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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
Maria Trindade Marques Bizarria
Montagem de Equipamento, Desenvolvimento, Caracterização
e Aplicações Médico-Farmacológicas de Nanofibras
Eletrofiadas à Base de Blendas de Quitosana
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA À FACULDADE DE
ENGENHARIA QUÍMICA DA UNICAMP COMO PARTE DOS
REQUISITOS EXIGIDOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
DOUTOR EM ENGENHARIA QUÍMICA.
Orientador: Profª. Drª. Lucia Helena Innocentini Mei
Co-Orientador: Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila
Campinas – SP
Fevereiro – 2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP
B551m
Bizarria, Maria Trindade Marques
Montagem de equipamento, desenvolvimento,
caracterização e aplicações médico-farmacológicas de
nanofibras eletrofiadas à base de blendas de quitosana /
Maria Trindade Marques Bizarria. --Campinas, SP:
[s.n.], 2012.
Orientadores: Lucia Helena Innocentini Mei, Marcos
Akira D'Ávila.
Tese de Doutorado - Universidade Estadual de
Campinas, Selecione.
1. Eletrofiação. 2. Nanofibras. 3. Membranas. 4.
Quitosana. 5. Poli (oxido de etíleno) - PEO. I. Mei,
Lucia Helena Innocentini. II. d’Ávila Marcos Akira. III.
Universidade Estadual de Campinas. Selecione. IV.
Título.
Título em Inglês: Design and assembly of equipment, development, characterization
and medical-pharmacological applications of electrospun
nanofibers based on chitosan blends
Palavras-chave em Inglês: Electrospinning, Nanofibers, Membranes, Chitosan, Poly
(ethylene oxide) - PEO
Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Materiais
Titulação: Doutor em Engenharia Química
Banca examinadora: Rosario Elida Suman Bretas, Valcinir Aloisio Scalla Vulcani,
Antonio Rodolfo Junior, Elizabeth Ferreira Martinez
Data da defesa: 28-02-2012
Programa de Pós Graduação: Engenharia Química
ii
iii
iv
Aos grandes amores da minha vida,
meu marido Jair Carlos, minhas filhas Lays e Joyce,
ao meu amado neto Luiz Carlos
Aos meus pais Arminda e João (in memorian) e,
aos meus irmãos José, Alice, Ascensão, Bernardino e Clotilde.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus,
Por ter me dado saúde, por me ter protegido nas minhas idas e
vindas, por ter me dado o apoio e o incentivo da minha família, e
ainda, por ter me cercado de pessoas que caminharam comigo nesta
jornada.
vi
AGRADECIMENTOS
A todas as pessoas, empresas, instituições e órgãos de fomento que de forma direta ou indireta
contribuíram, em maior ou menor grau, para a execução deste trabalho, minha sincera gratidão,
bem como meu reconhecimento da importância imprescindível de todos e de cada um ao longo
desta jornada. Deus abençoe a todos.
À minha professora, amiga e orientadora, Profª. Dra. Lucia Helena Innocentini Mei, pela
oportunidade de realizar o presente trabalho, por ter sempre acreditado, pelas inúmeras e valiosas
sugestões, pela confiança demonstrada nos momentos mais nebulosos, pela efetiva participação e
auxílio nos trabalhos de coautoria, e principalmente pelo contagiante otimismo e pelo apoio e
incentivo de todas as horas.
Ao Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila pela co-orientação segura, oportuna, pela amizade, e pela
valiosa e fundamental participação nas diversas etapas do presente trabalho, bem como, nos
trabalhos de coautoria e principalmente pela calma e discernimento nas horas difíceis.
Ao Prof. Dr. Valcinir Aloisio Scalla Vulcani, professor de histologia e anatomia veterinária,
pelo auxilio e parceria fundamental, nos testes de citotoxicidade in vitro e biocompatibilidade in
vivo.
Ao Professor de física Luiz Antônio Feijó Junior que, demonstrando um extraordinário
desprendimento e prazer em transmitir conhecimentos, além de nos fornecer informações
técnicas, nos cedeu a fonte de alta tensão por ele construída, a qual foi utilizada no presente
trabalho.
A empresa Acecil Central de Esterilização Com. Ind. Ltda. que se prontificou a esterilizar
graciosamente e sem burocracia todos os corpos de prova utilizados nos testes biológicos.
À colega Pós-Doutoranda Karen Segala, pela amizade, pelas fotomicrografias e pela parceria
na obtenção do nanocompósito de quitosana/PEO/AgNPs e demais trabalhos em andamento.
Aos pesquisadores do Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic em especial a
Profa. Dra. Almenara de Souza Fonseca Silva e a Profa. Dra. Elizabeth Ferreira Martinez
pelo auxílio e parceria nos testes de crescimento celular e nos da avaliação da atividade
antimicrobiana.
A Profª. Dra. Rosario Elida Suman Bretas, do DEMa-UFSCar, que nos possibilitou o primeiro
contato com um equipamento de eletrofiação e, demostrando extraordinário altruísmo nos
indicou parceria valiosa para continuação dos trabalhos.
vii
Ao Prof. Dr. Watson Loh e ao Prof. Dr. Edvaldo Sabadini do Departamento de FísicoQuímica do IQ-UNICAMP e seu aluno de pós-graduação, o mestrando Thiago Heiji Ito e a
técnica Marina Novelli Oliveira que nos disponibilizaram seus Laboratórios e seus préstimos
para as medições da tensão superficial e caracterização reológica das soluções poliméricas.
Ao Sr. Adriano Dellallibera da Ind. E. M. Balestro Ltda. pela pré-orientação no manuseio e
utilização de equipamentos de alta tensão quando da montagem do equipamento.
À FEE-UNICAMP na pessoa do Sr. Francisco Brito do Laboratório de Alta Tensão pela
colaboração e valiosas orientações no decorrer deste trabalho.
À FEM-UNICAMP, na pessoa da técnica Claudenete Vieira Leal pelas análises de MEV e
TGA.
À mestranda Leandra M. Santos, do DPB-FEQ pela colaboração nas medições de
condutividade das soluções poliméricas.
Aos colegas, técnicos e estagiários, do Laboratório Analítico e de Calibração e do Laboratório de
Análises Térmicas da FEQ/UNICAMP, Sra. Kelly, Sr. Disney, Adilson, Flavia e Carlos, pela
colaboração nas análises MEV, EDS e DSC.
Aos técnicos eletrônicos e mecânicos da Oficina Mecânica da FEQ/UNICAMP, Sr. Alexandre,
Sr. Daniel, Sr. Levi e, Sr. Edgar e demais profissionais pela decisiva colaboração na construção
e montagem do equipamento da eletrofiação.
A todos os funcionários, e professores do DTP da FEQ-UNICAMP pela valiosa colaboração em
todas as etapas deste trabalho .
Aos colegas do Laboratório de Biomateriais, Matheus, Larissa, Grabriela, Thiago, G.
Citrângulo, Silvia, Ívi, Deborah, Patrícia, Pilar, Adriana e Lucas. S. Andretto pela
colaboração ao longo das diferentes etapas deste trabalho.
Ao CNPq. pelo suporte financeiro (bolsa – p. 140146/2008-3 e p. 141579/2011-0).
viii
RESUMO
A obtenção de nanofibras de polímeros biocompatíveis, baseadas em quitosana, bem como a
montagem de equipamento capaz de produzi-las, foi o principal objeto deste trabalho. Com este
propósito, buscou-se de início reunir os dispositivos eletrônicos e mecânicos indispensáveis à
prática da eletrofiação e um equipamento básico, de baixo custo, mas funcional foi construído.
Com base na literatura, o ácido acético glacial a 90% em água deionizada foi o solvente utilizado
para preparo das soluções de quitosana. Para viabilizar o processo da produção das nanofibras
pela técnica da eletrofiação utilizaram-se blendas de soluções de quitosana com soluções de
outros polímeros biocompatíveis em vez de soluções de quitosana pura. Assim, blendas de
soluções de quitosana com soluções aquosas do poli(óxido de etileno) - PEO , bem como, com
soluções aquosas de Poli(álcool vinílico) - PVA, em diversas proporções, foram eletrofiadas. O
Poli(óxido de etileno) mostrou superior desempenho, como auxiliar na fiação da quitosana,
permitindo a obtenção de fibras com até 80% de quitosana, e com diâmetros inferiores àqueles
obtidos com as blendas de soluções de quitosana/PVA. A adição de um eletrólito (NaCl) às
soluções blendas de quitosana/PEO proporcionou um processo fácil ininterrupto, sendo assim,
buscou-se um melhor entendimento sobre as propriedades das soluções da quitosana e do PEO
que norteiam comportamentos mais ou menos favoráveis ao processo da eletrofiação,
caracterizando-se essas soluções através de estudos de viscosidade, de medidas de tensão
superficial e de condutividade elétrica. A morfologia das fibras obtidas foi caracterizada por
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e, as propriedades térmicas, das membranas
nanoestruturadas resultantes da eletrofiação das soluções de Quitosana/PEO, foram avaliadas por
análise
termogravimétrica
(TGA)
e
calorimetria
diferencial
exploratória
(DSC).
A
biocompatibilidade das membranas com teor de quitosana mais elevado (80% quitosana/20%
PEO) foi avaliada através de testes de citotoxicidade in vitro, biocompatibilidade in vivo e adesão
e crescimento celular in vitro. Adicionalmente, foram conduzidos experimentos visando avaliar o
desempenho destas mesmas membranas como carreadoras de fármacos sendo que, a incorporação
de nanopartículas de prata (AgNPs), bem como de digluconato de clorexidina apresentaram
resultados promissores.
Palavras-chave: Eletrofiação; nanofibras; membranas biocompatíveis; quitosana, PEO.
ix
ABSTRACT
The development of biocompatible polymer nanofibers based on chitosan and the design and
assembly of equipment capable of producing them were the main objectives of this work. For this
purpose, the basic electronic and mechanical devices were obtained and a low-cost functional
electrospinning setup was built. Based on the literature, glacial acetic acid with concentration of
90% in deionized water was the solvent used to prepare the chitosan solutions. In order to enable
the nanofiber production by electrospinning, blends of chitosan solutions with other
biocompatible polymers were used instead of pure chitosan solutions. Thus, blends of chitosan
solutions with aqueous solutions of poly (ethylene oxide) PEO as well as with aqueous solutions
of poly (vinyl alcohol) PVA, in various proportions, were electrospun. The PEO presented
superior performance as an aid to obtain chitosan fibers, resulting in fibers with up to 80% of
chitosan, and with smaller diameters than those obtained with solutions of blends of chitosan /
PVA. The addition of an electrolyte (NaCl) to the chitosan/PEO solution blends has provided an
easy and uninterrupted process. Thus, to obtain a better understanding about the properties of
chitosan and PEO solutions that lead to more or less favorable behaviors to the electrospinning
process, these solutions were characterized by performing viscosity studies and measurements of
surface tension and electrical conductivity. The morphology of the fibers was evaluated by
scanning electron microscopy (SEM) and the thermal properties of nanostructured membranes
resulting from electrospinning of chitosan/PEO solutions were evaluated by thermogravimetric
analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC).The biocompatibility of the highercontent-chitosan membranes (80%chitosan /20% PEO) was evaluated by tests of in vitro
cytotoxicity, in vivo biocompatibility and in vitro cell adhesion and growth. In addition,
experiments were conducted to evaluate the performance of the same membrane as a carrier of
drugs. In this way, the incorporation of silver nanoparticles (AgNPs) and chlorhexidine
digluconate showed promising results.
Keywords: Electrospinning, nanofibers, biocompatible membranes, chitosan, PEO.
x
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E NOMENCLATURAS
ΔH
Entalpia
Hc
Entalpia de cristalização
ΔHm
Entalpia de fusão
η
Viscosidade
Taxa de cisalhamento, taxa de deformação.
ACS
American Chemical Society
AgNPs
Nanopartículas de prata
ASTM
American Society for Testing and Materials
CA
Acetato de celulose
CAS
Chemical Abstracts Service (uma divisão da American Chemical Society)
Ce
Concentração de entrelaçamento (emaranhamento)
Conc.
Concentração
cP
Centésima parte do Poise (Poise é a unidade da viscosidade dinâmica no
Sistema CGS)
DMF
Dimetilformamida
DMSO
Dimetilsulfóxido
DSC
Calorimetria exploratória diferencial
DTG
Derivada termogravimétrica (primeira derivada da curva de perda de massa)
EDS
Espectroscopia de energia dispersiva
FEG
Do Inglês (Field emission gun)
GD
Grau de desacetilação
GH
Grau de hidrólise
HAc
Ácido acético
HE
Hematoxilina-eosina
xi
kDa
O Dalton (Da) ou kDa é uma unidade (não-SI) permitida para massa
molecular. Um Da. é aproximadamente igual à massa de um próton ou um
nêutron.
kV
Medida de tensão elétrica (1000 Volts)
LMw
Peso molecular ponderal baixo
MEV
Microscopia eletrônica de varredura
MEVA
Microscopia eletrônica de varredura ambiental
MEV-FEG
Microscópio eletrônico de varredura com canhão com emissão por efeito de
campo.
MIC
Concentrações inibitórias mínimas
MMw
Peso molecular ponderal médio
Mw
Peso molecular ponderal / massa molar
mRNA
O mRNA é um dos tipos de RNA (ácido ribonucleico). Os RNA existem na
célula como produtos diretos de genes e apresentam uma estrutura primária
semelhante a do DNA.
nm
Nanômetro (10 –9 metros)
pA
Picoampere (10-12 Ampere)
Pa.s
Pascal- segundo
PA – ACS
Puro para análise, segue as especificações da American Chemical Society
PBS
tampão: fosfato básico salino (62 mM NaCl, 2mM KCl, 0,9 mM CaCl2, 0,5
mM MgCl2 8 mM NaH2PO4, 8mM KH2PO4)
PC
Policarbonato
PCL
Poli--caprolactona
PEG
Poli(etileno glicol)
PEO
poli(óxido de etileno)
PGA
Ácido poli(glicólico)
pH
(Potencial hidrogeniônico) = ─ log [H+]. É o log negativo de base 10 da
concentração molar de íons hidrogênio (H+)
xii
PLLA
Poli-L-ácido lático
PVA
Poli(álcool vinílico)
QUIT/quit
Quitosana
sol.
Solução
Solv.
Solvente
t
t de Student
Tc
Temperatura de cristalização [ºC]
tcal
t calculado
TFA
Ácido trifluoracético
Tg
Temperatura de transição vítrea [ºC]
TGA
Análise termogravimétrica
Tm
Temperatura de fusão cristalina [ºC]
ttab
t tabelado
xiii
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................................................ix
ABSTRACT.....................................................................................................................................x
ABREVIATURAS SÍMBOLOS E NOMENCLATURAS.............................................................xi
LISTA DAS FIGURAS.................................................................................................................xix
LISTA DAS TABELAS..............................................................................................................xxiii
1 – INTRODUÇÃO........................................................................................................................1
2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS...............................................................................................7
2.1 – Introdução.........................................................................................................................7
2.2 – Técnicas de obtenção de nanofibras..................................................................................7
2.2.1 – Métodos de extração e produção de nanofibras naturais ou de celulose........................8
2.2.2 – Eletrofiação....................................................................................................................9
2.3 – Matérias-primas utilizadas na obtenção de nanofibras...................................................13
2.3.1 – Polissacarídeos.............................................................................................................13
2.3.1.1 – Quitosana..................................................................................................................14
2.3.1.1.1 – Atividade antimicrobiana da quitosana..................................................................17
2.3.2 – Poli(óxido de etileno) (PEO)........................................................................................18
2.3.3 – Poli(álcool vinílico) (PVA)..........................................................................................20
xiv
2.4 – Antissépticos...................................................................................................................21
2.4.1 – Clorexidina – Digluconato de clorexidina...................................................................22
2.5 – Parâmetros envolvidos na técnica da eletrofiação..........................................................22
2.5.1 – Propriedades da Solução..............................................................................................23
2.5.1.1 – Solubilidade do polímero..........................................................................................23
2.5.1.2 – Viscosidade da solução.............................................................................................24
2.5.1.3 – Tensão superficial.....................................................................................................25
2.5.1.4 – Volatilidade do Solvente...........................................................................................26
2.5.2 – Voltagem Aplicada/ Diferença de potencial/ Condutividade da solução....................26
2.6 – Levantamento bibliográfico – Eletrofiação.....................................................................27
2.6.1 – Breve histórico.............................................................................................................27
2.6.2 – Literatura recente – Eletrofiação..................................................................................29
3 – MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................33
3.1 – Introdução.......................................................................................................................33
3.2 – Equipamento utilizado neste trabalho.............................................................................33
3.3 – Materiais .........................................................................................................................34
3.4 – Experimental...................................................................................................................35
3.4.1 – Fase exploratória..........................................................................................................35
3.4.2 – Testes Preliminares – continuação da fase exploratória..............................................35
xv
3.4.3 – Blendas de quitosana MMw/PEO................................................................................35
3.4.3.1 – Preparação das soluções e blendas de quitosana MMw/PEO...................................35
3.4.3.2 – Eletrofiação das blendas de Quitosana/PEO.............................................................36
3.4.3.3 – Caracterização das soluções......................................................................................37
3.4.3.4 – Caracterização das membranas eletrofiadas de Quitosana/PEO..............................38
3.4.3.4.1 – Morfologia.............................................................................................................38
3.4.3.4.2 – Propriedades térmicas............................................................................................40
3.4.4 – Blendas de quitosana/poli(álcool vinílico) (PVA).......................................................40
3.4.4.1 – Preparação das soluções............................................................................................42
3.4.4.2 – Preparação e eletrofiação das blendas PVA/quitosana.............................................43
3.4.4.3 – Caracterização morfológica – fibras de PVA/quitosana...........................................43
3.4.5. – Caracterização biológica – Membrana quitosana (80%) / PEO (20%).......................43
3.4.5.1 – Citotoxicidade in vitro pelo método de difusão em Ágar.........................................43
3.4.5.2 – Avaliação da biocompatibilidade in vivo..................................................................44
3.4.5.3 – Estudo do crescimento e adesão celular: membranas 80%QUIT/20%PEO.............47
3.4.6 – Nanocompósitos de quitosana/PEO e nano partículas de Prata (AgNPs)....................49
3.4.6.1 – Preparação e eletrofiação da solução blenda Quitosana/PEO/AgNPs .....................49
3.4.7 – Incorporação de digluconato de clorexidina – membranas de QUIT/PEO..................50
3.4.7.1 – Preparação e eletrofiação da solução PEO/ digluconato de clorexidina...................50
xvi
3.4.7.2 – Confirmação semiquantitativa da presença de cloro / avaliação morfológica da
membrana resultante por MEV/EDS......................................................................51
3.4.7.3 – Ensaios biológicos – Avaliação da atividade antimicrobiana...................................51
4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES.........................................................................................53
4.1 – Fase exploratória: obtenção de nano e submicrofibras...................................................53
4.2 – Blendas de quitosana/PEO..............................................................................................54
4.2.1 – Caracterização das soluções de quitosana MMw e de quitosana/PEO........................54
4.2.2 – Eletrofiação das blendas e obtenção das membranas de quitosana/PEO.....................57
4.2.3 – Caracterização morfológica das membranas de quitosana MMw/PEO.......................61
4.2.4 – Caracterização térmica das membranas de Quitosana/PEO........................................65
4.3 – Blendas de quitosana/poli(álcool vinílico) (PVA).........................................................71
4.3.1 – Fase exploratória: obtenção de sub microfibras de quitosana/PVA............................71
4.3.2 – Blendas de PVA/QUIT - Planejamento fatorial de dois níveis com estudo de cinco
fatores (25)...................................................................................................................73
4.4 – Avaliação da Biocompatibilidade – Membrana 80% quitosana/20% PEO....................77
4.4.1 – Citotoxicidade in vitro.................................................................................................77
4.4.2 – Biocompatibilidade in vivo..........................................................................................79
4.4.3 – Estudo do crescimento e adesão celular: membranas 80%QUIT/20%PEO................83
4.5 – Nanocompósitos de quitosana/PEO e nanopartículas de Prata (AgNPs)........................86
4.6 – Incorporação de digluconato de clorexidina – membranas de QUIT/PEO....................88
xvii
5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS................................93
5.1 – Conclusões......................................................................................................................93
5.2 – Sugestões para trabalhos futuros.....................................................................................95
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................97
APÊNDICE A.............................................................................................................................107
APÊNDICE B – GLOSSÁRIO...................................................................................................116
xviii
LISTA DAS FIGURAS
Figura 2.01:
Esquema simplificado do processo de eletrofiação.
10
Figura 2.02:
Alguns exemplos das configurações que podem ser adquiridas pelo jato
da solução polimérica durante o processo da eletrofiação.
11
Esquema de um processo de eletrofiação, mostrando um envelope de
cone duplo e o disco coletor.
12
Figura 2.04:
Imagens de MEV de nanofibras de PEO em coletor de alumínio.
13
Figura 2.05:
Representação esquemática da fórmula estrutural da celulose.
14
Figura 2.06:
Representações esquemáticas das fórmulas estruturais da celulose quitina
e quitosana.
15
(a) Representação estrutural da fórmula da clorexidina; (b) e (c) duas
representações usuais da fórmula estrutural do digluconato de clorexidina.
21
Conjuntos de equipamentos (setups) utilizados no desenvolvimento e
confecção de membranas e outras geometrias alternativas; (a)
equipamento básico, (b e c) tipos de coletores rotativos; (d) e (e)
equipamento básico e rotativo com bomba de infusão incluída.
33
(a) Tabela gerada pelo software STATISTICA 9 para o planejamento
fatorial de um quarto; (b) tabela gerada pelo mesmo software para o
planejamento fatorial de dois níveis, planejamento completo.
42
a) Espécime da linhagem albina Wistar; b) esquema de manipulação e
aplicação de anestesia intraperitoneal; c) local de incisão para
implantação das amostras no subcutâneo.
45
Curvas de viscosidade para soluções de quitosana e de QUIT/ PEO em
função da taxa de cisalhamento.
56
a) Foto de membrana obtida do processamento da blenda 6D (blenda 6C
com NaCl); b) foto obtida imediatamente após o processamento da blenda
4B (blenda sem NaCl) e em (c) a mesma membrana sendo retirada do
molde.
59
Espécimes obtidos com o uso de dispositivos rotativos, em (a) uma
membrana com 10 cm de diâmetro; em (b) foto, na posição vertical, de
um espécime de geometria tubular e seu diâmetro interno iluminado pela
luz; em (c) e (d) geometrias tubulares de aproximadamente 2mm de
diâmetro x 10 mm de comprimento.
60
Foto das fibras produzidas pela blenda tripla, na presença de NaCl.
60
Figura 2.03:
Figura 2.07:
Figura 3.01:
Figura 3.02:
Figura 3.03:
Figura 4.01:
Figura 4.02:
Figura 4.03:
Figura 4.04:
xix
Figura 4.05:
Imagens de MEV de fibras obtidas pela eletrofiação da blenda 4B
produzidas com o equipamento básico a uma voltagem aplicada de 20 kV
e distância da ponta da agulha à placa coletora de 9 cm; a) com
magnificação de 30.000 vezes; b) a mesma membrana a uma
magnificação de 5.000 vezes.
61
Histogramas representativos da distribuição de diâmetros das fibras
determinados a partir da imagem de duas membranas obtidas no
instrumental básico com a formulação 4B.
62
Imagens de MEV obtidas das fibras produzidas pela eletrofiação da
solução blenda 4B utilizando-se o dispositivo rotativo com 32 mm de
diâmetro a) com magnificação de 20.000 vezes; b) a mesma membrana
com magnificação de 5000 vezes.
63
Histogramas representativos da distribuição de diâmetros das fibras
determinados a partir da imagem de duas membranas obtidas com
utilização do dispositivo rotativo pela eletrofiação da formulação 4B.
63
TGA / DTG curvas obtidas à taxa de 10ºC/min; a) para a quitosana pura
em pó; b) PEO puro e c) para amostra de membrana obtida pela
eletrofiação da blenda 4B.
67
Termogramas de DSC das primeiras corridas de aquecimento para a
quitosana e o PEO puros, em pó, e para amostras das membranas das
blendas 4B e 6C.
68
Curvas de resfriamento de DSC para a quitosana e o PEO puros, em pó, e
para amostras das membranas das blendas 4B e 6C.
69
Termogramas de DSC das segundas corridas de aquecimento para a
quitosana e o PEO puros, em pó, e para amostras das membranas das
blendas 4B e 6C.
69
Imagens de MEV das blendas de PVA/QUIT resultantes da eletrofiação
das blendas que apresentaram condições de processamento na fase
exploratória.
72
Figura 4.14:
Imagens de MEV correspondentes ao planejamento fatorial de um quarto.
74
Figura 4.15:
Imagens de MEV correspondentes ao fatorial completo e as respectivas
identificações geradas pelo STATISTICA para o fatorial de ¼ e para o
fatorial completo, as imagens correspondentes ao fatorial de ¼ estão aqui
identificadas por moldura azul.
75
Fotografia digital das placas de Petri contendo a linhagem celular HEp-2
(tumor de laringe humana): (a) com amostra da membrana
nanoestruturada de quitosana; (b) com controle positivo (látex); (c) com
controle negativo (papel de filtro). A formação de halo em (b) encontra-se
indicada por uma seta.
78
Figura 4.06:
Figura 4.07:
Figura 4.08:
Figura 4.09:
Figura 4.10:
Figura 4.11:
Figura 4.12:
Figura 4.13:
Figura 4.16:
xx
Figura 4.17:
Figura 4.18:
Figura 4.19:
Figura 4.20:
Figura 4.21:
Figura 4.22:
Figura 4.23:
Figura 4.24:
Figura 4.25:
Fotografia digital das placas de Petri contendo a linhagem celular Vero
(células renais de macaco verde africano): (a) com amostra da membrana
78
Fotografia digital das placas de Petri contendo a linhagem celular McCoy
(fibroblastos de camundongos): (a) com amostra da membrana
79
(a) e (b) Amostras retiradas aos sete dias pós-implante com aumentos de
200 e 400 vezes, respectivamente, e coloração Tricrômica. Evidencia-se o
processo inflamatório, com predominante invasão de neutrófilos (setas
finas) e presença de alguns linfócitos (seta mais espessa), ambos os tipos
predominantemente ao redor do implante. No emaranhado azul mais
claro, melhor observado na parte esquerda de (a), são fibras de colágeno,
constituintes do tecido.
81
Figura 4.20: Em (a) observa-se com aumento de 200 vezes e coloração
H.E, a interface formada pela fibrose, separando o tecido adjacente do
material implantado. O material foi degradado, restando somente o tecido
fibroso (setas). Em (b) observa-se, com aumento de 400 vezes e coloração
H.E, o material aos quinze dias pós-implante, sofrendo intensa
degradação. As setas mostram fragmentos da membrana.
82
Número de células viáveis e não viáveis após 24, 48 e 72 hs, em
membrana eletrofiada a partir da blenda 4B. As barras de erros
representam os desvios padrões.
83
Número de células viáveis e não viáveis após 24, 48 e 72 hs, em amostra
de membrana preparada por(casting) a partir da solução blenda 4B. As
barras de erros representam os desvios padrões.
84
Número de células viáveis e não viáveis em controle de poliestireno As
barras de erros representam os desvios padrões.
84
Imagens de MEV das células pré-osteoblasticas da linhagem MC373 após
72 horas de cultivo, à direita na membrana blenda com 80% de quitosana
e 20% de PEO, à esquerda, sobre o controle (vidro).
85
Figura 4.25: (a) Imagem de MEV com magnificação de 10.0000 vezes;
(b) imagem de MEV/FEG com magnificação de 600.000 vezes de fibra
da mesma membrana, produzida a partir de solução blenda de quitosana/
PEO na presença de AgNPs.
86
xxi
Figura 4.26:
Figura 4.27:
Figura 4.28:
Figura 4.29:
Figura 4.30:
Figura 4.31:
a) Imagem obtida por MEV/FEG de AgNPs com magnificação de
500.000x; b) imagem de MEV/FEG de uma fibra isolada, blenda 80 Quit/
20% PEO com incorporação de AgNPs, na qual a presença das AgNPs
pode ser observada.
87
Imagens de MEV da membrana da blenda QUIT/PEO com 33% do
fármaco digluconato de clorexidina, com magnificações: a) 1.000; b)
10.000; c) 20.000 e e) 30.000 vezes.
88
Espectro obtido por EDS de amostra de membrana de Quitosana /PEO
com digluconato de clorexidina incorporado.
89
Halos formados pelos micro-organismos da bactéria Escherichia coli
durante o teste de avaliação antimicrobiana da membrana nanoestruturada
de QUIT/PEO com clorexidina incorporada. ( ) Observa-se também a
formação de halos de inibição para o teste branco.
91
Halos formados pelos micro-organismos da bactéria Escherichia coli
durante o teste de avaliação antimicrobiana da membrana nanoestruturada
de QUIT/PEO com clorexidina incorporada. ( ) Observa-se também a
formação de halos de inibição para o teste branco.
91
Halos formados pelos micro-organismos do fungo Candida albicans
levados à lise durante o teste de avaliação antimicrobiana da membrana
nanoestruturada de QUIT/PEO com clorexidina incorporada. ( )
Observa-se também a formação de halos de inibição para o teste branco.
91
xxii
LISTA DAS TABELAS
Tabela 3.1 –
Soluções de Quitosana
36
Tabela 3.2 –
Preparação das blendas de quitosana/PEO e composição das membranas
37
Tabela 3.3 –
Estudo das condições da eletrofiação das blendas de PVA/QUIT.
41
Tabela 3.4 –
Variáveis examinadas nas lâminas com amostras da interface dos
implantes de quitosana nanoestruturada – subcutâneo do dorso de ratos
(distribuição em ordem alfabética).
47
Tabela 4.1 –
Caracterização das soluções de quitosana e blendas de quitosana/PEO
58
Tabela 4.2 –
Diâmetros médios e desvios padrões das fibras - membranas obtidas das
soluções blendas 4B
64
Tabela 4.3 –
Medidas de densidade e estimativa da porosidade das membranas de
quitosana /PEO
64
Tabela 4.4 –
Dados das análises de DSC e TGA para as blendas de QUIT/PEO e para a
quitosana e o PEO puros, em pó.
70
Tabela 4.5 –
Blendas de PVA/QUIT – Fase exploratória
71
Tabela 4.6 –
Avaliação da ocorrência e grau de aderência do material implantado e
tecidos subjacentes para os Grupos G1, G2 e G3.
80
Tabela 4.7 –
Número médio de células viáveis e não viáveis.
83
Tabela 4.8 –
Medidas dos tamanhos dos halos formados nos ensaios de avaliação da
atividade antimicrobiana da blenda nanoestruturada de quitosana/PEO
com clorexidina incorporada.
90
xxiii
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO
A nanotecnologia é a área da ciência e da tecnologia que lida com o desenvolvimento e
manipulação de sistemas de extensão nanométrica, ou seja, em escalas da ordem de 1 a 10 2 nm
(1nm = 10-9 m), conhecida como nanoescala. Embora a ciência dos átomos e moléculas esteja
bem estabelecida e fundamentada, a nanotecnologia se encontra em sua fase inicial, pois ainda há
muito a ser compreendido sobre os materiais na nanoescala. Devido às propriedades únicas dos
sistemas em nanoescala, as forças magnéticas e gravitacionais que nela atuam, tão importantes e
mensuráveis em outras ciências, agem de forma quase imperceptível (DURÁN et al. 2006).
Assim, esta área complexa e de grande interesse possui enorme potencial para o desenvolvimento
de novas tecnologias, bem como para o aperfeiçoamento das já existentes.
Sendo a nanotecnologia multidisciplinar, atualmente um grande número de cientistas,
pesquisadores de diversas áreas, de muitas instituições governamentais e privadas dedicam seus
esforços a este ramo da ciência. Novas aplicações em nanotecnologia surgem e abrangem áreas
como a agroindústria, a indústria eletrônica, aeroespacial, farmacêutica, médica, química e
petroquímica, dentre outras. Na área dos materiais poliméricos, pesquisas em nanocompósitos
merecem atenção especial, devido ao grande potencial de desenvolvimento de produtos de alto
valor agregado, a partir de matérias-primas fósseis convencionais ou de origem natural, com
aplicações nas áreas médica, farmacêutica, automobilística e outras (GALEMBECK e RIPPEL
2004).
No campo das fibras, naturais, artificiais, ou sintéticas, a nanotecnologia esta
possibilitando a obtenção de fibrilas com diâmetros na nanoescala, cuja elevada razão de aspecto
(diâmetro da ordem de 10 a 100nm) lhes confere grande área superficial e elevado módulo. É
possível se obter dispositivos com diversas morfologias e geometrias, que possibilitam aplicações
nas áreas de filtração, de engenharia de substituição ou de regeneração de tecidos, de
recobrimento de feridas, de liberação controlada de fármacos, de órgãos artificiais e de próteses
vasculares (ZILLA e GREISLER, 1999; UENO et al., 2001; HUANG et al., 2003; DI
MARTINO et al., 2005; MA et al., 2005; SCHINDLER et al., 2005; DVIR et al., 2005;
QUEEM, 2006; WU et al., 2006).
1
Com o avanço da tecnologia e seu domínio pelo homem, novas áreas de aplicação para
nanofibras estão surgindo, incluindo-se a área de compósitos poliméricos e de misturas/blendas
de polímeros sintéticos com naturais para aplicações como, por exemplo: malhas de polipropileno
recobertas com colágeno polianiônico, utilizadas para a reconstrução da parede abdominal
(GOISSIS et al., 2001) dentre outras.
Diversas metodologias vêm sendo aplicadas para o estudo e obtenção de nanofibras,
dentre elas o método da eletrofiação (electrospinning), o qual é considerado o mais versátil para
obtenção de nano ou submicrofibras (ZHOU e GONG, 2008). Uma das razões fundamentais para
o crescente interesse de pesquisadores por nanofibras produzidas por eletrofiação é que as
características morfológicas das mesmas podem ser modificadas através de alterações
convenientes dos parâmetros de processo, adequando-as a uma grande diversidade de aplicações
específicas. Apesar do equipamento básico e do próprio processo de eletrofiação serem
aparentemente simples, as variáveis que envolvem a produção de nanofibras precisam ser
cuidadosamente estabelecidas, pois são estas variáveis que irão adequar os diâmetros médios e a
qualidade superficial das nanofibras desejáveis para cada aplicação.
Dentre as várias opções de fontes existentes para obtenção de nanofibras, pode-se citar
tanto as sintéticas como as naturais. Dentre as sintéticas, destacam-se o poli(óxido de etileno)
(PEO), o poli(álcool vinílico) (PVA), a policaprolactona (PCL) e o policarbonato (PC). Dentre as
naturais, destacam-se a celulose e derivados, o poli-L-ácido lático (PLLA), a quitina e derivados,
como a quitosana, dentre outras.
Quando comparadas às fibras naturais, as de origem sintética tendem a apresentar
propriedades mecânicas superiores, tais como resistência à tração e módulo elástico. Além disso,
são mais fáceis de serem projetadas para aplicações específicas, dispensando também os métodos
de purificação complicados que acompanham as matérias primas naturais (DVIR et al., 2005).
Por outro lado, embora apresentem um desafio maior para a técnica de eletrofiação, as matériasprimas naturais têm propriedades bioativas multifuncionais que lhes conferem um bom
desempenho em sistemas biológicos com aumentada biocompatibilidade (KHOR e LIM, 2003).
Elas apresentam melhor interação com o corpo humano, tornando-se interessantes para novas
aplicações na área médica e em sistemas biológicos.
2
Dentre as fontes naturais podem citar-se as proteínas como o colágeno, e os
polissacarídeos, como a quitina e seus derivados, o ácido hialurônico e o alginato etc. A
quitosana, que é obtida pela desacetilação total ou parcial da quitina, apresenta-se como um
material atrativo para utilização na área médica, dentre outras, devido a sua biodegradabilidade,
ausência de toxicidade, efeito antifúngico, aceleração de cicatrização de ferimentos e estimulação
do sistema imune (SILVA et al., 2006).
No que se refere à eletrofiação da quitosana, diversos estudos têm sido publicados.
OHKAWA et al. (2004) investigaram os efeitos de vários solventes e concentração de quitosana
no processo de eletrofiação e morfologia final das fibras. Os ácidos fórmico, acético, clorídrico
diluído e trifluoracético (TFA) foram testados como solventes, sendo os melhores resultados
obtidos com uma mistura de diclorometano e TFA. Foi também reportado que o número de
defeitos do tipo contas (beads) diminui à medida que a concentração de quitosana aumenta
(JAYAKUMAR et al., 2010). HAIDER e PARK, (2009), utilizando TFA como solvente,
desenvolveram membranas de nanofibras de quitosana eletrofiadas as quais mostraram alta
afinidade para adsorção de íons metálicos em soluções aquosas. GENG et al. (2005) relataram a
obtenção de fibras, por eletrofiação, de quitosana de peso molecular médio e grau de
desacetilação de 54%, usando como solvente altas concentrações de ácido acético em solução
aquosa. Blendas de quitosana com grau de desacetilação em torno de 80%, preparadas com
polímeros sintéticos solúveis em água e biocompatíveis, têm sido eletrofiadas com graus variados
de sucesso, utilizando-se como solvente da quitosana soluções aquosas de ácido acético. O Poli
(óxido de etileno) (PEO) é um polímero sintético, bioabsorvível e biocompatível que tem sido
usado em curativos e na reparação tecidual da cartilagem (JAYAKUMAR et al., 2010). Suas
blendas com quitosana têm sido eletrofiadas satisfatoriamente.
Embora a literatura registre, em nível mundial, inúmeros estudos onde a quitosana foi
estudada como matéria-prima na obtenção de nanofibras, no Brasil não encontramos registros de
pesquisadores que tenham estudado a mesma como matéria-prima na obtenção de nanofibras pelo
processo de eletrofiação. Assim, este trabalho, primeiro no grupo, teve como objetivo principal
o estudo e o desenvolvimento de processo de obtenção de nanofibras por eletrofiação,
utilizando como matérias-primas a quitosana e suas blendas, bem como a caracterização
3
das mesmas, visando contribuir para o aproveitamento deste polímero natural abundante e
renovável nas áreas médica e farmacológica.
Objetivos específicos:

