana
Estuário do Tejo
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Condea et al., 2013
Salgado et al., 2007
Abrantes et al., 1999
Rodrigues et al., 2006
Moreira et al., 2005
Chainho et al., 2006
Condea et al., 2013
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Sado
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Carvalho et al., 2001
Silva et al., 2006
Nunes et al., 2008
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Sado
Estuário do Guadiana
Estuário do Tejo
Estuário do Tejo
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Carvalho et al., 2001
Condea et al., 2013
Rodrigues et al., 2006
Salgado et al., 2007
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Anexo/Tabela T1. Pequena checklist de poliquetas estuarinas portugueses, feita através da consulta de bibliografia
disponível ao público (continuação).
Famílias
Espécies
Diopatra neapolitana Delle
Onuphidae
Chiaje, 1841
Nothria geophiliformis
(Moore, 1903)
Scoloplos armiger (Müller,
Orbiniidae
1776)
Phylo foetida (Claparède,
1869)
Pholoe minuta (Fabricius,
Pholoidae
1780)
Pholoe inornata Johnston,
1839
Mysta picta (Quatrefages,
1866)
Eumida sanguinea (Örsted,
Phyllodocidae
1843)
Oxydromus flexuosus (Delle
Chiaje, 1827)
Phyllodoce mucosa Örsted,
1843
Hypereteone foliosa
(Quatrefages, 1865)
Pilargiidae
Pisionidae
Saccocirridae
Sigambra tentaculata
(Treadwell, 1941)
Pisione remota (Southern,
1914)
Saccocirrus papillocercus
Bobretzky, 1872
Boccardiella ligerica
(Ferronnière, 1898)
Microspio mecznikowianus
(Claparède, 1869)
Aonides oxycephala (Sars,
Spionidae
1862)
Streblospio benedicti
Webster, 1879
Polydora ciliata (Johnston,
1838)
Polydora cornuta Bosc, 1802
Locais
Referências
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Guadiana
Ria de Aveiro
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Condea et al., 2013
Cunha et al., 2005
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Sado
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Carvalho et al., 2001
Estuário do Guadiana
Condea et al., 2013
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Ria de Aveiro
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Nunes et al., 2008
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Guadiana
Estuário de Alvor
Condea et al., 2013
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Sado
Amaral & Costa., 1999
Estuário do Sado
Estuário de Alvor
Estuário do Douro
Estuário de Alvor
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Tejo
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Carpenter, 2004
Mucha et al., 2005
Carpenter, 2004
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Rodrigues et al., 2006
Amaral & Costa., 1999
Estuário do Tagus
Rodrigues et al., 2006
127
Anexo/Tabela T1. Pequena checklist de poliquetas estuarinas portugueses, feita através da consulta de bibliografia
disponível ao público (continuação).
Famílias
Espécies
Spiophanes bombyx
(Claparède, 1870)
Prionospio fallax Söderström,
1920
Prionospio cirrifera Wirén,
1883
Pygospio elegans Claparède,
1863
Spio martinensis Mesnil,
1896
Spionidae
Streblospio shrubsolii
(Buchanan, 1890)
Boccardia
polybranchia (Haswell, 1885)
Spio decoratus Bobretzky,
1870
Dipolydora coeca (Örsted,
1843)
Malacoceros fuliginosus
(Claparède, 1870)
Scolelepis squamata (O.F.
Muller, 1806)
Prionospio malmgreni
Claparède, 1869
Pseudopolydora antennata
(Claparède, 1869)
Terebellidae
Dorvilleidae
Eunicidae
Lanice conchilega (Pallas,
1766)
Pista cristata (Müller, 1776)
Protodorvillea
kefersteini (McIntosh, 1869)
Ophryotrocha puerilis
Claparède & Metschnikow,
1869
Lysidice ninetta Audouin &
Milne-Edwards, 1833
Lysidice unicornis (Grube,
1840)
Marphysa sanguinea
(Montagu, 1815)
Sabellaridae
128
Sabellaria spinulosa
(Leuckart, 1849)
Locais
Referências
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Estuário do Tejo
Estuário do Tejo
Chainho et al., 2006
Carpenter, 2004
Rodrigues et al., 2006
Salgado et al., 2007
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Mondego
Estuário do Guadiana
Estuário do Tejo
Estuário do Tejo
Chainho et al., 2006
Condea et al., 2013
Rodrigues et al., 2006
Salgado et al., 2007
Estuário do Tagus
Rodrigues et al., 2006
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Guadiana
Condea et al., 2013
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Tejo
Estuário de Alvor
Estuário de Alvor
Rodrigues et al., 2006
Carpenter, 2004
Carpenter, 2004
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Tejo
Silva et al., 2006
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Tejo
Rodrigues et al., 2006
Estuário do Tejo
Estuário de Alvor
Estuário do Sado
Silva et al., 2006
Carpenter, 2004
Garçês & Costa, 2009
Estuário do Tejo
Silva et al., 2006
Anexo/Tabela T1. Pequena checklist de poliquetas estuarinas portugueses, feita através da consulta de bibliografia
disponível ao público (continuação).
Famílias
Espécies
Jasmineira elegans Saint-
Sabellidae
Joseph, 1894
Sabella pavonina Savigny,
1822
Pectinariidae
Lagis koreni Malmgren, 1866
Amphictene auricoma (O.F.
Müller, 1776)
Scoletoma impatiens
Lumbrineridae
(Claparède, 1868)
Hilbigneris gracilis (Ehlers,
1868)
Ophelia laubieri Bellan &
Costa, 1987
Ophelia bicornis Savigny in
Opheliidae
Lamarck, 1818
Ophelia neglecta Schneider,
1892
Ophelia radiata (Delle Chiaje,
1828)
Pilargidae
Hesionidae
Sigambra parva (Day, 1963)
Syllidia armata Quatrefages,
1866
Podarkeopsis capensis (Day,
1963)
Parapionosyllis gestans
Syllidae
Dorvilleidae
Arenicolidae
(Pierantoni, 1903)
Syllis armillaris (O.F. Müller,
1776)
Prosphaerosyllis xarifae
(Hartmann-Schröder, 1960)
Protodorvillea kefersteini
(McIntosh, 1869)
Arenicola marina (Linnaeus,
1758)
Leiochone leiopygos (Grube,
Maldanidade
1860)
Euclymene collaris
(Claparède, 1869)
Goniadidae
Magelonidae
Serpullidae
Procerodidae
Goniadella galaica (Rioja,
1923)
Magelona alleni Wilson, 1958
Spirobranchus triqueter
(Linnaeus, 1758)
Procerodes littoralis (Ström,
1768)
Locais
Referências
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Estuário de Alvor
Ria de Aveiro
Leitão et al., 2006
Carpenter, 2004
Nunes et al., 2008
Estuário do Guadiana
Condea et al., 2013
Estuário do Mondego
Patricio & Marques,
2006
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Estuário do Sado
Bellan & Costa, 1987
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Mondego
Chainho et al., 2006
Estuário do Guadiana
Condea et al., 2013
Estuário do Guadiana
Condea et al., 2013
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário do Sado
Carvalho et al., 2001
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Estuário de Alvor
Estuário de Alvor
Estuário de Alvor
Estuário de Alvor
Estuário de Alvor
Estuário de Alvor
Carpenter, 2004
Carpenter, 2004
Carpenter, 2004
Carpenter, 2004
Carpenter, 2004
Carpenter, 2004
129
Anexo/Tabela T1. Pequena checklist de poliquetas estuarinas portugueses, feita através da consulta de bibliografia
disponível ao público (continuação).
Famílias
Oweniidae
Espécies
Owenia fusiformis Delle
Chiaje, 1844
Locais
Referências
Estuário do Mondego
Estuário do Guadiana
Estuário de Alvor
Chainho et al., 2006
Condea et al., 2013
Carpenter, 2004
Anexo/Tabela T2. Número total de poliquetas recolhidas nos diferentes estuários, distribuídos pela família e
espécie.
Famílias
Espécies
Locais
Nereididae
Estuario do Sado
Estuário do Minho
Ria de Aveiro
Estuário do Lima
Estuário do Sado
Estuário do Tejo
Estuário do Lima
Estuário do Lima
Estuário do Lima
Estuários do
Alentejo (Mira)
Estuário do Lima
Estuários do
Alentejo (Mira)
Estuário do Sado
Estuário do Lima
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuário do Lima
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Lima
Ria de Aveiro
Estuário do Lima
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Lima
Hediste diversicolor
Nereididae
Nereis zonata
Nereis fucata
Ceratonereis costae
Perinereis cultrifera
Perinereis sp.
Platynereis nadiae
Platynereis dumerili
Cirratulidae
Cirratulidae
Arenicolidae
Cirriformia tentaculata
Cirriformia sp.
Aphelochaeta marioni
Arenicola marina
Spionidae
Spionidae
Scolelepis foliosa
Streblospio benedicti
Nephtyidae
Nephtyidae
Nephtys hombergii
Nepthys caeca
Nepthys sp.
Glyceridae
Glyceridae
130
Glycera alba
Glycera trydactila
Glycera convoluta
Glycera sp.
Número de
espécimes
2
18
4
81
2
1
3
3
10
3
4
3
1
12
3
3
3
2
1
1
2
5
1
4
1
9
1
9
6
1
7
2
1
3
Anexo/Tabela T2. Número total de poliquetas recolhidas nos diferentes estuários, distribuídos pela família e
espécie (continuação).
Famílias
Sabellidae
Espécies
Locais
Sabellidae
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuário do Lima
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Estuário do Sado
Estuários do
Alentejo (Sines)
Estuário do Sado
Estuários do
Alentejo (Sines)
Estuário do Sado
Estuários do
Alentejo (Sines)
Estuário do Sado
Estuário do Lima
Estuário do Sado
Estuário do Sado
Ria de Aveiro
Ria de Aveiro
Ria de Aveiro
Estuário do Minho
Sabella pavonina
Onuphidae
Diopatra neopolitana
Eunicidae
Marphysa sanguinea
Lysidice ninetta
Marphysa sp.
Lysidice sp.
Lysidice hebes
Maldanidae
Maldanidae
Euclymene palermitana
Euclymene santanderensis
Euclymene gracillis
Euclymene robusta
Praxillella praetermissa
Leiochone leyopygos
Axyothela constricta
Capitellidae
Capitellidae
Orbiniidae
Terebellidae
Notomastus profondus
Heteromastus filiformis
Orbinia latreillii
Oribiniidae
Terebellidae
Pista cristata
Trichobranchus glacialis
Lanice conchilega
Lagis koreni
Amphitritides gracilis
Euthelepus setubalensis
Lumbrineridae
Lumbrineris latreilli
Lumbrineris tetraura
Oenonidae
Arabella iricolor
Syllidae
Trypanosyllis zebra
Syllis sp.
Aphroditidae
Aphroditidae
Ampharetidae
Ampharetidae
Alkmaria romijni
Polynoidae
Polynoidae
Harmathoe imbricata
Número de
espécimes
2
1
2
1
6
5
2
1
1
12
4
5
2
49
2
5
5
2
3
53
3
8
2
13
4
11
8
3
1
3
1
1
4
1
1
5
6
2
1
3
2
3
131
Anexo/Tabela T2. Número total de poliquetas recolhidas nos diferentes estuários, distribuídos pela família e
espécie (continuação).
Famílias
Phyllodocidae
Espécies
Número de
espécimes
Locais
Phyllodocidae
Eulalia viridis
Owenidae
Serpullidae
Owenia fusiformis
Pomatoceros lamarcki
Sabellaridae
Sabellaria alveolata
Sigalionidae
Sthenelais boa
Ria de Aveiro
Estuários do
Alentejo (Sines)
Estuário do Lima
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
Estuário do Lima
Estuário do Lima
Estuário do Tejo
Ria de Aveiro
3
1
3
1
3
3
1
7
2
Anexo/Tabela T3. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 2 desta tese.
Família
Espécie
Hediste
diversicolor
Nereididae
Hediste atoka
132
Acesso
GenBank
FJ030981.1
FJ030979.1
FJ030977.1
FJ030976.1
FJ030975.1
FJ030974.1
FJ030972.1
FJ030968.1
FJ030963.1
FJ030994.1
FJ030993.1
FJ030992.1
FJ030991.1
FJ030990.1
FJ030989.1
FJ030988.1
FJ030987.1
FJ030986.1
FJ030985.1
AB603869.1
AB603852.1
AB603862.1
AB603853.1
AB603849.1
AB603861.1
AB603847.1
AB603885.1
AB603864.1
Local
Referência
Finlândia
Audzijonyte et al.,2008
Japão
Tosuji & Sato, 2010
Anexo/Tabela T3. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 2 desta tese (continuação).
Família
Espécie
Hediste atoka
Nereididae
Perinereis vallata
Perinereis
gualpensis
Perinereis
longidonta
Perinereis
falklandica
Perinereis
brevicirris
Platynereis sp.
Glyceridae
Glycera alba
Acesso
GenBank
AB603869.1
AB603852.1
AB603862.1
AB603853.1
AB603849.1
AB603861.1
AB603847.1
AB603885.1
AB603864.1
AB603880.1
AB603875.1
AB603883.1
AB603876.1
AB603877.1
AB603886.1
AB603884.1
AB603844.1
AB603874.1
AB603887.1
AB603878.1
AB603855.1
AB603856.1
AB603867.1
AB603859.1
AB603860.1
AB603868.1
HQ938395.1
HQ705196.1
HQ705192.1
HQ705193.1
HQ705188.1
HQ705187.1
HQ705186.1
HQ705191.1
HQ705190.1
HQ705185.1
HQ705184.1
JX503026.1
JX503025.1
JX503024.1
HM473626.1
HM473621.1
HM473629.1
JN852946.1
Local
Referência
Japão
Tosuji & Sato, 2010
Chile
Sampertegui et al., 2013
Chile
Sampertegui et al., 2013
Chile
Sampertegui et al., 2013
Chile
Sampertegui et al., 2013
Coreia do Sul
Kim et al., não publicado
Canada
Carr et al., 2011
Suécia
Norlinder et al., 2012
133
Anexo/Tabela T3. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 2 desta tese (continuação).
