ESTUDO DE FATORES DE VIRULÊNCIA E DE - Sicbolsas

Transcrição

ESTUDO DE FATORES DE VIRULÊNCIA E DE ESTRESSE
OXIDATIVO NA PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE DO TIPO
RAMNOLIPÍDEO POR Pseudomonas aeruginosa PA1
Ana Carolina Loureiro Brito Fernandes
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Bioquímica, Instituto de Química,
Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire
Marcos Dias Pereira
Essa dissertação de Mestrado foi realizada
com o apoio financeiro da ANP - Agência
Nacional do Petróleo, Gás Natural e
Biocombustíveis.
Rio de Janeiro
Maio de 2010
ii
ESTUDO DE FATORES DE VIRULÊNCIA E DE ESTRESSE
OXIDATIVO NA PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE DO TIPO
RAMNOLIPÍDEO POR Pseudomonas aeruginosa PA1
Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire
Marcos Dias Pereira
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica,
Instituto de Química, Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Aprovada por:
_________________________________________________________
Presidente, Profa. Denise Maria Guimarães Freire, D. Sc. (IQ/UFRJ)
_________________________________________
Prof. Rodrigo Volcan Almeida, D. Sc. (IQ/UFRJ)
__________________________________________
Sérgio Cantú Mannarino, D. Sc. (IQ/UFRJ)
Rio de Janeiro
Maio de 2010
iii
Fernandes, Ana Carolina Loureiro Brito
Estudo de fatores de virulência e de estresse oxidativo na
produção
de
biossurfactante
do
tipo
ramnolipídeo
por
Pseudomonas aeruginosa PA1/ Ana Carolina Loureiro Brito
Fernandes. – Rio de Janeiro: UFRJ/IQ, 2010.
xiii, 110f : 29,7cm
Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire e
Marcos Dias Pereira
Dissertação (mestrado) – UFRJ/ IQ/ Programa de
Pós-graduação em Bioquímica, 2010.
Referências Bibliográficas: f. 92-110.
1. Biossurfactante. 2. Fatores de virulência. I. Freire,
Denise Maria Guimarães. II.Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Química. III. Título.
iv
Dedico este trabalho aos meus pais,
Márcia e Marco.
v
Agradecimentos
Meus sinceros agradecimentos a todos que contribuíram de algum modo para a realização
deste trabalho e em especial:
A minha orientadora Denise Maria Guimarães Freire pela orientação, dedicação, confiança e
paciência fundamentais para realização deste trabalho.
Aos meus pais pelo amor incondicional, por estarem ao meu lado em todos os momentos e
por serem os responsáveis por tudo que eu sou.
As minhas irmãs pela amizade, cumplicidade, alegria e carinho.
À minha amiga Roberta pelos nossos 10 anos de amizade e convivência.
Ao amigo Rodrigo Mineiro (o mais eficiente do leste ou oeste, dependendo do caminho...)
pela amizade, sugestões, companhia, ajuda nos momentos necessários e pela grande
contribuição para realização deste trabalho.
Ao amigo Fred pela presença constante nos experimentos em biorreator, pelas sugestões,
orientação e ajuda essenciais para realização deste trabalho.
Aos colegas do grupo dos Biossurfactante Lú, Lívia, Luiz Fernando e Rômulo pela
contribuição neste trabalho.
A todos os amigos do LaBiM/IQ principalmente Val, Elisa, Mel, Bruno, Joab, Jaque Velha,
Jaque Nova, Mateus, Fernanda, Ale, Antônio, Thaís e Angélica por terem tornado os dias
difíceis mais divertidos e os dias bons melhores ainda. Pessoas maravilhosas que tive a
oportunidade de conhecer e que fazem do LaBiM um ótimo ambiente de trabalho.
À secretária Aline pelo carinho e dedicação a todos os alunos do LaBiM.
Aos professores do LaMMP, Bianca e Rodrigo, por terem me emprestado seu laboratório para
realização de experimentos.
À tia Sonia por me ajudar a resolver todos os problemas com toda eficiência e carinho do
mundo.
A todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, em especial Su, Marcella,
Leandro, Thiago e Karen.
A ANP pela concessão da bolsa de estudos e as professoras Maria Regina e Jussara
responsáveis pelo programa Químico de Petróleo.
vi
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao IQ/UFRJ como parte dos requisitos necessários
à obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Estudo de fatores de virulência e de estresse oxidativo na produção de biossurfactante do tipo
ramnolipídeo por Pseudomonas aeruginosa PA1
Maio/2010
Orientadores:Denise Maria Guimarães Freire
Marcos Dias Pereira
A grande demanda por energia e o aumento no consumo e produção de derivados de petróleo
leva a um maior risco de acidentes ambientais. A ocorrência de inúmeros acidentes
ocasionados por derramamento de óleo, tem resultado em uma legislação ambiental mais
rigorosa, e por esse motivo, na procura de técnicas eficientes no controle e reparo dos danos
resultantes. A cepa Pseudomonas aeruginosa PA1, isolada de poços de petróleo, produz
elevadas concentrações de ramnolipídeo, um surfactante biodegradável com aplicações em
diversas áreas industrial e ambiental, como na remoção e lavagem de óleos em ambientes
impactados com derramamento de petróleo. Nesse contexto, objetivo deste trabalho foi
investigar os fatores de virulência e os de estresse oxidativo na cepa Pseudomonas aeruginosa
PA1, com vistas à redução da toxicidade do processo fermentativo, em biorreatores com
oxigenação controlada, para produção de biossurfactante do tipo ramnolipídeo. Visando uma
futura aplicação do meio de cultivo bruto livre de células na biorremediação, vários
parâmetros cinéticos foram investigados em duas condições de oxigenação distintas (6 mg
O2/L e de 1 mg O2/L ). Para análise de fatores extracelulares o meio de cultivo bruto livre de
células foi utilizado, e para análise dos fatores relacionados ao estresse oxidativo, proteínas
foram extraídas do pellet celular e analisadas na fase estacionária e exponencial de
crescimento. A quantidade absoluta de ramnolipídeo produzida não foi significativamente
afetada pela concentração de oxigênio dissolvido. No entanto a produção de fatores de
virulência extracelulares foi maior nas condições de maior concentração de oxigênio
dissolvido, sendo que os mesmos não foram encontrados nos meios de cultivo centrifugados e
autoclavados. Em relação ao estresse oxidativo, a presença de oxigênio desencadeou reações
na P. aeruginosa com produtos com atividades anti-oxidante, tornando assim suas células
resistentes a diferentes condições de oxigenação.
vii
Abstract of Dissertation presented to IQ/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements for
the degree of Master in Biochemistry.
Virulence factors and oxidative stress in rhamnolipid biosurfactant production by Pseudomonas
aeruginosa PA1
May/2010
Research Supervisor: Denise Maria Guimarães Freire
Marcos Dias Pereira
The high demand for energy and the increasing consumption and production of oil leads to an
increased risk of environmental accidents. The occurrence of numerous accidents caused by
oil spills, has resulted in a stricter environmental legislation, and therefore, the search for
efficient techniques to control and repair the harm caused. The strain of Pseudomonas
aeruginosa PA1, isolated from oil waste, produces high amounts of rhamnolipid, a
biodegradable surfactant with applications in several industrial and environmental fields, as
removal and cleaning of oils from similar environments to oil spill. In this context, the aim of
this work was to investigate the virulence factors and oxidative stress in rhamnolipid
biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa PA1 in order to reduce the toxicity of
fermentation in a bench scale bioreactor with controlled oxygenation, for production of
biosurfactant rhamnolipid type. Aiming at a future application of crude culture medium free
of cells in bioremediation, several kinetic parameters were investigated in two different
oxygenation conditions (6 mg O2/L e de 1 mg O2/L). For analysis of extra cellular factors, the
crude culture medium free of cells was used and for the analysis of factors related to oxidative
stress, proteins were extracted from the cell pellet and analyzed in the stationary phase and
exponential growth. The absolute amount of rhamnolipid produced was not significantly
affected by the concentration of dissolved oxygen. However the production of extra cellular
virulence factors were higher under conditions of high dissolved oxygen concentration, and
they were not found in centrifuged and autoclaved culture media. In relation to oxidative
stress, the presence of oxygen triggered reactions in P.aeruginosa products with antioxidant
activity, making their cells resistant to different oxygenation conditions.
viii
Lista de Abreviações
3O-C12-HSL - N-(3-oxododecanoil) homoserina lactona
AHL – homoseina lactona
BSA- soro albumina bovina
CMC- concentração micelar crítica
C4-HSL - N-butiril homoserina lactona
DNPH -2,4-dinitrofenilhidrazina
GPS- General Secretion Pathway
kDa- Quilodalton
LasI- acil-HSL sintase
LasR- regulador transcricional
LPS- lipopolissacarídeo
MEOR – microbial enhanced oil recovery
OD- oxigênio dissolvido no meio
OUR – taxa de consumo de oxigênio bruto
SOUR- taxa de consumo específico de oxigênio bruto
RhlAB- Ramnosiltransferase I
RhlC- Ramnosiltransferase II
RhlG- β-cetoacil-redutase
RhlI- acil-HSL- sintase
RhlR- regulador transcricional
QS- quorun sensing
Sec- General secretory pathway
SOD- Superóxido dismutase
Vf/Vm- relação volume de frasco/ volume de meio
ix
Lista de Quadros, Tabelas e Figuras
Quadro 1
Quadro 2
Tabela 1
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Tabela 2
Figura 14
Figura15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Tabela 3
Figura 20
Figura 21
Alguns acidentes envolvendo derramamento de óleo no Brasil e no
mundo
Leis e resoluções ambientais
Principais classes de biossurfactantes e sua origem microbiana
Sistema de quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa e sua
regulação gênica de rhlA e rhlB
Sistema Sec de secreção
Sistema Tat de secreção
Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo II
Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo V
Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo I, a proteína
secretada passa para o meio externo sendo transportada pela ABC
transportadora
Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo III
Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo VI
Estrutura da piocianina em dois estados: em pH perto do neutro ou
alcalino o pigmento existe na forma de zwitterion e possui a
coloração azul, enquanto que em pH ácido sua coloração é
vermelha
Formação de O2.- e H2O2 pela reação do NAD(P)H com a
piocianina e a interação subseqüente do H2O2 com GSH. GPx,
glutationa peroxidase
Rota biossintética da piocianina
Estrutura dos ramnolipídeos
Via metabólica de biossíntese de ramnolipídeo
Caracterização de algumas das principais Eros formadas in vivo
Estados do O2 segundo a teoria do orbital molecular
Formação das EROs a partir do oxigênio
Reação de dismutação catalisada pelas enzimas superóxido
dismutases
Fotografia do fermentador inserido na capela de exaustão,
acoplado ao sistema de oxigenação utilizando o contactor de
membranas
Controlador Lógico Programável utilizado para implementação de
uma malha de controle da concentração de oxigênio dissolvido nas
fermentações para a produção de ramnolipídeos por Pseudomonas
aeruginosa PA1
Fluxograma simplificado do sistema de oxigenação
Composição de uma solução de ramnolipídeos produzidos por
Pseudomonas aeruginosa PA1
Crescimento celular (g/L) e consumo de oxigênio (SOUR)
(mg/g.h) em função do tempo da fermentação. Dados da obtidos da
Ferm3, com condição de oxigenação de 6 mg O2/L
Perfil do crescimento de biomassa (A), consumo de glicerol (B) e
produção de ramnolipídeo (C) por Pseudomonas aeruginosa.
Fermentação em shaker a 30OC e 170 rpm utilizando frasco de 1 L
e diferentes relações Vf/Vm
1
2
5
11
15
17
18
19
22
24
26
27
28
29
32
33
35
37
37
38
44
45
46
49
60
62
x
Tabela 4
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Tabela 5
Tabela 6
Figura 27
Figura 28
Figura 29
Tabela 7
Figura 30
Figura 31
Comparação entre as variáveis x (variação na concentração de
biomassa), P (concentração de ramnolipídeos), Yp/x (rendimento
de produto por biomassa produzida), Yp/s (rendimento de
produto por substrato consumido), Yx/s (rendimento de
biomassa por substrato consumido) e Qp (produtividade de
ramnolipídeos) para as diferentes relações Vf/Vm (6 dias de
fermentação)
Perfil da produção de elastases (A) e proteases (B) por
Pseudomomas aeruginosa. Fermentação em shaker a 30OC e 170
rpm utilizando frasco de 1 L e diferentes relações Vf/Vm
Oxigênio dissolvido no meio (mg/L) ao longo das fermentações 3
(6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L)
Taxa de consumo de oxigênio bruto (OUR) (mg/L.h) ao longo das
fermentações 3 (6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L)
Taxa específica de consumo de oxigênio (mg/g.h) ao longo das
fermentações 3 (6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L)
Perfil do crescimento de biomassa (A e B) e consumo de glicerol
(C e D) e produção de ramnolipídeo (E e F) em biorreator com
condição de oxigenação de 6 mg O2/L e 1 mg O2/L,
respectivamente por Pseudomonas aeruginosa. Fermentações em
biorreator, a 30°C e 100 rpm utilizando frasco de 5 L com volume
útil de 3,2 L
Produção de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa com a
variação da concentração de oxigênio dissolvido (biomassa e
concentração de produto)
Comparação entre as variáveis x (variação na concentração de
biomassa), P (concentração de ramnolipídeos), Yp/x (rendimento
de produto por biomassa produzida), Yp/s (rendimento de
produto por substrato consumido), Yx/s (rendimento de
biomassa por substrato consumido) e Qp (produtividade de
ramnolipídeos) para as diferentes condições de oxigenação (6 dias
de fermentação)
Perfil da produção de elastases (A e B) e proteases (C e D) em
biorreator com condição de oxigenação de 6 mg O2/L e 1 mg O2/L,
respectivamente por Pseudomonas aeruginosa. Fermentações em
biorreator, a 30°C e 100 rpm utilizando frasco de 5 L com volume
útil de 3,2 L
Teste de hemólise realizado com ramnolipídeo purificado
Inóculos de com 72h de crescimento, crescido em meio de cultura
para maximizar a produção de biossurfactante, e para maximizar a
produção de piocianina, respectivamente
Valores de razão de absorbância e concentração do DNA
Gel de agarose 1%. 1,2,3- amostras autoclavadas, 4,5,6-amostras
centrifugadas, 7,8,9- amostras centrifugadas e autoclavadas,
10,11,12- amostras filtradas em membrana de 0,22μm, 13,14padrão de peso molecular 1Kb DNA Ladder, 15,16,17- amostras
centrifugadas e filtradas em membrana de 5kda
Gel de agarose 1%. 14 - padrão de peso molecular 1Kb DNA
Ladder, 15,16,17- amostras centrifugadas e filtradas em membrana
de 5kda
63
65
67
67
68
70
71
72
73
75
77
79
80
80
xi
Figura 32
Figura 33
Figura 34
Figura 35
Figura 36
Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as
fermentações controle sem H2O2
fermentações com oxigenação de 6 mg O2/L ( F1, F2 e F3) nas
fases exponencial e estacionária de crescimento em biorreator
fermentações de oxigenação de 1 mg O2/L (F4, F5 e F6) nas fases
exponencial e estacionária de crescimento em biorreator
Análise da carbonilação de proteínas em frascos agitados após
adição de H2O2(10 mM) por 1h nos controles de 10h e 36h
82
83
85
86
Análise da carbonilação de proteínas em biorreator nas fases 87
exponencial e estacionária de crescimento nas condições de
oxigenação de 6 mg O2/L (F2 e F3) e 1 mg O2/L (F5 e F6)
xii
Índice
1
2
2.1
2.2
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
3.5.3.1
3.5.3.2
3.5.4
3.5.4.1
3.5.4.2
3.5.4.3
3.6
3.6.1
3.6.2
3.6.3
3.6.4
3.6.5
3.6.6
3.7
3.7.1
3.7.2
3.7.3
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.5.1
4.6
4.7
4.8
Agradecimentos
Resumo
Lista de Quadros, Tabelas e Figuras
Índice
Introdução
Objetivos
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
Revisão Bibliográfica
Pseudomonas aeruginosa
Sistema de Quorun sensing
Virulência
Fatores de virulência de superfície
Flagelos
Pili
Lipopolissacarídeo
Alginato
Sistema de secreção de proteínas
O sistema Sec
O sistema Tat
Sistemas Sec-dependentes
Sistema de secreção do tipo II
Sistema de secreção do tipo V
Sistemas Sec-independentes
Sistema de secreção do tipo I
Sistema de secreção do tipo III
Sistema de secreção do tipo VI
Fatores de virulência secretados
Piocianina
Proteases
Lípases
Hemólise
Ramnolipídeo
DNA extracelular
Estresse oxidativo
Espécies reativas de oxigênio (Eros)
Superóxido Dismutase (Sod)
Oxidação de proteínas
Materiais e Métodos
Microrganismo e condições de cultivo
Preparo do inoculo
Esterilização
Frascos agitados
Biorreator
Controle da concentração de oxigênio no biorreator
Biomassa
Quantificação de glicerol
Quantificação de ramnolipídeos
v
vi
ix
xii
1
8
8
8
9
9
9
11
12
12
12
13
13
13
14
15
17
17
18
21
21
22
24
26
26
30
30
31
31
34
34
35
38
39
41
41
42
42
42
43
44
47
47
48
xiii
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
4.16
4.17
4.18
4.19
4.20
4.21
4.21.1
4.21.2
4.3
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
5.10.1
5.10.2
6
7
8
Quantificação de proteases
49
Quantificação de elastases
50
Quantificação de lipases
51
Quantificação de proteínas totais
51
Purificação do ramnolipídeo
52
Quantificação de hemólise
52
Precipitação do alginato
54
Quantificação de piocianina
54
Precipitação de DNA
55
Verificação de extração de DNA em gel de agarose
55
Detecção de DNA por método espectrofotométrico
56
Condições de estresse oxidativo
56
Extração de proteínas
57
Determinação da atividade de superóxido dismutase (Sod)
57
Proteína carbonilada
58
Análise estatística dos resultados
59
Resultados e Discussão
60
Cinética da produção de ramnolipídeos em frascos agitados
61
Perfil da produção de elastases e proteases em frascos agitados
64
Cinética da produção de ramnolipídeos em biorreator acoplado a 66
contactores de membrana
Perfil da produção de elastases e proteases em biorreator
72
Lipases
74
Hemólise
75
Alginato
76
Piocianina
77
DNA
78
Secreção de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo
81
Sod
81
Proteína Carbonilada
85
Conclusão
88
Publicações
91
Referências
92
1
1. Introdução
O petróleo é um recurso natural de grande importância nas nossas vidas. A grande
demanda por energia e o aumento no consumo e produção de derivados de petróleo leva a um
maior risco de acidentes ambientais. Por ser extraído em locais distantes do seu consumo, é
normal que este seja transportado em grandes quantidades. Considerando que as operações de
transporte e armazenamento envolvem a movimentação constante de petróleo e seus
derivados, a ocorrência de inúmeros acidentes ambientais ocasionados por derramamento de
óleo conforme ilustrado no quadro 1, tem resultado em uma legislação ambiental mais
rigorosa como demonstrada no quadro 2, e por esse motivo, na procura de técnicas eficientes
no controle e reparo dos danos resultantes.