Projetar e construir equipamento constituído dos elementos fundamentais para a prática da
eletrofiação.

Testar, em fase exploratória, soluções puras de quitosana e blendas das mesmas com
outros polímeros bioabsorvíveis, para serem consideradas na obtenção de nanofibras mais
homogêneas e livres de defeitos.

Caracterização das soluções e soluções blendas através de estudo reológico, medidas de
tensão superficial e de condutividade elétrica para melhor compreensão dos parâmetros
que favorecem a eletrofiação.

Caracterização morfológica das membranas obtidas por Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV) e intrusão líquida; e caracterização térmica por TGA e DSC.

Avaliação da citotoxicidade in vitro e biocompatibilidade in vivo e in vitro das
membranas obtidas.

Avaliação das membranas nanoestruturadas como carreadoras de AgNPs e clorexidina.
Esta tese de doutorado está dividida em seis capítulos sendo que nos dois primeiros é
apresentada a fundamentação teórica que deu respaldo ao desenvolvimento das diversas etapas
desta pesquisa. No Capítulo 3 estão apresentados o instrumental, os materiais e as metodologias
utilizadas na parte experimental deste trabalho. No Capítulo 4 os resultados obtidos em todas as
etapas do presente estudo estão apresentados e discutidos. Entretanto, devido ao caráter
interdisciplinar do mesmo, várias informações referentes a testes biológicos, in vitro e in vivo,
tanto pertencentes ao capítulo 3 como ao capítulo 4, são apresentadas de forma sucinta no corpo
deste estudo, por terem sido realizados sob responsabilidade de pesquisadores pertencentes às
áreas de medicina veterinária e odontológica. As conclusões à que se pôde chegar em decorrência
desta pesquisa bem como sugestões para futuros trabalhos estão apresentadas no Capítulo 5.
Finalizando, no Capítulo 6 estão apresentadas as referências bibliográficas dos trabalhos que
possibilitaram a concretização da pesquisa que resultou na presente Tese de Doutorado.
4
Acreditamos que o presente trabalho trouxe colaboração considerável não só
confirmando ou ponderando sobre os fundamentos em que se apoiou para ser elaborado, mas
principalmente, apresentando resultados experimentais que permitem servir de base para
concretização de aplicações práticas, aproximando-se um pouco mais das metas almejadas.
5
6
CAPÍTULO 2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS
2.1 – Introdução
Uma nanofibra é uma fibra com dimensões manométricas e se além de seu diâmetro
manométrico, ela contiver partículas dispersas poderá também ser considerada um
nanocompósito. Várias metodologias de obtenção de nanofibras têm sido citadas na literatura,
tais como: Estiramento (drawing), síntese template, separação de fases, auto-organização (self–
assembly) e eletrofiação (RAMAKRISHNA et al., 2005). No que se refere às fibras naturais e à
celulose advinda da madeira, duas metodologias que têm sido utilizadas com sucesso para separar
as nanofibrilas através da quebra das ligações de hidrogênio, que unem as moléculas de celulose,
podem ser destacadas: o método chamado polpa ou hidrólise (pulping) e o método químicomecânico (BHATNAGAR e SAIN, 2005).
Entre as técnicas citadas acima, o método de obtenção de nanofibras por eletrofiação é
apontado como um dos mais promissores sendo reconhecido, inclusive, como um método capaz
de produzir filamentos contínuos (ZHOU e GONG, 2008). A seguir, são apresentados alguns
comentários breves sobre estas técnicas de obtenção de nanofibras. As técnicas utilizadas para
extração e produção de nanofibras de celulose e a técnica da eletrofiação, em função de sua
importância devida à potencialidade do emprego das mesmas para obtenção de nanofibras em
escala industrial, são discutidas separadamente, nas seções 2.2.1 e 2.2.2 respectivamente.
2.2 – Técnicas de obtenção de nanofibras (RAMAKRISHNA et al., 2005)
Estiramento (Drawing): Esta técnica é uma técnica laboratorial, sendo utilizada apenas
em escala experimental; foi utilizada por ONDARCUHU e JOACHIM (1998). A mesma consiste
em mergulhar a ponta de uma micropipeta em uma gota de uma solução polimérica e mover
(puxar) a mesma produzindo, com a rápida evaporação do solvente, um nano ou micro filamento.
Síntese (template): Esta técnica, também considerada como laboratorial, consiste em
forçar, por meio de pressão, a passagem de uma solução polimérica através de uma membrana de
um óxido metálico. Este processo pode ser considerado um processo de extrusão e os diâmetros
7
das fibras produzidas são determinados pelos poros da membrana (FENG et al., 2002);
(RAMAKRISHNA et al, (2005).
Separação de Fases: Esta metodologia, descrita e utilizada por MA e ZHANG (1999), é
um pouco mais complexa que as anteriores, pode ser subdividida em algumas etapas principais,
ou seja, preparação da solução polimérica em solvente adequado, gelatinização, extração do
solvente, congelamento e secagem (remoção da água) e finalmente recongelamento.
Auto-organização
(Self–assembly):
Nesta
técnica,
utilizada
por
inúmeros
pesquisadores: LIU et al. (1996), LIU et al. (1999); YAN et al. (2001), HARTGERINK et al.
(2001) e MOEL et al. (2001), os átomos ou moléculas organizam-se de forma autônoma por
meio de interações físicas ou químicas construindo assim nanoestruturas ordenadas. Uma
molécula pequena ou uma micela arranja-se de uma maneira concêntrica, tal que ligações podem
se formar entre essas moléculas pequenas auto-organizadas concentricamente. O mecanismo
principal para uma auto-organização genérica é formado pelas forças intermoleculares as quais
mantêm juntas as pequenas unidades.
2.2.1 – Métodos de extração e produção de nanofibras naturais ou de celulose
Processo de polpa (Pulping process ou opening process): Consiste na extração das
nanofibras da celulose ou de fibras naturais através um tratamento térmico (temperatura acima da
Tg da lignina) seguido de moagem em moinho de bolas, passando por tratamento alcalino para
remoção da lignina, e subsequente trituração de alto impacto para liberar as fibrilas; finalizando,
um tratamento mecânico de alto cisalhamento é empregado para completar a desfibrilação.
Método químico-mecânico: Este processo envolve um pré-tratamento onde as fibras ou
celulose são expandidas por umectação (swelling) e em seguida submetidas a um tratamento
ácido para remoção da pectina e da hemicelulose, seguido de tratamento alcalino (eliminação de
lignina) sendo o processo completado através da desfibrilação por tratamento mecânico de alto
impacto e alto cisalhamento (BHATNAGAR e SAIN, 2005)
8
2.2.2 – Eletrofiação
O método da eletrofiação possui vasta gama de aplicações que permitem a obtenção de
nano ou sub microfibras oriundas de diversas fontes. O mecanismo de produção das nanofibras
por esta técnica se deve às forças eletrostáticas que atuam, na maioria das vezes, em uma solução
polimérica quando ela é submetida a um campo elétrico. O processo é iniciado quando um campo
elétrico (gerado por uma fonte de alta voltagem) entre a agulha da seringa que sustenta a solução
polimérica, e uma base coletora (geralmente aterrada), é aplicado a esta solução polimérica
(RAMAKRISHNA et al, (2005).
Embora aparentemente simples, o processo requer o controle rigoroso de variáveis que
são essenciais para a obtenção de fibras nanométricas com uma boa uniformidade. Na
eletrofiação, o processo é geralmente realizado a partir de uma solução polimérica. Assim,
parâmetros tais como tipo e concentração de polímero, tipo e concentração de solvente,
viscosidade, peso molecular, condutividade elétrica e tensão superficial devem ser devidamente
estabelecidos para o sucesso da operação. Como complemento para esse sucesso, os parâmetros
de processo como força do campo elétrico, vazão, distância entre o capilar e a placa coletora,
forma e movimento do coletor, temperatura ambiente e umidade devem igualmente ser estudados
cuidadosamente (FRENOT e CHRONAKIS, 2003; FRIDRIKH et al., 2003; HUANG et al.,
2003; MILLER et al., 2004; LI et al., 2005; QUEEN, 2006 e ZHOU e GONG, 2008).
Com relação à morfologia da fibra obtida, a técnica de eletrofiação oferece a
possibilidade de se produzir fibras nanométricas com altas razões de aspecto e tamanho de poros
pequenos, proporcionando ainda a possibilidade de se modificar e adequar os parâmetros de
processo para aplicações e necessidades específicas (HUANG et al., 2003 e MILLER et al.,
2004).
Em sua forma mais simples, o processo de eletrofiação, cujo esquema simplificado pode
ser visto na figura 2.01, requer uma fonte de alta tensão na faixa de kV, dois eletrodos, um capilar
para ejeção do jato e um coletor adequado para recolher as fibras. O processo consiste na
aceleração de uma solução polimérica, inicialmente contida num capilar (ex: agulha de uma
seringa), pela presença de um campo elétrico externo.
9
Figura 2.01: Esquema simplificado do processo de eletrofiação
(Fonte: Adaptado de RAMAKRISHNA et al. 2005)
Uma pequena gota exibindo a forma de um cone é formada na ponta do capilar (essa
gotícula é conhecida como cone de Taylor). No momento em que o campo elétrico atinge a
intensidade necessária para superar a tensão superficial da gotícula, um jato de solução
(polimérica) eletrificado é formado sendo acelerado na direção de um segundo eletrodo. Este
segundo eletrodo é aterrado e atua como coletor das fibras que se formam. Devido à evaporação
do solvente, enquanto o jato está sendo acelerado, as cargas elétricas condensam-se provocando a
instabilidade crescente do mesmo, que geralmente adquire uma forma espiralada, embora várias
outras configurações tenham também sido documentadas. A figura 2.02 mostra exemplos de
configurações que podem ser adquiridas pelo jato de uma solução polimérica, documentadas por
RENEKER e YARIN (2008).
10
Figura 2.02: Alguns exemplos das configurações que podem ser adquiridas pelo jato da solução
polimérica durante o processo da eletrofiação (fonte: RENEKER e YARIN, 2008).
Diversos tipos de coletores têm sido desenvolvidos; eles podem ser rotativos ou
estacionários, de forma plana, cilíndrica, ou em forma de disco. As figuras 2.03 e 2.04 mostram
dois diferentes tipos de coletores.
11
Figura 2.03: Esquema de um processo de eletrofiação, mostrando um envelope de cone duplo e o
disco coletor.
(fonte: Yarin e Zussman, 2004)
Figura 2.04: Imagens de MEV de nanofibras de PEO em coletor de alumínio.
(fonte: Yarin e Zussman, 2004)
12
2.3 – Matérias-primas utilizadas na obtenção de nanofibras
Nanofibras vêm sendo obtidas de inúmeras fontes tanto de origem sintética, extinguível
ou renovável, assim como de polímeros naturais como polissacarídeos e proteínas.
Dentre os inúmeros materiais poliméricos sintéticos não biodegradáveis que têm sido
eletrofiados com sucesso para inúmeras aplicações, o poli(óxido de etileno) (PEO) e poli(álcool
vinílico) (PVA) vêm merecendo grande destaque, principalmente no que se refere à formação de
blendas para obter nano ou microfibras com potencialidade de utilização em diversas áreas,
principalmente nas médicas. Entre os materiais poliméricos biodegradáveis de origem sintética,
os poliésteres alifáticos, em particular, têm despertado interesse especial, pois além da
biodegradabilidade, possuem também caráter biocompatível. Neste grupo, o poli-L-ácido lático
(PLLA), a poli--caprolactona (PCL), e o ácido poli(glicólico) (PGA), este último, geralmente
utilizado em blendas com os dois primeiros, vêm encontrando relevante aplicação nas áreas
biomédicas.
No grupo dos polímeros naturais, devem ser citadas como fontes de obtenção de nanofibras ou
microfibras, algumas proteínas que têm sido eletrofiadas tais como o colágeno, a gelatina, e a
fibroína da seda. Os polissacarídeos, entretanto, são os de maior ocorrência na natureza e é deles,
em especial da quitosana (obtida da quitina) que trata este trabalho.
2.3.1 - Polissacarídeos
Polissacarídeos, ou glicanos, são macromoléculas formadas pela união de muitos
monossacarídeos que por sua vez originam-se da hidrólise de carboidratos. Nos organismos, a
quase totalidade dos polissacarídeos é classificada em dois grupos: polissacarídeos de reserva
energética e os polissacarídeos estruturais. A celulose e a quitina são os mais abundantes dos
polissacarídeos estruturais que ocorrem na natureza.
A celulose, cujo monômero é a glicose, é um polímero de cadeia longa de peso
molecular variável, com fórmula (C6H1005)n, e um valor típico de n entre 300 e 700 podendo,
entretanto, extrapolar estes valores. Ela tem sido usada há décadas na indústria para fabricação do
rayon de viscose pelo processo de fiação por via úmida. A fórmula estrutural da celulose pode ser
vista na figura 2.05.
13
Figura 2.05: Representação esquemática da fórmula estrutural da celulose.
(Fonte: Adaptado de KLEMM et al. 2005)
As paredes celulares das plantas verdes, bem como das plantas vasculares, dos musgos e
das algas verdes são essencialmente formadas por microfibrilas de celulose.
Micro e nanofibras podem ser extraídas da celulose por métodos químico, mecânicos
acompanhados ou não de tratamentos térmicos; outra alternativa, é modificar a estrutura da
celulose por reação com o grupo hidroxila ou por degradação da cadeia da mesma. O acetato de
celulose (CA) pode ser utilizado para obtenção de micro ou nanofibras pelo método da
eletrofiação.
2.3.1.1 – Quitosana
A quitosana é um polissacarídeo linear obtido industrialmente pela desacetilação
alcalina total ou parcial da quitina sendo a última encontrada no exoesqueleto de crustáceos como
camarão, caranguejo, lagosta etc. A estrutura química da quitina é muito semelhante a da
celulose, a diferença estrutural entre as duas se deve aos grupos hidroxila localizados na posição
2, que na quitina são substituídos por grupos acetamino. Depois da celulose, a quitina é o
polímero de ocorrência natural mais abundante na natureza (a estrutura química da celulose,
quitina e quitosana estão esquematizadas na figura 2.06).
A unidade monomérica predominante na quitina é a β-(1-4)-N-acetil-D-glucosamina;
após a desacetilização, a mesma dá origem à D-glucosamina que é a unidade monomérica
predominante na quitosana. Quitina e quitosana são, portanto, dois copolímeros de origem natural
14
e renovável, biocompatíveis, biodegradáveis e atóxicos, ambos constituídos de proporções
variáveis, distribuídas aleatoriamente, das unidades monoméricas β-(1-4)- N-acetil-Dglucosamina e da D-glucosamina, diferindo apenas pela predominância de um ou outro tipo de
unidade monomérica. Assim, vários tipos de quitosana com diferentes propriedades, podem ser
obtidos de acordo com o grau de desacetilação médio (GD) atingido durante a reação de
desacetilação da quitina. O peso molecular médio é outra característica afetada por este mesmo
processo. Via de regra, a obtenção de alto GD envolve a degradação da cadeia polimérica, por
estas razões, quitosanas apresentando propriedades físico-químicas variáveis, tais como
viscosidade e solubilidade, estão disponíveis comercialmente (KUMAR, 2000).
Fórmula estrutural
Denominação
Figura 2.06: Representações esquemáticas das fórmulas estruturais da celulose, quitina e
quitosana.
Apesar da ocorrência abundante, inclusive no Brasil, e de seu alto potencial de
utilização, só em décadas recentes a quitosana vem merecendo o crescente interesse dos
pesquisadores. Alguns fatores contribuíram para desencorajar sua utilização e retardar a pesquisa
15
básica, como por exemplo, a sua não termoplasticidade associada à sua insolubilidade em
solventes orgânicos comuns podem ser citados (LIU et al., 2004).
As propriedades da quitosana são profundamente afetadas pelas condições nas quais ela
é processada. Os seus grupos amina livres cujo teor varia, como visto acima, de acordo com o seu
grau de desacetilação, conferem-lhe carga positiva líquida e, junto com os grupos hidroxilas
impõem uma alta reatividade ao polímero. Quando positivamente carregadas, as cadeias da
quitosana interagem eletrostaticamente com moléculas negativamente carregadas. (SILVA et al.
2006).
Devido sua biodegradabilidade, ausência de toxicidade, efeito antifúngico, aceleração de
cicatrização de ferimentos e estimulação do sistema imune, a quitosana apresenta-se como um
material atrativo para utilização na área médica. Por razões semelhantes, também na agricultura,
a quitosana está despertando alto interesse, como por exemplo, no recobrimento de folhas e
sementes, como fertilizante ou carreadora de fertilizantes, sem agredir o meio ambiente por se
tratar de um material atóxico (KUMAR, 2000; SILVA et al. 2006). Tem sido relatado aumento
da eficiência de plantações pela melhora na germinação, no enraizamento, no crescimento de
folhas, no rendimento das sementes e na retenção de umidade do solo, além de reduzir a
ocorrência de doenças e infecções fúngicas na plantação. Como quelante, a quitosana pode ser
empregada, por exemplo, no tratamento de água e efluentes contaminados com íons metálicos
como cobre, chumbo, mercúrio e urânio. Para citar mais uma aplicação importante da quitosana,
constata-se que na indústria de alimentos ela está sendo muito utilizada para a remoção de
corantes e gorduras e para a preservação de alimentos, como agente antibacteriano e antifúngico,
durante seu período de estocagem (LI et. al, 1992; LI et. al., 1999; HUDSON e JENKINS, 2001;
FRIDRIKH et al., 2003).
Fibras de quitosana têm sido preparadas por diversos pesquisadores utilizando como
solventes de fiação soluções aquosas de ácido acético ou soluções aquosas de ácido acético/
polietileno glicol e, como sistemas de coagulação, soluções aquosas de NaOH. Solução aquosa de
NaOH–40%/metanol ou NaOH-NaSO4, bem como solução aquosa de CuSO4-amonia
concentrada foram ainda utilizadas como sistemas de coagulação (TOKURA et al., 1987;
AGBOH e QIN, 1997; HIRANO et al., 1999; TUZLAKOGLU et al., 2004). O desenvolvimento
de novos solventes de fiação e de coagulação, bem como de novas técnicas são ainda importantes
16
para a preparação de fibras de quitosana de alta qualidade (HIRANO et al., 1999 e
TUZLAKOGLU et al, 2004).
Pesquisas reportadas na literatura, referentes ao processo de eletrofiação de quitosana
(DUAN et al., 2004; JIANG et al., 2004; MIN et al., 2004; OHKAWA, et al, 2004; PARK et al.,
2004; SPASOVA et al, 2004), BHATTARAI et al., 2005; GENG et al., 2005; SUBRAMANIAN
et al., 2005; LI e HSIEH, 2006), apontam como principais desafios da aplicação desta técnica a
alta viscosidade de suas soluções e a difícil solubilização deste polímero em solventes orgânicos
comuns (LI e HSIEH, 2006). Como consequência, o trabalho reportado que obteve maior êxito,
na eletrofiação de soluções de quitosana pura, utilizou uma solução de ácido acético com apenas
7% do biopolímero. Recentemente têm sido reportados trabalhos que alcançaram graus variados
de sucesso utilizando blendas de quitosana em solução (JIANG et al., 2004; SPASOVA et al.,
2004 e BHATTARAI et al, 2005).
2.3.1.1.1 – Atividade antimicrobiana da quitosana
O interesse na aplicação e pesquisa de quitosana tem crescido exponencialmente, nas
últimas décadas, em diversos setores como já mencionado. Fatores como abundância, derivação
de fontes renováveis, utilização de resíduos (carapaças de camarão e lagosta) e biodegrabilidade
bem como o avanço tecnológico e, em particular, na indústria farmacêutica e na biomedicina,
fatores de biocompatibilidade e especialmente as suas características antimicrobianas, justificam
este crescente interesse acadêmico e industrial (SILVA et. al., 2006).
A atividade antimicrobiana de quitosana é uma importante característica deste
biopolímero que tem atraído a atenção de muitos pesquisadores (KUMAR, 2000). No entanto,
embora a atividade antimicrobiana desse polímero esteja bem documentada e provada, os
mecanismos de ação são apenas vagamente definidos (RAAFAT et al., 2008). No início, foi
aceito que as propriedades antimicrobianas da quitosana eram devidas aos seus grupos aminos,
que seriam protonados quando em contato com o ambiente fisiológico, sendo capazes de se
ligarem com grupos aniônicos de micro-organismos. Isto inibiria o seu crescimento devido à
aglutinação das células.
Nesses primeiros estudos foi geralmente assumido que a quitosana atuava como um
agente bactericida ou bacteriostático, ou seja, matava ou impedia o crescimento de bactérias
17
respectivamente, não propondo, entretanto, distinção entre as duas atividades (GOY et al., 2009).
A literatura recente, no entanto, tende a considerar o efeito da quitosana como uma ação
bacteriostática (ou seja, impede a fissão binária das células). O mecanismo exato, porém,
continua a ser objeto de estudo, mas três modelos foram propostos (GOY et al., 2009). No
primeiro, a interação ocorre através dos grupos NH3+ da quitosana e da membrana celular do
micro-organismo, promovendo mudanças na permeabilidade da parede da célula causando
desequilíbrio osmótico; no segundo, pelo mRNA inibindo a síntese de proteínas através da
penetração da quitosana nos núcleos dos microorganismos e, finalmente no terceiro, formando
uma barreira externa, no qual a quitosana atua como agente quelante de metais, causando a
supressão de nutrientes essenciais para o crescimento microbiano. Aceita-se que todos esses
fenômenos podem ocorrer simultaneamente, mas em intensidade variada. RAAFAT et al. (2008)
argumentam que a ação da quitosana poderia ocorrer através de uma série de eventos, de natureza
bacteriostática, que uma vez acionada, acabaria levando à morte da bactéria, uma vez que o
tempo de vida da mesma é de curta duração e seria impedida de proliferar. Esta eficácia, no
entanto, varia de acordo com o micro-organismo alvo. GOY et al. (2009), em artigo de revisão,
descrevem em uma tabela as concentrações inibitórias mínimas de quitosana (MIC) para uma
variedade de micro-organismos, incluindo várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas,
bem como vários tipos de fungos. A influência do peso molecular médio da quitosana e de seu
grau de desacetilação também tem sido estudada por muitos pesquisadores (GOY et al., 2009).
2.3.2 – Poli(óxido de etileno) – PEO
O poli(óxido de etileno), (H2C-CH2O)n, é um dos polímeros sintéticos solúveis em
água mais extensivamente estudados não apenas pela sua elevada gama de aplicações, mas
também pelo ponto de vista da compreensão fundamental do comportamento das soluções
poliméricas (DEVANAND e SELSER, 1990; HAKEM e LAL, 2002 e, MOHAPATRA, 2008).
Além de sua solubilidade em água o PEO é também solúvel em vários solventes orgânicos como
a acetonitrila, o diclorometano e o tetrahidrofurano entre outros (GRAY, 1991)
O PEO é produzido a partir do óxido de etileno, também conhecido por óxido de eteno
(C2H4O), através do processo de polimerização aniônica, catiônica, ou por mecanismo de
coordenação nucleofílica via abertura de anel do monômero de óxido de eteno. As
18
polimerizações catiônicas e aniônicas produzem polímeros com baixa massa molar, PEO com
massa molar igual ou maior que 105g/mol é melhor sintetizado por coordenação nucleofílica
(ODIAN, 1981; SILVA, 1995).
O óxido de etileno (monômero) é um poderoso esterilizante com ação bactericida,
fungicida, virucida e esporicida (atua interferindo na síntese proteica do agente contaminante),
sendo largamente utilizado no setor médico e farmacêutico para esterilizar uma enorme variedade
de produtos confeccionados a base de plásticos, papéis, inclusive papel celofane, e outros
materiais que não possam ser expostos ao calor não resistindo, portanto, ao aquecimento por uso
de vapor.
O PEO é também um dos polímeros mais estudados como eletrólito polimérico. Por sua
vez, define-se eletrólito polimérico como um polímero ionicamente condutor, contendo centros
iônicos em sua estrutura monomérica. Eletrólitos poliméricos são formados pela dispersão de sal,
em nível molecular, em polímeros de alto peso molecular.
O PEO apresenta propriedades tais como, ponto de fusão relativamente alto, boa
integridade estrutural, baixa temperatura de transição vítrea (Tg) que viabiliza o transporte de
íons à temperatura ambiente. Estas propriedades são de grande interesse devido a aplicações
tecnológicas, como eletrólitos sólidos em eletroquímica. Nesta classe de materiais, o principal
problema apontado por JANUÁRIO (2004) é o fato de o PEO ser um polímero semicristalino,
que ao ser utilizado no estado sólido atrapalharia a condução de íons.
No presente trabalho, que focou a eletrofiação da quitosana, o PEO foi utilizado em
solução, onde atuou no sentido de aumentar a condutividade e ao mesmo tempo quebrar/atenuar
as fortes interações infra e intermoleculares das macromoléculas da quitosana, bem como a
tendência da mesma à formação de gel na presença de água, agindo assim no sentido de diminuir
a viscosidade destes sistemas.
SILVA e LOH (2000) trabalhando com objetivos opostos aos do presente trabalho
(formar sistema bifásicos com vista à utilização na técnica de partição/purificação de materiais
biológicos), investigaram a miscibilidade de dois polímeros, o poli (óxido de etileno) e o dextran,
com ou sem a adição de eletrólitos (sais). Os sais foram selecionados pelas suas diferentes
propensões à indução de formação dos sistemas aquosos bifásicos. Estes pesquisadores
19
constataram que para induzir estes processos à separação de fases, é necessária uma menor
quantidade de Na2SO4 do que de Li2SO4 e que o NaCl é incapaz de induzir o processo à separação
de fases. Estudos objetivando o entendimento das razões que levam a formação de sistemas
aquosos de duas fases são relativamente poucos. Estes estudos são, entretanto, fundamentais na
concepção de sistemas para uma determinada finalidade específica (SILVA e LOH, 2000).
Alguns trabalhos que estudaram blendas de Poli(óxido de etileno) e quitosana YLMAZ et al.
(2003) e RAKKAPAO et al. (2011) apontaram estes sistemas como miscíveis. KLOSSNER et al.
(2008), todavia, trabalhando com eletrofiação, relataram a instabilidade das blendas
(PEO/quitosana) após 24 h de preparação; ainda, estes pesquisadores constataram que a adição de
NaCl prorrogava a estabilidade das blendas para aproximadamente uma semana.
2.3.3 - Poli(álcool vinílico) – PVA
O poli(álcool vinílico), é um polímero sintético, solúvel em água, semicristalino, com
ponto de fusão e transição vítrea definidos, respectivamente 230ºC e 80ºC, produzido a partir da
polimerização do acetato de vinila seguida da reação de hidrólise do poli(acetato de vinila). O
grau de hidrólise indica o percentual de poli(acetato de vinila) convertido a poli (álcool vinílico)
no copolímero final e, associado ao grau de polimerização, confere ao mesmo um gradiente de
propriedades que proporciona uma ampla gama de aplicações. Entre os polímeros sintéticos
solúveis em água o PVA é o mais produzido industrialmente e se destaca por apresentar boas
propriedades mecânicas e interfaciais (ARANHA e LUCAS, 2001; LIN et al., 2006; COSTA Jr.
e MANSUR, 2008). O PVA é um excelente adesivo encontrando ampla aplicação na fabricação
de colas, ligantes, tintas, filmes e estabilizantes de emulsões para diversos segmentos como a
indústria papeleira e têxtil. Este polímero é também utilizado na construção civil (ex. massa
corrida e cerâmicas), bem como em produtos escolares, artesanato etc.
O PVA possui excelentes propriedades de barreira e resistência aos solventes químicos e
graxas, sendo solúvel em solventes de alta polaridade e hidrófilos. Além da água, o
dimetilsulfóxido (DMSO), a dimetilformamida (DMF), a acetamida e glicóis são solventes deste
polímero, sendo o mesmo usado predominantemente em solução tendo a água como solvente. O
grau de hidrólise interfere na solubilidade do PVA; quando altamente hidrolisado, há formação
20
de pontes de hidrogênio (intra- e intermoleculares) que dificultam a solubilidade a frio
(ARANHA e LUCAS, 2001).
O PVA é um polímero biocompatível, porém, a baixa resistência à água e a baixa
compatibilidade sanguínea restringem seu uso em determinadas aplicações médicas (LIN et al.,
2005). Recentemente o PVA tem sido utilizado como carreador de medicamentos e outras
aplicações biomédicas, devido às suas propriedades de degradabilidade e não toxidez (LLANOS
e SEFTON, 1993; LIN et al., 2005).
2.4 – Antissépticos
A palavra séptico vem do grego septikós e significa pútrido (que faz apodrecer), ou seja,
contaminação por micro-organismos que é o passo inicial para septicemia; antisséptico significa,