Família
Espécie
Glycera nana
Glyceridae
Glycera capitata
Arenicolidae
Arenicola marina
Trypanosyllis zebra
Syllidae
Syllis elongata
Maldanidae
Acesso
GenBank
HQ932551.1
HQ932532.1
HQ932562.1
HQ024310.1
HQ024311.1
HM473749.1
GU672482.1
GU672465.1
GU672489.1
JQ950326.1
JQ950327.1
HQ023449.1
HQ023442.1
HQ023443.1
GQ487321.1
GQ487320.1
GQ487319.1
JF903793.1
JF903790.1
HM473695.1
HM473696.1
HM473701.1
HM473699.1
HM473700.1
HM473697.1
HQ023889.1
HM473461.1
EU835661.1
Axiothella
rubrocincta
Maldanidae
Praxillella affinis
pacifica
Praxillella
praetermissa
Euclymene zonalis
Onuphidae
134
Diopatra
marocensis
HM473325.1
HM473326.1
HM473649.1
HM473648.1
HM473650.1
GU672356.1
GU672285.1
GU672610.1
HQ024016.1
GU672589.1
HQ024015.1
FJ646632.1
GQ456165.1
FJ428915.1
Local
Referência
Canadá
International Barcode of
Life (iBOL) data release,
não publicado
Canadá
Carr et al., 2011
Rússia
Hardy et al., 2011
França
Pires et al., submissão
directa (2012)
Canada
Carr et al., 2011
Holanda
Luttikhuizen & Dekker,
2010
Espanha
Aguado et al., 2012
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Austrália
Neave et al., não
publicado
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Russia
Canadá
Carr et al., 2011
Hardy et al., 2011
Carr et al., 2011
Portugal
Rodrigues et al., 2009
Europa
Ocidental
Berke et al., 2010
Anexo/Tabela T3. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 2 desta tese (continuação).
Família
Espécie
Diopatra cuprea
Onuphidae
Polynoidae
Diopatra
neapolitana
GQ497525.1
Harmothoe impar
Harmothoe glabra
JN852930.1
JN852929.1
HQ024044.1
HM473424.1
HM473415.1
HQ024056.1
HM473408.1
JN852934.1
HM473448.1
HM473445.1
HM473444.1
AY839587.1
DQ172736.1
DQ172741.1
DQ172755.1
DQ172688.1
DQ172704.1
DQ172683.1
GU670794.1
GU670792.1
GU670791.1
GU670786.1
GU670784.1
GU672621.1
GU670811.1
GU670802.1
GU672619.1
HQ023478.1
HQ024288.1
HM473343.1
HM417794.1
HQ023477.1
GU672216.1
GU672480.1
Harmothoe
imbricata
Lepidonotus
squamatus
Sigalionidae
Sthenelais boa
Sabellaridae
Phragmatopoma
caudata
Sabellaridae
Phragmatopoma
californica
Scoloplos acutus
Naineris
quadricuspida
Scoloplos armiger
Cirratulidae
FJ428894.1
FJ428893.1
FJ428892.1
FJ428951.1
FJ428848.1
FJ428834.1
GQ456164.1
EU878539.1
Onuphis elegans
Lepidonotus clava
Orbiniidae
Acesso
GenBank
Cirratulus cirratus
Local
Referência
Europa
Ocidental
Berke et al., 2010
Europa
Ocidental
Berke et al., 2010
Portugal
Rodrigues et al., 2009
Estados
Unidos
Zanol et al., 2010
Suécia
Norlinder et al., 2012
Canadá
Carr et al., 2011
Suécia
Norlinder et al., 2012
Canadá
Carr et al., 2011
Suécia
Wiklund et al., 2005
Estados
Unidos
Drake et al., 2007
Estados
Unidos
Drake et al., 2007
Russia
Hardy et al., 2011
Russia
Hardy et al., 2011
Russia
Hardy et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Russia
Hardy et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Russia
Hardy et al., 2011
135
Anexo/Tabela T3. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 2 desta tese (continuação).
Família
Espécie
Acesso
GenBank
Local
Referência
Palola viridis
JN558582.1
JN558584.1
JN558581.1
Samoa
Americana
Schulze & Timm, 2012
Lysidice collaris
GQ497557.1
KC208488.1
Eunicidae
Marphysa
sanguinea
Marphysa
californica
GQ497552.1
GQ497553.1
Marphysa
brevitentaculata
GQ497548.1
Eumida elektra
Phyllodoce
maculata
Nephtys hombergii
Nephtys hystricis
Nephtys
longosetosa
Nephtyidae
GQ497547.1
Marphysa viridis
Eumida alkyone
Phyllodocidae
AY040708.1
Nephtys sp.
Nephtys cirrosa
Micronephthys
minuta
Bipalponephtys
neotena
HM358691.1
HM358692.1
HM358694.1
HM358678.1
HM358677.1
HM358680.1
GU670815.1
GU670816.1
GU670822.1
GU179410.1
GU179411.1
HQ023590.1
HQ023586.1
GU672313.1
HQ024111.1
GU179408.1
GU672399.1
GU672310.1
HQ024378.1
GU672457.1
GU672458.1
GU672455.1
GU672502.1
GU672476.1
Spionidae
Spionidae
Scolelepis sp.
136
Estados
Unidos
India
Estados
Unidos
HQ024464.1
HM375486.1
HM375492.1
HQ024462.1
HQ024461.1
HQ024460.1
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Zanol et al., 2010
Sekar et al., não publicado
Siddall et al., 2001
Zanol et al., 2010
Zanol et al., 2010
Zanol et al., 2010
Zanol et al., 2010
Suécia
Nygren & Pleijel, 2011
Suécia
Nygren & Pleijel, 2011
Russia
Hardy et al., 2011
Portugal
Suécia
Ravara et al., 2010
Ravara et al., 2010
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Portugal
Carr et al., 2011
Ravara et al., 2010
Canadá
Carr et al., 2011
Russia
Hardy et al., 2011
Russia
International Barcode of
Life (iBOL) data release,
não publicado
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Anexo/Tabela T3. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 2 desta tese (continuação).
Família
Espécie
Spio sp.
Spionidae
Scolelepis
squamata
Owenia fusiformis
Oweniidae
Galathowenia
oculata
Terebellidae
Polycirrus sp.
Ampharetidae
Ampharetidae
Terebellidae
Acesso
GenBank
HQ023791.1
HQ023788.1
HQ023790.1
HM473680.1
HM473679.1
KC208487.1
DQ319457.1
DQ319458.1
DQ319471.1
DQ319459.1
DQ319473.1
DQ319469.1
GU672574.1
GU672611.1
GU672578.1
GU672458.1
GU672455.1
HQ024451.1
HQ024452.1
HQ024453.1
GU672575.1
GU672573.1
HQ023432.1
Ampharete sp.
HQ023431.1
HQ024261.1
HM473291.1
Ampharete
HM473292.1
labrops
HM473290.1
HQ023454.1
Asabellides sp.
HQ023460.1
HQ023458.1
HQ024451.1
Polycirrus sp.
HQ024452.1
HQ024453.1
GU672524.1
Polycirrus medusa
GU672483.1
Local
Referência
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
India
Sekar et al., não
publicado
França
Jolly et al., 2006
Russia
Hardy et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Russia
International Barcode of
Life (iBOL) data release,
não publicado
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Russia
Hardy et al., 2011
Terebellidae
HM417788.1
Russia
International Barcode of
Life (iBOL) data release,
não publicado
Pista maculata
HQ023774.1
HQ938395.1
HQ938396.1
Canadá
Carr, 2010 (não
publicado)
137
Anexo/Tabela T4. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 3 desta tese.
Família
Espécie
Eunoe depressa
Harmothoe
imbricata
Harmothoe fragilis
Harmothoe
rarispina
Eunoe oerstedi
Polynoidae
Arctonoe vittata
Arctonoe pulchra
Lepidasthenia
berkeleyae
Lepidasthenia
elegans
Lepidonotus
squamatus
Amphitrite cirrata
Ampharetidae
Amphitrite figulus
Neoamphitrite
robusta
Nicolea zostericola
Terebellidae
Polycirrus medusa
Polycirrus eximius
138
Acesso
GenBank
Local
Referência
Estados
Unidos
Carr et al., 2011
Noruega
Nygren et al., 2011
Rússia
Canadá
Hardy et al., 2011
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Estados
Unidos
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
HM473443.1
Canadá
Carr et al., 2011
JN852933.1
Suécia
Norlinder et al., 2012
JX503015.1
JX503013.1
JX503014.1
Coreia do
Sul
Kim et al., não publicado
HM473733.1
HM473731.1
HM473732.1
GQ478953.1
GQ478949.1
GU672445.1
HM473407.1
HQ024356.1
HM473428.1
HQ024058.1
HM473740.1
HM473743.1
HQ024019.1
HM473321.1
HM473320.1
HM473323.1
HM473317.1
HM473310.1
HM473301.1
HQ932561.1
Canadá
HQ024485.1
HQ023920.1
HQ023984.1
HQ023978.1
HQ023970.1
HM473492.1
HM473490.1
HM473491.1
GU670826.1
GU672559.1
HQ024409.1
GU672483.1
GU672524.1
HQ024197.1
HQ024200.1
HQ024199.1
International Barcode of
Life (iBOL) data release,
não publicado
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Rússia
Hardy et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Rússia
Hardy et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Anexo/Tabela T4. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 3 desta tese (continuação)
Família
Espécie
Terebellidae
Pista maculata
Nereis pelagica
Nereididae
Nereis vexillosa
Alitta virens
Eunicidae
Eunice norvegica
Eunice harassii
Eunice antarctica
Marphysa
sanguinea
Nereimyra
woodsholea
Hesionidae
Nereimyra
punctata
Leocrates
chinensis
Lumbrineris
fragilis
Lumbrineridae
Lumbrineris
tetraura
Ninoe nigripes
Onuphidae
Hyalinoecia
tubicola
longibranchiata
Nothria
conchylega
Chrysopetalidae
Vigtorniella
ardabilia
Acesso
GenBank
HQ938395.1
HQ938396.1
HQ023774.1
HQ023603.1
GU672328.1
HQ024125.1
HM473511.1
HM473504.1
HM473510.1
HQ023963.1
HQ023951.1
HQ023939.1
GQ497541.1
GQ497535.1
GQ497532.1
GQ497547.1
AY040708.1
AY644805.1
AY644802.1
AY644804.1
AY644790.1
AY644795.1
GU672539.1
Local
Referência
Canadá
Carr, 2010 (não
publicado)
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Estados Unidos
Estados Unidos
Estados Unidos
Zanol et al., 2010
Zanol et al., 2010
Zanol et al., 2010
Zanol et al., 2010
Siddall et al., 2001
Estados Unidos
Atlântico
Ocidental
Nygren et al., 2005
Noruega
Suécia
Noruega
Russia
Nygren et al., 2005
DQ442565.1
França
Ruta et al., 2007
GU672570.1
HQ023882.1
GU672337.1
GU362689.1
Russia
Hardy et al., 2011
Carr et al., 2011
Carr, não publicado
Zhou et al., 2010
Peng & Cheng, não
publicado
EU352318.1
HQ024159.1
HQ024144.1
HQ024127.1
JX219817.1
JX219838.1
JX219804.1
HM473519.1
HM473517.1
HM473514.1
EU555061.1
EU555064.1
EU555059.1
Canadá
China
Hardy et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Nova Zelândia
Bors et al., 2012
Canadá
Carr et al., 2011
Nordeste
Atlântico
Wiklund et al., 2009
139
Anexo/Tabela T4. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 3 desta tese (continuação)
Família
Amphinomidae
Espécie
Acesso
GenBank
Pareurythoe
borealis
JN086550.1
Hermodice
carunculata
Phyllodoce
medipapillata
Phyllodocidae
Eumida notata
Eumida kelaino
Eclysippe vanelli
Ampharetidae
Ampharete
labrops
Ampharete sp.
Sigalionidae
Sthenelais boa
Glycera
southeastatlantica
Glyceridae
Glycera
dibranchiata
Nautiliniellidae
Natsushima
bifurcata
Natsushima sp.
Praxillella affinis
pacifica
Maldanidae
Maldane sarsi
Oenonidae
140
Arabella
semimaculata
Arabella iricolor
KC017598.1
KC017577.1
KC017550.1
HM473582.1
HM473581.1
HM473577.1
HM358713.1
HM358712.1
HM358708.1
HM358690.1
HM358688.1
HM358686.1
JX423766.1
HM473292.1
HM473291.1
HM473290.1
HQ024261.1
HQ023431.1
AY894321.1
GQ426630.1
GQ426632.1
GQ426631.1
HQ024033.1
HQ024038.1
HQ024029.1
JF304492.1
JF304496.1
JF304497.1
HM473650.1
HM473648.1
HM473651.1
GU672597.1
GU672576.1
HQ024362.1
Local
Mar
Mediterrâneo
São Tomé e
Principe
Oceano
Atlântico
Referência
Borda et al., 2012
Ahrens et al., 2013
Canadá
Carr et al., 2011
Portugal
(Madeira)
Suécia
Nygren & Pleijel (2011)
Suécia
Nygren & Pleijel (2011)
Noruega
Stiller et al., 2013
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Estados Unidos
Struck et al., 2005
Sudoeste
Atlântico
Boeggemann, 2009
Canadá
Carr et al., 2011
Golfo do Cádiz
Aguado & Rouse, 2011
Costa Rica
Canadá
Rússia
Rússia
Canadá
Carr et al., 2011
Hardy et al., 2011
Carr et al., 2011
AY838866.1
Estados Unidos
Struck et al., 2006
GU362693.1
China
Zhou et al., 2010
Anexo/Tabela T4. Acessões do Genbank das sequências COI de poliquetas para comparação obtidas a partir de
outros estudos, usadas para construção da árvore filogenética do capítulo 3 desta tese (continuação)
Família
Espécie
Scolelepis sp.
Scolelepis
squamata
Spionidae
Malacoceros
fuliginosus
Prionospio
steenstrupi
Prionospio sp.
