projeto PESQUISA BIOTECKMinisterio da Saude

Dados do projeto
Título: Desenvolvimento de biomateriais e estudo de marcadores moleculares para seleção
de células-tronco adultas com potencial osteogênico para terapia celular
Instituição: Instituto de Biociências (I.B.), Universidade de São Paulo (USP)
Unidade: Departamento de Genética e Biologia Evolutiva
Dados do pesquisador candidato
Nome e titulação: Roberto Dalto Fanganiello, Bacharel em Ciências Biológicas pelo Instituto de
Biociências, Universidade de São Paulo. Doutorando do programa de Doutorado Direto em
Biologia/Genética do Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo com período
sanduíche no Departamento de Ortopedia e Reabilitação da Universidade de Yale, Connecticut,
EUA. A conclusão do doutorado está prevista para outubro de 2009.
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
acesso):
http://lattes.cnpq.br/0863279559059369
Endereço residencial: Rua Dr. Melo Alves, 265, apto 113, Cerqueira Cesar. CEP: 01417-010
Telefone residencial: 11 + 30851349
Endereço profissional: Rua do Matão, 277, sala 200, Cidade Universitária, Butantã. CEP:
05508-090
Telefone profissional: 11 + 3091 9910
Telefone celular: 11 + 6665 0009
1 Fax: 11 + 3091 7966 ramal 29
e-mail: [email protected]
Dados do preceptor
Nome, titulação e vínculo com a IES: Professora Doutora Maria Rita dos Santos e PassosBueno, Professora Titular do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo, Coordenadora de Transferência de Tecnologia do
Centro de Estudos do Genoma Humano (CEPID / FAPESP), Bacharel em Ciências Biológicas
pelo Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, Doutora em Biologia / Genética pelo
Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, Pós-Doutorado pela Universidade de
Oxford, Bolsista de produtividade em pesquisa do CNPq – nível 1A.
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
acesso):
http://lattes.cnpq.br/4063718580685742
Endereço profissional: Rua do Matão, 277, sala 200, Cidade Universitária, Butantã. CEP:
05508-090
Telefone profissional: 11 + 3091 9910
Fax: 11 + 3091 7966 ramal 29
e-mail: [email protected]
2 Introdução e eixos temáticos
A maioria dos procedimentos cirúrgicos voltados a reconstrução crânio-maxilo-facial são
feitos para a substituição de tecido ósseo danificado ou para a construção de estruturas
esqueléticas perdidas por motivos cirúrgicos, de trauma, de infecção, neoplásicos ou de
malformação congênita. Os métodos biológicos tradicionais regularmente empregados incluem o
transplante ósseo autólogo e o alotransplante.
O transplante autólogo é considerado o “padrão ouro” atualmente e implica na obtenção
de tecido ósseo de outras regiões que não as danificadas (sítios doadores, como crista ilíaca e
costelas). Desvantagens que permeiam este procedimento são: morbidade e quantidade
significativa de dor e hematoma no sítio doador, quantidade limitante de osso proveniente de
sítios doadores, possibilidade de incompatibilidade anatômica, estrutural e de formato, o que é
particularmente importante quando tratamos do complexo craniofacial e alta reabsorção óssea
durante a cicatrização (Glowacki e Mulliken, 1985; El-Ghannam, 2004). Estas características
desfavoráveis contribuem para que sejam reportadas taxas de insucesso de até 30% associadas ao
transplante ósseo autólogo (Jackson, Helden et al., 1986; Scheller, Krebsbach et al., 2009). O
uso de alotransplante (enxerto de tecido ósseo proveniente de outros indivíduos, mantidos em
bancos de ossos) tem as desvantagens de poder suscitar reações imunológicas e risco de
transmissão de doenças, tanto virais quanto bacterianas (Buck, Malinin et al., 1989).
Além disso, temos de ressaltar que a manutenção inicial in vivo destes enxertos ósseos é
dependente de difusão de nutrientes. Dessa forma pode haver falha na integração do osso
transplantado ao sítio cirúrgico, principalmente quando tratamos de um defeito de grande
3 dimensão, além de demandarem um longo tempo de cicatrização, o que limita a projeção da
evolução clínica (Burg, Porter et al., 2000).
Pesquisas conduzidas nos Estados Unidos mostram que cerca de 500.000 a 600.000
enxertos ósseos são realizados por ano naquele país, sendo 6% de ordem craniofacial
(Greenwald, Boden et al., 2001; Eppley, Pietrzak et al., 2005). Ainda, dados do “US Health Cost
and Utilization Project” registraram 12.700 enxertos ósseos cranianos em 2001 para o reparo de
defeitos craniofaciais infantis, a um custo total de 549 milhões de dólares (Steiner, Elixhauser et
al., 2002). Pesquisas realizadas a cada cinco anos pelo “Japanese Orthopaedic Association
Committee on Tissue Transplantation and Regenerative Medicine” desde 1985 em hospitais
japoneses mostram que a cada ano há um aumento relativo do uso de substitutos ósseos
sintéticos e uma conseqüente diminuição relativa da proporção do uso de transplantes ósseos
autólogos e de alotransplantes, embora a maior parte dos transplantes ósseos ainda sejam
autólogos e alotransplantes (Urabe, Itoman et al., 2007).
O desenvolvimento de biomateriais que substituam os implantes ósseos proporcionam
vantagens fundamentalmente importantes do ponto de vista econômico, de saúde individual e de
saúde pública, tais como prevenção de cirurgias adicionais para a remoção de osso autólogo,
diminuindo expressivamente o tempo cirúrgico, prevenção de transmissão de doenças no caso de
alotransplante, prevenção de reação imunológica em alotransplantes, além de serem
extremamente úteis no caso de pacientes que não podem prover tecido ósseo em quantidade
suficiente para transplante autólogo ou de pacientes que não podem prover tecido ósseo saudável
em virtude de osteoporose (Legeros, 2002; Okuda, Ioku et al., 2007). Além disso, vantagens do
uso de material sintético com parâmetros e produção otimizados para a regeneração óssea
incluem a facilidade e o controle de sua síntese, oferta ilimitada, forma e características pré-
4 determinadas, tanto com relação à macro-estrutura (formato tridimensional, diâmetro dos poros)
quanto com relação à micro-estrutura (porosidade, interconectividade dos poros) (Behravesh,
Yasko et al., 1999; Lendlein e Langer, 2002; Gunatillake e Adhikari, 2003).