por tanto, contra infecção e refere-se a tudo que inibe, degrada, ou evita a proliferação de microorganismos. O uso de antissépticos iniciou-se em 1847 e a clorexidina, um tipo de antisséptico,
foi sintetizada em 1940 e comercializada a partir de 1954 (FIORENTINO et al., 2010). Em 1983,
a clorexidina passou a ser um produto de primeira escolha, após ter sido reconhecida como
essencial pelo WHO (World Health Organization) que é o órgão máximo de saúde internacional
ligado a ONU (Organização das Nações Unidas).
b
a
Clorexidina
número CAS 55-56-1
c
Digluconato de clorexidina: C22H30Cl2N10.2C6H12O7
Peso molecular:
897,8 g/mol
Figura 2.07: (a) Representação estrutural da fórmula da clorexidina; (b) e (c) duas representações
usuais da fórmula estrutural do digluconato de clorexidina.
21
2.4.1 – Clorexidina – Digluconato de clorexidina
A clorexidina, um composto químico catiônico, com molécula simétrica, conhecido
como l, 6 bis 4-clorofenil-biguanidohexano (fig. 2.07a), é um antisséptico pertencente ao grupo
dos biguanídicos largamente utilizado na medicina tradicional, odontológica e veterinária com
ação sobre bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus. Atua sobre a membrana
celular dos micro-organismos, desestruturando a função osmótica da mesma causando perda de
material intracelular. A clorexidina é utilizada em seguimentos como produção de aves, suínos,
leite alimentício, abatedouros e frigoríficos, usinas de açúcar e álcool, fabricação de rações
animais e produtos veterinários, farmacêuticos, cosméticos, hospitalares e odontológicos, bem
como no tratamento de águas e limpeza de ar acondicionado. A clorexidina pode apresentar-se na
forma de diversos sais, como acetato, cloridrato e digluconato, sendo o último mais solúvel em
água e em pH fisiológico. (THOMAS et al., 2000; BAMBACE et al., 2003; FIORENTINO et al.,
2010).
2.5 – Parâmetros envolvidos na técnica da eletrofiação
Os princípios da técnica da eletrofiação são em grande parte os mesmos envolvidos nas
técnicas de fiação tradicionais. Esta técnica aplica princípios da fiação por fusão, da fiação em via
úmida, e da fiação por via seca. Nestas técnicas convencionais, o polímero fundido ou uma
solução polimérica é forçado(a) a passar através de uma matriz. Porém, diferentemente destas
técnicas de fiação tradicionais, onde forças mecânicas externas direcionam e estiram o polímero
para auxiliar na formação do fio, a eletrofiação faz uso de cargas elétricas e de alta voltagem. Em
eletrofiação, uma voltagem é aplicada no polímero fluido (fundido ou em solução) e quando esta
voltagem atinge um valor crítico, um jato do polímero irá irromper da gota a qual formou uma
espécie de cone (conhecido como cone de Taylor). O jato de polímero fluido irá, então, projetarse na direção de um potencial mais baixo que na maioria dos casos é um coletor aterrado.
Apesar da eletrofiação ser reconhecida como um processo simples, que requer
equipamentos comuns de laboratório, os princípios científicos envolvidos que lhe dão
sustentação, não são simples. Eletrostática, reologia do polímero fundido ou da solução
polimérica, propriedades da solução polimérica, taxa de evaporação do solvente, tensão
superficial e condutividade elétrica da solução são parâmetros fundamentais que estão sempre
22
influenciando e interagindo entre si durante o processo de eletrofiação (RAMAKRISHNA et al,
2005).
O domínio destes parâmetros, e da ciência básica que envolve estes materiais, é o
primeiro requisito para se conduzir adequadamente este processo.
2.5.1 – Propriedades da solução
Embora a técnica da eletrofiação possa ser aplicada em polímeros fundidos, devido a
fatores técnicos inerentes a esta técnica, o uso de soluções poliméricas tem sido predominante. As
propriedades das soluções poliméricas desempenham, portanto, papel de altíssima relevância não
só no processo de eletrofiação em si, mas também na morfologia das fibras obtidas e, em
consequência, nas propriedades das mesmas.
A escolha de um solvente capaz de dissolver o polímero, e ao mesmo tempo apresentar as
características necessárias de utilização em eletrofiação, é o primeiro passo para o sucesso na
aplicação da técnica em discussão.
2.5.1.1 – Solubilidade do Polímero
Um polímero sintético (termoplástico) é mais versátil que um polímero natural.
Variáveis como massa molar e cristalinidade, que exercem importante efeito na dissolução do
polímero podem, geralmente, ser controladas nesta classe de polímeros. Neste aspecto, os
polímeros naturais estão em desvantagem.
Via de regra, para um mesmo par polímero/solvente, o polímero de peso molecular mais
elevado é menos solúvel ou requer um tempo mais longo para alcançar a dissolução. Mais crítico
do que o peso molecular elevado, no que se refere à dificuldade de dissolução, é o grau de
cristalinidade (elevado) que alguns polímeros atingem. O grau de cristalinidade de um polímero
refere-se à quantidade de cadeias que estão ordenadamente dispostas entre a massa desordenada
(amorfa) do polímero. Da mesma forma que num polímero de massa molar mais elevada, num
polímero de grau de cristalinidade mais alto, as moléculas do solvente terão maior dificuldade de
penetração por entre a massa do mesmo. Dependendo do sistema polímero/solvente, um tempo de
dissolução mais prolongado, principalmente quando a dissolução é conseguida com auxílio de
23
temperaturas acima do ambiente pode resultar em degradação termo-oxidativa ou termohidrolítica da cadeia polimérica. Além disso, os solventes utilizados para a preparação das
soluções de polímeros são geralmente selecionados com base no parâmetro de solubilidade entre
o par polímero/solvente. No entanto, o solvente com a maior solubilidade nem sempre é o melhor
solvente para o processo de eletrofiação uma vez que a produção de fibras por esta técnica é
também dependente das propriedades elétricas e da volatilidade do próprio solvente.
(RAMAKRISHNA et al, 2005; PATTAMAPROM et al, 2006).
2.5.1.2 – Viscosidade da solução
A viscosidade da solução é um fator que afeta fortemente o processo da eletrofiação. A
viscosidade, que de uma maneira genérica e simplificada, é a medida da resistência do material
ao fluxo, no caso da eletrofiação, quando a viscosidade é excessivamente baixa o processo pode
gerar apenas gotículas em vez de produzir fibras. Da mesma forma uma viscosidade alta pode
também inviabilizar o processo. Por outro lado, uma viscosidade mais baixa tende a produzir
fibras mais ásperas com a presença de pérolas (ou contas), enquanto que viscosidades mais altas
tendem a produzir fibras de formação mais regular. (ZHONG et al, 2002; RAMAKRISHNA et
al, 2005)
Em uma solução polimérica, a viscosidade além de manter uma forte correlação com a
concentração do polímero e com a extensão média da cadeia molecular do mesmo, e ainda uma
correlação inversa com a temperatura, é também afetada pelo tipo de solvente. Sabe-se da
literatura, que em termos gerais, a viscosidade intrínseca é alta em bons solventes e baixa em
solventes pobres. Em bons solventes, as cadeias macromoleculares são estendidas e rodeadas por
moléculas de solvente, reduzindo assim, o contato entre as moléculas do polímero. Em solventes
pobres, a dissolução do polímero é endotérmica, requerendo, portanto, o auxílio de fonte de calor
externa para dissolução. Nestes solventes, os segmentos do polímero são atraídos mutuamente
formando redes tridimensionais que tendem a expulsar o solvente ou ao encapsulamento do
mesmo sendo que o último leva a formação de gel com as cadeias adquirindo uma configuração
ondulada. Em bons solventes, porém, a fluidez se mantém mesmo em concentrações
relativamente altas (ALFREY et al., 1942; RAMAKRISHNA et al., 2005).
24
2.5.1.3 – Tensão superficial
Tensão superficial é um efeito que ocorre na camada superficial de um líquido o qual
leva a superfície do mesmo a se comportar como membrana elástica. As moléculas situadas no
interior de um líquido são atraídas em todas as direções pelas moléculas vizinhas e, por isso, a
resultante das forças que atuam sobre cada molécula é praticamente nula. As moléculas da
superfície do líquido, entretanto, sofrem apenas atração lateral e inferior. Estas forças de atração
entre as moléculas do líquido, para o lado e para baixo, superam a atração exercida pelas
moléculas de ar e criam uma tensão na superfície do líquido, fazendo com que a mesma se
comporte como uma película elástica. Assim, quando uma quantidade muito pequena de água
(uma gota) cai através do ar, esta toma, geralmente, a forma esférica (ISRAELACHVILI, 1992;
RAMAKRISHNA et al., 2005).
Para um sistema líquido puro, é esperado que a tensão superficial decresça com o
aumento da temperatura.
Para uma mistura de solventes, a tensão superficial não é uma simples função da tensão
superficial dos componentes. Em um sistema aquoso/orgânico, por exemplo, pequenas
quantidades de líquido orgânico podem afetar significativamente a composição da superfície do
sistema. Isto se deve ao caráter hidrofóbico das moléculas orgânicas que tendem a ser rejeitadas
pela fase aquosa e se concentram na superfície, afetando, portanto a tensão superficial da mistura.
No processo de eletrofiação, a voltagem aplicada à solução polimérica precisa ser
suficientemente alta para superar a tensão superficial da mesma, ou seja, romper a força de
coesão entre as moléculas de uma dada solução. Quando o campo elétrico é suficientemente
intenso, um jato de solução é formado e acelerado pelo campo elétrico em direção ao eletrodo
aterrado que serve de coletor para as fibras. Enquanto o jato viaja pelo ar, a solução é estirada, as
fibras são formadas e o solvente evapora. Neste momento, a tensão superficial pode causar a
quebra da solução em gotículas inviabilizando a formação de fibras. A formação de pérolas (ou
contas) nas fibras eletrofiadas é muitas vezes atribuída à tensão superficial (ZHONG, et al. 2002;
SHENOY et al. 2005).
25
2.5.1.4. – Volatilidade do solvente
A taxa de evaporação do solvente é outro parâmetro crítico do processo de eletrofiação;
ela tem que ser suficientemente alta de forma a permitir que o solvente evapore, durante o curto
intervalo de tempo em que o jato da solução percorre o trajeto da ponta do capilar até atingir o
coletor onde as fibras são depositadas. Porém, a taxa de evaporação do solvente é dependente de
um número muito elevado de fatores, tais como: pressão de vapor, ponto de ebulição, calor
específico, entalpia e calor de vaporização do solvente. E ainda, taxa de suprimento de calor para
o sistema, interação entre as moléculas do solvente e as do soluto e tensão superficial do líquido.
A taxa de evaporação do solvente é, adicionalmente, significantemente influenciada pela
movimentação do ar em torno da superfície do líquido.
Devido à complexidade dos mecanismos de evaporação envolvidos, preferencialmente,
utilizam-se métodos experimentais para determinar a volatilidade da solução (RAMAKRISHNA
et al., 2005).
CÁRDENAS NIETO (2006), relatou o uso de um aparato contendo acetona, acoplado
por sobre o contra-eletrodo coletor, para receber as nanofibras de polianilina formadas,
considerando que a acetona teria sido de fundamental importância na boa formação das mesmas.
O uso da acetona teria sido motivado pela constatação que o ácido fórmico, utilizado como
solvente, não estaria evaporando completamente durante o trajeto do jato no ar.
2.5.2 – Voltagem Aplicada/ Diferença de potencial/ Condutividade da solução
O processo da eletrofiação só se torna viável se existir uma diferença de potencial entre
a solução e o coletor. Via de regra, um campo elétrico é usado para controlar o jato resultante.
Fatores que afetem a habilidade da solução de transportar cargas, o campo elétrico que circunda
(envolve) o jato, e ainda, a dissipação das cargas nas fibras de polímero que são depositadas no
coletor irão interferir no processo da eletrofiação. A maioria dos polímeros são materiais que
podem ser considerados bons isolantes, assim, cargas residuais deixadas entre as fibras não
dissipam facilmente, podendo influenciar o processo, principalmente quando grandes quantidades
de fibras devem ser coletadas. A presença de sais, ácidos e bases, bem como a adição de água,
26
quando o solvente for um ácido orgânico, irá aumentar a condutividade da solução (TSAI. et al.,
2002; RAMAKRISHNA et al., 2005).
SUBBIAH et al. (2005), em sua revisão, relataram que diversos autores correlacionaram
o aumento da carga aplicada, à diminuição do diâmetro das fibras coletadas, e ainda, que diversos
tipos de instabilidade que ocorrem durante o processo de formação da fibra são atribuídos à
combinação dos efeitos do campo eletrostático e as propriedades do material polimérico.
2.6 – Levantamento bibliográfico - Eletrofiação
2.6.1 – Breve histórico
A obtenção de fibras com o uso de forças eletrostáticas, a partir de soluções poliméricas,
já é conhecida há mais de 100 anos (a patente US 705.691, relatando o trabalho de William James
Morton data de 1902). Através desse período, inúmeras pesquisas utilizaram a nova tecnologia, o
que possibilitou a fabricação de fibras com diâmetros muito menores do que os das fibras
convencionalmente produzidas por fiação via úmida, via seca e fiação do fundido ou fiação de
gel.
A história da evolução do processo de eletrofiação pode, entretanto, ser rastreada a partir
de Formhals que em 1934 depositou a primeira de uma série de patentes. Em seu primeiro
trabalho, utilizando forças eletrostáticas para produzir filamentos artificiais, relatou o processo e
o equipamento para produzir fibras alinhadas de acetato de celulose (ANTON FORMHALS,
1934). O surgimento dos novos polímeros sintéticos manteve vivo o interesse dos pesquisadores
por esta tecnologia.
No fim da década de 60, o físico Geoffrey Ingram Taylor, baseado em estudos anteriores
de outros autores no campo da eletrohidrodinâmica, que relatavam o surgimento de um cone
quando uma quantidade muito pequena de fluido era exposta a um campo elétrico, descreveu
matematicamente a forma teórica desse cone e demonstrou que esse cone se aproxima mais da
forma teórica, no momento exato que o jato irrompe do mesmo e que os jatos são ejetados do
vértice desse cone (MORA e LOSCERTALES, 1994). Em subsequentes literaturas esse tipo de
cone passou a ser referido como cone de Taylor.
27
Foi, porém, a partir dos anos 90, quando diversos grupos de pesquisadores
demonstraram que muitos polímeros sintéticos poderiam ser eletrofiados, resultando na obtenção
de nanofibras com potencialidade de aplicação em importantes áreas, nominalmente, as áreas de
saúde e da engenharia de materiais, que o crescimento das pesquisas ganhou proporções
exponenciais, aumentando ano após ano, podendo se destacar, entre outros, os trabalhos de
DOSHI e RENEKER (1995) e RENEKER et al. (2000).
Doshi e Reneker na década de 90 eletrofiaram com sucesso polímeros distintos obtendo
fibras com diâmetros abaixo da faixa do submicro. Os principais parâmetros envolvidos no
processo, tais como voltagem aplicada, concentração da solução, distância entre a ponta do
capilar e do coletor, a condutividade da solução e até mesmo ambiente do processamento foram
cuidadosamente investigados. Um modelo baseado no poli(óxido de etileno) (PEO) foi proposto,
onde o jato levaria as moléculas eletricamente carregadas, do reservatório de fluido até o coletor,
completando assim o circuito elétrico que manteria o fluxo. A diminuição no diâmetro do jato foi
atribuída ao estiramento do mesmo e à evaporação do solvente. Segundo estes pesquisadores, à
medida que o jato se tornava fino, as forças radiais aumentavam devido às cargas elétricas;
quando o jato atingia um diâmetro crítico, estas forças radiais eram suficientes para vencer a
força de coesão entre as moléculas, dividindo o jato em múltiplas fibras. Esta divisão ocorria
várias vezes antes das fibras atingirem o coletor (CÁRDENAS NIETO, 2006).
RENEKER et al.(2000), fazendo uso de câmeras de alta velocidade, constataram que as
fibras não se dividiam múltiplas vezes, mas que o jato entrava em uma fase de instabilidade
adquirindo uma forma espiralada. Praticamente em datas simultâneas (2001-2003) vários
pesquisadores, entre eles, YARIN et al. (2001), HOHMAN et al. (2001) e FENG (2003),
realizaram trabalhos teóricos propondo novos modelos para predição, por exemplo, da área de
coleta das fibras eletrofiadas, trajetória do jato, etc.
O estágio em que se encontra o processo de eletrofiação, ainda pode se considerado em
escala laboratorial. Contudo, o número de depósitos de patentes e o número de universidades e
centros de pesquisa, em todos os continentes, que estudam os diferentes aspectos desta tecnologia
e as fibras por ela produzidas, é grande (SUBBIAH et al, 2005; RAMAKRISHNA et al, 2005 e
RAMAKRISHNA et al.,2006).
28
Com base na literatura publicada disponível, SUBBIAH et al. (2005), em sua cuidadosa
revisão, concluíram que a passagem da escala laboratorial para a escala comercial requer, ainda,
um melhor domínio dos conhecimentos fundamentais envolvidos no processo de eletrofiação. O
maior desafio técnico apontado foi, certamente, o controle do comportamento da instabilidade
dos jatos que determina o diâmetro das fibras. Entretanto, TEO et al. (2011) aceitam que hoje há
compreensão suficiente do processo de eletrofiação e resultados experimentais que sugerem que
eletrofiação de precisão é uma possibilidade real. Devido ao seu custo relativamente baixo, a
pequena quantidade de matérias primas requeridas, a facilidade de manutenção e a facilidade de
se obter diâmetros de fibras nanométricos, a eletrofiação continuará a ser uma nanotecnologia
popular em laboratórios e é esperado que a mesma seja mais largamente incorporada na indústria.
2.6.2 –Literatura recente – Eletrofiação
Recentemente, vários materiais, incluindo polímeros fundidos e compósitos, cerâmicos e
metálicos, têm sido submetidos ao processo de eletrofiação (ZHOU e GONG, 2007), mas sem
dúvida, são principalmente as soluções de polímeros termoplásticos, biodegradáveis ou não, de
fontes renováveis ou fósseis, bem como soluções de polímeros naturais que têm atraído maior
número de pesquisadores.
GERRINI et al. (2006), sintetizaram o poli(álcool vinílico), por polimerização em
solução, partindo do monômero acetato de vinila e produziram mantas nanofibrílicas através de
eletrofiação de soluções de PVA/água e PVA/água/cloreto de alumínio. Os resultados obtidos
mostraram que as fibras de PVA obtidas sem adição de cloreto de alumínio apresentaram
diâmetros maiores do que na presença de cloreto de alumínio, o que foi atribuído à diferença
observada na condutividade elétrica das soluções.
OHKAWA et al. (2004) focaram seu trabalho na preparação de mantas (não-tecidas) à
base de quitosana pelo processo de eletrofiação. Os efeitos da concentração deste polissacarídeo
catiônico, e do tipo de solvente na morfologia das mantas resultantes foram cuidadosamente
estudados. O ácido acético, o ácido clorídrico (diluído), o ácido fórmico puro, e ainda, o ácido
trifluoracético foram os solventes testados. Os autores observaram que à medida que aumentavam
a concentração da quitosana foram obtendo morfologias que variaram de pérolas (contas ou
29
partículas esféricas) até redes de fibras interconectadas. Em condições otimizadas, fazendo uso de
aditivos, os autores relataram ter obtido fibras de quitosana, com diâmetro médio de 330 nm.
SPASOVA et al. (2008) prepararam pelo processo de eletrofiação, matrizes fibrosas de
poli(L-ácido lático) (PLLA) e matrizes fibrosas de PLLA/poli(etileno glicol). Visando diminuir a
ação bacteriana, as matrizes foram então revestidas com quitosana, sendo a presença da mesma
comprovada através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de fluorescência. Estudos
microbiológicos indicaram que o revestimento das matrizes com quitosana conferiu às mesmas
um comportamento antibacteriano o que sugere a aplicabilidade das mesmas em tratamentos de
lesões cutâneas.
GENG et al., (2005), relataram a obtenção de nanofibras de quitosana (GD=54%) com
diâmetro médio de 130 nm pelo processo de eletrofiação. As mesmas foram obtidas nas
condições otimizadas que seguem: solução aquosa com 90% de ácido acético e 7% de quitosana
em um campo elétrico de 4 kV/cm. Os autores salientaram ainda, que 30% de ácido acético em
solução aquosa é a concentração mínima necessária para obtenção das fibras de quitosana,
porque, à medida que a concentração de ácido acético aumenta, a tensão superficial da solução de
quitosana progressivamente decresceria e concomitantemente a densidade de carga aumentaria,
sem efeito significante na viscosidade da solução. Entretanto, os autores alertaram que
concentrações superiores a 90% de ácido acético não dissolvem adequadamente a quitosana. Da
mesma forma, atenção deve ser dada para o peso molecular da quitosana; os autores utilizaram
quitosanas com alto (398.000g/mol), baixo (30.000 g/mol) e médio (106.000g/mol) pesos
moleculares e relataram que apenas com a quitosana de peso molecular médio foi possível obter
nanofibras homogêneas sem a presença de pérolas (beads).
MIN et al. (2004), com o objetivo de produzir membranas para curativos, partiram da
quitina, utilizando o 1,1,1,3,3,3,-hexafluor-2-propanol como solvente, e radiação gama para
promover a despolimerização da quitina, aumentando assim, a solubilidade da mesma. Assim,
estes pesquisadores obtiveram, pelo processo de eletrofiação, mantas formadas por fibras de
quitina. Parte destas mantas, compostas por nanofibras com diâmetros variando na faixa de 40640 nm, foram então, submetidas a um processo de desacetilação. A desacetilação das matrizes
foi realizada por tratamento termoquímico a 60 ou 100ºC em uma solução aquosa de hidróxido de
sódio (NaOH). Os autores puderam observar que com o tratamento por 150 minutos a 100ºC, ou
30
a 60ºC por um dia, as matrizes de quitina foram transformadas em matrizes de quitosana, o que
foi confirmado por análises de difração de raios-X e infravermelho com transformada de Fourier
(FT-IR).
BHATTARAI et al. (2005), visando aplicações na área da medicina regenerativa
pesquisaram a eletrofiação de blendas de soluções de quitosana, poli(oxido de etileno) (PEO) e
um tensoativo comercialmente disponível, o Triton X-100tm . Os autores constataram uma forte
interdependência entre a viscosidade da solução (e % de PEO) com a facilidade de
processamento, e consequente morfologia das fibras produzidas. O uso potencial, na área de
medicina regenerativa, das matrizes fibrosas produzidas foi avaliado por testes de integridade em
água e compatibilidade celular. Os autores apontaram a matriz com 90/10 de Quitosana/PEO,
respectivamente, como formulação excelente no que se refere à conservação de sua integridade
em água.
PARK et al. (2004), usando ácido fórmico como solvente de fiação, prepararam blendas
de fibroína da seda e quitosana em diversas concentrações. O grupo de pesquisa relatou a
obtenção de fibras com estrutura contínua quando blendas com 30%, ou acima, de quitosana em
relação à fibroína foram eletrofiadas, embora, alertando para a impossibilidade de se obter o
mesmo resultado com quitosana pura. Outras observações importantes relatadas pelo grupo de
pesquisa foram: a diminuição do diâmetro das fibras à medida que se aumenta a concentração de
quitosana e o aparecimento de perolas (beads) quando a proporção de quitosana na blenda
ultrapassou os 40%. Assim, podemos concluir que nas condições de trabalho utilizadas, a
concentração de quitosana na blenda deve situar-se entre 30 e 40 % em relação à fibroína da seda.
Isto limita, infelizmente, a vantagem no que se refere à progressiva diminuição do diâmetro das
fibras com o aumento da concentração da quitosana.
LIN et al. (2006), utilizaram a quitosana como aditivo objetivando a melhora na
performance do processo de eletrofiação de soluções aquosas do poli(álcool vinílico) (PVA).
Estes autores relataram que devido ao efeito da quitosana sobre a viscosidade e condutividade da
solução foi possível conduzir o processo sem quebras do jato, e que devido à facilidade de
estiramento do mesmo, foram obtidas fibras de PVA com espessura fina e uniforme mesmo
utilizando soluções aquosas de PVA com alto grau de diluição.
31
LI e HSIEH (2006), após vários testes experimentais, obtiveram, pela técnica da
eletrofiação, nanofibras baseadas em quitosana e PVA com diâmetros médios entre 20 e 100 nm.
Li e Hsieh utilizaram misturas de quitosana com grau de desacetilação de 82,5% e massa
molecular média viscosimétrica de 1600 kDa., com PVA de MW =124-186kDa. em solução
aquosa de ácido acético 2% (v/v). A obtenção de nanofibras foi possível em soluções com
concentrações acima de 3% de quitosana. À medida que o a adição do componente PVA
aumentava, as fibras obtidas iam adquirindo melhor estrutura com a presença de poucas pérolas
(beads). Os autores relataram ainda a obtenção de nanofibras com estrutura porosa, conseguida
através da posterior remoção do componente PVA das nanofibras obtidas da formulação
contendo 17/83 quitosana/PVA respectivamente. A remoção foi obtida pelo tratamento das
mesmas com NaOH 1M por 12 horas. Entretanto, a produção de fibras com melhores estruturas
só foram alcançadas após tratamento da quitosana original com solução aquosa a 50% em peso de
NaOH a 95ºC por 48 horas, o que foi atribuído a conseqüente redução da massa molar da
quitosana e ao aumento do seu grau de desacetilação.
KLOSSNER et al. (2008), tendo como primeiro objetivo a obtenção de fibras a partir de
soluções de quitosana pura, utilizaram quitosana de MMw (148.000 g/mol) e grau de
desacetilação em torno de 80%. Após criterioso estudo, estes pesquisadores concluíram que a
obtenção de fibras de quitosana pura com alto grau de desacetilação continua a ser um desafio,
pois a quitosana é um polieletrólito catiônico, resultando em uma solução de viscosidade muito
maior do que um polímero neutro de comprimento de cadeia similar. Segundo Klossner et al.
(2008), como a carga na cadeia é maior, a conformação da mesma expande e a viscosidade
aumenta substancialmente. Como consequência, quando se tenta fiar soluções de quitosana com
concentrações acima da concentração de entrelaçamento (Ce) o campo elétrico é insuficiente para
superar o efeito combinado da viscosidade e da tensão superficial da solução. Diante de tais
conclusões, este grupo de pesquisadores optou por eletrofiar blendas de quitosana/PEO tendo
relatado a obtenção de fibras sem defeitos contendo 62% de quitosana.
32
CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Introdução
Como já foi visto nas seções 2.5.1 e 2.5.2, as variáveis da solução polimérica incluem:
tipo e concentração do polímero, tipo e concentração do solvente, viscosidade e massa molar do
polímero, tensão superficial e condutividade elétrica da solução. O equipamento utilizado, tal
como tipo de coletor, sistema de alimentação etc., é também fator a ser considerado para se
atingir objetivos específicos. Neste capítulo estão apresentados os materiais, solutos e solventes,
bem como o equipamento de eletrofiação e as metodologias empregadas nas diversas fases deste
trabalho.
3.2 – Equipamento utilizado neste trabalho
Figura 3.01: Conjuntos de equipamentos (setups) utilizados no desenvolvimento e confecção de
membranas e outras geometrias alternativas; (a) equipamento básico; (b e c) tipos de coletores
rotativos; (d) e (e) equipamento básico e rotativo com bomba de infusão incluída.
O equipamento de eletrofiação utilizado neste trabalho foi construído pela autora da
presente pesquisa, que contou com a colaboração dos orientadores e de diversos profissionais, e
consistiu basicamente de seringa com agulha de aço inoxidável, uma fonte de alta tensão com
33
controle de 2 a 32 kV e, alguns acessórios alternativos (vide fig. 3.01). Na fase exploratória do
trabalho, a vazão de alimentação foi estabelecida pela viscosidade da solução, diâmetro interno
da agulha de aço inoxidável e pela força da gravidade. (fig. 3.01a). Nas fases posteriores uma
bomba de infusão foi incluída e o fluxo de alimentação pôde ser controlado adequadamente. As
fibras eletrofiadas foram coletadas em coletores aterrados, na forma de placas metálicas aterradas
(fig. 3.01a e fig. 3.01d). Alternativamente, dispositivos rotativos (80 rpm) aterrados ou
entrepostos entre a ponta do capilar metálico (agulha) e a placa coletora aterrada, foram também
utilizados. Todos estes dispositivos podem ser vistos na figura 3.01.
3.3 – Materiais
Neste trabalho foram utilizados os seguintes materiais:

