Arquivo - Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Carotenoides da microalga Spirulina platensis: obtenção e
avaliação da atividade antioxidante
TÁCILA ALCÂNTARA MENDONÇA
SALVADOR-BA
2014
TÁCILA ALCÂNTARA MENDONÇA
Carotenoides da microalga Spirulina platensis: obtenção e
avaliação da atividade antioxidante
Orientador (a): Profa Drª. Itaciara Larroza Nunes
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como
requisito para a obtenção do grau de Mestre.
SALVADOR-BA
2014
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Mendonça, Tácila Alcântara
Carotenóides da microalga Spirulina platensis: obtenção e
avaliação da atividade antioxidante / Tácila Alcântara Mendonça. –
2014.
98 f.: il.
Anexos
Orientador: Profª. Drª. Itaciara Larroza Nunes
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia.
Faculdade de Farmácia. Salvador, 2014.
1. Óleo de palma. 2. Atividade oxidante. 3. Planejamento
experimental. I. Nunes, Itaciara Larroza. II. Universidade Federal da
Bahia. III. Faculdade de Farmácia. V. Título.
CDD –641.338.51
CDU – 665.353.4
AGRADECIMENTOS
À Deus por sua infinita misericórdia e por prover mais essa vitória em minha vida.
À minha mãe Ivonelia, pelo amor, pelo carinho, pela luta incansável, enorme apoio,
compreensão nos momentos de ausência e incentivo para que eu conseguisse superar as
dificuldades. Ao meu pai Pedro, pelo cuidado, pela confiança e constante preocupação.
Ao meu irmão Mateus pelo esforço incondicional para me ajudar de alguma forma,
torcer e vibrar com minhas conquistas.
Ao meu namorado Daniel pelo amor, carinho, amizade, e compreensão nos momentos
de ausência, por estar sempre me apoiando nos momentos difíceis e comemorando com
minhas vitórias.
À minha orientadora Itaciara Larroza Nunes, por ter me orientado desde a iniciação
científica, por acreditar no meu potencial, pelo incentivo, respeito e dedicação.
Aos amigos Márcia, Ícaro, Luciana e Luís pela presença, pela amizade, pelas
conversas e auxílio na execução deste trabalho e pela paciência durante os dias no laboratório,
obrigada pela convivência, carinho e respeito.
As bolsistas de iniciação científica Débora, Amanda e Tayane pela grande
contribuição ao trabalho, dedicação e amizade.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) por
proporcionar o desenvolvimento deste trabalho devido ao financiamento do projeto de
pesquisa e bolsa de mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), pelo auxílio
dissertação.
Enfim, a todos que de alguma forma, colaboram para que meu trabalho tenha sido
realizado com sucesso e a minha jornada completa.
SUMÁRIO
Lista de Figuras..................................................................................................................... I
Lista de Tabelas..................................................................................................................... II
RESUMO.............................................................................................................................. III
ABSTRACT.......................................................................................................................... IV
1. Introdução Geral .............................................................................................................
11
Referências..........................................................................................................................
12
2. Objetivos............................................................................................................................ 14
2.1. Objetivo geral..............................................................................................................
14
2.2. Objetivos específicos................................................................................................... 14
CAPÍTULO I........................................................................................................................
15
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................................
15
1. Microalgas.........................................................................................................................
16
2. Spirulina platensis: caraterísticas e aspectos nutricionais............................................. 17
3. Carotenoides...................................................................................................................... 19
3.1. Carotenoides em microalgas........................................................................................ 22
3.2. Técnicas de extração/obtenção de carotenoides..........................................................
24
3.3. Separação, identificação e quantificação de carotenoides..........................................
30
3.4. Métodos para avaliar a atividade antioxidante............................................................
32
3.4.1. Determinação da atividade DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil).......................
32
3.4.2. Oxidação acelerada em Rancimat ..................................................................... 35
4. Referências........................................................................................................................
37
CAPÍTULO II.......................................................................................................................
47
CAROTENOIDES DA MICROALGA SPIRULINA PLATENSIS: OBTENÇÃO E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE........................................................... 47
RESUMO…………………………………………………………………………………… 48
ABSTRACT...........................................................................................................................
49
1. Introdução........................................................................................................................
50
2. Materiais e Métodos.........................................................................................................
52
2.1. Amostras...................................................................................................................... 52
2.2. Extração de carotenoides……………………………………………………….........
53
2.2.1. Método convencional.........................................................................................
53
2.2.2. Planejamento experimental................................................................................
53
2.3. Análise de carotenoides por CLAE……………………….…………........................
54
2.4. Determinação da atividade antioxidante através do método DPPH............................
55
2.5. Oxidação acelerada em Rancimat………………………………………………......
55
2.6. Análise estatística……………………………………………………………….…..
56
3. Resultados e Discussão.....................................................................................................
57
3.1. Obtenção de carotenoides..........................................................................................
57
3.2. Atividade antioxidante...............................................................................................
62
3.3. Oxidação acelerada em Rancimat.............................................................................
63
4. Agradecimentos................................................................................................................
66
5. Referências……………………………………………………………………………....
66
Conclusão Geral.................................................................................................................... 71
ANEXOS................................................................................................................................ 72
Lista de Figuras
Capítulo I
FIGURA 1. Gênero Spirulina vista ao microscópio (40x)............................................
18
FIGURA 2. Estrutura química de alguns carotenoides..................................................
20
FIGURA 3. Mecanismo de clivagem do β-caroteno......................................................
22
FIGURA 4. Estrutura do DPPH e sua redução por um antioxidante.............................
33
FIGURA 5. Representação esquemática do funcionamento do Rancimat.....................
35
Capítulo II
FIGURA 1. Gráfico de Pareto dos efeitos principais verificados no planejamento
experimental fatorial completo. Número de extrações (B); tempo de extração (C);
razão massa:volume x tempo de extração (A x C); tempo de extração x temperatura
de extração (C x D); razão massa:volume x número de extrações x tempo de extração
(A x B x C); razão massa:volume x número de extrações x temperatura de extração
(A x B x D)......................................................................................................................
59
FIGURA 2. Análise de carotenoides por CLAE em (A) extração convencional e (B)
condição ótima do planejamento experimental. Picos 1-7 representam: 1) luteína; 2)
zeaxantina; 3) -caroteno 5,6-epóxido; 4) criptoxantina; 5) all-trans--caroteno; 6)
all-trans--caroteno; 7) 9-cis--caroteno…………………………………....................
61
I
Lista de Tabelas
Capítulo II
TABELA 1. Valores reais e codificados do planejamento experimental fatorial
completo, tendo como resposta a concentração média de carotenoides totais e percentual
de extração…………...........................................................................................................
57
TABELA 2. Atividade antioxidante (%) dos extratos de carotenoides obtidos da
microalga Spirulina platensis.…………………..................................................................
63
TABELA 3. Oxidação acelerada em Rancimat do óleo de palma refinado sem
antioxidante e adicionado de antioxidantes (TBHQ e extrato de carotenoides da
microalga Spirulina platensis).………………………………………………....................
64
II
RESUMO
A Spirulina platensis é uma microalga que tem sido alvo de estudos científicos devido à divulgação de
informações sobre a sua aplicabilidade ecológica, econômica e nutricional. O objetivo desse trabalho
foi obter carotenoides a partir da microalga Spirulina platensis utilizando planejamento experimental e
comparar com o método de extração convencional, bem como avaliar a atividade antioxidante dos
extratos obtidos. Para tal foi desenvolvido um planejamento experimental fatorial completo (24) e
utilizado como controle o extrato obtido por método de extração convencional. Os extratos obtidos
(extração convencional e condição ótima do planejamento experimental) foram analisados e
caracterizados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), a atividade antioxidante dos
mesmos foi determinada pelo método DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e o efeito antioxidante do
extrato obtido na condição ótima do planejamento e do terc-butil-hidroquinona (TBHQ) sobre a
oxidação lipídica de óleo de palma refinado foi avaliado através de oxidação acelerada em Rancimat.
Análise de variância (ANOVA) foi utilizada para analisar os efeitos e interações entre as variáveis
independentes do planejamento experimental (p < 0,05). Os resultados da atividade antioxidante pelo
método DPPH e Rancimat foram analisados pelo teste de aleatorização de Wilcoxon e Kruskal-Wallis
respectivamente, (p < 0,05). O conteúdo de carotenoides obtido através da extração convencional foi
de 272,26 ± 8,52 g/g e utilizando razão massa:volume de 0,5:15 (g/ml), 5 extrações de 30 min. e
temperatura de 35ºC (condição ótima do planejamento) foi de 250,71 ± 4,34 g/g, sendo esse total
correspondente a 92,08% do teor obtido no método convencional, e apresentou vantagens a utilização
de solvente Generally Recognized As Safe (GRAS), menor tempo total de análise e menor gasto de
solvente. A separação por CLAE mostrou que o all-trans--caroteno foi o principal carotenoide
encontrado nesta microalga (140,05 g/g extração convencional e 105,20 g/g condição ótima). Os
extratos de carotenoides apresentaram uma percentagem de inibição do radical DPPH de 53,73 ±
0,44% (extração convencional) e 45,06 ± 0,34% (condição ótima do planejamento), não diferindo
estatisticamente. Os tempos de indução das amostras de óleo de palma refinado submetidas à oxidação
acelerada em Rancimat variaram de 7,86 ± 0,42 h a 9,00 ± 0,02 h para os óleos de palma sem
acréscimo de antioxidante, de 14,15 ± 0,05 h a 14,85 ± 0,46 h, para os óleos com TBHQ e de 10,43 ±
0,30 h a 14,33 ± 0,52 h para os óleos adicionados do extrato de carotenoides obtido a partir da
microalga na condição ótima do planejamento, não sendo verificada diferença estatística entre os
resultados obtidos para as amostras com TBHQ e com o extrato de carotenoides. Os resultados
sugerem, portanto, que o extrato de carotenoides tem potencial para uso como antioxidante natural em
óleo de palma refinado.
Palavras-chave: -caroteno, planejamento experimental, atividade antioxidante, óleo de palma
refinado, oxidação acelerada.
III
ABSTRACT
Spirulina platensis is a microalga which has been the subject of scientific studies due to the disclosure
of information about their ecological, economic and nutritional applicability. The aim of this study
was to obtain carotenoids from Spirulina platensis using experimental design and compare with the
traditional extraction method, as well as evaluating the antioxidant activity of the extracts. To this we
developed a full factorial experimental design (24) and used as the control extract obtained by
traditional extraction method. The extracts (traditional extraction and optimum condition of the
experimental design) were analyzed and characterized by High-Performance Liquid Chromatography
(HPLC), the antioxidant activity has been assessed by the DPPH method (2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl) and the antioxidant effect of the extract obtained from the optimum condition of the
experimental design and terc-butyl hydroquinone (TBHQ) on lipid oxidation refined palm oil was
evaluated by Rancimat accelerated oxidation. Analysis of variance (ANOVA) was used to analyze the
effects and interactions between the independent variables of the experimental design (p < 0.05). The
results of antioxidant activity by DPPH and Rancimat method were analyzed by randomization
Wilcoxon and Kruskal-Wallis test, respectively, (p < 0.05). The content of carotenoids obtained by
traditional extraction was 272.26 ± 8.52 g/g using mass:volume ratio 0.5:15 (g/mL), 5 extractions 30
min. and 35 ºC (optimum condition experimental design) was 250.71 ± 4.34 g/g, with this total
corresponding to 92.08% of the levels obtained in the traditional method and presenting the
advantages of using Generally Recognized As Safe (GRAS) solvent, lower total analysis time and
solvent consumption. Separation by HPLC showed that all-trans--carotene was the major carotenoid
found in this microalga (140.05 g/g traditional extraction and 105.20 g/g optimum condition). The
extracts of carotenoids showed a percentage inhibition of DPPH radical of 53.73 ± 0.44% (traditional
extraction) and 45.06 ± 0.34% (optimum condition experimental design) did not differ statistically.
The induction times of samples of refined palm oil subjected to accelerated Rancimat oxidation ranged
from 7.86 ± 0.42 h 9.00 ± 0.02 h for oil palm without adding antioxidant, 14.15 ± 0.05 h 14.85 ± 0.46
h for oil with TBHQ and 10.43 ± 0.30 h 14.33 ± 0.52 h for oils added extract of carotenoids obtained
from microalgae in optimum condition experimental design, not being verified statistical difference
between the results obtained for samples with TBHQ and extract carotenoids. The results therefore
suggest that the extract of carotenoids has potential for use as a natural antioxidant in refined palm oil.
Keywords: -carotene, experimental design, antioxidant activity, refined palm oil, accelerated
oxidation.
IV
1. Introdução Geral
Há um grande interesse pela utilização de microalgas em processos biotecnológicos,
principalmente pela identificação de substâncias sintetizadas por estes organismos, que podem
ter aplicabilidade comercial na nutrição, saúde humana e animal, como também no tratamento
de águas residuais, produção de energia e obtenção de compostos de interesse para as
indústrias alimentares, química, cosmética e farmacêutica, entre outras (WANG et al. 2007;
SILVA, 2008; AMBROSI et al. 2008; CHU et al. 2010).
A Spirulina platensis é uma cianobactéria composta por diferentes compostos, tais
como, ficocianinas, carotenoides, ácidos fenólicos e ácidos graxos polinsaturados (GIREESH
et al. 2001; COLLA et al. 2007; SILVA, 2008; MALA et al. 2010; CHU et al. 2010). Pode
apresentar em sua biomassa o pigmento -caroteno em níveis de 0,5 a 1-2 g kg-1 de matéria
seca (GIREESH et al. 2001; CHRISTAKI et al. 2013).
Como os carotenoides, em especial o -caroteno, apresentam poder corante e
propriedades funcionais importantes para os organismos vivos, como atividade de próvitamina A e atividade antioxidante, sendo que a Spirulina platensis apresenta-se como uma
fonte alternativa para a produção desse pigmento em escala comercial e industrial, à medida
que o uso de corantes naturais em alimentos vem se tornando uma tendência atual, devido à
demanda dos consumidores por produtos naturais que tragam benefícios à saúde
(HAJIMAHMOODI et al. 2010; SOUZA et al. 2011; MENDONÇA et al. 2012;
MENDONÇA et al. 2013).
Vários métodos estão sendo desenvolvidos para a extração de carotenoides em
microalgas. A extração por solventes orgânicos é uma técnica que tem sido utilizada, todavia
é considerada trabalhosa e pode apresentar riscos para a saúde, uma vez que, muitos são
considerados tóxicos. Apesar disso, é uma técnica vantatosa, pois apresenta baixo custo e
facilidade de operação, pode ser adaptada para atender as necessidades de extração, como
também é um método bem estabelecido na indústria de alimentos (GIL-CHÁVEZ et al. 2013).
Para a obtenção de compostos naturais que se apresentem seguros para a utilização na
indústria de alimentos e para o meio ambiente, se faz necessária à seleção e escolha de
solventes orgânicos considerados seguros (Generally Recognized As Safe - GRAS)
(HERRERO et al. 2005; HERRERO et al. 2006; SANTOYO et al. 2006; MENDIOLA et al.
2007). Após a extração, os carotenoides são separados e quantificados na maior parte dos
estudos através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), sendo utilizadas
11
principalmente colunas de fase reversa (C18 e C30) (NUNES & MERCANDANTE, 2006;
MEZZOMO, 2012).
Com a divulgação de estudos científicos revelando que os compostos produzidos por
microalgas (compostos fenólicos, carotenoides, dentre outros) apresentam atividade
antioxidante, e pelo fato de serem consideradas fontes naturais, estes microrganismos tem
sido cada vez mais estudados e pesquisados (HAJIMAHMOODI et al. 2010; SOUZA et al.
2011; MENDONÇA et al. 2012; MENDONÇA et al. 2013).
Sendo assim, avaliar a atividade antioxidante das substâncias presentes na Spirulina
platensis e determinar a oxidação acelerada em Rancimat torna-se importante, uma vez que
pode auxiliar na divulgação e consolidação das informações a respeito dos efeitos benéficos
destes compostos, como também demonstrar que a biomassa dessa microalga tem grande
potencial
econômico,
nutricional
e
aplicabilidade
na
indústria
de
alimentos
(HAJIMAHMOODI et al. 2010; SOUZA et al. 2011).
Referências:
AMBROSI, M. A.; REINEHR, C. O.; BERTOLIN, T. E.; COSTA, J. A. V.; COLLA, L. M.
Propriedades de saúde da microalga Spirulina. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e
Aplicada, v. 29, n. 2, p. 115-123, 2008.
CHRISTAKI, E.; BONOS, E.; GIANNENASA, I.; FLOROU-PANERIA, P. Functional properties of
carotenoids originating from algae. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 93, n. 1, p. 511, jan., 2013.
CHU, W.-L.; LIM, Y.-W; RADHAKRISHNAN, A. K.; LIM, P.-E. Protective effect of aqueous
extract from Spirulina platensis against cell death induced by free radicals. BioMed Central
Complementary and Alternative Medicine, v. 10, n. 53, p. 3-8, 2010.
COLLA, L. M.; REINEHR, C. O.; REICHERT, C.; COSTA, J. A. V. Production of biomass and
nutraceutical compounds by Spirulina platensis under different temperature and nitrogen regimes.
Bioresource Technology, v. 98, p. 1489–1493, 2007.
GIL-CHÁVEZ, G. J.; VILLA, J. A.; AYALA-ZAVALA, F.; HERDIA, J. B.; SEPULVEDA, D.;
YAHIA, E. M.; GONZÁLEZ-AGUILAR, G. A. Technologies for extraction and production of
bioactive compounds to be used as nutraceuticals and food ingredients: an overview. Comprehensive
Review s in Food Sciende and Food Safety, v. 12, p. 5-23, 2013.
GIREESH, T.; JAYADEEP, A.; RAJASEKHARAN, K. N.; MENON, V. P.; VAIRAMANY, M.;
TANG, G.; NAIR, P. P.; SUDHAKARAN, P. R. Production of deuterated β-carotene by metabolic
labeling of Spirulina platensis. Biotechnology Letters, v. 23, p. 447-449, 2001.
HAJIMAHMOODI, M., FARAMARZI, M. A., MOHAMMADI, N., SOLTANI, N., OVEISI, M. R.,
NAFISSI VARCHEH, N. Evaluation of antioxidant properties and total phenolic contents of some
strains of microalgae. Journal Applied Phycology, v. 22, p. 43-50, 2010.
12
HERRERO, M.; MARTÍN-ÁLVAREZ, P. J.; SEÑORÁNS, F. J.; CIFUENTES, A.; IBÁÑEZ, E.
Optimization of accelerated solvent extraction of antioxidants from Spirulina platensis microalga.
Food Chemistry, v. 93, p. 417-423, 2005.
HERRERO, M.; JAIME, L.; MARTÍN-ÁLVAREZ, P. J.; CIFUENTES, A.; IBÁÑEZ, E.