O papel do molde de biomaterial na bioengenharia de tecidos é o de funcionar como uma
matriz extracelular inicial em que as células nele aderidas cresçam e auxiliem na cicatrização/
formação do órgão ou tecido em questão (Abukawa, Papadaki et al., 2006). A configuração
geométrica específica deste molde também pode ditar a macro e a micro-estrutura do tecido a ser
gerado (Langer e Vacanti, 1993). Um molde ideal para a bioengenharia de tecido ósseo deve ser
tanto osteocondutivo, guiando a restituição óssea em local que não cicatrizaria naturalmente
(auxiliando na capilarização e invasão de células do hospedeiro), quanto osteoindutivo, tendo
habilidade de induzir a diferenciação de células pluripotentes, nele contidas ou circundantes, em
osteoblastos e osteócitos (Burg, Porter et al., 2000). De forma mais específica, um molde ideal
deve atender às seguintes necessidades:
•
Estrutura e constituição química de superfície apropriadas para facilitar a penetração,
absorção, distribuição, proliferação e diferenciação de células (Crane, Ishaug et al.,
1995; Sachlos, Reis et al., 2003)
•
Permeabilidade ao meio de cultura (Glowacki, 2001)
•
Porosidade interconectada possibilitando integração adequada com o tecido e
vascularização in vivo (Frerich, Lindemann et al., 2001; Smith, Peters et al., 2004)
•
Manutenção do fenótipo osteoblástico (Muschler, Nakamoto et al., 2004)
•
Dureza e propriedades mecânicas adequadas (Williams, Adewunmi et al., 2005)
•
Facilidade e rapidez na fabricação (Hutmacher, 2001; Abukawa, Papadaki et al., 2006)
5 Até o momento há uma miríade de moldes sintéticos desenvolvidos e testados para
regeneração óssea, tais como cerâmicas com base em fosfato ou sulfato de cálcio (Ohgushi,
Okumura et al., 1990; Yoshikawa, Ohgushi et al., 1996; Zuk, 2008) , co-polímeros de ácidos
glicólico e poli-L-láticos (Vacanti, Kim et al., 1993; Ishaug-Riley, Crane et al., 1997),
polifosfazenos (Laurencin, El-Amin et al., 1996), colágenos (Krebsbach, Kuznetsov et al., 1997)
e ligas metálicas tratadas, principalmente de titânio e tântalo (Zuk, 2008), dentre outros, mas um
molde com propriedades ótimas que cumpra todos os requisitos supracitados ainda não foi
desenvolvido. Independente do crescimento exponencial que a área de bioengenharia de tecidos
tem sofrido nos últimos 20 anos, não há dúvida de que esta não é uma tarefa trivial, uma vez que
envolve a convergência de estratégias e de tecnologias provenientes de áreas bem distintas como
biologia molecular e celular, química de polímeros, ciência dos materiais, engenharia mecânica,
ciências clínicas e genética molecular.
Cerâmicas com base em fosfato de cálcio são consideradas excelentes biomateriais, com
propriedades bioativas e osteocondutivas, uma vez que se ligam ao osso e aceleram a formação
óssea. As formas mais usadas de cerâmicas de fosfato de cálcio são as de β-tricálcio fosfato
[Ca3(PO4)2 , TCP] e de hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2, HA]. Cerâmicas de β-tricálcio fosfato
apresentam a vantagem de serem altamente bio-reabsorvíveis, porém sua atividade osteoindutiva
é limitada, ficando comumente restrita ao uso em regeneração de defeitos ósseos menores
(Anker, Holdridge et al., 2005; Komaki, Tanaka et al., 2006; Okuda, Ioku et al., 2007).
Já as cerâmicas de hidroxiapatita (HA), que já foram usadas por muitas décadas como
substitutos ósseos em defeitos mandibulares, apresentam estrutura molecular igual à fase mineral
do osso (os ossos são constituídos por aproximadamente 70% de hidroxiapatita), o que as faz
altamente osteocompatíveis (El-Ghannam, 2004; Rosso, Marino et al., 2005). Além disso, a
6 adsorção de proteínas e fatores de crescimento à superfície das cerâmicas de hidroxiapatita é um
evento de natureza eletrostática e acredita-se que os íons Ca2+ e PO43- desempenhem função de
sítios de ligação destas proteínas, o que torna estes biomateriais muito propícios para abrigarem
crescimento celular (Villarreal, Sogal et al., 1998; Zeng, Chittur et al., 1999; Rosengren,
Pavlovic et al., 2002; Rouahi, Gallet et al., 2006).
Devido ao comportamento piezelétrico exibido pelos ossos (Kon, Muraglia et al., 2000),
com a indução de tensão mecânica há a promoção de potenciais elétricos na estrutura óssea, o
que influencia diretamente a atividade de crescimento ósseo (Livingston, Ducheyne et al., 2002).
Desta maneira, a propriedade piezelétrica é fundamental para esta classe de biomateriais. O
material piezelétrico CaTiO3 é um forte candidato para formar interface entre HA e implantes de
titânio (Webster, Ergun et al., 2003), comumente utilizados em cirurgias ortopédicas. Webster et
al. (Webster, Ergun et al., 2003), a partir de testes de citocompatibilidade, verificaram que houve
um aumento da adesão de osteoblastos sobre materiais que continham CaTiO3 em relação a HA
pura. A partir dos resultados obtidos, os autores concluíram que revestimentos ortopédicos que
formam CaTiO3 podem aumentar a integração óssea com o implante, resultando em maior
adesão de osteoblastos. Ergun et al. (Ergun, Liu et al., 2007) verificaram que a adesão dos
osteoblastos para o sistema HA:CaTiO3 é 4,5 vezes maior que para a HA pura.
Um dos fatores que limitam o uso mais abrangente deste material é a baixa
osteoindutividade a ele associado e o pouco conhecimento a respeito das estratégias ideais de
síntese e de parâmetros ótimos de macro e de micro-estrutura. Embora não sejam naturalmente
osteoindutivos, podem ser combinadas a células-tronco para incorporarem potencial osteogênico
(Ohgushi, Dohi et al., 1993; Legeros, 2002).
7 Recentemente foi identificada uma enorme quantidade de fontes de onde podem ser
isoladas células-tronco adultas, dentre elas medula óssea (Friedenstein, Piatetzky et al., 1966),
tecido adiposo (Zuk, Zhu et al., 2001; Zuk, Zhu et al., 2002), músculo esquelético (Noth, Tuli et
al., 2002; Wada, Inagawa-Ogashiwa et al., 2002), músculo orbicular labial (Bueno, Kerkis et al.,
2009), músculo cardíaco (Warejcka, Harvey et al., 1996), polpa dentária (Gronthos, Mankani et
al., 2000), derme (Toma, Akhavan et al., 2001), sangue de cordão umbilical (Campagnoli,
Roberts et al., 2001), trompa de falópio (Jazedje, Perin et al., 2009) etc., sendo que duas delas
foram isoladas e identificadas neste ano por grupos de pesquisa do CEGH / USP (Bueno, Kerkis
et al., 2009; Jazedje, Perin et al., 2009). Até o momento as fontes que foram mais bem
caracterizadas quanto à possibilidade de aplicação para engenharia de tecido craniofacial são
medula óssea e tecido adiposo.