Quitosana de peso molecular médio (MMw), viscosidade 284-338 cP, (em solução: 1%
em acido acético) e grau de desacetilação (GD) 80% da Sigma-Aldrich.

Quitosana de peso molecular baixo (LMw), viscosidade 32 cP (em solução: 1% em acido
acético) e grau de desacetilação (GD) 91%, da Aldrich.

Poli(óxido de etileno) (PEO), peso molecular 900.000 g/mol, da Aldrich.

Poli(alcool vinílico) (PVA), Mw 13.000-23.000, viscosidade 4,1cP (em 4% H2O), grau de
hidrólise (GH) 87,7% , da Aldrich.

Ácido acético glacial PA-ACS, da Synth. Temperatura. de ebulição: 118 ºC à 1 atm; calor
específico: 0,5 cal/g °C.

Clorofórmio PA – ACS, da J. T. Baker.

Alcool etílico absoluto PA – ACS da Synth.

Nanopartículas de prata (AgNPs), sintetizadas no nosso próprio laboratório: Laboratório
de Biomateriais da FEQ/UNICAMP, pelas Pós-Doutoranda Karen Segala e Mestranda
Deborah Cruz e cedidas gratuitamente.

Digluconato de clorexidina, solução 20% (p/v) em H2O, da Sigma-Aldrich. A temperatura
de fusão (Tm) do digluconato de clorexidina sólido é de 134ºC.
Todos os
polímeros
e
solventes
acima
foram utilizados
como
recebidos.
Adicionalmente, utilizou-se água deionizada como solvente ou para compor o sistema de
solventes.
34
3.4 – Experimental
3.4.1 – Fase exploratória
Esta fase esta descrita no artigo (submetido em 02/06/2009) ao 10º CBPol - 10º
Congresso Brasileiro de Polímeros realizado pela Associação Brasileira de Polímeros em outubro
de 2009 onde o mesmo foi apresentado oralmente (ver APÊNDICE A).
3.4.2 – Testes Preliminares – Continuação da fase exploratória
Nesta fase do trabalho, diversos testes foram efetuados visando o estabelecimento de
condições mais favoráveis para condução do processo de confecção de membranas. Para tanto,
novas soluções de quitosana MMw (tab. 3.1) e blendas de quitosana/PEO foram preparadas e
utilizadas para investigação de diversos parâmetros do processo, tais como, voltagem aplicada,
distância da ponta da agulha (capilar metálico) à placa coletora e concentração da quitosana e do
PEO nas blendas Quitosana/PEO (tab. 3.2). Embora várias amostras de fibras produzidas tenham
sido submetidas à análise de MEV, a avaliação foi, geralmente, visual e baseou-se na observação
do processo e nas amostras de fibras produzidas. Ainda nesta fase exploratória, uma blenda (aqui
denominada de blenda tripla) foi adicionalmente preparada e eletrofiada, também em diversas
condições de processo. Esta blenda de quitosana/PEO na proporção 4/1, respectivamente, foi
preparada utilizando-se solução com 4% de quitosana composta de mistura de uma solução com
4% de quitosana de MMw e uma solução com 4% de quitosana LMw.
3.4.3 – Blendas de quitosana MMw/PEO
3.4.3.1 – Preparação das soluções e blendas de quitosana MMw /PEO
Soluções de quitosana MMw foram preparadas em diferentes concentrações, em um
sistema de solventes composto de 90% de ácido acético e 10% de água deionizada
(volume/volume). A quitosana (em pó) foi pesada e a mistura de solventes foi adicionada também
35
por peso, procedendo-se a dissolução sob continua agitação, em agitadores magnéticos, à
temperatura ambiente. A tabela 3.1 sumariza as soluções de quitosana utilizadas neste trabalho.
Tabela 3.1 – Soluções de quitosana
Quitosana
Peso da quitosana
(%)
(g)
1,0
0,25
Peso da solução de
ácido acético 90% (g)
24,75
Quantidade
preparada (g)
25
2,0
0,50
24,50
25
4,0
2,00
48,00
50*
6,0
3,00
47,00
50*
7,0
1,75
23,25
25
*Preparadas diversas vezes
Soluções blendas de Quitosana/PEO
Partindo-se das soluções de 4 e 6% de quitosana MMw, foram preparada blendas de
quitosana e poli(óxido de etileno) – PEO, utilizando-se PEO a 3% em solução aquosa
(peso/volume), de acordo com a tabela 3.2. Todas as blendas foram preparadas com no mínimo
duas horas de agitação à temperatura ambiente.
3.4.3.2 – Eletrofiação das blendas de quitosana/PEO
As blendas de quitosana/PEO foram submetidas à eletrofiação utilizando-se o
instrumental mostrado na figura 3.01. Foi utilizada seringa de vidro graduada com capacidade de
10 ml, acoplada à agulha de aço inoxidável (10x40 mm), que serviu como capilar metálico
(fieira). Uma placa de alumínio aterrada, revestida com folha de papel de alumínio, foi utilizada
como coletor. Um disco de tecido de teflon (lençol de teflon) foi também utilizado, para facilitar
o desmolde das fibras produzidas. A taxa de alimentação (vazão) situou-se entre 0,5 a 1,5 ml/h,
com voltagem aplicada na ordem de 15 a 25 kV e a distância da ponta do capilar ao coletor
aterrado entre 7 e 10 cm.
36
Tabela 3.2 – Preparação das blendas de quitosana/PEO e composição das membranas
AMOSTRAS
Solução
de
QUIT
4%
NaCl*
Quantidade Quantidade % Final de
da solução da solução quitosana na
de
de PEO
membrana
quitosana
3% p/v.
% Final de
PEO na
membrana
Soluções ou
blendas
eletrofiadas
Rateios das
soluções de
QUIT/PEO
4A
3/0
0
(pura)
zero
100
zero
4B
3/1
0
30,00 g
10,0 ml
80
20
4C
3/1
1
30,00 g
10,0 ml
67
17
6A
2/0
0
(pura)
zero
100
zero
6B
2/1
0
40,00 g
20,0 ml
80
20
6C
2/2
0
30,00 g
30,0 ml
67
33
6D**
2/2
1
30,00 g
30,0 ml
60
30
7A
1/1
0
10,00 g
10,0ml
70
30
(%)
6%
7%
*1% em relação à solução de quitosana. /** mesma blenda 6C adicionado sal após a preparação. /QUIT=quitosana
3.4.3.3 – Caracterização das soluções
As soluções de quitosana pura e a solução de PEO puro, bem como as suas blendas
foram caracterizadas através da determinação da tensão superficial, da viscosidade em função da
taxa de cisalhamento (propriedades reológicas) e da condutividade elétrica das mesmas.
Tensão superficial
As medições de tensão superficial foram efetuadas nos Laboratórios do IQ-UNICAMP
em um tensiômetro KSV, modelo Sigma 701, pelo método da placa, à velocidade de 2 mm/min.
(temperatura 24ºC, umidade relativa 40%).
37
Curvas de viscosidade
As curvas de viscosidade em função da taxa de cisalhamento foram obtidas nos
Laboratórios do IQ-UNICAMP em um reômetro HAAKE Rheostress 1, método das placas
paralelas à temperatura ambiente, com taxas de cisalhamento varrendo o intervalo de 0,1 a 100s-1.
Condutividade elétrica
As medições de condutividade elétrica foram efetuadas na FEQ-UNICAMP, em um
condutivímetro Digimed, Mod. DM 32, com célula de condutividade K=1cm-1 e gama de
medição na faixa 0,01µScm-1 - 2Scm-1, e resolução intercambiável de 0,1/0,01/0,001 com
precisão relativa de 5%.
3.4.3.4. – Caracterização das membranas eletrofiadas de Quitosana/PEO
3.4.3.4.1 – Morfologia
Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As imagens de MEV foram obtidas na FEM-UNICAMP em um microscópio eletrônico
de varredura marca Jeol, modelo JXA 840, bem como no Laboratório de Recursos Analíticos e de
Calibração (LRAC) da FEQ-UNICAMP, em microscópio eletrônico de varredura. mod. LEO
440i de alta resolução, com tensão de aceleração de 20 kV e 50 pA. Antes da análise por MEV as
amostras foram revestidas com uma fina camada de ouro, por pulverização catódica (sputtering),
para melhorar a sua condutividade.
Metodologia para estimativa da porosidade das membranas eletrofiadas.
Discos de 20 mm de diâmetro, de cada membrana a ser analisada, foram cortados,
pesados e introduzidos em frascos de vidro individuais contendo álcool etílico absoluto, para
permitir a difusão do mesmo nos espaços vazios das membranas. Após serem fechados, os
frascos contendo as amostras foram deixados em repouso por 36 horas e, cumprido esse período,
os mesmos foram transferidos para uma plataforma agitadora controlada a 100 rpm à temperatura
38
ambiente por 3 horas. Em seguida, os corpos de prova foram retirados, um após outro, e
colocados sobre lenços de papel para a extração do líquido em excesso e novamente pesados.
A porosidade estimada das membranas, expressa em porcentagem de espaços vazios, foi
calculada utilizando-se a seguinte equação:
P=
VEtOH
VEtOH+ VMEMB
x 100
[Eq. 3.1]
onde:
p é a porosidade estimada de cada membrana analisada (em percentagem de espaço vazio)
VEtOH é o volume do álcool etílico absoluto, absorvido pelo corpo de prova, obtido
subtraindo-se o peso do corpo de prova seco (peso inicial) do peso do corpo de prova após
a intrusão do liquido (peso final) e dividindo-se este valor pela densidade do álcool etílico
utilizado.[(peso final ─ peso inicial)/densidade do etanol]
VMEMB é o volume do corpo de prova, correspondente a cada membrana analisada, sendo
que o mesmo é a razão entre o peso do corpo de prova (seco) pela densidade da respectiva
membrana em análise.
A densidade de cada tipo de membrana analisada, foi obtida preparando-se misturas de
dois líquidos miscíveis em diversas proporções, escolhidos propositadamente com densidade
inferior e superior ao material em análise e, atentando-se para que os mesmos não dissolvessem
ou afetassem os componentes da membrana. Assim, diversas misturas de etanol absoluto e
clorofórmio foram preparadas e acondicionadas em 20 ºC, em banho termostatizado provido de
agitação. As amostras das membranas foram sendo introduzidas nestas misturas de solventes e,
no momento que o corpo de prova estacionou no centro da coluna líquida, equidistante do fundo
e da superfície do líquido, a densidade da membrana foi, então, considerada igual à desta solução
líquida.
39
Todos os valores de densidade utilizados para calcular porosidade estimada das
membranas (densidade das soluções líquidas de etanol/clorofórmio, bem como, do álcool etílico
absoluto) foram determinados em um picnômetro a 20ºC.
3.4.3.4.2 – Propriedades térmicas
Análise termogravimétrica (TGA)
As curvas de TGA e suas primeiras derivadas (DTG) foram obtidas, de acordo com a
norma ASTM E 1131, em um aparelho NETZSCH STA 409 C/CD com taxa de aquecimento de
10ºC/mim, no intervalo entre a temperatura ambiente (21ºC) e 600ºC, sob atmosfera de
nitrogênio com vazão de 60 ml/min em cadinho de alumina, com massas de corpos de prova entre
14 e 20 mg para as amostras puras (como recebidas) de quitosana e PEO e de aproximadamente 5
mg para as membranas resultantes das blendas eletrofiadas.
Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
As curvas de DSC foram obtidas de acordo com a norma ASTM D 3418, sob fluxo de
nitrogênio à razão de 50 ml/min, em um aparelho da TA Instrumentos, mod. DSC 2920
modulated DSC, taxa de 10ºC/min, em um intervalo de temperatura entre –100 e 250ºC em
cadinho de alumínio (tampa furada) com massas de corpos de prova aproximadas de 5 mg. Os
corpos de prova foram submetidos ao seguinte ciclo térmico: (i) resfriamento de 10 º C/min até 100 º C e mantidos nesta temperatura por 3 min; (ii) aquecimento com a mesma taxa até 250 ºC,
isoterma de 3 mim e, resfriamento à mesma razão (10ºC/min) até –100ºC, isoterma de 3 min, (iii)
aquecimento até 250ºC.
3.4.4 – Blendas de quitosana/poli(álcool vinílico) (PVA)
Nesta fase do trabalho, onde se utilizou uma bomba de infusão para controlar a vazão
das soluções através do capilar metálico, ferramentas estatísticas foram também utilizadas para se
buscar a melhor probabilidade de acerto na escolha das condições do processo de eletrofiação,
bem como encontrar as melhores concentrações das soluções e as proporções das mesmas que
seriam utilizadas para preparação das blendas. Tomando-se por base uma série de testes
40
exploratórios, e visando-se a estabilização e menor dispersão da voltagem aplicada, optou-se por
se substituir a seringa de vidro por seringa plástica de 10 ml. Devido às altas viscosidades das
blendas, passou-se a usar como fieira um capilar metálico com diâmetro interno maior = 1,2 mm
(agulha de aço inoxidável 12x40mm), bem como se fixar a concentração da quitosana em 4%
variando-se o teor de ácido no solvente da mesma. As fibras foram coletadas, em placa de cobre
aterrada, utilizada em posição vertical (fig. 3.01d). O software utilizado foi o STATISTICA 9 e
um planejamento fatorial de dois níveis foi escolhido para se estudar a influência de cinco fatores
(25) no processamento por eletrofiação, bem como na morfologia e diâmetros das fibras de
qitosana/PVA. Isto é, estudou-se a concentração de ácido na solução de quitosana, variando-se o
teor de acido acético no solvente da mesma, estudou-se ainda além da influencia da concentração
da solução do PVA, a razão entre as mesmas para constituir as blendas em solução. A influência
da vazão de alimentação, e da distância da ponta do capilar (agulha) ao coletor aterrado foi
também estudada (tab. 3.3). Inicialmente, pensou-se em se partir de um planejamento fatorial de
um quarto (8 experimentos) para se proceder a triagem dos parâmetros de eletrofiação com
efeitos mais significativos.
Tabela 3.3 – Estudo das condições da eletrofiação das blendas de PVA/QUIT.
Fatores estudados
min.
max.
Ponto Central
*Solvente da QUIT - % HAc. em H20
10
90
50
Distância (cm)
7
13
10
Vazão de alimentação (ml/hora)
0,4
1,2
0,8
Concentração de PVA (% p/p)
10
40
25
Razão entre as soluções (PVA/QUIT)
1/3
3/1
3/3
*Concentração da Quitosana fixada em 4%./ QUIT= quitosana.
Observando-se cuidadosamente as tabelas de experimentos geradas pelo STATISTICA
(a tabela de ¼ e a tabela do planejamento de dois níveis completa) verificou-se que todas as
diferentes blendas em solução já estão na tabela do fatorial de ¼ e, devido a peculiaridades
inerentes ao presente estudo, ou seja, facilidade em se variar fatores como distância e vazão
optou-se, então, por se realizar concomitantemente ao planejamento de ¼, o planejamento
41
completo (totalizando 32 experimentos) e, acrescido ainda dos experimentos correspondentes ao
ponto central. As duas tabelas geradas pelo STATISTICA podem ser vistas na figura 3.02.
Figura 3.02: (a) Tabela gerada pelo software STATISTICA 9 para o planejamento fatorial de um
quarto; (b) pelo mesmo software para o planejamento fatorial de dois níveis, planejamento
completo.
3.4.4.1 - Preparação das soluções
Soluções de PVA de 10, 25, 40% (p/p) foram preparadas usando como único solvente
água deionizada. Para dissolução do PVA no preparo das soluções mais concentradas, 25 e 40%,
além de agitação magnética constante, um banho de silicone mantido à 80ºC foi utilizado para se
atingir a completa dissolução do polímero. As soluções de quitosana com concentração de 4%
42
(p/p) foram preparadas como descrito anteriormente, exceto pela variação da concentração de
ácido no solvente. Uma foi preparada com uso de solução aquosa de ácido acético a 90% (v/v),
porém, uma segunda solução foi preparada utilizando-se como solvente uma solução aquosa de
ácido acético a 10% (v/v).
3.4.4.2 – Preparação e eletrofiação das blendas PVA/quitosana
As blendas PVA/quitosana foram preparadas partindo-se das soluções puras de PVA e
quitosana, respeitando-se as proporções, em peso/ peso, indicadas na tabela do fatorial de um
quarto, mostrada na figura 3.02 (a), ou seja, na razão (PVA/QUIT) de 1/3, ou 3/1, e ainda de 3/3
para o ponto central respectivamente. Após a pesagem, as misturas das soluções foram deixadas
sob agitação magnética por um tempo não inferior a 2 h, sendo em seguida submetidas ao
processo da eletrofiação nas condições de processo indicadas nas tabelas geradas pelo
STATISTICA (fig. 3.02).
3.4.4.3 – Caracterização morfológica – fibras de PVA/quitosana
O método de avaliação morfológica das fibras foi baseado na microscopia eletrônica de
varredura (MEV), onde se pode observar se há ou não formação de fibras e, em caso positivo, o
diâmetro das mesmas, bem como a presença de defeitos. As análises de MEV foram efetuadas
nos mesmos Laboratórios e utilizando-se a mesma metodologia e equipamentos usados
anteriormente para a avaliação morfológica das blendas de Quitosana/PEO.
3.4.5. – Caracterização biológica – Membrana quitosana (80%) / PEO (20%)
3.4.5.1 – Citotoxicidade in vitro pelo método de difusão em Ágar
Este trabalho foi realizado em parceria com pesquisadores da área de medicina
veterinária, da Universidade Federal de Goiás sendo os ensaios de citotoxicidade efetuados no
Instituto de Química da Universidade de São Paulo no Campus de São Carlos. A metodologia
utilizada está sucintamente descrita no corpo deste trabalho.
43
Os ensaios in vitro foram realizados em triplicata com três linhagens celulares distintas,
HEp-2 (tumor de laringe humana), Vero (rim de macaco verde africano) e McCoy (fibroblastos
de camundongos) em membranas resultantes da eletrofiação da blenda 4B, com ≈ 80% de
quitosana em sua composição final. Estas membranas foram obtidas com o instrumental
mostrado na figura 3.01 b e submetidas ao processo de esterilização por óxido de etileno antes da
realização dos ensaios.
Na etapa inicial, etapa (I), procedeu-se a cultura celular: as células foram semeadas em
placa de Petri (60 x 15 mm) no volume de 5 ml e na concentração de 3,0 x 105 células/ml. Após
um período de 24 horas, o meio foi retirado e descartado. A cada placa de Petri foram
adicionados 5 ml de uma mistura de 1:1 de meio ISCOVE'S e ágar a 1,8 %, contendo 0,01% de
vermelho neutro. Na etapa seguinte (II) fragmentos da membrana, medindo cerca de 0,25 cm2 de
área superficial, foram, então, introduzidos antes da solidificação completa do Ágar. As placas de
Petri foram incubadas, durante 24 h com 5% de CO2 a 37 °C, (látex foi utilizado como controle
positivo e papel filtro como controle negativo). Finalmente, na etapa (III). as placas foram
analisadas, sendo que a presença de halo ao redor da amostra foi utilizada como parâmetro
macroscópico, e a integridade das células como microscópico.
3.4.5.2 – Avaliação da biocompatibilidade in vivo
Para este tipo de experimentos, torna-se indispensável submeter protocolo cirúrgico, o
mesmo foi submetido à Comissão de Ética e Experimentação Animal da Universidade Federal de
Goiás, Campus de Jataí, registrado sob o número 097/11.
Este trabalho, a exemplo do anterior, foi efetuado em parceria com pesquisadores da área
de medicina veterinária da Universidade Federal de Goiás, que realizaram estudo experimental de
caráter intervencionista, conforme descrito sucintamente a seguir. E, em concordância com
metodologias semelhantes às descritas em VULCANI et al. (2008); VULCANI et al. (2009).
Foi empregado um total de 30 ratos jovens (metade fêmeas e metade machos) da
linhagem albina Wistar (fig. 3.03 a), divididos em cinco grupos experimentais (G1, G2, G3, G4 e
G5), contendo cada um seis animais que foram submetidos à eutanásia após 7, 15, 30, 45 e 60
dias da inclusão do material respectivamente.
44
Os procedimentos cirúrgicos foram feitos sob anestesia geral, por meio da injeção
intraperitoneal de pentobarbital sódico, seguido da tricotomia (retirada dos pelos) da região dorsal
dos animais. Após este procedimento os mesmos sofreram uma incisão longitudinal de
aproximadamente 1,5 cm, na região do dorso onde a membrana nanoestruturada, 80%
quitosana/20% PEO foi introduzida (no subcutâneo). A pele foi então suturada com pontos
simples separados e, finalmente, os animais foram medicados, com antibiótico, por via
intraperitoneal, e pomada de mupirocina.
Figura 3.03: a) Espécime da linhagem albina Wistar; b) esquema de manipulação e aplicação de
anestesia intraperitoneal; c) local de incisão para implantação das amostras no subcutâneo.
Após a implantação, houve acompanhamento clínico dos animais, observando-se o
comportamento dos mesmos, como também o consumo de água e ração de cada animal
individualmente. Para a eutanásia foi utilizada dose excessiva (sobredose) intraperitoneal de
pentobarbital sódico (3%).
Quando da retirada das amostras implantadas verificou-se a ocorrência de aderência
tecidual às amostras de membranas de quitosana seguindo a classificação:
(+)
aderência mínima
(liberação da amostra dos tecidos adjacentes por
dissecação romba delicada)
(++) aderência moderada
(liberação da amostra dos tecidos adjacentes por
dissecação romba grosseira)
(+++) aderência máxima
(impossibilidade de liberação por dissecação romba)
45
Os fragmentos retirados foram fixados em solução de formalina (10%) tamponada com
fosfato (pH 7,2) por pelo menos 24 horas e, após este período, processados (desidratados e
diafanizados) para inclusão em parafina. Os passos seguintes foram a microtomia, (corte em
fatias seriadas de 5 µm de espessura), a coloração com hematoxilina-eosina (HE), Tricrômio e
Von-Kossa e montagem das lâminas, sendo então os cortes avaliados por microscopia óptica e
graduados por um patologista não conhecedor de suas identidades.
As variáveis examinadas nessas lâminas, referentes ao processo inflamatório, bem como
à metaplasia encontram-se listadas, em ordem alfabética, na tabela 3.4. Estas variáveis (achados)
são usualmente verificadas, quanto à ocorrência e maior ou menor incidência, em qualquer tipo
de implante.
A análise microscópica foi acrescida de dados objetivos obtidos por meio de histometria.
Para tanto, utilizou-se microscópio binocular (Olympus® BX 60 s.r) com equipamento para
fotomicrografia, câmera de captação de imagem e analisador de imagens (Image-Pro-plus.
Cybernetics. Califórnia, USA). De cada corte histológico foram escolhidos 20 campos aleatórios
para a contagem celular.
Quantificou-se o processo inflamatório e a neovascularização (proliferação de vasos
sanguíneos), seguindo o seguinte critério de classificação: 0/5 como mínimo e 5/5 como máximo,
ou seja, de cada uma das seis amostras geradas a cada período de retirada (sete, 15, 30, 45 e 60
dias após o implante), uma lâmina foi examinada. Nela, todas as variáveis foram examinadas e
mensuradas em cada um de 20 campos diferentes de cada lâmina, quanto à ocorrência e
incidência de todas às variáveis que constam na tabela 3.4, sendo atribuída a cada uma das
variáveis uma avaliação de 0 a 5, sendo zero para a não ocorrência (mínimo) e 5 para ocorrências
altas (máximo). Ao invés de decimais, utilizou-se o sinal + (exemplo: 0+/5; significa que em uma
avaliação de zero a cinco, a nota atribuída foi perto de zero).
46
Tabela 3.4 – Variáveis examinadas nas lâminas com amostras da interface dos implantes de
quitosana nanoestruturada – subcutâneo do dorso de ratos (distribuição em ordem alfabética).
Achados ao exame histológico
Avaliação do processo inflamatório
 Cápsula Fibrosa
 C.G.M*
 Fibroblastos
 Macrófagos
 Neovascularização
 Polimorfonucleares
 Mononucleares
 Outros achados**
* Célula gigante multinucleada
** Possíveis variáveis não previstas
Avaliação de metaplasia