Optimization of the extraction of antioxidants from Dunaliella salina microalga by pressurized
liquids. Journal of Agricultural Food Chemistry, v. 54, p. 5597−5603, 2006.
MALA, R.; KARTHIK, V.; SAKTHISELVAN, S.; SARAVANABABU, S. Milking of Spirulina
platensis for the production of carotenoids by aqueous two phase bioreactor systems. International.
Journal Chemical Sciences, v. 8, n. 5, p. 84-91, 2010.
MENDIOLA, J. A.; JAIME, L.; SANTOYO, S.; REGLERO, G.; CIFUENTES, A.; IBÁÑEZ, E.;
SEÑORÁNS, F. J. Screening of functional compounds in supercritical fluid extracts from Spirulina
platensis. Food Chemistry, v. 102, p. 1357-1367, 2007.
MENDONÇA, T. A.; DRUZIAN, J. I.; NUNES, I. L. Prospecção tecnológica da utilização da
Spirulina platensis. Cadernos de Prospecção Tecnológica, v. 5, n. 1, p. 44-52, 2012.
MENDONÇA, T. A.; CAZUMBÁ, Í; LIMA, A. B.; NUNES, I. L. Prospecção tecnológica da
utilização de microalgas em processo de extração de carotenoides voltados para insumos na nutrição
humana e animal. Revista GEINTEC, v. 3, n. 4, p. 193-204, 2013.
MEZZOMO, N. Extração e encapsulamento de compostos com importância tecnológica e
biológica proveniente do resíduo de processamento de camarão. 2012. 216 f. Tese (Doutorado em
Engenharia de Alimentos), Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Centro
Tecnológico, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2012.
NUNES, I. L.; MERCADANTE, A. Z. Vantagens e desvantagens das colunas C18 e C30 para a
separação de carotenoides por CLAE. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 4, p.
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SANTOYO, S.; CIFUENTES, A.; IBÁÑEZ, E.; SEÑORÁNS, F. J. Functional characterization of
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SILVA, L. A. Estudo do processo biotecnológico de produção, extração e recuperação do
pigmento ficocianina da Spirulina platensis. 2008. 87 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia
Química), Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos, Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, 2008.
SOUZA, M. M.; PRIETTO, L.; RIBEIRO, A. C.; SOUZA, T. D.; BADIALE-FURLONG, E.
Assessment of the antifungal activity of Spirulina platensis phenolic extract against Aspergillus flavus.
Revista Ciência e Agrotecnologia, v. 35, n. 6, p. 1050-1058, 2011.
WANG, L.; PAN, B.; SHENG, J.; XU, J.; HU, Q. Antioxidant activity of Spirulina platensis extracts
by supercritical carbon dioxide extraction. Food Chemistry, v. 105, p. 36-41, 2007.
13
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Obter carotenoides da microalga Spirulina platensis utilizando planejamento experimental
e comparar com o método de extração convencional, bem como avaliar a atividade
antioxidante dos extratos obtidos.
2.2. Objetivos específicos

Extrair os carotenoides da microalga Spirulina platensis utilizando metodologia
convencional;

Estabelecer método para a extração de carotenoides a partir da microalga Spirulina
platensis através de planejamento experimental fatorial completo (24);
 Utilizar o método estabelecido para a obtenção de extrato rico em carotenoides a partir
da microalga Spirulina platensis;
 Caracterizar os extratos obtidos quanto ao conteúdo e perfil de carotenoides por
espectrofotometria
e
cromatografia
líquida
de
alta
eficiência
(CLAE),
respectivamente;
 Caracterizar os extratos de carotenoides obtidos com relação à atividade antioxidante
através do método DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil);
 Avaliar o efeito antioxidante do extrato de carotenoides obtido a partir da condição
ótima do planejamento experimental e do antioxidante sintético terc-butilhidroquinona (TBHQ) na oxidação lipídica do óleo de palma refinado através da
oxidação acelerada em Rancimat.
14
CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
15
1. Microalgas
Microalgas são microrganismos que crescem geralmente em meio líquido, se
multiplicam rapidamente e são capazes de realizar fotossíntese oxigênica, produzindo
biomassa rica em compostos biologicamente ativos, como por exemplo, proteínas, ácidos
graxos insaturados, vitaminas e pigmentos. Por apresentarem tais características são
considerados os sistemas biológicos mais eficientes (pois armazenam energia solar
convertendo-a em energia biológica) e com enorme potencial de aproveitamento, seja como
fonte de alimento ou de compostos químicos de interesse (SILVA, 2008; SOUZA, 2012;
BARROS, 2010; MAGRO, 2010; SCHMITZ et al. 2012).
O termo microalgas refere-se a microrganismos algais que contém clorofila (em
especial a clorofila a, pigmento considerado mais importante para a fotossíntese, visto que
apresenta papel central para a captação de energia luminosa) e outros pigmentos
fotossintéticos (luteína, -caroteno, ficocianina, aloficocianina, dentre outros). São
encontrados em todos os ecossitemas da terra e podem ser cultivadas em ambientes inaptos e
em condições de “estresse” (calor, seca, frio, salinidade, foto-oxidação, anaerobiose, pressão
osmótica e exposição à radiação ultravioleta), uma vez que, requerem suprimentos
nutricionais relativamente simples (BARROS, 2010). Todavia, quando cultivadas com
substratos de interesse podem produzir biomassa de valor para a indústria de alimentos e para
processos biotecnólogicos (GUEDES et al. 2011).
O interesse em estudar microalgas iniciou-se por volta de 1890, com o cultivo de
culturas puras de Chlorella vulgaris (MATSUDO, 2006; MAGRO, 2010; JACOME, 2010).
Entretanto, alguns registros históricos informam que a coleta e o cultivo de microlgas para
utilização humana são realizados deste a pré-história por povos antigos do Lago Texcoco
(México), nativos do Lago Chade (África) e Ásia que consumiam os produtos feitos com a
biomassa da Spirulina spp. e do gênero Nostoc respectivamente (DERNER et al. 2006;
LÉON, 2010; BARROS, 2010; MAGRO, 2010; MENDONÇA et al. 2012).
A partir da década de 50, devido à procura de novas fontes de proteínas para
alimentação humana, verificou-se um maior interesse em cultivar estes microrganismos em
larga escala, sendo estudados principalmente os gêneros Chlorella e Scenedesmus. A partir
de então, bases de cultivo foram estabelecidas em diversos países como, por exemplo, Japão,
Estados Unidos, Alemanha dentre outros. Somente na década de 60 inicia-se a produção de
microalgas em escala comercial com a produção de Chlorella principalmente, e na década
seguinte de Spirulina (MATSUDO, 2006; MAGRO, 2010; JACOME, 2010; SOUZA, 2012).
16
No Brasil, as pequisas com microalgas difundiram-se nos anos 80 através de parcerias
entre pesquisadores e universidades de vários estados e entre as instiuições pioneiras destacase a Universidade Federal de Pernambuco, Universidade Federal do Rio Grande,
Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal do Rio de Janeiro. Atualmente os
principais centros de pesquisa com microalgas centram-se nas regiões Sudeste e Sul do país e
estes estão voltados principalmente para cultivo em nível experimental. A exemplo disso,
têm-se a Universidade Federal do Rio Grande (RS) que realiza pesquisas com a microalga
Spirulina platensis acerca do cultivo e aproveitamento da biomassa para diversos fins
(BARROS, 2010; MENDONÇA et al. 2012).
Com a divulgação de estudos científicos demonstrando que os compostos bioativos
produzidos
por
antimicrobiana,
microalgas
antifúngica,
desempenham
atividade
citotóxica
propriedades
e
antioxidante,
de
antiinflamatória,
inibição
enzimática
(HAJIMAHMOODI et al. 2010), como também potencial econômico e ecológico, inúmeras
indústrias foram instaladas para a produção de biomassa em escala comercial, sendo os
gêneros Spirulina e Dunaliella as mais cultivadas. Desde então, os estudos com microalgas
tem se expandido em vários países (WALTER, 2011).
2. Spirulina platensis: características e aspectos nutricionais
O gênero bacteriano Spirulina, também denominado de Arthrospira, faz parte do reino
Bactéria, divisão Cianobactéria, classe Cyanophyceae e família Oscillatoriaceae. As espécies
mais importantes desse gênero são a Spirulina platensis, Spirulina fusiformes e Spirulina
máxima (MARTÍNEZ, 2010; FERREIRA, 2011; WALTER, 2011).
A Spirulina platensis (FIGURA 1) é uma cianobactéria filamentosa de cor verdeazulada, encontrada em locais como solos, pântanos, lagos alcalinos e águas salobras,
marinhas e doces. Converte os nutrientes em matéria celular e libera oxigênio, através da
fotossíntese (COSTA et al. 2003; BERTOLIN et al. 2005; DERNER et al. 2006; AMBROSI
et al. 2008). Souza (2012) informa que esta microalga descende dos primeiros seres
fotossintetizantes do planeta e apresenta os maiores índices de produção de biomassa.
17
FIGURA 2. Gênero Spirulina vista ao microscópio (40x). Fonte: SILVA, 2008.
Considerada de fácil cultivo em larga escala, a Spirulina platensis é caracterizada por
cadeias de células cilíndricas que estão dispostas de maneira helicoidal, e podem variar de
tamanho e morfologia de acordo com as condições de cultivo, todavia podem atingir até 1 mm
de comprimento e 1 a 12 µm de diâmetro (JACOME, 2010; LÉON, 2010; MAGRO, 2010;
MARTÍNEZ, 2010; MOREIRA, 2010; FERREIRA, 2011; SOUZA, 2012).
Esta microalga é composta por cerca de 60-70% de proteína e aminoácidos
específicos, (ESTRADA et al. 2001; COLLA et al. 2004; AMBROSI et al. 2008; WALTER
2011) sendo os não essenciais alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, ácido glutâmico,
glicina, histidina, prolina, serina e tirosina e os essenciais isoleucina, leucina, lisina,
metionina, fenilalanina, treonina e valina (AMBROSI et al. 2008).
É constituída também por carboidratos, minerais (ferro, cálcio, fósforo, magnésio,
zinco, cobre, cromo, manganês, o sódio e o potássio), vitaminas (biotina, ácido fólico,
inositol, vitamina E, B12 (ESTRADA et al. 2001), B6, B3, B2, B1 e ácido pantotênico
(WANG et al. 2007; AMBROSI et al. 2008), compostos fenólicos (ácido caféico,
clorogênico, salicílico, sináptico e trans-cinâmico) (ESTRADA et al. 2001; COLLA et al.
2007a), pigmentos fotossintéticos como clorofila a, luteína, -caroteno, ficocianina,
aloficocianina, dentre outros (ESTRADA et al. 2001; WANG et al. 2007; SILVA, 2008;
MALA et al. 2010; MOHAMMED & MOHD, 2011) e ácidos graxos como ácido γlinolênico, -linolênico e o araquidônico (COSTA et al. 2003; COLLA et al. 2004; COLLA
et al. 2007a; WANG et al. 2007; SILVA, 2008; CHU et al. 2010).
Apresenta envoltório celular constituído por polissacarídeos, açúcares simples e
proteínas ao invés de celulose sendo, por isso facilmente digerida e absorvida pelo corpo
humano, com assimilação entre 85 a 95%. Do ponto de vista nutricional, essa característica é
de grande relevância, uma vez que permite o consumo in natura e sem necessidade de
18
processos de cocção ou outro tipo de tratamento, além de permitir a preservação da
integridade dos componentes presentes na mesma (principalmente vitaminas e ácidos graxos
polinsaturados) (RODRIGUES, 2008; MAGRO, 2010; MARTÍNEZ, 2010; MOREIRA,
2010; BARROS, 2010).
Trabalhos científicos vêm documentando que esta microalga não apresenta nenhuma
toxicidade, por isso, ela é classificada pelo FDA (Food and Drug Administration, 2003) como
GRAS (Generally Recognized As Safe), o que garante seu uso seguro e nutritivo na
alimentação humana ou animal. Estudos ‘in vitro’ e ‘in vivo’ mostram que as propriedades
nutricionais da microalga Spirulina platensis têm sido relacionadas com possíveis
propriedades terapêuticas que podem auxiliar no tratamento de problemas de saúde como
diabetes,
artrite,
anemia,
desnutrição,
obesidade,
tensão
pré-menstrual,
doenças
cardiovasculares, câncer, entre outros (ESTRADA et al. 2001; WANG et al. 2007;
AMBROSI et al. 2008). Por esta razão esta microalga tem sido adicionada em produtos
farmacêuticos e alimentares sendo comercializada principalmente como alimento funcional,
nutracêutico e/ou suplemento alimentar (ESTRADA et al. 2001; COLLA et al. 2004;
HERRERO et al. 2005; COLLA et al. 2007a; ABD EL-BAKY et al. 2007; WANG et al.
2007; AMBROSI et al. 2008; CHU et al. 2010; AZEREDO, 2012; MENDONÇA et al. 2012).
3. Carotenoides
Os carotenoides são classificados como tetraterpenos, formado por 40 átomos de
carbono, constituído de oito unidades isoprenoides de cinco carbonos (C5), possui uma longa
cadeia de hidrocarbonetos poliênicos que pode conter de 9 a 15 ligações conjugadas
(FIGURA 2). A estrutura linear e simétrica destes possibilita diversas modificações como:
ciclização, hidrogenação, desidrogenação, migração de duplas ligações, encurtamento ou
alongamento da cadeia, rearranjo, isomerização, introdução de funções oxigenadas (álcoois,
fenóis, aldeídos, cetonas, ésteres e ácidos carboxílicos) ou a combinação destes processos, o
que resulta em uma diversidade de estruturas (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; FRASER &
BRAMLEY, 2004; RODRIGUEZ-AMAYA & KIMURA, 2004; OLIVEIRA 2005;
AMBRÓSIO et al. 2006; MORAIS, 2006; CERQUEIRA et al. 2007; UENOJO et al. 2007;
BARBOSA FILHO et al. 2008; OLIVEIRA, 2010).
19
FIGURA 2. Estrutura química de alguns carotenoides. Fonte: BARBOSA FILHO et al. 2008.
Esses pigmentos naturais são responsáveis pelas colorações amarela, laranja e
vermelha. Na natureza estão principalmente na forma trans e divididos em duas classes: os
carotenos, que são hidrocarbonetos terpênicos (-caroteno, -caroteno, licopeno, dentre
outros) e as xantofilas, que são hidrocarbonetos terpênicos com oxigênio na cadeia, (luteína,
zeaxantina, criptoxantina, dentre outros). São biossintetizados por plantas, algas, bactérias,
fungos, leveduras e insetos (CERQUEIRA et al. 2007; BARBOSA FILHO et al. 2008; PIRES
et al. 2008; VALDUGA et al. 2009; DUARTE, 2010; TAKAICHI, 2011; CHRISTAKI et al.
2013).
Por causa da propriedade de síntese por esses seres vivos, este pigmento está
distribuído amplamente na natureza em frutas, flores, sementes, raízes, plantas dentre outros,
tendo sido identificados mais de 600 compostos em diversos organismos.
Somente 20
carotenoides, provenientes da dieta, são encontrados em tecidos humanos, visto que os
humanos são incapazes de biossintetizar estes pigmentos. Entre os principais incluem-se o caroteno, licopeno e as xantofilas, astaxantina, cantaxantina, luteína e zeaxantina
(RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; RODRIGUEZ-AMAYA & KIMURA, 2004; OLIVEIRA,
2005; AMBRÓSIO et al. 2006; MORAIS, 2006; CERQUEIRA et al. 2007; BARBOSA
20
FILHO et al. 2008; PIRES et al. 2008; VALDUGA et al. 2009; DUARTE, 2010; TAKAICHI,
2011; CHRISTAKI et al. 2013).
Os carotenoides são considerados compostos apolares ou lipofílicos, por isso são
encontrados em tecido adiposo, lipoproteínas e membranas celulares. São insolúveis em água
e solúveis em solventes orgânicos como acetona, éter de petróleo, éter etílico, clorofórmio e
acetato de etila (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; MORAIS, 2006; CERQUEIRA et al. 2007;
OLIVEIRA, 2010). Cerqueira et al. (2007) relataram que a cadeia de hidrocarbonetos, como
também as características estruturais deste composto influenciam em suas características
químicas, localização e orientação no interior da bicamada lipídica como também em
ambientes biológicos.
A estrutura química altamente insaturada dos carotenoides os torna propensos à
isomerização e oxidação. Agentes como calor, ácidos, luz, oxigênio e enzimas como, por
exemplo, as lipoxigenases, promovem a isomerização dos mesmos da forma trans para a
forma cis, ocasionando perdas de coloração e de atividade biológica. A degradação oxidativa
é considerada a principal causa de perda dos carotenoides, podendo ocorrer de duas formas:
reação com oxigênio na presença de luz, enzimas e metais e co-oxidação com hidroperóxidos
lipídicos (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; RODRIGUEZ-AMAYA & KIMURA, 2004;
AMBRÓSIO et al. 2006; MORAIS, 2006; MELÉNDEZ-MARTÍNEZ et al. 2007a;
OLIVEIRA, 2010).
Além do poder corante, os carotenoides apresentam propriedades funcionais que
formam a base de diversas funções e ações em organismos vivos, visto que alguns possuem
atividade de pró-vitamina A, além de apresentar a capacidade de sequestrar espécies reativas
de oxigênio, como o radical peroxil (ROO●) e o oxigênio singlete (1O2), estabilizando o
elétron desemparelhado do radical por ressonância, atuando dessa forma, como um composto
capaz de inibir a oxidação de biomoléculas e protegendo os sistemas biológicos contra o dano
oxidativo, que poderia levar à inativação enzimática, mutação, ruptura da membrana, aumento
na aterogenicidade e morte celular (CANELA et al. 2002; CERQUEIRA et al. 2007;
CONTADO et al. 2010; SOUZA, 2012).
A propriedade antioxidante apresentada pelos carotenoides está relacionada
principalmente a estruturas destas substâncias que é composta por ligações duplas conjugadas,
característica que permite que estes compostos atuem na prevenção de doenças crônicas não
transmissíveis, câncer, doenças degenerativas, dentre outras. A ordem crescente de
capacidade para sequestrar o oxigênio singlete por parte dos carotenos e xantofilas é:
21
licopeno, astaxantina, cantaxantina, β-caroteno, bixina, luteína e crocina (DI MASCIO et al.
1989; AMBRÓSIO et al. 2006; MORAIS, 2006; CERQUEIRA et al. 2007; OLIVEIRA,
2010).