Vários estudos já constataram formação de osso a partir de células-tronco provenientes de
medula óssea (BMSCs) combinadas com moldes tridimensionais de cerâmica de hidroxiapatita
ou de hidroxiapatita associada a tricálcio-fosfato em defeitos cranianos de roedores, cães,
coelhos e ovelhas (Ohgushi, Goldberg et al., 1989; Bruder, Kraus et al., 1998; Kon, Muraglia et
al., 2000; Arinzeh, Peter et al., 2003; Ge, Baguenard et al., 2004), além de haverem sido
associadas a outros tipos de biomateriais também com finalidade de reposição de tecido ósseo
em roedores, porcos, ovelhas e cães (Krebsbach, Mankani et al., 1998) (Bidic, Calvert et al.,
2003) (Weng, Wang et al., 2006) (Shang, Wang et al., 2001), dentre outros.
Devemos, entretanto, ressaltar a existência de algumas desvantagens quanto ao uso destas
células para reconstrução de tecidos em humanos, como a dor, o estigma e a invasividade do
procedimento cirúrgico de punção associados ao acesso e à aspiração estéril da medula óssea e
8 também à pequena quantidade de células obtidas a cada coleta (1MSC / 104 – 106 células de
estroma (Kadiyala, Young et al., 1997).
Outra opção é o uso de células-tronco provenientes de tecido adiposo (AMCs), tendo em
vista tanto a relativa facilidade de obtenção destas células como produto de lipoaspiração,
principalmente em indivíduos adultos, e a grande quantidade em que podem ser obtidas, embora
possam também ser cultivadas e expandidas in vitro quando necessário (Zuk, Zhu et al., 2001;
De Ugarte, Morizono et al., 2003; Cowan, Shi et al., 2004). O potencial de ossificação in vivo
destas células foi menos estudado que o das BMSCs, mas resultados positivos foram descritos
quando AMCs foram combinadas a diversos biomateriais para testar seu potencial osteogênico
em diferentes situações, incluindo a aplicação destas células com chips ósseos de crista ilíaca
para a regeneração de defeitos calvariais em um paciente (Lee, Parrett et al., 2003) (Hicok, Du
Laney et al., 2004) (Dragoo, Choi et al., 2003; Dragoo, Lieberman et al., 2005) (Cowan, Shi et
al., 2004) (Lendeckel, Jodicke et al., 2004). Contudo, existem estudos conflitantes, onde o
potencial de ossificação das AMCs mostrou-se, como quando AMCs foram associadas a moldes
gelatinosos e implantadas em defeitos calvariais de coelhos (Dudas, Marra et al., 2006). Dessa
forma, o uso destas células associadas a biomateriais para regeneração de tecido ósseo é
promissor e ainda precisa ser melhor explorado.
Outras fontes celulares também precisam ser exploradas quanto ao potencial uso para
regeneração óssea.
Por exemplo, o uso de células-tronco de polpa de dente (DPSCs) é
interessante para reconstrução óssea uma vez que podem ser isoladas de forma fácil e por
procedimento não invasivo, principalmente no caso de dentes decíduos de indivíduos jovens,
sem a necessidade de punção medular ou de lipoaspiração. Trabalhos mostram que estas células
são de certa forma análogas a células osteogênicas, uma vez que expressam marcadores
9 osteogênicos e respondem a muitos fatores de crescimento para diferenciação osteoodontogênica (Hanks, Sun et al., 1998; Unda, Martin et al., 2000; Ueno, Kitase et al., 2001).
Além disso, DPSCs mostraram uma maior potencial proliferativo in vitro, tornando-as mais
fáceis de expansão quando comparadas a BMSCs sob as mesmas condições, o que foi atribuído a
uma maior expressão de kinase 6 dependente de ciclina, um ativador de ciclo celular (Shi, Robey
et al., 2001). Somado a isto, nosso grupo recentemente demonstrou que estas células também
tem potencial osteogênico in vivo quando associadas a uma membrana de colágeno e
implantadas em defeito crítico de ratos não imunossuprimidos (De Mendonca Costa, Bueno et
al., 2008)
Com base neste cenário geral percebemos que muitas questões ainda precisam ser
abordadas, principalmente com relação ao melhor biomaterial a ser empregado em diferentes
situações de reconstrução óssea, à caracterização e otimização do tipo ou subpopulação
celular mais eficiente para este propósito e ao melhor sistema experimental a ser usado para
testarmos a eficiência do biomaterial em questão e das células selecionadas. Além disso, é
também fundamental que entendamos quais instruções as células precisam para que se
organizem no tecido em questão e quais células devemos escolher para esta tarefa. Este controle
é complexo e envolve sinalização parácrina, autócrina e endócrina, interações na matriz celular e
contato célula-célula. Como apontado em (Scheller, Krebsbach et al., 2009) a caracterização e o
entendimento do funcionamento de cada elemento desta tríade ( células / moldes / sinais) é
fundamental para aperfeiçoarmos a regeneração e a engenharia de tecidos funcionais. Além
disso, esta abordagem tripartite é necessária para identificarmos a forma mais adequada de cada
um destes constituintes em cada caso específico de bioengenharia óssea.
10 O controle de parâmetros de macro e de micro-estrutura de biomateriais de hidroxiapatita
é possível e extremamente necessário. Por exemplo, o delineamento da porosidade (porcentagem
de poros) ótima, da distribuição de diâmetros ideais dos poros e da melhor interconectividade
destes poros é fundamental para a formação de tecido ósseo uma vez que estas variáveis
influenciam diretamente na infusão, migração e proliferação de osteoblastos e de células
mesenquimais no interior do biomaterial, assim como a vascularização do tecido neoformado.
Maior porosidade e maior tamanho de poros levam a maior formação de ossos e maior
vascularização in vivo. Entretanto, com o aumento da porosidade em biomateriais de
hidroxiapatita há a desvantagem de uma conseqüente diminuição das propriedades mecânicas do
material. (Karageorgiou e Kaplan, 2005). Dependendo do sítio ósseo a ser regenerado, isso pode
ser contornado associando proteínas como colágeno tipo 1 a este biomaterial, com o intuito de
torná-lo menos quebradiço.
Mesmo variações sutis em parâmetros como composição, topologia, rugosidade e
cristalinidade podem levar a variações significativas nas taxas de adesão e de proliferação
celular, de síntese protéica, transcrição gênica, diferenciação celular e formação de tecido
(Ohgushi, Okumura et al., 1990; Puleo, Holleran et al., 1991; James, Levene et al., 1999;
Zreiqat, Evans et al., 1999; Chou, Huang et al., 2005; Hartman, Vehof et al., 2005).