Mineralização
Tecido osteóide
Osteoblastos
Osteoclastos
Osso primário
Outros achados**
3.4.5.3 – Estudo do crescimento e adesão celular: membranas 80%QUIT/20%PEO
Este trabalho foi realizado em parceria com pesquisadores da área odontológica do
Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic em Campinas-SP, onde os ensaios
biológicos foram realizados utilizando-se células pré-osteoblásticas de mus musculus (rato
caseiro), da linhagem MC373, procedentes da American Type Culture Collection (ATCC,
Manassas, VA, EUA ).
Para os ensaios de adesão e crescimento celular, membranas de quitosana/PEO
resultantes da eletrofiação da blenda 4B, com ≈ 80% de quitosana em sua composição final,
processadas no instrumental com dispositivo rotativo (fig. 3.01b), foram previamente cortadas em
forma de discos (diâmetro de 9 mm) e submetidas à esterilização pela técnica do óxido de etileno.
Esse procedimento foi feito na empresa especializada Acecil Central de Esterilização Com. Ind.
Ltda e, após o período de 15 dias, submetidas aos testes de citocompatibilidade. Para efeitos
comparativos, além dos controles (discos de poliestireno para crescimento celular, e de vidro para
adesão celular) membranas preparadas por casting, da mesma solução da blenda 4B eletrofiada,
foram também submetidas aos mesmos procedimentos.
47
Cultivo celular - etapa (I),
Na etapa inicial, etapa (I), as células foram cultivadas em meio Essencial Mínimo,
modificação alfa (-MEM) (Nutricell, Campinas, SP, Brasil) suplementado com 10% de soro
fetal bovino (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 1 % de antibiótica-antimicótica (Sigma, St. Louis,
Missouri, EUA), sendo mantidas a 37°C, em atmosfera úmida contendo 5% de CO 2. O meio de
cultura foi trocado a cada 2-3 dias e a progressão da cultura, foi avaliada por microscopia de fase
em culturas crescidas sobre poliestireno (plástico). Após atingirem a subconfluência, as células
foram então tripsinizadas e contadas para utilização nos experimentos posteriores (experimentos
da etapa II). Para esta contagem (análise) do número de células viáveis, e não viáveis, crescidas
em cada grupo experimental e, portanto, avaliação da proliferação celular, foi utilizado o método
de exclusão por corante vital azul de Trypan, iniciando-se a seguir, a etapa (II) do trabalho.
Proliferação celular - etapa (II)
Para tal, as membranas em formato de discos (utilizadas como suportes ou "scaffolds") foram
colocadas em placas de 24 wells (24 poços), lavadas com água destilada esterilizada e, finalmente
com o meio de cultura. A suspensão de células na concentração de 1,8 x10 4 células/ml foi
plaqueada em cada poço contendo os corpos de prova, e 1 ml do meio de cultura foi adicionado
por sobre os mesmos. As células cultivadas nos corpos de prova foram analisadas após 24, 48 e
72 horas de cultura.
Depois de cumpridos estes períodos o meio foi removido, as células foram lavadas com
solução de PBS (tampão fosfato salino) e incubadas com solução de tripsina por 5 minutos a
37ºC. Os precipitados celulares foram ressuspendidos e 10 µl dessa suspensão celular foram
dispensados em tubo de ensaio, sendo adicionados 10 µl de azul de Trypan (Sigma).
Posteriormente, 10 µl desta mistura foram transferidos para um hemocitômetro ou câmara de
Neubauer que, a seguir, foi levado ao microscópio de fase para a realização da contagem do
número de células.
A proliferação celular foi determinada por um único examinador, cego para os grupos
experimentais, sendo selecionado um campo aleatório por amostra efetuando-se a contagem das
48
células coradas e não coradas mediante o uso de microscópio invertido de fase. Todos os
experimentos foram feitos em triplicatas e repetidos três vezes.
Adesão celular - etapa (III)
As células cultivadas por 72 horas (foram fixadas por uma hora, em temperatura
ambiente, em solução de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído 0,1% em tampão cacodilato de
sódio, pH 7,2, e rotineiramente processados para MEV.
As análises por MEV foram realizadas no Laboratório de Recursos Analíticos e de
Calibração (LRAC) da FEQ-UNICAMP, em equipamento de alta resolução modelo. LEO 440i
operando a 20 kV e 50 pA para a caracterização da morfologia e adesão celular nos diferentes
grupos experimentais. Antes da análise todas as amostras foram secas ao ponto crítico (lavagem
com CO2 líquido) e, a seguir revestidas com uma fina camada de ouro para melhorar a sua
condutividade.
3.4.6–Nanocompósitos de quitosana/PEO e nanopartículas de Prata (AgNPs)
Esta etapa do trabalho, a qual ainda deve ter continuidade, foi realizada em parceria com
membros do grupo de pesquisa do nosso próprio Laboratório, sendo que as AgNPs foram obtidas
de acordo com a metodologia descrita por SEGALA (2009), contando também com a
colaboração de pesquisadores cujos trabalhos ainda não foram publicados. Resumidamente, as
nanopartículas foram sintetizadas em meio aquoso pela redução química de nitrato de prata
(AgNO3) por boroidreto de sódio (NaBH4), utilizando-se citrato de sódio como estabilizante. As
dimensões das AgNPs sintetizadas foram aferidas por espectrofotometria na região do espectro
intermediária entre o visível e ultravioleta, e a caracterização das mesmas foi efetuada por
microscopia eletrônica de varredura ambiental (MEVA), com canhão de emissão de campo (Field
Emission Gun) - FEG .
3.4.6.1 – Preparação e eletrofiação da solução blenda Quitosana/PEO/AgNPs
O meio aquoso, contendo 0,0012g de Ag na forma de nanopartículas, foi concentrado
até aproximadamente 4,5 ml (4,53g) e adicionado a 21,72g de uma solução blenda de
quitosana/PEO contendo um total de 0,97g de polímeros na proporção de 4:1, respectivamente,
49
deste modo, obteve-se uma concentração final dos polímeros na membrana eletrofiada de
aproximadamente 80% de quitosana e 20% de PEO, e uma presença de Ag de aproximadamente
1.200 ppm.
A solução blenda de Quitosana/PEO/AgNPs foi submetida à eletrofiação em
instrumental mostrado na figura 3.01 d. Foi utilizada seringa de vidro graduada com capacidade
de 10 ml acoplada à agulha de aço inoxidável e distância da ponta do capilar (agulha) ao coletor
aterrado de 13 cm. A vazão de alimentação foi controlada por bomba de infusão, sendo fixada em
1ml/h e o tempo de fiação foi cerca de 4h30 min, com uma voltagem aplicada de 20kV. As fibras
foram recolhidas em placa de cobre aterrada revestida com folha de alumínio.
3.4.7 – Incorporação de digluconato de clorexidina – membranas de QUIT/PEO
Esta etapa do trabalho, a qual deverá ter continuidade, foi realizada em parceria com
pesquisadores da área odontológica do Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic em
Campinas-SP onde os ensaios biológicos foram realizados.
3.4.7.1- Preparação e eletrofiação da solução PEO/ digluconato de clorexidina
Devido à solubilidade do PEO e do digluconato de clorexidina em H20, optou-se por se
preparar a solução de PEO já incorporada com este fármaco.
Da solução aquosa a 20% (p/v) de digluconato de clorexidina (tal qual foi adquirida)
tomou-se uma alíquota de 3,75 ml e adicionou-se 0,30 g de PEO (em pó), dissolveu-se a mistura
por agitação magnética em água deionizada, e completou-se o volume para 10 ml.
Preparação e eletrofiação da blenda
A blenda em solução a ser eletrofiada foi preparada misturando-se, por agitação
magnética durante 2 horas, uma alíquota da solução de PEO/digluconato de clorexidina a uma
alíquota de solução de quitosana com concentração 4% (p/p), na proporção de 1/3
respectivamente; ou seja, 2,5ml de solução de PEO/digluconato de clorexidina foram adicionados
a 7,5 g da solução de quitosana. Esta mistura, embora mantenha a proporção da blenda 4B, entre
50
os polímeros (Quitosana/PEO), projeta uma concentração de aproximadamente 33% do princípio
ativo digluconato de clorexidina na membrana final.
Após cumprir o período de agitação, a blenda foi eletrofiada, segundo, os seguintes
parâmetros de processo: distância de 10 cm da ponta do capilar metálico ao coletor (placa de
cobre aterrada fig. 3.01d), vazão de alimentação de 0,8 ml/h e voltagem aplicada de 25 kV, sendo
que o processo de fiação se estendeu por 4h e 30 min em temperatura ambiente (que oscilou entre
24 e 25,5 ºC), com umidade relativa do ar que variou entre 37 e 42%.
3.4.7.2- Confirmação semiquantitativa da presença de cloro / avaliação morfológica da
membrana resultante por MEV/EDS.
A presença de cloro, bem como a morfologia da membrana, produzida conforme item
anterior, foram investigadas por microanálise elementar e MEV, respectivamente, em
microscópio eletrônico de varredura com detector de energia dispersiva de raio X, modelo. MEV:
Leo440i. com EDS: 6070. Para obtenção das micrografias usou-se tensão de aceleração igual a
15 kV e corrente do feixe igual a 150 pA, enquanto que, para os espectros de raio X, a tensão de
aceleração e corrente foram respectivamente, 20 kV e 600 pA.
Antes da análise, as amostras foram metalizadas, sendo recobertas com camada de ouro
de aproximadamente 92A°, por (sputtering) através de equipamento: Sputter Coater POLARON
modelo: SC7620.
3.4.7.3 – Ensaios biológicos – Avaliação da atividade antimicrobiana
Da membrana produzida como descrito no item 3.4.7.1, foram cortados corpos de prova
em formato de discos, com diâmetro de 9 mm, os quais foram submetidos à esterilização por
óxido de etileno na empresa especializada: Acecil Central de Esterilização Com. Ind. Ltda. Para
se assegurar a dissipação total do gás , segundo procedimento padrão, somente após período de
15 dias, eles foram submetidos a ensaios biológicos para se avaliar a efetividade do potencial
antimicrobiano do material.
Para a avaliação da atividade antimicrobiana foi realizado o teste disco-difusão
utilizando-se três tipos de micro-organismos obtidos do ATCC (American Type Culture
51
Collection, VA, EUA); foram utilizados: a bactéria Gram positiva - Staphylococcus aureus
(ATCC 25923), a Gram negativa - Escherichia coli (ATCC 25922) e o fungo Candida albicans
(ATCC 10231). A semeadura foi realizada em placa de Petri, contendo o meio de cultura Mueller
Hinton Ágar (Himedia Laboratories, Mumbai, India). Como controle (teste branco) foram
utilizadas membranas sem a incorporação do digluconato de clorexidina. As placas foram
incubadas à 37ºC por 48 horas para posterior avaliação dos resultados; ou seja, para se verificar
formação ou não de halos de inibição ao redor das amostras. A determinação do diâmetro dos
halos de inibição foi realizada com paquímetro.
52
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES
Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados coletados deste trabalho,
conforme descrito no capítulo 3. Como listado no índice geral da tese, iniciar-se-á fazendo-se as
devidas considerações sob a fase exploratória e as tentativas de obtenção de fibras de quitosana
pura, bem como de blendas de quitosona/PEO, desde as preparações das soluções até a
caracterização das membranas obtidas; estas etapas estão discutidas nas seções 4.1 e 4.2. As
considerações e discussões dos resultados da eletrofiação das blendas quitosana/PVA estão
apresentadas na seção 4.3 e as discussões da continuidade das pesquisas utilizando,
preferencialmente membranas 80% quitosana/20% PEO, resultantes da eletrofiação da
formulação 4B, estão apresentada nas seções 4.4 a 4.6, onde a biocompatibilidade desse tipo de
membrana, bem como a incorporação de fármacos são avaliados.
4.1 – Fase exploratória: obtenção de nano e submicrofibras
Nem todas as soluções de quitosana MMw puras preparadas (tab. 3.1) puderam ser
processadas. As soluções mais concentradas (6 e 7%) apresentaram viscosidades muito elevadas,
o que impediu o escoamento da solução através da agulha de aço-inoxidável da seringa utilizada.
Por outro lado, as soluções menos concentradas (1% e 2%) apresentaram gotejamento devido à
baixa viscosidade. Apenas a solução com 4% de concentração ofereceu condições de
processamento para o equipamento utilizado, na fase exploratória experimental. Nesta solução,
diversas condições de processamento foram testadas variando-se a carga aplicada (10, 15, 20, e
25 kV) e a distância (7 a 10 cm) entre a ponta da agulha e a placa coletora. Entretanto, tal como
descrito por KLOSSNER et al. (2008), que trabalharam com quitosana semelhante à usada neste
trabalho (GD ≈ 80%), também não foi possível obter fibras de quitosana pura com nível de
defeitos aceitável. Opostamente, GENG et al. (2005), em estudo prévio, usando o mesmo sistema
de solventes (acido acético a 90% em solução aquosa), publicou a obtenção de nanofibras de
quitosana pura. KLOSSNER et al. (2008) associaram estes resultados discordantes ao baixo grau
de desacetilação (54%) da quitosana utilizada por GENG et al. (2005).
53
Neste trabalho, os resultados mais promissores foram alcançados no processamento das
blendas de quitosana/PEO, onde se obteve fibras com diâmetros entre 50 e 300 nm.
Ainda nesta fase exploratória, em uma tentativa de se diminuir a viscosidade da solução
de quitosana pura, porém mantendo-se a concentração final da mesma, preparou-se soluções de
quitosana usando-se 50% de quitosana de MMw e 50 % de quitosana de LMw. Entretanto,
também neste caso específico, não se conseguiu obter fibras, mesmo após a adição de um
eletrólito (NaCl). Continuando as tentativas, somente após a adição de PEO conseguiu-se
eletrofiar esta solução. Esta mistura com PEO, chamada de blenda tripla, mostrou-se efetiva no
sentido de abaixar a viscosidade; porém, apesar de ter facilitado o processo, não foi considerada
para dar continuidade aos trabalhos optando-se por se trabalhar com quitosana de peso molecular
médio.
Blendas de quitosana/PVA também foram testadas e se mostraram capazes de produzir
fibras, com diâmetros um pouco mais elevados, na ordem do submicro; todavia, somente as
blendas com altos percentuais de PVA produziram fibras livres de defeitos, concentrações
intermediárias, ou com altas concentrações de quitosana produziram contas (beads) ao invés de
fibras. Como o centro deste trabalho era a quitosana, optou-se por continuar o mesmo com foco
nas blendas de quitosana/PEO.
4.2 – Blendas de quitosana/PEO
4.2.1 – Caracterização das soluções de quitosana MMw e de quitosana/PEO
De acordo com a literatura, algumas das principais propriedades das soluções
poliméricas que afetam o processo da eletrofiação são a tensão superficial, a condutividade
elétrica e o comportamento reológico das mesmas. Estas propriedades, entretanto, podem ser
modificadas alterando-se a concentração da solução ou adicionando-se outros polímeros que
permitem obter diferentes blendas. Além disso, pode-se também adicionar um eletrólito que
atuará de modo a aumentar condutividade da solução, ajustando-a desta forma às condições
desejadas no processo.
54
Blendas de quitosana/PEO em diversas proporções, com ou sem adição de NaCl, bem
como as soluções puras de quitosana (MMw de 4 e 6%) utilizadas para obtenção das mesmas,
foram submetidas a estudos de viscosidade, a determinações de condutividade elétrica e medidas
de tensão superficial. Deste modo, através da comparação desses resultados, pôde-se buscar um
melhor entendimento da influência destes parâmetros no processo da eletrofiação das blendas
mencionadas. Na figura 4.01 estão mostradas as curvas de viscosidade (Pa.s) versus a taxa de
cisalhamento (s-1). Os resultados das medições da tensão superficial e da condutividade elétrica
encontram-se resumidos na tabela 4.1; estes valores são médias de pelo menos duas medidas, e
não diferiram mais de 0,2 mN/m para valores de tensão superficial e de 0,1 x 103 µS/cm, para
valores de condutividade elétrica.
A concentração da solução é apontada por alguns pesquisadores (RAMAKRISHNA et
al., 2005); KLOSSNER et al., 2008), como um fator importante para controlar a formação de
contas (beads) nas nanoestruturas obtidas por eletrofiação, uma vez que o aumento da
concentração do polímero na solução resulta no aumento da viscosidade da mesma. Este aumento
pode ser atribuído ao aumento do emaranhamento das cadeias poliméricas na solução (HWANG
et al., 2000; SHENOY et al., 2006). Espera-se que um certo grau de emaranhamento, e portanto
que uma determinada viscosidade estejam presentes e adequados na solução para evitar a ruptura
do jato durante eletrofiação. Viscosidades muito altas não são desejáveis, uma vez que dificultam
ou impedem a formação do jato.
No caso específico de quitosana, soluções na faixa de 4-6% de concentração já
apresentam uma estrutura gelatinosa, com viscosidade muito alta. Assim, verificou-se que a
adição de uma solução de PEO (3%) a essas soluções diminui a viscosidade e, ao mesmo tempo,
mantem a concentração total de polímeros no sistema.
Na figura 4.01 pode-se observar que todas as soluções apresentaram um comportamento
dilatante a baixas taxas de cisalhamento, e um comportamento pseudoplástico para taxas
superiores a 10s-1. Tal comportamento pode ser atribuído a uma característica do perfil reológico
de polímeros associativos (BARNES, 2000). Particularmente, a solução 6A mostrou um
comportamento dilatante considerável, devido à alta concentração de quitosana.
55
Figura 4.01: Curvas de viscosidade para soluções de quitosana e de QUIT/ PEO em função da
taxa de cisalhamento.
Comportamento dilatante a baixas taxas de cisalhamento também foi observado para
todas as blendas de quitosana/PEO, ou seja, 4B, 4C, 6B e 6C (fig. 4.01). A adição de PEO às
soluções de 4 e 6% de quitosana causou uma redução geral na viscosidade das mesmas. Também
foi possível observar que entre as soluções com PEO analisadas, as blendas 4B, 4C e 6C foram as
que apresentaram os menores valores de viscosidade para a faixa de taxas de cisalhamento
estudada. Ressaltamos que estas blendas são as mesmas que, nos testes experimentais,
apresentaram as melhores condições de processamento.
Além disso, a adição de PEO levou a uma pequena redução na tensão superficial das
soluções, o que é desejável para a eletrofiação uma vez que, como já é bem conhecido, um fluido
com uma alta tensão superficial tende a inviabilizar o processo da eletrofiação, impedindo a
formação do jato ou provocando a quebra do mesmo com a formação de gotículas (GENG et al.
2005; RAMAKRISHNA et al. 2005). Comparando-se a tensão superficial e os valores de
condutividade obtidos para as soluções blendas 4B e 6C (ambas sem sal) ou 4C e 6D (ambas com
a adição de sal), uma tensão superficial menor e uma condutividade elétrica bem superior podem
ser observadas (ver tabela 4.1) nas blendas preparadas com a solução de maior concentração de
quitosana. Considerando que a concentração de quitosana, nas quatro blendas em solução, é a
56
mesma (3%), essas propriedades diferenciadas devem ser atribuídas às diferentes concentrações
de PEO nos sistemas.
Assim, a adição de PEO às soluções de quitosana causou um aumento da sua
condutividade elétrica, que já era alta, devido a seu caráter catiônico, atribuído à presença de
grupamentos amina das cadeias de quitosana. Como esperado, a adição de sal resultou em um
aumento substancial da condutividade elétrica das soluções.
4.2.2 – Eletrofiação das blendas e obtenção das membranas de quitosana/PEO
A dificuldade para se preparar soluções de quitosana, utilizando-se quitosana de alto ou
médio peso molecular, com grau de desacetilação elevado em concentrações suficientes e
apropriadas para se obter fibras, tem sido o principal obstáculo para a eletrofiação da mesma. O
uso de blendas da quitosana com polímeros sintéticos biocompatíveis tem sido utilizado para se
obter soluções com parâmetros, como viscosidade e tensão superficial, que atendam o processo
da eletrofiação (KLOSSNER et al., 2008).
Em primeira análise o que se pôde observar, em relação aos polímeros e sistemas de
solventes utilizados neste trabalho, foi que soluções com viscosidades e tensões superficiais mais
baixas conduziram a processos mais favoráveis. Assim, as blendas 6D, 4C e 6C foram as que
apresentaram melhor processabilidade, seguidas pela blenda 4B.
A presença de um eletrólito (NaCl) na preparação da blenda 4C, única alteração em
relação à blenda 4B, tornou claro que o sal, como esperado, aumentou a condutividade da mesma
e, ao mesmo tempo, diminuiu a viscosidade; entretanto, não foram observadas alterações
significativas na tensão superficial desta blenda. Sem dúvida, a alteração favorável dos dois
primeiros parâmetros, ou seja, um grande incremento na condutividade acompanhada da
diminuição da viscosidade assegurou um processamento fácil, ininterrupto e eficiente. Esta
mesma situação ocorreu durante o processamento da solução da blenda 6C, que originalmente
havia sido preparada sem adição de sal e já havia apresentado ótimas condições de
processamento. Ela foi processada novamente após a adição de sal (blenda 6D, tab.4.1), também
resultando em um processo fácil e ininterrupto.
57
Tabela 4.1 – Caracterização das soluções de quitosana e blendas de quitosana/PEO
Soluções blendas e soluções de quitosana pura
Identificação das
soluções
Solução
de
Quitosana
4%
Solução
de
Quitosana
6%
Quitosana/PEO* NaCl**
(%)
Quitosana
%
Tensão Condutividade
superficial
elétrica
Polímero total
%
(mN/m)
(μS/cm)
4A
3/0
0
4,0
4,0
43,9
1,13x103
4B
3/1
0
3,0
3,75
42,5
1,71 x103
4C
3/1
1
3,0
3,75
42,7
5,21 x103
6A
2/0
0
6,0
6,0
58,0
1,53 x103
6B
2/1
0
4,0
5,0
50,8
2,54 x103
6C
2/2
0
3,0
4,5
41,9
2,41 x103
6D***
2/2
1
3,0
4,5
41,7
6,14 x103
* Solução de PEO utilizada: 3% em água deionizada (p/v); **% relativa à solução de quitosana.
*** A mesma blenda 6C ( adicionado sal após a preparação); condutividade elétrica do HAc 90% = 98 μS/cm.
Embora a adição de sal tenha facilitado o processo da eletrofiação, não favoreceu a boa
formação das membranas; ao contrário, houve espalhamento excessivo como mostrado na figura
4.02 a, formando teias muito finas, e sem consistência. A figura 4.02 (b) e (c) mostram imagens
de uma membrana obtida pelo processamento da blenda 4B (blenda sem sal), onde uma
membrana com boa formação pode ser observada (b) imediatamente após o processamento, e (c)
a mesma membrana sendo desmoldada.
O uso de um dispositivo rotativo, entreposto entre o capilar contendo a solução e o
coletor (fig. 3.01b), permitiu a obtenção de membranas com aspectos mais consistentes. A figura
4.03 (a) mostra foto de uma membrana obtida utilizando-se esse dispositivo giratório. O
prosseguimento da pesquisa com dispositivos rotativos variados possibilitou a obtenção de outras
geometrias, tais como geometrias tubulares, como mostram as figuras 4.03 (b), (c) e (d), exibindo
a versatilidade da técnica. Na figura 4.03b observa-se foto que exibe uma amostra na posição
vertical, apoiada em uma agulha e do seu diâmetro interno sendo iluminado pela luz. As figuras
58
4.03c e 4.03d exibem geometrias tubulares com aproximadamente 2 mm de diâmetro interno x 10