Acesso
GenBank
GU672370.1
GU672198.1
GU672153.1
HM473680.1
HM473679.1
KC208487.1
EF432015.1
EF432014.1
EF432012.1
GU672264.1
GU672273.1
GU672268.1
FM212789.1
FM212792.1
FM212788.1
Local
Referência
Canadá
Carr et al., 2011
Canadá
Carr et al., 2011
Índia
Sekar et al., não
publicado
Alemanha
Blank & Bastrop.,
2009
Canadá
Carr et al., 2011
Mediterrânio
Oriental
Gaudron et al.,
2010
141
50 MSSED7|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
100
L1SED39|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 1
SFP6 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
20
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030976.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030979.1| FINLAND
97
3
55 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030977.1| FINLAND
MOTU 2
MOTU 2
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030981.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030984.1| FINLAND
9
8
MESED4|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Minho)
7
1515
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030975.1| FINLAND
14
MSSED5|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030963.1| FINLAND
MOTU 3
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030974.1| FINLAND
39
33
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030972.1| FINLAND
MOTU 4
BLAST Hediste diversicolor AB - GenBank: FJ030994.1| FINLAND
54
99
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030968.1| FINLAND
LPTSED16|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP7 - 003|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
98
100
MOTU 5
SFP7 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
96
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030990.1| FINLAND
78 BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030986.1| FINLAND
99
98
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030987.1| FINLAND
MOTU 6
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030985.1| FINLAND
100
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030988.1| FINLAND
MOTU 7
60
98 BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030989.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030993.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030991.1| FINLAND
100
MOTU 8
Nereididae
80 BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030992.1| FINLAND
86 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603887.1| JAPAN
99
73 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603878.1| JAPAN
71 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603876.1| JAPAN
41
89
56
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603877.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603874.1| JAPAN
MOTU 9
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603884.1| JAPAN
58
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603875.1| JAPAN
94
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603883.1| JAPAN
100
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603880.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603885.1| JAPAN
MOTU 10
100
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603862.1| JAPAN
87
99
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603886.1| JAPAN
100
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603860.1| JAPAN
MOTU 11
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603861.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603868.1| JAPAN
26
99
56 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603853.1| JAPAN
81 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603847.1| JAPAN
54
100
MOTU 12
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603852.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603849.1| JAPAN
Nereididae
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603869.1| JAPAN
80
96
MOTU 13
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603844.1| JAPAN
100 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603855.1| JAPAN
38
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603856.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603867.1| JAPAN
83
18
99
MOTU 14
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603864.1| JAPAN
44 BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603859.1| JAPAN
64 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473626.1| CANADA
100 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473629.1| CANADA
MOTU 15
Platynereis sp.
HM473621.1|
CANADA de diversos locais geográficos. Foi
Anexo/Figura F1. Árvore NJ deBLAST
nucleótidos
de- GenBank:
poliquetas
provenientes
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705198.1| CHILE
41
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a
BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705185.1| CHILE
100
localização das diferentes famílias
e os MOTUs representam grupos monofiléticos
MOTU 16 com <3% de divergência
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705197.1| CHILE
63
intraespecífica. 15Realçado a verde
encontram-se
as
sequências
desenvolvidas
por
este trabalho, enquanto que as
56 BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705184.1| CHILE
que estão sublinhadas a azul, são
as restantes
sequências
desenvolvidas
no âmbito dos projectos LusoMarBoL e
BLAST
Perinereis gualpensis
- GenBank:
HQ705186.1| CHILE
BestBarcode, presentes na BOLD,
abordadas
capítulo
2. HQ705188.1| CHILE MOTU 17
BLAST
Perinereis no
gualpensis
- GenBank:
100
99 BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705187.1| CHILE
33 SFP20-1|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
46 SFP20 - 002|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
142
MOTU 18
SFP20-2|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP20 - 003|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100 BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705191.1| CHILE
19
BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705190.1| CHILE
16
83
LMBSCt12-003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SFP17 - 003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 19
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603852.1| JAPAN
54
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603849.1| JAPAN
Nereididae
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603869.1| JAPAN
80
96
MOTU 13
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603844.1| JAPAN
100 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603855.1| JAPAN
38
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603856.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603867.1| JAPAN
83
MOTU 14
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603864.1| JAPAN
99
44 BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603859.1| JAPAN
18
64 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473626.1| CANADA
100 BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473629.1| CANADA
MOTU 15
BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473621.1| CANADA
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705198.1| CHILE
41
BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705185.1| CHILE
100
MOTU 16
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705197.1| CHILE
63
15
56 BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705184.1| CHILE
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705186.1| CHILE
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705188.1| CHILE
100
MOTU 17
99 BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705187.1| CHILE
33 SFP20-1|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
46 SFP20 - 002|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 18
100
SFP20-2|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP20 - 003|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100 BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705191.1| CHILE
19
MOTU 19
BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705190.1| CHILE
16
LMBSCt12-003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
83
SFP17 - 003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
MOTU 20
SFP17 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
Nereididae
51
SFP17 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
91 BLAST Perinereis vallata - GenBank: HQ705192.1| CHILE
99 BLAST Perinereis vallata - GenBank: HQ705193.1| CHILE
BLAST Perinereis vallata - GenBank: HQ705196.1| CHILE
100
MOTU 21
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676180.1| INDIA
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676159.1| INDIA
100
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676143.1| INDIA
67 37
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503025.1| SOUTH KOREA
100
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503024.1| SOUTH KOREA
MOTU 22
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503026.1| SOUTH KOREA
SFP18 - 003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
60
SFP18 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
SFP16 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
46
MOTU 23
SFP18 - 004|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
56
LMBP18-2|Perinereis cultrifera PORTUGAL (Estuario do Lima)
31
21 SFP18 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
23
43 SS1|Nereis zonata| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SS2|Nereis zonata| PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 24
LMBSAP24-002|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
100
94 LMBSAP24-001|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
46 SFP5 - 003|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
57 SFP5 - 002|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
98
MOTU 25
RR101|Glycera alba| PORTUGAL (Estuario do Sado)
RR111|Glycera tridactyla| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SFP5 - 001|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Glycera alba - GenBank: JN852946.1| SWEDEN
97
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932551.1| CANADA
100
96
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932562.1| CANADA
MOTU 26
Glyceridae
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932532.1| CANADA
93 BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024310.1| CANADA
100
BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024311.1| CANADA
100
79
76
9
BLAST Glycera capitata - GenBank: HM473749.1| CANADA
MOTU 27
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672482.1| RUSSIA
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672465.1| RUSSIA
68 BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672489.1| RUSSIA
41 BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473415.1| CANADA
100
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473408.1| CANADA
MOTU 28
Harmothoe imbricata - GenBank: HM473424.1| CANADA
100
Anexo/Figura F1. Árvore
NJ BLAST
de nucleótidos
de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HQ024044.1| CANADA
54 de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações.
utilizado o modelo
MOTU As
29 linhas laterais mostram a
100 BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HQ024056.1| CANADA
localização das38 diferentes famílias
e
os
MOTUs
representam
grupos
monofiléticos
com
<3% de divergência
BLAST Harmothoe glabra - GenBank: JN852929.1| SWEDEN
Polynoidae
intraespecífica. Realçado a verde
encontram-se
as
sequências
desenvolvidas
por
este
trabalho,
enquanto que as
SFP4 - 001|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
88
que estão sublinhadas a azul,
são
as
restantes
sequências
desenvolvidas
no
âmbito
dos
projectos
LusoMarBoL e
100 LMBSAP29-001|Polynoidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 30
BLAST
Harmothoe impar
- GenBank: 2
JN852930.1|
SWEDEN
BestBarcode, presentes na BOLD,
abordadas
no capítulo
(continuação).
51
SFP4 - 002|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
32
MOTU 31
100
BLAST Lepidonotus clava - GenBank: JN852934.1| SWEDEN
100 SFP28 - 001|Sthenelais boa| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 32 (Sigalionidae)
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY839587.1| SWEDEN
143
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473448.1| CANADA
71
100
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473445.1| CANADA
MOTU 33 (Polynoidae)
100 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473444.1| CANADA
97
100
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172736.1| USA
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172741.1| USA
MOTU 34
100
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932562.1| CANADA
96
MOTU 26
Glyceridae
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932532.1| CANADA
93 BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024310.1| CANADA
100
BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024311.1| CANADA
BLAST Glycera capitata - GenBank: HM473749.1| CANADA
100
MOTU 27
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672482.1| RUSSIA
79
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672465.1| RUSSIA
76
9
68 BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672489.1| RUSSIA
41 BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473415.1| CANADA
100
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473408.1| CANADA
MOTU 28
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473424.1| CANADA
100
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HQ024044.1| CANADA
54
MOTU 29
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HQ024056.1| CANADA
100
38
BLAST Harmothoe glabra - GenBank: JN852929.1| SWEDEN
Polynoidae
SFP4 - 001|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
88
LMBSAP29-001|Polynoidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
100
MOTU 30
BLAST Harmothoe impar - GenBank: JN852930.1| SWEDEN
SFP4 - 002|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
32
51
MOTU 31
BLAST Lepidonotus clava - GenBank: JN852934.1| SWEDEN
100
100 SFP28 - 001|Sthenelais boa| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 32 (Sigalionidae)
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY839587.1| SWEDEN
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473448.1| CANADA
71
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473445.1| CANADA
100
MOTU 33 (Polynoidae)
100 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473444.1| CANADA
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172736.1| USA
97
100
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172741.1| USA
16
MOTU 34
BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172755.1| USA
84
BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172688.1| USA
BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172704.1| USA
100
79
MOTU 35
Sabellaridae
60 BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172683.1| USA
SFP21-2 Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
LMBLP4-001|Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Tejo)
100
MOTU 36
36 LMBLP4-002|Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Tejo)
LPCSED3|Scolelepis foliosa| PORTUGAL (Estuario do Lima)
40
BLAST Spionidae - GenBank: GU672502.1| RUSSIA
63
100
5
BLAST Spionidae - GenBank: HQ024464.1| CANADA
45
BLAST Spionidae - GenBank: HM375492.1| CANADA
75
77
MOTU 37
BLAST Spionidae - GenBank: GU672476.1| RUSSIA
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024461.1| CANADA
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024462.1| CANADA
100
MOTU 38
58 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024460.1| CANADA
Spionidae
99 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
97
100
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473679.1| CANADA
MOTU 39
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
BLAST Spionidae - GenBank: HM375486.1| CANADA
60
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023791.1| CANADA
100
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023788.1| CANADA
100
MOTU 40
53 BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023790.1| CANADA
100 BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024452.1| CANADA
100
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024453.1| CANADA
MOTU 41
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024451.1| CANADA
68
BLAST Terebellidae - GenBank: HM417788.1| RUSSIA
BLAST Polycirrus medusa GenBank: GU672524.1| RUSSIA
80 57
Terebellidae
MOTU 42
100 BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672483.1| RUSSIA
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ023774.1| CANADA
39
100
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA
MOTU 43
49 BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
SFP1 - 001|Alkmaria romijni| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 44 (Ampharetidae)
100
SFP22 - 003|Ampharetidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Anexo/Figura F1. Árvore NJ de nucleótidos
de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi
66 BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358691.1| SWEDEN
utilizado o modelo de evolução K2P e 100
o teste
deEumida
Bootstrap
1000HM358692.1|
replicações.
As linhas
mostram a
BLAST
alkyone com
- GenBank:
SWEDEN
MOTUlaterais
45
localização das diferentes famílias
e
os
MOTUs
representam
grupos
monofiléticos
com
<3%
de
divergência
BLAST
Eumida
alkyone
GenBank:
HM358694.1|
SWEDEN
99
BLAST Eumida
- GenBank:
HM358677.1| SWEDEN
intraespecífica. Realçado a verde encontram-se
as elektra
sequências
desenvolvidas
por este trabalho, enquanto que as
BLAST
Eumida
elektra
GenBank:
HM358678.1|
SWEDEN
MOTU
46
que estão sublinhadas a64 azul, são as
restantes
sequências
desenvolvidas
no
âmbito
dos
projectos
LusoMarBoL e
100
92 BLAST Eumida
elektra -2GenBank:
HM358680.1| SWEDEN
BestBarcode,51presentes na BOLD, abordadas
no capítulo
(continuação).