Cerca de 50 carotenoides apresentam atividade de pró-vitamina A, mas esta função
está limitada a aqueles que possuem um anel -ionona não substituído em pelo menos uma
das suas extremidades e uma cadeia poliênica com no mínimo 11 carbonos, tais como: caroteno, -caroteno, e -criptoxantina, entre outros. Todavia, dentre os isômeros presentes
entre os carotenoides o mais importante é o -caroteno, pois é o único carotenoide que
apresenta dois radicais -ionona, que ao romper-se forma duas moléculas de pró-vitamina A
(FIGURA 3), além disso, é o pigmento mais abundante nos alimentos e o mais interessante
economicamente (KIMURA & RODRIGUEZ-AMAYA, 2002; FRASER & BRAMLEY,
2004; AMBRÓSIO et al. 2006; MORAIS, 2006; OLIVEIRA, 2010; AISSA, 2010;
RODRIGUEZ-AMAYA, 2010).
FIGURA 3. Mecanismo de clivagem do β-caroteno. Fonte: Adaptada de AMBRÓSIO et al. 2006.
3.1. Carotenoides em microalgas
Os carotenoides biossintetizados por estes microrganismos, como também por plantas,
bactérias, fungos, leveduras dentre outros, desempenham várias funções impotantes, tais
como, atuam como pigmento acessório na captura da energia solar, protegem o aparelho
fotossintético contra danos de foto-oxidação e contra tensões ambientais e de cultivo (PIRES
et al. 2008; GUEDES et al. 2011).
22
Neste aspecto, as microalgas tem sido foco de estudos e utilizadas para a produção de
carotenoides por rota biotecnológica com a finalidade de otimizar a bioprodução de
carotenoides, em especial o -caroteno. De acordo com os estudos realizados por Derner et al.
(2006), Silva (2008) e Valduga et al. (2009) existem algumas vantagens na produção de
pigmentos por microalgas, quando comparado com os similares de vegetais e animais, as
quais incluem a simplidade nas técnicas de cultivo (fator que possibilita o cultivo contínuo),
utilização de substratos de baixo custo, pequeno espaço para produção e a rápida taxa de
crescimento.
Todavia, a biossíntese de carotenoides através de microalgas pode variar de acordo
com as condições do meio de cultivo, fatores ambientais e luminosidade. Certas espécies de
microalgas quando cultivadas em meios adequados, podem duplicar a sua biomassa
diariamente, alcançando produtividades de 30 a 50 g/m2dia em massa seca (PIRES et al.
2008; VALDUGA et al. 2009; DUARTE, 2010).
Outra vantagem em se propor o cultivo destes micro-organismos deve-se ao fato de
serem considerados os sistemas biológicos de maior eficiência na captura de energia solar
para a produção de biomassa rica em compostos bioativos. Além disso, não apresentam vasos
de transporte e órgão de reprodução, características que as tornam de grande relevância e com
enorme potencial de aproveitamento em estudos e pesquisas científicas, como também para a
exploração de pigmentos naturais ou de compostos químicos de interesse em larga escala,
visto que a biomassa produzida por estes micro-organismos apresentam aplicabilidade em
diversos setores industriais (DERNER et al. 2006; SOUZA, 2012; BARROS, 2010;
DUARTE, 2010; MAGRO, 2010; FERREIRA, 2011; SCHMITZ et al. 2012).
Os microrganismos mais utilizados para a produção de carotenoides atualmente são as
leveduras (Rhodotorula, Phaffia rhodozyma, Sporobolomyces), fungos (Blakeslea trispora) e
microalgas (Dunaliella salina e Heamatococcus pluvialis), sendo a astaxantina, -caroteno,
cantaxantina, toruleno e licopeno os carotenoides mais investigados (VALDUGA et al. 2009).
Christaki et al. (2013) relataram que as cepas das microalgas Spirulina spp. e Chlorella spp.,
também podem ser utilizadas para a produção comercial de carotenoides, visto que podem
alcançar níveis desses pigmentos em torno de 1-2g Kg-1 de matéria seca.
O carotenoide tipicamente presente em microalgas é o β-caroteno sendo geralmente
encontrado numa fração inferior a 1% da massa seca, mas pode ser acumulado em até
aproximadamente 10% em espécies halotolerantes, como por exemplo, as do gênero
Dunaliella. Esta é considerada uma das microalgas mais bem sucedidas em escala comercial,
23
já que pode ser cultivada em altas e baixas temperaturas, alta salinidade e vários tipos de água
(DERNER et al. 2006; GUEDES et al. 2011; AZEREDO, 2012).
Segundo Gireesh et al. (2001) a Spirulina platensis pode alcançar uma quantidade de
-caroteno de aproximadamente de 0,5 g Kg-1 de massa seca, o que a torna viável como fonte
deste pigmento. Dessa forma, além de apresentar propriedade nutricional e terapêutica
(AMBROSI et al. 2008), esta microalga pode ser considerada mais uma fonte alternativa para
a produção em escala comercial do pigmento -caroteno (SILVA, 2008).
Em prospecção tecnológica de patentes, realizada em 2012 e 2013, pode-se verificar
que as algas (54%) são os principais microrganismos utilizados em processos tecnológicos
relacionados à obteção de carotenoides e que o -caroteno (32%) foi o principal pigmento de
interesse nesses processos. Além disso, o Brasil não possui pedidos de patentes referentes a
esta tecnologia tanto na base nacional (Intituto Nacional de Propriedade Industrial - INPI)
como européia (European Patent Office - ESPACENET). Cabe ressaltar que as poucas
patentes brasileiras depositadas (4) e patente concendida (1) no INPI utilizando a microalga
Spirulina platansis voltam-se principalmente para atividades de cultivo (3), obtenção de outro
pigmento (ficocianina) (1) e produção de produtos cosméticos contendo extrato microalgal (1)
(MENDONÇA et al. 2012; MENDONÇA et al. 2013).
3.2. Técnicas de extração/obtenção de carotenoides
A análise de carotenoides envolve uma série de etapas, como tomada da amostra,
extração, saponificação, análise cromatográfica, identificação e quantificação (NUNES, 2005;
MELÉNDEZ-MARTÍNEZ et al. 2007b). Porém, devido à grande diversidade de carotenoides
presentes nas diferentes matérias-primas, não existe um método simples que possa ser
aplicado para todas as amostras.
O processo de extração de carotenoides em microalgas dependerá de fatores como:
componente bioquímico extraído, matriz utilizada para obtenção do pigmento e das condições
de cultivo das mesmas (AZEREDO, 2012; MEZZOMO, 2012). Normalmente para atender às
especificações da produção comercial de carotenoides em grande escala, utiliza-se o hexano
para a extração de β-caroteno de algas, visto que este solvente apresenta baixa polaridade e os
carotenos são melhor extraídos de suas matrizes com o uso de solventes apolares
(MEZZOMO, 2012; CHRISTAKI et al. 2013).
Vários métodos têm sido desenvolvidos para a extração de carotenoides em
microalgas, tais como: técnicas com extração por solventes (SE), como também a utilização
24
de óleos vegetais, métodos de ultrassom, extração com fluído supercrítico e extração com
fluído subcrítico dentre estes últimos, o método de extração com líquido pressurizado (PLE) e
extração acelerada com solventes (ASE) (MENDIOLA et al. 2008; CHRISTAKI et al. 2013;
MEZZOMO, 2012; GIL-CHÁVEZ et al. 2013).
A extração por solventes é um método bastante utilizado para se obter compostos
bioativos (carotenoides, compostos fenólicos, flavonoides, dentre outros compostos
antioxidantes) das mais variadas matérias-primas, tais como sedimentos, solos, polímeros,
bactérias, fungos, algas, microalgas e, mais comumente de, plantas/vegetais. Nesta técnica, a
matéria prima é exposta a diferentes solventes orgânicos, o que permite a obtenção de
compostos de interesse como também de outros agentes, como por exemplo, aromas e
corantes (GIL-CHÁVEZ et al. 2013).
Muitos autores consideram esta metodologia trabalhosa (ISHIDA & CHAPMAN,
2009; STRATI & OREOPOULOU, 2011; GIL-CHÁVEZ et al. 2013). Apesar desta
desvantagem esta técnica apresenta vantagens em comparação com outros métodos de
extração, devido ao baixo custo de processamento, facilidade de operação e por ser um
método bem estabelecido na indústria de alimentos para a extração de carotenoides. Por este
motivo, é uma técnica que pode ser modificada para atender os propósitos de extração, ou
melhorada através da associação de outras técnicas como o uso de soxhlet, ultrassom,
microondas e fluido supercrítico, entre outros, a fim de obter melhores rendimentos (STRATI
& OREOPOULOU, 2011; GIL-CHÁVEZ et al. 2013).
Os solventes orgânicos mais utilizados para a extração de carotenoides por esta técnica
são acetona, hexano, álcool benzílico, acetato de etila, isopropanol, metanol, clorofórmio,
benzeno, diclorometano, éter de petroléo e etanol, contudo o uso destes, bem como as
concentrações depende do tipo de alimento e onde os mesmos serão empregados (STRATI &
OREOPOULOU, 2011; MEZZOMO, 2012; CHRISTAKI et al. 2013; GIL-CHÁVEZ et al.
2013). A utilização de solventes polares miscíveis em água como acetona, metanol e etanol,
tem se mostrado efetivo na extração de carotenoides em tecidos que contenham água,
entretanto o uso de solventes apolares não é recomendado em tecidos com esta característica,
já que a penetração deste tipo de solvente na parte hidrofóbica que envolve os pigmentos é
limitada (DELGADO-VARGAS et al. 2000; MEZZOMO, 2012).
Verifica-se também que o emprego de solventes orgânicos quando utilizado em sua
temperatura de ebulição, pode alcançar mais facilmente os espaços em que estão presentes os
solutos, visto que a tensão superficial e viscosidade do solvente apresentam-se reduzidas
25
quando comparadas a temperaturas inferiores (KOPAS & WARTHESEN, 1995; DE SIO et
al. 2001; MARKOM et al. 2007; MEZZOMO, 2012). Todavia, o uso de altas temperaturas
pode resultar na degradação dos pigmentos, além de ocasionar quantidades residuais de
solvente reduzindo seu potencial de aplicação na indústria de alimentos (BABU et al. 2008).
Dessa forma, o precessso de evaporação/recuperação de solventes é uma etapa de
fundamental importância quando se aplica solventes orgânicos no processo de extração de
carotenoides, devido a fatores de segurança operacional, ambiental e econômico (ISHIDA &
CHAPMAN, 2009; GIL-CHÁVEZ et al. 2013).
Ao estudarem a biocompatibilidade e toxidade de alguns solventes orgânicos (polares
e apolares) no processo de extração de -caroteno a partir da microalga Dunaliella salina,
Mojaat et al. (2008) verificaram que a capacidade de extração do solvente utilizado, depende
da sua afinidade com o produto extraído e com a concentração incorporada deste solvente na
membrana celular. Sendo assim, a seleção dos solventes orgânicos a serem utilizados no
processo de extração de carotenoides é de fundamental importância, quando a questão é a
segurança dos produtos finais para o uso alimentar, visto que grande parte dos solventes
utilizados apresentam efeitos adversos sobre a saúde humana devido a sua toxicidade, como
também oferecem riscos ao ambiente. Dessa forma, é necessário buscar alternativas seguras
para a extração de carotenoides com a utilização de solventes considerados GRAS (STRATI
& OREOPOULOU, 2011; GIL-CHÁVEZ et al. 2013).
Ao estudarem o processo de mistura de solvente orgânicos (etanol, hexano e acetona)
para otimizar o processo de extração de licopeno a partir de tomate e produtos derivados de
tomate, Periago et al. (2004), verificaram que os tipos de solventes utilizados para o processo
de extração apresentaram diferentes quantidades de licopeno (0,65 a 4,72 mg/100g no tomate
cru; 1,06 a 14,71 mg/100g no molho de tomate; e 11,47 a 53,90 mg/100g no extrato de
tomate), que aumentaram em função do tratamento térmico, e que a escolha do solvente
depende da natureza da matriz a ser analisada.
Kaur et al. (2008) ao avaliarem o efeito das condições de extração de licopeno a partir
de resíduos de pele de tomate desidratadas utilizando planejamento experimental com cinco
variáveis independentes: razão massa:volume (1:20, 1:30, 1:40. 1:50 e 1:60 g/ml), número de
extrações (1, 2, 3, 4 e 5), temperatura (20, 30, 40, 50 e 60ºC), tamanho de partícula (0,05,
0,15, 0,25, 0,35 e 0,43 mm) e tempo (4, 8, 12, 16 e 20 minutos), verificaram que a
concentração de licopeno variou de 0,64 a 1,98 mg/100g e que a quantidade máxima de
26
licopeno (1,98 mg/100g) foi obtida com 4 extrações de 8 minutos, a 50ºC, com um tamanho
de partícula de 0,15 mm e razão massa:volume de 1:30 g/ml.
A extração de carotenoides a partir de resíduos de tomate foi avaliada por Strati &
Oreopoulou (2011) com o intuito de verificar a influência das condições de extração (tipo de
solvente, tempo de extração, temperatura e número de extração) para obter rendimento
máximo de carotenoides. A concentração de carotenoides diminuiu com o tempo de extração,
isto é, inicialmente é maior depois decai, pois atinge a concentração de equilíbrio para a
solubilização do licopeno no solvente de extração sendo menor em etanol (0,38 mg L-1) e alta
em lactato de etilo (12,52 mg L-1) quando comparado com os demais solventes utilizados
(hexano - 1,99 mg L-1; acetona - 2,23 mg L-1 e acetato de etila 2,82 mg L-1), portanto um
tempo de 30 minutos foi suficiente para cada etapa de extração. Além disso, o aumento da
temperatura (até 70ºC) influenciou no maior rendimento de carotenoides (202,73 a 243,00
para lactato de etilo; de 31,46 a 46,21 para acetato de etila; de 25,22 a 34,45 para hexano e de
6,10 a 17,57 para etanol) e o tipo de solvente (polar e apolar) utilizado, interferiu no processo
de extração de carotenoide.
Obtenção de cristais de licopeno com 98% de pureza na forma de cristais a partir de
descarte de tomate foi reportada por Nunes & Mercadante (2004), utilizando as seguintes
etapas: 1) retirada de água do tomate com 4 extrações de 30 minutos, cada uma com 30 ml de
etanol; 2) extração dos carotenoides através de 4 extrações de 120 minutos com acetato de
etila e relação massa:volume de 1;0,7 g/ml e 3) purificação do licopeno através de duas
cristalizações com diclorematano/etanol a quente. O teor médio de licopeno obtido foi de
59,20 ± 21,80 µg/g.
O emprego de óleos vegetais como extrator de carotenoides apresenta vantagens,
como: efeito protetor contra a ação do oxigênio, uso de uma fonte lipídica quando aplicados
posteriormente nos alimentos e a não necessidade de eliminação do solvente, pois o produto
obtido é uma mistura de óleo/extrato de carotenoides. Assim, não apresenta inconvenientes de
degradação térmica dos extratos (MEYERS & BLIGH, 1981; CHEN & MEYERS, 1982;
SHAHIDI & SYNOWIECKI, 1991; CHEN et al. 1998; KRICHNAVARUK et al. 2008;
NEGRO & GARRIDO-FERNÁNDEZ, 2000; MEZZOMO, 2012). A desvantagem desta
técnica relaciona-se com a utilização de equipamentos que requer controle de temperatura e
pressão, visto que estes fatores podem influenciar na oxidação/degradação do óleo vegetal a
ser utilizado no processo de extração, como também do componente que está sendo extraído
(KRICHNAVARUK et al. 2008).
27
Kang & Sim (2008) ao estudarem o processo para a extração direta de astaxantina a
partir da microalga Haematococcus spp., utilizando óleos vegetais, obtiveram recuperações
entre 87,5 a 93,9%. Krichnavaruk et al. (2008) encontraram rendimento de 36,4%, na extração
de astaxantina de Hematococcus pluvialis utilizando o óleo de soja como co-solvente da
extração supercrítica com dióxido de carbono.
O método de ultrassom consiste na transmissão de ondas sonoras na matéria, criando
ciclos de expansão e compressão na mesma. As ondas ultrassônicas são transmitidas numa
frequência superior à da capacidade humana, estando acima de 20 kHz e quando aplicadas no
meio desencadeiam um série de bolhas ou cativações que, por sua vez transmitem energia
cinética para a superfície celular, promovendo o rompimento celular, devido à dilatação e
hidratação do material. A utilização desta técnica é promissora, por não depender de
aquecimento, não gerar danos aos compostos que são termo sensíveis, além de ser um
procedimento rápido e fácil de ser realizado, já que não necessita de equipamentos especiais
(ALISSANDRAKIS et al. 2003; AZEREDO, 2012; MEZZOMO, 2012).
Macías-Sánchez et al. (2009) utilizando técnicas de ultrassom assistido, com N,N’dimetilformina e metanol e extração supercrítica com dióxido de carbono para a extração de
carotenoides e clorofila da microalga Dunaliella salina, verificaram que houve maior
rendimento de extração quando foi utilizado o método de ultrassom com dimetilformina (27,7
g/mg - carotenoides e 3,1 g/mg - clorofila), do que com metanol (14,1 g/mg carotenoides e 3,5 g/mg - clorofila). Todavia houve maior seletividade dos pigmentos
quando foi utilizada a tecnologia supercrítica (15 g/mg - carotenoides e 0,3 g/mg clorofila).
No estudo de Dey & Rathod (2013), utilizando a técnica de ultrassom assitido para a
extração de -caroteno da microalga Spirulina platensis com diferentes solventes (hexano, nheptano e éter dietílico), foi verificado que a escolha do solvente para o processo de extração
é muito importante para a eficiência da análise. Dessa forma, apesar do éter dietílico
apresentar o maior rendimento de extração (1,2 mg/g) este não foi selecionado, visto que, por
possuir baixo ponto de ebulição (34ºC), é muito volátil, produz vapores prejudiciais a saúde e
sob aquecimento aumenta o risco de explosão. Assim, o n-heptano mostrou-se como o melhor
solvente de extração, devido a sua solubilidade em água (0,0003 % w/w), como também por
ser um solvente hidrofóbico e, portanto mais seletivo para a extração do -caroteno, apesar do
rendimento ser mais baixo (1,0 mg/g), em comparação ao éter dietílico.
28
O método de extração com fluído supercrítico baseia-se no princípio de que qualquer
substância submetida a altas temperaturas e pressões acima do ponto crítico, pode tornar-se
um fluído supercrítico e apresentar propriedades físico-químicas intermediárias entre um gás e
líquido (LANÇAS, 2002; AZEREDO, 2012; MEZZOMO, 2012). Segundo Christaki et al.
(2013) e Mezzomo (2012) esta técnica também vem ganhando destaque, pois trata-se de um
processo livre de resíduos tóxicos, sem pós-processamento, impede a degradação térmica dos
extratos, e previne reações de oxidação (ocasionadas pela ausência de luz e oxigênio). Dessa
forma pode se tornar uma técnica alternativa para a extração de carotenoides.