mm de comprimento.
Figura 4.02: a) Foto de membrana obtida do processamento da blenda 6D (blenda 6C com NaCl);
b) foto obtida imediatamente após o processamento da blenda 4B (blenda sem NaCl) e em (c) a
mesma membrana sendo retirada do molde.
Como já discutido, a utilização de quitosana de LMw como auxiliar para controle de
viscosidade/concentração da solução de quitosana de MMw, embora tenha atuado
favoravelmente, diminuindo a viscosidade e mantendo a concentração da solução, só foi capaz de
produzir fibras com adição de PEO; mesmo a despeito da presença de NaCl, na solução mista
original, sendo assim, a utilização da mesma não foi considerada para dar continuidade a
pesquisa. A figura 4.04 mostra foto durante o processamento das fibras produzidas por blenda
tripla (ou seja, a formulação 4C onde metade da solução de quitosana de MMw foi substituída
por solução de quitosana de LMw com a mesma concentração).
59
Figura 4.03: Espécimes obtidos com o uso de dispositivos rotativos, em (a) uma membrana com
10 cm de diâmetro; em (b) foto, na posição vertical, de um espécime de geometria tubular e seu
diâmetro interno iluminado pela luz; em (c) e (d) geometrias tubulares de aproximadamente 2mm
de diâmetro x 10 mm de comprimento.
Figura 4.04: Foto das fibras produzidas pela blenda tripla, na presença de NaCl.
60
4.2.3 – Caracterização morfológica das membranas de quitosana MMw/PEO
Microscopia Eletrônica de varredura
As imagens de MEV (fig. 4.05) mostram, em duas magnitudes diferentes, a presença de
morfologia nanoestruturada, altamente porosa, em membrana obtida com a utilização do
instrumental básico (mostrado na figura 3.01a) para a formulação 4B. A mesma foi produzida
com voltagem aplicada de 20 kV e distância da ponta da agulha à placa coletora de 9 cm.
Figura 4.05: Imagens de MEV de fibras obtidas pela eletrofiação da blenda 4B produzidas com o
equipamento básico a uma voltagem aplicada de 20 kV e distância da ponta da agulha à placa
coletora de 9 cm; a) com magnificação de 30.000 vezes; b) a mesma membrana a uma
magnificação de 5.000 vezes.
Medidas dos diâmetros das fibras desta mesma membrana 4B (1), bem como de uma
segunda membrana, 4B (2), obtida da mesma formulação e no mesmo instrumental básico foram
determinadas a partir da imagem de duas fotomicrografias de duas regiões diferentes de cada
membrana e suas distribuições encontram-se representadas nos histogramas da figura 4.06. Estas
imagens evidenciam que os diâmetros característicos das fibras são ao redor de 100 nm.
A introdução do dispositivo rotativo (fig. 3.01b) com velocidade relativamente baixa
(apenas 80 rpm) não provocou estiramento adicional nas fibras; foi observada uma área menor,
ocupada pela deposição das mesmas no coletor, durante o processamento. Isso provavelmente foi
causado pela redução do diâmetro final da espiral do jato, que encontrou o cilindro coletor
antecipadamente, ganhando assim estabilidade.
61
Figura 4.06: Histogramas representativos da distribuição de diâmetros das fibras determinados a
partir da imagem de duas membranas obtidas no instrumental básico com a formulação 4B.
Figura 4.07: Imagens de MEV obtidas das fibras produzidas pela eletrofiação da solução blenda
4B utilizando-se o dispositivo rotativo com 32 mm de diâmetro a) com magnificação de 20.000
vezes; b) a mesma membrana com magnificação de 5000 vezes.
62
Deste modo, para se obterem membranas com 10 cm de diâmetro e homogeneidade
aceitável, utilizando-se o dispositivo rotativo mostrado na figura 3.01b, foi necessário mover a
agulha sobre o cilindro para ampliar a área de deposição das fibras. Imagens de MEV das fibras
das membranas obtidas, usando-se o dispositivo rotativo, podem ser observadas nas figuras 4.07
e 4.08 onde se verifica diâmetros ligeiramente superiores aos das fibras das membranas
produzidas utilizando-se o instrumental básico.
Figura 4.08: Histogramas representativos da distribuição de diâmetros das fibras determinados a
partir da imagem de duas membranas obtidas com utilização do dispositivo rotativo pela
eletrofiação da formulação 4B
Com o equipamento e condições utilizadas, nesta fase da pesquisa, os diâmetros médios
das fibras produzidas, com coletor rotativo, foram aproximadamente 50% superiores aos
diâmetros médios das fibras obtidas com o dispositivo básico, cujo coletor é estático.
63
A tabela 4.2 mostra os valores médios, bem como os desvios padrões dos diâmetros das
fibras produzidas com soluções blenda 4B, produzidas utilizando-se o equipamento básico (fig.
3.01a), como também com utilização do dispositivo rotativo (fig. 3.01b).
Tabela 4.2 – Diâmetros médios e desvios padrões das fibras - membranas obtidas das soluções blendas 4B
Equipamento
Membrana
Diâmetro Médio
(nm)
Número de medições
(n)
Básico
(figura: 3.01a)
Básico
(figura: 3.01a)
Rotativo
(figura: 3.01b)
Rotativo
(figura: 3.01b)
(1)
111±42
100
(2)
96±34
84
(1)
171±62
91
(2)
139±57
100
Estimativa da porosidade das membranas de quitosana /PEO
As amostras das membranas submetidas à análise de MEV revelaram imagens de fibras
com diâmetros entre a escala nanométrica e submicrométrica, formando estruturas de teias não
tecidas altamente porosas. Para se estimar essa porosidade, utilizou-se do método de intrusão
líquida, adaptando-se a metodologia descrita por SOLIMAN et al., (2010) conforme foi descrito
no capítulo 3 (item 3.4.3.4.1). Isto porque não se encontrou alguma norma ou mesmo um método
tradicional específico para esta determinação em membranas eletrofiadas.
Os valores obtidos usando essa metodologia compreendem a média de três ensaios
independentes e estão sumarizados na tabela 4.3.
Tabela 4.3 – Medidas de densidade e estimativa da porosidade das membranas de quitosana/PEO
Densidade
(g/cm3)
Porosidade em % de volume livre
(p)
0,806
80±3,6
Blenda 4B
Blenda 4B obtida em
coletor rotativo
0,839
81±4,2
0,893
86±2,9
Blenda 6C
0,906
82±4,3
Álcool etílico
0,792
---
Identificação
Blenda tripla
(sem sal)
64
Embora, como esperado, a discordância entre os resultados destes testes individuais para
a mesma membrana tenha sido alta, devido a dificuldades inerentes à própria metodologia
utilizada, os mesmos não diferiram entre si em mais de 9%. A membrana produzida com a blenda
tripla (sem sal), embora não tenha sido considerada para dar continuidade aos trabalhos desta
tese, foi também incluída por interesses puramente investigativos.
Entre os quatro tipos de membranas submetidos à intrusão líquida, a membrana
proveniente da blenda 4B, produzida no equipamento com dispositivo rotativo (fig. 3.01b), foi a
que apresentou valor de porosidade mais alta (86%), entretanto, a diferença entre este valor e os
apresentados pelos demais tipos de membranas não ultrapassa a seis por cento, situando-se,
portanto, na mesma ordem de grandeza do erro analítico observado. Por outro lado, os demais
tipos de membranas apresentaram valores de p muito próximos, relativamente aos erros
observados. Os ensaios de intrusão liquida confirmaram a alta porosidade das membranas que já
havia sido revelada nas imagens de MEV.
4.2.4. – Caracterização térmica das membranas de Quitosana/PEO
A figura 4.09 apresenta, no intervalo de temperatura de 20-610ºC, as curvas de TGA e
suas primeiras derivadas (DTG) para as amostras de quitosana pura (fig. 4.09 a) e para o PEO
puro (fig. 4.09 b) como recebidos, e também para uma amostra de membrana obtida da
eletrofiação da blenda 4B, utilizando-se o dispositivo rotativo (fig. 4.09 c). A amostra de
quitosana (em pó) apresentou, no intervalo de temperatura analisado, dois eventos de perda de
massa distintos, o primeiro, um pico largo que se estendeu desde o inicio do aquecimento até
130ºC, tendo seu ápice em aproximadamente 80ºC representando aproximadamente 5% da massa
total, referente à perda de água e outros possíveis voláteis. O segundo evento de perda de massa,
por decomposição da quitosana, teve início em aproximadamente 260ºC, com seu ápice em
aproximadamente 300ºC e perdendo intensidade à aproximadamente 340ºC; porém, estendeu-se
por todo o intervalo de temperatura em análise, sendo que, por volta de 510ºC, a perda de massa
começa a aumentar novamente de intensidade devido ao provável aumento da combustão do
carbono da amostra interrompida com o término da análise a 610ºC.
65
Para o PEO puro (em pó) ocorreu um só evento de perda de massa, correspondente à
decomposição que se iniciou à aproximadamente 360ºC com ápice em aproximadamente 400 ºC
e diminuindo de intensidade por volta 420ºC; após, manteve-se quase estável até o termino do
ensaio (605ºC), correspondendo à uma perda de massa de aproximadamente 89% da amostra.
Essa estabilidade final é, provavelmente, devida ao ambiente neutro (fluxo de nitrogênio) em que
o ensaio foi conduzido.
Finalmente nos termogramas (TGA/DTG) da membrana resultante da eletrofiação da
blenda Quitosana/PEO 4B, três eventos térmicos podem ser observados. O primeiro, quase
imperceptível, correspondente à perda de água e eventuais voláteis, iniciando-se por volta de 6070 ºC e tendo seu ápice em torno de 130ºC. Apesar da predominância (≈80%) de quitosana na
composição final da blenda eletrofiada, o percentual de perda de massa atingido neste primeiro
evento não chegou a 2% da massa total da amostra. Isto pode sugerir que as fibras da blenda de
Quitosana /PEO são menos higroscópicas do que a quitosana pura em pó, o que se justifica
devido às interações entre as cadeias poliméricas de quitosana/PEO. Também a orientação das
fibras, devido ao estiramento sofrido durante o processo de eletrofiação (NA et al., 2008;
COSTA et al., 2009) pode ter causado um efeito hidrofóbico, devido a maior ordem no
empacotamento das macromoléculas, desfavorecendo a absorção de água pelas cadeias
moleculares da quitosana nas fibras produzidas.
No segundo evento, a perda de massa corresponde aproximadamente à temperatura de
decomposição da quitosana, iniciando-se, cerca de 25ºC mais cedo e tendo seu ápice, também
mais cedo, em aproximadamente 280ºC, o que pode significar uma ligeira perda de estabilidade
térmica em relação a quitosana pura quando o PEO esta presente. Entretanto, o terceiro evento,
que como esperado teve início antes do termino do segundo, registrou a sua perda de massa de
maior intensidade exatamente a 400ºC, coincidindo com a perda de massa de maior intensidade
do PEO puro, em pó.
66
Figura 4.09: TGA / DTG curvas obtidas à taxa de 10ºC/min; a) para a quitosana pura em pó; b)
PEO puro e c) para amostra de membrana obtida pela eletrofiação da blenda 4B.
As curvas de DSC para as mesmas amostras submetidas à TGA, como também para uma
amostra de membrana eletrofiada da blenda 6C são mostrados nas figuras 4.10, 4.11 e 4.12;
enquanto os dados obtidos para todos os parâmetros térmicos estão sumarizados na tabela 4.4. A
curva da quitosana pura (fig. 4.10) apresentou apenas um evento endotérmico, observado no
primeiro aquecimento que corresponde à desidratação dos anéis sacarídeos nas cadeias
67
poliméricas (COVAS et al., 1993), e sendo também dependente da história de secagem ou
exposição da amostra. (SANTOS et al., 2003). Este processo de desidratação da quitosana é
comprovado pela ausência de eventos no termograma do segundo aquecimento (fig. 4.12) e pela
perda de massa, em torno de 100ºC, detectada no primeiro evento térmico apresentado nas curvas
da análise TGA/DTG como discutido anteriormente.
Figure 4.10: Termogramas de DSC das primeiras corridas de aquecimento para a quitosana e o
PEO puros, em pó, e para amostras das membranas das blendas 4B e 6C.
A quitosana como grande parte dos polissacarídeos não experimenta fusão, devido as
fortes forças intermoleculares que derivam de seus grupos hidroxilos, acetamidos e aminos;
quando submetida a temperaturas severas sofre degradação térmica decompondo-se sem que a
temperatura de fusão cristalina seja atingida (AGBOH e QIN, 1997; DUAN et al., (2004).
68
Figure 4.11: Curvas de resfriamento de DSC para a quitosana e o PEO puros, em pó, e para
amostras das membranas das blendas 4B e 6C
Figure 4.12: Termogramas de DSC das segundas corridas de aquecimento para a quitosana e o
PEO puros, em pó, e para amostras das membranas das blendas 4B e 6C.
69
Com relação ao PEO puro, a temperatura de fusão cristalina obtida no primeiro
aquecimento (cerca de 71°C), foi ligeiramente maior do que a obtida no segundo aquecimento
após o histórico térmico da amostra ter sido apagado. Não obstante, quando a quitosana está
presente, mesmo no primeiro aquecimento, o pico de fusão cristalina do PEO aparece em
temperaturas mais baixas (fig. 4.10), claramente mostrando a interferência da quitosana na
cristalização do mesmo. Isto pode ser confirmado comparando-se as temperaturas de cristalização
PEO (43,4 ºC) com as das blendas (38,5 e 37,0 º C), nas curvas de resfriamento (fig. 4.11).
Portanto, pode ser admitido que a presença da quitosana desfavoreceu e retardou a cristalização
do PEO.
Tabela 4.4 – Dados das análises de DSC e TGA para as blendas de QUIT/PEO e para a
quitosana e o PEO puros, em pó.
DSC
Amostra
Primeiro aquecimento
TGA
Resfriamento
Segundo
aquecimento
Perda
de
água
Decomposição
Tm
Desidratação
H
Tc
Hc
Tm
Hm
Pico
Início
Pico1
Pico2
(ºC)
(ºC)
(J/g)
(ºC)
(J/g)
(ºC)
(J/g)
(ºC)
(ºC)
(ºC)
(ºC)
176,1
43,4
134,7
64,0
144,7
360
400
311,6
---
---
---
---
260
300
62,3
38,5
19,2
60,5
21,3
≈235
≈280
176,3
---
---
---
---
86,1
37,0
33,2
62,3
31,9
144,9
---
---
---
---
PEO
como
recebido
70,9
Quitosana
96,8
como
recebida
Blenda
4B
Blenda
6C
59,2
92,0
60,1
96,0
70
80
400
4.3 – Blendas de quitosana/poli(álcool vinílico) (PVA)
4.3.1 – Fase exploratória: obtenção de submicrofibras de quitosana/PVA
Nesta fase exploratória dos trabalhos, várias soluções blendas compostas de duas
concentrações diferentes de quitosana (4 ou 6% em ácido acético 10%) e de duas concentrações
diferentes de PVA (10 ou 40%), em diferentes proporções, foram testadas. Houve, entretanto,
dificuldades para manter-se o processo de fiação estável. Apesar de, nesta fase da pesquisa, já se
poder contar com uma bomba de infusão para controlar o fluxo de alimentação do processo de
eletrofiação, diâmetros de agulhas muito finos e soluções muito viscosas, bem como, dificuldades
de se manter estável a tensão aplicada inviabilizaram o planejamento inicial. As blendas
preparadas, quando possível, foram então eletrofiadas para se angariar dados que auxiliassem em
futuro planejamento, como descrito na seção 3.4.4.
Apesar do planejamento inicial ter-se mostrado insatisfatório, algumas amostras de
fibras resultantes da eletrofiação destas soluções blendas de PVA/QUIT, que apresentaram
condições de processamento, foram submetidas à analise de MEV. As fotomicrografias
resultantes podem ser observadas na figura 4.13 e as condições utilizadas no processamento das
mesmas, bem como as concentrações das soluções e a proporções utilizadas para se compor as
blendas, estão na tabela 4.5.
Tabela 4.5 – Blendas de PVA/QUIT – Fase exploratória
Condições de Processamento
Soluções
Membranas
%
PVA
QUIT
Resultados
MEV
figura:4.13
1P/3Q
69,0
31,0
(a)
6
3P/3Q
87,0
13,0
(b)
40
4
3P/1Q
96,8
3,2
(c)
7
40
4
3P/1Q
96,8
3,2
(d)
25
10
10
4
3P/3Q
71,4
28,6
(e)
25
13
10
4
3P/3Q
71,4
28,6
(f)
Conc.
% (p/p)
Diâmetro
da agulha
(mm)
Vazão
(ml/h)
Tensão
(kV)
Distância
(cm)
PVA
QUIT
0,8
1,0
25
13
40
6
0,8
0,5
22
7
40
0,6
0,5
20-25
13
0,6
0,5
17-18
0,8
0,5
0,8
0,5
71
Razão
PVA/QUIT
%
Figura 4.13: Imagens de MEV das blendas de PVA/QUIT resultantes da eletrofiação das blendas
que apresentaram condições de processamento na fase exploratória.
Estas imagens mostram que apenas as blendas de PVA/QUIT com altas concentrações
de PVA, projetando percentuais de PVA em torno de 87% ou maiores para a membrana final, em
que a solução de 40% PVA foi utilizada para compor as blendas, produziram fibras com poucos
ou nenhum defeito; nelas, fibras com diâmetros em torno de 300 nm podem ser observadas,
figura 4.13. Na figura 4.13 (a), em que a concentração de PVA projetada para a membrana final
72
foi de 69%, e a de quitosana 31%, fibras com diâmetros ligeiramente inferiores são observadas,
embora com elevado número de defeitos. Entretanto, as imagens na figura 4.13 (e) e (f), mostram
apenas contas (beads), embora as proporções PVA/QUIT na membrana final sejam muito
semelhantes a anterior (fig.4.13 a). Isto possivelmente se deve as diferentes concentrações totais
de polímero nas soluções das blendas eletrofiadas, ou seja, 14,5% (para a mostrada em 4.13 a) e
apenas 7% para as mostradas em 4.13 (e) e (f). As ultimas, (e) e (f), cujas soluções originais são
idênticas, mostram imagens muito semelhantes. Uma análise cuidadosa mostra que em (e) as
contas tendem a se alongar mais acentuadamente do que em (f) o que provavelmente é devido a
diferença das condições em que ambas foram eletrofiadas; ou seja, a distância da ponta da agulha
ao coletor aterrado foi de10 e 13 cm, respectivamente; como a voltagem aplicada foi mantida em
25 kV para ambas, a mostrada em 4.13 (e) foi eletrofiada em campo elétrico ligeiramente
superior.
4.3.2 – Blendas de PVA/QUIT - Planejamento fatorial de dois níveis com estudo de cinco
fatores (25)
Como discutido na seção 3.4.4 deste trabalho, optou-se, primeiramente por se realizar
um planejamento fatorial de ¼ (oito experimentos) mais o ponto central. A figura 4.14 mostra as
fotomicrografias de MEV resultantes da eletrofiação das blendas de PVA/QUIT, correspondentes
aos experimentos desse fatorial.
Todavia, devido a peculiaridades da presente pesquisa, ou seja, facilidade em se variar
fatores como distância e vazão, foi possível realizar concomitantemente o fatorial completo,
totalizando 32 experimentos mais o ponto central. As imagens de MEV correspondentes aos
experimentos do fatorial completo são mostradas na figura 4.15. Todos os experimentos deste
novo planejamento foram executados, utilizando-se solução de quitosana a 4% (p/p) e voltagem
aplicada de 25 kV.
A exemplo do que já havia sido observado na “Fase exploratória” (deste mesmo item,
4.3), das soluções das blendas em que a solução de PVA a 10% (p/p) fez parte da composição das
blendas (experimentos 1, 2, 5 e 6 do fatorial de 1/4) não se conseguiu obter fibras com poucos ou
nenhum defeito (fig. 4.14); mesmo no ponto central, onde se utilizou solução de PVA a 25%, não
foram obtidas fibras.
73
Statistica
n°
1
2
3
4
5
6
7
8
P. Central
Fatores investigados
Solv. Quit. (%HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Alimentação (ml/h)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. (%HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. (%HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. ( %HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. ( %HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. ( %HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. ( %HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. ( %HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Solv. Quit. ( %HAc)
Conc. sol. PVA (%)
Distância (cm)
Razão PVA/Quit
Conc. PVA nas fibras
%
10
10
7
1,2
3/1
90
10
7
0,4
1/3
10
40
7
0,4
3/1
90
40
7
1,2
1/3
10
10
13
1,2
1/3
90
10
13
0,4
3/1
10
40
13
0,4
1/3
90
40
13
1,2
3/1
50
25
10
0,8
3/3
Imagens de MEV
Mag. 10.000 x
88,2
45,5
96,8
76,9
45,5
88,2
76,9
96,8
86,2
Figura 4.14: Imagens de MEV correspondentes ao planejamento fatorial de um quarto, das
blendas PVA/Quitosana.
74
STATISTICA
Identificação
1/4 Completo
17,
21,
1
25,
29
2,
6,
2
10,
14
19,
23,
3
27,
31
4,
8,
4
12,
16
1,
5,
5
9,
13
18,
22,
6
26,
30
3,
7,
7
11,
15
20,
24,
8
28,
32
Vazão 0,4 ml/h
Distância 7 cm
Distância 13 cm
Não fiou
Não fiou
Vazão 1,2 ml/h
Distância 7 cm
Distância 13 cm
Não Fiou
Figura 4.15: Imagens de MEV correspondentes ao fatorial completo e as respectivas
identificações geradas pelo STATISTICA para o fatorial de ¼ e para o fatorial completo, das
blendas PVA/Quitosana. As imagens correspondentes ao fatorial de ¼ estão aqui identificadas
por moldura azul.
75
A falta de êxito nos experimentos nºs. 4 e 7 (do fatorial ¼) cujas blendas
correspondentes também não foram capazes de produzir fibras sem defeitos, embora tenham sido
preparadas com soluções de PVA a 40%, pode ser atribuída à razão entre as soluções de
PVA/QUIT utilizadas (1P/3Q) , que resultou em composição de blendas com concentrações
totais de polímero de 13%. Por sua vez, as blendas que foram capazes de produzir fibras sem
defeitos ou com poucos defeitos, neste fatorial de ¼, tinham uma concentração total de polímeros
de 31% (experimentos: 3 e 8). No estudo PVA/QUIT, incluindo-se também a fase exploratória, o
valor da menor concentração total de polímeros capaz de produzir fibras sem defeitos foi de 23%
(tab. 4.5, fig. 3.13 b), sendo que neste sistema a concentração de PVA foi de 20%, e a de
quitosana de 3%.
Os resultados dos experimentos do planejamento fatorial completo de dois níveis, (25),
corroboraram com as considerações acima, reafirmando que entre os fatores investigados os mais
significativos, no sistema PVA/QUIT estudado, são os que envolvem as concentrações dos
polímeros e as proporções em que os mesmos são adicionados para compor as blendas. Ou seja, a
solução polimérica e suas propriedades. Assim, os resultados das análises por MEV apresentados
na figura 4.15 apenas confirmaram que, em linhas gerais, a morfologia das fibras pode ser
modificada, otimizando-se as condições do processo de eletrofiação; tais como, distância da
ponta do capilar ao coletor, voltagem aplicada fluxo de alimentação, diâmetro interno,
comprimento do capilar, qualidade e design do equipamento etc. Entretanto, neste sistema
verificou-se que a solução foi o fator determinante para se obter, ou não, fibras com poucos ou
nenhum defeito. Quanto aos dois solventes utilizados para dissolver a quitosana, ou seja, 10 ou
90% (v/v) de acido acético em água, observou-se pelas imagens de MEV, que as fibras obtidas
mostraram-se mais homogêneas no experimento nº 3 (solv. 10% HAc.) do que no experimento
nº8 (solv. 90% HAc.). Segundo a literatura, soluções aquosas de ácido acético glacial usadas
como solvente para a quitosana, quando utilizadas em concentrações elevadas deste ácido, até
90% (v/v), favorecem a eletrofiação devido ao aumento da condutividade elétrica do sistema
(GENG et al., 2005). Por outro lado, SON et al. (2005), em seu estudo sobre o efeito do pH na
eletrofiação de PVA puro em solução, relatou não ter conseguido fibras livres de defeitos em pH
ácido devido à protonação do PVA. Neste trabalho, as blendas de PVA/QUIT sob condições
76
ácidas produziram fibras sem defeitos, abrindo caminho para futuras investigações; entretanto, as
baixas concentrações de quitosana na membrana final desqualificam este sistema para os
objetivos específicos deste trabalho, sendo o mesmo desconsiderado por hora.
Ainda neste sistema, o planejamento fatorial de um quarto, embora seja uma