A
degradação in vivo de cerâmicas de hidroxiapatita é lenta , o que permite uma boa
osteointegração do material no sítio de interesse, proporcionando tempo suficiente para as
atividades osteocondutivas e osteoindutivas e não gerando derivados químicos indesejáveis e
desfavoráveis à atividade osteogênica na região. Além disso, a taxa desta degradação pode ser
controlada alterando parâmetros como a razão Ca2+ / PO43- e a porosidade da porção interna
(Zuk, 2008).
11 O entendimento e a caracterização do tipo celular mais apropriado a ser usado associado
ao biomaterial escolhido também é de suma importância (Caplan, 1991; Bianco e Robey, 2001;
Mao, Giannobile et al., 2006). Sabemos que independente da fonte, as populações celulares
isoladas pelos métodos usuais são heterogêneas, o que pode levar a variações em propriedades de
crescimento e osteogênese em grupos celulares da mesma fonte mas de diferentes doadores
(Phinney, Kopen et al., 1999) ou a discrepâncias entre os potenciais osteogênicos in vitro e in
vivo (Mendes, Tibbe et al., 2004). Por exemplo, pela inspeção de colônias individuais de BMSCs
nota-se uma diferença em formato e tamanho, taxas de proliferação e de crescimento, além de
poucas colônias expressarem marcadores osteogênicos iniciais, como fosfatase alcalina, ou
apresentarem alguma marcação positiva para oil red O (marcador adipogênico)(Kuznetsov,
Krebsbach et al., 1997; Derubeis e Cancedda, 2004). Ademais, estudos demonstraram que
diferentes sub-populações clonais de células BMSCs apresentam diferentes níveis de potencial
de diferenciação: poucas sub-populações clonais mostraram potencial tríplice in vitro,para
diferenciar em osteoblastos, condrócitos e adipócitos, enquanto outros grupos apresentaram
apenas potenciais condro-osteogênicos ou ainda somente potencial osteogênico (Owen e
Friedenstein, 1988; Muraglia, Cancedda et al., 2000). Ainda, foi demonstrado que somente 60%
de sub-populações clonais de BMSCs associadas a moldes de biocerâmica e implantadas de
forma subcutânea em camundongos imunocomprometidos deram origem a osso e, dentre estes,
apenas 65% diferenciaram tanto em osso quanto em estroma hematopoiético (Kuznetsov,
Krebsbach et al., 1997). Atualmente existe a possibilidade de usarmos estratégias de citometria
de fluxo para o isolamento de sub-populações celulares cada vez mais homogêneas baseando-nos
em marcadores (proteínas) de superfície celular, como seleção positiva por “microbeads”
combinados com FACS (fluorescence activated cell sorting) ou MACS (magnetic-activated cell
12 sorting) (Mao, Giannobile et al., 2006). Existe, por exemplo, a opção de selecionarmos células
STRO-1 positivas e Hoescht negativas para termos enriquecimento de células-tronco mais
primitivas, mas esta seleção não é específica para células osteogênicas e não implica que todas
tenham potencial de ossificação. Há também resultados iniciais que mostram que a os níveis de
osteocalcina secretados para o meio de cultura em condições osteoindutivas pode ser um
indicativo do potencial osteogênico de BMSCs mas, para este potencial ser acessado, é
obrigatória a etapa de diferenciação in vitro destas células (Nakamura, Dohi et al., 2009). Assim
sendo, não são conhecidos ainda quais os marcadores que poderíamos usar para filtrá-las e
selecionar as células com potencial ideal de ossificação.
Objetivos e resultados esperados
Os objetivos gerais são gerar biomateriais com base em hidroxiapatita e colágeno tipo I
que, quando associados a células tronco adultas de polpa de dente ou de tecido adiposo,
possibilitem uma reconstrução eficaz de defeitos ósseos cranianos.
Pretendemos também identificar um painel de marcadores moleculares ou celulares que
nos permitam identificar e selecionar previamente as células com
o melhor potencial
osteogênico. Temos por objetivos específicos:
I)
Encontrar parâmetros ótimos (porosidade, diâmetro e interconectividade dos
poros) do biomaterial escolhido que confiram a ele melhor osteointegração,
osteocondutividade e osteoindutividade.
13 II)
Encontrar as sub-populações celulares, provenientes de tecido adiposo ou de
polpa dentária, que apresentam os melhores potenciais osteogênicos in vitro e in
vivo (neste último caso associadas ao biomaterial).
III)
Caracterizar estas sub-populações com relação ao perfil de expressão gênica a
procura de uma assinatura de expressão que as confira identidade molecular.
IV)
Melhor elucidar o conjunto de eventos moleculares e as vias transcricionais
envolvidas com a predisposição destas células-tronco adultas à melhor
diferenciação osteogênica.
V)
Gerar um painel de marcadores moleculares que permitam selecionarmos as
células com este potencial.
Justificativa e Impacto Previsto
Para a bioengenharia de tecidos funcionais devemos prover às células (tanto contidas no
biomaterial quanto circundantes, do hospedeiro) sinais espaciais e temporais adequados que
permitam o crescimento, diferenciação e síntese de matriz extracelular em volume suficiente.
Este estudo visa, com o destino final de aplicação, identificar e entender alguns destes fatores
fundamentais para a bioengenharia de tecido ósseo da porção craniofacial, tais como sinais
envolvidos no processo de biogênese de tecido ósseo, parâmetros ideais de micro e macroestrutura do biomaterial e tipo e/ou subpopulação ideal de células com maior potencial de
ossificação.
14 As finalidades últimas deste projeto, como detalhadas na seção “objetivos e resultados
esperados”, são:
I)
Encontrar um conjunto de características ideais do biomaterial selecionado que
maximizem suas propriedades osteocondutivas e osteoindutivas;
II)
Encontrar o grupo / subpopulação celular que melhor responda à formação
óssea in vivo;
III)
Entender qual a assinatura de expressão das células com maior propensão à
ossificação;
IV)
Estabelecer uma forma de pré-seleção que otimize a ossificação in vivo.
Os intuitos são os de potencialmente gerarmos um protocolo de procedimentos ou um kit
que nos permita identificar as células com maior potencial de ossificação e usá-las, associadas ao
biomaterial desenvolvido, para regeneração óssea craniofacial.