Para otimizar a extração de carotenoides da microalga Spirulina maxima utilizando
essa técnica, Careri et al. (2001) verificaram que este procedimento é mais eficaz e vantajoso
quando comparado com a extração utilizando solventes orgânicos, visto que a extração com
fluído supercrítico obteve rendimento similar (118,0 mg/g para -caroteno, 7,5 mg/g para criptoxantina e 48,0 mg/g para zeaxantina) ao encontrado na extração com solventes
orgânicos (120,0 mg/g para -caroteno, 8,0 mg/g para -criptoxantina e 50,0 mg/g para
zeaxantina).
Montero et al. (2005), ao proporem a extração de -caroteno da cianobactéria
Synechococcus sp., através da extração com fluído supercrítico, verificaram que interações
entre o método de extração e a matriz do pigmento podem representar problemas
principalmente no rendimento dos pigmentos de interesse (2,1 mg/g). Dessa forma, antes da
análise é preciso selecionar as condições de operação do equipamento, para que haja
eficiência no processo de extração.
Outra técnica que vem se destacando é o método de extração com fluído subcrítico
associados com os métodos de extração com líquido pressurizado (PLE) e/ou extração
acelerada com solventes (ASE). Este método é considerado um processo automatizado de
extração de compostos orgânicos e tem sido utilizado, tanto para a análise de substâncias
sólidas como de semi-sólidas. Difere do processo tradicional de extração porque faz uso de
solvente em elevada temperatura e pressão, além disso, é uma técnica que apresenta tempo de
análise reduzido e menor gasto de solventes (LANÇAS, 2002; ABAD, 2006).
Herrero et al. (2004) e Herrero et al. (2005), a fim de determinarem a atividade
antioxidante dos extratos obtidos da Spirulina platensis, utilizando PLE e otimização de
extração por ASE com diferentes solventes, verificaram que o etanol proporciona maior
eficiência no processo de extração, por apresentar maiores rendimentos (121,7 a 270,1 mg em
massa seca quando utilizado temperaturas de 115-170ºC e 9-15 minutos e 6,88 a 19,62% nas
29
temperaturas de 60, 115 e 170ºC e 3, 9 e 15 minutos, respectivamente), além de ser mais
vantanjoso em relação aos demais solventes, por ser considerado como GRAS e, portanto, de
utilização mais segura na indústria de alimentos.
Ao proporem a otimização de extração de antioxidantes da microalga Dunaliella
salina por PLE com diferentes solventes, Herrero et al. (2006) também concluiram que o
etanol foi o solvente que apresentou melhor rendimento (17,1 a 34,6% utilizando
temperaturas de 40, 100 e 160ºC), quando comparado com os extratos obtidos com água e
hexano (1,3 a 9,2% e 12,2 a 17,6 %, respectivamente). Sendo também mais vantajoso em
relação aos demais solventes pela condição GRAS que apresenta. De acordo com Christaki et
al. (2013), mesmo com as diversas técnicas existentes, ainda é um desafio criar métodos mais
eficientes para a extração de carotenoides.
3.3. Separação, identificação e quantificação de carotenoides
As principais técnicas de determinação de carotenoides são executadas principalmente
por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia líquida acoplada com
espectrometria de massas, sendo utilizadas para este fim principalmente colunas de fase
reversa (C18 e C30) (NUNES & MERCANDANTE, 2006; MEZZOMO, 2012).
Sander et al. (1994) e Nunes & Mercadante (2006), informam que melhores
separações de carotenos e isômeros são demostradas em colunas C18 poliméricas do que com
monoméricas. Contudo, não proporcionam boa separação de isômeros geométricos (cis ou
trans) de carotenoides apolares e de luteína e zeaxantina. Em contrapartida, a coluna C30
possibilita a separação de maior número de isômeros, como também é a única capaz de
separar isômeros de carotenoides não-simétricos, como 13-cis-,13’-cis-, 9-cis- e 9’-cis-luteína.
Também, apresenta resolução superior entre carotenoides com polaridade análoga quando
comparada com a C18. Dessa forma, a C30 é selecionada quando o objetivo é fazer a separação
de isômeros geométricos para o estudo do perfil de carotenoides (SCHIEBER & CARLE,
2005; MELÉNDEZ-MARTÍNEZ et al. 2007b).
Na fase móvel, sistemas de eluições isocráticas e por gradiente, tem sido empregados,
mas geralmente os métodos com gradiente apresentam melhores resultados quando
comparado aos do tipo isocrático, pois possibilitam a separação de um maior número de
compostos. Todavia apresenta como inconveniente maior tempo de análise, visto que há a
necessidade de reequilibrar a coluna após cada injeção. Na tentativa de reduzir os efeitos de
grupos ácidos da coluna, que atuam como interferentes na estabilidade dos carotenoides,
30
modificadores como a trietilamina tem sido adicionados à fase móvel (MELÉNDEZMARTÍNEZ et al. 2007b; PROVESI, 2010; MEZZOMO, 2012).
Assim, é necessário selecionar a coluna e fase móvel de maneira adequada para
proporcionar o sucesso da separação e recuperação dos carotenoides. Cabe ressaltar, que os
espectros de absorção dos carotenoides são extremamente dependentes do solvente utilizado
para análise, uma vez que durante o procedimento podem ser utilizados solventes em eluição
isocrática ou por gradiente, fator que pode interferir na ordem de eluição dos carotenoides
analisados (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999).
Os detectores mais utilizados para separação de carotenoides são o ultravioleta-visível
(UV-Vis) e o de arranjo de diodos (DAD) e quando as matrizes são muito complexas acoplase a esta técnica um espectro de massas. A identificação dos carotenoides também pode ser
feita através da comparação das características dos espectros, ordem de eluição, cocromatografia com padrões comerciais e/ou produzidos em laboratório (RODRIGUEZAMAYA, 1999).
Nota-se que os estudos científicos voltados para a determinação de carotenoides da
microalga Spirulina, empregam as mais diversas condições cromatográficas para análise,
fatores que dificultam a reprodutibilidade dos experimentos e a comparação dos resultados.
São utilizados injetores manuais e automáticos com injeções entre 10 e 20 L, colunas
cromatográficas C18 e C30 de diferentes marcas (ex: R-Sil C18, ODS Hypersil, Spherisorb ODS
2, Novapack C18, Chromosil C18, XTERRA C18, Spherisorb S5 ODS2, Pronto SIL C30 e
YMC C30)
e tamanho de partículas (3 a 5 m), a depender do objetivo do estudo
(OLAIZOLA & DUERR, 1990; CARERI et al. 1999a; CARERI et al. 1999b; CARERI et al.
2001; JAIME et al. 2005; ABD EL-BAKY et al. 2007; WANG et al. 2008; LEEMA et al.
2010; ALENCAR et al. 2011; YU et al. 2012).
Os detectores mais utilizados nesses trabalhos são o DAD e o UV-Vis, sendo
empregadas fases móveis com as mais variadas composições [metanol:tetrahidrofurano,
metanol:acetonitrila, acetonitrila:metanol (acetato de amônio):diclorometano, metanol
(acetato de amônio), metanol:éter tert metil butílico:água (com ou sem acetato de amônio),
metanol:água, acetonitrila (trietilamina):metanol (acetato de amônio)] e proporções de
solventes com eluições do tipo isocráticas ou por gradiente (OLAIZOLA & DUERR, 1990;
CARERI et al. 1999a; CARERI et al. 1999b; CARERI et al. 2001; JAIME et al. 2005; ABD
EL-BAKY et al. 2007; WANG et al. 2008; LEEMA et al. 2010; ALENCAR et al. 2011; YU
et al. 2012).
31
No intuito de identificar os carotenoides analisados, os autores comparam as
características dos picos das amostras com os padrões comerciais (OLAIZOLA & DUERR,
1990; CARERI et al. 2001; JAIME et al. 2005; ABD EL-BAKY et al. 2007; WANG et al.
2008; LEEMA et al. 2010; ALENCAR et al. 2011) e/ou padrões produzidos em laboratório
(NUNES & MERCADANTE, 2004; NUNES, 2005; YU et al. 2012) como também a
associação da CLAE a um espectro de massas (CARERI et al. 1999a; CARERI et al. 1999b),
ou a comparação dos espectros UV-Vis com os dados disponíveis na literatura (JAIME et al.
2005).
3.4. Métodos para avaliar a atividade antioxidante
A maioria dos efeitos benéficos dos componentes das microalgas é resultante de sua
atividade antioxidante, sendo propostos vários métodos para avaliar tais propriedades, que
diferem em relação ao mecanismo de reação adotado em ensaios químicos, e às espécies alvo,
em ensaios biológicos. Não obstante a diversidade de métodos para avaliar a capacidade
antioxidante, não existe um procedimento metodológico universal. Este fato impõe a
necessidade de avaliar a capacidade antioxidante por diferentes ensaios, com fundamentos e
mecanismos de ação diferentes para uma mesma fonte (ALVES et al. 2010; SOUZA et al.
2011; SOUZA, 2012).
Os métodos utilizados, para avaliar a atividade antioxidante se baseiam na capacidade
dos antioxidantes sequestrar radicais. Geralmente são analisadas pelo emprego de métodos
espectrofotométricos:
DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) e ABTS (2,2´-azino-bis-3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (CZERNIAKA et al. 2008). A escolha por estes métodos
baseia-se no fato destes serem considerados mais práticos, rápidos e sensíveis, sendo por isso,
amplamente empregados (BRAND-WILLIAMS et al. 1995; RE et al. 1999). Outra maneira
de se avaliar a atividade antioxidante é através da análise do teor de ácidos voláteis por
condutimetria. Esta análise baseia-se no registo das variações da condutividade da água
destilada, na qual se faz a coleta dos ácidos de baixo peso molecular, que são obtidos
normalmente após iniciação forçada da oxidação a uma temperatura e corrente de ar
selecionada para análise (SILVA et al. 1999).
3.4.1. Determinação da atividade DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)
O ensaio do DPPH consiste em avaliar a atividade sequestradora do radical 2,2difenil-1-picril-hidrazil, de coloração púrpura, que absorve em um comprimento de onda de
32
515 nm. Por ação de um antioxidante ou uma espécie radicalar (R), o DPPH é reduzido
formando 2,2-difenilpicril-hidrazina (DPPH-H), de coloração amarela, com consequente
desaparecimento da banda de absorção, sendo a mesma monitorada pelo decréscimo da
absorbância (FIGURA 4) (MOLYNEUX, 2004; RAMADAN, 2010).
FIGURA 4. Estrutura do DPPH e sua redução por um antioxidante. Fonte: RAMADAN, 2010.
A partir dos resultados obtidos, determina-se a porcentagem de atividade antioxidante
(quantidade de DPPH reduzido pelo antioxidante) ou sequestradora de radicais e/ou a
porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional, sendo que a quantidade de
antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada
concentração eficiente (CE50), também chamada de concentração inibitória (CI50). Quanto
maior for o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua
atividade antioxidante (SOUZA, 2012).
Herrero et al. (2004) ao determinarem os compostos antioxidantes da Spirulina
platensis, utilizando PLE com diferentes solventes, verificaram que o os extratos obtidos com
etanol possuiam boa atividade antioxidante, com valores de CE50 de 63,9-100,1g/ml quando
comparados com os obtidos pelo hexano (47,3-86,9 g/ml) e éter de petróleo (52,6-95,6
g/ml), como também é um solvente considerado GRAS, apresentando-se mais vantajoso
para os processos de extração.
No estudo realizado por Herrero et al. (2005) para determinar a atividade antioxidante
de extratos obtidos da Spirulina platensis, utilizando extração por ASE, foram encontrados
valores de CE50, de 83,2-100,5 g/ml para os extratos obtidos com etanol, 70,5-110,3 g/ml
para os extratos de hexano e de 67,9-117,9 g/ml para os extratos de éter de petróleo. Estes
autores concluíram que a polaridade dos solventes utilizados no processo de extração
influencia diretamente nos resultados de CE50 e que o etanol apresenta boa atividade
antioxidante quando comparado aos demais solventes, além disso, possui a vantagem de ser
considerado GRAS.
33
Ao otimizarem a extração de antioxidantes da microalga Dunaliella salina através da
extração por PLE, Herrero et al. (2006) verificaram que os extratos obtidos com hexano
apresentaram as melhores atividades antioxidantes (0,749-1,118 g TEAC.g-1), quando
comparados com os extratos dos demais solventes (0,165-0,353 g TEAC.g-1 para o etanol,
0,0107-1,118 g TEAC.g-1 para água), todavia concluíram que o etanol é o solvente
apropriado para o processo de extração em matrizes alimentícias por ser considerado GRAS.
Mendiola et al. (2007) ao avaliarem a atividade antioxidante dos compostos funcionais
da Spirulina platensis obtidos por fluído supercrítico, encontraram valores de CE50, estimado
pela inibição do DPPH de até 297,8 g/ml, comparados aos obtidos pelo ácido ascórbico (4,4
µg/ml) e do antioxidante sintético - BHT (14,4 µg/ml). Por apresentar tal característica, esta
microalga é vista com grande potencial para a obtenção de antioxidantes naturais.
Ao estudarem o efeito da temperatura e concentração de nitrogênio no meio de cultivo
sobre o potencial antioxidante da Spirulina platensis, Colla et al. (2007b) concluíram que
quando esta microalga é cultivada a uma temperatura de 35ºC e com concentrações de nitrato
de sódio de 1,8 g.L-1 e 2,5 g.L-1, o potencial antioxidante dos extratos fenólicos obtidos foram
de 29 e 35%, respectivamente. Dessa forma, as condições de cultivo nas quais as microalgas
são submetidas podem influenciar na concentração destes compostos na biomassa das
mesmas.
Em estudo para determinar a atividade antioxidante in vitro de extratos fenólicos das
microalgas Spirulina platensis e Chlorella sp., Souza (2012) verificou que a Spirulina
platensis apresentou
maior conteúdo de compostos fenólicos (1,1 mgGAE/gmassa
comparação com a Chlorella sp. (0,65 mgGAE/gmassa
seca),
seca)
em
como também maior capacidade
sequestrante de radicais livres, inativando 53,5% do DPPH reativo em 180 minutos (CE50 de
70 µgácido
gálico/mL),
além disso limitou o escurecimento enzimático ocasionado pela
peroxidase em 55%.
Cabe ressaltar que a maior parte dos estudos científicos (HERRERO et al. 2004;
HERRERO et al. 2005; HERRERO et al. 2006; SANTOYO et al. 2006; MENDIOLA et al.
2007), não especifica qual o componente da microalga está sendo analisado, refere-se apenas
a avaliação dos extratos antioxidantes de maneira geral, podendo compreender tanto os
carotenoides como os compostos fenólicos, já que estes apresentam importante ação
antioxidante para os organismos vivos. A não especificação dos compostos a serem analisados
dificulta, portanto a reprodução dos métodos para um componente específico.
34
3.4.2 Oxidação acelerada em Rancimat
O Rancimat é o método padrão utilizado para medir a estabilidade oxidativa de óleos
vegetais e gorduras, este se baseia na decomposição térmica dos componentes da amostra. Os
produtos formados nesta decomposição são arrastados por um fluxo de ar de uma célula de
medição abastecida com água destilada e o tempo de indução determinado pela medida da
condutividade. Apresenta-se como um método vantajoso quando comparado com os demais
testes que são realizados à temperatura ambiente, já que estes são considerados tediosos e
demandam tempo de análise (FIGURA 5) (SILVA et al. 1999; COOPIN & PIKE, 2001;
OETTERER et al. 2006; FARHOOSH, 2007; WANG, 2010; SANTOS, 2010).
De acordo com Antolovich et al. (2002), os testes de oxidação acelerada em Rancimat,
também são utilizados para avaliar a eficácia antioxidante de compostos que apresentam este
potencial, uma vez que os resultados quantificados através da medição do tempo de indução
de uma amostra (controle e/ou adicionada de antioxidantes) além de informar a respeito do
menor e/ou maior tempo de indução obtido, podem indicar sobre potencial antioxidante da
amostra.
FIGURA 5. Representação esquemática do funcionamento do Rancimat (METROHM, 2009).
Com o objetivo de retardar os processos oxidativos, provenientes das reações de
oxidação lipídica (aparecimento de sabores e odores estranhos), alguns compostos
antioxidantes são adicionados aos óleos vegetais. Estas substâncias podem ser sintéticas tais
como: butil hidroxianisol (BHA), butil hidroxitolueno (BHT), propil galato (PG) e terc-butil
hidroquinona (TBHQ) ou naturais como: pigmentos, vitamina E, flavonoides, ácido
ascórbico, fenois, ácidos fenólicos, fosfolipídios, aminoácidos, ácidos fítico e esterois, que
35
são substâncias encontradas largamente na natureza (RAMALHO & JORGE, 2006;
CASTELO-BRANCO & TORRES, 2011; MACHADO, 2011).
Dos antioxidantes sintéticos mais utilizados na indústria de alimentos, em óleos e
gorduras, estão o BHA, BHT, PG e TBHQ. Estes antioxidantes possuem uma estrutura
fenólica que doa um próton a um radical livre, regenerando, a molécula do acilglicerol e
interrompendo o mecanismo de oxidação por radicais livres. O TBHQ é mais utilizado para
retardar a oxidação de óleos, pois resiste ao calor, não altera o sabor ou o cheiro do material e
pode ser utilizado em menor concentração (RAMALHO & JORGE, 2006). No Brasil, o uso
deste antioxidante é controlado pelo Ministério da Saúde, sendo a concentração máxima
permitida em óleos e gorduras igual a 200 mg Kg-1 (BRASIL, 2005).
Todavia nos últimos anos o emprego de antioxidantes sintéticos na indústria de
alimentos tem sido alvo de questionamentos devido aos efeitos negativos que os mesmos
podem representar para a saúde. Dessa forma, diante do interesse do consumidor por produtos
naturais e seguros para a saúde, pesquisas estão voltadas para a busca de compostos naturais
que apresentem esta propriedade funcional, como alternativa para prevenir a deterioração
oxidativa de alimentos e diminuir o uso de antioxidantes sintéticos (ÖZCAN & ARSLAN,
2011; MALHEIRO et al. 2013; TAGHVAEI et al. 2014).
Souza (2012) ao estudar a atividade antioxidante in vitro de extratos fenólicos das
microalgas Spirulina platensis e Chlorella sp., verificou que os extratos fenólicos obtidos da
Spirulina platensis quando adicionados em óleo de oliva, inibiu a peroxidação lipídica em
46% após 14 dias e 31% após 21 dias de armazenamento. Observa-se que está técnica é válida
para a análise da oxidação lipídica em alimentos, todavia é considerada tediosa e demanda
tempo para a realização do procedimento. Caso fosse utilizado o ensaio acelerado de
oxidação, estes resultados poderiam ser obtidos com um menor tempo de análise e maior
reprodutibilidade (WANG et al. 2010).