metodologia empírica, e não se tenha conseguido dados numéricos para serem processados no
software utilizado, ele mostrou eficiência no que tange a selecionar os fatores mais significativos
envolvidos no sistema em estudo.
4.4 – Avaliação da Biocompatibilidade – Membrana 80% quitosana/20% PEO
Entre as blendas de quitosana/PEO que apresentaram boas condições de processamento,
a formulação 4B foi preferencialmente utilizada para dar continuidade aos trabalhos devido ao
seu conteúdo de quitosana 4 vezes maior em relação ao PEO. Tal fato se traduz em propriedades
mais adequadas dessa blenda para futura utilização em suportes (scaffolds) para regeneração de
tecidos, onde a pronta dissolução em água do PEO pode não ser desejada (BHATTARAI et al.,
2005). Embora o PEO seja um polímero biocompatível, amplamente aceito para outras aplicações
nas áreas médica e farmacológica, este não possui as propriedades antimicrobianas da quitosana,
o que denota a importância desta blenda onde a quitosana se torna um polímero natural funcional,
além de outras características desejadas.
4.4.1 – Citotoxicidade in vitro.
Na figura 4.16, encontram-se fotos de um dos testes realizados em linhagem celular
HEp-2 (tumor de laringe humana). Em 4.16a, temos a foto do teste feito com amostra da
membrana nanoestruturada na proporção 80%QUIT/20%PEO; em 4.16b com o controle positivo
(látex) e finalmente em 4.16c com o controle negativo (papel de filtro). Observou-se a formação
de halo apenas ao redor do controle positivo (seta), demonstrando que as amostras
nanoestruturadas de quitosana não são tóxicas para este tipo de célula.
77
a
A
b
b
b
b
c
Figura 4.16: Fotografia digital das placas de Petri contendo a linhagem celular HEp-2 (tumor de
laringe humana): (a) com amostra da membrana nanoestruturada de quitosana; (b) com controle
positivo (látex); (c) com controle negativo (papel de filtro). A formação de halo em (b) encontrase indicada por uma seta.
a
b
c
c
Figura 4.17: Fotografia digital das placas de Petri contendo a linhagem celular Vero (células
renais de macaco verde africano): (a) com amostra da membrana nanoestruturada de quitosana;
(b) com controle positivo (látex); (c) com controle negativo (papel de filtro). A formação de halo
em (b) encontra-se indicada por uma seta.
Na figura 4.17, fotos de um dos testes realizados em linhagem celular Vero (células
renais de macaco verde africano) podem ser observadas. Em 4.17a, com amostra da membrana
nanoestruturada de 80%QUIT/20%PEO; em 4.17b com o controle positivo (látex) e finalmente
em 4.17c com o controle negativo (papel de filtro). Também com esta linhagem a formação de
78
halo foi observada apenas ao redor do controle positivo (seta), demonstrando que as amostras
nanoestruturadas de quitosana não são citotóxicas para a linhagem celular Vero. Finalmente, a
figura 4.18 mostra fotos de teste realizado em linhagem McCoy (fibroblastos de camundongos).
Similar às anteriores, a não citotoxicidade da membrana pode ser observada.
a
b
c
Figura 4.18. Fotografia digital das placas de Petri contendo a linhagem celular McCoy
(fibroblastos de camundongos): (a) com amostra da membrana nanoestruturada de quitosana; (b)
com controle positivo (látex); (c) com controle negativo (papel de filtro). A formação de halo em
(b) encontra-se indicada por uma seta.
Em vista dos resultados apresentados, cujos testes foram realizados em triplicata e com
três linhagens celulares diferentes, as membranas resultantes da eletrofiação da blenda 4B com
80% quitosana em sua composição final, foram consideradas não citotóxicas e aptas para serem
testadas in vivo.
4.4.2 – Biocompatibilidade in vivo
Conforme proposto na metodologia, no momento da retirada dos implantes, foi
verificada a ocorrência de aderência do material implantado com o tecido subjacente.
Analisando-se a tabela 4.6 verifica-se que em relação aos grupos G1, G2, com a retirada dos
implantes aos sete e 15 dias após serem colocados, houve pouca aderência, com grau mínimo de
liberação em relação aos tecidos. Das seis amostras dos implantes retiradas aos sete dias (G1),
cinco apresentaram grau de aderência mínima e uma moderada. Aos quinze dias (G2) o quadro
79
não apresentou alterações em relação ao grau de aderência. Na retirada dos implantes do grupo
G3, verificou-se diminuição considerável da quantidade de material e até mesmo degradação
completa, em virtude da biodegradação que a quitosana sofre em contato com tecidos animais; a
aderência foi mínima em todas as amostras.
Tabela 4.6 – Avaliação da ocorrência e grau de aderência do material implantado e tecidos
subjacentes para os grupos G1, G2 e G3.
Escore
G1
(sete dias)
G2
(15 dias)
G3
(30 dias)
+
5
5
6
1
1
0
0
0
0
(mínima)
++
(moderada)
+++
(máxima)
Na análise histomorfométrica, o primeiro evento usualmente verificado é a invasão por
neutrófilos (polimorfonucleares) e linfócitos (mononucleares) para se avaliar a intensidade do
processo inflamatório. Foi atribuída a cada uma das variáveis uma avaliação de 0 a 5, zero para a
não ocorrência e cinco para ocorrências altas (0/5 a 5/5) e, ao invés de decimais utilizou-se o
sinal (+). Quando há uma agressão ou invasão do organismo por corpo estranho (implante, por
exemplo), o organismo inicia uma defesa inespecífica, sempre com o mesmo padrão: ataque por
células (neutrófilos), as quais combatem o invasor e morrem juntamente com o mesmo.
No exame das amostras, aos sete dias, como esperado, observou-se o predomínio de
polimorfonucleados, em media 2+/5, (em uma avaliação de zero a cinco) bem como quantidade
moderada de linfócitos, em media 1+/5, (figura 4.19a e 4.19b). Ambas as classes de células
estavam em maior concentração na interface do material e tecido adjacente e não no interior do
implante.
80
Figura 4.19: (a) e (b) Amostras retiradas aos sete dias pós-implante com aumentos de 200 e 400
vezes, respectivamente, e coloração Tricrômica. Evidencia-se o processo inflamatório, com
predominante invasão de neutrófilos (setas finas) e presença de alguns linfócitos (seta mais
espessa), ambos os tipos predominantemente ao redor do implante. No emaranhado azul mais
claro, melhor observado na parte esquerda de (a), são fibras de colágeno, constituintes do tecido.
Houve diferença significativa da quantidade de polimorfonucleares (neutrófilos) e de
linfócitos nos diferentes momentos do experimento. A quantidade de neutrófilos diminuiu (em
media 1+/5), enquanto a quantidade de linfócitos aumentou (em media 2+/5). A linfocitose teve
aumento significativo aos 15 dias pós-implante, no entanto decresceu com o passar do tempo,
pois a degradação do material foi intensa. Aos 30, 45 e 60 dias, pós-implante, o material havia
sido degradado completamente, ficando evidente a interface biomaterial/tecido adjacente,
formada por uma pequena cápsula de tecido conjuntivo, figura 4.20 (a).
Em relação aos macrófagos, que são células que fogocitam o implante, observou-se aos
sete dias moderada concentração (em media 0+/5), que tendeu a aumentar aos 15 dias (em media
1+/5), porem não houve diferença significativa. A partir dos 30 dias houve diminuição
significativa da quantidade de macrófagos, no entanto o material já havia sofrido degradação
total.
A contagem de fibroblastos mostrou que aos sete dias havia discreta presença ao redor
do implante (em media 0+/5). No entanto essa quantidade aumentou significativamente a partir
dos 15 dias (em media 2+/5), tendo sua maior quantidade aos 30 dias pós-implantação (em media
3+/5). Aos 45 e 60 dias o processo cicatricial estava resolvido, não havendo diferença na
quantidade de fibroblastos.
81
Verificou-se intensa neovascularização ao redor de todos os implantes em quantidades
muito pouco variáveis em função do tempo de retirada dos mesmos.
Em relação à degradação do material, observou-se clara diminuição da massa, tanto no
interior quanto na periferia da amostra, nos primeiros sete dias pós-implantação, que se acentuou
ate a completa degradação do material com o passar do tempo de implantação. A figura 4.20 b
exibe fragmentos da membrana em processo avançado de degradação após 15 dias de implante.
Figura 4.20: Em (a) observa-se com aumento de 200 vezes e coloração H.E, a interface formada
pela fibrose, separando o tecido adjacente do material implantado. O material foi degradado,
restando somente o tecido fibroso (setas). Em (b) observa-se, com aumento de 400 vezes e
coloração H.E, o material aos quinze dias pós-implante, sofrendo intensa degradação. As setas
mostram fragmentos da membrana.
A verificação de metaplasia na região de implante não apresentou resultado significativo
de alterações celulares.
Não houve óbito de nenhum animal durante o procedimento de implantação e nem
durante o período pós-cirúrgico, até a retirada do implante.
A ocorrência de aderências na interface material e tecidos adjacentes foi mínima,
demonstrando que o material não estimula reações orgânicas de rejeição aguda sugerindo a
habilitação do mesmo para futuros estudos/aplicações. Pelo experimento, pode-se concluir que a
membrana é biocompatível, pois embora o processo inflamatório observado tenha sido agudo, o
mesmo é considerado normal. Além disso, mostrou-se decrescente em função do tempo, não
82
havendo persistência do mesmo, embora isso possa ser atribuído à degradação do material e
consequente diminuição da massa e superfície de exposição aos tecidos adjacentes.
4.4.3. – Estudo do crescimento e adesão celular: membranas 80%QUIT/20%PEO
Os resultados dos ensaios de crescimento e proliferação celular são mostrados na tabela
4.7 e ilustrados nas figuras 4.21, 4.22 e 4.23. Os valores que constam na tabela 4.7 foram obtidos
com a utilização da câmara de contagem Neubauer e são médias de três ensaios paralelos.
Tabela 4.7 – Número médio de células viáveis e não viáveis
Amostras
Contagem 24h
Viáveis
casting
Controle (poliestireno)
Contagem 72h
Não viáveis
Viáveis
Não viáveis
Viáveis
Não viáveis
0,1 x 104
3,0 x 104
zero
4,2 x 104
0,1 x 104
1,5 x 104
zero
2,6 x 104
(0,03) x 104
3,8 x 104
0,1 x 104
1,6 x 104
zero
5,1 x 104
0,1 x 104
6,3 x 104
0,1 x 104
Eletrofiada 1,6 x 104
Membrana
Blenda 4B
Contagem 48h
Figura 4.21: Número de células viáveis e não viáveis após 24, 48 e 72 hs, em membrana
eletrofiada a partir da blenda 4B. As barras de erros representam os desvios padrões.
83
Figura 4.22: Número de células viáveis e não viáveis após 24, 48 e 72 hs, em amostra de
membrana preparada por casting a partir da solução blenda 4B. As barras de erros representam os
desvios padrões.
Figura 4.23: Número de células viáveis e não viáveis em controle de poliestireno As barras de
erros representam os desvios padrões.
Os dados apresentados claramente demonstram a biocompatibilidade das membranas
obtidas a partir da blenda 4B. Para fins comparativos, estas membranas foram preparadas por
eletrofiação e por casting, para que se possa inequivocamente avaliar não só a biocompatibilidade
da membrana eletrofiada, mas também o efeito da morfologia nanoestruturada na adesão e
crescimento celular. A adesão celular da membrana eletrofiada (amostra após 72 horas de
cultivo) foi confirmada por análise de MEV (fig. 4.24). Não foi possível, porém, obter-se
imagens de MEV da membrana (casting). As amostras de ambos os tipos de membrana
mostraram sensibilidade ao meio de cultura e ofereceram dificuldades para serem retiradas do
84
mesmo após 72 horas de cultivos. No caso da membrana (casting) não foi possível retirá-la para
posterior análise de MEV. Quanto à membrana eletrofiada, embora mais resistente, esta, passou
com grande dificuldade nos preparos rotineiros necessários para a submissão à MEV. Os ganhos
observados, no crescimento celular na mesma em relação à membrana (casting), foram pequenos,
um tratamento estatístico dos dados experimentais foi utilizado na avaliação da significância dos
mesmos. Assim, o cálculo de t (de Student), para comparação de duas médias experimentais
(SKOOG, et al 2005), foi empregado no tratamento dos dados de crescimento celular sobre
ambos os tipos de membranas (contagem após 72 horas). O valor de t calculado (tcal = 1,61) foi
menor que o valor de t tabelado para os níveis de confiança de 95% (ttab = 2,78), bem como de
90% (ttab = 2,13) sendo, entretanto, maior do que o valor de t tabelado para o nível de confiança
de 80% (ttab = 1,53). Desta forma, pôde-se conclui que houve ganhos, ao nível de confiança de
80%, no crescimento celular com o emprego da membrana eletrofiada em relação à membrana
(casting) para a linhagem estudada.
Devido provavelmente à alta orientação das cadeias moleculares alcançada durante a
trajetória do jato e formação das fibras, a membrana eletrofiada mostrou resistência superior ao
meio de cultura. Observando-se ainda o aspecto macroscópico dos dois tipos de membrana, a
eletrofiada macia e delicada enquanto que a por casting apresentando o aspecto de um plástico
comum, é inferível que tais propriedades (maior maciez e resistência ao meio de cultura) podem
ser úteis para aplicação na liberação controlada de fármacos.
Figura 4.24: Imagens de MEV das células pré-osteoblasticas da linhagem MC373 após 72 horas
de cultivo, à direita na membrana blenda com 80% de quitosana e 20% de PEO, à esquerda, sobre
o controle (vidro).
85
4.5 – Nanocompósitos de quitosana/PEO e nanopartículas de Prata (AgNPs)
As imagens das fibras obtidas por eletrofiação da solução blenda de Quitosana/PEO com
a adição AgNPs podem ser observadas na figura 4.25. A adição da suspensão de prata (em meio
aquoso) à solução blenda de Quitosana/PEO, em nada prejudicou o processo da eletrofiação, que
ocorreu de maneira fácil e continua depositando fibras no alvo (coletor) e no entorno.
Figura 4.25: (a) Imagem de MEV com magnificação de 10.0000 vezes; (b) imagem de
MEV/FEG com magnificação de 600.000 vezes de fibra da mesma membrana, produzida a partir
de solução blenda de quitosana/ PE0 na presença de AgNPs.
A morfologia da membrana nanoestruturada de quitosana/PE0 na presença de AgNPs,
produzida com distância de 13 cm (ponta do capilar ao coletor) e voltagem aplicada de 20 kV,
obtida por MEV com magnificação de 10.000 vezes, é mostrada na figura 4.25a. Esta imagem
permite dizer que os diâmetros das fibras estão na ordem do nano e menores que 1 µm. A
imagem em 4.25 b, de uma fibra isolada da mesma membrana obtida por MEV/FEG com
magnificação de 600.000 vezes, confirma a formação do nanocompósito. Na figura 4.26, esta
mesma imagem é contrastada diretamente com a imagem das AgNPs em meio aquoso, tendo a
mesma sido ampliada para facilitar a visualização.
Estas imagens, com aumentos de 500.000 e 600.000x respectivamente, mas ambas
balizadas pela escala de 100 nanômetros, mostram claramente a formação de nanocompósito de
AgNPs com blenda de polímeros biocompatíveis e bioabsorvíveis ou seja , quitosana e poli(óxido
de etileno).
86
a
b
Figura 4.26: a) Imagem obtida por MEV/FEG de AgNPs com magnificação de 500. 000x; b)
imagem de MEV/FEG de uma fibra isolada, blenda 80 Quit/ 20% PEO com incorporação de
AgNPs, na qual a presença das AgNPs pode ser observada.
(Em (a) foto gentilmente cedida por Karen Segala e Déborah C. Cruz pesquisadoras do
Laboratório de Biomateriais da FEQ/UNICAMP)
87
4.6 – Incorporação de digluconato de clorexidina – membranas de QUIT/PEO
A adição do fármaco digluconato de clorexidina quando da preparação da solução
blenda, no teor em que foi adicionado, não interferiu negativamente no processo. A eletrofiação
da mesma ocorreu normalmente, sendo que o processo manteve-se constante durante todo o
período de processamento, já indicando que os 33,3 % do fármaco haviam sido incorporados
favoravelmente. Isto foi confirmado pelas imagens de MEV as quais podem ser visualisadas na
figura 4.27.
Figura 4.27: Imagens de MEV da membrana da blenda QUIT/PEO com 33% do fármaco
digluconato de clorexidina, com magnificações: a) 1.000; b) 10.000; c) 20.000 e e) 30.000 vezes.
88
Estas imagens (fig. 4.27) foram obtidas com magnificações 1.000x, 10.000x, 20.000 e
30.000x respectivamente e exibem amostras cuja morfologia apresenta baixo número de defeitos
e com os diâmetros das fibras oscilando entre as escalas nanométrica e submícrométrica,
fortemente sugerindo que o fármaco foi incorporado com sucesso, o que foi confirmado pela
presença de pico de cloro (fig. 4.28) na análise de espectroscopia de energia dispersiva (EDS).
Figura 4.28: Espectro obtido por EDS de amostra de membrana de Quitosana /PEO com digluconato de
clorexidina incorporado.
89
A técnica EDS apresenta limitações não detectando elementos com baixo número
atômico (baixo Z) e os resultados obtidos pela mesma são, normalmente, considerados semiquantitativos para os elementos não metálicos. Entretanto, após os devidos cálculos, o resultado
percentual do teor de cloro (calculado em porcentagem atômica dos picos apresentados), sendo
este média de 10 medidas tomadas em diferentes pontos da amostra, 2,89% ± 0,33, mostrou boa
concordância com o teor de cloro esperado na membrana final, após a incorporação do
digluconato de clorexidina, calculado por estequiometria (2,63%).
Ensaios biológicos – Avaliação da atividade antimicrobiana
As medidas dos halos formados durante o período em que corpos de prova foram
submetidos aos ensaios biológicos estão sumarizadas na tabela 4.8. As dimensões destes halos
foram utilizadas para a avaliação da atividade antimicrobiana da blenda de QUIT/PEO, após a
incorporação do digluconato de clorexidina. As fotos dos experimentos nas placas de Petri
mostram halos, para cada tipo de micro-organismo utilizado, (figuras 4.29 para Escherichia coli,
4.30 para Staphylococcus aureus e 4.31 para Candida albicans) na presença das membranas de
quitosana/PEO com a clorexidina incorporada. A título de comparação, testes em branco (discos
de membrana com a mesma formulação sem incorporação de clorexidina) foram utilizados como
controle.
Tabela 4.8 – Medidas dos tamanhos dos halos formados nos ensaios de avaliação da atividade
antimicrobiana da blenda nanoestruturada de quitosana/PEO com clorexidina incorporada.
Tipo de
Denominação
Halo (mm)
micro-organismo
Bactéria Gram-negativa
Escherichia coli ATCC 25922
Bactéria Gram-positiva
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Fungo
Candida albicans ATCC 10231
90
23,19
23,05
22,14
28,19
26,61
27,30
26,03
25,26
25,38
Figura 4.29: Halos formados pelos micro-organismos da bactéria Escherichia coli durante o teste
de avaliação antimicrobiana da membrana nanoestruturada de QUIT/PEO com clorexidina
incorporada. ( ) Observa-se também a formação de halos de inibição para o teste branco.
Figura 4.30: Halos formados pelos micro-organismos da bactéria Staphylococcus aureus levados
à lise durante o teste de avaliação antimicrobiana da membrana nanoestruturada de QUIT/PEO
com clorexidina incorporada. ( ) Observa-se também a formação de halos de inibição para o
teste branco.
Figura 4.31: Halos formados pelos micro-organismos do fungo Candida albicans levados à lise
durante o teste de avaliação antimicrobiana da membrana nanoestruturada de QUIT/PEO com
clorexidina incorporada. ( ) Observa-se também a formação de halos de inibição para o teste
branco.
91
As dimensões dos halos obtidos não deixam dúvidas sobre a atividade antimicrobiana
das membranas de Quitosana/PEO com incorporação de 33,3% de digluconato de clorexidina,
sugerindo que as mesmas são excelentes carreadores para este fármaco. Embora aparentemente a
concentração de digluconato de clorexidina seja alta (33,3%) as membranas nanoestruturadas são
levíssimas e os corpos de prova testados pesavam em torno de 3 mg.
Observou-se também a formação de halos de inibição para os testes brancos de todos os
micro-organismos testados; porém, estes em dimensões bem menores, apenas sobre o corpo de
prova da membrana de 80% Quit/20% PEO o que, como esperado, comprova a ação
antimicrobiana da mesma.
92
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
5.1 – Conclusões
Parte relevante deste trabalho foi a montagem de um equipamento simples, a custo
relativamente baixo, para desenvolver a eletrofiação em laboratório. O equipamento, empregando
apenas componentes básicos, (fonte de alta tensão, seringa com agulha em inox e placa metálica
aterrada) foi capaz de produzir nanofibras através da metodologia que emprega cargas
eletrostáticas para produzir fibras com diâmetros na ordem do nanômetro ou submicro, ou seja,
pelo processo da eletrofiação (electrospinning).
Utilizando-se apenas este equipamento básico, foi possível obter membranas com boa
formação e alto percentual (80%) do polímero de origem natural “quitosana” (fig. 4.02b e 4.02c).
O acoplamento de dispositivos rotativos a este equipamento possibilitou a obtenção de
membranas com aspecto mais consistente (fig. 4.03a), bem como permitiu obter outras
geometrias (fig. 4.03b, c, d).
Pelas imagens de MEV pôde-se confirmar a morfologia nanoestruturada das membranas
(fig.4.05 e 4.07), cujos aspectos, foram o de membranas altamente porosas o que foi confirmado
empregando-se metodologia de intrusão líquida. Como já discutido, a introdução de dispositivo
rotativo, na velocidade utilizada, não diminuiu o diâmetro das fibras obtidas.
A caracterização de soluções e blendas em solução, estrategicamente selecionadas, nos
permitiu concluir, que no sistema em estudo, com o equipamento utilizado, o favorecimento do
processo da eletrofiação, pela adição (às soluções de quitosana) do PEO, bem como do NaCl,
pode ser atribuído ao aumento da condutividade elétrica e simultânea queda da viscosidade das
soluções, mantendo-se o nível da concentração total de polímeros. Quando se partiu da solução
de quitosana com concentração mais elevada (6%), também a queda da tensão superficial foi
decisiva para a viabilidade do processo, sendo que só as formulações 6C e 6D (com sal e sem sal
respectivamente) foram capazes de produzir fibras com níveis de defeitos aceitáveis. Entre as
formulações que produziram fibras com grau de defeitos aceitáveis a blenda 4B foi
preferencialmente utilizada na obtenção das membranas devido ao elevado teor de quitosana nas
membranas resultantes (80%).
93
A utilização de PVA, como um facilitador da eletrofiação das soluções de quitosana,
nesta fase do trabalho já se podendo contar com uma bomba de infusão para controlar o fluxo de
alimentação da solução no processo da eletrofiação, embora tenha produzido fibras livres de
defeitos, mostrou-se insatisfatória para a finalidade específica dos objetivos deste trabalho. Além
de diâmetros de fibras mais elevados, percentuais muito baixos de quitosana, nas composições
finais das membranas formadas, foram fatores decisivos para que o PEO e não PVA fosse o
facilitador de eletrofiação utilizado para a continuidade das pesquisas.
Assim termogramas da TGA e da DSC do PEO e da quitosana puros, como recebidos e