Devemos ressaltar que, de acordo com o edital número 12/2009 Capes/MEC e
MS/SCTIE/Decit, lançado em 24/07/2009 no Diário Oficial da União, o presente projeto abrange
tanto a área de pesquisa científica quanto a de inovação tecnológica, atendendo duas linhas de
apoio para 2009: 1.2.1 – I, “Pesquisa Biomédica – Células-tronco” e 1.2.3 – I,
“Desenvolvimento de produtos industriais em saúde – Desenvolvimento de equipamentos e
materiais de uso em saúde”, envolvendo o item “implante ortopédico”, presente na lista de
produtos/materiais estratégicos definida pela Portaria MS no 978, de 16 de maio de 2008. Ainda
citando a portaria acima referida, lemos “... a balança comercial da indústria brasileira de saúde
mostra-se frágil e dependente, sem competitividade internacional expressiva, contribuindo para a
vulnerabilidade da política social, com alto grau de impacto sanitário e orçamentário para o
15 Sistema Único de Saúde”. Este é claramente o quadro que encontramos no país no que concerne
a área de biomateriais para implantes ósseos e ortopédicos. Uma simples busca, feita em
10/08/2009, na base de patentes do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI), banco
que reúne um volume aproximado de 24 milhões de documentos de patentes, dá apenas 26
resultados brasileiros para a entrada “implante ósseo” e apenas 6 resultados para a entrada
“implante ortopédico”.
Como consideração final, acreditamos também que o financiamento deste projeto é
fundamental para reforçar a estrutura e firmar os alicerces do Centro de Terapia Celular
recentemente formado, sob a coordenação da Profa Dra Maria Rita Passos-Bueno e para
podermos contribuir de forma efetiva e edificante para o crescimento desta área de bioengenharia
de tecidos, ainda emergente e pouco explorada no país.
Ações previstas (metodologia)
1)
Síntese do material biocerâmico HA:CaTiO3
1.1)
Preparo das Suspensões e Processamento
Para a obtenção do sistema HA:CaTiO3, inicialmente será utilizado o método de coprecipitação. Desta maneira serão obtidas suspensões, baseadas na hidrólise de um alcóxido ou
sal dos íons de interesse (Ca2+, P5+, Ti4+ e Eu3+). O primeiro passo é dissolver o reagente de
partida em um solvente (por exemplo, água) sob constante agitação.
16 A seguir, será adicionada ao frasco contendo os reagentes de partida uma base, tal como
NH4OH, (NH2)2CO (uréia) ou KOH, para precipitação dos respectivos cátions na forma de
hidróxidos. A escolha da base, bem como sua concentração dependerá dos resultados obtidos em
relação à formação de fase, tamanho e forma das partículas.
A mistura reacional resultante da precipitação dos hidróxidos será então transferida a uma
autoclave de teflon a ser acoplada a um forno de microondas doméstico (2.450 MHz). Este
dispositivo foi montado, tomando-se como base um forno de microondas doméstico Panasonic®,
Modelo MN-S46B, com freqüência de 2.450 MHz e 800 W de potência. Deste equipamento, a
magnétron (válvula termiônica para gerar microondas) foi desligada do controle do painel e
então ligada a um controlador externo de temperatura. Desta forma, o controle de envio de
potência à magnétron passou a ser feito pelo controlador acoplado. A célula reacional foi
construída em Teflon® (politetrafluoretileno) espesso com furos passantes para sua vedação.
Uma tampa, em aço inox, em conjunto com uma junta de silicone e a arruela inferior para os
parafusos passantes, proporciona o fechamento da célula. Uma vez que a mistura reacional
encontra-se no interior da célula, um sistema contendo uma válvula de segurança e um
manômetro com selo de diafragma fecha hermeticamente a célula reacional, deixando-a pronta
para processamento de hidrotermalização por microondas.
Durante o processamento, as microondas emitidas pela antena são espalhadas dentro da
cavidade do forno de microondas, perpassando a célula de Teflon e aquecendo a mistura
reacional em seu interior. As suspensões precursoras para os pós de interesse serão tratadas a
temperaturas de aproximadamente 140°C, em diferentes tempos e taxas de aquecimento, a fim de
verificar qual a melhor condição de tratamento para a obtenção das nano e mesopartículas
individualmente.
17 O produto final será lavado com água até o ajuste do pH da suspensão se aproximar de 7.
Posteriormente, as partículas em suspensão serão submetidas à centrifugação para remoção do
sobrenadante, secas em estufa e caracterizadas.
Em momento inicial iremos sintetizar pastilhas de HA:CaTiO3 associadas a colágeno tipo
I, com diâmetros médios de poros de 100 µm, 300 µm e 500 µm e com porosidades de 30%,
50% e 80% respectivamente. A depender do desempenho destes materiais quando acoplados a
células-tronco adultas para o fechamento de defeitos ósseos, re-avaliaremos estes parâmetros de
forma a otimizá-los.
1.2) Caracterização do biomaterial sintetizado
Após a obtenção da fase HA:CaTiO3 pelo processamento hidrotermal assistido por
microondas serão realizadas as seguintes caracterizações:
a) Difração de raios X (DRX)
Os ensaios de difração de raios X (DRX) serão realizados em um equipamento Rigaku,
modelo DMax 2500PC, utilizando radiação Cu Kα, para determinação da fase cristalina obtida e
verificar a ausência de fases secundárias. As condições usadas para as análises serão escolhidas de
acordo as necessidades de cada sistema, visando otimizar resultados e uso do equipamento. As análises de
DRX serão realizadas no LIEC/DQ/UFSCar.
b) Espectrofotometria na região do infravermelho
A espectrofotometria na região de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
será utilizada para confirmar ausência, ou a presença de espécies adsorvidas na superfície da fase
18 de interesse (HA:CaTiO3). Nesta análise será empregado o módulo de refletância difusa em um
equipamento Bruker, modelo Equinox 55. As análises de FTIR serão realizadas no
LIEC/DQ/UFSCar.
c) Espectroscopia óptica nas regiões ultravioleta e visível (UV-Vis)
A análise por espectroscopia óptica nas regiões das radiações ultravioleta e visível (UVVis) é um tema muito importante para estudos de bandas eletrônicas. Sendo possível a
observação de efeitos quânticos relacionados a alterações na energia do gap com a redução no
tamanho das partículas, por meio de espectros de absorção. As caracterizações por UV-Vis serão
realizadas em um equipamento Cary, modelo 5G no LIEC/DQ/UFSCar.
d) Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman será utilizada como técnica complementar à DRX, devido a esta ser
mais sensível a mudanças de parâmetros de rede, ou seja, de ordem local. A espectroscopia
Raman, fornece uma resposta analisando o material em uma ordem a curta e média distâncias
dos átomos no retículo cristalino, assim tornando as duas técnicas complementares na análise de
formação de fases. Sobretudo, em relação ao efeito de pequenas concentrações de dopantes no
retículo cristalino, como é o interesse do presente projeto com a adição de CaTiO3 à HA. Os
dados de espectroscopia Raman serão obtidos em um equipamento RFS/100/S Bruker FT-Raman. As
análises serão realizadas no LIEC/DQ/UFSCar.