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670815.1| RUSSIA
96
9
100
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670816.1| RUSSIA
MOTU 47
60 BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670822.1| RUSSIA
144
LMBLP7-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuario do Tejo)
MOTU 48
100
LMBSST13-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
100
47
66
BLAST Ampharetidae - GenBank: GU672575.1| RUSSIA
MOTU 49
BLAST Ampharetidae - GenBank: GU672573.1| RUSSIA
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023432.1| CANADA
Phyllodocidae
100 BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024452.1| CANADA
100
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024453.1| CANADA
MOTU 41
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024451.1| CANADA
68
BLAST Terebellidae - GenBank: HM417788.1| RUSSIA
BLAST Polycirrus medusa GenBank: GU672524.1| RUSSIA
80 57
Terebellidae
MOTU 42
100 BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672483.1| RUSSIA
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ023774.1| CANADA
39
100
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA
MOTU 43
49 BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
SFP1 - 001|Alkmaria romijni| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
MOTU 44 (Ampharetidae)
100 SFP22 - 003|Ampharetidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
66 BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358691.1| SWEDEN
100 BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358692.1| SWEDEN
MOTU 45
BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358694.1| SWEDEN
99
BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358677.1| SWEDEN
100
64
BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358678.1| SWEDEN
MOTU 46
92 BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358680.1| SWEDEN
51
Phyllodocidae
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670815.1| RUSSIA
96
100
9
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670816.1| RUSSIA
MOTU 47
60 BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670822.1| RUSSIA
LMBLP7-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuario do Tejo)
MOTU 48
100 LMBSST13-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
100 BLAST Ampharetidae - GenBank: GU672575.1| RUSSIA
47
MOTU 49
BLAST Ampharetidae - GenBank: GU672573.1| RUSSIA
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023432.1| CANADA
66
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
97
MOTU 50
83
100 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ024261.1| CANADA
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473291.1| CANADA
100
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473292.1| CANADA
100
Ampharetidae
MOTU 51
72 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473290.1| CANADA
BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023454.1| CANADA
100
BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023460.1| CANADA
MOTU 52
58 BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023458.1| CANADA
93
99 BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672574.1| RUSSIA
100
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672611.1| RUSSIA
MOTU 53
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672578.1| RUSSIA
SFP26 - 001|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
94
SFP26 - 003|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
100
SFP26 - 002|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
39
Owenidae
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319473.1| FRANCE
53
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319471.1| FRANCE
MOTU 54
71
30
21
19
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319469.1| FRANCE
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319459.1| FRANCE
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319457.1| FRANCE
35 BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319458.1| FRANCE
42 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672399.1| RUSSIA
BLASTNJ
Micronephthys
minuta - GenBank:
GU672310.1| CANADA
Anexo/Figura
F1.100Árvore
de nucleótidos
de poliquetas
provenientes
de diversos locais geográficos. Foi
MOTU 55
11
utilizado o modelo100de evolução
K2P e o minuta
teste - de
Bootstrap
comCANADA
1000 replicações. As linhas laterais mostram a
BLAST Micronephthys
GenBank:
HQ024378.1|
localização das diferentes
famílias
e osneotena
MOTUs
representam
grupos monofiléticos com <3% de divergência
BLAST
Bipalponephtys
- GenBank:
GU672455.1| RUSSIA
intraespecífica. RealçadoBLAST
a verde
encontram-se
as
sequências
desenvolvidas
por este trabalho, enquanto que as
Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672457.1| RUSSIA
MOTU 56
100
que estão sublinhadas
a azul, são as restantes sequências desenvolvidas no âmbito dos projectos LusoMarBoL e
40 BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672458.1| RUSSIA
BestBarcode,
presentes na BOLD, abordadas no capítulo 2 (continuação).
64
BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
57
BLAST Nephtys sp. - GenBank: HQ024111.1| CANADA
42
47 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023586.1| CANADA
100 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: GU672313.1| CANADA
22
Nephtyidae
MOTU 57
BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023590.1| CANADA
90 SFP27 - 001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
25
56
145
BLAST Nephtys hombergii - GenBank: GU179410.1| PORTUGAL
SFP13 - 001|Nephtys sp.| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
100
60
LMBSAP16-004|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
LMBSAP16-001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
MOTU 58
SFP26 - 001|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
94
SFP26 - 003|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
100
SFP26 - 002|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
39
Owenidae
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319473.1| FRANCE
53
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319471.1| FRANCE
MOTU 54
71
30
21
19
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319469.1| FRANCE
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319459.1| FRANCE
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319457.1| FRANCE
35 BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319458.1| FRANCE
42 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672399.1| RUSSIA
100 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672310.1| CANADA
11
MOTU 55
BLAST Micronephthys minuta - GenBank: HQ024378.1| CANADA
100
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672455.1| RUSSIA
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672457.1| RUSSIA
100
MOTU 56
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672458.1| RUSSIA
40
64
BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
57
BLAST Nephtys sp. - GenBank: HQ024111.1| CANADA
42
47 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023586.1| CANADA
Nephtyidae
100 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: GU672313.1| CANADA
22
MOTU 57
BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023590.1| CANADA
SFP27 - 001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
90
25
56
BLAST Nephtys hombergii - GenBank: GU179410.1| PORTUGAL
SFP13 - 001|Nephtys sp.| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
LMBSAP16-004|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
100
MOTU 58
LMBSAP16-001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
60
LMBSAP16-002|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
52
49 LMBSAP16-003|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
63 BLAST Arenicola marina - GenBank: JQ950326.1| FRANCE
54 BLAST Arenicola marina - GenBank: JQ950327.1| FRANCE
67 BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487320.1| NETHERLANDS
97
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487319.1| NETHERLANDS
MOTU 59 (Arenicolidae)
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487321.1| NETHERLANDS
100
BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023443.1| CANADA
BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023449.1| CANADA
100
81 BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023442.1| CANADA
43 RR78|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
5
100
RR116b|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 60
RR90|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
28
39
RR91|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
22
35
RR127|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
32
RR74|Leiochone leiopygos| PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Axiothella rubrocincta - GenBank: HM473325.1| CANADA
MOTU 61
100 BLAST Axiothella rubrocincta - GenBank: HM473326.1| CANADA
RR70|Praxillella praetermissa| PORTUGAL (Estuario do Sado)
78
90
100
MOTU 62
Maldanidae
79
5
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473649.1| CANADA
52
BLAST Maldanidae - GenBank: HM473461.1| CANADA
BLAST Maldanidae - GenBank: EU835661.1| AUSTRALIA
BLAST Maldanidae - GenBank: HQ023889.1| CANADA
16
RR89|Axyothela constricta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
10
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672285.1| CANADA
99
100
25
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672610.1| CANADA
MOTU 63
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672356.1| CANADA
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: GU672589.1| RUSSIA
100
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024016.1| CANADA
100
85
MOTU 64
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024015.1| CANADA
82 BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428893.1| WESTERN EUROPE
100
BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428892.1| WESTERN EUROPE
MOTU 65
Anexo/Figura
F1. BLAST
ÁrvoreDiopatra
NJ cuprea
de nucleótidos
de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi
63
- GenBank: FJ428894.1| WESTERN EUROPE
utilizado o modelo deBLAST
evolução
K2P
e
o
teste
de
Bootstrap
Onuphis elegans - GenBank: GQ497525.1|
USA com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a
localização das diferentes
famílias
e
os
MOTUs
representam
grupos monofiléticos com <3% de divergência
BLAST
Diopatra
marocensis
GenBank:
FJ646632.1|
PORTUGAL
62
27
intraespecífica.
Realçado
a verde
encontram-se
as sequências
desenvolvidas por
este
trabalho, enquanto que as
100 BLAST
Diopatra
marocensis - GenBank:
GQ456165.1| PORTUGAL
MOTU
66
que estão sublinhadas a BLAST
azul,Diopatra
são asmarocensis
restantes
sequências
desenvolvidas
no âmbito dos projectos LusoMarBoL e
- GenBank:
FJ428915.1|
WESTERN EUROPE
Onuphidae
- 002|Diopatra
neopolitana|
de Aveiro)
BestBarcode,
presentes SFP6
na BOLD,
abordadas
noPORTUGAL
capítulo(Ria
2 (continuação).
73
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428951.1| WESTERN EUROPE
100
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428834.1| WESTERM EUROPE
31
4
6
146
40
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428848.1| WESTERN EUROPE
MOTU 67
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: GQ456164.1| PORTUGAL
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: JQ950321.1| PORTUGAL
25 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: EU878539.1| PORTUGAL
100
85
LMBSAP27-001|Marphysa sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
LMBSAP23-001|Marphysa sanguinea| PORTUGAL (Estuario do Sado)
29
MOTU 68
BLAST Maldanidae - GenBank: EU835661.1| AUSTRALIA
BLAST Maldanidae - GenBank: HQ023889.1| CANADA
16
RR89|Axyothela constricta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
10
99 BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672285.1| CANADA
100
25
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672610.1| CANADA
MOTU 63
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672356.1| CANADA
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: GU672589.1| RUSSIA
100
100
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024016.1| CANADA
MOTU 64
85 BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024015.1| CANADA
82 BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428893.1| WESTERN EUROPE
100 BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428892.1| WESTERN EUROPE
63
MOTU 65
BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428894.1| WESTERN EUROPE
BLAST Onuphis elegans - GenBank: GQ497525.1| USA
62 BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ646632.1| PORTUGAL
27
100 BLAST Diopatra marocensis - GenBank: GQ456165.1| PORTUGAL
MOTU 66
BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ428915.1| WESTERN EUROPE
Onuphidae
SFP6 - 002|Diopatra neopolitana| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
73
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428951.1| WESTERN EUROPE
100
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428834.1| WESTERM EUROPE
31
4
6
40
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428848.1| WESTERN EUROPE
MOTU 67
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: GQ456164.1| PORTUGAL
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: JQ950321.1| PORTUGAL
25 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: EU878539.1| PORTUGAL
LMBSAP27-001|Marphysa sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
100
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
85
LMBSAP23-001|Marphysa sanguinea| PORTUGAL (Estuario do Sado)
MOTU 68
29
100
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
BLAST Marphysa viridis - GenBank: GQ497553.1| USA
100
BLAST Marphysa brevitentaculata - GenBank: GQ497548.1| USA
43
Eunicidae
BLAST Marphysa californica - GenBank: GQ497552.1| USA
44
BLAST Lysidice collaris - GenBank: GQ497557.1| USA
100
MOTU 69
BLAST Lysidice collaris - GenBank: KC208488.1| INDIA
BLAST Palola viridis - GenBank: JN558581.1| AMERICAN SAMOA
38
100
BLAST Palola viridis - GenBank: JN558582.1| AMERICAN SAMOA
MOTU 70
63 BLAST Palola viridis - GenBank: JN558584.1| AMERICAN SAMOA
100 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023477.1| CANADA
57
MOTU 71
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: GU672216.1| CANADA
99
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM473343.1| CANADA
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM417794.1| RUSSIA
100
9
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: GU672480.1| RUSSIA
100
100
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023478.1| CANADA
Cirratulidae
MOTU 72
99 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ024288.1| CANADA
LMBP23-1|Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 73
100 LMBP23-2 Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
80 BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU670811.1| RUSSIA
100 BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU670802.1| RUSSIA
MOTU 74
Anexo/Figura F1. Árvore NJ de nucleótidos
de poliquetas
provenientes
de diversos
locaisRUSSIA
geográficos. Foi
BLAST Scoloplos
armiger - GenBank:
GU672619.1|
99
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de BootstrapBLAST
com Scoloplos
1000 replicações.
As
linhas
laterais
mostram a
acutus - GenBank: GU670791.1| RUSSIA
14
localização
das diferentes famílias e os MOTUs representam
grupos
monofiléticos
com
<3%
de
divergência
BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670794.1| RUSSIA
MOTU 75
100
100
intraespecífica. Realçado a verde encontram-se
as sequências
desenvolvidas por este trabalho, enquanto que as
76 BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670792.1| RUSSIA
que estão sublinhadas a azul, são as restantes sequências desenvolvidas no âmbito dos projectos LusoMarBoL e
BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU672621.1| RUSSIA
BestBarcode,
presentes na BOLD, abordadas no capítulo 2 (continuação).
47
100
BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU670786.1| RUSSIA
59 BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU670784.1| RUSSIA
RR97|Orbinidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903793.1| SPAIN
99
28
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903790.1| SPAIN
100
95
99
SFP24 - 002|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
147
MOTU 77
SFP24 - 003|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP24 - 005|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 78
100 SFP24 - 001|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
99
SS18|Trypanosyllis zebra| PORTUGAL (Estuario do Sado)
Syllidae
Orbinidae
MOTU 76
99
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM473343.1| CANADA
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM417794.1| RUSSIA
100
9
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: GU672480.1| RUSSIA
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023478.1| CANADA
100
99 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ024288.1| CANADA
100
Cirratulidae
MOTU 72
LMBP23-1|Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 73
100 LMBP23-2 Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
80 BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU670811.1| RUSSIA
100 BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU670802.1| RUSSIA
99
MOTU 74
BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU672619.1| RUSSIA
BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670791.1| RUSSIA
14
100
100
BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670794.1| RUSSIA
MOTU 75
Orbinidae
76 BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670792.1| RUSSIA
BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU672621.1| RUSSIA
47
BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU670786.1| RUSSIA
100
59 BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU670784.1| RUSSIA
MOTU 76
RR97|Orbinidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903793.1| SPAIN
99
28
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903790.1| SPAIN
100 SFP24 - 002|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
99
MOTU 77
SFP24 - 003|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
95
SFP24 - 005|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MOTU 78
100 SFP24 - 001|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SS18|Trypanosyllis zebra| PORTUGAL (Estuario do Sado)
99
Syllidae
65 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473695.1| CANADA
75
100 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473697.1| CANADA
MOTU 79
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473696.1| CANADA
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473699.1| CANADA
100
100
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473701.1| CANADA
MOTU 80
74 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473700.1| CANADA
OUTGROUP (Oligochaeta)
100
0.05
Anexo/Figura F1. Árvore NJ de nucleótidos de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a
localização das diferentes famílias e os MOTUs representam grupos monofiléticos com <3% de divergência
intraespecífica. Realçado a verde encontram-se as sequências desenvolvidas por este trabalho, enquanto que as
que estão sublinhadas a azul, são as restantes sequências desenvolvidas no âmbito dos projectos LusoMarBoL e
BestBarcode, presentes na BOLD, abordadas no capítulo 2 (continuação).
148
41 LMBP18-2|Perinereis cultrifera PORTUGAL (Estuario do Lima)
22 SFP18 - 004|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
33 SFP18 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
1 SFP16 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503024.1| SOUTH KOREA
2 BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705191.1| CHILE
3
BLAST Perinereis longidonta - GenBank: HQ705190.1| CHILE
45
7
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503025.1| SOUTH KOREA
BLAST Perinereis brevicirris - GenBank: JX503026.1| SOUTH KOREA
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676180.1| INDIA
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676159.1| INDIA
BLAST Perinereis vallata - GenBank: JX676143.1| INDIA
17 SFP18 - 003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP18 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Perinereis vallata - GenBank: HQ705193.1| CHILE
BLAST Perinereis vallata - GenBank: HQ705192.1| CHILE
BLAST Perinereis vallata - GenBank: HQ705196.1| CHILE
25
SFP17 - 003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP17 - 001|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
81
LMBSCt12-003|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
28
26 SFP17 - 002|Perinereis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SS2|Nereis zonata| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SS1|Nereis zonata| PORTUGAL (Estuario do Sado)
2
73
LMBSAP24-002|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
75
LMBSAP24-001|Nereididae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473621.1| CANADA
93
BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473629.1| CANADA
BLAST Platynereis sp. - GenBank: HM473626.1| CANADA
SFP20-1|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
61
SFP20-2|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
97 SFP20 - 002|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
1
SFP20 - 003|Platynereis nadiae| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705185.1| CHILE
83
55
BLAST Perinereis falklandica - GenBank: HQ705184.1| CHILE
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705197.1| CHILE
BLAST Pseudonereis variegata - GenBank: HQ705198.1| CHILE
33
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030979.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030977.1| FINLAND
42
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030976.1| FINLAND
27 SFP6 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
7 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030963.1| FINLAND
56
MSSED7|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
L1SED39|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MSSED5|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
8
MESED4|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Minho)
LPTSED16|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP7 - 003|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Nereididae
2 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030984.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030981.1| FINLAND
diversicolor
- GenBank:abordados
FJ030975.1|no
FINLAND
Anexo/Figura F2. ÁrvoreBLAST
NJ deHediste
aminoácidos
deApoliquetas
capítulo 2 provenientes de diversos
BLASToHediste
diversicolor
A - GenBank:
locais geográficos. Foi47utilizado
modelo
de evolução
K2P e FJ030974.1|
o teste de FINLAND
Bootstrap com 1000 replicações. As
BLAST Hediste
- GenBank: FJ030972.1| FINLAND
linhas laterais mostram 17
a localização
dasdiversicolor
diferentesAfamílias.