2000 - Baía de Guanabara/RJ, derramamento de 1,3 milhões de litros de óleo;

2001 - Derramamento causado pelo naufrágio do navio tanque Windy Bay,
transportando 35 mil galões de óleo diesel, no Alaska;

2001 - Acidente na plataforma P-7 na Bacia de Campos ocasionou vazamento de 110
mil litros de óleo;

2002 - O navio Prestige de bandeira das Bahamas, partiu-se ao meio. O navio
carregava 77 mil toneladas de óleo, e foi avariado a 250 km da costa espanhola;

2003 - Acidente com balsa derrama 20 mil litros de óleo diesel no Rio Pará;

2006 - Um navio carregado com 70 toneladas afunda no Paquistão;

2007 - Uma forte tempestade castigou o Mar Negro, partindo em dois o navio russo
"Volganeft-139", que verteu no mar, no Estreito de Kertch, as 2.000 toneladas de óleo;

2007 - Derramamento de 10,5 mil toneladas de petróleo após o acidente entre um
cargueiro e um navio petrolífero na Coréia do Sul;

2010 – Uma explosão seguida de um incêndio causaram o afundamento da plataforma
Deepwater Horizon, com vazamento de mais de 72 milhões de litros de petróleo no Golfo do
México.
Quadro 1 : Alguns acidentes envolvendo derramamento de óleo no Brasil e no mundo
(Modificado de REIS, 2008).
2

Resolução Conama n° 398/2008- "Dispõe sobre o conteúdo mínimo do plano de
emergência individual para incidentes de poluição por óleo em águas sob jurisdição nacional,
originados em portos organizados, instalações portuárias, terminais, dutos, sondas terrestres,
plataformas e suas instalações de apoio, refinarias, estaleiros, marinas, clubes náuticos e
instalações similares, e orienta a sua elaboração.";

Resolução Conama n° 393/2007- "Dispõe sobre o descarte contínuo de água de
processo ou de produção em plataformas marítimas de petróleo e gás natural, e dá outras
providências";

Resolução Conama n° 269/2000- "Regulamenta o uso de dispersantes químicos em
derrames de óleo no mar";

Lei nº 9.966, de 28 de abril de 2000- “dispõe sobre a prevenção, o controle e a
fiscalização da poluição causada por lançamento de óleo e outras substâncias nocivas ou
perigosas em águas sob jurisdição nacional” (sendo o valor da multa por descumprimento
desta no mínimo de R$ 7.000,00 no máximo R$ 50.000.000,00);

Convenção internacional sobre o preparo, resposta e cooperação em caso de poluição
por óleo, promulgada pelo Brasil por meio do decreto nº 2.870, de 10 de dezembro de 1998,
define como um dos seus compromissos o estabelecimento de um sistema nacional para
responder aos incidentes de poluição por óleo, incluindo a preparação do plano nacional de
contingência.
Quadro 2: Leis e resoluções ambientais. Disponível em:
www.mma.gov.br/port/conama/legi.cfm
A remediação, ou seja, restauração das condições ambientais a níveis aceitáveis, é uma
das maiores preocupações e um dos maiores desafios da comunidade técnico-científica na
área petroquímica. A degradação completa de petróleo cru requer a ação simultânea de
diferentes grupos microbianos (RAHMAN et al., 2002). O principal fator que limita a
biodegradação destes poluentes é a sua limitada disponibilidade aos microorganismos.
Hidrocarbonetos geralmente se agregam a componentes do solo, sendo de difícil remoção ou
degradação. Compostos tensoativos reduzem as tensões superficial e interfacial através de seu
acúmulo na interface de fluidos imiscíveis ou de um fluido e um sólido, aumentando a área de
3
compostos insolúveis, levando ao aumento de sua disponibilidade e subseqüente
biodegradação. Estes compostos podem ser produzidos por via química ou bioquímica e são
denominados surfactantes, RAHMAN et al. (2003)
Em função da presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma molécula, os
surfactantes tendem a se distribuir nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de
polaridade (óleo/água e água/óleo) (BANAT, 1995). A formação de um filme molecular,
ordenado nas interfaces, reduz a tensão interfacial e superficial, sendo responsável pelas
propriedades únicas dos surfactantes. Estas propriedades fazem os surfactantes serem
adequados para uma ampla gama de aplicações industriais envolvendo: detergência,
emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilização e
dispersão de fases. A maior utilização dos surfactantes se concentra na indústria de produtos
de limpeza (sabões e detergentes), na indústria de petróleo e na indústria de cosméticos e
produtos de higiene. A produção mundial de surfactantes excede 3 milhões de toneladas por
ano2, sendo a maioria utilizada como matéria-prima para fabricação de detergentes de uso
doméstico (NITSCHKLE e PASTORE, 2002; SINGH et al., 2007).
Surfactantes químicos sintéticos vem sendo utilizados pela indústria de petróleo para
auxiliar na limpeza de derrames de óleo, bem como para aumentar a recuperação de óleo em
reservatórios. Estes compostos não são biodegradáveis e podem ser tóxicos ao meio ambiente,
trazendo novos problemas de caráter ambiental as áreas afetadas (BORDOLOI e KONWAR,
2008).
Recentemente, devido ao aumento na preocupação com a proteção do ambiente, os
biossurfactantes passaram a ser considerados como alternativas ambientalmente corretas
comparativamente
aos
surfactantes
sintéticos
(SARACHAT,
2010).
Ademais,
regulamentações ambientais mais severas e uma maior sensibilização para a necessidade de
proteger o ecossistema resultaram em um interesse crescente nos biossurfactantes como
4
possíveis alternativas aos surfactantes químicos. Biossurfactantes são compostos anfifílicos de
origem microbiana com potencial considerável em aplicações comerciais de diversos setores.
Eles têm vantagens sobre os surfactantes químicos na biodegradabilidade, possuem baixa
toxicidade e são eficazes a temperaturas e pH extremos (BANAT et al. 2000). Em muitos
casos os biossurfactantes têm propriedades de emulsificação equivalentes aos surfactantes
químicos. Assim, há um crescente interesse na possível utilização de biossurfactantes na
mobilização de petróleo bruto pesado, transporte de petróleo em oleodutos, gestão
derramamentos de óleo, controle de poluição de óleo, limpeza de resíduos de hidrocarbonetos
provenientes de instalações de armazenamento, biorremediação de solo/areia e recuperação
microbiana melhorada de petróleo (MEOR – microbial enhanced oil recovery) (BORDOLOI
e KONWAR, 2008).
Estes compostos possuem um domínio hidrofílico e outro hidrofóbico. A porção
hidrofóbica da molécula baseia-se em ácidos graxos de cadeia longa saturados, insaturados ou
hidroxilados. A porção hidrofílica pode ser de carboidratos, aminoácidos, peptídeos cíclicos,
fosfato, ácido carboxílico ou álcool (MULLIGAN, 2004). Uma ampla variedade de
microorganismos pode produzir estes compostos como pode ser observado na tabela 1
(NITSCHKLE e PASTORE, 2002).
Há três principais estratégias adotadas para a utilização de biossurfactantes na
recuperação aprimorada de petróleo ou mobilização de óleos pesados: (i) injeção de
microrganismos produtores de biossurfactante no reservatório através do poço, com posterior
multiplicação dos microrganismos in situ nas rochas reservatórios; (ii) injeção de nutrientes
selecionados em um reservatório, estimulando o crescimento de microrganismos endógenos
produtores de biossurfactantes; (iii) produção de biossurfactantes ex situ e sua posterior
injeção no reservatório (BANAT, 1995).
5
TABELA1: Principais classes de biossurfactantes e sua origem microbiana
Tipo de surfactante
Microorganismo
Glicolipídios:
- ramnolipídeos
Pseudomonas aeruginosa
- soforolipídios
Torulopsis bombicola, T. apicola
- trehalolipídios
Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium
sp.
Lipopeptídios e lipoproteínas
- Peptídio-lipídio
Bacillus licheniformis
- Viscosina
Pseudomonas fluorescens
- Serrawetina
Serratia marcescens
- Surfactina
Bacillus subtilis
- Subtilisina
Bacillus subtilis
- Gramicidina
Bacillus brevis
- Polimixina
Bacillus polymyxa
Ácidos graxos, lipídios neutros
e fosfolipídios
- Ácidos graxos
Corynebacterium lepus
- Lipídios neutros
Nocardia erythropolis
- Fosfolipídios
Thiobacillus thiooxidans
Surfactantes poliméricos
- emulsan
Acinetobacter calcoaceticus
- biodispersan
- liposan
Candida lipolytica
- carboidrato-lipídio-proteína
Pseudomonas fluorescens
- manana-lipídio-proteína
Candida tropicalis
Surfactantes particulados
- vesículas
- células
Várias bactérias
6
O custo de produção de biossurfactantes é aproximadamente de 3 a 10 vezes maior do
que o de surfactantes químicos restringindo bastante sua utilização em larga escala. A sua
biossíntese, concentração e purificação compreendem cerca de 60% do custo do produto,
devido ao fato do mesmo ser secretado em uma solução diluída (SARACHAT, 2010). Muitas
vezes os biossurfactantes são produzidos durante o crescimento dos microorganismos em
hidrocarbonetos e/ou fontes de carbono de elevado custo, aumentando assim o custo total do
processo. Contudo, a utilização de substratos mais baratos como resíduos (soap stock,
glicerina bruta) e/ou substratos solúveis em água (glicose, glicerol e etanol) são alternativas
interessantes (KRONEMBERGER, 2007; KRONEMBERGER et al., 2008).
Nos últimos dez anos o Laboratório de Biotecnologia Microbiana (LaBiM) vem
desenvolvendo, em cooperação com a Petrobras, diversos projetos com o objetivo aumentar a
produção de biossurfactante do tipo ramnolipídeo utilizando uma cepa de Pseudomonas
aeruginosa isolada de poços de petróleo. Foram desenvolvidas estratégias metabólicas de
aumento da produção de ramnolipídeo em detrimento da produção de outros fatores de
virulência (SANTOS et al., 2002), estratégias de modo de condução do processo fermentativo
como utilização de resíduos industrias, como o glicerol (rejeito da produção de biodiesel)
como fonte carbono (SANTA ANNA et al., 2001, 2002), e desenho de novos reatores
utilizando contactores de membranas capazes de suplantar o crítico problema operacional de
formação de espuma (KRONEMBERGER et al., 2008). Ademais, esta biomolécula
apresentou excelentes resultados quando aplicada na biorremediação e lavagem de solos
contaminados com derramamento de óleo (SANTA ANNA et al., 2007).
Sabra et al. (2002) propôs que P. aeruginosa produz ramnolipídeos para reduzir a taxa
de transferência de oxigênio contra o estresse oxidativo, e parece que este mecanismo é
ativado pela deficiência de ferro (KIM et al., 2003). Segundo Kronemberger (2007), uma
hiperoxigenação resulta em uma queda de biomassa e este fato pode estar relacionado a algum
7
tipo de estresse oxidativo. Deste modo à investigação dos fatores de estresse oxidativo e sua
relação com a produção do biosurfactante poderia ser uma estratégia interessante para a
otimização do meio de cultivo. Por outro lado, a investigação dos fatores de virulência
secretados no meio de cultivo também é uma estratégia a ser considerada, uma vez que, para
diminuição do custo de produção do biossurfactante, a aplicação do meio bruto sem prévia
purificação pode ser uma alternativa interessante.
Neste contexto, o presente trabalho visa investigar os fatores de virulência e os fatores
de estresse oxidativo na produção de ramnolipídeos, em biorreator acoplado a um contactor
de membranas, que permite o controle da concentração de oxigênio dissolvido no meio de
cultura, com vistas à redução da toxicidade do meio de cultivo bruto, para futura aplicação do
meio de cultivo bruto livre de células na remediação e/ou biorremediação de solos
contaminados por petróleo.
8
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
.
O objetivo deste trabalho foi investigar os fatores de virulência secretados e os de
estresse oxidativo na cepa Pseudomonas aeruginosa PA1, com vistas à redução da toxicidade
do processo fermentativo, em biorreatores com oxigenação controlada, para produção de
biossurfactantes do tipo ramnolipídeo.
2.2 Objetivos Específicos
Padronizar os protocolos de análise de fatores de virulência secretados e relacionados
ao estresse oxidativo como ramnolipídeo, proteases, elastases, lipases, alginato, piocianina e
superóxido dismutase, por Pseudomonas aeruginosa em diferentes concentrações de
oxigenação.
Avaliar o meio bruto contendo biosurfactante em relação aos fatores de virulência.
9
3. Revisão Bibliográfica
3.1 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa, pertencente à classe gamaproteobactéria e à família Pseudomonadaceae, encapsulada e móvel (HARDALO e EDBERG,
1997). É um patógeno oportunista, podendo ser encontrada em amostras de solo, água e
plantas (RAHME et al, 1997). É capaz de provocar infecções locais em pacientes com fibrose
cística, câncer, pneumonia, queimaduras e imunodeficientes (HAHN, 1997; WILSON,
DOWLING, 2006). As infecções causadas por P. aeruginosa são muito difíceis de serem
tratadas porque bactérias gram-negativas formam biofilmes e apresentam alta resistência a
antibióticos (NIKAIDO, 1998). Sua patogenicidade está associada a um único grande genoma
que contém genes para muitos fatores de virulência e mecanismos regulatórios que permitem
sua adaptação a ambientes hostis (KIPNIS et al. 2006).
3.2 Sistema de Quorun sensing
A adaptação da bactéria a um novo ambiente e sua capacidade de perceber e reagir a
este ambiente são essenciais para sua patogenia. Estas são afetadas por muitas condições
ambientais, tais como pH, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes e densidade
populacional. Quando as bactérias detectam uma alteração no ambiente elas alteram a
produção de vários fatores que lhes permitem prosperar nesses novos ambientes. Sistema de
Quorun sensing (QS) é o mecanismo que permite que as bactérias modifiquem seu
metabolismo de acordo com a densidade da população bacteriana ao redor e coordenadamente
responder a essas informações pela co-regulação de vários genes (SMITH e IGLEWSKI,
10
2003). QS é um sistema de regulação genética presente em diversas bactérias, onde é
responsável por regular virulência, produção de metabólitos secundários, simbiose, formação
de biofilme, bem como indução de respostas da fase estacionária e mobilidade. A sinalização
celular não só ocorre em altas densidades celulares, pois o termo está agora sendo aplicado
para descrever qualquer comunicação intercelular bacteriana que envolva pequenas moléculas
sinalizadoras (WINTERS et al., 2001).
P. aeruginosa possui dois sistemas distintos que interagem, las e rhl, caracterizando o
QS. Estes sistemas são hierarquicamente arranjados, sendo que o sistema las controla o
sistema rhl conforme demonstrado na Figura 1 (LATIFI et al., 1996). Com o aumento da
população bacteriana, as moléculas sinais autoindutoras produzidas pela Pseudomonas
aeruginosa, N-(3-oxododecanoil) homoserina lactona (3O-C12-HSL) e N-butiril homoserina
lactona (C4-HSL), se acumulam, e assim que um limiar de concentração intracelular é obtido
essas moléculas se ligam a seus reguladores transcricionais e os ativam. Ambos os sistemas
las e rhl foram encontrados como reguladores na produção de múltiplos fatores de virulência
(SMITH e IGLEWSKI, 2003).
Em adição a lasA, lasB e rhlAB, genes da protease alcalina (aprA), exotoxina A
(toxA), piocianina, pioverdina, ácido cianídrico, lipase, rpoS, alginato, secreção de proteínas,
catalases, ramnolipídeo, lectinas, homoserina lactonas aciladas e superóxido desmutase (katA,
sodA e sodB), todos são controlados por quorun sensing (SMITH, IGLEWSKI, 2003;
RUMBAUGH, GRISWOLD, HAMOOD, 2000). No sistema las, a enzima LasI produz a
molécula sinal 3O-C12-HSL, que complexa com LasR para ativar um número de genes
virulentos, incluindo lasB, lasA, apr, toxA e o próprio lasI. A enzima RhlI catalisa a síntese da
molécula sinal C4-HSL, que em conjunto com RhlR ativa a expressão do rhlAB , gene da
síntese do ramnolipídeo, rhlI e lasB. Outros fatores de virulência e metabólitos secundários,
11
incluindo piocianina, ácido cianídrico são positivamente regulados pelo sistema
rhl.(WHITELEY et al. 1999).
Figura 1- Sistema de quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa e sua regulação gênica de
rhlA e rhlB. Os triângulos correspondem ao autoindutor 3OC12-HSL, e os losangos
correspondem ao autoindutor C4-HSL, que, ao atingirem um limiar de concentração
intracelular, se ligam aos seus reguladores transcricionais, LasR e RhlR respectivamente, e os
ativam. As regiões em azul correspondem aos promotores dos respectivos genes e as setas
direcionadas a essas regiões indicam a ativação gênica (REIS, 2008).
3.3 Virulência
Segundo Ryan e colaboradores (2004) muitas propriedades são necessárias para que
uma célula bacteriana obtenha acesso a um hospedeiro, invada seu sistema imunológico e
estabeleça uma infecção. Elas incluem:

Adesão e penetração as superfícies da célula hospedeira
12

Evasão à fagocitose e ataque ao sistema imunológico

Secreção de proteínas tóxicas para enfraquecimento do hospedeiro e promover a ação
do agente patogênico

Aquisição de nutrientes, incluindo ferro, para permitir seu crescimento dentro do
hospedeiro.