e) Método de Brunnaner-Emmett-Teller (BET)
19 As análises de adsorção e dessorção de nitrogênio pelo método BET (Brunauer, Emmett e
Teller) para obtenção dos valores de área de superfície específica serão realizadas em um equipamento
Micromeritcs, modelo ASAP 2000. As análises serão realizadas no LIEC/DQ/UFSCar.
f) Microscopia Eletrônica de Transmissão Varredura
Para a determinação de forma, tamanho e distribuição das partículas é essencial o uso da
microscopia eletrônica. Neste trabalho será usado um microscópio eletrônico de transmissão
varredura com fonte de emissão de campo, STEM-FEG (Scanning Transmission Electron
Microscopy - Field Emission Gun) Zeiss, modelo Supra 35. As análises serão realizadas no
LIEC/DQ/UFSCar.
g) Espectroscopia de Fotoluminescência
A resposta da propriedade fotoluminescente do material obtido será analisada em
comprimentos de onda de excitação da ordem de 350 nm, empregando-se um espectrômetro
Thermal Jarrel-Ash Monospec 27. A espectroscopia de luminescência associada a outras técnicas
de caracterização estrutural permite uma avaliação do grau de ordem e desordem imposta ao
sistema durante a síntese e processamento. As medidas serão executadas no IFSC - Instituto de
Física de São Carlos/GFO - Grupo de Fotônica da Universidade de São Paulo (USP).
2)
Comitê de ética
Para a utilização destas células tronco adultas (CTA) para pesquisa, os pais ou responsáveis
destes indivíduos assinarão o termo de consentimento livre e esclarecido. Além disso, o projeto
20 está sendo submetido à avaliação do comitê de Ética Humano do IB-USP. Assim que for
aprovado enviaremos, se necessário, esta documentação.
A utilização do modelo animal de defeitos críticos na calota craniana de ratos Wistar
(modelo animal escolhido) já foi aprovada pelo comitê de ética animal do IB-USP (protocolo
037/2006). Esta documentação pode ser apresentada em qualquer momento que for julgado
necessário.
3)
Obtenção de material biológico, cultura e caracterização de células:
Os procedimentos de coleta de tecido adiposo e de isolamento e cultivo de células-tronco
deles derivadas já está padronizado por nosso grupo (De Mendonca Costa, Bueno et al., 2008;
Bueno, Kerkis et al., 2009). Iremos obter 6 culturas primárias de células de tecido adiposo de
diferentes indivíduos e 6 culturas primárias de polpa dentária, também de diferentes indivíduos.
Após implantadas, expandidas e com alíquotas congeladas após a primeira passagem, as células
terão seu imunofenótipo (proteínas específicas de superfície celular) caracterizado. Serão usados
anticorpos primários, conjugados com PE, FITC ou Cy3, específicos de linhagens mesenquimais,
hematopoiéticas e endoteliais: 1) Mesenquimais - anti-CD29, anti-CD90 (Becton Dickinson, NJ,
USA), anti-SH2 e anti-SH3 (Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio, USA); 2)
Hematopoiéticos: anti-CD45, anti-CD117 (Becton Dickinson, NJ, USA); 3) Endotelial: antiCD31 (Becton Dickinson, NJ, USA). A fluorescência das células será adquirida com o uso do
equipamento “EasyCyte flow cytometer” (Guava Technologies) e os dados analisados com o uso
do software “Guava ExpressPlus”.
4)
Experimentos de diferenciação osteogênica e expansão clonal in vitro:
21 Os protocolos de diferenciação serão conduzidos em triplicatas para cada uma das
amostras (triplicatas técnicas). Para a diferenciação osteogênica as replicatas biológicas e
técnicas, das células referidas acima serão tratadas com meio de proliferação (DMEM Low
Glicose) suplementado com 50 µM de ascorbate-2-phosphate, 10 mM de β-glicerofosfato
(Sigma), e 0,1 µM de dexametasona por 21 dias. A diferenciação osteoblástica será constatada
por marcação de fosfatase alcalina no 9o dia e a diferenciação osteogênica será demonstrada por
acúmulo de matriz extracelular de cálcio por coloração de de Alizarin Red. As imagens serão
fotografadas em microscópio invertido, com aumentos de 5X, 10X e 20X e registradas e a
ossificação será quantificada por remoção da coloração de Alyzarin Red de cada uma das
amostras, quantificação da absorbância da solução em espectofotômetro e comparação com estes
mesmos dados provenientes do controle negativo (as mesmas células, marcadas com Alyzarin
Red, mas não tratadas com meio de diferenciação osteogênica).
Com o intuito de caracterizarmos a possível heterogeneidade celular, a partir das
amostras que apresentarem melhor potencial de ossificação in vitro derivaremos 10 clones
individuais e caracterizaremos cada um com relação à morfologia celular, proliferação e
diferenciação. As expansões clonais serão feitas de acordo com protocolo de diluições limitantes.
De forma geral as células em terceira passagem, numa confluência de 80 % em garrafas de 25
mL serão tripsinizadas, contadas em câmara de Neubauer e diluídas em séries de 10 X até
obtermos uma concentração final de 100 células em 10 mL. Neste momento usaremos uma placa
de 96 poços e plaquearemos 100 uL por poço, o que dá uma quantidade média de 1 célula por
poço. A partir desta célula, geraremos as colônias, necessárias para o estudo de heterogeneidade
celular
22 5)
Experimentos de ossificação in vivo
O modelo in vivo usado será de fechamento de defeito crítico calvarial em ratos Wistar, já
estabelecido por nosso grupo. Acreditmos que este modelo seja mais fidedigno que o modelo de
ossificação de enxertos subcutâneos de biomaterial, muito usado em uma série de trabalhos, uma
vez que é mais próximo da realidade cirúrgica (tanto quanto ao osso envolvido quanto com
relação ao procedimento). Usaremos 8 ratos Wistar NIS para cada experimento (machos, de 2
meses de idade, com peso corpóreo de no máximo 200 g cada), não imunossuprimidos.
Até o momento da cirurgia e no período pós-cirúrgico os animais serão mantidos em
estantes ventiladas (Alesco, Brazil), com condições padronizadas de temperatura, arejamento e
iluminação (22ºC, ciclagem de 12 horas de claridade por dia), com acesso livre a água e ração.
Um total de 106 células por amostra selecionada será diluído em 100 uL de meio de
cultura e infundido em pastilhas circulares de 5 mm de diâmetro dos biomateriais (pastilhas de
diâmetros médios de poros de 100 µm, 300 µm e 500 µm e com porosidades de 30%, 50% e
80% respectivamente) com o suporte de placas de 35 mm (6-well plate, Corning). As células
ficarão em contato com o biomaterial por 2 horas e, em seguida, as placas serão suplementadas
com 2,5 mL de meio de cultura de células e as pastilhas serão incubadas a 37ºC, 5% CO2 por 24
horas antes do transplante. A princípio os experimentos serão realizados em triplicatas técnicas e
biológicas. Se necessário o número amostral será aumentado em momento subseqüente.