3
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030968.1| FINLAND
SFP7 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
BLAST Hediste diversicolor AB - GenBank: FJ030994.1| FINLAND
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603868.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603860.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603859.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603867.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603856.1| JAPAN
149
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030979.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030977.1| FINLAND
42
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030976.1| FINLAND
27 SFP6 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
7 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030963.1| FINLAND
56
MSSED7|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
L1SED39|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
MSSED5|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Sapal do Minho)
8
MESED4|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Minho)
LPTSED16|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP7 - 003|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Nereididae
2 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030984.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030981.1| FINLAND
3
47
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030975.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030974.1| FINLAND
17 BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030972.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor A - GenBank: FJ030968.1| FINLAND
SFP7 - 001|Hediste diversicolor| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
BLAST Hediste diversicolor AB - GenBank: FJ030994.1| FINLAND
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603868.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603860.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - Genbank: AB603859.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603867.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603856.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603855.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603878.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603887.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603874.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603844.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603884.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603886.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603877.1| JAPAN
39
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603876.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603883.1| JAPAN
11 BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603875.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603880.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603885.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603847.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603861.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603849.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603853.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603862.1| JAPAN
27
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603852.1| JAPAN
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603869.1| JAPAN
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030990.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030989.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030985.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030986.1| FINLAND
59
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030988.1| FINLAND
63
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030987.1| FINLAND
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603864.1| JAPAN
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030993.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030992.1| FINLAND
79
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030991.1| FINLAND
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705188.1| CHILE
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705187.1| CHILE
92
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705186.1| CHILE
BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358694.1| SWEDEN
BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358678.1| SWEDEN
21
Eumida elektra
- GenBank: abordados
HM358677.1| SWEDEN
Anexo/Figura F2. Árvore NJ de
aminoácidos
de poliquetas
no capítulo 2 provenientes de diversos
71 BLAST
BLAST
Eumida
elektra
GenBank:
HM358680.1|
SWEDEN
locais geográficos. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste
de Bootstrap
com 1000 replicações. As linhas
BLAST Eumida
alkyone
- GenBank: HM358691.1| SWEDEN
71 diferentes
laterais mostram a localização das
famílias
(continuação).
BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358692.1| SWEDEN
LMBLP7-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuario do Tejo)
96
89
LMBSST13-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670816.1| RUSSIA
150
96
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670815.1| RUSSIA
96 BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670822.1| RUSSIA
17
67
RR111|Glycera tridactyla| PORTUGAL (Estuario do Sado)
20 SFP5 - 002|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
Phyllodocidae
59
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030988.1| FINLAND
63
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030987.1| FINLAND
BLAST Hediste atoka - GenBank: AB603864.1| JAPAN
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030993.1| FINLAND
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030992.1| FINLAND
79
BLAST Hediste diversicolor B - GenBank: FJ030991.1| FINLAND
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705188.1| CHILE
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705187.1| CHILE
92
BLAST Perinereis gualpensis - GenBank: HQ705186.1| CHILE
BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358694.1| SWEDEN
BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358678.1| SWEDEN
21
71 BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358677.1| SWEDEN
BLAST Eumida elektra - GenBank: HM358680.1| SWEDEN
BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358691.1| SWEDEN
71
BLAST Eumida alkyone - GenBank: HM358692.1| SWEDEN
Phyllodocidae
LMBLP7-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuario do Tejo)
96
LMBSST13-001|Phyllodocidae | PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
89
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670816.1| RUSSIA
BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670815.1| RUSSIA
96
96 BLAST Phyllodoce maculata - GenBank: GU670822.1| RUSSIA
17
67
RR111|Glycera tridactyla| PORTUGAL (Estuario do Sado)
20 SFP5 - 002|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
56 SFP5 - 003|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
100
RR101|Glycera alba| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SFP5 - 001|Glycera sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
BLAST Glycera alba - GenBank: JN852946.1| SWEDEN
29
99
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932532.1| CANADA
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932562.1| CANADA
Glyceridae
99
BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024311.1| CANADA
93
BLAST Glycera capitata - GenBank: HM473749.1| CANADA
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672482.1| RUSSIA
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672465.1| RUSSIA
3
10
BLAST Glycera capitata - GenBank: GU672489.1| RUSSIA
BLAST Glycera nana - GenBank: HQ932551.1| CANADA
63 BLAST Glycera capitata - GenBank: HQ024310.1| CANADA
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473415.1| CANADA
70 BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473408.1| CANADA
87
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HQ024044.1| CANADA
Polynoidae
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HM473424.1| CANADA
42
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: HQ024056.1| CANADA
BLAST Harmothoe glabra - GenBank: JN852929.1| SWEDEN
24
BLAST Lepidonotus clava - GenBank: JN852934.1| SWEDEN
98
Polynoidae
13 LMBSAP29-001|Polynoidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
5
51
SFP4 - 001|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Polynoidae
SFP4 - 002|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
6
BLAST Harmothoe impar - GenBank: JN852930.1| SWEDEN
Polynoidae
83 SFP28 - 001|Sthenelais boa| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
8
48
Sigalionidae
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY839587.1| SWEDEN
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473445.1| CANADA
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473448.1| CANADA
41
33 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473444.1| CANADA
Polynoidae
58 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672399.1| RUSSIA
16 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: HQ024378.1| CANADA
BLAST
Bipalponephtys
neotena - GenBank:
GU672455.1|abordados
RUSSIA
Anexo/Figura F2.
Árvore
NJ de aminoácidos
de poliquetas
no capítulo 2 provenientes de diversos
82 BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672458.1| RUSSIA
locais geográficos. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas
Bipalponephtys
neotena - GenBank:
RUSSIA
laterais mostram aBLAST
localização
das diferentes
famílias GU672457.1|
(continuação).
BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672310.1| CANADA
BLAST Nephtys hombergii - GenBank: GU179410.1| PORTUGAL
94
SFP13 - 001|Nephtys sp.| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
36
91
78 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023590.1| CANADA
78 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023586.1| CANADA
64
51
BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: GU672313.1| CANADA
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
35 BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
151
Nephtyidae
SFP4 - 002|Polynoidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
BLAST Harmothoe impar - GenBank: JN852930.1| SWEDEN
6
Polynoidae
83 SFP28 - 001|Sthenelais boa| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
8
Sigalionidae
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY839587.1| SWEDEN
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473445.1| CANADA
48
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473448.1| CANADA
41
33 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: HM473444.1| CANADA
Polynoidae
58 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672399.1| RUSSIA
16 BLAST Micronephthys minuta - GenBank: HQ024378.1| CANADA
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672455.1| RUSSIA
82 BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672458.1| RUSSIA
BLAST Bipalponephtys neotena - GenBank: GU672457.1| RUSSIA
BLAST Micronephthys minuta - GenBank: GU672310.1| CANADA
BLAST Nephtys hombergii - GenBank: GU179410.1| PORTUGAL
94
SFP13 - 001|Nephtys sp.| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
78 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023590.1| CANADA
91
36
78 BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: HQ023586.1| CANADA
Nephtyidae
BLAST Nephtys longosetosa - GenBank: GU672313.1| CANADA
64
51
BLAST Nephtys hystricis - GenBank: GU179411.1| SWEDEN
35 BLAST Nephtys cirrosa - GenBank: GU179408.1| PORTUGAL
70 LMBSAP16-002|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
LMBSAP16-003|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
SFP27 - 001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
36
LMBSAP16-001|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuarios do Alentejo - Praia de S. Torpes)
LMBSAP16-004|Nephtys hombergii| PORTUGAL (Estuario do Sado)
19
26 BLAST Nephtys sp. - GenBank: HQ024111.1| CANADA
59 BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172736.1| USA
65 BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172741.1| USA
28 BLAST Phragmatopoma caudata - GenBank: DQ172755.1| USA
63
BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172688.1| USA
89
BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172683.1| USA
Sabellaridae
BLAST Phragmatopoma californica - GenBank: DQ172704.1| USA
99
LMBLP4-001|Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Tejo)
SFP21-2 Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
95
41 LMBLP4-002|Sabellaria alveolata| PORTUGAL (Estuario do Tejo)
LPCSED3|Scolelepis foliosa| PORTUGAL (Estuario do Lima)
65
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023788.1| CANADA
65
40
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023790.1| CANADA
76
BLAST Spio sp. - GenBank: HQ023791.1| CANADA
63
BLAST Spionidae - GenBank: HM375486.1| CANADA
89 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473679.1| CANADA
9984 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
Spionidae
BLAST Spionidae - GenBank: GU672502.1| RUSSIA
56
BLAST Spionidae - GenBank: HQ024464.1| CANADA
69 BLAST Spionidae - GenBank: GU672476.1| RUSSIA
11
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024462.1| CANADA
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024461.1| CANADA
15
BLAST Spionidae - GenBank: HM375492.1| CANADA
56
73 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024460.1| CANADA
62 BLAST Arenicola marina - GenBank: JQ950326.1| FRANCE
42 BLAST Arenicola marina - GenBank: JQ950327.1| FRANCE
26 BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023449.1| CANADA
Anexo/Figura F2.
Árvore NJ de aminoácidos de poliquetas abordados no capítulo 2 provenientes de diversos
85
locais geográficos. FoiBLAST
utilizado
o modelo
evolução
K2P e oCANADA
teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas
Arenicola
marina -de
GenBank:
HQ023443.1|
Arenicolidae
laterais mostram a66localização
das diferentes
famílias
(continuação).
BLAST Arenicola
marina - GenBank:
HQ023442.1|
CANADA
40
99
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487320.1| NETHERLANDS
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487319.1| NETHERLANDS
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487321.1| NETHERLANDS
152
81
RR70|Praxillella praetermissa| PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Maldanidae - GenBank: HQ023889.1| CANADA
90
43 RR78|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
97
RR116b|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Spionidae - GenBank: GU672502.1| RUSSIA
56
BLAST Spionidae - GenBank: HQ024464.1| CANADA
69 BLAST Spionidae - GenBank: GU672476.1| RUSSIA
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024462.1| CANADA
11
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024461.1| CANADA
15
BLAST Spionidae - GenBank: HM375492.1| CANADA
56
73 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: HQ024460.1| CANADA
62 BLAST Arenicola marina - GenBank: JQ950326.1| FRANCE
42 BLAST Arenicola marina - GenBank: JQ950327.1| FRANCE
26 BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023449.1| CANADA
85
BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023443.1| CANADA
Arenicolidae
66
BLAST Arenicola marina - GenBank: HQ023442.1| CANADA
40
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487320.1| NETHERLANDS
99
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487319.1| NETHERLANDS
BLAST Arenicola marina - GenBank: GQ487321.1| NETHERLANDS
RR70|Praxillella praetermissa| PORTUGAL (Estuario do Sado)
81
BLAST Maldanidae - GenBank: HQ023889.1| CANADA
43 RR78|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
90
97
23
RR116b|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
RR90|Euclymene santanderensis| PORTUGAL (Estuario do Sado)
RR91|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
53
97 59
RR127|Euclymene robusta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
RR74|Leiochone leiopygos| PORTUGAL (Estuario do Sado)
49 BLAST Axiothella rubrocincta - GenBank: HM473325.1| CANADA
49 BLAST Axiothella rubrocincta - GenBank: HM473326.1| CANADA
RR89|Axyothela constricta| PORTUGAL (Estuario do Sado)
25
Maldanidae
61 11 BLAST Maldanidae - GenBank: HM473461.1| CANADA
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
21
76 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
26
11
BLAST Maldanidae - GenBank: EU835661.1| AUSTRALIA
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473649.1| CANADA
58
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672356.1| CANADA
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672610.1| CANADA
99
22
13
17
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024016.1| CANADA
BLAST Euclymene zonalis - GenBank: GU672589.1| RUSSIA
BLAST Praxillella praetermissa - GenBank: GU672285.1| CANADA
71 BLAST Euclymene zonalis - GenBank: HQ024015.1| CANADA
44 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: GQ456164.1| PORTUGAL
47 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: EU878539.1| PORTUGAL
18 BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: JQ950321.1| PORTUGAL
8
39
62
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428834.1| WESTERM EUROPE
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428848.1| WESTERN EUROPE
BLAST Diopatra neapolitana - GenBank: FJ428951.1| WESTERN EUROPE
SFP6 - 002|Diopatra neopolitana| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
99
Onuphidae
BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ428915.1| WESTERN EUROPE
94
44
BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ646632.1| PORTUGAL
59 BLAST Diopatra marocensis - GenBank: GQ456165.1| PORTUGAL
BLAST Onuphis elegans - GenBank: GQ497525.1| USA
BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428892.1| WESTERN EUROPE
52
95
BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428894.1| WESTERN EUROPE
68 BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428893.1| WESTERN EUROPE
94 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473695.1| CANADA
90 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473700.1| CANADA
61 BLAST Syllis
Anexo/Figura F2. Árvore NJ de aminoácidos
de poliquetas
abordados
no capítulo
2 provenientes de diversos
elongata - GenBank:
HM473696.1|
CANADA
35 de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas
locais geográficos. Foi utilizado o modelo
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473699.1| CANADA
laterais mostram a localização das diferentes
famílias (continuação).