Sobrevivência tanto dentro como fora do hospedeiro.
3.4 Fatores de virulência de superfície
3.4.1 Flagelos
São estruturas protéicas complexas formando um apêndice filamentoso polar na
superfície da P. aeruginosa que permitem o movimento chamado de “swimming”. Tem um
papel patogênico importante na aderência à células epiteliais, ligando-se a membrana
(FELDMAN et al., 1998).
3.4.2 Pili
São filamentos pequenos, encontrados na superfície da bactéria. O pili da
Pseudomonas aeruginosa está envolvido em sua motilidade. O movimento chamado
“twiching” é responsável pelas propriedades retráteis permitindo que a bactéria se espalhe ao
longo de superfícies hidratadas, ao invés de usar o movimento “swim”. O pili é crucial na fase
de adesão na colonização de células epiteliais (KIPNIS et al., 2006).
13
3.4.3 Lipopolissacarídeo
A face externa da membrana externa é composta por lipopolissacarídeo (LPS), que é
extremamente tóxica a humanos e outros animais, e é chamada de endotoxina. Mesmo em
quantidades mínimas, o montante liberado durante uma infecção por bactérias gram-negativas
pode causar febre. LPS é composta por lipídeo A (um fosfolipídio tóxico composto por
glicosamina), o core polissacarídeo (que contém resíduos de carboidratos) e a cadeia lateral de
polissacarídeo, chamada de antígeno O. Moléculas hidrofóbicas como os antibióticos podem
ser bloqueados pelo antígeno O. Como o flagelo e o pili, LPS também se adere à membrana
(RYAN e RAY, 2004; KIPNIS et al., 2006).
3.4.4 Alginato
É um polissacarídeo extracelular composto de polímeros repetidos de ácido
manurônico e glucurônico. Protege a bactéria de antibióticos, da fagocitose e aumenta a
resistência da bactéria ao sistema imune do hospedeiro. Participa no processo de formação do
biofilme (GACESA, 1998; KIPNIS et al., 2006). A formação de alginato representa um
importante mecanismo contra o estresse oxidativo. (SABRA et al., 2002).
3.5 Sistema de secreção de proteínas
A secreção de toxinas e outras proteínas contribui bastante para a virulência da
bactéria, Esta secreção ocorre por diversas vias e algumas utilizam componentes de GSP
(mecanismo geral de secreção, do inglês General Secretion Pathway). Nas espécies gramnegativas, a secreção deve deslocar a proteína através de duas membranas: a membrana
14
citoplasmática e a membrana externa. Foram descobertas cinco vias em diferentes patógenos
gram-negativos que exportam proteínas para o ambiente (RYAN e RAY, 2004).
Pseudomonas aeruginosa possui um grande arsenal de fatores de virulência que para serem
secretados dependem de sistemas especializados de exportação, incluindo os sistemas de
secreção do tipo I, II, III, V e o tipo VI, que foi recentemente descoberto (ENGEL e
BALACHANDRAN, 2009). Os sistemas II e V utilizam o sistema de secreção Sec ou Tat
conforme descrito a seguir (SAIER, 2006).
3.5.1 O sistema Sec
O sistema Sec (general secretory pathway), ou via secretora geral, exporta as proteínas
através da membrana citoplasmática. Nas bactérias este sistema inclui várias proteínas
conservadas entre diversas espécies (SecY, SecE, SecG, YidC, FtsY e Ffh) e proteínas
adicionais encontradas apenas em alguns organismos (SecA, SecB, SecD, SecF e YajC). A
transferência através da membrana interna envolve o reconhecimento da pré-proteína, que
ainda não está na conformação final, pela SecB (que é uma proteína chaperona ATPindependente) e uma posterior associação com a proteína SecA (que é uma ATPase) que
impulsiona a exportação da cadeia do polipeptídeo substrato através do canal condutor
SecYEG (formado pelas proteínas SecY, SecE e SecG), formando o que chamamos de
translocase. A proteína passa para o espaço periplasmático através da translocase (MA et al,
2003).
Conforme ilustrado na Figura 2, a exportação da proteína pelo sistema Sec ocorre em
3 fases: na fase 1 a proteína pré-secretada (linha laranja) com peptídeo sinal amino terminal
(retângulo laranja) se liga a translocase pelo signal recognition particle, (SRP: azul) ou pela
chaperona SecB (lilás) e é enviada para a translocase SecYEG ou para SecYEG complexada
15
com a SecA (caso a pré-proteína tenha seqüências hidrofílicas). FtsY (lilás) e SecA atuam
como receptores para a SRP e SecB, respectivamente. Na fase 2 a pré-proteína é translocada
pelo canal SecYEG ,integra-se à bicamada lipídica e perde o peptídeo sinal pela peptidase
seguindo para fase 3 onde é translocada para o espaço periplasmático (PAPANIKOU et al.,
2007).
Figura 2: Sistema Sec de secreção. A exportação da proteína ocorre em 3 fases; na fase 1, a
proteína pré-secretada (laranja) com peptídeo sinal amino-terminal (retângulo laranja) se liga
à translocase pelo sinal de reconhecimento (SRP) ou pela chaperona SecB (lilás), sendo
enviada à translocase SecYEG ou à translocase SecYEG complexada com a SecA. As
proteínas FtsS e SecA atuam como receptoras do SRP e da SecB. Na fase 2, a pré-proteína
está sendo translocada pelo canal SecYEG e se integra a bicamada lipídica, perdendo o
peptídeo sinal e na fase 3 ela segue para o espaço periplasmático (PAPANIKOU et al.,2007)
3.5.2 O sistema Tat
A via Tat (twin-arginine translocator) opera em paralelo ao sistema Sec na exportação
de proteínas periplasmáticas. Em uma bactéria, a via Tat é distinta do sistema Sec em termos
da sua notável capacidade de transporte de enzimas enoveladas, utilizando apenas gradiente
de prótons como fonte de energia. O sistema Tat se encontra na membrana citoplasmática da
16
maioria das bactérias e consiste em três proteínas integrais de membrana: TatA, TatB e TatC
(CLINE e MCCAFFERY, 2007). O peptídeo sinal das proteínas Tat-dependentes se
assemelham ao peptídeo sinal das proteínas Sec-dependentes considerando suas estruturas
globais, mas possuem um motivo de argininas geminadas na região positivamente carregada.
A maioria das proteínas Tat-dependentes conhecidas possuem fatores redox, e são
componentes de várias cadeias respiratórias que ajudam no crescimento anaeróbico da
bactéria. Em Pseudomonas aeruginosa, o sistema Tat é usado na secreção de pelo menos duas
fosfolipases C (VOULHOUX et al., 2001; BUCK, et al., 2008).
Um esquema do sistema Tat de secreção pode ser visto na Figura 3: (a) quando não
existem substratos presentes à proteína TatA (verde) e o complexo TatBC (amarelo e
vermelho) estão presentes, mas separados na membrana interna (IM), (b) o ciclo Tattransporte começa quando o motivo de argininas geminadas do peptídeo sinal do substrato Tat
é reconhecido pelas TatB e TatC, (c) o complexo TatA se associa ao complexo substrato
TatBC, sendo dependente de uma força motriz de prótons, (d) o substrato é translocado do
citoplasma (CP) para o periplasma (PP) pelo canal formado pela proteína TatA, (e) os dois
complexos se dissociam novamente (BUCK et al., 2008).
17
Figura 3: Sistema Tat de secreção. (BUCK et al., 2008).
3.5.3 Sistemas Sec-dependentes
3.5.3.1 Sistema de secreção tipo II
O sistema de secreção do tipo II é um sistema Sec-dependente e ocorre em duas
etapas. A primeira etapa corresponde na passagem da proteína para fora da membrana interna
pela vias Sec ou Tat, enquanto que a segunda etapa consiste em um período extremamente
curto, onde a proteína é transportada do periplasma para fora da membrana externa como
ilustrado na Figura 4 (CIANCIOTTO, 2005). Na primeira etapa, a proteína a ser secretada é
produzida com um peptídeo sinal N-terminal, o que permite a sua translocação Secdependente através da membrana citoplasmática. Isto é seguido pela remoção do peptídeo
sinal, enovelamento e liberação das proteínas maduras no espaço periplasmático. Neste
compartimento, pode sofrer modificações como formação de ligação dissulfeto, antes de
18
serem translocadas através da membrana externa pela máquina Xcp ou secreton. Este aparato
composto de 12 a 16 proteínas é extremamente específico, podendo distinguir as proteínas a
serem excretadas das proteínas periplasmáticas residentes (SANDKVIST, 2001; DESVAUX
et al., 2004).
Figura 4: Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo II (RYAN e RAY, 2004).
Dentre as proteínas secretadas por este sistema estão a elastase, a lipase, a fosfolipase C e a
Exotoxina A (KIPNIS et al., 2006).
3.5.3.2 Sistema de secreção tipo V
O sistema de secreção do tipo V ocorre em duas etapas e é Sec dependente, sendo
considerado o sistema mais simples de secreção (RYAN e RAY, 2004). Neste sistema estão
incluídas as famílias de proteínas que são secretadas pelo sistema de autotransporte (tipo Va
ou AT-1), o sistema de secreção de dois componentes (tipo Vb) e o sistema tipo Vc. As
proteínas secretadas por essas vias apresentam semelhanças em suas estruturas primárias. Na
Figura 5 é possível ver um esquema do sistema de secreção do tipo V.
19
Figura 5: Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo V. No sistema de secreção do
tipo Va, as proteínas são chamadas de autotransportadoras por não necessitarem de
acoplamentos de energia, nem de proteínas acessório. Após a passagem para o periplasma
pelo sistema Sec, o domínio β localizado na extremidade C-terminal adota uma estrutura em
forma de barril, facilitando a passagem da molécula efetora pela membrana externa. No
sistema do tipo Vb o peptídeo sinal orienta a passagem através da membrana interna. Após
passar para o periplasma, o domínio de passagem se insere na membrana externa, formando a
estrutura β-barril. Uma vez na superfície, o domínio de passagem pode sofrer um processo
proteolítico para atingir sua função fisiológica. O sistema do tipo Vc é um sistema alternativo
ao tipo Va, onde ocorre a formação de vários barris (HENDERSON et al., 2004).
a) Tipo Va
As proteínas secretadas por este sistema são chamadas de autotransportadoras por não
necessitar de acoplamentos de energia nem de proteínas acessório para sua translocação.
20
Possuem os seguintes domínios: a sequência sinal (ou peptídeo sinal), o domínio de passagem
(ou domínio α) e a unidade de translocação que é dividida em duas regiões: uma região curta
de ligação α-helicoidal e um domínio β. A sequência sinal está presente na extremidade Nterminal da proteína e permite a sua ligação com a membrana interna para sua posterior
passagem para o periplasma. O domínio β, localizado na extremidade C-terminal adota uma
estrutura em forma de barril quando embebido na membrana externa, facilitando a
translocação do domínio de passagem a pela membrana externa. O domínio de passagem
corresponde à molécula efetora, uma vez que executa a função extracelular da proteína. Os
domínios de passagem são muito diferentes em sequência e função, mas tem sido
relacionados à virulência bacteriana. Eles podem apresentar atividade enzimática (proteases,
peptidases, esterases e lipases), mediar a motilidade bacteriana, ou agir como adesinas,
toxinas, citotoxinas ou ainda permitir a maturação de uma outra proteína de virulência.
(DESVAUX et al, 2004; HENDERSON et al, 2004).
b) Tipo Vb
No sistema de secreção de dois componentes ou TPS (Two-partner secretion), como
no sistema Va, o domínio de passagem possui uma sequência sinal que orienta a translocação
através da membrana interna. Após a exportação para o periplasma, o domínio de passagem
se insere no poro da membrana externa formado pela estrutura β-barril. Uma vez na superfície
da bactéria, o domínio de passagem pode sofrer um processo proteolítico para atingir sua
função fisiológica. Contudo, em contraste com a via autotransportadora, onde a proteína é
produzida como um polipeptídeo único, o domínio de passagem (também chamado de
exoproteína) e o domínio que forma os poros são chamados respectivamente de TpsA eTpsB.
(JACOB-DUBUISSON et al., 2001).
21
c) Tipo Vc
Este tipo de sistema de secreção tem sido proposto como um sistema alternativo ao
sistema autotransportador, devido à secreção de proteínas terciárias autotransportadoras de
forma diferente do sistema Va. A família das adesinas oligoméricas tem sido descrita como
subfamília de autotransportadoras oligoméricas de ligação de superfície. A proteína YadA de
Y. pestis é a adesina prototípica deste sistema. (HENDERSON et al, 2004).
Dentre as proteínas autotransportadoras em Pseudomonas aeruginosa está a esterase
EstA (WILHELM et al, 2007).
3.5.4 Sistemas Sec-independentes
Em contraste com os sistemas de secreção dos tipos II e V, os sistemas do tipo I, III,
VI exportam proteínas através das membranas internas e externas por um processo contínuo
sem a necessidade de um sistema acessório (HUECK, 1998).
3.5.4.1 Sistema de secreção tipo I
O sistema de secreção do tipo I consiste de três proteínas que formam o canal
transmembrana, através do qual a proteína secretada se move, sendo transportada por uma das
proteínas, uma transportadora ABC (ATP- binding cassete). Em apenas uma etapa, a proteína
secretada que apresenta um sinal clássico de secreção, passa do citosol para o meio externo,
sem necessitar de um intermediário citoplasmático (Figura 6). Segundo Guzzo e
colaboradores (1991), a protease alcalina é secretada por esse sistema. A AprA exibe um sinal
de secreção C-terminal bem característico, localizado nos últimos 60 aminoácidos (DUONG
22
et al, 1996). As três proteínas da membrana necessárias para a secreção são AprD (proteína
transportadora ABC), AprE (proteína de fusão de membrana) e AprF ( proteína de membrana
externa). (DUONG et al., 2001).
Figura 6: Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo I, a proteína secretada passa
para o meio externo sendo transportada pela ABC transportadora (RYAN e RAY, 2004).
3.5.4.2 Sistema de secreção tipo III
O sistema de secreção do tipo III, o qual é responsável pela secreção de muitos fatores
de virulência na espécie Pseudomonas, é formado por aproximadamente 20 proteínas. Estas
proteínas associam-se em uma estrutura supramolecular que lembra uma seringa com uma
agulha denominada injectissoma (CORNELIS, 2006). Este sistema é dependente de contato,
onde a secreção das proteínas virulentas (ou efetores) é ativada pelo contato entre célula
bacteriana e a célula hospedeira, resultando na injeção direta da proteína secretada no
citoplasma da célula eucariótica (Figura 7). O sistema de secreção do tipo III consiste em três
complexos de proteínas distintos, mas que operam coordenadamente: o aparato de secreção, o
aparato de translocação, efetores e chaperonas. É um sistema Sec-independente, formando um
canal de translocação dos efetores bacterianos para a célula. Apenas quatro moléculas efetoras
foram identificadas em Pseudomonas aeruginosa: ExoU, ExoS, ExoT e ExoY. ExoS é uma
23
toxina bifuncional com dois domínios ativos, um domínio C-terminal ADP- ribosiltransferase,
cuja atividade depende de um cofator da célula eucariótica, e um domínio N- terminal GTPase
ativador de proteína (GAP). Sua patogenicidade é atribuída a atividade da ADPribosiltransferase, levando ao estabelecimento da infecção e danos ao tecido (FU et al.,1993).
ExoT é similar a ExoS, com atividades ADP- ribosiltransferase e GAP, porém é considerada
uma citotoxina minoritária, não sendo considerada como responsável a patogenicidade da
Pseudomonas aeruginosa (KIPNIS et al.,2006). ExoY é uma adenilato ciclase injetada
diretamente no citosol do hospedeiro, Sua toxicidade ainda é incerta, embora seja tóxica
quando expressa em leveduras (ENGEL e BALACHANDRAN, 2009). ExoU é uma potente
fosfolipase sendo considerada a principal citotoxina secretada pelo sistema de secreção do
tipo III, podendo matar rapidamente os macrófagos, células epiteliais e fibroblastos (JAIN t
al., 2008). Efetores adicionais deverão ser revelados à medida que novas cepas são
seqüenciadas e posteriormente analizadas. ExoT e ExoY são codificadas por quase todas as
cepas, embora nem todas produzam ExoY funcional, devido a mutações. ExoS e ExoU são
genes variavelmente codificados e quase nunca são encontrados na mesma cepa (ENGEL e
BALACHANDRAN, 2009).
24
Figura 7: Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo III (RYAN e RAY, 2004).
3.5.4.3 Sistema de secreção tipo VI
Este sistema foi inicialmente descrito por Pukatzki et al. (2006), que usando
Dictyostellium discoideum como modelo de hospedeiro identificou um mecanismo de
virulência em V. cholerae que envolvia a translocação de proteínas extracelulares que não
possuíam uma seqüência líder na região N-terminal hidrofóbica. Estes genes foram nomeados
de VAS (virulence associated secreton) e foram propostos como sendo os codificadores do
sistema de secreção do tipo VI. A função do sistema de secreção do tipo VI seria mediar a
exportação extracelular de fatores de virulência e translocá-los para células eucarióticas.
O sistema do tipo VI é um sistema dependente de energia, e usa uma ATPase
hexamérica da família AAA+, ClpV. As proteínas Hcp (hemolisina A co-regulada) estudadas
em V. cholerae e confirmadas em P. aeruginosa não possuem um peptídeo sinal canônico,