utilizados, contrastados com os das membranas provenientes das formulações 4B e, 4B e 6C,
respectivamente, revelaram que a interferência da formação das blendas e do processo da
eletrofiação, embora observada, foi pequena não descaracterizando as propriedades térmicas
originais dos dois componentes.
No prosseguimento do presente trabalho, em parceria com outros pesquisadores, testes
de citotoxicidade, adesão e crescimento celular (in vitro), bem como de biocompatibilidade (in
vivo) foram conduzidos, sempre utilizando membranas provenientes da eletrofiação da
formulação 4B (80% QUIT/20%PEO). Estes testes, como esperado, apresentaram resultados
satisfatórios encorajando a continuidade da presente pesquisa. Porquanto, ainda em parceria com
outros pesquisadores, deu-se prosseguimento à incorporação de princípios ativos, assim AgNPs e
digluconato de clorexidina foram incorporados, já nas soluções a serem eletrofiadas, ambos os
princípios agiram como eletrólitos facilitando a eletrofiação das respectivas soluções. As
nanopartículas de prata homogeneamente dispersas nas fibras formaram um nanocompósito (fig.
4.26b). As membranas (QUIT/PEO) mostraram-se boas carreadoras (scaffolds) para o
digluconato de clorexidina, percentagens relativamente altas (33,3%) puderam ser incorporadas e
eletrofiadas sem que isto causasse qualquer deformação nas fibras (fig. 4.27). A incorporação foi
confirmada pela presença do pico de cloro na análise de espectroscopia de energia dispersiva (fig.
4.28), bem como pelos halos formados nos ensaios biológicos, onde a atividade antimicrobiana
da clorexidina incorporada pôde ser confirmada pela lise dos micro-organismos das bactérias
Escherichia coli, da Staphylococcus aureus , bem como do fungo Candida albicans.
94
5.2 – Sugestões para trabalhos futuros
Tomando-se por base os resultados obtidos, as conclusões, bem como, o interesse
demostrado por pesquisadores de áreas correlatas neste trabalho estão apresentadas, a seguir,
algumas sugestões para trabalhos futuros.
1- Estudar em detalhes as vantagens e desvantagens do uso de misturas de quitosana de
MMw e LMw para ajustar a viscosidade das soluções blendas a serem eletrofiadas,
conservando-se as concentrações totais de polímeros nas mesmas, estudando-se
inclusive as propriedades mecânicas das blendas resultantes bem como a liberação
controlada de medicamentos sempre em comparação com as blendas originais, isto é:
com as blendas onde apenas quitosana de MMw foi utilizada. Focando-se além da
facilitação do processo e consequente facilitação da aquisição de quitosana apropriada à
eletrofiação e a destinação prática final das membranas.
2- Adquirir ou projetar equipamento de eletrofiação munido de dispositivos rotativos que
alcancem altas rotações (sem vibrações excessivas), para que se possa adequar a
velocidade dos mesmos visando à obtenção de membranas com espessuras mais
homogêneas, livres de redissoluções causadas por deposição de fibras repetidamente no
mesmo ponto.
3- Estudar a ação antimicrobiana dos nanocompósitos de AgNPs/QUIT/PEO avaliando
inclusive a mínima concentração inibitória (MCI) das AgNPs para microrganismos
como bactérias do tipo Gram-positivas, Gram-negativas e fungos.
4- Estudar a liberação controlada de fármacos utilizando as mesmas membranas produzidas
neste trabalho, determinando inclusive a curva de liberação da clorexidina no sistema
onde a atividade antimicrobiana já foi comprovada no presente trabalho.
5- Complementar o estudo das blendas de PVA/QUIT utilizando PVA de massa molecular
mais elevado e AgNPs.
6- Visando o aperfeiçoamento e facilitação do processo de eletrofiação das membranas de
QUIT/PEO, realizar estudo utilizando o planejamento fatorial de dois níveis para
95
investigar a concentração do ácido acético no solvente da quitosana no entorno inferior
dos 90%, levando-se também em conta a maior ou menor facilidade de dissolução da
quitosana.
96
CAPÍTULO 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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106
APÊNDICE A
Pgs. 107 – 115
DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS BASEADAS EM NANOFIBRAS DE
BLENDAS DE QUITOSANA/POLI(ÓXIDO DE ETILENO) PELO PROCESSO DE
ELETROFIAÇÃO
10° Congresso Brasileiro de Polímeros – 2009 – Foz do Iguaçu – PR
(apresentação oral)
107
APÊNDICE A
DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS BASEADAS EM
NANOFIBRAS DE BLENDAS DE QUITOSANA/POLI(ÓXIDO
DE ETILENO) PELO PROCESSO DE ELETROFIAÇÃO
1
2
3
1
1
Maria T. M. Bizarria , Marcos A. d’Ávila , Luiz A. F. Junior , Mathews C. S. Marques , Lucia H. I. Mei *
Departamento de Tecnologia de Polímeros – Faculdade de Engenharia Química - Universidade Estadual de
Campinas – UNICAMP, Campinas, SP
2Departamento de Engenharia de Materiais- Faculdade de Engenharia Mecânica – Universidade Estadual de
Campinas- UNICAMP, Campinas, SP
3 Testtech Laboratórios de Avaliação de conformidade – Bairro Boa Vista – Porto Alegre-RS
*[email protected]
1.
Resumo
O presente trabalho teve como foco principal a preparação e a caracterização morfológica de membranas de nanofibras
baseadas em quitosana visando aplicações na área médica e farmacológica. Foram preparadas, pelo processo de
eletrofiação (electrospinning), membranas constituídas de fibras cujos diâmetros variaram, aproximadamente, entre 50 300 nm. Para estabilização do processo foi necessária a utilização de polímeros sintéticos biocompatíveis, sendo que o
Poli(óxido de etileno) (PEO) apresentou resultados promissores. Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura
(MEV) foram utilizadas para a avaliação morfológica das membranas desenvolvidas.
Palavras-chave: Eletrofiação, nanofibras, membranas biocompatíveis, quitosana, PEO.
Development of Membranes based on Chitosan/PEO Blends Nanofibers by the Electrospinning Process
Abstract
The main focus of the present work was the preparation and morphological characterization of nanofiber membranes based
on chitosan aiming applications in medical and pharmacological areas. Membranes with diameters ranging from 50 – 300
nm were prepared by the electrospinning process. In order to stabilize the process, it was necessary to use biocompatible
synthetic polymers, where the Poly(ethylene oxide) (PEO) presented promising results. Images obtained through Scanning
Electron Microscopy (SEM) were used for the membranes morphological evaluation.
Keywords: Electrospinning, nanofibers, biocompatible membranes, chitosan, PEO.
Introdução
No campo da nanotecnologia, a obtenção de fibras com diâmetros na nanoescala de sistemas
poliméricos naturais e sintéticos vem se mostrando uma área promissora para aplicações nos setores
médicos e farmacológicos. Devido à alta razão de aspecto das nanofibras (diâmetros da ordem de 10 a
200 nm), que confere elevada área superficial e módulo, além da habilidade de se obter diversas
morfologias e geometrias, possibilitam aplicações em diversas tecnologias como filtração,
membranas multifuncionais, engenharia tecidual, recobrimento de feridas, liberação controlada de
drogas, órgãos artificiais e próteses vasculares 1-9. Com o avanço da tecnologia, novas áreas de
aplicação para nanofibras estão surgindo, incluindo-se a área de compósitos poliméricos e de
misturas/blendas de sintéticos com naturais para aplicação como, por exemplo, malhas de
polipropileno recobertas com colágeno polianiônico utilizadas para a reconstrução da parede
abdominal10.
108
APÊNDICE A
Diversas metodologias vêm sendo aplicadas para o estudo e obtenção de nanofibras. Dentre elas
destaca-se o método da eletrofiação (electrospinning), o qual é considerado um dos mais versáteis
para obtenção de nano ou submicrofibras 11. Este método foi aplicado com sucesso em uma grande
diversidade de sistemas poliméricos, onde foram obtidas nanofibras de diversas dimensões e
morfologias12. O mecanismo de produção das nanofibras por eletrofiação ocorre devido às forças
eletrostáticas que atuam na solução. O processo é iniciado quando um campo elétrico é gerado por
uma fonte de alta voltagem (5 a 20 kV) entre um ou mais capilares condutores, que sustentam a
solução polimérica, e uma base coletora aterrada.
Embora aparentemente simples, o processo requer o controle rigoroso de variáveis que são essenciais
para a obtenção de fibras nanométricas com uma boa uniformidade. Na eletrofiação de polímeros
naturais, o processo é realizado a partir de uma solução polimérica. Assim, parâmetros como
concentração de polímero, concentração de solvente, viscosidade, peso molecular, condutividade e
tensão superficial devem ser devidamente estabelecidos para o sucesso da operação. Também devem
ser considerados os parâmetros de processo como a intensidade do campo elétrico, vazão, distância
entre o capilar e a placa coletora, forma e movimento do coletor, temperatura e umidade3,8,11,14-19.
Em aplicações nas áreas médica e farmacológica, as nanofibras devem ser preparadas utilizando
polímeros biocompatíveis, que podem ser naturais ou sintéticos. Dentre os polímeros sintéticos
destacam-se o Poli (óxido de etileno) (PEO), o Poli (álcool vinílico) (PVA) e a Policaprolactona
(PCL). Dentre os polímeros naturais destacam-se a Celulose e derivados, o Poli-L-ácido lático
(PLLA), a quitina e derivados como a quitosana, dentre outros.
Quando comparadas às fibras naturais, as de origem sintética tendem a apresentar propriedades
mecânicas superiores, como a resistência à tração e o módulo. Além disso, são mais fáceis de serem
projetadas para aplicações específicas, dispensando também os complexos métodos de purificação
que acompanham as matérias primas naturais 7 . Por outro lado, embora apresentem um desafio
maior para a técnica de eletrofiação, as matérias primas naturais possuem propriedades bioativas
multifuncionais que lhes conferem desempenho superior em sistemas biológicos devido à maior
biocompatibilidade13. Portanto, esses polímeros proporcionam melhor interação com o corpo
humano, tornando-os interessantes para novas aplicações na área médica e em sistemas biológicos.
Dentre as fontes naturais pode-se citar as proteínas, como o colágeno, e os polissacarídeos,
como a quitina e seus derivados. A quitosana, que é obtida pela desacetilação total ou parcial
da quitina, apresenta-se como um material atrativo para utilização na área médica, devido a sua
2
109
APÊNDICE A
biodegradabilidade, ausência de toxicidade, efeito antifúngico, aceleração de cicatrização de
ferimentos e estimulação do sistema imunológico.
Neste trabalho são apresentados resultados da eletrofiação de blendas de quitosana/PEO em diferentes
concentrações. O equipamento de eletrofiação foi construído pelo nosso grupo de pesquisa. As fibras
obtidas foram analisadas por MEV e os resultados mostraram-se promissores para os diferentes
sistemas estudados. Pelo conhecimento de nosso grupo, não foram encontradas publicações de
trabalhos que utilizam esta técnica para produzir nanofibras de quitosana no Brasil.
Objetivos
O objetivo deste trabalho foi preparar membranas baseadas em blendas de quitosana e PEO em
diferentes concentrações por eletrofiação e avaliar sua morfologia através de MEV.
Experimental
Materiais
Foi utilizada quitosana de médio peso molecular com grau de desacetilação de 80% e viscosidade de
284 cps (em solução de 1% em acido acético) adquirida da Aldrich. O solvente utilizado foi o ácido
acético glacial PA-ACS obtido da Synth. O poli(óxido de etileno) com peso molecular 900.000g/mol,
também foi adquirido da Aldrich. Todos os materiais foram utilizados como recebidos
Adicionalmente, foi utilizada água deionizada para compor o sistema de solventes.
Equipamento
O instrumental para realização do presente trabalho foi construído pelo nosso grupo de pesquisadores,
estando ainda em fase de otimização. Basicamente, ele é constituído de componentes, conforme
descrito abaixo:
- Uma fonte de alta tensão com saída regulável de maneira contínua (gera tensões de 2.000. até cerca
de 32.000 Volts). Possui proteção contra curto circuito e limitação de potência. (Vide esquema do
circuito da fonte de alta tensão utilizada, bem como a foto da mesma, nas figuras 01 e 02
respectivamente).
-Uma seringa (comum) de vidro de 10 ml, bico tipo Luer Lock, munida de agulha de aço inoxidável.
-Um eletrodo, (no caso uma pequena garra metálica para unir a saída da fonte de alta tensão à agulha)
-Uma garra de sustentação para a seringa (acoplada a um suporte de sustentação para a garra).
-Um coletor aterrado (placa de alumínio com quatro pés confeccionados com tarugo de náilon).
3
110
APÊNDICE A
Soluções de quitosana com diversas concentrações (tab.01) foram preparadas utilizando-se como
solvente uma solução aquosa de acido acético, 90% volume/volume.
Preparação das Blendas – Composição das membranas
Das soluções com 4 e 7 % (tab. 01) foram preparadas blendas de quitosana/PEO, utilizando uma
solução aquosa de PEO a 3% (peso/volume) de acordo com a tabela 02. Todas as blendas foram
preparadas com no mínimo duas horas de agitação à temperatura ambiente
4
111
APÊNDICE A
Eletrofiação das Membranas
Nesta fase exploratória da pesquisa, além de se conduzir experimentos eletrofiando (quando possível)
as soluções acima (tabs. 01 e 02) procurou-se obter o máximo de informações sobre parâmetros, tais
como: a distância entre a ponta do capilar metálico (agulha) e a placa coletora aterrada (7 a 10 cm), e
a voltagem aplicada (5, 10, 15 e 20 kV). Embora, através de utilização de concentrações variadas,
tenha se trabalhado com viscosidades diferentes, o escoamento foi, entretanto dependente de forças
gravitacionais. No processamento das membranas da série EO4 a vazão média foi de
aproximadamente 0,95 ml/h.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As imagens de MEV foram obtidas no Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração (LRAC)
da FEQ/UNICAMP em um microscópio Eletrônico de varredura mod. LEO 440i de alta resolução.
Resultados e Discussão
Nem todas as soluções de quitosana puras preparadas (tab. 01) puderam ser processadas. As soluções
mais concentradas (6 e 7%) apresentaram viscosidades muito elevadas, o que impediu o escoamento
da solução através da agulha da seringa. Por outro lado, a solução menos concentrada (1%), devido à
baixa viscosidade, apresentou gotejamento. Assim, apenas a solução com 4% de concentração
ofereceu condições de processamento para este equipamento. Embora diversas condições de
processamento com variações da carga aplicada (10, 15, 20, e 25 kV) e variações da distância (7 a 10
cm) entre a ponta da agulha e a placa coletora, tenham sido experimentadas, tal como descrito em
2008 por Klossner e colaboradores20, a solução de 4% de quitosana não foi capaz de produzir
membranas com estrutura fibrosa livre de defeitos. Para o caso do processamento das blendas de
quitosana/PEO, foram obtidos bons resultados, ou seja, foi constatada a formação de nanofibras. As
imagens de MEV (figuras 03, 04 e 05) evidenciam inequivocamente uma morfologia nanoestruturada.
5
112
APÊNDICE A
Figura 03: Imagem de MEV com magnitude de 30.000 vezes da membrana E04B (tab.02) produzida com voltagem aplicada de 20 kV e distância
(entre a extremidade da agulha e o coletor) de 7,5 cm.
Figura 04: Imagem de MEV com magnitude de 30.000 vezes da
membrana E05 (tab.02) produzida com voltagem aplicada de 20 kV e
distância (entre a extremidade da agulha e o coletor) de 9 cm.
Figura 05: Mesma membrana da figura 04, porém imagem obtida com
magnitude diferente (5.000 vezes).
Na figura 03, a imagem mostra a presença de nanofibras para a formulação E04B (ver tabela 2). Os
diâmetros de duas fibras selecionadas foram determinados com os valores de 70,8 e 121 nm. Assim,
esse resultado fornece uma estimativa do diâmetro médio das fibras, que é da ordem de 100 nm.
Pretende-se realizar medidas mais precisas a partir das imagens, a fim de se determinar o diâmetro
médio e a dispersão da distribuição de diâmetros. Esses dados serão apresentados posteriormente.
A diferença entre a composição da blenda correspondente à figura 03 e a da composição da blenda
referente às figuras 04 e 05, é praticamente inexistente. As condições de processamento, porém, não
6
113
APÊNDICE A
foram as mesmas. Embora a voltagem aplicada tenha sido a mesma, as distâncias entre a extremidade
da agulha e o coletor foram diferentes devido ao modelo de agulha usada, isto é, uma agulha de ponta
chanfrada foi utilizada para se obter a membrana E04B, enquanto que uma agulha de ponta reta foi
usada para a obtenção da membrana EO5. As consequências dessa mudança puderam ser observadas
melhor a olho nu do que nas imagens de MEV. Durante o processamento das membranas da série E04
(mais especificamente da membrana E04A) notou-se uma tendência sistemática do jato cair (ou se
encaminhar) sempre para a mesma direção. Aparentemente, formava-se um único filamento
(contínuo) que periodicamente se dividia em dois. Embora a estrutura nanométrica da membrana
tenha sido considerada razoável pelas imagens de MEV (ainda não publicadas), a formação da
membrana a olho nu revelou a falta de homogeneidade. A membrana E04B, cuja estrutura
nanométrica é mostrada na figura 03, foi processada através de um artifício, que consistiu de um
dispositivo acoplado a ponta da agulha que facilitou, em parte, o espalhamento do jato. Entretanto, o
problema só foi resolvido satisfatoriamente, quando uma agulha com ponta reta foi utilizada
(membrana E05). Isto proporcionou um espalhamento excelente e com uma boa formação da
membrana tanto no nível macroscópico como microscópico.
Conclusões e Continuidade do Trabalho
A parte relevante deste trabalho foi a montagem de um equipamento simples e relativamente barato
para desenvolver a eletrofiação em laboratório, utilizando-se recursos mínimos. O equipamento foi
montado apenas com uma fonte e uma seringa, para confeccionar nanofibras através da metodologia
que emprega cargas eletrostáticas para produzir fibras com diâmetros na ordem dos nanômetros ou
submicrons, ou seja, pelo processo da eletrofiação (electrospinning).
Obteve-se, nesta fase exploratória do trabalho, nanofibras com alto percentual do polímero de origem
natural “quitosana”, as quais estão em fase de otimização dos parâmetros da solução e do
equipamento. Pelas imagens de MEV pode-se confirmar a formação das nanofibras com a amostra
E05, cujo aspecto macroscópico foi o de uma membrana porosa. Trabalhos com outros polímeros
naturais ou biocompatíveis estão sendo desenvolvidos no momento pelo grupo, utilizando a
metodologia desenvolvida, e deverão contar com a participação de outros pesquisadores.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Profª Dra. Rosário E. S. Bretas e seu aluno Matheus B. Souza, do DEMaUFSCar, que possibilitaram um primeiro contato com um equipamento de eletrofiação, desenvolvido
pelo seu grupo e ao CNPq. pelo suporte financeiro (bolsa – p. 140146/2008-3).
7
114
APÊNDICE A
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2953.
8
115
APÊNDICE B
GLOSSÁRIO
Azul de Tripano
O azul de tripano, ou benzamine blue, é um corante de exclusão que
(C34H24N6Na4O14S4) apenas entra em células permeabilizadas (inviáveis). Após a entrada na
célula, atravessa o invólucro nuclear e acaba por se localizar nos núcleos,
que ficam corados de azul.
Ce (concentração de Emaranhamento: É a fronteira entre o regime semidiluído onde as cadeias
entrelaçamento)
poliméricas se sobrepõem, umas as outras, mas não estão emaranhadas e o
regime semidiluído onde as cadeias poliméricas significativamente se
sobrepõem umas as outras restringindo mutuamente seus movimentos.
Cacodilato de sódio
Dimetilarsenato de sódio
Confluência
Confluência celular: substrato integralmente forrado por células.
Diafanização
Após a desidratação em álcool dos tecidos, a diafanização consiste na
infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo
solvente do álcool (desalcolizante). O xilol é comumente utilizado.
Fagocitose
Fagocitose é o englobamento e digestão de partículas sólidas e
microorganismos por fagócitos (leucócitos).
Formalina
Formalina é uma mistura de gás formol com água. Formalina, geralmente,
é uma concentração a 37%.
Histologia
Estudo dos tecidos biológicos
Histometria
Histometria estudo de alterações patológicas baseadas no grau de lesão
tecidual.
HEp-2
Linhagem celular referente a células de tumor de laringe humana
Linfocitose
É um aumento do número de linfocitos no sangue (glóbulos brancos).
Linhagem celular
Chama-se cultura celular à cultura in vitro de células de um tecido.
Quando essas células são cultivadas sucessivamente, temos uma linhagem
celular.
Lise celular
Destruição celular por ruptura ou dissolução da membrana celular.
Macrófagos
Macrófagos são células de grandes dimensões do tecido conjuntivo, ricos
em lisossomos, que fagocitam elementos estranhos ao corpo.
116
APÊNDICE B
McCoy
A linhagem de células McCoy é originada de fibroblastos de tumor de
camundongo.
Mupirocina.
Pomada dermatológica (antibiótico)
Neovascularização
Processo patológico constituído por proliferação de vasos sangüíneos em
tecidos ou posições anormais.
Osteóide
Porção orgânica, não mineralizada, da matriz do osso que se forma antes
da maturação do tecido ósseo.
PBS
Tampão: fosfato básico salino (62 mM NaCl, 2mM KCl, 0,9 mM CaCl2,
0,5 mM MgCl2 8 mM NaH2PO4, 8mM KH2PO4)
Peritônio
É uma membrana serosa, a maior do corpo, com duas camadas (parietal e
visceral) que cobre as paredes abdominais.
Tricotomia
Retirada dos pelos
Tripsinização
Processo de resuspender células aderidas ao substrato (placas e frascos de
cultivo) empregando-se, após a troca do meio, tripsina 0,01 a 0,5% diluída
em solução salina tamponada (PBS), e mantendo as mesmas em estufa a
37ºC durante 5 a 15 minutos.
mRNA
O mRNA é um dos tipos de RNA (ácido ribonucleico). Os RNA existem
na célula como produtos diretos de genes e apresentam uma estrutura
primária semelhante a do DNA. O mRNA é o RNA mensageiro (o mesmo
guarda informações que posteriormente serão traduzidas em uma
proteína).
Histopatológica
Do grego, (histo = tecido celular; pathos = doença; logia = estudo)
histopatologia e o estudo de como uma doença específica afeta um
conjunto de células.
Metaplasia
Metaplasia é uma alteração reversível quando uma célula adulta, seja
epitelial ou mesenquimal, é substituída por outra de outro tipo celular.
Pode ser interpretado como uma tentativa do organismo de substituir um
tipo celular exposto a um estresse a um tipo celular mais apto a suportá-lo.
Neutrófilos
São leucócitos polimorfonucleados e são um dos 5 principais tipos de
leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos e linfócitos); são
os primeiros a chegar às áreas de inflamação
Vero
Linhagem celular referente a células de rim de macaco verde africano
Via intraperitoneal
Infusão ou injeção na cavidade peritoneal
117

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