99
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473697.1| CANADA
99
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473701.1| CANADA
SS18|Trypanosyllis zebra| PORTUGAL (Estuario do Sado)
98
92
SFP24 - 002|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP24 - 003|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
98
100
SFP24 - 005|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
79 SFP24 - 001|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
4
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903793.1| SPAIN
21
Syllidae
153
99 SFP6 - 002|Diopatra neopolitana| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Onuphidae
BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ428915.1| WESTERN EUROPE
94
44
BLAST Diopatra marocensis - GenBank: FJ646632.1| PORTUGAL
59 BLAST Diopatra marocensis - GenBank: GQ456165.1| PORTUGAL
BLAST Onuphis elegans - GenBank: GQ497525.1| USA
BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428892.1| WESTERN EUROPE
52
95
BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428894.1| WESTERN EUROPE
68 BLAST Diopatra cuprea - GenBank: FJ428893.1| WESTERN EUROPE
94 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473695.1| CANADA
90 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473700.1| CANADA
61 BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473696.1| CANADA
35
99
99
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473699.1| CANADA
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473697.1| CANADA
BLAST Syllis elongata - GenBank: HM473701.1| CANADA
SS18|Trypanosyllis zebra| PORTUGAL (Estuario do Sado)
98
Syllidae
92 SFP24 - 002|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
SFP24 - 003|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
98
100
SFP24 - 005|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
79 SFP24 - 001|Syllis sp.| PORTUGAL (Estuario do Lima)
4
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903793.1| SPAIN
21
99
BLAST Trypanosyllis zebra - GenBank: JF903790.1| SPAIN
RR97|Orbinidae | PORTUGAL (Estuario do Sado)
77 BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU670786.1| RUSSIA
100 BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU670784.1| RUSSIA
62
BLAST Naineris quadricuspida - GenBank: GU672621.1| RUSSIA
BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU670811.1| RUSSIA
Orbinidae
100
BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU670802.1| RUSSIA
BLAST Scoloplos armiger - GenBank: GU672619.1| RUSSIA
99
BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670794.1| RUSSIA
BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670792.1| RUSSIA
64
BLAST Scoloplos acutus - GenBank: GU670791.1| RUSSIA
69 BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
61 BLAST Marphysa viridis - GenBank: GQ497553.1| USA
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
51
46 BLAST Marphysa californica - GenBank: GQ497552.1| USA
29
6
LMBSAP27-001|Marphysa sp.| PORTUGAL (Estuario do Sado)
100
BLAST Marphysa brevitentaculata - GenBank: GQ497548.1| USA
Eunicidae
36
LMBSAP23-001|Marphysa sanguinea| PORTUGAL (Estuario do Sado)
BLAST Lysidice collaris - GenBank: GQ497557.1| USA
56
100 BLAST Lysidice collaris - GenBank: KC208488.1| INDIA
BLAST Palola viridis - GenBank: JN558581.1| AMERICAN SAMOA
99
BLAST Palola viridis - GenBank: JN558582.1| AMERICAN SAMOA
46 BLAST Palola viridis - GenBank: JN558584.1| AMERICAN SAMOA
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319473.1| FRANCE
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319469.1| FRANCE
68 BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319459.1| FRANCE
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319457.1| FRANCE
34 BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319458.1| FRANCE
71
5
BLAST Owenia fusiformis - GenBank: DQ319471.1| FRANCE
Owenidae
SFP26 - 002|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
83
SFP26 - 003|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
71
SFP26 - 001|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672574.1| RUSSIA
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672611.1| RUSSIA
100
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672578.1| RUSSIA
82 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023478.1| CANADA
58 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023477.1| CANADA
27 BLAST Cirratulus
Anexo/Figura F2. Árvore NJ de aminoácidos
de poliquetas
abordados
capítulo 2 provenientes de diversos
cirratus - GenBank:
HQ024288.1|no
CANADA
63 de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas
locais geográficos.
Foi
utilizado
o
modelo
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: GU672480.1| RUSSIA
22
62
laterais mostram a localização das diferentes
famílias
(continuação).
BLAST
Cirratulus cirratus
- GenBank: GU672216.1| CANADA
Cirratulidae
100
100
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM473343.1| CANADA
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM417794.1| RUSSIA
LMBP23-1|Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
154
88 LMBP23-2 Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
32
72 BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023454.1| CANADA
88 BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023460.1| CANADA
BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023458.1| CANADA
83
SFP26 - 003|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
71
SFP26 - 001|Owenia fusiformis| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672574.1| RUSSIA
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672611.1| RUSSIA
100
BLAST Galathowenia oculata - GenBank: GU672578.1| RUSSIA
82 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023478.1| CANADA
58 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ023477.1| CANADA
27 BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HQ024288.1| CANADA
63
22
62
100
100
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: GU672480.1| RUSSIA
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: GU672216.1| CANADA
Cirratulidae
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM473343.1| CANADA
BLAST Cirratulus cirratus - GenBank: HM417794.1| RUSSIA
LMBP23-1|Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
88
LMBP23-2 Cirriformia tentaculata| PORTUGAL (Estuario do Lima)
72 BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023454.1| CANADA
32
88
BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023460.1| CANADA
BLAST Asabellides sp. - GenBank: HQ023458.1| CANADA
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023432.1| CANADA
100
88 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
64
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ024261.1| CANADA
Ampharetidae
28 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473290.1| CANADA
32
40
43
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473291.1| CANADA
BLAST Ampharetidae - GenBank: GU672575.1| RUSSIA
BLAST Ampharetidae - GenBank: GU672573.1| RUSSIA
19 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473292.1| CANADA
100 SFP1 - 001|Alkmaria romijni| PORTUGAL (Ria de Aveiro)
Ampharetidae
SFP22 - 003|Ampharetidae | PORTUGAL (Ria de Aveiro)
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA
100
16
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ023774.1| CANADA
99 BLAST Polycirrus medusa GenBank: GU672524.1| RUSSIA
94
BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672483.1| RUSSIA
Terebellidae
BLAST Terebellidae - GenBank: HM417788.1| RUSSIA
91
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024451.1| CANADA
74
99
BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024452.1| CANADA
86 BLAST Polycirrus sp. - GenBank: HQ024453.1| CANADA
OUTGROUP (Oligochaeta)
100
0.05
Anexo/Figura F2. Árvore NJ de aminoácidos de poliquetas abordados no capítulo 2 provenientes de diversos
locais geográficos. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas
laterais mostram a localização das diferentes famílias (continuação).
155
97 BLAST Nereis vexillosa - GenBank: HM473511.1| CANADA
100
BLAST Nereis vexillosa - GenBank: HM473504.1| CANADA
MOTU 1
BLAST Nereis vexillosa - GenBank: HM473510.1| CANADA
65
BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023951.1| CANADA
100
79
BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023963.1| CANADA
MOTU 2
85 BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023939.1| CANADA
Nereididae
PGC00029 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
63
BLAST Nereis pelagica - GenBank: HQ024125.1| CANADA
83
BLAST Nereis pelagica - GenBank: HQ023603.1| CANADA
100
MOTU 3
100 BLAST Nereis pelagica - GenBank: GU672328.1| CANADA
CHEP0011 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
19
78 BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426630.1| SE ATLANTIC
100 BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426632.1| SE ATLANTIC
MOTU 4
BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426631.1| SE ATLANTIC
66 BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024038.1| CANADA
80
100 BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024029.1| CANADA
MOTU 5
Glyceridae
BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024033.1| CANADA
PGC00022 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
53
1
100
68
PGC00023 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 6
CHEP0009 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
86 PGC00021 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Arabella semimaculata - GenBank: AY838866.1| USA
66
83
BLAST Arabella iricolor - GenBank: GU362693.1| CHINA
Oenonidae
PGC00078 Tainokia sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
92
100
7
BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644805.1| WESTERN ATLANTIC
BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644802.1| NORWAY
MOTU 7
BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644804.1| NORWAY
99
BLAST Nereimyra punctata - GenBank: AY644790.1| SWEDEN
100
BLAST Nereimyra punctata - GenBank: AY644795.1| NORWAY
MOTU 8
70 BLAST Nereimyra punctata - GenBank: GU672539.1| RUSSIA
50
BLAST Leocrates chinensis - GenBank: DQ442565.1| FRANCE
1
CHEP0001 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Hesionidae
74
PBB00011 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
PBB00005 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
31
PGC00075 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
23
53 PGC00026 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
22
MOTU 9
PGC00074|Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
24 PGC00025 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
57 PBB00006 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100 PGC00036 Fimbriosthenelais zetlandica| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
54
MOTU 10 (Sigalionidae)
PGC00035 Sthenelais boa| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Anexo/Figura F3. Árvore NJ de nucleótidos
de Panthalis
poliquetas
provenientes
de (Gulf
diversos
geográficos. Foi
PGC00016
oerstedi|
ATLANTIC OCEAN
of Cadiz)locais
Acoetidae
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste
de
Bootstrap
com
1000
replicações.
As
linhas
laterais
mostram a
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY894321.1| USA Sigalionidae
localização das diferentes famílias e os MOTUs representam grupos monofiléticos com <3% de divergência
PAS00007 Lepidasthenia sp.| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
intraespecífica. Realçado a azul, são100as sequências COI do projecto de Marina R. Cunha e Ascensão Ravara
PBB00002
presentes33 na BOLD, abordadas no capítulo
3. Lepidasthenia cf. brunnea| NE ATLANTIC (Bay of Biscay) MOTU 11
PAS00008 Lepidasthenia sp.| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
64
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503014.1| SOUTH KOREA
156
28
51
100
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503015.1| SOUTH KOREA
76 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503013.1| SOUTH KOREA
BLAST Lepidasthenia elegans - GenBank: JN852933.1| SWEDEN
54 BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473321.1| CANADA
Polynoidae
MOTU 12
100
PBB00005 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
31
PGC00075 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 9
23
53 PGC00026 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
22
PGC00074|Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
24 PGC00025 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
57 PBB00006 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100 PGC00036 Fimbriosthenelais zetlandica| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
54
MOTU 10 (Sigalionidae)
PGC00035 Sthenelais boa| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00016 Panthalis oerstedi| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY894321.1| USA
Acoetidae
Sigalionidae
PAS00007 Lepidasthenia sp.| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
100
33
PBB00002 Lepidasthenia cf. brunnea| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
MOTU 11
PAS00008 Lepidasthenia sp.| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
64
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503014.1| SOUTH KOREA
28
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503015.1| SOUTH KOREA
100
76 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503013.1| SOUTH KOREA
51
Polynoidae
MOTU 12
BLAST Lepidasthenia elegans - GenBank: JN852933.1| SWEDEN
54 BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473321.1| CANADA
100
BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473323.1| CANADA
MOTU 13
BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473320.1| CANADA
100
BLAST Arctonoe pulchra - GenBank: HM473310.1| CANADA
52
Polynoidae
84
BLAST Arctonoe pulchra - GenBank: HM473317.1| CANADA
100
MOTU 14
81 BLAST Arctonoe pulchra - GenBank: HM473301.1| CANADA
33
CHEP0005 Subadyte pellucida| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Lepidasthenia berkeleyae - GenBank: HM473443.1| CANADA
PGC00072 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
65
1
29
Polynoidae
PGC00027 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100 PAS00009 Harmothoe evei| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
61
Hesionidae
MOTU 15
PGC00073 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
86
PGC00034 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100 BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: GQ478953.1| NORWAY
100
37
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: GQ478949.1| NORWAY
MOTU 16
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: GU672445.1| RUSSIA
BLAST Harmothoe fragilis - GenBank: HM473407.1| CANADA
43
100 BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473740.1| USA
100
MOTU 17
Polynoidae
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473743.1| USA
46
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HQ024019.1| CANADA
34
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HM473428.1| CANADA
100
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024058.1| CANADA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024356.1| CANADA
65
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473732.1| USA
99
100
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473733.1| USA
MOTU 18
68 BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473731.1| USA
31 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672273.1| CANADA
100 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672268.1| CANADA
MOTU 19
Anexo/Figura F3. Árvore NJ de nucleótidos
de poliquetas
de diversos
BLAST Prionospio
steenstrupiprovenientes
- GenBank: GU672264.1|
CANADA locais geográficos. Foi
77
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a
Prionospio sp. - GenBank: FM212789.1| EASTERN MEDITERRANEAN
localização das diferentes famílias eBLAST
os MOTUs
representam grupos monofiléticos com <3% de divergência
Prionospio sp. COI
- GenBank:
FM212792.1|deEASTERN
MOTU 20 Ravara
intraespecífica. Realçado a azul, 100
são BLAST
as sequências
do projecto
MarinaMEDITERRANEAN
R. Cunha e Ascensão
presentes
na
BOLD,
abordadas
no
capítulo
3
(continuação).