indicando que elas não são secretadas por um sistema Sec ou Tat dependentes, e
provavelmente atravessam o envelope celular bacteriano de uma só vez (PUKATZKI et al
25
2006, MOUGOUS et al 2006). A proteína VgrG de V. cholerae pode formar um dispositivo
similar a cauda de um bacteriófago. Este dispositivo pode ser usado para perfurar o envelope
bacteriano e ainda a membrana da célula hospedeira para o transporte de efetores. Já as
proteínas Hcp formam anéis hexaméricos, que formam um duto extracelular que envolve o
tubo formado pelas proteínas VgrG.
Conforme ilustrado na figura 8, a ATPase ClpV (laranja) ajuda a transportar Hcp
(amarelo) e VgrG (verde escuro) através do envelope celular. A Lip (rosa) é uma lipoproteína
putativa de membrana externa, sendo improvável que esta forme um poro na membrana uma
vez que está ancorada na mesma por modificação lipídica. As proteínas IcmF (azul) e DotU
(vermelho) são proteínas de membrana interna. O nível de fosforilação da proteína Fha
(marrom) é que regula a atividade do sistema (FILLOUX et al., 2008).
26
Figura 8: Esquema de transporte do sistema de secreção do tipo VI, C-citoplasma bacteriano,
IM- membrana interna bacteriana, P-periplasma bacteriano, OM- membrana externa
bacteriana, ECM- meio extracelular e PM- membrana do hospedeiro. (FILLOUX et al. ,
2008).
3.6 Fatores de virulência secretados
3.6.1 Piocianina
A piocianina (1-hidróxi-5-metil-fenazina) (Figura 9), em modelos animais de infecção
pulmonar aguda e crônica, mostrou-se essencial para a virulência da Pseudomonas
aeruginosa. Por ser um zwitterion pode penetrar facilmente nas membranas biológicas. Na
maioria dos casos, a citotoxicidade da piocianina tem sido fortemente ligada ao seu potencial
ciclo redox podendo aceitar elétrons diretamente dos agentes redutores celulares NADH ou
27
NADPH. Sob condições aeróbias, ela transfere os elétrons para o O2 levando a um aumento
do estresse oxidativo dos sistemas celulares pela geração de espécies reativas de oxigênio
como radical superóxido (O2.-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (O’MALLEY et al, 2004;
(LIU e NIZET, 2009 ).
Piocianina
H
-
-
O
O
N
+
- H+
N
+
+ H+
CH3
Vermelho
pKa=4.9
N
+
N
CH3
Azul
Figura 9: Estrutura da piocianina em dois estados: em pH perto do neutro ou alcalino o
pigmento existe na forma de zwitterion e possui a coloração azul, enquanto que em pH ácido
sua coloração é vermelha.
A maioria das células possui vários mecanismos essenciais para limitar sua exposição
a espécies reativas de oxigênio. Um dos principais componentes da defesa antioxidante é o
composto tiol glutationa. Quando as células são expostas a espécies oxidantes como H2O2, a
glutationa reduzida (GSH) é oxidada a sua forma dimerizada, (GSSG) pela ação da enzima
glutationa peroxidase. GSSG é reduzida novamente a GSH pela ação da glutationa redutase
(Figura 10). Esse ciclo da GSH é um importante mecanismo de limitar a exposição celular aos
efeitos citotóxicos do H2O2. O consumo e a perda de GSH é conseqüência da exposição
celular a agentes oxidantes e contribui para lesão celular. (O’MALLEY et al, 2004).
28
Piocianina
NAD(P)+
NAD(P)H
2O2
.-
2H+
H2O2
2O2
+
O2
GPx
2GSH
GSSG
NADP+
NADPH
GSH
redutase
Figura 10: Formação de O2.- e H2O2 pela reação do NAD(P)H com a piocianina e a interação
subseqüente do H2O2 com GSH. GPx, glutationa peroxidase.
Este pigmento possui atividade antibiótica contra uma grande variedade de
microorganismos, o que beneficia a P. aeruginosa na eliminação de microrganismos
competidores, inibindo a fagocitose e induzindo a apoptose do hospedeiro. Além disso,
também participa na redução do ferro e funciona como um tampão redox intracelular.
Recentemente a piocianina mostrou ter função de sinalização, sendo responsável pela
regulação de genes específicos, Omo genes envolvidos na aquisição de Fe+3(PRICEWHELAN et al, 2006; PRICE-WHELAN et al, 2007; KIPNIS et al., 2006; RESKA et al. ,
2006).
A síntese da piocianina é regulada por quorum sensing. As moléculas sinais N-(3oxododecanoil) homoserina lactona e N-butiril homoserina lactona são sintetizadas pelos
genes lasI e rhlI respectivamente. A uma alta densidade celular, o ativador transcricional
LasR se liga a N-butiril homoserina lactona (C4-HSL) para ativar a transcrição de genes de
virulência, alguns deles envolvidos na produção da piocianina (Figura 11) (LAU t al., 2004).
29
Quinolones
LasR-LasI
RhlR-Rhll
PAI-1
+
PAI-2
+
phzA1B1C1D1E1F1G1
e phzA2B2C2D2E2F2G2
Chorismic acid
Phenazine-1-carboxylic acid
S-adenosyl-Lmethionine
PhzM
S-adenosyl-Lhomocysteine
5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine
NADH + O2
NAD+ + H2O
Pyocyanin
Figura 11: Rota biossintética da piocianina. (LAU t al., 2004)
30
3.6.2 Proteases
Várias proteases de P. aeruginosa que tem sido isoladas mostraram estar envolvidas
em sua patogênese. Grande parte do dano tecidual causado por infecções por P. aeruginosa
pode ser atribuído a zinco-dependente metaloendopeptidase LasB (elastase), LasA e proteases
alcalinas. Embora o nome sugira especificidade à elastina, a LasB pode degradar uma gama
de substratos como fibrinogênio, colágeno, lamimina, transferrina e imunoglobinas. Esta
protease é uma das mais bem caracterizadas, sendo secretada pelo sistema de secreção do tipo
II. A LasA é ativa contra uma pequena gama de substratos e potencializa a ação da LasB.
Semelhante a LasB, a protease alcalina demonstra ampla especificidade a fibrina,
fibrinogênio, lamimina e é secretada pelo sistema de secreção do tipo I. (MARQUART et al,
2005; KIPNIS et al., 2006).
3.6.3 Lipases
Lipases,
triacilglicerol
hidrolases,
são
um
importante
grupo
de
enzimas
biotecnologicamente relevantes que possuem muitas aplicações nas indústrias de alimentos,
de detergentes e farmacêuticas. Lipases são em geral produzidas a partir de microorganismos
e, especificamente as lipases bacterianas desempenham um papel vital em empreendimentos
comerciais (GUPTA et al., 2004). Lipases também são definidas como glicerol éster
hidrolases que catalisam a hidrólise de triglicerídeos a ácidos graxos livres e glicerol. Estas
enzimas podem catalisar reações de esterificação, interesterificação, acidólise e alcoólise.
Novas aplicações biotecnológicas tem sido estabelecidas com sucesso usando lipases para a
síntese de biopolímeros e biodiesel, na produção de fármacos enantiopuros e compostos
agroquímicos (HASAN et al., 2009).
31
Pseudomonas aeruginosa é capaz de infectar pacientes imunocomprometidos. Este
patógeno possui um sistema lipolítico extracelular complexo, com pelo menos duas
fosfolipases C, uma esterase ligada a membrana externa e uma lipase. Konig et al. (1996)
descobriram que a ação combinada das enzimas lipase e fosfolipase levam a um aumento das
substâncias reativas ácido 12-hidroxieicosatetranoico das plaquetas humanas e leucotrieno B4
dos neutrófilos. Essas reações podem levar a distúrbios de respostas imunes, que poderia
iniciar dano tecidual e estimular processos inflamatórios (STEHR et al.,2003).
A lipase produzida por Pseudomonas aeruginosa é secretada pela via de secreção do
tipo II (LIEBETON et al., 2000).
3.6.4 Hemólise
O poder hemolítico é um fator de virulência para muitas bactérias patogênicas. Pode
ser relacionado a vários fatores: toxinas formadoras de poros, citolisinas dependentes de tiol,
fosfolipases, biossurfactantes, componentes do sistema de secreção do tipo III, ou pela ação
concomitante destas moléculas (ROWE e WELCH, 1994).
3.6.5 Ramnolipídeo
Em
condições
ambientais
específicas,
Pseudomonas
aeruginosa
produz
biossurfactante do tipo glicolipídeo contendo ramnose. A produção de ramnolipídeos pela
bactéria foi relatada pela primeira vez por Jarvis et al. (1949). Em cultura líquida,
P.aeruginosa
produz,
principalmente,
hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato
duas
formas
de
(monoramnolipídeo)
ramnolipídeo:
e
ramnosil-β-
ramnosil-ramnosil-β-
hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato (diramnolipídeo) (Figura 12) (RENDELL et al., 1990).
32
A biossíntese dessas moléculas tenso-ativas ocorre através de duas reações seqüenciais
de
transferência
de
grupamento
ramnosil,
catalisada
pelo
complexo
enzimático
ramnosiltransferase I (RhlA/RhlB) (BURGER et al., 1963) e ramnosiltransferase II (RhlC)
(Rahim et al., 2001), respectivamente, tendo a molécula de deoxi-timidina-difosfatoLramnose (dTDP-L-ramnose) como doadora do ramnosil em ambas as reações e a molécula
de β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato ou ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato
atuando como os respectivos receptores (BURGER, 1966). A figura 13 ilustra a via
biossintética destas moléculas, (SOBERÓN-CHAVÉZ et al., 2005).
Figura 12: Estrutura dos ramnolipídeos (SOBERÓN-CHÁVEZ et al., 2005)
P. aeruginosa pode produzir ramnolipídios a partir de uma grande variedade de
substratos incluindo alcanos C11 e C12, succinato, piruvato, citrato, frutose, glicerol, óleo de
oliva, glicose e manitol. A composição e os rendimentos dependem do tipo de fermentador,
pH, composição de nutrientes, substrato e temperatura (MULLIGAN, 2009).
33
D-glucose-6-phosphate
FATTY ACID BIOSYNTHESIS
AlgC
D-glucose-1-phosphate
ß-Ketodecanoylester
RmlA
NADPH
dTDP-D-glucose
RhlA
NADP+
LPS
ß-Hydroxydecanoyl-ACP
RmlB
CoA
dTDP-4-keto-6deoxy-L-mannose
ACP
ß-Hydroxydecanoyl-S-CoA
NADPH
RmlD
NADP+
OH
PhaC
O
CH3
OH
OH
O
O
O P O P O Timidine
OO-
HO
+
H
C
H
C C O C C CO-S-CoA
H
H
(CH2)62 O
(CH2)62
CH3
CH3
ß-Hydroxydecanoyl-B-hydroxydecanoyl-S-CoA
dTDP-L-rhamnose
RhlAB
TDP
O
LPS
OH
O
CH3
O
H
C
C C
H2
(CH2)6
O
CH3
OH OH
H
C
C COOH
H2
(CH2)6
CH3
L-Rhamnosyl-ß-hydroxydecanoyl-ß-hydro
xydecanoate
TDP-L-rha
RhlC
TDP
O
OH
O
CH3
OH O
OH
O
CH3
O
H
C
C C
H2
(CH2)6
CH3
O
H
C
C COOH
H2
(CH2)6
CH3
L-RhamnosylL-Rhamnosyl-ßhydroxydecanoyl-ß-hydroxydecanoate
OH OH
Figura 13: Via metabólica de biossíntese de ramnolipídeo (SOBERÓN-CHÁVEZ et al.,2005;
ZHU e ROCK, 2008)
34
3.6.6 DNA extracelular
O patógeno oportunista P. aeruginosa tornou-se um organismo modelo na pesquisa de
biofilmes. É possível portanto, que a liberação do DNA, em alguns casos, permita a troca de
material genético para dar lugar e induzir a formação da estrutura do biofilme e sua
estabilização. A relativamente longa duração da proximidade física de bactérias em biofilmes
permite que as células constituintes estabeleçam relacionamentos de longo prazo uns com os
outros, e biofilmes parecem ser ambientes ideais para que transferência de genes ocorra
através do processo de transformação (ALLESEN-HOLM et al, 2006).
3.7 Estresse oxidativo
O estresse oxidativo é caracterizado quando a concentração de pró-oxidantes gerados
por fatores de origem endógena e/ou exógena supera as defesas antioxidantes das células. A
oxidação é parte fundamental da vida aeróbica, e assim os radicais livres são produzidos
naturalmente. Radicais livre, cujo elétron desemparelhado encontra-se centrado no átomo de
oxigênio são denominados espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs tem sido
caracterizadas como causadoras de danos no DNA, RNA, proteínas e lipídeos. Estas
moléculas são produzidas como um subproduto inevitável do metabolismo aeróbico normal, e
sua produção é ainda exacerbada pela exposição a certos ambientes (BARREIROS et al.,
2006; KOGOMA et al.,1991).
35
3.7.1 Espécies reativas de oxigênio (EROs)
As principais EROs distribuem-se em dois grandes grupos, os radicalares: hidroxila
(HO.), superóxido (O2.-), peroxila (ROO.) e alcoxila (RO.); e os não radicalares: oxigênio
singlete (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl) e ozônio (O3).
Algumas destas espécies estão relacionadas na Tabela 2 (BARREIROS e DAVID, 2006).
Tabela 2: Caracterização de algumas das principais EROs formadas in vivo (RIBEIRO et al,
2005)
Intermediário
Comentário
Sítio de formação
(O2.-)
Formado a partir da redução Reações
de
autoxidação envolvendo
parcial do oxigênio molecular flavoproteínas e ciclos redox
por 1 elétron
H2O2
Formado a partir da redução Vias catalisadas por oxidases e pela
parcial do oxigênio molecular superóxido dismutase
por 2 elétrons
OH.
Formado a partir da redução Locais adjacentes à formação de ânion
parcial do oxigênio molecular superóxido/peróxido de hidrogênio na
por 3 elétrons e nas reações de presença de metais, principalmente Fe2+ ;
Fenton
e
Haber-Weiss, produto da reação de óxido nítrico com o
catalisada por metais
RO.
Radical orgânico centrado no Intermediário na peroxidação de lipídeos
oxigênio
.
ROO
Formado
de membrana
a
partir
hidroperóxidos orgânicos
1
radical superóxido
Δg O2
de Intermediário na peroxidação de lipídeos
de membrana
Primeiro estado excitado do Sem sítios metabólicos definidos
oxigênio molecular
Segundo a teoria do orbital molecular, a molécula do oxigênio diatômico (O2=
oxigênio molecular ou tripleto), em seu estado fundamental (Figura 14a), possui dois elétrons
36
desemparelhados no orbital antiligante π*. Nota-se que os dois elétrons apresentam spins
paralelos e este fato restringe a reatividade da molécula, porque quando a mesma tenta oxidar
outro átomo ou molécula, os elétrons que serão aceitos pelo oxigênio devem também ter spins
paralelos para permanecerem nos orbitais vazios. Entretanto é possível eliminar a restrição de
spin da molécula de oxigênio movendo um dos elétrons desemparelhados, o qual sofre uma
inversão de spin, e assim os dois elétrons passam a emparelhar-se (Figura 14b). Isto requer
energia e forma o oxigênio singlete. Existem duas formas do oxigênio singlete: uma com os
dois elétrons em orbitais diferentes (Figura 14d) e outra, na qual os dois elétrons ocupam o
mesmo orbital (Figura 14b). A primeira forma, (1∑gO2), é considerada muito instável e antes
de reagir com outras moléculas ela se converte no estado (1Δg O2) (Figura 14b), o qual é mais
estável (RIBEIRO et al, 2005). Como conseqüência, a reatividade do oxigênio com
biomoléculas é restrita por spin. A reatividade do oxigênio aumenta pela adição de um, dois
ou três elétrons para formar, respectivamente o radical superóxido (O2.-) (Figura 14c),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO.) ou quando ocorre a inversão de spin
para formar o oxigênio singlete (1∑gO2). Em condições ácidas, O2- pode ser protonado para
formar o radical peridroxila (HOO.) (Figura 15) (KOGOMA, e FARR, 1991).
37
Figura 14: Estados do O2 segundo a teoria do orbital molecular (RIBEIRO et al, 2005)
eO2
e-, H+
e-, 2H+
O 2-
H2O2
.
OH
e-, H+
H2O
(pKa4,8)
HOO.
Figura 15: Formação das EROs a partir do oxigênio (KOGOMA, e FARR, 1991).
Quanto ao potencial de reatividade das EROs no meio biológico, o radical hidroxila é
o mais reativo, podendo oxidar qualquer biomolécula presente em células vivas. O peróxido
de hidrogênio é mais estável que o radical hidroxila e pouco reativo, porém pode atravessar
membranas com facilidade. O oxigênio singlete pode reagir com lipídeos de membrana,
proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos, carboidratos e tióis (RIBEIRO et al, 2005; BAYIR,
38
2005). A caracterização de algumas das principais EROs formadas in vivo pode ser vista na
tabela 2.
3.7.2 Superóxido dismutase (Sod)
Durante a respiração aeróbia o desvio de corrente de elétrons da cadeia de transporte
de elétrons pode levar a produção de O2.-. A produção deste radical é contida pelas enzimas
superóxido dismutases (Sod) que catalisam a dismutação de dois radicais superóxidos em
oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio (Figura 16) (HASSETT et al., 1995).
.-
SOD
+
O2 + H2O2
2O2 + 2H
Figura 16: Reação de dismutação catalisada pelas enzimas superóxido dismutases (BAYIR,
2005).
O radical superóxido é gerado em organismos aeróbios espontaneamente e também
como produto de processos metabólicos. A Sod é considerada de grande importância na
proteção contra os danos causados pelo oxigênio, e o aumento da tolerância ao estresse
oxidativo está relacionado à ativação desta enzima (SCOTT et al.,1987).
Pseudomonas aeruginosa possui duas superóxido dismutases, Mn-Sod codificada pelo
gene sodA e Fe-Sod codificada por sua vez pelo gene sodB. A Mn-Sod apresenta atividade
máxima quando o organismo está privado de ferro, enquanto que a Fe-Sod apresenta atividade
máxima quando o ferro é abundante. No entanto, a regulação destes genes e o impacto
relativo dos seus produtos gênicos sobre metabolismo de P. aeruginosa em condições de
aerobiose são desconhecidos (HASSETT et al, 1992; HASSETT et al, 1999).
39
Os regulons moduladores de resposta ao estresse oxidativo em E. coli são SoxR e
OxyR, sendo ambos ativados a níveis postranslacionais. O ânion superóxido O2- ativa SoxR
pela oxidação de seus centros[2Fe-2S] e o SoxR oxidado induz a expressão do segundo fator
transcripcional SoxS, que ativa diretamente a transcrição de alguns genes, incluindo sodA em