Nos estudos de Zeb & Murcovic (2010, 2011, 2013a, 2013b), ao utilizarem o
Rancimat para analisar a estabilidade oxidativa de óleos vegetais (óleo de milho, canola,
girassol, triacilglicerois e azeite de oliva) e adicionados de -caroteno (300 g/g) verificaram
que a concentração deste diminuiu em função do tempo de aquecimento sendo degradado nas
primeiras horas (3-5 horas) de tratamento térmico. Verificaram também, que os óleos vegetais
utilizados nos experimentos foram mais estáveis durante o tratamento térmico, na presença de
-caroteno, quando o mesmo apresentava em sua composição outras substâncias, tais como:
36
tocoferóis, ácido oleico, compostos fenólicos, dentre outras, visto que podem atuar
sinergicamente com este pigmento retardando a oxidação lipídica.
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46
CAPÍTULO II
Carotenoides da Microalga Spirulina platensis: Obtenção e Avaliação da Atividade
Antioxidante
Artigo em fase de tradução para submissão à Revista Journal of Agricultural and Food
Chemistry
47
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi obter carotenoides a partir da microalga Spirulina platensis
utilizando um planejamento experimental fatorial completo e comparar com o método de
extração convencional, bem como avaliar a atividade antioxidante dos extratos. Verificou-se
que o conteúdo de carotenoides obtido através da extração convencional foi de 272,26 ± 8,52
g/g e utilizando razão massa:volume de 0,5:15 (g/mL), 5 extrações de 30 min. e temperatura
de 35ºC (condição ótima do planejamento) foi de 250,71 ± 4,34 g/g, apresentando como
vantagens a utilização de solvente Generally Recognized As Safe (GRAS), menor tempo total
de análise e menor gasto de solvente. A separação por CLAE mostrou que o all-trans-caroteno foi o principal carotenoide encontrado nesta microalga. Os extratos de carotenoides
apresentaram uma porcentagem de inibição do radical DPPH de 53,73 ± 0,44% (extração
convencional) e de 45,06 ± 0,34% (condição ótima do planejamento). Os resultados da
oxidação acelerada em Rancimat sugerem que o extrato de carotenoides obtido na condição
ótima do planejamento experimental tem potencial para uso como antioxidante natural em
óleo de palma refinado.
PALAVRAS-CHAVE: extração; planejamento experimental; atividade antioxidante; óleo
de palma refinado; Rancimat.
48
ABSTRACT
The aims of this study were to obtain carotenoids of Spirulina platensis using experimental
design and compare with the traditional extraction method, as well as evaluating the
antioxidant activity of the extracts. The results showed that content of carotenoids obtained by
traditional extraction method was 272.26 g/g and using 0.5:15 g/mL, 5 extractions, 30 min.
and 35ºC (optimum condition in the experimental design) was 250.71 g/g presented as
advantages of lower total analysis time and lower expense of solvents GRAS. The separation
by HPLC showed that the all-trans--carotene was principal carotenoid this microalga. The
extracts of carotenoids obtained presented percent inhibition the DPPH the 53.43%
(traditional extraction method) and 45.06% (optimum condition in the experimental design).
The results of test Rancimat suggest that the extract added refined palm oil can be used as a
natural antioxidant.
KEYWORDS: extraction; experimental design; antioxidant activity; refined palm oil;
Rancimat.
49
1. Introdução
Há um grande interesse pela utilização de microalgas em processos biotecnológicos,
principalmente pela identificação de substâncias sintetizadas por estes organismos, que podem
ter aplicabilidade comercial na nutrição, saúde humana e animal, como também na indústria
de alimentos à medida que o uso de corantes naturais em alimentos vem se tornando uma
tendência atual, devido à demanda dos consumidores por produtos naturais que tragam
benefícios à saúde.1-5
A Spirulina platensis é uma cianobactéria filamentosa de cor verde-azulada, composta
por diferentes compostos, tais como, ficocianinas, carotenoides, compostos fenólicos e ácidos
graxos polinsaturados. Tem sido investigada por apresentar propriedades medicinais,
nutricionais e terapêuticas que podem auxiliar no tratamento de problemas de saúde1,4,6-8 e
também por apresentar em sua biomassa o pigmento -caroteno em níveis de 0,5 a 1-2 g kg-1
de matéria seca.8,9
Como os carotenoides, em especial o -caroteno, é um composto de grande interesse
para a indústria de alimentos, por apresentar poder corante e propriedades funcionais que
formam a base de diversas funções e ações em organismos vivos, como atividade de próvitamina A, propriedade antioxidante10-13 e utilidade na conservação de alimentos, por
retardar os processos de oxidação lipídica,6,11-14 a Spirulina platensis apresenta-se como uma
fonte alternativa para a produção deste pigmento em escala comercial e industrial.
Alterações decorrentes da oxidação lipídica são indesejáveis nos alimentos, visto que
esta reação reduz a qualidade e o valor nutricional dos mesmos. Os produtos formados por
este processo podem ser perigosos para a saúde, uma vez que estão associados ao
envelhecimento, doenças cardíacas e câncer.15,16 Assim, a adição de antioxidantes sintéticos
ou naturais nos alimentos, se faz necessária para retardar a oxidação de lipídios presentes na
composição dos mesmos.
50
Antioxidantes sintéticos tais como: butil hidroxianisol (BHA), butil hidroxitolueno
(BHT) e terc-butil hidroquinona (TBHQ) são bastante utilizados na indústria de alimentos
para retardar os processos oxidativos provenientes das reações de oxidação lipídica,
principalmente de óleos e gorduras. Todavia, o emprego destes, tem sido alvo de
questionamentos devido aos efeitos negativos que os mesmos podem representar para a saúde
humana. Por este motivo, pesquisas estão sendo realizadas com o intuito de encontrar
compostos naturais que possam substituir os antioxidantes sintéticos.17-21
Pensando na obtenção de compostos naturais que se apresentem seguros para a
utilização na indústria de alimentos, saúde humana e para o meio ambiente, vários métodos
estão sendo desenvolvidos para a obtenção de carotenoides a partir de microalgas.1-4,8,22-24
Dentre estes métodos, destaca-se a extração por solventes orgânicos (SE), que tem sido uma
técnica bastante utilizada para a obtenção de diversos compostos bioativos (carotenoides,
compostos fenólicos, flavonoides, dentre outros compostos antioxidantes) das mais variadas
matérias-primas.25
Apesar de ser considerada uma técnica trabalhosa e utilizar solventes orgânicos no
processo de extração, que por sua vez, podem apresentar riscos para a saúde humana por
serem considerados tóxicos, apresenta vantagens como: baixo custo e facilidade de operação,
além disso, pode ser adaptada para atender as necessidades de extração, como também é um
método bem estabelecido na indústria de alimentos.25
Sendo assim, quando a questão é a segurança dos produtos finais para o uso alimentar,
à seleção e a escolha dos solventes orgânicos a serem utilizados nos processos de extração de
carotenoides, é de fundamental importância. Dessa forma, devem-se buscar sempre
alternativas seguras, para a extração destes compostos, dando preferência, principalmente
aqueles solventes considerados seguros (Generally Recognized As Safe - GRAS).1,3,4,7
51
Diante deste cenário, o objetivo deste trabalho foi estudar a obtenção de carotenoides a
partir da microalga Spirulina platensis utilizando um planejamento experimental e comparar
com o método de extração convencional, bem como avaliar a atividade antioxidante dos
extratos obtidos. Para tal foi desenvolvido um planejamento experimental fatorial completo
(24), com pontos centrais, considerando quatro fatores (razão massa:volume, número, tempo e
temperatura de extração). Os extratos obtidos (extração convencional e condição ótima do
planejamento experimental) foram analisados e caracterizados por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE), a atividade antioxidante dos mesmos foi determinada pelo método
DPPH e o efeito antioxidante do extrato obtido na condição ótima do planejamento e do
TBHQ sobre a oxidação lipídica de óleo de palma refinado foi avaliado através da oxidação
acelerada em Rancimat.
2. Materiais e Métodos
2.1. Amostra
A microalga utilizada no presente estudo foi à Spirulina platensis LEB 18,
(Arthrospira LEB 18) isolada da Lagoa Mangueira no Sul do Brasil e cultivada em uma
planta piloto localizada no município de Santa Vitória do Palmar/RS (entre latitudes de 32º32’
05”S e 33º31’57”S).26 As amostras foram fornecidas pelo Laboratório de Engenharia
Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande (FURG) na forma seca (50ºC por 4 h em
secador de bandeja) e embalada a vácuo em sacos plásticos. Imediatamente após o
recebimento, a biomassa da Spirulina platensis foi liofilizada (Terroni LS 3000, Terroni, São
Carlos, São Paulo, Brasil) por 24h. Em seguida, as amostras foram armazenadas em frascos
âmbar, fechados em atmosfera inerte (nitrogênio), e mantidas em refrigeração (5ºC) até o
momento das análises.
52
2.2. Extração de carotenoides
2.2.1. Método convencional
A extração quantitativa de carotenoides a partir de 0,5 g da microalga foi realizada
segundo Rodriguez-Amaya (1999)27, utilizando-se acetona. Em seguida o extrato foi
submetido à saponificação com KOH 10% em metanol por uma noite a temperatura ambiente.
Após lavagem com água para a remoção do álcali, o extrato de carotenoides obtido foi
transferido para éter de petróleo (30-70ºC) e quantificado em espectrofotômetro UV-Vis
Lambda 25 (Perkin Elmer, Ayer Rajah Crescent, Singapore) através de leitura da absorbância
no comprimento de onda máximo de absorção do -caroteno (450 nm) em éter de petróleo, e
a concentração calculada considerando uma absortividade (A1%1cm) de 259228.
2.2.2. Planejamento experimental
Foi utilizado um planejamento fatorial completo (24), com pontos centrais para estudar
o efeito simultâneo de quatro variáveis (relação massa: volume, número de extrações, tempo
de extração e temperatura de extração) na extração de carotenoides da microalga Spirulina
platensis (Tabela 1), totalizando 19 experimentos (16 pontos do planejamento experimental
fatorial completo e 3 pontos centrais). Para a extração dos carotenoides da Spirulina platensis
0,5 g da microalga foi homogeneizada em uma incubadora de bancada tipo shaker (Model CT
712, Cientec, São Paulo, Brasil), considerando extração e saponificação simultâneas com
etanol. Após a remoção do álcali, a concentração de carotenoides foi mensurada utilizando
um espectrofotômetro UV-Vis de acordo com o método descrito no item 2.2.1. Os
experimentos foram realizados em triplicata. A inter-relação entre as variáveis independentes
foi estabelecida utilizando o modelo linear expresso pela equação 1:
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b4X4 + b12X1X2 + b13X1X3 + b14X1X4 + b23X2X3 + b24X2X4 + b34X3X4
+b1234X1X2X3X4
(1)
53
onde Y é a resposta prevista, X1, X
2,
X3 e X4 são as variáveis independentes, b0 é a média
global das observações , b1, b2, b3 e b4 são os efeitos lineares, b12, b13, b14, b23, b24, b34, e b1234
são as interações entre as variáveis independentes.
2.3. Análise de carotenoides por CLAE
Os extratos de carotenoides obtidos pelo método convencional de extração e condição
ótima do planejamento experimental foram inicialmente concentrados em rota evaporador
(Rotavapor R II, Büchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland) (T < 35°C), submetidos à
secagem com nitrogênio e armazenados em freezer antes da quantificação em CLAE
(Agillent, Waldbronn, Germany), equipado com degasser, sistema quaternário de bombas e
detector UV-Vis. Os carotenoides foram separados em coluna de fase reversa C30 250 × 4,6
mm, 3 μm (YMC), utilizando como fase móvel água:metanol:éter tert metil-butílico (MTBE)
(J. T. Baker-Mallinckrodt) em gradiente de 5:90:5 para 0:95:5 em 12 min., para 0:89:11 em
25 min., para 0:75:25 em 40 min. e para 0:50:50 até o final da corrida (60 min.), fluxo de 1
mL/min. e temperatura da coluna mantida a 33 °C.29 Os padrões de carotenoides foram
adquiridos da Sigma-Aldrich. Para a quantificação, curvas de calibração foram construídas
com all-trans--caroteno (5-50 μg/mL), all-trans-α-caroteno (2-25 μg/mL), luteína (1-65
μg/mL), criptoxantina (4-100 μg/mL), e zeaxantina (1-40 μg/mL). Os limites de quantificação
(LOQ) e detecção (LOD) foram 10,89 × 10−2 μg/g e 6,53 × 10−2 μg/g para all-trans-caroteno e 9-cis--caroteno; 1,15 × 10−2 μg/g e 6,9 × 10−3 μg/g para luteína; 3,51 × 10−2 μg/g
e 2,11 × 10−2 μg/g para criptoxantina; 1,59 × 10−2 μg/g e 9,56 × 10−2 μg/g para zeaxantina;
3,28 × 10−2 μg/g e 1,97 × 10−2 μg/g para all-trans--caroteno; e 7,43 × 10−2 μg/g e 4,46 × 10−2
μg/g para o -caroteno 5,6-epóxido, respectivamente.
54
2.4. Determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH
A atividade antioxidante dos extratos obtidos pelo método de extração convencional e
condição ótima do planejamento experimental foram mensurados com o uso do radical livre
DPPH de acordo com a metodologia proposta por Brand-Williams.30 Para isso foi preparada
uma solução de DPPH (20,0 mg) em metanol (50 mL) e esta armazenada a 4ºC. Para a
realização das medições da atividade antioxidante esta solução foi diluída na proporção de
1:10 em metanol. Alíquotas de 1 mL dos extratos de carotenoides foram adicionados a 3,0 mL
de solução de DPPH para obter volume final de 4 mL. A solução ficou em repouso por
30min. em temperatura ambiente no escuro, e a leitura da absorbância da mistura foi realizada
em espectrofotômetro UV-Vis Lambda 25 (Perkin Elmer, Ayer Rajah Crescent, Singapore) no
comprimento de onda de 515 nm. As análises foram realizadas em triplicata. Os resultados
foram expressos como a concentração de antioxidante requerida para decrescer a
concentração inicial de DPPH em 50% (EC50). O percentual de inibição (%) do DPPH foi
calculada de acordo com a equação 2:
% de Inibição = [(Acontrole - Ateste)/Acontrole)] x 100
(2)
onde: Acontrole é a absorbância do controle (solução de DPPH sem amostra) e Ateste é a
absorbância da amostra com a solução de DPPH.
2.5. Oxidação acelerada em Rancimat
O efeito antioxidante do extrato de carotenoides obtido da microalga Spirulina
platensis (condição ótima do planejamento experimental) e do antioxidante sintético TBHQ,
foi avaliado através do método de oxidação acelerada em Rancimat modelo 743 (Methrom,
AG, Herisau, Switzerland). As amostras de óleo de palma refinado, doadas pela Agropalma
S/A, (Companhia Refinadora da Amazônia, Belém/Pará, Brasil), foram submetidas à
determinação espectrofotométrica de carotenoides totais antes da adição do extrato de
55
carotenoides obtido da microalga conforme método descrito no item 2.2.1. Foram analisados
três lotes de óleo de palma refinado sem antioxidantes e adicionados de antioxidante sintético
(200 mg kg−1 TBHQ) e natural [extrato de carotenoides da microalga Spirulina platensis
obtidos da condição ótima do planejamento experimental (222,52 ± 12,10 mg kg−1)]. O
TBHQ foi adicionado às amostras de óleo de palma refinado e estas foram aquecidas a 35ºC
em banho-maria por 5 min. para dissolução completa do mesmo. O extrato de carotenoides,
previamente concentrado em rota evaporador ( 5 mL), foi adicionado às amostras de óleo de
palma refinado e estas levadas ao aquecimento por 5 min. a 35ºC para homogeneização,
sendo posteriormente submetidas à secagem com nitrogênio por 10 min. para a completa
remoção do solvente. Uma quantidade de 3,0 g de amostra foi cuidadosamente pesada
diretamente nos tubos de reação do equipamento, e submetida à análise a uma temperatura de
120ºC e fluxo de ar de 20 L/h. O processo de oxidação foi registrado automaticamente pela
mensuração da mudança na condutividade da água destilada e o tempo de indução (TI)
expresso em horas (h). Cada lote foi analisado em triplicata.
2.6. Análise estatística
Os dados da extração de carotenoides da microalga Spirulina platensis, obtidos através
do planejamento experimental fatorial completo (24) foram analisados pelo programa
Statistica 7.0 e Análise de Variância (ANOVA) foi utilizada para analisar os efeitos e
interações entre as variáveis independentes do planejamento experimental, considerado um
nível de confiança de 95% (p < 0,05) para o modelo estatístico.
Os resultados da determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH e da
oxidação acelerada em Rancimat foram analisados pelo teste de aleatorização Wilcoxon e
Kruskall-Wallis, respectivamente, considerando uma significância estatística de 95% (p <
0,05).
56
3. Resultados e Discussão
3.1. Obtenção de carotenoides
Os parâmetros analisados e as respostas obtidas no planejamento experimental fatorial
completo (24) estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Valores reais e codificados do planejamento experimental fatorial completo, tendo como resposta a
concentração média de carotenoides totais e o percentual de extração.
variáveis independentes
ensaios
variáveis dependentes
relação
massa:volume
(g/mL)
nº de
extrações
tempo
temperatura
carotenoides
totais (g/g)
extração
(%)a
(min)
(ºC)
1
- (0,5:10)
- (4)
- (20)
- (30)
227,48
83,55
2
+ (0,5:20)
- (4)
- (20)
- (30)
204,93
75,27
3
- (0,5:10)
+ (6)
- (20)
- (30)
231,64
85,08
4
+ (0,5:20)
+ (6)
- (20)
- (30)
221,25
81,26
5
- (0,5:10)
- (4)
+ (40)
- (30)
240,34
88,28
6
+ (0,5:20)
- (4)
+ (40)
- (30)
233,54
85,78
7
- (0,5:10)
+ (6)
+ (40)
- (30)
220,76
81,08
8
+ (0,5:20)
+ (6)
+ (40)
- (30)
256,15
94,08
9
- (0,5:10)
- (4)
- (20)
+ (40)
199,83
73,40
10
+ (0,5:20)
- (4)
- (20)
+ (40)
216,74
79,61
11
- (0,5:10)
+ (6)
- (20)
+ (40)
233,95
85,93
12
+ (0,5:20)
+ (6)
- (20)
+ (40)
214,97
78,96
13
- (0,5:10)
- (4)
+ (40)
+ (40)
239,90
88,12
14
+ (0,5:20)
- (4)
+ (40)
+ (40)
247,04
90,74
15
- (0,5:10)
+ (6)
+ (40)
+ (40)
239,54
87,98
16
+ (0,5:20)
+ (6)
+ (40)
+ (40)
257,44
94,56
17 (C)
0 (0,5:15)
0 (5)
0 (30)
0 (35)
245,83
90,29
18 (C)
0 (0,5:15)
0 (5)
0 (30)
0 (35)
252,16
92,62
19 (C)
0 (0,5:15)
0 (5)
0 (30)
0 (35)
254,15
93,35
R2 = 0,7545. a Porcentagem calculada em relação a extração convencional de carotenoides (272,26 ± 8,52 g/g).