57
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212788.1| EASTERN MEDITERRANEAN
32
Spionidae
63 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672370.1| CANADA
100 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672153.1| CANADA
1
157
MOTU 21
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672198.1| CANADA
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
95
100
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
MOTU 22
BLAST Harmothoe fragilis - GenBank: HM473407.1| CANADA
43
100 BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473740.1| USA
100
MOTU 17
Polynoidae
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473743.1| USA
46
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HQ024019.1| CANADA
34
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HM473428.1| CANADA
100
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024058.1| CANADA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024356.1| CANADA
65
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473732.1| USA
99
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473733.1| USA
100
MOTU 18
68 BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473731.1| USA
31 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672273.1| CANADA
100 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672268.1| CANADA
MOTU 19
BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672264.1| CANADA
77
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212789.1| EASTERN MEDITERRANEAN
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212792.1| EASTERN MEDITERRANEAN
100
MOTU 20
57 BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212788.1| EASTERN MEDITERRANEAN
32
Spionidae
63 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672370.1| CANADA
100 BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672153.1| CANADA
1
MOTU 21
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672198.1| CANADA
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
95
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
100
MOTU 22
99 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473679.1| CANADA
41 PGC00041 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
4
31 PGC00038 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100 PGC00040 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 23
Spionidae
PGC00043 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
34 PGC00042 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00039 Spionidae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PAS00002 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
12
Poecilochaetidae
98 PAS00001 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
100
54
PBB00001 Poecilochaetus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
MOTU 24 (Poecilochaetidae)
PAS00003 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432012.1| GERMANY
48
100
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432015.1| GERMANY
MOTU 25 (Spionidae)
48 BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432014.1| GERMANY
81
100
76
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219838.1| NEW ZEALAND
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219804.1| NEW ZEALAND
MOTU 26
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219817.1| NEW ZEALAND
PGC00049 Hyalinoecia tubicola| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
92
Onuphidae
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473514.1| CANADA
3
100
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473519.1| CANADA
MOTU 27
54 BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473517.1| CANADA
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
99
49
83
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
PGC00077de
Marphysa
bellii| ATLANTIC
OCEAN (Gulf of Cadiz)
Anexo/Figura F3. Árvore NJ de nucleótidos
poliquetas
provenientes
de diversos locais geográficos. Foi
Eunice
norvegica|ATLANTIC
of Cadiz)
utilizado o modelo de evolução K2P
teste de
Bootstrap
com OCEAN
1000(Gulf
replicações.
As linhas laterais mostram a
100 e oPGC00076
MOTU 28
localização das
diferentes100famílias e os
MOTUs
representam
gruposUSA
monofiléticos com <3% de divergência
BLAST
Eunice norvegica
- GenBank: GQ497541.1|
64
intraespecífica. Realçado a azul, são PBB00008
as sequências
do (Bay
projecto
Eunice sp.| NECOI
ATLANTIC
of Biscay) de Marina R. Cunha e Ascensão Ravara
presentes na BOLD, abordadas no capítulo 3 (continuação).
100 PGC00003 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
40
Eunicidae
MOTU 29
PGC00002 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Eunice harassii - GenBank: GQ497535.1| USA
82
BLAST Eunice antarctica - GenBank: GQ497532.1| USA
68
PBB00007 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
MOTU 30
98
68
8
PBB00009 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PBB00010 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
91 BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017577.1| ATLANTIC OCEAN
158
100
73
68
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017550.1| ATLANTIC OCEAN
MOTU 31
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017598.1| SAO TOME AND PRINCIPE
BLAST Pareurythoe borealis - GenBank: JN086550.1| MEDITERRANEAN SEA
Amphinomidae
48 BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432014.1| GERMANY
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219838.1| NEW ZEALAND
81
100
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219804.1| NEW ZEALAND
76
MOTU 26
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219817.1| NEW ZEALAND
PGC00049 Hyalinoecia tubicola| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
92
Onuphidae
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473514.1| CANADA
3
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473519.1| CANADA
100
MOTU 27
54 BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473517.1| CANADA
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
99
49
83
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
PGC00077 Marphysa bellii| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00076 Eunice norvegica|ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
MOTU 28
100
64
BLAST Eunice norvegica - GenBank: GQ497541.1| USA
PBB00008 Eunice sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100 PGC00003 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
40
Eunicidae
MOTU 29
PGC00002 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Eunice harassii - GenBank: GQ497535.1| USA
82
BLAST Eunice antarctica - GenBank: GQ497532.1| USA
68
PBB00007 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
100
MOTU 30
98
68
8
PBB00009 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PBB00010 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
91 BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017577.1| ATLANTIC OCEAN
100
73
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017550.1| ATLANTIC OCEAN
MOTU 31
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017598.1| SAO TOME AND PRINCIPE
68
Amphinomidae
BLAST Pareurythoe borealis - GenBank: JN086550.1| MEDITERRANEAN SEA
PGC00001 Pareurythoe borealis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
98 BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: GU672570.1| RUSSIA
100
60
12
BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: HQ023882.1| CANADA
MOTU 32
BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: GU672337.1| CANADA
53
PGC00011 Lumbrineris gracilis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PBB00004 Lumbrineridae| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
Lumbrineridae
100 BLASY Lumbrineris tetraura - GenBank: GU362689.1| CHINA
92
MOTU 33
BLAST Lumbrineris tetraura - GenBank: EU352318.1| CHINA
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024127.1| CANADA
50
40
100
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024159.1| CANADA
MOTU 34
60 BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024144.1| CANADA
PGC00012 Lumbrineridae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Lumbrineridae
60 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
100 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473651.1| CANADA
32
MOTU 35
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
PAS00012 Maldanidae| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
29
Maldanidae
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672597.1| RUSSIA
100
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672576.1| RUSSIA
MOTU 36
54 BLAST Maldane sarsi - GenBank: HQ024362.1| CANADA
58 PAS00004 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
100
PAS00005 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
MOTU 37
SEA (Alboran Sea)
MEDITERRANEAN
PAS00006 Pista cristata|
Anexo/Figura
de poliquetas
provenientes
de diversos locais geográficos. Foi
38 F3. Árvore NJ de nucleótidos
utilizado o modelo de evolução K2PBLAST
e oPista
teste
de
Bootstrap
com
1000
replicações.
As linhas laterais mostram a
maculata - GenBank: HQ023774.1| CANADA
16
localização das diferentes famílias e os MOTUs representam grupos monofiléticos com <3% de divergência
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA MOTU 38
Terebellidae
100
29 Realçado a azul,
intraespecífica.
são as sequências COI do projecto de Marina R. Cunha e Ascensão Ravara
49 BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
presentes na BOLD, abordadas no capítulo 3 (continuação).
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: HQ024409.1| CANADA
100
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU670826.1| RUSSIA
MOTU 39
100 BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU672559.1| RUSSIA
66
100 CHEP0003 Nicolea venustula| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
39
PGC00044 Pterolysippe vanelli| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PBB00003 Polycirrus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
77 BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ024485.1| CANADA
Terebellidae
MOTU 40
Ampharetidae
Terebellidae
159
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024127.1| CANADA
50
40
100
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024159.1| CANADA
MOTU 34
60 BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024144.1| CANADA
PGC00012 Lumbrineridae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Lumbrineridae
60 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
100 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473651.1| CANADA
32
MOTU 35
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
PAS00012 Maldanidae| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
29
Maldanidae
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672597.1| RUSSIA
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672576.1| RUSSIA
100
MOTU 36
54 BLAST Maldane sarsi - GenBank: HQ024362.1| CANADA
58 PAS00004 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
100
PAS00005 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
MOTU 37
PAS00006 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
38
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ023774.1| CANADA
16
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA
100
29
MOTU 38
Terebellidae
49 BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: HQ024409.1| CANADA
100
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU670826.1| RUSSIA
MOTU 39
100 BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU672559.1| RUSSIA
66
100 CHEP0003 Nicolea venustula| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
39
Terebellidae
MOTU 40
PGC00044 Pterolysippe vanelli| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PBB00003 Polycirrus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
Ampharetidae
Terebellidae
77 BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ024485.1| CANADA
100
29
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ023920.1| CANADA
MOTU 41
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ932561.1| CANADA
82
PGC00045 Amphitrite cf. cirrata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 42
100 PGC00047 Neoamphitrite| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
CHEP0010 Neoamphitrite affinis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
50
100 BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672483.1| RUSSIA
MOTU 43
BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672524.1| RUSSIA
15
84 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024197.1| CANADA
100 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024199.1| CANADA
21 62
Terebellidae
MOTU 44
BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024200.1| CANADA
CHEP0013 Polycirrus norvegicus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
83 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023984.1| CANADA
19
100 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023970.1| CANADA
MOTU 45
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023978.1| CANADA
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473492.1| CANADA
100
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473490.1| CANADA
53
MOTU 46
100 BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473491.1| CANADA
100 PGC00071 Natsushima bifurcata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
84
MOTU 47
BLAST Natsushima bifurcata - GenBank: JF304492.1|ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Nautiliniellidae
Anexo/Figura F3. Árvore NJ de nucleótidos de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi
BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304496.1| COSTA RICA
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas laterais mostram
a
MOTU 48
100
100 BLASTgrupos
Natsushimamonofiléticos
sp. - GenBank: JF304497.1|
RICA divergência
localização das diferentes famílias e os MOTUs representam
com COSTA
<3% de
intraespecífica. Realçado a azul, são as sequências COI do BLAST
projecto
de Marina
R. Cunha
e Ascensão
Ravara
Vigtorniella
ardabilia - GenBank:
EU555061.1|
NE ATLANTIC
presentes na BOLD, abordadas no capítulo 3 (continuação). BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555064.1| NE ATLANTIC MOTU 49 (Chrysopetalidae)
100
54 BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555059.1| NE ATLANTIC
64 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473292.1| CANADA
100 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473290.1| CANADA
88
48
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473291.1| CANADA
Ampharetidae
100
160
MOTU 50
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ024261.1| CANADA
MOTU 51
100 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
BLAST Eclysippe vanelli - GenBank: JX423766.1| NORWAY
75 BLAST Eumida notata - GenBank: HM358713.1| PORTUGAL (Madeira)
100 BLAST Eumida notata - GenBank: HM358712.1| PORTUGAL (Madeira)
MOTU 52
100 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024199.1| CANADA
21 62
MOTU 44
BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024200.1| CANADA
CHEP0013 Polycirrus norvegicus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
83 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023984.1| CANADA
19
100 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023970.1| CANADA
MOTU 45
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023978.1| CANADA
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473492.1| CANADA
100
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473490.1| CANADA
53
MOTU 46
100 BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473491.1| CANADA
100 PGC00071 Natsushima bifurcata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
84
MOTU 47
BLAST Natsushima bifurcata - GenBank: JF304492.1|ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Nautiliniellidae
BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304496.1| COSTA RICA
100
MOTU 48
100 BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304497.1| COSTA RICA
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555061.1| NE ATLANTIC
100
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555064.1| NE ATLANTIC
MOTU 49 (Chrysopetalidae)
54 BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555059.1| NE ATLANTIC
64 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473292.1| CANADA
100 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473290.1| CANADA
48
MOTU 50
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473291.1| CANADA
88
Ampharetidae
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ024261.1| CANADA
100
MOTU 51
100 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
BLAST Eclysippe vanelli - GenBank: JX423766.1| NORWAY
75 BLAST Eumida notata - GenBank: HM358713.1| PORTUGAL (Madeira)
100 BLAST Eumida notata - GenBank: HM358712.1| PORTUGAL (Madeira)
98
MOTU 52
BLAST Eumida notata - GenBank: HM358708.1| SWEDEN
89
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358686.1| SWEDEN
100
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358690.1| SWEDEN
MOTU 53
79 BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358688.1| SWEDEN
91 BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473581.1| CANADA
100
100 BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473577.1| CANADA
Phyllodocidae
MOTU 54
BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473582.1| CANADA
PAS00011 Phyllodoce madeirensis| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
95
PGC00032 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
42
100
PGC00030 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
MOTU 55
100 PGC00031 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
OUTGROUP (Oligochaeta)
100
0.05
Anexo/Figura F3. Árvore NJ de nucleótidos de poliquetas provenientes de diversos locais geográficos. Foi
utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As linhas laterais mostram a
localização das diferentes famílias e os MOTUs representam grupos monofiléticos com <3% de divergência
intraespecífica. Realçado a azul, são as sequências COI do projecto de Marina R. Cunha e Ascensão Ravara
presentes na BOLD, abordadas no capítulo 3 (continuação).
161
BLAST Harmothoe fragilis - GenBank: HM473407.1| CANADA
BLAST Lepidasthenia berkeleyae - GenBank: HM473443.1| CANADA
PAS00009 Harmothoe evei| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
PGC00034 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00073 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
12
PAS00008 Lepidasthenia sp.| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
PAS00007 Lepidasthenia sp.| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
Polynoidae
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503015.1| SOUTH KOREA
15 BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503013.1| SOUTH KOREA
BLAST Lepidonotus squamatus - GenBank: JX503014.1| SOUTH KOREA
PBB00002 Lepidasthenia cf. brunnea| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PGC00072 Harmothoe evei| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Lepidasthenia elegans - GenBank: JN852933.1| SWEDEN
39
11
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HQ024019.1| CANADA
40
37
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473743.1| USA
Polynoidae
BLAST Eunoe oerstedi - GenBank: HM473740.1| USA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024356.1| CANADA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HM473428.1| CANADA
Polynoidae
4
99 PGC00036 Fimbriosthenelais zetlandica| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
8
54
1
PGC00035 Sthenelais boa| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Sigalionidae
BLAST Sthenelais boa - GenBank: AY894321.1| USA
8
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473733.1| USA
BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473731.1| USA
Polynoidae
61 BLAST Eunoe depressa - GenBank: HM473732.1| USA
BLAST Harmothoe rarispina - GenBank: HQ024058.1| CANADA
CHEP0005 Subadyte pellucida| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
41
BLAST Arctonoe pulchra - GenBank: HM473317.1| CANADA
50
BLAST Arctonoe pulchra - GenBank: HM473310.1| CANADA
72
BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473321.1| CANADA
Polynoidae
BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473323.1| CANADA
54 BLAST Arctonoe vittata - GenBank: HM473320.1| CANADA
98
BLAST Arctonoe pulchra - GenBank: HM473301.1| CANADA
PGC00027 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Hesionidae
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: GU672445.1| RUSSIA
48
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: GQ478953.1| NORWAY
Polynoidae
83
BLAST Harmothoe imbricata - GenBank: GQ478949.1| NORWAY
PGC00016 Panthalis oerstedi| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Acoetidae
41 BLAST Nereis vexillosa - GenBank: HM473504.1| CANADA
78 BLAST Nereis vexillosa - GenBank: HM473510.1| CANADA
51
9
54
75
BLAST Nereis vexillosa - GenBank: HM473511.1| CANADA
BLAST Nereis pelagica - GenBank: HQ024125.1| CANADA
BLAST Nereis pelagica - GenBank: HQ023603.1| CANADA
63
BLAST Nereis pelagica - GenBank: GU672328.1| CANADA
Nereididae
PGC00029 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
71
CHEP0011 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023939.1| CANADA
96
BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023963.1| CANADA
92
75 BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023951.1| CANADA
47 BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644802.1| NORWAY
13 BLAST Nereimyra punctata - GenBank: GU672539.1| RUSSIA
13
18 BLAST Nereimyra punctata - GenBank: AY644795.1| NORWAY
Anexo/Figura F4. Árvore
NJ de aminoácidos de poliquetas abordados no capítulo 3 provenientes de diversos
51
BLASToNereimyra
- GenBank:
locais geográficos. Foi utilizado
modelo punctata
de evolução
K2PAY644790.1|
e o testeSWEDEN
de Bootstrap com 1000 replicações. As
18
99
BLAST Nereimyra
woodsholeafamílias.