Escherichia coli (OCHSNER et al., 2000). Já a bactéria Pseudomonas aeruginosa tem uma
ORF que codifica uma proteína homóloga a E. coli SoxR mas não para SoxS (KOBAYASHI,
TAGAWA, 2004). Ela possui duas superóxido dismutases (SodA e SodB) que representam a
primeira linha de defesa contra O2-, transformando-o em H2O2 e três catalases (KatA, KatB e
KatE) protegem a célula contra o H2O2. Finalmente quatro alquilhidroperóxido redutases
(AhpA, AhpB, AhpCF e Ohr) detoxificam o H2O2 e vários peróxidos orgânicos. O regulador
transcricional-LysR de 34kDa, OxyR, é crucial para a regulação dos genes antioxidantes katB,
aphB e ahpCF após contato com H2O2. (OCHSNER et al, 2000).
3.7.3 Oxidação de proteínas
As proteínas podem ser diretamente oxidadas por todas as EROs ou também ser alvo
dos produtos da peroxidação lipídica.
As modificações das proteínas basicamente são iniciadas pelo radical OH., contudo a
continuidade do processo de oxidação é determinada pela disponibilidade de oxigênio (O2) ou
de sua forma protonada (.HO2). Coletivamente, estas EROs conduzem a oxidação de resíduos
de aminoácidos (Pro, Asp e Glu), o que pode resultar na inativação e até mesmo fragmentação
das proteínas (BARLETT e STADTMAN, 1997). Em geral, a oxidação dos aminoácidos se
dá na cadeia lateral. Grupos carbonílicos (CO) podem ser formados nas cadeias laterais de
aminoácidos livres ou em cadeias polipeptídicas (especialmente His, Pro, Arg, Lys e Thr)
quando oxidadas. Os produtos formados são quimicamente estáveis, podendo ser facilmente
40
usado como biomarcador de estresse oxidativo (DALLE-DONNE et al, 2003; STADTMAN,
1993; LEVINE et al, 1994 ).
A carbonilação de proteínas pode afetar diretamente o metabolismo celular ao alterar a
atividade das proteínas. Atualmente, a análise de carbonilação em proteínas é o biomarcador
mais utilizado para a determinação dos níveis de oxidação protéica. O acúmulo de proteínas
carboniladas tem sido observado em células de S. cerevisiae durante diversos processos
biotecnológicos, em especial o processo fermentativo para produção de etanol (LANDOLFO
et al.,2008). Um exemplo de utilização deste biomarcador em bactérias pode ser visto em
Dukan e colaboradores (2000), onde em E.coli foi observado que proteínas danificadas
oxidativamente são mais suscetíveis a proteólise, e o acúmulo destas proteínas foi
acompanhado pelo aumento de proteínas carboniladas.
41
4. Materiais e Métodos
Neste capítulo, são apresentados os materiais utilizados para o desenvolvimento do
presente trabalho e as metodologias empregadas. São descritas as técnicas utilizadas para a
condução e para o acompanhamento das fermentações e dosagem de alguns fatores de
virulência, realizadas no Laboratório de Biotecnologia Microbiana (LaBiM, Instituto de
Química/UFRJ). Também são apresentadas as técnicas utilizadas para determinação de
proteínas relacionadas ao estresse oxidativo, realizadas no Laboratório de Investigação de
Fatores de Estresse ( LIFE, Instituto de Química/UFRJ).
4.1 Microrganismo e condições de cultivo
A cepa de Pseudomonas aeruginosa PA1 previamente selecionada de
ambientes de petróleo como melhor produtora de biossurfactantes (SANTA ANNA, 2000) foi
preservada em glicerol a 10% em ultrafreezer a -80 °C. O pré-inóculo foi crescido em placa
com YPDA (extrato de levedura 0,3%, peptona 1,5%, dextrose 0,1%, agar 1,2%) a 30 oC por
48 horas e transferido para frascos de 1000 mL com 300 mL de meio com a seguinte
composição (g/L): NaNO3 1,0; KH2PO4 3,0; K2HPO4 7,0; MgSO4.7H2O 0,2 ; extrato de
levedura 5,0; peptona 5,0 e glicerol 30,0. Após 24 horas de cultivo, o meio de fermentação
contendo as células foi estocado em criotubos na relação glicerol/meio fermentado de 1:3 para
servir como pré-inóculo padrão em todas as fermentações.
42
4.2 Preparo do inóculo
O conteúdo de 1,0 ml do criotubo foi inoculado em 300ml de meio de fermentação
com a seguinte composição (g/L): glicerol 30,0; NaNO3 1,0; K2HPO4 7,0; KH2PO4 3,0;
MgSO4.7H2O 0,2; extrato de levedura 5,0 e peptona 5,0. Os frascos foram então incubados
em agitadores rotatórios a 30oC e 170 rpm por 40 horas. Ao final desse período, as células de
cada frasco foram recuperadas por centrifugação (5000 g por 20 minutos) e utilizadas como
inóculo.
4.3 Esterilização
O fermentador e os frascos, já com o meio de cultura a ser utilizado, foi esterilizado
em autoclave a 121°C por 15 minutos antes de cada produção. O sistema de oxigenação foi
esterilizado com a circulação de uma solução de hipoclorito de sódio a 1,0 % por 1 hora.
Depois deste procedimento, foi circulada água destilada estéril pelo sistema para a eliminação
de vestígios de cloro. Só então foi realizada a inoculação dos microorganismos.
(KRONENBERGER, 2007).
4.4 Frascos agitados
Foram conduzidas fermentações em frascos agitados de 1000 mL em quatro diferentes
relações Vf/Vm (volume de frasco / volume de meio) (1:0,15, 1:0,30, 1:0,50 e 1:0,70), com o
objetivo de se avaliar o efeito da aeração superficial na produção do biossurfactante.
43
As células foram incubadas a 30ºC e a uma rotação de 5000 g em meio de cultivo
(30,0 g/L de glicerol, 1,38 g/L de NaNO3, 7,0 g/L de K2HPO4, 3,0 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de
MgSO4.7H2O) com uma relação carbono/nitrogênio (C/N) igual a 60 (SANTOS et al., 2002).
4.5 Biorreator
O meio de cultura utilizado nas fermentações apresentava a seguinte composição em
gramas por litro: glicerol 30,0; NaNO3 1,4; K2HPO4 7,0; KH2PO4 3,0 e MgSO4.7H2O 0,2,
resultando em uma relação carbono/nitrogênio igual a 60 (SANTOS, 2003).
As fermentações foram realizadas em um biorreator BioFlo IIc (Batch/Continuous
Fermentor; New Brunswick Scientific; USA) com capacidade nominal de 5,0 litros de
volume, inserido em uma capela com exaustão (Figura 17). O volume útil médio utilizado nas
fermentações foi de 3,0 litros, a temperatura foi mantida em 30°C e a agitação, em 100 rpm.
A oxigenação foi conduzida de forma não dispersiva através de um contactor gás/líquido. A
oxigenação foi realizada com o auxílio de um cilindro de oxigênio puro. As condições de
oxigenação utilizadas foram de 1 mg O2/L e 5 mg O2/L (KRONENBERGER, 2007).
Também foram conduzidas fermentações em frascos agitados para efeito comparativo
com o sistema proposto. A temperatura da fermentação foi mantida em 30,0 oC e a agitação,
em 5000 g, em um agitador rotatório (C25KC Incubator Shaker, New Brunswick Scientific).
44
Figura 17: Fotografia do fermentador inserido na capela de exaustão, acoplado ao
sistema de oxigenação utilizando o contactor de membranas
4.5.1 Controle da concentração de oxigênio no biorreator
O sistema de controle da concentração de oxigênio dissolvido foi projetado e
construído, utilizando-se um Controlador Lógico Programável (CLP OCS, GE Fanuc). Outro
sistema de controle da concentração de oxigênio dissolvido foi desenvolvido previamente por
SABRA et al. (2000), mas a oxigenação era realizada de forma dispersiva por borbulhamento
de uma mistura dos gases nitrogênio e oxigênio. Assim, além de persistir o problema da
formação de espumas, havia perda de oxigênio, sendo extremamente complexa a
determinação da exata quantidade consumida deste nutriente. Uma malha simplificada de
controle foi implementada neste controlador com a função de manter a concentração de
oxigênio dissolvido no meio constante ao longo da fermentação. Isto foi conseguido
45
igualando-se a taxa de fornecimento de oxigênio à taxa de consumo deste nutriente pelas
bactérias. Na Figura 18 estão apresentadas fotos do CLP e de seu painel elétrico.
Figura 18: Controlador Lógico Programável utilizado para implementação de uma malha de
controle da concentração de oxigênio dissolvido nas fermentações para a produção de
ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa.
Pela experiência adquirida através da condução dos experimentos com o controle
manual da oxigenação, a estratégia de controle foi baseada em se alterar primeiramente a
vazão da corrente líquida e, posteriormente, a pressão da corrente gasosa para controlar a taxa
de fornecimento de oxigênio. Essa taxa é diretamente proporcional às duas variáveis citadas.
Assim, se o valor da concentração de oxigênio dissolvido fosse reduzido para um valor abaixo
do desejado, a taxa de fornecimento deveria ser elevada pelo aumento na vazão da corrente
46
líquida e, se insuficiente, na pressão da corrente gasosa. Se a concentração de oxigênio
estivesse acima do estabelecido, a taxa deveria ser reduzida. Um fluxograma simplificado do
sistema de oxigenação é apresentado na Figura 19.
Figura 19: Fluxograma simplificado do sistema de oxigenação.
Como observado na figura acima, a vazão da corrente líquida era controlada através da
atuação sobre a bomba de engrenagens e sobre a válvula v1. Já a pressão da corrente de
alimentação de oxigênio era controlada pela atuação sobre as válvulas de entrada e saída do
contactor, v2 e v3, respectivamente. Assim, a única entrada do CLP se refere à concentração
de oxigênio dissolvido medida no meio de fermentação, enquanto que as saídas são quatro –
para a bomba e as válvulas.
Os dados de operação do controlador eram repassados a um computador acoplado ao
sistema através de um programa supervisório (IFix StandAlone Standard HMI Pack RunTime
47
para 75 pontos). Esses dados eram armazenados para análise posterior (KRONENBERGER,
2007).
4.6 Biomassa
A concentração celular das suspensões de Pseudomonas aeruginosa PA1 foi
determinada através da absorbância de luz a 600 nm (Espectrofotômetro MultiSpec – 1501;
Shimadzu Corporation, Japan). O valor de absorbância foi convertido no valor de
concentração (g/L) através de uma curva de calibração (TAVARES, 2007).
Amostras coletadas no fim de uma fermentação foram filtradas em membranas de 0,2
µm para a retirada das células. Essas células foram levadas em estufa a 70 oC até que fosse
atingido massa constante. A curva de calibração da absorbância em função da massa seca foi
construída a partir de uma série de diluições realizadas com amostras idênticas de meio de
cultivo contendo células. Para cada diluição os valores de absorbância e massa seca foram
determinados e construiu-se assim uma curva de calibração. O fator de conversão de
absorbância em concentração, calculado através da equação Abs = 2,5437 * X, foi de 0,39
g/L.
4.7 Quantificação de glicerol
O teor de glicerol nas amostras livre de células foi avaliado pelo método
enzimático/colorimétrico para determinação de triglicerídeos (Triglicérides Enzimático –
Bioclin; Quibasa química Básica Ltda.). O método consiste na fosforilação de glicerol a
glicerol-3-fosfato em presença de glicerol quinase e ATP. O glicerol-3-fosfato é então
oxidado pela enzima glicerol-3-fosfato oxidase, liberando peróxido de hidrogênio que, na
48
presença de aminoantipirina, p-clorofenol e peroxidase, produz um composto quinônico de
cor cereja. A intensidade dessa coloração pode ser determinada pela medida de absorbância
de luz no comprimento de onda correspondente – 490 nm – e é proporcional à concentração
de glicerol, podendo assim ser comparada a um padrão (KRONENBERGER, 2007).
4.8 Quantificação de ramnolipídeos
A quantificação dos ramnolipídeos nas amostras livre de células foi realizada de modo
indireto, utilizando-se a ramnose como referência – a ramnose é um subproduto da hidrólise
ácida dos ramnolipídeos. Foi utilizado um método adaptado do descrito por Pham et al.
(2004), onde a etapa de extração dos ramnolipídeos foi suprimida, sendo o ensaio realizado
diretamente a partir do meio fermentado livre de células, já que o biossurfactante é um
produto predominantemente extracelular. Para a determinação da concentração de ramnose
presente na amostra, o valor de absorbância obtido era comparado com o valor obtido na
dosagem de uma solução padrão de ramnose. Tomando como base 100,0 g de ramnolipídeos,
temos um total de 0,2737 gmol de ramnose. Sabendo-se que a massa molar da ramnose
(C6H12O5) é igual a 164,0 g/gmol, calculamos um total de 44,89 g de ramnose. Com isso, é
determinado o fator de 2,23 (100,0 g de ramnolipídeos/44,89 g de ramnose) para a conversão
de concentração de ramnose em concentração total de ramnolipídeos (KRONENBERGER,
2007).
A solução de biossurfactantes produzida pela cepa PA1 de Pseudomonas aeruginosa
foi caracterizada por HPLC e comparada a cromatogramas obtidos na literatura (SANTA
ANNA, 2005). A composição de ramnolipídeos desta solução está apresentada na Tabela 3.
49
Tabela 3: Composição de uma solução de ramnolipídeos produzidos por Pseudomonas
aeruginosa PA1.
Tipo
Fórmula Massa molar (g/gmol) Concentração mássica (%)
R1 (MonoC10C10) C26H36O9
492
35,3
R2 (Di C10C10) C32H46O13
638
51,0
DiC10C12
C34H50O13
666
9,8
DiC10C8
C30H42O13
610
3,9
4.9 Quantificação de proteases
A atividade proteolítica nas amostras livre de células foi medida através da hidrólise
de azocaseína por alíquotas do meio de cultura livre de células (CHARNEY e TOMARELLI;
1947).
Para preparação do substrato, 0,5 g de azocaseína foram adicionados a 10 mL de
tampão Tris/HCl (0,05M, pH9) sob agitação suave. Para o ensaio, 0,5 mL do sobrenadante da
fermentação foi adicionado a 0,5 mL de azocaseína. A mistura foi levada a banho-maria a
37°C. Três aliquotas de 0,5 mL do meio reacional foram retiradas em 5, 10 e 15 min e a
reação interrompida pela adição de 0,5 mL de TCA 10% gelado. Após 10 minutos à
temperatura ambiente a mistura foi centrifugada a 5000 g/15min. Para dosagem, 0,5 mL do
sobrenadante foi adicionado a 0,5 mL de KOH 5N e foi feita a leitura da absorbância a
428nm.
Para preparação do branco, adicionou-se a enzima primeiro o TCA e depois a solução de
azocaseína. A atividade foi determinada pela equação (1):
A
absamostra  absbranco  1000
Va  t
Onde:
A = atividade (U/L)
Absamostra = absorbância da amostra
Absbranco = absorbância do branco da reação
∆t = tempo de reação (min)
Va = volume de amostra (mL)
(1)
50
A unidade de atividade proteásica foi definida como a quantidade de enzima que
produz uma diferença de uma unidade na absorbância entre a amostra e seu branco, por
minuto, nas condições do ensaio.
4.9 Quantificação de elastases
Para a dosagem de elastases nas amostras livre de células foi utilizado um teste
baseado na degradação de uma elastina ligada ao vermelho do congo. A degradação deste
substrato libera no meio este corante, permitindo a avaliação da atividade (BRAGA et al.;
1994).
O substrato foi preparado a partir de uma suspensão de elastina-vermelho do Congo
(1 mg/mL) em tampão Tris/HCl (0,05M, pH 8). Para o ensaio, 125μL do sobrenadante da
fermentação foi adicionado a 1mL da suspensão. A mistura foi incubada a 37°C por 24 h e
depois centrifugada a 5000 g/10 min. Foi medida a absorbância do sobrenadante em
espectrofotômetro a 495 nm. Como controle foi utilizado o sobrenadante fervido por 10 min,
e como branco foi utilizado tampão.
A atividade foi determinada pela equação (2):
A
absamostra  abscontrole  1000
Va  t
Onde:
A = atividade (U/L)
Absamostra = absorbância da amostra
Abscontrole = absorbância do controle da reação
∆t = tempo de reação (min)
Va = volume de amostra (mL)
(2)
51
A unidade de atividade elastásica foi definida como a quantidade de enzima que
produz uma diferença de uma unidade na absorbância entre a amostra e seu branco, por
minuto, nas condições do ensaio.
4.11 Quantificação de lipases
A atividade lipásica foi medida pelo método espectrofotométrico, o qual se baseia na
formação de um produto cromóforo (p-nitrofenol) a partir da reação de hidrólise do pnitrofenil laureato catalisada pelas lipases. A solução do substrato foi preparada utilizando-se
0,25 mL de p-nitrofenil laureato 2,5 mM em 2,2 mL de tampão fosfato de sódio 25 mM pH
7,0. A reação foi iniciada pela adição de 0,05 mL do extrato enzimático e conduzida a 30ºC.
O progresso da reação (formação do p-nitrofenol) foi acompanhado em espectrofotômetro
com leituras das absorbâncias a 412 nm. Uma unidade internacional (U) é definida como a
quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1,0 μmol de p-nitrofenil laureato por minuto
nas condições de ensaio descritas.
4.12 Quantificação de proteínas totais
As proteínas extracelulares, presentes nos sobrenadantes dos cultivos de P. aeruginosa
foram determinadas através do método de Lowry et al. (1951). O método de Lowry se baseia
na reação do cobre com proteína, em meio alcalino, e posteriormente redução do reagente de
fosfomolibdato-fosfotungstenato no reagente folin. Quando o reagente folin é adicionado à
proteína tratada com o cobre, ocorre a redução do reagente folin que resulta em uma cor azul
mais intensa. A concentração de proteínas foi determinada através de curva padrão utilizando
52
a albumina de soro bovino (BSA) nas concentrações de 0,1 mg/mL para dosagem de proteínas
extracelulares, e de 1 mg/mL para dosagem de proteínas intracelulares.