Antes das cirurgias os animais serão anestesiados com injeção intraperitonial
(0,3mL/100g de massa corpórea) com uma combinação de hidroclorido de ketamina (5%) e
xilasina (2%). Durante o procedimento cirúrgico será feita uma incisão de linha média desde a
região frontonasal até a protuberância occiptal externa. A pele, o periósteo craniano e a
23 musculatura temporal serão rebatidos lateralmente, de forma a deixarmos exposta a região
calvarial.
Dois defeitos cranianos simétricos com diâmetro de 5mm (defeito crítico neste modelo)
serão feitos na região parietal, lateralmente à sutura sagital, entre as suturas occiptais e as
coronais, com o uso de uma broca e constante irrigação com solução fisiológica. A dura-mater
será mantida intacta, evitando sangramento excessivo e lesões nas outras meninges e no
encefálo. No momento do transplante, os materiais infundidos de células serão transferidos para
o defeito ósseo do lado esquerdo e materiais livres de células mas submetidos ao mesmo
tratamento de meio de cultura serão transferidos para o defeito do lado direito dos animais. Dessa
forma teremos o experimento e o controle no mesmo animal.
Após 30 e 60 dias da cirurgia, 3 animais serão sacrificados para cada grupo, em câmara
de CO2. As regiões parietais submetidas ao estudo serão dissecadas, removidas e fixadas em
formol 10% por 24 horas, depois serão descalcificadas em acido fórmico 5% por 48 horas e
embebidas em parafina. Serão obtidos cortes de 5µm e corados com hematoxilina e eosina. A
preparação histológica será realizada em colaboração com a Dra Marilia T. Martins, do
Departamento de Patologia da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo. 6)
Experimento de microarray de expressão gênica
As análises da expressão das células que foram triadas para maior potencial de
ossificação in vitro e in vivo serão realizadas por microarrays com a lâmina Human Gene 1.0 ST
(Affymetrix). Após três passagens em garrafas de 25 mL, as células contidas nas garrafas serão
lisadas e o RNA total será extraído de acordo com a técnica de extração de RNA isolado a partir
24 de linfócitos com o uso de TRIzolTM (Invitrogen), adaptado para a extração de RNA de células
em cultura.
O RNA total será diluído em água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato) e a qualidade
do RNA será averiguada por meio de eletroforese (100 volts por 60 minutos) em gel de agarose
(0,6% de agarose, 2%. de brometo de etídeo diluídos em tampão 1 X TBE). As bandas de RNA
serão visualizados com o uso de luz ultravioleta e o gel fotografado.
De forma geral, o GeneChip® Whole Transcript Sense Target Labeling (Affymetrix) é
designado para gerar DNAs senso amplificados e marcados com biotina, resultantes da expressão
de todo o genoma. A partir de 100 ng do RNA total, o cDNA dupla fita é sintetizado com
hexâmeros randômicos contendo uma cauda de T7, que age como uma seqüência promotora. O
cDNA dupla-fita é subseqüentemente utilizado como molde e amplificado pela polimerase T7
RNA (Affymetrix), produzindo muitas cópias de cRNA anti-senso. No segundo ciclo de síntese
do cDNA, hexâmeros randômicos são utilizados como oligonucleotídeos iniciadores para a
transcrição reversa do cRNA, resultando em DNA simple-fita. Durante o segundo ciclo da
transcrição reversa, é também adicionado dUTP à reação. O DNA simples-fita é então tratado
com uma combinação de DNA uracil glicosilase (UDG) e endonuclease apurínica/apiridímica 1
(APE 1), que reconhecem especificamente os resíduos de dUTP e quebram a fita de DNA. Em
seguida, o DNA é marcado pela transferase deoxinucleotídeo terminal (TdT) com DNA Labeling
Reagent (Affymetrix), que é covalentemente ligado à biotina. Este cDNA é hibridado por 17
horas à lâmina Human Gene 1.0 ST com o auxílio de um forno de hibridação a 45 ˚C a 60 rpm. O
processo de marcação por Streptavidina e de lavagem da lâmina ocorre na estação fluídica
(GeneChip® Fluidics Station 450), comandada por um computador. Por fim, as lâminas são
25 escanedas pelo GeneChip® Scanner 3000 7G System e um relatório de controle de qualidade é
gerado pelo Affymetrix® Expression Console™ Software.
Os dados serão normalizados com o método RMA (Robust Multi-array Average) do
pacote Affy do projeto Bioconductor (Gentleman et al., 2004). Para a seleção dos genes
diferencialmente expressos serão utilizados dois algoritmos, o Limma (Smyth, 2004) e o
RankProd (Hong et al., 2006), ambos também disponibilizados no Bioconductor do programa R.
Em seguida serão adicionadas a cada arquivo de normalização as informações de anotação
disponibilizadas pela ferramenta NETAFFX da Affymetrix (http://www.affymetrix.com/). O
programa GeneSpring GX 10.0 também será usado para a mineração de dados e para
procedimentos de clusterização. Redes de interação e enriquecimento funcional dos genes
diferencialmente expressos funcionais serão analisados com os softwares Ingenuity Pathway
Analysis
(Ingenuity
Systems)
e
DAVID
Bioinformatics
Database
Analysis
(http://david.abcc.ncifcrf.gov/).
Com identificação do perfil diferencial de expressão gênica das células com maior
potencial de ossificação pretendemos delinear um método seguro de seleção destas células.
Caracterização dos docentes / pesquisadores participantes
Além do preceptor e do pesquisador candidato, estarão também envolvidos diretamente
neste projeto os pesquisadores abaixo relacionados.
Nome: Elson Longo
26 Titulação: Professor Emérito e Titular do Departamento de Química da Universidade
Federal de São Carlos e diretor do Centro Multidisciplinar de Desenvolvimento de Materiais
Cerâmicos (CEPID - FAPESP)
Tipo de Vínculo: Desenvolvimento e manufatura dos biomateriais a serem usados
Publicações nos últimos 5 anos (a partir de 2005): 309 publicações em periódicos de
impacto internacional, que podem ser verificadas na Plataforma Lattes (endereço colocado
abaixo).
Linhas de pesquisa / projetos a que se vinculam: Desenvolvimento de cerâmicas para
bioengenharia de tecidos
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
acesso):
http://lattes.cnpq.br/9848311210578810
_____________________________________________________________________________
Nome: Elaine Cristina Paris
Titulação: Doutora em Química pela Universidade Federal de São Carlos, pós-doutorado
pela Universidade Federal da Paraíba. Bolsista de pós-doutorado Júnior do CNPq junto ao
Centro Multidisciplinar de Desenvolvimento de Materiais Cerâmicos.