Verificou-se que o total de carotenoides obtido pelo método de extração convencional
foi de 272,26 ± 8,52 g/g (Tabela 1). Em relação aos dados do planejamento experimental
57
nota-se que os melhores resultados em termos de rendimento de extração foram obtidos nos
experimentos 8 (256,15 µg/g; razão massa:volume 0,5:20 (g/mL), 6 extrações de 40 min. e
temperatura de 30ºC), 16 (257,44 µg/g; razão massa:volume 0,5:20 (g/mL), 6 extrações de 40
min. e temperatura de 40ºC) e pontos centrais (250,71 µg/g valor médio dos 3 pontos centrais,
razão massa:volume 0,5:15 (g/mL), 5 extrações de 30 min. e temperatura de 35ºC ).
Consequentemente foi escolhida como condição ótima a região dos pontos centrais,
em que foi utilizada razão massa:volume 0,5:15 (g/mL), 5 extrações de 30 min. e temperatura
de 35ºC, uma vez que o percentual de extração de carotenoides foi de 92,08% para essa
condição em relação ao teor obtido no método de extração convencional, o que representou
uma diferença de 2,00 e 2,50% para os pontos 8 e 16, respectivamente, além das vantagens de
menor tempo total de análise, menor gasto de solvente e utilização de etanol, considerado
GRAS e portanto seguro para a utilização e aplicação na indústria de alimentos.1-4
Cabe esclarecer que o objetivo deste estudo foi obter a maior quantidade de
carotenoides com o menor gasto de solvente e menor tempo de análise. Deste modo, em
nenhum momento foi feita a extração exaustiva de carotenoides para o método de extração
proposto pelo planejamento experimental, assim como reportado no estudo de Nunes &
Mercadante (2004) para obtenção de licopeno.31
Vale salientar que o método proposto para a extração de carotenoides da microalga
Spirulina platensis a partir do planejamento experimental quando comparado com a extração
convencional (em torno de 20 h) apresentou menor tempo total de análise (em torno de 5 h),
lembrando que este tempo total gasto foi decorrente de 2,5 h para extração, 1,5 h para
lavagem dos extratos já que estes foram preparados em triplicata e 1 h para a quantificação
em espectrofotômetro (considerando o tempo inicial de estabilização do equipamento).
Dessa forma, pensando no menor tempo de análise e no uso de solvente considerado
GRAS para a obtenção dos carotenoides, este método pode ser considerado viável para
58
aplicação em escala industrial, visto que a técnica com o uso de solventes para a extração de
carotenoides é bem estabelecida na indústria de alimentos.32
Análise de Variância (ANOVA) foi utilizada para estimar a significância estatística
dos efeitos e interações das variáveis independentes do planejamento experimental (Figura
1). Os resultados mostraram que as variáveis: número de extrações (B), tempo de extração (C)
e as interações entre as variáveis: razão massa:volume x tempo de extração (A x C); tempo de
extração x temperatura de extração (C x D); razão massa:volume x número de extrações x
tempo de extração (A x B x C); razão massa:volume x número de extrações x temperatura de
extração (A x B x D), apresentaram efeito significativo na resposta (p < 0,05) do
planejamento experimental proposto. Verificou-se que todas as variáveis apresentaram efeito
positivo na resposta, exceto, a interação entre as variáveis A x B x D.
8,65
C
4,17
AxC
-3,74
AxBxD
3,60
AxBxC
3,10
B
2,49
CxD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Efeitos
Figura 1. Gráfico de Pareto dos efeitos principais verificados no planejamento experimental fatorial completo.
Número de extrações (B); tempo de extração (C); razão massa:volume x tempo de extração (A x C); tempo de
extração x temperatura de extração (C x D); razão massa:volume x número de extrações x tempo de extração (A
x B x C); razão massa:volume x número de extrações x temperatura de extração (A x B x D).
59
O modelo proposto com base na concentração total de carotenoides (Tabela 1) explica
75,45% da variância dos dados experimentais (R2 = 0,7545), sendo assim, este pode ser
explicado considerando apenas as variáveis que apresentaram efeito significativo na resposta
(p < 0,05) (B, C, A x C, C x D, A x B x C e A x B x D). O modelo linear proposto pode ser
verificado na equação 3:
Y=231,54 + 4,12(B) + 11,49(C) + 5,54(AC) + 3,31(CD) + 4,79(ABC) – 4,97(ABD)
(3)
Esta falta de ajuste pode ser explicada considerando que a concentração de
carotenoides na microalga não depende apenas da presença ou ausência do pigmento em sua
biomassa, mas também das condições de cultivo, intensidade da luz e de fatores ambientais
que induzem o crescimento da microalga.
A composição dos extratos de carotenoides obtidos pelo método convencional de
extração (Figura 2A) e condição ótima do planejamento experimental (Figura 2B) analisados
por CLAE são mostrados na Figura 2.
60
Figura 2. Análise de carotenoides por CLAE em (A) extração convencional e (B) condição ótima do
planejamento experimental. Picos 1-7 representam: 1) luteína; 2) zeaxantina; 3) -caroteno 5,6-epóxido; 4)
criptoxantina; 5) all-trans--caroteno; 6) all-trans--caroteno; 7) 9-cis--caroteno.
Observou-se que os cromatogramas dos extratos de carotenoides da microalga
Spirulina platensis obtidos através do método de extração convencional e condição ótima do
planejamento experimental apresentaram composição similar. Os pigmentos identificados em
ambos os cromatogramas foram: luteína, zeaxantina, -carotene 5,6-epóxido, criptoxantina,
all-trans--caroteno, all-trans--caroteno e 9-cis--caroteno. Os picos 1, 2 e 5 não foram
quantificados porque estavam abaixo do limite de quantificação (Figura 2).
61
Verifica-se que em ambos os cromatogramas o pigmento all-trans--caroteno2,33,34 foi
o principal carotenoide desta microalga, contribuindo com 140,05 e 105,20 g/g do total do
conteúdo de carotenoides, para a extração convencional e condição ótima do planejamento
experimental, respectivamente. O conteúdo de all-trans--caroteno obtido através do método
de extração convencional, foi similiar ao apresentado no estudo de Gireesh et al. (2001)9,
sobre a produção de deutérios de -caroteno a partir do cultivo da microalga Spirulina
platensis com água enriquerida com deutério (D2O), em que o rendimento deste pigmento
ficou em torno de 140,00-175,00 g/g.
Como demostrado por outros autores
8,9
o -caroteno obtido de microalgas vem se
destacando e ganhando importância em escala comercial e biotecnológica, visto que estes
microrganismos apresentam características como: simples estrutura celular, rápida taxa de
crescimento, vivem em condições adversas (alta temperatura, alta salinidade, frio,
anaerobiose, foto-oxidação, pressão osmótica, exposição à radiação ultravioleta dentre
outros), podem ser encontrados nos mais variados ecossistemas aquáticos e terrestres, como
também, devido ao envolvimento deste pigmento na saúde humana (ação de pró-vitamina A e
atividade antioxidante )3,14 e do interesse da indústria de alimentos, uma vez que estes podem
ser usados como corantes e conservantes em alimentos4,8.
3.2. Atividade antioxidante
Os resultados da determinação da atividade antioxidante utilizando o método do
radical DPPH estão apresentados na Tabela 2.
62
Tabela 2. Atividade antioxidante (%) dos extratos de carotenoides obtidos da microalga Spirulina platensis.
Extratos
Tempo
extração convencional
30 min.
53,73 ± 0,44a
condição ótima
Letras iguais não diferem estatisticamente (p < 0,05).
45,06 ± 0,34a
Observa-se que os percentuais de inibição do radical DPPH foram de 53,73 e 45,06%
para os extratos de carotenoides obtidos pelo método de extração convencional e condição
ótima do planejamento, respectivamente. Estes resultados foram similares e não diferiram
estatisticamente (p < 0,05). Também foram similares aos resultados do estudo de Santoyo et
al. (2006)1, em que foram encontrados percentuais de inibição de DPPH de 46,00-67,00% e
50,00-59,00% para os extratos antioxidantes da microalga Spirulina platensis obtidos com
éter de petróleo e etanol, respectivamente, por extração com líquido pressurizado (PLE).
Os resultados da presente investigação sugerem que os compostos antioxidantes
obtidos a partir da microalga Spirulina platensis apresentam propriedades antioxidantes, dessa
forma, esta microalga pode ser considerada uma fonte promissora para a obtenção de
antioxidantes naturais e com aplicabilidade funcional na indústria de alimentos, no que diz
respeito ao desenvolvimento e fabricação de alimentos "saudáveis".25
3.3. Oxidação acelerada em Rancimat
As amostras de óleo de palma refinado adicionadas de TBHQ e do extrato de
carotenoides da microalga Spirulina platensis foram mais estáveis ao processo de oxidação
acelerada e apresentaram diferença estatística significativa em relação ao controle (óleo de
palma refinado sem adição de antioxidantes) (p < 0,05) (Tabela 3).
O óleo de palma refinado foi utilizado nesse estudo, devido a sua aplicabilidade na
indústria de alimentos em processos de fritura e outros processamentos térmicos.17,35,36 O
63
tempo de indução do óleo de palma refinado sem antioxidante foi próximo ao encontrado por
Anwar (2003)37 que relata o valor de 10,83 h para óleo de palma refinado, branqueado e
desodorizado (RBD), ao estudar a relação entre a utilização do equipamento Rancimat e o
Método do Oxigênio Ativo (AOM), no processo de oxidação lipídica de óleos e gorduras.
Tabela 3. Oxidação acelerada em Rancimat do óleo de palma refinado sem antioxidante e adicionado de
antioxidantes (TBHQ e extrato de carotenoides da microalga Spirulina platensis).
lote 1
óleo de palma refinado
lote 2
lote 3
tempo de indução (h)
Controle
9,00 ± 0,02a
7,86 ± 0,42a
8,44 ± 0,32a
antioxidante I1
14,85 ± 0,46b
14,30 ± 0,46b
14,15 ± 0,05b
antioxidante II1
13,07 ± 0,24b
14,33 ± 0,52b
10,43 ± 0,30b
1
Antioxidante I - TBHQ, antioxidante II - extrato de carotenoides. Valores que apresentam a mesma letra, numa
mesma linha ou coluna, não apresentam diferenças significativas (p < 0,05).
O óleo de palma adicionado com TBHQ apresentou maior estabilidade à oxidação
quando comparado às amostras controle e aquelas adicionadas com o extrato de carotenoides,
entretanto não apresentou diferença estatística em relação às últimas (p < 0,05). Estes
resultados estão de acordo com os estudos que relatam que o TBHQ é o antioxidante sintético
mais utilizado para retardar a oxidação de óleos vegetais e outros produtos, pois resiste ao
calor, não altera o sabor ou o cheiro do material e pode ser utilizado em menor
concentração.16,20,21,38
Entretanto, foi verificado também que o óleo de palma refinado adicionado com o
extrato de carotenoides da microalga Spirulina platensis apresentou efeito protetor similar ao
óleo de palma refinado adicionado com o antioxidante sintético TBHQ (Tabela 3). Os
resultados sugerem, portanto, que o referido extrato de carotenoides pode ser utilizado como
um antioxidante natural para prevenir a oxidação lipídica de óleo de palma refinado, estando
de acordo com o estudo de Kajimoto et al. (1996)39, em que a adição do -caroteno aos óleos
de oliva e de baleia, proporcionou efeito protetor na oxidação lipídica dos mesmos.
64
Associando estas informações as propriedades biológicas que o -caroteno apresenta
para a saúde humana, como também, por se tratar do pigmento mais interessante
economicamente, devido a sua aplicabilidade na indústria de alimentos, o extrato de
carotenoides obtido desta microalga pode ser considerado um antioxidante natural capaz de
substituir o antioxidante sintético para aumentar a vida de prateleira de óleos vegetais.
Zeb et al.12,13,40,41ao estudarem o efeito da adição de -caroteno na estabilidade
oxidativa de diferentes óleos vegetais (óleo de milho, canola, girassol, triacilglicerois e azeite
de oliva) verificaram que este pigmento é degradado nas primeiras horas (3-5 horas) de
tratamento térmico. Estes autores observaram também, que os óleos vegetais utilizados nestes
experimentos apresentaram maior estabilidade durante o tratamento térmico, na presença de
-caroteno, quando o mesmo continha em sua composição outras substâncias, tais como:
tocoferóis, ácido oleico, compostos fenólicos, dentre outras, visto que podem atuar
sinergicamente com este pigmento retardando a oxidação lipídica.
Cabe esclarecer que os óleos vegetais utilizados nestes estudos apresentam em sua
composição, ácidos graxos de cadeia insaturada, portanto mais susceptíveis a oxidação e
degradação dos seus constituintes, o que promove um maior consumo de -caroteno pela
amostra. Como o óleo de palma refinado é rico em ácido palmítico e oleico, tal característica
pode ter influenciado também no maior tempo de indução e, portanto conferindo maior
estabilidade oxidativa às amostras utilizadas no presente trabalho.37
Em conclusão, verificou-se que o conteúdo de carotenoides obtido utilizando a
condição ótima do planejamento experimental (razão massa:volume de 0,5:15 (g/mL), 5
extrações de 30 min. e temperatura de 35ºC) foi de 250,71 ± 4,34 g/g, sendo esse total
correspondente a 92,08% do teor obtido no método convencional, e apresentando como
vantagens a utilização de solvente GRAS, menor tempo total de análise e menor gasto de
solvente. O all-trans--caroteno foi o principal carotenoide encontrado na biomassa desta
65
microalga, independente do método de extração utilizado, dessa forma a obtenção de
carotenoides com o uso de solvente GRAS mostra-se viável para aplicação em escala
industrial. Os extratos de carotenoides obtidos pelo método de extração convencional e
condição ótima do planejamento experimental apresentaram potencial antioxidante e os
resultados da oxidação acelerada em Rancimat sugerem que o extrato de carotenoides
adicionado ao óleo de palma refinado pode ser usado como um antioxidante natural para
retardar a oxidação lipídica.
4. Agradecimentos
Os autores agradem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo financiamento do projeto Rede Nanobiotec AUX-PE-NANOBIOTEC
769/2009 e pela bolsa de mestrado.
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70
Conclusão Geral
O conteúdo de carotenoides obtido utilizando a condição ótima do planejamento
experimental (razão massa:volume de 0,5:15 (g/ml), 5 extrações de 30 min. e temperatura de
35ºC) foi de 250,71 ± 4,34 g/g, sendo esse total correspondente a 92,08% do teor obtido no
método convencional, e apresentando como vantagens a utilização de solvente GRAS, menor
tempo total de análise e menor gasto de solvente.
O planejamento experimental realizado mostrou que as variáveis, número de
extrações, tempo de extração e as interações entre as variáveis: razão massa: volume x tempo
de extração, tempo de extração x temperatura de extração, razão massa: volume x número de
extrações x tempo de extração e razão massa:volume x número de extrações x temperatura de
extração foram os fatores que apresentaram efeito significativo na resposta. Todas as variáveis
apresentaram efeito positivo na resposta, exceto, a interação entre as variáveis A x B x D.
Os pigmentos identificados por CLAE foram: luteína, zeaxantina, -caroteno 5,6epóxido, criptoxantina, all-trans--caroteno, all-trans--caroteno e 9-cis--caroteno. O alltrans--caroteno foi o principal carotenoide encontrado na biomassa desta microalga,
contribuindo com 140,05 e 105,20 g/g do total do conteúdo de carotenoides, para a extração
convencional e condição ótima do planejamento experimental, respectivamente.
Os extratos de carotenoides obtidos pelo método de extração convencional e condição
ótima do planejamento experimental apresentaram uma percentagem de inibição do radical
DPPH de 53,73 ± 0,44 e 45,06 ± 0,34%, respectivamente. Os resultados da oxidação
acelerada em Rancimat sugerem que o extrato de carotenoides adicionado ao óleo de palma
refinado pode ser usado como um antioxidante natural para retardar a oxidação lipídica.
71
ANEXOS
Anexo 1. Dados de ANOVA e efeitos obtidos do planejamento experimental para extração de
carotenoides da microalga Spirulina platensis.
Tabela 1. Dados de ANOVA do planejamento experimental para extração de carotenoides da microalga
Spirulina platensis.
Fonte de
Variação
Soma
Quadrática
Grau de
liberdade
Média
Quadrática
Fcalculado
Ftab(95%)
Fcalc/Ftab
Regressão
11441,34
6
1906,89
22,53
2,31
9,75
Resíduo
3723,68
44
84,63
Total
15165,03
50
Tabela 2. Efeitos para as variáveis obtidas pelo tratamento estatístico para a microalga Spirulina platensis.
Efeitos
p-valora
B
8,2350
0,0033
C
22,9883
0,0000
AxC
11,0800
0,0001
CxD
6,6175
0,0165
AxBxC
9,5858
0,0007
AxBxD
-9,9358
0,0005
Interações
R2 = 0,7545. a Significativo ao nível de confiança 95% (p < 0,05).
72
Anexo 2. Curvas de calibração utilizadas para quantificação dos carotenoides.
2.1. Curva de calibração para luteína
R=0,9993; y= 6.383.618,1283x - 2.440.624,8516
2.2. Curva de calibração para zeaxantina.
R=0,9996; y= 5.320.319,3243x + 3.054.303,8507
73
2.3. Curva de calibração para criptoxantina.
R=0,9911; y= 3.961.828,7494x + 8.874.416,3654
2.4. Curva de Calibração para all-trans--caroteno.
R=0,9998; y= 4.702.876,6974x - 2.046.377,6207
74
2.5. Curva de calibração para all-trans--caroteno.
R=0,9934; y= 2.966.829,6227x - 4.962.250,0373
75
Anexo 3. Tabelas do teste de aleatorização utilizando os testes de Wilcoxon e Kruskal-Wallis,
para DPPH e Rancimat.
Tabela 3. Resumo da porcentagem de redução de DPPH após 30 minutos de análise para os extratos de
carotenoides da microalga Spirulina platensis.
Tratamento
Min.
Media
Max.
Desv. Pad.
Extração Convencional
53,47
55,01
56,55
2,1779
Condição Ótima
43,03
44,44
45,85
1,9940
Tabela 4. Resumo do tempo de indução do óleo de palma refinado sem antioxidante e adicionado com TBHQ e
extrato de carotenoides da microalga Spirulina platensis.
Tratamento
Min.
Mediana
Media
Max.
Desv. Pad.
Sem antioxidante
7,74
8,60
8,45
9,02
0,6525
Com TBHQ
14,15
14,47
14,38
14,51
0,1973
Extrato carotenoides Spirulina
10,39
13,31
12,81
14,74
2,2171
76
Anexo 4. Prospecções tecnológicas sobre a microalga Spirulina platensis.
77
44
PROSPECÇÃO TECNOLÓGICA DA UTILIZAÇÃO DA Spirulina platensis
Tácila Alcântara Mendonça*1; Janice Izabel Druzian2; Itaciara Larroza Nunes3
1
Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Universidade
Federal da Bahia – UFBA – Salvador/BA – Brasil ([email protected]).