4.13 Purificação do ramnolipídeo
Para purificação do ramnolipídeo produzido foi realizada uma extração do meio de
cultura livre de células com clorofórmio: metanol (2:1) overnight. A fração de clorofórmio
contendo ramnolipídeo foi separada e o clorofórmio foi separado por rotaevaporação a 55°C.
O ramnolipídeo foi seco em estufa a 40°C até apresentar peso constante (RODRIGUES et al,
2006).
4. 14 Quantificação de hemólise
O teste de quantificação de hemólise foi realizado conforme descrito por Hoffman
Group – standart for hemolysis assay (HOFFMAN, 2010). O ensaio de atividade é realizado
com suspensões de hemácias pela medida da hemoglobina liberada a 540 nm. A menor
quantidade de hemolisina capaz de causar uma lise completa de células de sangue é
considerada uma unidade hemolítica (HEID et al., 2008).
a) Preparação das hemácias
Foram centrifugados a 1000 g/5min um volume de 5 mL de sangue de carneiro,
marcando-se o volume de sangue na lateral do tubo. O soro foi removido com pipeta
automática. O sangue foi ressuspendido com NaCl (150mM) e novamente centrifugado,
sendo este procedimento repetido por três vezes. O volume de sangue foi retomado com
53
tampão fosfato de sódio salino (PBS) (100mM, pH 7,4 com 0,05% de NaCl). A preparação de
hemácias foi diluída por dez vezes com tampão, gerando uma suspensão de hemácias 5x108
hemácias/mL.
b) Ensaio e quantificação
Inicialmente, foi preparado um controle positivo, onde foi utilizada água destilada que
gerou um desequilíbrio osmótico para romper as hemácias; e um controle negativo, onde foi
utilizado o próprio tampão PBS que manteve o equilíbrio osmótico sem ruptura das hemácias.
Uma solução na concentração de 1 mg /mL de ramnolipídeo purificado em tampão PBS foi
preparada e dez amostras diluídas de uma a dez vezes foram preparadas a partir desta solução.
A um volume de 800μL de amostra foram adicionados 200μl de suspensão de
hemácias. Por inversão a solução formada foi homogeneizada e incubada em banho-maria por
1 h a 37°C. Novamente a solução foi homogeneizada e centrifugada a 10000 rpm/5min. O
sobrenadante foi transferido e sua absorbância foi medida a 541nm. O cáculo do percentual de
hemólise foi feito utilizando a equação (3):
% Hemolise 
( A541amostra)  ( A541branco)  100
A541controlepo sitivo  A541branco
Onde:
% Hemólise= percentual de hemólise
Abs541amostra = absorbância da amostra
Abs541branco = absorbância do branco da reação
Abs541controle positivo = absorbância do controle da reação
(3)
54
4.15 Precipitação do alginato
Ao sobrenadante do meio de cultura foram adicionados 3 volumes de etanol 95%
gelado (estocado a -70°C) sob agitação para precipitação do alginato. Foi realizada uma
centrifugação 5000 g /15 min. O centrifugado foi lavado por duas vezes com etanol 95%, por
uma vez com etanol absoluto e então foram realizadas três diálises por 24h em 4L de água
destilada para remoção de pequenas moléculas (MAY e CHAKRABARITY, 1994).
4.16 Quantificação de piocianina
O ensaio de quantificação é baseado na absorbância da piocianina a 520 nm em meio
ácido (KURACHI, 1958; MACDONALD, 1967).
De dois inóculos de Pseudomonas aeruginosa com 72 h de crescimento, um crescido
em meio de cultura para maximizar a produção de piocianina (20 g/L de peptona, 1,4g/L de
MgCl2, 10g/L de K2SO4) e outro crescido em meio de cultura para maximizar a produção de
biossurfactante, foram feitas extrações para determinação de piocianina.
Foram transferidos 5ml do meio de cultura para um funil de separação de capacidade
de 10 ml. A primeira extração foi feita com 3 ml de clorofórmio e então uma nova extração
da fase orgânica com 1ml de HCl 0,2N foi realizada. A concentração expressa em
microgramas de piocianina produzida por mililitros de sobrenadante foi determinada pela
multiplicação da absorbância a 520 nm por 17,072 (coeficiente da distinção molar da
piocianina) conforme descrito em KURACHI (1958).
55
4. 17 Precipitação de DNA
A extração do DNA foi realizada através da precipitação do DNA por etanol
(ZEUGIN e HARTLEY, 1985).
A um volume de 250μl de amostra foi adicionado 2,5 mL de tampão acetato de sódio
previamente autoclavado e armazenado a 4°C. A esta solução formada foi adicionado 7,5 ml
de etanol 100% sendo esta incubada em geladeira overnight. Na manhã seguinte, a solução foi
centrifugada a 14000 g por 30min a 4°C. O sobrenadante foi removido, ficando o pellet no
tubo. Este foi rinsado por duas vezes com etanol 70%. O pellet foi então ressuspenso em 1 ml
tampão TE (Tris-HCl 10mM pH 7,6-8,0 e EDTA 0,1mM).
4.18 Verificação de extração de DNA em gel de agarose
Eletroforese através de gel de agarose é um método padrão usado para separar,
identificar e purificar fragmentos de DNA (SAMBROOK et al., 1989).
Foram dissolvidos 0,5 de agarose em 50 mL de tampão TAE 1x (Tris-ácido acéticoEDTA). A mistura foi aquecida em microondas até que ficasse translúcida. Deixou-se a
solução esfriar ate aproximadamente 50 oC e esta foi aplicada no suporte da cuba de
eletroforese horizontal. O pente foi ajustado na cuba e aguardou-se até a solidificação da
agarose. A cuba foi preenchida com tampão TAE 1x. 3μl de tampão de amostra (corante)
foram adicionados e homogeneizados a 7μl de amostra de DNA. As amostras com tampão
foram aplicadas ao gel e a eletroforese foi realizada a 70V por 30min O gel foi corado em
solução de brometo de etídio (0,1μg/ml). O brometo de etídio é um corante fluorescente que
se intercala entre as bases do DNA e, sob radiação ultravioleta permite a visualização de
56
DNA. As bandas correspondentes aos fragmentos de DNA foram visualizadas e digitalizadas
em fotodocumentador UVP BioImaging Systems.
4.19 Detecção de DNA por método espectrofotométrico
A absorção da amostra de DNA é feita em dois comprimentos de onda. As medidas de
absorção a 260nm são quantitativas para ácidos nucléicos, mas não é possível fazer a
distinção entre DNA e RNA. No entanto a razão A260/A280 pode ser utilizada para
determinação da pureza dos ácidos nucléicos em relação ao conteúdo de proteínas, o que
reduz o valor da razão A260/A280 (AUSUBEL, 1999). A amostra de DNA foi diluída 25 vezes
em água destilada para sua quantificação. O branco foi água destilada. Foram feitas leituras
nos comprimentos a 260 e 280 nm. Para determinar a concentração do DNA presente, foi
utilizada a equação (4):
C ( g / ml) 
A260100
0,020
(4)
A A260 foi multiplicada por 100 (diluição total), sendo considerado que na precipitação do
DNA a diluição foi de 4 vezes e que o DNA extraído estava 25 vezes diluído.
4. 20 Condições de estresse oxidativo
A exposição das células de P. aeruginosa PA1 ao estresse oxidativo foi realizado
através da exposição direta do cultivo, em frascos agitados, ao peróxido de hidrogênio 10mM
durante 60 min a 30°/170rpm (SEGUNDO, 2007).
57
4.21 Extração de proteínas
Foram realizadas extrações para determinação da atividade Sod e do nível de
carbonilação de proteínas após o estresse oxidativo. Para todas as extrações, 30 mg de células
foram precipitadas, após centrifugação do fermentado a 5000g / 20min, e a extração foi
realizada a partir do sedimentado, previamente lavado com água destilada. As células foram
ressuspensas em 2mL de tampão Kpi 36mM pH 7,8 (36mM K2HPO4, 36mM KH2PO4) e
transferidas para criotubo. Foram adicionados 40μL de inibidor de proteases preparado com
água destilada. Pérolas de vidro foram adicionadas ao sistema. As células foram rompidas por
sonicação no aparelho Sonics Vibracell (Ultra sonic processor 750W/20KHz) por 30 ciclos
(12,5 min) 30%, posicionando-se a ponteira do sonicador acima das pérolas de vidro, para que
as pérolas não fossem quebradas. O rompimento das células foi verificado em microscópio
ótico Axioskop 40 Zeiss. Após os procedimentos as amostras foram transferidas para
microtubos de 2 mL (número suficiente para acondicionar todo o volume de amostra) e
centrifugados a 14.000 g, por 15 min, sendo os sobrenadantes coletados para posterior análise.
4.21.1 Determinação da atividade de superoxido dismutase (Sod)
A atividade de superóxido dismutase foi realizada em gel de eletroforese nativo de
poliacrilamida (PAGE) após imersão do gel em solução contendo NBT e riboflavina. A
atividade Sod foi acompanhada pela inibição da redução do NBT após geração de radicais
superóxido pela riboflavina iluminada.
Volumes de extrato de células correspondentes a 80 μg de proteína foram diluídos em
5μL de tampão de amostra (1:4 v/v; Tris-HCl 1M pH 6.8, glicerol 80%, azul de bromofenol
1%), avolumados a 20μL com água e aplicados a cada poço de um gel de poliacrilamida a
58
10%, espaçamento de 1,5 mm. A eletroforese foi realizada em sistema vertical de minigel
(Power-Pac Basic, Bio-Rad) a 30 mA, por aproximadamente 90 min. Após a eletroforese, para
medir a atividade Sod o gel foi incubado por 20 min em NBT 2,5 mM, depois por 15 min em
solução de desenvolvimento (100ml tampão Kpi 36mM pH 7,8, 418,8μl TEMED 28mM, 3,23mg
riboflavina 86 μM) e exposto a luz até o aparecimento das bandas. As bandas foram visualizadas
e digitalizadas em fotodocumentador UVP BioImaging System.
4.21.2 Proteína Carbonilada
Para análise da oxidação protéica 100μg de proteínas foram aplicados em um sistema a
vácuo para fixar as proteínas em uma membrana de nitrocelulose, anteriormente umedecida
em tampão PBS (100mL de tampão PBSA:80 g/L NaCl, 2 g/LKCl, 15 g/L Na2HPO4, 2 g/L
Na2H2PO4, 800 mL água destilada, 0,1g/L MgCl2, 0,1g CaCl2). A membrana foi incubada por
10 min em solução 0,1mg/mL de DNPH (2,4-dinitrofenilhidrazina) em HCl 2N para que
ocorresse a reação entre o DNPH e as carbonilas presentes nas cadeias laterais dos
aminoácidos oxidados das proteínas. Em seguida a membrana foi lavada por três vezes com
HCl 5N para remoção do DNPH não reagido. A membrana de nitrocelulose foi incubada em
solução bloqueadora (5% de leite em pó desnatado, em PBS acrescido de 300μl de azida a
cada 10ml e uma gota de Tween). Após um mínimo de 24h a membrana foi novamente
incubada em solução bloqueadora contendo anti-DNP (1:2500) de coelho por 2h. Ao fim
desta incubação a membrana foi lavada por três vezes em PBS e incubada por 10 mim em
Tris-HCl 50mM pH 7,5 contendo NaCl 150mM. A membrana foi transferida para um
recipiente contendo solução bloqueadora livre de azida e fosfato (5% de leite em pó desnatado
em Tris-HCl 50mM pH 7,5 e NaCl 150mM) contendo anticorpo secundário IgG conjugado a
peroxidase (1:2500) por 1h. A membrana foi lavada por duas vezes em tampão Tris-HCl
59
10mM pH 7,5. Para revelação a membrana foi incubada em solução cromógena (6mg
diaminobenzidina tetraidrocloreto para 9 mL de Tris-HCl 10mM pH 7,6 e 1 mL de CoCl2
0,3% acrescido de 10μl de H2O2) até o aparecimento das bandas (DALLE-DONNE et al,
2003). As membranas foram escaneadas através do programa ImageMaster 2D Platinum e a
intensidade das bandas foi determinada através do programa ImageMaster versão 5. A
carbonilação protéica foi calculada através da razão entre as intensidades das bandas obtidas
descontadas do valor do branco da seguinte forma: em frascos agitados a comparação foi feita
nos pontos de 10h (fase exponencial) e 36h (fase estacionária) sem exposição e expostos por
1h a H2O2. Em biorreator a comparação foi feita entre as fermentações nas condições de
oxigenação mínima de 1 mg O2/L e máxima de 6 mg O2/L, nas fases exponencial e
estacionária de crescimento.
4.3 Análise estatística dos resultados
Todos os experimentos foram realizados no mínimo em triplicata. Os resultados são
apresentados como uma média ± desvio padrão de pelo menos três experimentos
independentes. O teste-t de Student foi utilizado para comparação entre duas médias. Definido
o intervalo de confiança de 95%, uma diferença foi considerada significante estatisticamente
quando p ≤ 0,05.
60
5. Resultados e Discussão
Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados obtidos na investigação de
fatores de virulência e os fatores de estresse oxidativo no processo de produção de
biossurfactantes por Pseudomonas aeruginosa PA1.
Com o sistema de controle da concentração de oxigênio dissolvido implantado por
Kronemberger (2007) foi observada uma variação do consumo de oxigênio ao longo das
diferentes fases de metabolismo celular. Após a fase de adaptação, que dura no máximo 4
horas, ocorre um aumento no consumo total de oxigênio, OUR. (Oxygen Uptake Rate). A
elevação no valor do consumo se inicia com 4 horas de fermentação e dura cerca de 12 horas,
até quando a fermentação atinge 16 horas. É interessante notar que esse aumento na taxa de
consumo coincide com a fase exponencial de crescimento microbiano, concluindo-se que o
consumo de oxigênio atinge o seu máximo no início da fase estacionária de crescimento e se
reduz a um nível mínimo após atingir a fase estacionária (KRONEMBERGER et al.,2008).
2,5
80
2
60
1,5
40
1
20
0,5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Biomassa (g/L))))
SOUR (mg/g.h)))))
100
0
100
t (h)
SOUR
Biomassa
Figura 20: Crescimento celular (g/L) e consumo de oxigênio (SOUR) (Specific Oxygen
Uptake Rate) (mg/g.h) em função do tempo da fermentação. Dados obtidos em fermentação
com condição de oxigenação de 6 mg O2/L.
61
Esse comportamento também é observado para a taxa específica, SOUR (Specific
Oxygen Uptake Rate), o que confirma que essa variação não está somente relacionada à
mudança nos valores de concentração celular (Figura 20).
Desta forma, o estudo consistiu em verificar alguns fatores de virulência secretados e
fatores de estresse oxidativo produzidos por Pseudomonas aeruginosa PA1. A princípio
foram utilizados frascos agitados com diferentes relações de volume do frasco/volume de
meio Vf/Vm (1:0,15, 1:0,30, 1:0,50 e 1:0,70) com objetivo de se variar à oxigenação do meio,
onde foram verificadas produtividade de ramnolipídeos e produção de fatores de virulência
secretados ao longo do tempo. Em seguida, ainda em frascos agitados, foram analisados os
fatores de estresse oxidativo na presença de H2O2 (10mM) e por fim em biorreator duas
diferentes condições de oxigenação foram testadas, uma condição mínima de 1mgO2/L e uma
condição máxima de 6mgO2/L, onde fatores de virulência secretados e fatores de estresse
oxidativo bem como produtividade de ramnolipídeos foi analisada, visando obter uma
condição onde houvesse o máximo de produção de biossurfactante com o mínimo de
produção de fatores de virulência.
5. 1 Cinética da produção de ramnolipídeos em frascos agitados
As primeiras fermentações foram realizadas com o objetivo de se avaliar o efeito do
oxigênio na produção de ramnolipídeos. Inicialmente foi avaliado o efeito da aeração
superficial em frascos agitados. Desta forma, o crescimento celular foi avaliado nos frascos
em diferentes relações de volume do frasco/volume de meio Vf/Vm (1:0,15, 1:0,30, 1:0,50 e
1:0,70) ao longo do tempo. Na Figura 21(A) verifica-se que nos frascos onde há maior relação
Vf/Vm e, conseqüentemente, maior taxa de aeração superficial ocorreu um maior crescimento
celular em função do tempo.
62
Glicerol
Biomassa
B
40
Conc (g/L)))
1:0,15
2
1:0,30
1:0,50
1
1:0,70
1:0,15
30
1:0,30
20
1:0,50
10
0
1:0,70
0
0
50
100
150
0
Tempo (h)
50
100
150
Tem po (h)
Ram nolipídeo
C
10
Conc (g/L)))
Conc (g/L)))
A
3
8
1:0,15
6
1:0,30
4
1:0,50
2
1:0,70
0
0
50
100
150
Tem po (h)
Figura 21- Perfil do crescimento de biomassa (A), consumo de glicerol (B) e produção
de ramnolipídeo (C) por Pseudomonas aeruginosa. Fermentação em shaker a 30OC e 170 rpm
utilizando frasco de 1L e diferentes relações Vf/Vm.
Na Figura 21(B), onde está representado o consumo de glicerol (g/L) em função do
tempo, verifica-se que o consumo de substrato, conseqüentemente, foi mais rápido nos frascos
onde há uma maior concentração celular. Nos frascos com relação Vf/Vm igual a 1:0,15, o
consumo de glicerol observado foi de 224,0 mg/L.h. Nos frascos com Vf/Vm 1:0,30 e 1:0,50,
o consumo da principal fonte de carbono foi igual, respectivamente, a 210 e 129 mg/L.h. O
menor consumo de substrato (37 mg/L.h) foi observado nos frascos com Vf/Vm de 1:0, 70.
Na Tabela 4, é apresentada a comparação entre as variáveis x (variação na
concentração de biomassa), P (concentração de ramnolipídeos), Yp/x (rendimento de
63
produto por biomassa produzida), Yp/s (rendimento de produto por substrato consumido),
Yx/s (rendimento de biomassa por substrato consumido) e Qp (produtividade de
ramnolipídeos).
Tabela 4: Comparação entre as variáveis x (variação na concentração de biomassa), P
(concentração de ramnolipídeos), Yp/x (rendimento de produto por biomassa produzida),
Yp/s (rendimento de produto por substrato consumido), Yx/s (rendimento de biomassa
por substrato consumido) e Qp (produtividade de ramnolipídeos) para as diferentes relações
Vf/Vm (6 dias de fermentação).
Relação
x
P
Yp/x
Yp/s
Yx/s
Qp
Vf/Vm
(g/L)
(g/L)
(g/g)
(g/g)
(g/g)
(mg/L.h)