Tipo de Vínculo: Desenvolvimento e manufatura dos biomateriais a serem usados.
Publicações nos últimos 5 anos (a partir de 2005): 11 publicações em periódicos de
impacto internacional, que podem ser verificadas na Plataforma Lattes (endereço colocado
abaixo).
27 Linhas de pesquisa / projetos a que se vinculam: Desenvolvimento de cerâmicas para
bioengenharia de tecidos
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
de
Materiais
acesso):
http://lattes.cnpq.br/8475640212486290
Nome: Mário Lúcio Moreira
Titulação:
Mestre
em
Engenharia
e
Ciência
pela
Universidade Estadual de Ponta Grossa, UEPG. Atualmente realiza seu doutoramento junto ao Centro
Multidisciplinar de Desenvolvimento de Materiais Cerâmicos, sendo bolsista CNPq.
Tipo de Vínculo: Desenvolvimento e manufatura dos biomateriais a serem usados.
Publicações nos últimos 5 anos (a partir de 2005): 7 publicações em periódicos de
impacto internacional, que podem ser verificadas na Plataforma Lattes (endereço colocado
abaixo).
Linhas de pesquisa / projetos a que se vinculam: Desenvolvimento de materiais
cerâmicos por método químico
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
acesso):
http://lattes.cnpq.br/6395095165722635
______________________________________________________________________________
Nome: Daniela Franco Bueno
28 Titulação: Doutora em Genética pelo Instituto de Biociências, Universidade de São
Paulo. Bolsista de pós-doc da FAPESP
Tipo de Vínculo: Isolamento e caracterização de células-tronco de polpa de dente
Publicações nos últimos 5 anos (a partir de 2005): 8 publicações em periódicos de
impacto internacional, que podem ser verificadas na Plataforma Lattes (endereço colocado
abaixo).
Linhas de pesquisa / projetos a que se vinculam: Uso de células-tronco adultas para
bioengenharia de tecidos
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
acesso):
http://lattes.cnpq.br/8605096417282301
_____________________________________________________________________________
Nome: Meire Aguena
Titulação: Doutora em microbiologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo. Bolsista de Desenvolvimento de Tecnologia Industrial do CNPq,
Nível 1 (Processo – 380683 / 2009)
Tipo de Vínculo: Isolamento, caracterização e expansão de células-tronco adultas
Publicações nos últimos 5 anos (a partir de 2005): 2 publicações em periódicos de
impacto internacional, que podem ser verificadas na Plataforma Lattes (endereço colocado
abaixo).
29 Linhas de pesquisa / projetos a que se vinculam: Uso de células-tronco adultas para
bioengenharia de tecidos
Currículo
na
Plataforma
Lattes
(endereço
eletrônico
de
acesso):
http://lattes.cnpq.br/7814711850749998
Detalhamento da infra-estrutura física e tecnológica a ser
utilizada
A porção do trabalho envolvendo a síntese do biomaterial de hidroxiapatita e colágeno
tipo 1, o controle dos parâmetros de micro e macro-estrutura envolvidos neste processo e os
testes de qualidade do material serão executado no Centro Multidisciplinar de Desenvolvimento
de Materiais Cerâmicos (Araraquara / São Carlos). Esta porção será supervisionada pelo Prof.
Dr. Elson Longo, Professor Emérito e Titular do Departamento de Química da UFSCar, diretor
do Centro Multidisciplinar de Desenvolvimento de Materiais Cerâmicos (CMDMC) e Bolsista
de Produtividade em Pesquisa do CNPq – Nível 1A. Este grupo tem excelência nas áreas de
estudo, implementação e desenvolvimento de materiais cerâmicos para diversos usos. O
CMDMC possui amplas instalações para processamento e caracterização de materiais cerâmicos,
tais como Fluorescência e Difração de Raios X, Microscopia Eletrônica de Varredura,
Microscopia Eletrônica Transmissão-Varredura com Canhão de Emissão de Campo, Reômetro,
Análise Térmica Diferencial e termogravimétrica, Dilatômetro, Porosímetro de Mercúrio,
Análisador de Adsorção Física (BET), Espectroscopia em várias Regiões do Espectro Eletro-
30 Magnético e infraestrutura computacional para realização de cálculos teóricos mecânicoquânticos.
A parte envolvendo o isolamento e o cultivo celular, ensaios de diferenciação celular in
vitro e in vivo serão realizados no Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do IB – USP e
no Centro de Estudos do Genoma Humano da USP. A parte executada junto a estes centros será
supervisionada pela preceptora, Prof a Dr
a
Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno, Professora
Titular do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do IB – USP, Coordenadora de
Transferência de Tecnologia do Centro de Estudos do Genoma Humano e Bolsista de
Produtividade em Pesquisa do CNPq – Nível 1A. Estes centros dispõe de salas de cultura de
células equipadas com cabines de fluxos laminares, estufas de precisão, microscópios ópticos,
invertidos e de fluorescência, biotério para armazenamento dos animais, equipamentos para
experimentos de microarrays de expressão da Affymetrix, Agilent e Codelink (GE HealthCare),
infra-estrutura computacional, softwares e know-how para análise de dados de microarrays,
equimapentos para PCR em tempo real (Applied Biosystems 7500 e Roche LightCycler 480 II),
citômetro de fluxo (Guava Technologies EasyCyte), NanoDrop ND 1000. O grupo em questão
têm excelência nas áreas de terapia celular, células-tronco e biologia regenerativa, o que pode ser
constatado pelos manuscritos publicados nos últimos 10 anos.
Devemos deixar aqui explicitado que os grupos acima relacionados tem infra-estrutura
suficiente e capacidade plena para o desenvolvimento das atividades do projeto proposto.
31 Linhas gerais do cronograma a ser cumprido
1o ano: Padronização das condições ideais de síntese do biomaterial; obtenção, cultivo e
caracterização do imunofenótipo das linhagens celulares primárias; condução de experimentos de
diferenciação osteogênica in vitro e de expansão clonal in vitro.
2o ano: Condução de experimentos de ossificação in vivo; experimentos de microarrays
para delineamento de perfil de expresssão gênica; análise de resultados.
O cronograma dos próximos anos será elaborado com base nos resultados obtidos até o
final do segundo ano, quando será apresentado.
Orçamento
A planilha orçamentária foi juntada a este projeto como Anexo I. Os preços nela
discriminados para material permanente e para material de consumo foram feitos com base em
orçamentos obtidos em agosto / setembro de 2009. Preços em dólar foram convertidos para reais
usando a taxa de conversão de 1 de setembro de 2009 (1 dolar = 1,9 reais). A planilha
orçamentária para os anos 4 e 5 dependerá de resultados obtidos nos primeiros anos, quando será
juntada a esta primeira planilha.
Referências Bibliográficas
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