2
3
Faculdade de Farmácia, Departamento de Análises Bromatológicas, Universidade Federal da
Bahia - UFBA – Salvador/BA – Brasil.
Escola de Nutrição, Departamento de Ciência dos Alimentos, Universidade Federal da Bahia UFBA, Salvador/BA – Brasil.
RESUMO
A Spirulina platensis é uma cianobactéria de cor verde-azulada, fonte de nutrientes com
aplicabilidade ecológica, econômica e nutricional. O objetivo deste trabalho foi analisar as
potencialidades e evolução tecnológica, através dos depósitos de patentes em relação à utilização da
microalga Spirulina platensis, nos setores industriais. A pesquisa foi realizada a partir de palavras
chaves sobre o tema, nos bancos de dados de patentes do INPI, Espacent e WIPO. Verificou-se 207
patentes a respeito desta tecnologia, sendo que o cultivo da microalga (29,5%), indústria
farmacêutica (18,9%), indústria de alimentos (15,5%) e área médica (14,0%) são os principais
setores de sua utilização. Os principais países detentores de pedidos de patentes são República de
Móldova (74), Rússia (30), Japão (23) e Coréia (21). O Brasil possui somente 4 depósitos de
patentes e 1 concedida, sendo necessários mais incentivos para aumentar o seu cenário inovativo.
Palavras Chave: Spirulina platensis, tendências tecnológicas, prospecção, patentes.
ABSTRACT
Spirulina platensis is a blue-green cyanobacterium, nutrient source with applicability ecological,
economic, and nutritional. The aim of this study was to analyze the potential and technological
evolution, through patent applications on the use of Spirulina platensis, in the industrial sectors.
The survey was conducted from key words on the subject in the database of the INPI, European
Office, the Spacenet and WIPO. There are 207 patents regarding this technology, and the
cultivation of microalgae (29.5%), pharmaceutical industry (18.9%), food industry (15.5%) and
medical (14.0%) are the main sectors of use. The main countries of patent holders are the Republic
of Moldova (74), Russia (30), Japan (23) and Korea (21). Brazil has only 4 patent applications and
1 granted, requiring greater incentives aimed at increasing the innovative scenario of the country.
Key words: Spirulina platensis, technological trends, prospecting, patents.
Cadernos de Prospecção - ISSN 1983-1358 (print) 2317-0026 (online), 2012. vol.5, n.1, p.44-52
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Área tecnológica: Tecnologia de alimentos, produtos naturais.
INTRODUÇÃO
Microalgas são microrganismos que crescem geralmente em meio líquido, se multiplicam
rapidamente e são capazes de realizar fotossíntese oxigênica, produzindo biomassa rica em
compostos biologicamente ativos. Algumas espécies de microalgas são cultivadas comercialmente
como as espécies dos gêneros Chlorella, Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis
(Chlorophyceae) e Arthrospira (Spirulina) (Cyanophyceae) (DERNER et al., 2006), devido à
aplicabilidade na indústria de alimentos (COLLA et al., 2004; AMBROSI et al., 2008; SILVA,
2008; CHU et al., 2010), e para a produção de aditivos naturais, tais como -caroteno e astaxantina
(DERNER et al., 2006; GUEDES et al., 2011).
A Spirulina platensis é uma cianobactéria filamentosa de cor verde-azulada, encontrada em locais
como solos, pântanos, lagos alcalinos e águas salobras, marinhas e doces. Através da fotossíntese
converte os nutrientes em matéria celular e libera oxigênio (COSTA et al., 2003; BERTOLIN et al.,
2005; DERNER et al., 2006; AMBROSI et al., 2008). Esta microalga é composta por cerca de 6070% de proteína, e aminoácidos específicos (ESTRADA et al., 2001; COLLA et al., 2004;
AMBROSI et al., 2008) (os não essenciais - alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, ácido
glutâmico, glicina, histidina, prolina, serina e tirosina e os essenciais - isoleucina, leucina, lisina,
metionina, fenilalanina, treonina e valina) (AMBROSI et al., 2008).
É constituída também por carboibratos, minerais (ferro, cálcio, fósforo, magnésio, zinco, cobre,
cromo, manganês, o sódio e o potássio), vitaminas (biotina, ácido fólico, inositol, vitamina E, B12
(ESTRADA et al., 2001), B6, B3, B2, B1 e ácido pantotênico) (WANG et al., 2007; AMBROSI et
al., 2008), compostos fenólicos (ácido caféico, clorogênico, salicílico, sináptico e trans-cinâmico)
(ESTRADA et al., 2001; COLLA et al., 2007;), pigmentos fotossintéticos como clorofila a, luteína,
-caroteno, ficocianina, aloficocianina, dentre outros (ESTRADA et al., 2001; WANG et al., 2007;
SILVA, 2008; MALA et al., 2010; MOHAMMED & MOHD, 2011), e ácidos graxos como ácido
gama-linolênico, -linolênico, e o araquidônico (COSTA et al. 2003; COLLA et al., 2004; COLLA
et al., 2007; WANG et al., 2007; SILVA, 2008; CHU et al., 2010).
Estudos ‘in vitro’ e ‘in vivo’ mostram que as propriedades nutricionais da microalga Spirulina
platensis têm sido relacionadas com possíveis propriedades terapêuticas que podem auxiliar no
tratamento de problemas de saúde como diabetes, artrite, anemia, desnutrição, obesidade, tensão
pré-menstrual, doenças cardiovasculares, câncer, entre outros. Por esta razão tem sido adicionada
em produtos farmacêuticos, alimentares e comercializada principalmete como alimento funcional,
nutracêutico e/ou suplemento alimentar, devido ao seu elevado conteúdo de proteínas, ácido gamalinolênico, vitaminas e minerais que podem melhorar a qualidade nutricional das preparações
(ESTRADA et al., 2001; COLLA et al., 2004; HERRERO et al., 2005; COLLA et al., 2007;ABD
EL-BAKY et al., 2007; WANG et al., 2007; AMBROSI et al., 2008; CHU et al., 2010).
Nos últimos anos verifica-se o crescente interesse pela utilização de microalgas em estudos e
processos biotecnológicos, devido à aplicabilidade econômica, ecológica e nutricional,
principalmente pela identificação de substâncias sintetizadas por estes organismos, que podem ter
aplicabilidade comercial na nutrição, saúde humana e animal, como também no tratamento de águas
residuais, produção de energia e obtenção de compostos de interesse para as indústrias alimentares,
química, cosmética e farmacêutica, entre outras (COSTA et al., 2003; DERNER et al., 2006; DAOCadernos de Prospecção - ISSN 1983-1358 (print) 2317-0026 (online), 2012. vol.5, n.1, p.44-52
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LUN & ZU-CHENG, 2006; WANG et al., 2007; SILVA, 2008; AMBROSI et al., 2008; CHU et al.,
2010).
Diante desse cenário, o objetivo deste trabalho foi realizar um estudo de prospecção tecnológica
para avaliar o panorama mundial da utilização da Spirulina platensis, relacionando os documentos
de patentes depositados sobre a utilização e aplicação da microalga, bem como estabelecer quais
países são os principais detentores desta tecnologia.
METODOLOGIA OU ESCOPO
Essa prospecção tecnológica foi realizada entre os meses de agosto e setembro de 2012, tendo como
base os pedidos de patentes depositados no European Patent Office (Espacenet), na World
Intellectual Property Organization (WIPO) e no Banco de dados do Instituto Nacional de
Propriedade Industrial (INPI) do Brasil. O foco da pesquisa foi a microalga Spirulina platensis e sua
utilização e aplicação nos diversos setores industriais.
Para a obtenção dos dados foi elaborada uma estratégia de busca levando em consideração
palavras-chave como o nome científico da migroalga (Spirulina platensis, Arthrospira platensis e
Spirulina spp,) acrescida de alguns substantivos de interesse: alimento (food), suplemento
(supplement), cultivo (cultivation), biomassa (biomass), obtenção (obtaining), composição
(composition), cosmético (cosmetic), partículas (particles) e cápsulas (capsule), termos estes que
poderiam representar a forma como esta microalga poderia ser encontrada nos documentos de
patentes.
Foi utilizada a pesquisa avançada (Advanced Search) e os campos de pesquisa “título” e “resumo”
nos bancos de patentes durante o levantamento de dados. Foram excluídos documentos pertencentes
à mesma família de patentes. A prospecção tecnológica foi realizada por meio de coleta, tratamento
e análise das informações extraídas dos documentos de patentes encontrados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O resultado deste estudo revelou um universo total de 313 documentos de patentes referente à
tecnologia de interesse, entretanto isso não representa o valor total de invenções protegidas, visto
que uma patente pode ser depositada mais de uma vez em diferentes países devido ao direito da
territorialidade.
Após a análise das informações extraídas dos documentos da tecnologia de interesse, 206 patentes
foram incluídas no universo de dados dessa pesquisa. Foram encontradas 188 patentes na base
européia - Espacenet (no campo título e resumo), 13 na WIPO (no campo folha de rosto) e 05 na
base do INPI (no campo resumo, com palavras-chave em inglês).
Alguns relatos informam que o uso da Spirulina platensis na dieta humana está presente desde a
pré-história, sendo consumida, por exemplo, entre os povos antigos do Lago Texcoco (México) e
nativos do Lago Chade (África) (COSTA et al., 2007; COSTA & MORAIS, 2011). Entre os anos
de 1964 e 1965 pesquisadores franceses iniciaram os primeiros estudos a respeito da microalga,
devido às atividades de campo realizadas no Lago Texcoco no México (LEONARD, 1966).
Todavia, somente a partir da década de 1970 verificou-se um maior interesse a respeito desta
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matéria-prima, devido à publicação de estudos revelando as suas propriedades nutricionais,
medicinais e terapêuticas (CHAMORRO et al., 1996; AMBROSI et al., 2008).
Na Figura 1 é demonstrada a evolução anual de depósitos de patentes relacionados à utilização da
Spirulina platensis, nos diversos setores industriais (cultivo, medicina, farmacêuticas, alimentos,
dentre outros) entre 1971 a 2011. Entre os anos de 1975 a 1986 têm-se depósitos de pedidos
voltados à tecnologia básica de obtenção da microalga, refletindo possivelmente os resultados dos
estudos que associam a mesma a diversos fins comerciais, na alimentação humana e animal, no
tratamento de águas residuais, produção de energia e, principalmente, na produção de compostos
biologicamente ativos de interesse para as indústrias alimentares, química, cosmética e
farmacêutica, dentre outras (COSTA et al., 2003; KEPEKÇI & SAYGIDEGER, 2012).
Todavia, entre os anos de 2005 e 2007 há maior presença de pedidos de patentes (22), este resultado
possivelmente pode estar associado a um maior investimento financeiro em Ciência e Tecnologia
(C&T) por parte dos países investidores, na intenção de proporcionar maiores avanços na área de
pesquisa e de desenvolvimento da tecnologia de interesse. Vale ressaltar que essa ação é positiva,
pois permitirá o desenvolvimento de novos processos tecnológicos, como impulsionará a pesquisa e
o desenvolvimento científico a respeito da utilização da microalga em diferentes seguimentos
industriais.
25
20
15
10
5
0
Figura 1: Evolução anual de depósitos de patentes da microalga
Spirulina platensis entre 1971 e 2011. Fonte: Autoria
própria, 2012. Na Figura 2 verifica-se a distribuição de patentes de acordo a área de aplicação no setor industrial.
Nota-se que as formas de cultivo da microalga (29,5%), indústria farmacêutica (18,9%), indústria
de alimentos (15,5%) e área médica (14,0%) são os principais setores de utilização da microalga.
Verifica-se que apenas 4,8% destinam-se às atividades voltadas para a biotecnologia.
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O grande interesse pela forma de cultivar a microalga deve-se à possibilidade de modificar e criar
meios de cultivo com diferentes substratos, a fim de proporcionar a produção de uma biomassa rica
em determinados nutrientes como, por exemplo, proteínas, ácidos graxos polinsaturados, vitaminas,
dentre outros, matéria-prima que poderá ter aplicabilidade nos diversos setores industriais (LÉON,
2010; BERTOLIN et al., 2005).
Biotecnologia
5%
Medicina Cosméticos
Veterinária
3%
4%
Alimentação de
animais
8%
Agricultura
1%
Cultivo
30%
Área Médica
14%
Indústria de
Alimentos
16%
Indústria
Farmacêutica
19%
Figura 2: Distribuição de patentes de acordo área de aplicação.
Fonte: Autoria própria, 2012.
O interesse das indústrias farmacêuticas, de alimentos e área médica deve-se aos estudos ‘in vitro’ e
‘in vivo’ que revelam que a microalga Spirulina platensis apresenta propriedades nutricionais que
estão relacionadas com possíveis ações terapêuticas que podem auxiliar no tratamento de problemas
de saúde (ESTRADA et al., 2001; COLLA et al., 2004; HERRERO et al., 2005; COLLA et al.,
2007; ABD EL-BAKY et al., 2007; WANG et al., 2007; AMBROSI et al., 2008; CHU et al., 2010).
Além disso, estes setores industriais são os principais responsáveis pelo investimento financeiro em
pesquisas voltadas para ciência e tecnologia de novos produtos, uma vez que isso pode se traduzir
em fins comerciais e lucrativos para o país financiador, já que uma patente pode ser depositada em
diferentes países, com o objetivo de garantir o direito de exclusividade aos depositantes nos
mercados considerados mais relevantes, garantindo assim o direito territorial da patente.
Os principais países detentores de pedidos de patentes utilizando a Spirulina platensis (Figura 3)
são República de Moldova (74), Rússia (30), Japão (23) e Coréia (21). O Brasil apresenta apenas 4
depósitos de pedidos de patentes e 1 uma patente concedida a respeito desta tecnologia, sendo 4
desses depósitos realizados por universidades (Universidade de São Paulo, Universidade Federal do
Rio Grande e Universidade Federal do Paraná) e 1 por empresa privada nacional.
As patentes brasileiras (Tabela 1) depositadas no INPI tiveram o estado de São Paulo (3) como o
maior detentor das titularidades, e os pedidos de patentes estão voltados principalmente para
atividades de cultivo, sobretudo para a produção de compostos específicos (como ácidos graxos,
biopolímeros, proteínas, dentre outros). Cabe ressaltar que os principais centros de estudos e as
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melhores condições de cultivo em nível experimental da Spirulina platensis encontram-se na região
Sudeste e Sul do país, devido principalmente à infra-estrutura montada e dedicada exclusivamente
para a realização de pesquisas, aperfeiçoamento e desenvolvimento de técnicas acerca do cultivo, da
produção e utilização da biomassa microalgal.
Nota-se que no Brasil ainda existem poucos pedidos de patentes referentes a esta tecnologia e este
resultado pode estar associado à falta de uma tradição local sobre o assunto, imaturidade do sistema
de inovação, assim como a poucos incentivos do mercado brasileiro, universidades e políticas
governamentais mais elaboradas capazes de promover e permitir o avanço e desenvolvimento de
novas tecnologias.
80
74
70
60
50
40
30
30
23 21
20
18
2
2
2
2
1
1
Suécia
Georgia
Ucrânia
França
Taiwan
México
Itália
1
1
1
EP
3
Alemanha
3
Reino Unido
5
EUA
5
Lituânia
11
10
Brasil
Coréia
Romênia
China
Japão
Rússia
Rep. Moldova
0
Figura 3: Patentes depositadas por país no INPI, Espacenet e
WIPO. Sendo MD (República de Móldova), JP (Japão), RU (Rússia),
RO (Romênia),CN (China), KR (Coréia), BR (Brasil), US (Estados
Unidos), LT (Lituânia), SE (Suécia),GE (Georgia), UA (Ucrânia), FR
(França), TW (Taiwan), MX (México), IT (Itália), GB (Reino Unido),
DE (Alemanha), ES (Espanha). Fonte: Autoria própria, 2012 Tabela 1: Documentos de patentes no Brasil até setembro de 2012, sobre a microalga Spirulina platensis.
Data de
Título da Patente
Estado Depósito/
Item Número
Concessão
1
PI90032918
Processo de obtenção de um meio de cultura para a
produção de Spirulina spp
SP
2
PI08012709
Processo para produção de biomassa e proteínas por
microalgas
SP
Cadernos de Prospecção - ISSN 1983-1358 (print) 2317-0026 (online), 2012. vol.5, n.1, p.44-52
D.O.I.: 10.9771/S.CPROSP.2012.005.005
04/07/1990
23/01/2001
08/01/2008
50
3
PI08017026
Obtenção do extrato de ficocianina a partir de
Spirulina sp.
RS
12/02/2008
4
PI08051232
Método de aproveitamento de dióxido de carbono e seu
uso no cultivo de microorganismos fotossintetizantes
SP
19/11/2008
5
PI004637-2
Produtos cosméticos contendo extratos e componente
microalgais e proceso para a produção dos mesmos
PR
12/11/2010
Fonte: Autoria própria, 2012.
Numa tentativa de modificar este cenário, existem grupos científicos trabalhando com a Spirulina
platensis, a exemplo, temos a Rede de pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande/RS
(FURG) - REDE NANOBIOTEC (que reúne parcerias com universidades nacionais, internacionais,
empresas nacionais, governamentais e não-governamentais), cujo objetivo é proporcionar a
formação de uma massa crítica de recursos humanos bem como estimular o desenvolvimento de
produtos de alta tecnologia a fim de difundir o tema nanofotobiotecnologia no país. Com esse
estímulo e parcerias espera-se que o país desperte o interesse sobre o campo de inovações e invista
financeiramente na geração de novas tecnologias.
CONCLUSÃO OU COMENTÁRIOS FINAIS
A microalga Spirulina platensis apresenta-se em potencial de crescimento para a produção de novas
tecnologias, devido à aplicabilidade econômica (taxa de crescimento rápido), ecológica (cultivo
simples sem degradação do meio ambiente) e nutricional (devido às substâncias que são sintetizadas
pela mesma), o que representa potencial de utilização nas diversas áreas da tecnologia industrial.
As patentes depositadas nos bancos de dados estão voltadas principalmente para as áreas de cultivo,
indústria farmacêutica, indústria de alimentos e médica. O Brasil apresenta poucas patentes
depositadas e São Paulo é o principal estado detentor desta tecnologia. O fato de não existirem
muitas patentes depositadas no Brasil pode estar relacionada à falta de cultura local a respeito do
tema, bem como a falta de interesse do mercado brasileiro e incentivos que poderiam aumentar o
cenário de inovações voltadas para a origem de novas tecnologias.
Para que haja o desenvolvimento de novas tecnologias no Brasil se faz necessária a difusão
de informações a respeito do tema, como a combinação de políticas governamentais e estratégias
empresariais mais efetivas a fim de possibilitar a criação de um ambiente propício para impulsionar
a realização de atividades voltadas para a geração de inovações tecnológicas.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a CAPES pelo financiamento concedido ao projeto Rede Nanofotobiotec Rede integradora de nanotecnologia e biotecnologia microalgal para o desenvolvimento
científico/tecnológico e formação de recursos humanos (AUX-PE-NANOBIOTEC 769/2009).