(1:0,15)
1,8
8,5
4,7
0,29
0,062
59,0
(1:0,30)
1,8
7,4
4,2
0,25
0,059
51,4
(1:0,50)
1,5
6,3
4,1
0,24
0,059
43,8
(1:0,70)
0,7
1,8
2,5
0,16
0,062
12,5
Podemos observar que os dois experimentos conduzidos com maiores relações Vf/Vm
conduziram a melhores oxigenações do meio com conseqüente aumento no crescimento
celular, taxa de consumo de glicerol e produção de ramnolipídeos. Na condição de Vf/Vm de
1:0,50 o fornecimento deficiente de oxigênio começa causar um decréscimo em todos estes
parâmetros. Entretanto, apenas na condição de menor aeração superficial este fenômeno
torna-se evidente com uma diminuição drástica de 61%, no crescimento celular, e 79%
produção de ramnolipídeos em relação à condição Vf/Vm de 1:0,15, embora a diferença seja
de 0% na taxa de consumo de glicerol. Conseqüentemente, menores rendimentos de produto
por biomassa produzida e de biomassa por substrato consumido são obtidos. A produtividade
(Qp) obtida na menor relação ficou 79% inferior em relação ao obtida na maior relação
64
Vf/Vm (Tabela 3), indicando que existe um valor limite de fornecimento de oxigênio para um
melhor crescimento celular e conseqüente produção de ramnolipídeo.
Os valores de produtividade obtidos nestas fermentações iniciais em frascos agitados
são comparáveis aos encontrados na literatura científica. Os valores variam de 24 mg/L.h com
biomassa de 1,25 g/L a 82 mg/L.h com biomassa de 1,37 g/L (COSTA et al., 2006). No
entanto, deve-se ressaltar que estes valores de produtividade de ramnolipídeos foram obtidos
com diferentes fontes de carbono (óleo de buriti e óleo de castanha, respectivamente) e, com
outra cepa de Pseudomonas aeruginosa LBI. Para Kronemberger (2007) a produtividade em
frascos agitados chega a 51,1 mg/L.h em experimentos com Pseudomonas aeruginosa PA1.
Em Wei e colaboradores (2005), a produtividade máxima alcançada foi de 26mg/L.h para a
cepa Pseudomonas aeruginosa J4 crescida em meio MS (mineral salts) e em Wu e
colaboradores (2007), foi de 21,9 mg/L.h para a cepa Pseudomonas aeruginosa EM1 crescida
em meio com óleo de oliva como fonte de carbono. Ambos os autores não revelaram os
valores de biomassa correspondentes.
5. 2 Perfil da produção de elastases e proteases em frascos agitados
Na figura 22 são apresentados os perfis cinéticos de produção de elastases e proteases
para diferentes condições de aeração superficial.
65
0,80
0,60
1:0,15
0,40
1:0,30
0,20
1:0,50
0,00
0
50
100
Tem po (h)
150
1:0,70
Atividade (U/L))))
Atividade (U/L))))
Protease
Elastase
A
B
50
40
30
20
10
0
1:0,15
1:0,30
1:0,50
0
50
100
150
1:0,70
Tem po (h)
Figura 22: Perfil da produção de elastases (A) e proteases (B) por Pseudomomas aeruginosa.
Fermentação em shaker a 30OC e 170 rpm utilizando frasco de 1L e diferentes relações
Vf/Vm.
Observa-se que a atividade das elastases em frascos agitados é baixa com atividade
máxima em 150h de 0,7U/L e 0,4U/L no frasco com maior aeração, 0,3U/L e 0,1U/L nos
frascos de relação Vf/Vm de (1;0,50) e (1:0,70) respectivamente, havendo variação com a
taxa de aeração superficial empregada (Figura 22A). O perfil da atividade da protease alcalina
(pH 9) é 100 vezes maior do que das elastases, mostrando-se também maior nos frascos com
maior aeração superficial, em 79h com valores de 31U/L e 41U/L nos frascos de relação
Vf/Vm de (1; 0,15) e (1:0,30) respectivamente e em torno de 10U/L nos frascos com menor
aeração superficial (Figura 22B). As duas enzimas apresentam um perfil cinético parecido,
apresentando uma variação de 64% para elastase e 72% para protease alcalina, entre as
médias dos frascos de maior e menor oxigenação em 150h. Como nos frascos onde se tem
menor relação Vf/Vm a concentração de células é maior, é possível que por este motivo as
atividades enzimáticas também tenham sido, podendo o aumento da atividade das enzimas
protease e elastase ser atribuído a um aumento de biomassa e não a uma maior oxigenação.
O sistema de quorun sensing através do ativador transcricional LasR promove a
transcrição de proteases distintas envolvidas na virulência desta bactéria, como as elastases A
e B e a protease alcalina. As elastases são secretadas pelo sistema de secreção do tipo II, que
ocorre em duas etapas, onde a rota de secreção desta proteína é feita através da membrana
66
interna, onde há a dependência do sistema Sec e do sinal do peptídeo na extremidade amino
das proteínas transportadoras. Já as proteases são proteínas secretadas pelo sistema de
secreção do tipo I, onde as proteínas passam diretamente ao meio sem passar pelo espaço
periplasmático (SOBERÓN, 2001).
5. 3 Cinética da produção de ramnolipídeos em biorreator acoplado a contactores de
membrana
Depois de se obter o comportamento cinético em frascos agitados da cepa de
Pseudomonas aeruginosa sob diferentes condições de aeração superficial, a próxima etapa do
trabalho foi testar em biorreator duas condições de oxigenação distintas. A primeira, onde a
manutenção de concentração de oxigênio dissolvido no meio foi de 6 mg O2/L, e a segunda,
onde a concentração foi de 1 mg O2/L. Estes valores correspondem respectivamente a 86% e
14% da concentração de saturação de oxigênio que, nas condições definidas para as
fermentações era igual a 7,0 mg O2/L (KRONEMBERGER, 2007). O perfil da oxigenação
das fermentações 3 (6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L) podem ser vistos nas figuras seguintes: na
figura 23 têm-se oxigênio dissolvido no meio (mg/L) ao longo das fermentações; na figura 24
a taxa de consumo de oxigênio bruto (OUR)(mg/L.h) e na figura 25 a taxa específica de
consumo de oxigênio (SOUR)(mg/g.h). Estas condições foram escolhidas por serem as
condições máxima e mínima de oxigenação que puderam ser obtidas no biorreator acoplado a
contactores de membrana.
67
10
9
OD (mg/L)))
8
7
6
Ferm3
5
Ferm5
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
t (h)
Figura 23: Oxigênio dissolvido no meio (mg/L) ao longo das fermentações 3 (6 mg O2/L) e 5
(1 mg O2/L).
120
OUR (mg/L.h))))
100
80
Ferm3
60
Ferm5
40
20
0
0
50
100
150
200
t (h)
Figura 24: Taxa de consumo de oxigênio bruto (OUR)(mg/L.h) ao longo das fermentações 3
(6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L).
68
120
SOUR (mg/g.h)))))
100
80
Ferm3
60
Ferm5
40
20
0
0
50
100
150
200
t (h)
Figura 25: Taxa específica de consumo de oxigênio (mg/g.h) ao longo das fermentações 3
(6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L).
Para melhor entender a influência da concentração de oxigênio na fermentação, os
resultados obtidos com o sistema de oxigenação foram comparados com os valores obtidos
em uma fermentação convencional realizada em frasco agitado de relação Vf/Vm (1:0, 15),
considerada como controle.
Na Figura 26(A e B) verifica-se que as duas condições de oxigenação
apresentaram perfis semelhantes de crescimento celular em função do tempo. Na Figura 26 (C
e D), onde está representado o consumo de glicerol (g/L) em função do tempo, verifica-se que
o consumo de substrato, também apresenta perfis semelhantes para as duas condições de
oxigenação. A produção de ramnolipídeos na Figura 26 (E e F), foi um pouco maior na
condição de menor oxigenação 1 mg O2/L.
As concentrações iniciais das células utilizadas e as concentrações máximas de
ramnolipídeo obtidas estão apresentadas na Tabela 5. Os valores obtidos para o aumento da
concentração da biomassa em função do tempo foram similares aos obtidos em frascos
agitados. Pela comparação dos valores médios de concentração de ramnolipídeo nas
69
diferentes condições de fermentação, pode-se observar que uma menor concentração de
oxigênio dissolvido leva a uma pequeno aumento na produção de ramnolipídeos. Podemos
observar que a condição de concentração de oxigênio dissolvido de 1mgO2/L foi a que
apresentou um maior rendimento de produto por biomassa produzida, maior rendimento de
produto por substrato consumido e conseqüentemente maior produtividade de ramnolipídeos
(Tabela 6). Os valores obtidos para Yp/s(g/g) na fermentação conduzida com concentração
de oxigênio dissolvido igual a 6,0 mgO2/L foram semelhantes aos obtidos por Kronemberger
(2007). Em Sabra et al. (2002), que testou concentrações de saturação de oxigênio de 1%,
10% e 50%, a taxa de formação específica de ramnolipídeos foi maior para células cultivadas
em maiores valores de saturação de oxigênio, contudo a quantidade absoluta de ramnolipídeo
produzida não foi significativamente afetada pela concentração de oxigênio dissolvido. Para
Kronemberger (2007) a concentração de oxigênio dissolvido ideal para a produção de
ramnolipídeos pela cepa bacteriana Pseudomonas aeruginosa PA1 é igual a 4,0 mgO2/L onde,
nesta situação, foi obtida uma produtividade igual a 30 mg/L.h enquanto que a produtividade
em frascos agitados chega a 51,1 mg/L.h. A produtividade em biorreator ainda é 50% inferior
quando estes são comparados a produtividade em frascos agitados. O aumento de escala na
produção apresenta perdas na produtividade, porém os resultados obtidos indicam a
possibilidade de uso do sistema de oxigenação na produção de ramnolipídeos em maior
escala.
70
Biom assa
A
Biom assa
B
3
Ferm2
2
Ferm3
1
Controle
Conc(g/L)))
Conc(g/L)))
3
0
Ferm5
2
Ferm6
1
controle
0
0
50
100
150
0
50
Tem po (h)
30
Ferm2
20
Ferm3
10
Controle
Conc (g/L) )
Conc (g/L) )
Glicerol
D
40
40
30
Ferm5
20
Ferm6
10
controle
0
0
0
50
100
0
150
50
Ram nolipídeo
7
6
5
4
3
2
1
0
Ferm2
Ferm3
controle
0
50
100
Tem po (h)
150
Ram nolipídeo
F
150
Conc (g/L)))
E
100
Tempo (h)
Tem po (h)
Conc (g/L)))
150
Tem po (h)
Glicerol
C
100
7
6
5
4
3
2
1
0
Ferm5
Ferm6
controle
0
50
100
150
Tem po (h)
Figura 26- Perfil do crescimento de biomassa (A e B) e consumo de glicerol (C e D) e
produção de ramnolipídeo (E e F) em biorreator com condição de oxigenação de 6 mg O2/L e
1 mg O2/L , respectivamente por Pseudomonas aeruginosa. Fermentações em biorreator, a
30°C e 100 rpm utilizando frasco de 5L com volume útil de 3,2L.
71
Tabela 5: Produção de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa com a variação da
concentração de oxigênio dissolvido (biomassa e concentração de produto).
Fermentação/Condição
Biomassa
Biomassa
Conc. máxima
Conc. máxima
de oxigenação
inicial (g/L)
com 6 dias
de produto
média de
(g/L)
(g/L)
produto (g/L)
3,5
Ferm 2 (6 mg O2/L)
0,63
2,40
4,0
Ferm 3 (6 mg O2/L)
0,47
2,30
3,0
Ferm 5 (1 mg O2/L)
0,59
2,08
4,5
Ferm 6 (1 mg O2/L)
0,83
2,59
4,5
Controle
0,63
2,40
8,5
4,5
8,5
72
Tabela 6: Comparação entre as variáveis x (variação na concentração de biomassa), P
(concentração de ramnolipídeos), Yp/x (rendimento de produto por biomassa produzida),
Yp/s (rendimento de produto por substrato consumido), Yx/s (rendimento de biomassa
por substrato consumido) e Qp (produtividade de ramnolipídeos) para as diferentes condições
de oxigenação (6 dias de fermentação).
Fermentações
x
(condição de
P
(g/L)
Yp/x Yp/x Yp/s Yp/s Yx/s Yx/s
(g/g)
oxigenação)
(g/L)
Ferm 2
1,8
4,0
2,2
Ferm3 (6mgO2/L)
1,8
3,0
1,7
Ferm 5
1,5
4,5
2,5
1,8
4,5
2,5
1,8
8,5
4,7
médio
(g/g)
(g/g)
1,9
médio
(g/g)
(g/g)
0,15
0,14
médio
Qp
Qp
(mg/L.h)
médio
(mg/L.h)
(g/g)
0,069
0,075
28,6
25,0
(6mgO2/L)
0,13
2,5
0,22
0,081
0,2
0,072
21,4
0,073
32,1
32,1
(1mgO2/L)
Ferm6
0,18
0,074
32,1
(1mgO2/L)
Controle
4,7
0,29
0,29
0,062
0,062
59,0
5. 4 Perfil da produção de elastases e proteases em biorreator
Na figura 27 são apresentados os perfis de produção de elastases e protease. Observase que a atividade elastásica em biorreator apresenta atividade máxima de 0,8U/L em 91h para
Ferm2, sendo que em 150h os valores são de 0,41U/L e 0,38U/L para as fermentações de 6
mg O2/L e de 0,20U/L e 0,26U/L para as fermentações de 1 mg O2/L. O perfil de produção
também não parece variar muito de acordo com a aeração, apresentando comportamento
parecido ao observado em frascos agitados. O perfil da atividade da protease alcalina (pH 9)
também se apresenta maior que o das elastases na ordem de 100 vezes, com valor máximo em
59,0
73
382 U/L em 88h para Ferm3, sendo que em 150h os valores são de 348U/L e 400U/L para as
fermentações de 6mgO2/L e de 216U/L e 226U/L para as fermentações de 1mgO2/L As duas
enzimas apresentaram o perfil cinético parecido, apresentando uma variação de 41% para
elastase e 41% para protease alcalina, entre as médias das fermentações de maior e menor
oxigenação em 150h.
Para Sabra e colaboradores (2002) a atividade elastásica encontrada não foi
significativa, sendo nula para as fermentações conduzidas a 10% e 50% de saturação de
oxigênio.
Elastase
Elastase
0,80
0,60
Ferm2
0,40
Ferm3
Controle
0,20
Atividade (U/L))))
Atividade (U/L))))
A
0,00
0
50
100
B
0,80
0,60
Ferm5
0,40
Ferm6
0,20
Controle
0,00
0
150
50
Protease
Ferm2
400
Ferm3
200
Controle
0
50
100
Tem po (h)
150
Atividade (U/L))))
Atividade (U/L))))
Protease
600
0
150
Tem po (h)
Tem po (h)
C
100
D
600
Ferm5
400
Ferm6
200
Controle
0
0
50
100
150
Tem po (h)
Figura 27: Perfil da produção de elastases (A e B) e proteases (C e D) em biorreator com
condição de oxigenação de 6 mg O2/L e 1 mg O2/L, respectivamente por Pseudomonas
aeruginosa. Fermentações em biorreator, a 30°C e 100 rpm utilizando frasco de 5L com
volume útil de 3,2L.
74
Foi feita a dosagem da atividade de elastastásica e proteásica no meio de cultivo livre
de células e autoclavado no fim das fermentações em biorreator. Após a autoclavação o
mesmo não apresentou atividade para nenhuma das duas enzimas, mostrando que estas são
degradadas pelo calor, e que o meio de produção autoclavado é uma das alternativas para
desativar estas enzimas e diminuir a toxicidade da preparação bruta de ramnolípídeo a ser
empregada em remediações ambientais.
5. 5 Lipases
O sobrenadante do meio de cultura analisado não apresentou atividade lipásica.
Cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de pacientes com fibrose cística secretam
uma variedade de proteínas, incluindo uma lipase e duas fosfolipases extracelulares que estão
envolvidas
na
variedade de
hidrólise
substratos
de
ácidos
monoésteres
graxos
de
longa
fosfóricos. Tais
e
lipases
curta
são
cadeia
e
importantes
uma
na
patogênese da fibrose cística, mediando a hidrólise completa dos lipídios principais do
surfactante pulmonar, dipalmitoilfosfatidilcolina (HENDERSON e NATARO, 2001; STUER
et al.1986).
Gilbert et al. (1991) utilizou diferentes meios sólidos de cultura para otimização da
produção de lipases. Quando utilizou glicerol como fonte de carbono a atividade lipásica
encontrada foi menor que 139μmol min
min
-1
-1
(mg células -1) e a maior atividade lipásica 39μmol
(mg células -1) foi encontrada na fase estacionária de crescimento de Pseudomonas
aeruginosa em meio de cultura contendo Tween 80.
O meio de cultura utilizado não apresentou atividade lipásica, para o ensaio utilizando
p-nitrofenil laureato como substrato. A atividade da fosfolipase C não foi determinada,
portanto não se pode concluir que há a ausência de lipase no meio de cultura.
75
5. 6 Hemólise
O percentual de hemólise produzido pelo ramnolipídeo purificado pode ser visto na
figura 28. Pode-se verificar que o percentual de hemólise torna-se significativo a partir da
concentração de ramnolipídeo de 80 mg/L e na concentração de 100 mg/L tem-se hemólise de
100%.
Teste hem ólise - RML purificado
% Hemólise ))
120
100
80
60
40
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
Ram nolipídeo (m g/L)
Figura 28: Teste de hemólise realizado com ramnolipídeo purificado
Para Haubler et al., (1998), a atividade hemolítica do ramnolipídeo produzido por B.
pseudomallei se devem as suas atividades detergentes. Em Santa Anna et al. (2007) foram
obtidos resultados de remoção de 91% de óleo aromático numa concentração de 10%p/p
utilizando 6,3g/L de biossurfactante e de 79,7% de óleo parafínico numa concentração de
9,3%p/p utilizando 7,23g/L de biossurfactante de Pseudomonas aeruginosa PA1. A
concentração utilizada por Santa Anna et al (2007) é da ordem de dez vezes maior da
concentração máxima utilizada para o teste de hemólise, indicando que nesta concentração a
hemólise do surfactante é de 100% Em Soderlind e Karlsson (2005) surfactantes sintéticos
como n-tetradecil β-D-maltopiranosida foi verificado hemólise de 50%, sendo atribuído que
76
quanto maior a cadeia maior a atividade hemolítica. Porém apenas surfactantes analisados
pelo mesmo método podem ser comparados por atividade hemolítica.
5. 7 Alginato
Não houve precipitação de alginato do sobrenadante do meio de cultura analisado.
A produção de alginato está diretamente relacionada à formação de biofilme em P.
aeruginosa. Estudos mostram a formação de biofilme in vitro como em pacientes de fibrose
cística (FC). A doença é caracterizada pela colonização bacteriana e infecção crônica das vias
aéreas que progressivamente destroem os pulmões de pacientes e, muitas vezes, levam a
insuficiência respiratória. As cepas de P. aeruginosa que inicialmente infectam os pulmões de