- GenBank: AY644804.1| NORWAY
linhas laterais mostram a localização
das diferentes
BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644805.1| WESTERN ATLANTIC
63
76
CHEP0001 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Leocrates chinensis - GenBank: DQ442565.1| FRANCE
PGC00026 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
162
81
PGC00025 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00075 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00074|Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
77
PBB00011 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
Hesionidae
75
BLAST Nereis pelagica - GenBank: HQ023603.1| CANADA
63
BLAST Nereis pelagica - GenBank: GU672328.1| CANADA
Nereididae
PGC00029 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
71
CHEP0011 Eunereis longissima| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023939.1| CANADA
96
BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023963.1| CANADA
92
75 BLAST Alitta virens - GenBank: HQ023951.1| CANADA
47 BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644802.1| NORWAY
13 BLAST Nereimyra punctata - GenBank: GU672539.1| RUSSIA
13
18 BLAST Nereimyra punctata - GenBank: AY644795.1| NORWAY
51
18
BLAST Nereimyra punctata - GenBank: AY644790.1| SWEDEN
99
BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644804.1| NORWAY
BLAST Nereimyra woodsholea - GenBank: AY644805.1| WESTERN ATLANTIC
CHEP0001 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
63
76
BLAST Leocrates chinensis - GenBank: DQ442565.1| FRANCE
Hesionidae
PGC00026 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00025 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
81
PGC00075 Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00074|Leocrates atlanticus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
77
PBB00011 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PBB00005 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PBB00006 Leocrates atlanticus| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
16
PGC00012 Lumbrineridae| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Lumbrineridae
PGC00078 Tainokia sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
31
BLAST Arabella semimaculata - GenBank: AY838866.1| USA
88
Oenonidae
91 BLAST Arabella iricolor - GenBank: GU362693.1| CHINA
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672198.1| CANADA
98
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672153.1| CANADA
BLAST Scolelepis sp. - GenBank: GU672370.1| CANADA
99
Spionidae
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473680.1| CANADA
BLAST Scolelepis squamata - GenBank: HM473679.1| CANADA
99
99 BLAST Scolelepis squamata - GenBank: KC208487.1| INDIA
79 BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672264.1| CANADA
100
50
BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672273.1| CANADA
BLAST Prionospio steenstrupi - GenBank: GU672268.1| CANADA
98
Spionidae
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212789.1| EASTERN MEDITERRANEAN
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212792.1| EASTERN MEDITERRANEAN
100
BLAST Prionospio sp. - GenBank: FM212788.1| EASTERN MEDITERRANEAN
8
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432014.1| GERMANY
36
98
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432012.1| GERMANY
Spionidae
BLAST Malacoceros fuliginosus - GenBank: EF432015.1| GERMANY
61
PAS00002 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
PBB00001 Poecilochaetus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
63
Poecilochaetidae
99
PAS00003 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
80 PAS00001 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
77 BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017577.1| ATLANTIC OCEAN
48
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017550.1| ATLANTIC OCEAN
64
83
BLAST Pareurythoe borealis - GenBank: JN086550.1| MEDITERRANEAN SEA
Amphinomidae
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017598.1| SAO TOME AND PRINCIPE
PGC00001 Pareurythoe borealis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00022 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
70
98
PGC00023 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
CHEP0009 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Anexo/Figura F4. Árvore NJ de aminoácidos de poliquetas abordados no capítulo 3 provenientes de diversos
PGC00021 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
88
locais geográficos. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As
BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426631.1| SE ATLANTIC
linhas laterais
mostram a localização das diferentes famílias (continuação).
Glyceridae
50
98
96
BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426630.1| SE ATLANTIC
62 BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426632.1| SE ATLANTIC
BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024029.1| CANADA
100
BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024033.1| CANADA
78 BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024038.1| CANADA
BLAST Eumida notata - GenBank: HM358708.1| SWEDEN
9
67
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358690.1| SWEDEN
99 BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358688.1| SWEDEN
163
PBB00001 Poecilochaetus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
63
Poecilochaetidae
PAS00003 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
99
80 PAS00001 Poecilochaetus japonicus| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
77 BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017577.1| ATLANTIC OCEAN
48
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017550.1| ATLANTIC OCEAN
64
BLAST Pareurythoe borealis - GenBank: JN086550.1| MEDITERRANEAN SEA
83
Amphinomidae
BLAST Hermodice carunculata - GenBank: KC017598.1| SAO TOME AND PRINCIPE
PGC00001 Pareurythoe borealis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00022 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
70
98
PGC00023 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
CHEP0009 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00021 Glycera tesselata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
88
BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426631.1| SE ATLANTIC
Glyceridae
50
98
96
BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426630.1| SE ATLANTIC
62 BLAST Glycera southeastatlantica - GenBank: GQ426632.1| SE ATLANTIC
BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024029.1| CANADA
BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024033.1| CANADA
100
78 BLAST Glycera dibranchiata - GenBank: HQ024038.1| CANADA
BLAST Eumida notata - GenBank: HM358708.1| SWEDEN
67
9
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358690.1| SWEDEN
99 BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358688.1| SWEDEN
BLAST Eumida kelaino - GenBank: HM358686.1| SWEDEN
BLAST Eumida notata - GenBank: HM358713.1| PORTUGAL (Madeira)
BLAST Eumida notata - GenBank: HM358712.1| PORTUGAL (Madeira)
99
PAS00011 Phyllodoce madeirensis| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
Phyllodocidae
75 PGC00030 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
65
94
PGC00031 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00032 Phyllodoce cf. madeirensis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
49 BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473582.1| CANADA
46
BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473581.1| CANADA
41 BLAST Phyllodoce medipapillata - GenBank: HM473577.1| CANADA
74 BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: GU672570.1| RUSSIA
100
40
BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: HQ023882.1| CANADA
BLAST Lumbrineris fragilis - GenBank: GU672337.1| CANADA
PGC00011 Lumbrineris gracilis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
23
BLASY Lumbrineris tetraura - GenBank: GU362689.1| CHINA
45
Lumbrineridae
96 BLAST Lumbrineris tetraura - GenBank: EU352318.1| CHINA
95
PBB00004 Lumbrineridae sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024127.1| CANADA
99
BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024159.1| CANADA
77 BLAST Ninoe nigripes - GenBank: HQ024144.1| CANADA
5
51 BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473292.1| CANADA
50
97
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473291.1| CANADA
BLAST Ampharete labrops - GenBank: HM473290.1| CANADA
Ampharetidae
9
BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ024261.1| CANADA
100
90 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
BLAST Eclysippe vanelli - GenBank: JX423766.1| NORWAY
18 PGC00038 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
18 PGC00040 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
46 PGC00042 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
20
52
100
Spionidae
PGC00041 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00043 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00039 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555064.1| NE ATLANTIC
98
50
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555059.1| NE ATLANTIC
Anexo/Figura F4. Árvore NJ de aminoácidos de poliquetas abordados no capítulo
3 provenientes
de diversos
BLAST
Vigtorniella ardabilia
- GenBank: EU555061.1| NE ATLANTIC
locais
geográficos.
Foi
utilizado
o
modelo
de
evolução
K2P
e
o
teste
de
Bootstrap
com
1000
replicações.
As
PGC00071
Natsushima
bifurcata|
ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
12
100 70
linhas laterais mostram a localização das diferentes famílias (continuação).
BLAST Natsushima bifurcata - GenBank: JF304492.1| COSTA RICA
93
BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304496.1| COSTA RICA
76 BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304497.1| COSTA RICA
86 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
164
100
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473651.1| CANADA
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
PAS00012 Maldanidae| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
76
94
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672597.1| RUSSIA
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672576.1| RUSSIA
Maldanidae
90 BLAST Ampharete sp. - GenBank: HQ023431.1| CANADA
BLAST Eclysippe vanelli - GenBank: JX423766.1| NORWAY
18 PGC00038 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
18 PGC00040 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
46 PGC00042 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
20
52
100
Spionidae
PGC00041 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00043 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00039 Spionidae sp.| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555064.1| NE ATLANTIC
98
50
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555059.1| NE ATLANTIC
Chrysopetalidae
BLAST Vigtorniella ardabilia - GenBank: EU555061.1| NE ATLANTIC
12
70 PGC00071 Natsushima bifurcata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
BLAST Natsushima bifurcata - GenBank: JF304492.1| COSTA RICA
Nautiliniellidae
93 BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304496.1| COSTA RICA
76 BLAST Natsushima sp. - GenBank: JF304497.1| COSTA RICA
86 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473648.1| CANADA
100 BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473651.1| CANADA
BLAST Praxillella affinis pacifica - GenBank: HM473650.1| CANADA
PAS00012 Maldanidae| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
76
Maldanidae
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672597.1| RUSSIA
94
99
BLAST Maldane sarsi - GenBank: GU672576.1| RUSSIA
50 BLAST Maldane sarsi - GenBank: HQ024362.1| CANADA
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938396.1| CANADA
100
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ023774.1| CANADA
Terebellidae
BLAST Pista maculata - GenBank: HQ938395.1| CANADA
95 PAS00006 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
98
PAS00005 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
PAS00004 Pista cristata| MEDITERRANEAN SEA (Alboran Sea)
9321
Terebellidae
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU670826.1| RUSSIA
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: GU672559.1| RUSSIA
99
BLAST Nicolea zostericola - GenBank: HQ024409.1| CANADA
96 CHEP0003 Nicolea venustula| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
40
Terebellidae
PGC00044 Pterolysippe vanelli| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
Ampharetidae
CHEP0010 Neoamphitrite affinis| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
33 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024200.1| CANADA
51
97 BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024199.1| CANADA
52
BLAST Polycirrus eximius - GenBank: HQ024197.1| CANADA
3224
CHEP0013 Polycirrus norvegicus| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672483.1| RUSSIA
100 BLAST Polycirrus medusa - GenBank: GU672524.1| RUSSIA
PBB00003 Polycirrus sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
11
91 PGC00045 Amphitrite cf. cirrata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
PGC00047 Neoamphitrite| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
7
Terebellidae
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ024485.1| CANADA
85
58
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ023920.1| CANADA
BLAST Amphitrite cirrata - GenBank: HQ932561.1| CANADA
50 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023984.1| CANADA
5054
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023978.1| CANADA
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023970.1| CANADA
53
46
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473492.1| CANADA
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473490.1| CANADA
80 BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473491.1| CANADA
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219838.1| NEW ZEALAND
77
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219804.1| NEW ZEALAND
BLAST Hyalinoecia
tubicola longibranchiata
- GenBank: JX219817.1|
ZEALAND abordados no capítulo 3 provenientes de diversos
Anexo/Figura
F4. Árvore
NJ de aminoácidos
de NEW
poliquetas
locais 77geográficos.
Foi utilizado
o modelo
deof Cadiz)
evolução K2P e Onuphidae
o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As
PGC00049 Hyalinoecia
tubicola| ATLANTIC
OCEAN (Gulf
linhas laterais
mostram
a localização
das diferentes
famílias (continuação).
BLAST Nothria
conchylega
- GenBank: HM473514.1|
CANADA
63
92
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473519.1| CANADA
51 BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473517.1| CANADA
PGC00076 Eunice norvegica| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
99
92
20
36
BLAST Eunice norvegica - GenBank: GQ497541.1| USA
PBB00008 Eunice sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PGC00077 Marphysa bellii| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
96
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
99 BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
165
50 BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023984.1| CANADA
5054
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023978.1| CANADA
BLAST Amphitrite figulus - GenBank: HQ023970.1| CANADA
53
46
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473492.1| CANADA
BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473490.1| CANADA
80 BLAST Neoamphitrite robusta - GenBank: HM473491.1| CANADA
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219838.1| NEW ZEALAND
77
63
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219804.1| NEW ZEALAND
BLAST Hyalinoecia tubicola longibranchiata - GenBank: JX219817.1| NEW ZEALAND
PGC00049 Hyalinoecia tubicola| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
77
Onuphidae
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473514.1| CANADA
92
BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473519.1| CANADA
51 BLAST Nothria conchylega - GenBank: HM473517.1| CANADA
PGC00076 Eunice norvegica| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
99
92
20
BLAST Eunice norvegica - GenBank: GQ497541.1| USA
PBB00008 Eunice sp.| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
36
PGC00077 Marphysa bellii| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: GQ497547.1| USA
96
99
9
BLAST Marphysa sanguinea - GenBank: AY040708.1| USA
BLAST Eunice harassii - GenBank: GQ497535.1| USA
Eunicidae
PGC00003 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
100
99
PGC00002 Eunice vittata| ATLANTIC OCEAN (Gulf of Cadiz)
BLAST Eunice antarctica - GenBank: GQ497532.1| USA
61
PBB00007 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
98
94
98
PBB00009 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
PBB00010 Eunice pennata| NE ATLANTIC (Bay of Biscay)
BLAST Microscolex phosphoreus - GenBank: AB750665.1| JAPAN
BLAST Microscolex phosphoreus - GenBank: AB750645.1| JAPAN
100
76 BLAST Microscolex phosphoreus - GenBank: AB750641.1| JAPAN
OUTGROUP (Oligochaeta)
0.05
Anexo/Figura F4. Árvore NJ de aminoácidos de poliquetas abordados no capítulo 3 provenientes de diversos
locais geográficos. Foi utilizado o modelo de evolução K2P e o teste de Bootstrap com 1000 replicações. As
linhas laterais mostram a localização das diferentes famílias (continuação).
166