pacientes com FC têm um fenótipo não-mucóide que é típico das cepas isoladas no meio
ambiente. Essas cepas são também altamente móveis e secretam altos níveis de protease e
exotoxinas (BOUCHER, 2004; SABRA et al., 2002).
A produção de alginato pela bactéria e a formação de microcolônias (biofilme) nos
pulmões de pacientes são as principais características de persistência a infecção de P.
aeruginosa (SABRA, KIM, ZENG, 2002).
De acordo com a literatura, fatores de associação celular como alginato são
importantes para virulência de Pseudomonas aeruginosa (MITTAL et al, 2009; RAMSEY,
WOZNIAK, 2005). A ausência de alginato no meio de cultivo bruto livre de células mostra
que a cepa de Pseudomonas utilizada está em um nível de relativa baixa virulência, em
relação as estágio de virulência de cepas isoladas de hospitais tonando-se assim um ponto
positivo para a sua futura aplicação.
77
5. 8 Piocianina
A fenazina piocianina é um pigmento azul esverdeado característico produzido por
Pseudomonas aeruginosa.
Para determinação da concentração de piocianina foram preparados dois inóculos, um
crescido em meio de cultura para maximizar a produção de piocianina (20 g/L de peptona,
1,4g/L de MgCl2, 10g/L de K2SO4) e outro meio de cultura para maximizar a produção de
biossurfactante (glicerol 30,0 g/L; NaNO3 1,0 g/L; K2HPO4 7,0 g/L; KH2PO4 3,0 g/L;
MgSO4.7H2O 0,2 g/L; extrato de levedura 5,0 g/L e peptona 5,0 g/L). Após 72h de cultivo
(fase estacionária de crescimento), o meio para produção de biossurfactante apresentava a
coloração amarela característica e o meio de cultura para produção de piocianina apresentava
coloração verde (Figura 29). Foi realizado o procedimento de extração do pigmento nos dois
meios de cultura e foram medidas as absorbâncias a 520 nm. O meio para biossurfactante
apresentou absorbância nula, indicando que no meio de cultura utilizado não houve produção
de piocianina. O outro meio de cultura apresentou uma concentração de 2,56 μg/mL de
piocianina utilizando-se o fator de conversão determinado por Essar et al. (1990). É
importante observar que mesmo em uma concentração bem pequena (2,56 μg/mL), o
pigmento é capaz de tingir fortemente o meio de cultura, sendo que por simples análise visual
torna-se possível detectar a presença desta toxina.
Figura 29: Inóculos de com 72h de crescimento, crescido em meio de cultura para maximizar
a produção de biossurfactante, e para maximizar a produção de piocianina, respectivamente.
78
Estudos in vitro revelam que a piocianina faz um amplo espectro de danos celulares e
podem contribuir para a persistência da P. aeruginosa nos pulmões de pacientes com fibrose
cística. A piocianina causa múltiplos efeitos sobre as células humanas, como a inibição da
respiração celular, da função ciliar, do crescimento das células da epiderme, bem como a
perturbação da homeostase do cálcio.Concentrações fisiologicamente maiores que 27 μg/mL
de piocianina foram encontradas na saliva de pacientes crônicos de fibrose cística e tem sido
mostradas como indutoras de apoptose em neutrófilos. Como descrito anteriormente, a
piocianina modula o ciclo redox da GSH no pulmão de células epiteliais e endoteliais. A taxa
de indução de apoptose é dependente da concentração e do tempo, com um aumento de dez
vezes na apoptose na condição de 5 h de exposição a 50 μg de piocianina (LAU et al, 2004;
O’MALLEY et al, 2004). A não detecção de piocianina no meio de cultura livre de células
favorece sua aplicação em biorremediação.
5. 9 DNA
O meio de cultivo bruto ao final das fermentações foi processado, de forma que
fossem simuladas algumas alternativas de esterilização e/ou filtração das células para
posterior análise de DNA.
Após a extração, cada amostra de DNA teve sua concentração e pureza determinadas
através das leituras de absorbância em 260nm ( C ( g / ml) 
A260100
) e em 280nm
0,020
(quantificação de proteínas), no espectrofotômetro. A razão entre as leituras em 260nm/
280nm foi utilizada como um indicativo da pureza do DNA obtido (Tabela 7).
Baseado nos valores da razão da absorbância de 260nm/280nm observou-se que o
DNA obtido estava de boa qualidade e com baixas concentrações de proteínas e de RNA.
79
Segundo Ausubel et al (1999), uma razão da absorbância de 260nm/280nm abaixo de 2,0
indica uma preparação altamente purificada de DNA.
Tabela 7: Valores de razão de absorbância e concentração do DNA.
Amostras
A260
A280
Pureza
Conc.
Conc.
A260/ A280
(mg/ml)
média
(mg/ml)
Autoclavadas
0,701 0,402
1,74
3,50
0,757 0,436
1,74
3,78
0,609 0,366
1,66
3,04
0,040 0,029
1,38
0,20
0,044 0,050
0,88
0,22
0,061 0,045
1,35
0,30
0,783 0,451
1,74
3,91
0,728 0,435
1,67
3,64
Filtradas em membrana
0,083 0,068
1,22
0,41
de tamanho de poro de
0,123 0,075
1,64
0,61
0,22 μm
0,118 0,080
1,47
0,59
Centrifugadas e filtradas
0,005 0,003
1,66
0,02
em membrana de 5kDa
0,004 0,005
0,8
0,02
0,001 0,004
0,25
0
Centrifugadas
3,44±0,37
0,24±0,05
1,61±0,11
0,01±0,01
A eletroforese para verificação da qualidade do DNA extraído foi realizada em gel de
agarose 1% (Figura 30 e 31).
80
Figura 30: Gel de agarose 1%. 1,2,3- amostras autoclavadas, 4,5,6-amostras centrifugadas,
7,8,9- amostras centrifugadas e autoclavadas, 10,11,12- amostras filtradas em membrana de
0,22μm, 13 - padrão de peso molecular 1Kb DNA Ladder.
Figura 31: Gel de agarose 1%. 14 - padrão de peso molecular 1Kb DNA Ladder, 15, 16,17amostras centrifugadas e filtradas em membrana de 5kDa.
A análise da imagem do DNA extraído no gel de agarose mostrou que as amostras
autoclavadas (Figura 30: 1,2 3) e as amostras centrifugadas e autoclavadas (Figura 30: 7, 8,9)
apresentaram sinais de DNA degradado. As amostras que foram apenas centrifugadas (Figura
30: 4,5,6) apresentaram uma banda bem intensa, e as amostras filtradas em membrana de 0,22
μm (Figura 30: 10,11,12) apresentam a mesma banda em uma intensidade mais fraca,
mostrando que com esses processos fragmentos de
DNA da bactéria Pseudomonas
aeruginosa ainda se encontram presentes no meio de cultivo bruto. Nas amostras
centrifugadas e filtradas em membrana de 5 kda (Figura 31: 15, 16,17), pode-se verificar que,
81
tanto pela análise por espectrofotometria quanto pela análise de imagem do gel de agarose, a
mesma não apresenta fragmentos de DNA. Portanto, a eliminação do DNA do meio de cultivo
bruto para posterior aplicação mostrou-se
viável através de filtração por membranas.
Trabalhos futuros são necessários para determinar um sistema de filtração eficiente para
eliminar DNA das amostras concomitante ao maior fluxo de filtração possível, de forma a
tornar o processo rápido e eficiente.
5. 10 Secreção de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo
Conforme mencionado anteriormente por Kronemberger et al. (2007) após a fase de
adaptação ocorre um significativo aumento no consumo total de oxigênio atingindo seu pico
de consumo em 16 h, o que coincide com o fim da fase exponencial de crescimento. Em
fermentações em frascos agitados, o fim da fase exponencial ocorre em 10h. Por esse motivo
as análises das proteínas relacionadas ao estresse oxidativo foram realizadas em frascos
agitados (controles), em amostras coletadas em 10 h (fase exponencial) e 36 h (fase
estacionária). Nas fermentações realizadas em biorreator as amostras foram coletadas em 16h
(fase exponencial) e a partir das 160 h (fase estacionária). Como controle de estresse
oxidativo utilizamos o H2O2 (10mM) por 1 h.
5.10.1 Sod
O consumo de oxigênio molecular por Pseudomonas aeruginosa pode levar à
produção de EROs, incluindo superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxila. Como
uma primeira linha de defesa contra os níveis potencialmente tóxicos de superóxido
endógenos, P. aeruginosa possui as enzimas ferro e manganês superóxido dismutase (Sod)
82
(HASSET, SCHWEIZER, OHMAN, 1995). As duas superóxido dismutases (SodA e SodB)
representam a primeira linha de defesa contra O2-, transformando-o em H2O2 e três catalases
(KatA, KatB e KatE) protegem a célula contra o H2O2. Finalmente quatro alquilhidroperóxido
redutases (AhpA, AhpB, AhpCF e Ohr) detoxificam o H2O2 e vários peróxidos orgânicos
(OCHSNER et al, 2000).
Análises da atividade enzimática da Sod de P. aeruginosa em gel nativo de
poliacrilamida são relatados em alguns artigos da literatura (HASSET et al 1993; HASSET,
SCHWEIZER, OHMAN, 1995; HOWARD et al, 1985).
De acordo com a figura 32 podemos observar a presença de atividade das enzimas FeSod e Mn-Sod nos controles de 10h e 36h sem H2O2.
Cont
10h
s/H2 O2
Cont
10h
s/H2 O 2
Cont
10h
s/H2 O2
Cont
36h
s/H2 O2
Cont
36h
s/H2 O 2
Cont
36h
s/H2 O 2
Mn-SOD
Fe-SOD
Figura 32: Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as fermentações
controle sem H2O2.
Já nas figuras 33 e 34 podemos observar a presença de atividade enzimática da Fe-Sod
nos controles de 10h e 36h com e sem H2O2, e nas fermentações realizadas em biorreator na
83
condição de oxigenação de 6mgO2/L e 1mgO2/L tanto na fase exponencial como na fase
estacionária de crescimento. A atividade da enzima Mn-Sod está presente nos controles de
10h e 36h sem H2O2 (Figura 31) e nos controles de 10h e 36h com e sem H2O2 (Figuras 33 e
34). Nas fermentações em biorreator a marcação da atividade da Mn-Sod parece ser bem
discreta na fase exponencial e não é observada sua presença na fase estacionária das duas
condições de oxigenação. Na fase exponencial de crescimento o consumo de oxigênio por
Pseudomonas aeruginosa PA1 é bem maior do que na fase estacionária, como já demonstrado
nas figuras 24 e 25.
Cont
10h
s/H2 O2
Cont
10h
c/H2 O2
F1
fase
exp
F2
fase
exp
F3
fase
exp
Cont
36h
s/H2 O2
Cont
36h
c/H2 O2
F1
fase
est
F2
fase
est
F3
fase
est
Mn-SOD
Fe-SOD
Figura 33: Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as fermentações com
oxigenação de 6 mg O2/L ( F1, F2 e F3) nas fases exponencial e estacionária de crescimento
em biorreator.
Segundo Hasset e colaboradores (1993, 1995) a enzima Fe-Sod é a Sod sintetizada
predominantemente na presença de concentrações relativamente altas de ferro extracelular. Já
a Mn-Sod é expressa ao máximo quando os organismos são privados de ferro, enquanto que a
84
atividade Fe-Sod é máxima quando o ferro é abundante. A Mn-Sod apenas serve de reserva
quando a atividade da Fe-Sod diminui. Devido à natureza aeróbia obrigatória da P.
aeruginosa, níveis elevados de ferro são necessários, não só como um co-fator para os
componentes da cadeia respiratória, mas para Fe-Sod e para catalases. Assim, a provável
razão para os altos níveis da Fe-Sod em relação à Mn-Sod é que o ferro se encontra no estado
férrico (insolúvel) em condições aeróbicas. Para a manutenção dos processos celulares
normais em condições aeróbias, cabe ao organismo manter altas concentrações de ferro
intracelular, armazenando-o em proteínas como a Fe-Sod, catalases ou proteínas Fur (ferric
uptake regulation). Em contraste, a proteína Mn-Sod, ao contrário da E. coli, é controlada por
Fur, uma vez que é aumentada apenas em resposta a falta de ferro.
85
Cont
10h
s/H2 O2
Cont
10h
c/H2O2
F4
fase
exp.
F5
fase
exp
F6
fase
exp
Cont
36h
s/H2 O2
Cont
36h
c/H2O2
F4
fase
est
F5
fase
est
F6
fase
est
Mn-SOD
Fe-SOD
Figura 34: Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as fermentações com
oxigenação de 1 mg O2/L (F4, F5 e F6) nas fases exponencial e estacionária de crescimento
em biorreator.
5. 10.2 Proteína Carbonilada
A carbonilação protéica foi medida através dos valores das intensidades das bandas
obtidas descontadas do valor do branco. Os resultados apresentam as médias e o desvio
padrão de no mínimo três experimentos independentes.
Na análise da carbonilação de proteínas nos controles realizados em frascos agitados
(Figura 35) verificou-se que após 1h de exposição ao H2O2, a carbonilação protéica foi três
vezes maior nos pontos de 10h e 36h quando comparados aos pontos de 10h e 36h que não
86
foram expostos ao H2O2. A análise estatística (teste t) feita entre as amostras antes e depois a
exposição ao H2O2 indica que estas são diferentes.
Figura 35: Análise da carbonilação de proteínas em frascos agitados após adição de
H2O2(10mM) por 1h nos controles de 10h e 36h.
A análise estatística (teste t) feita entre as amostras das fermentações realizadas em
biorreator (Figura 36) indicaram que as fermentações na condição de oxigenação de 6 mg
O2/L e 1 mg O2/L tanto na fase exponencial como na fase estacionária de crescimento são
estatisticamente iguais.
87
Figura 36: Análise da carbonilação de proteínas em biorreator nas fases exponencial e
estacionária de crescimento nas condições de oxigenação de 6 mg O2/L (F2 e F3) e 1 mg O2/L
(F5 e F6).
Organismos
aeróbicos
utilizam
o
oxigênio
molecular
para
a
respiração
ou oxidação de nutrientes para obter energia. EROs, como ânion radical superóxido, peróxido,
e os radicais hidroxila altamente reativos, são gerados continuamente nas células cultivadas
em aerobiose (CABISCOL et al., 2000). Coletivamente, estas EROs conduzem a oxidação de
resíduos de aminoácidos (Pro, Asp e Glu), o que pode resultar na inativação e até mesmo
fragmentação das proteínas (BARLETT e STADTMAN, 1997).
A sensibilidade da técnica não foi adequada para este ensaio, portanto não se pode
chegar a nenhuma conclusão relacionando a carbonilação de proteínas e oxigenação .
88
6. Conclusão
Em frascos agitados observou-se que uma maior aeração superficial leva a uma maior
produtividade de ramnolipídeos. Em biorreator, uma maior produtividade de ramnolipídeos
foi encontrada na condição de menor concentração de oxigênio dissolvido. No entanto a
produção de fatores de virulência extracelulares como elastases e proteases é maior nas
condições de maior concentração de oxigênio dissolvido, provavelmente por haver um maior
crescimento celular nestas condições tanto em frascos agitados como em biorreator.
A protease alcalina apresentou atividade mais alta que a elastase tanto nas
fermentações conduzidas em frascos agitados como nas fermentações conduzidas em
biorreator. Porém, após autoclavação, os meios de cultivo livre de células não apresentaram
atividade, mostrando que estas enzimas são desativadas por calor. O meio de produção
autoclavado é uma das alternativas para desativar estas enzimas e diminuir a toxicidade da
preparação bruta de RML a ser empregada em remediações ambientais.
Não foi observada a produção de alginato e piocianina pela cepa Pseudomonas
aeruginosa PA1. A ausência destes fatores de virulência contam como pontos positivos,
mostrando que a cepa de Pseudomonas utilizada está em um nível de relativa baixa virulência,
em relação as estágio de virulência de cepas isoladas de hospitais tonando-se assim um ponto
positivo para a sua futura aplicação.
O meio de cultura utilizado não apresentou atividade lipásica para o ensaio utilizando
p-nitrofenil laureato como substrato. A atividade de fosfolipase C não foi determinada,
89
portanto pode-se concluir que não há lipase secretada, porém não foi feito ensaio para lipase
intracelular.
A atividade hemolítica do biosurfactante produzido por Pseudomonas aeruginosa
pode estar ligada à sua capacidade detergente, sendo observado que surfactantes sintéticos
também apresentam tais características. A CMC utilizada em biorremediação é de 60mg/L,
onde a atividade hemolítica do biossurfactante produzido é bem baixa, tornando assim o meio
de cultura menos nocivo ao meio ambiente.
A eliminação do DNA do meio de cultivo bruto para posterior aplicação mostrou-se
viável através de filtração por membranas. Trabalhos futuros são necessários para determinar
um sistema de filtração eficiente para eliminar DNA das amostras concomitante ao maior
fluxo de filtração possível, de forma a tornar o processo rápido e eficiente.
A atividade da enzima Fe-Sod foi encontrada em todas as condições de oxigenação
bem como nos controles com e sem H2O2 . Já a enzima Mn-Sod só não foi observada na fase
estacionária das fermentações.
Na análise da carbonilação de proteínas nos controles realizados em shaker verificouse que após 1h de exposição ao H2O2, a carbonilação protéica foi três vezes maior nos pontos
de 10h e 36h. A análise estatística (teste t) feita entre as amostras antes e depois a exposição
ao H2O2 indica que estas são diferentes. A análise estatística (teste t) feita entre as amostras
das fermentações realizadas em biorreator indicaram que as fermentações na condição de
oxigenação de 6mgO2/L e 1mgO2/L tanto na fase exponencial como na fase estacionária de
crescimento são estatisticamente iguais. Desta forma não se pode concluir se as células de
90
Pseudomonas aeruginosa são capazes de suportar diferenças de oxigenação não sendo
observado diferenças na carbonilação de proteínas entre as duas condições de oxigenação
empregadas no biorreator.
91
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