REFERÊNCIAS
Cadernos de Prospecção - ISSN 1983-1358 (print) 2317-0026 (online), 2012. vol.5, n.1, p.44-52
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PROSPECÇÃO TECNOLÓGICA DA UTILIZAÇÃO DE MICROALGAS EM PROCESSO
DE EXTRAÇÃO DE CAROTENOIDES VOLTADOS PARA INSUMOS NA NUTRIÇÃO
HUMANA E ANIMAL
TECHNOLOGICAL FORECASTING OF THE USE IN PROCESS OF MICROALGAE
EXTRACTION OF CAROTENOIDS AIMED FOR SUPPLIES IN NUTRITION AND FEED
Tácila Alcântara Mendonça1; Ícaro Cazumbá2; Alberto O. Lima3; Itaciara Larroza Nunes4
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Universidade Federal da Bahia – UFBA – Salvador/BA – Brasil
[email protected]
2
Universidade Federal da Bahia – UFBA – Salvador/BA – Brasil
[email protected]
3
Universidade Federal de Bahia – UFBA – Salvador/BA – Brasil
[email protected]
4
Universidade Federal da Bahia – UFBA – Salvador/BA – Brasil
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Resumo
Microalgas atualmente apresentam grande potencial de utilização nos setores industriais devido à capacidade
destes em produzir biomassa rica em compostos biologicamente ativos como carotenoides. Diante dessa
situação, o presente estudo objetivou realizar um estudo de prospecção tecnológica para coletar informações
a respeito de técnicas de extração de carotenoides em microalgas. Para a realização da busca de patentes,
utilizou-se a base de dados do European Patent Office (Espacenet). Ao avaliar o cenário verificou-se
que o Japão (23) foi o país com o maior número de documentos de patentes e que o Brasil não possui
nenhum documento de patente a respeito desta tecnologia. A partir da década de 80 verifica-se uma maior
presença de pedidos de patentes (3 a 8). As principais áreas de aplicação dos documentos de patentes são:
extração (44), cultivo (23) e biotecnologia (14). As algas (54%) são os principais microrganismos envolvidos
nos processos de extração de carotenoides e que os principais pigmentos pesquisados em tais processos são o
-caroteno (32%) e astaxantina (10%), sendo a microalga Dunaliella sp (22) a mais utilizada. Nota-se,
portanto que o Brasil precisa de políticas mais eficazes e investimentos financeiros para modificar este
cenário.
Palavras-chave: Algas, tendências tecnológicas, prospecção, patentes.
Abstract
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Microalgae currently have great potential for use in industry due to their ability to produce biomass rich in
biologically active compounds such as carotenoids. Given this situation, this study aimed to perform a study
of technology foresight to collect information about techniques for extracting carotenoids in microalgae. To
perform the patent search, we used the database of the European Patent Office (Espacenet). When
evaluating the scenario was found that to Japan (23) was the country with the largest number of patent
documents and that Brazil has no patent document regarding this technology. From the 80's there is a greater
presence of patent applications (3-8). The main areas of application of patent documents are extracted (44),
culture (23) and biotechnology (14). Algae (54%) are the main microorganism involved in the processes of
extraction of carotenoids and that the main pigments such processes are researched in the -carotene (32%)
and astaxanthin (10%) being the microalga Dunaliella sp (22) the most used. Note, therefore that Brazil
needs more effective policies and investments to change this scenario.
Key-words: Algae, technological trends, prospecting, patents.
1. Introdução
Nos dias atuais, as microalgas vêm ganhando grande espaço dentro do panorama das
pesquisas mundiais, visto que são microrganismos que apresentam taxa de crescimento rápido,
possuem cultivo simples e são capazes de produzir biomassa rica em compostos biologicamente
ativos como, por exemplo, vitaminas, proteínas, ácidos graxos insaturados, dentre outros e de
interesse para as indústrias alimentares, química, cosmética e farmacêutica (COSTA et al., 2003;
DERNER et al., 2006; DAO-LUN & ZU-CHENG, 2006; WANG et al., 2007; SILVA, 2008;
AMBROSI et al., 2008; CHU et al., 2010).
Uma das mais antigas utilidades das microalgas é na alimentação humana, uma vez que,
desde a idade antiga, povos antigos do Lago Texcoco (México), nativos do Lago Chade (África) e
Ásia já consumiam os produtos feitos com a biomassa da Spirulina spp e outras microalgas do
gênero Nostoc, sendo as mesmas empregadas principalmente para o suprimento de proteínas
(DERNER et al., 2006; LÉON, 2010; BARROS, 2010; MAGRO, 2010; MENDONÇA et al., 2012).
Algumas espécies de microalgas são cultivadas comercialmente, devido à aplicabilidade na
indústria de alimentos, pois são empregadas para a produção de aditivos naturais, tais como caroteno e a astaxantina, dentre as principais microalgas temos as dos gêneros Chlorella, Dunaliella
salina, Haematococcus pluvialis e Arthrospira (Spirulina) (DERNER et al., 2006; COLLA et al.,
2004; AMBROSI et al., 2008; SILVA, 2008; CHU et al., 2010; GUEDES et al., 2011).
O interesse na produção de carotenoides a partir de microalgas deve-se ao fato deste
pigmento representar um tema de importância científica e comercial. Como estes pigmentos são
sintetizados por microalgas, estes microrganismos têm sido visto com grande potencial para a
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produção dos mesmos, uma vez que são considerados recursos renováveis e com aplicabilidade
nutricional, econômica e nutricional (ARMSTRONG et al., 1997; MENDONÇA et al., 2012).
A biossíntese de carotenoides através de microalgas pode variar de acordo com as condições
do meio de cultivo, fatores ambientais e luminosidade. Certas espécies de microalgas quando
cultivadas em meios adequados, podem duplicar a sua biomassa diariamente, alcançando
produtividades de 30 a 50 g/m2dia em massa seca (PIRES et al., 2008; VALDUGA et al., 2009;
DUARTE, 2010). Sendo assim com os avanços e investimentos financeiros para a produção de
novas tecnologias, torna-se necessário o conhecimento do panorama de documentos de patentes que
se voltam para os processos de extração de carotenoides em microalgas.
Diante desse cenário, o objetivo deste trabalho foi realizar um estudo de prospecção
tecnológica no intuito de coletar informações a respeito de técnicas de extração de carotenoides em
microalgas, relacionando com os documentos de patentes depositados, bem como estabelecer quais
os países detentores desta tecnologia.
2. Metodologia
Essa prospecção tecnológica foi realizada entre os meses de fevereiro e março de 2013,
tendo como base os pedidos de patentes depositados no European Patent Office (Espacenet). A
pesquisa foi centralizada neste escritório, uma vez que, esta é uma base de dados gratuita e que
compila um acervo de patentes depositadas em mais de 90 países. O foco da pesquisa foi o
levantamento de dados a respeito de técnicas de extração de carotenoides em microalgas.
Para a obtenção dos dados foi elaborada uma estratégia de busca levando-se em
consideração palavras-chave como: extraction and caroten* e caroten* and alga* associados com
classificação internacional (C12P23/00), correspondente ao preparo de compostos contendo átomos
de carbono ligados por ligações duplas conjugadas. Foi utilizada a pesquisa avançada (Advanced
Search) e os campos de pesquisa “título” e “resumo” durante o levantamento de dados. Foram
excluídos documentos pertencentes às mesmas famílias. A prospecção tecnológica foi realizada por
meio de coleta, tratamento e análise das informações extraídas dos documentos de patentes
encontrados.
3. Resultados e discussão
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O resultado deste estudo revelou um universo total de 95 documentos de patentes referente à
tecnologia de interesse, entretanto isso não representa o valor total de invenções protegidas, visto
que uma patente pode ser depositada mais de uma vez em diferentes países devido ao direito da
territorialidade, dessa forma após o tratamento e análise das informações extraídas dos documentos
da tecnologia de interesse 81 patentes foram incluídas no universo de dados dessa pesquisa.
Derner et al., (2006), relata que o interesse pelo cultivo de algas transcende a escala
acadêmico-científica, uma vez que, os princípios ativos resultantes de sua exploração (proteínas,
vitaminas, ácidos graxos insaturados, pigmentos, dentre outros) é hoje algo de grande interesse no
âmbito da atividade industrial em alguns países, principalmente por representar interesse comercial.
A Figura 1 mostra os principais países detentores de pedidos de patentes, utilizando
microalgas. Verifica-se claramente que o Japão (JP) apresenta uma expressiva liderança nos
pedidos (23), seguido dos Estados Unidos da América (US), com 16, sendo a China (CN) e
Organização Europeia de Patentes (EP), com 8 e 7, respectivamente.
SE
CA
RU
IT
EA
PT
IL
FR
IN
KR
ES
DE
UA
AU
EP
CN
US
JP
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
4
7
8
16
23
0
5
10
15
20
25
Figura 1. Patentes depositadas por país no Espacenet. Sendo JP (Japão), US (Estados Unidos da América), CN (China),
EP (Organização Europeia de Patentes), AU (Austrália), UA (Ucrânia), DE (Alemanha), ES (Espanha), KR (Coréia), IN
(Índia), FR (França), IL (Israel), PT (Portugal), EA (Emirados Árabes Unidos), IT (Itália), RU (Rússia), CA (Canadá),
SE (Suécia). Fonte: Autoria própria (2012).
Este cenário reflete a forte tradição nipônica e sua relação com o uso de recursos marinhos
em diversos âmbitos. Magro (2010) cita que as bases para implantar processos tecnológicos
voltados para cultivos de algas foram estabelecidas principalmente nas décadas de 50 e 60 em
diversos países como Japão, Estados Unidos, Alemanha e Israel. Todavia o Japão foi o país pioneiro
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na produção de microalgas em escala comercial, principalmente de Chlorella (MATSUDO, 2006;
MAGRO, 2010; JACOME, 2010; SOUZA, 2012).
Sendo assim, o grande número de documentos de patentes pelo Japão, reflete o interesse
deste em utilizar os recursos naturais disponíveis, como o investimento financeiro, acadêmico e
tecnólogico de muitos anos e pelo fato de que isso pode se traduzir em fins comerciais e lucrativos
para o país financiador, visto que uma patente pode ser depositada em diferentes países,
principalmente aqueles considerados mais relevantes, no intuito de garantir proteção à tecnologia
que foi produzida e o direito de exclusividade aos depositantes (MENDONÇA et al., 2012).
Nota-se que no Brasil não tem pedidos de patentes referentes a esta tecnologia. Mendonça et
al., 2012 nos informa que esta situação pode ser resultado da falta de tradição local em relação ao
assunto, a imaturidade do sistema de inovação, bem como poucos incentivos do mercado brasileiro
em pesquisas nas universidades e políticas governamentais que permitam o avanço e
desenvolvimento de novas tecnologias.
Na Figura 2 é demonstrada a evolução anual de depósitos de patentes relacionados à
extração de carotenoides em algas, nos setores industriais (extração, cultivo e biotecnologia) entre
os anos de 1958 a 2012.
9
8
7
6
5
4
3
2
1
1958
1960
1962
1964
1966
1968
1970
1972
1974
1976
1978
1980
1982
1984
1986
1988
1990
1992
1994
1996
1998
2000
2002
2004
2006
2008
2010
2012
0
Figura 2. Evolução anual de depósitos de patentes entre os anos 1958 a 2012. Fonte: Autoria própria (2012).
Observa-se que entre o final da década de 50 e 70 existem poucos depósitos de patentes, isto
possivelmente deve-se ao período de investimentos para o aprimoramento de técnicas para o
cultivo, uma vez que foi neste período que ocorreram as bases de implantação de processos
tecnológicos neste aspecto, como também, o início de estudos acadêmicos e científicos voltados
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para investigar as características e potencial econômico das microalgas (LEONARD, 1966;
CHAMORRO et al., 1996; AMBROSI et al., 2008; MAGRO, 2010).
Contudo, a partir da década de 80 verifica-se uma maior presença de pedidos de patentes (3
a 8) em relação aos anos anteriores. Isto pode ser resultado da divulgação de estudos científicos
demonstrando que os compostos bioativos presente nas microalgas desempenham atividade
antioxidante, antiinflamatória, antimicrobiana, antifúngica, citotóxica e propriedades de inibição
enzimática (ESTRADA et al., 2001; HAJIMAHMOODI et al., 2010; CHU et al., 2010; SOUZA,
2012), como aplicabilidade em processos tecnológicos, e a um maior investimento financeiro em
Ciência e Tecnologia (C&T) por parte dos países investidores, na intenção de proporcionar maiores
avanços em pesquisa e desenvolvimento na tecnologia de interesse (MENDONÇA et al., 2012).
A Figura 3 mostra a distribuição de patentes de acordo à área de aplicação no setor
industrial. Nota-se que os documentos de patentes estão voltados para as tecnologias empregadas
para o processo de extração (44), seguido das técnicas de cultivo (23) e processos biotecnológicos
(14).
Biotecnologia
14
Cultivo
23
Extração
44
0
10
20
30
40
50
Figura 3. Distribuição de patentes de acordo área de aplicação. Fonte: Autoria própria (2012)
De acordo Mendonça et al., (2012), Léon (2010) e Bertolin et al., (2005) o interesse pelos
processos de cultivo deve-se a possibilidade de produzir meios de cultivo com diferentes substratos
e características, no intuito de proporcionar biomassa rica em determinados nutrientes, ou seja,
produzir matéria-prima que poder apresentar aplicabilidade nos diversos setores industriais. Devido
ao interesse em se produzir tecnologias com características renováveis a tendência é que esta
situação se modifique e volte-se principalmente para investimentos que abranjam os processos
biotecnológicos.
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Verifica-se (Figura 4) que as algas (54%), bactérias (17%) e fungos (10%) são os principais
microrganismos mais utilizados para os processos tecnológicos relacionados à obtenção de
carotenoides. Nota-se também que -caroteno (32%) e astaxantina (10%) são os principais
pigmentos de interesse em processos tecnológicos.
Algas
6%
Bactérias
13%
10%
54%
Fungos
17%
Demais
Carotenoides
10%
32%
b-caroteno
58%
Fungos e
Algas
Astaxantina
Outros
Figura 4. Microrganismos e carotenoides de interesse em processos tecnológicos. Fonte: Autoria própria (2012)
O interesse pela utilização de algas em processos tecnológicos deve-se ao fato destes
microrganismos serem considerados os sistemas biológicos de maior eficiência na captura de
energia solar para a produção de biomassa rica em compostos bioativos, como também por
apresentar rápida taxa de crescimento, cultivo simples sem prejuízos ao meio ambiente (fator que
possibilita o cultivo contínuo), utilização de substratos de baixo custo e pequeno espaço para
produção (DERNER et al., 2006; SILVA, 2008; VALDUGA et al., 2009; BARROS, 2010;
DUARTE, 2010; MAGRO, 2010; FERREIRA, 2011; SCHMITZ et al., 2012; SOUZA, 2012).
Tais características revelam que estes microrganismos apresentam grande potencial de
aproveitamento em estudos e pesquisas científicas, como também para a exploração de pigmentos
naturais ou de compostos químicos de interesse em larga escala, uma vez que a biomassa produzida
pode ser utilizada em diversos setores industriais (FERREIRA, 2011; SCHMITZ et al., 2012;
SOUZA, 2012).
O grande interesse pelos pigmentos -caroteno e astaxantina, deve-se ao fato destes serem
utilizados na indústria de alimentos como aditivos naturais (MENDONÇA et al. 2012; GUEDES et
al., 2011; CHU et al., 2010; AMBROSI et al., 2008; DERNER et al., 2006; COLLA et al., 2004).
Além disso, a utilização de pigmentos/corantes naturais em alimentos vem se tornando uma
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tendência atual, principalmente pelas crescentes exigências dos consumidores frente à busca de
produtos naturais e que tragam benefícios à saúde (SILVA, 2008).
A figura 5 mostra as principais microalgas utilizadas nos processos de extração de
carotenoides.
50
47
45
40
35
30
25
22
20
15
10
6
6
Chrorella sp
Haematoococcus sp
5
0
Dunaliella sp
Outros
Figura 5. Microalgas utilizadas nos processos de extração de carotenoides. Fonte: Autoria Própria (2012).
Nota-se que a Dunaliella sp (22) é a principal microalga utilizada nos processos de extração
de carotenoides nos documentos de patentes. Isto pode ser explicado pelo fato desta poder acumular
em até aproximadamente 10% -caroteno em sua biomassa, como também por ser considerada uma
das microalgas mais bem sucedidas em escala comercial, já que pode ser cultivada em altas e baixas
temperaturas, alta salinidade e vários tipos de água (DERNER et al., 2006; GUEDES et al., 2011;
AZEREDO, 2012).
Cabe ressaltar que a produção de carotenoides por microalgas é viável, visto que estes
pigmentos são produzidos naturalmente pelas mesmas, pois estes pigmentos desempenham várias
funções impotantes para as mesmas, tais como, atuam como pigmento acessório na captura da
energia solar, protege o aparelho fotossintético contra danos de fotooxidação e contra tensões
ambientais e de cultivo (PIRES et al., 2008; GUEDES et al., 2011).
A produção de algas está inserida no campo da aquicultura, sendo considerada uma
commoditie pela sua própria natureza produtiva de biomassa e princípios ativos derivados, por isso
também foi feita uma pesquisa com os códigos da classificação internacional de patentes na
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tentativa de buscar um maior número de documentos depositados. A Figura 6 mostra o número de
patentes por códigos e suas respectivas definições.
160
140
140
120
100
80
60
40
20
29
25
24
19
15
15
15
12
10
10
9
9
8
8
7
6
6
6
6
6
0
Figura 6. Distribuição das patentes relacionadas produção e extração de algas por códigos da classificação
internacional. C12P23/00: Preparação de compostos contendo átomos de carbono ligados por ligações duplas
conjugadas; C12N1/12: Processos de preparação ou de isolamento (meio de cultura) utilizando algas unicelulares;
C12R1/89: Processos utilizando microrganismos (algas); C07C403/24: Compostos acíclicos ou carbocíclico com
cadeias laterais substituídas por seis membros não-aromáticos; C09B61/00: Corantes de origem natural preparado a
partir de fontes naturais; A23K1/16: Ração para animais suplementada com esteroides, enzimas e hormônios;
A23L1/30: Ração para animais contendo aditivos; C12R1/645: Processos utilizando microrganismos (fungos);
C12N1/14: Processos de preparação ou isolamento (meio de cultura) utilizando fungos; A23L1/275: Ração para
animais com adição de corantes ou pigmentos; C12R1/01: Processos utilizando microrganismos (bactérias e
actinobactéria); C07C403/00: Derivados de ciclo-hexano ou ciclohexano com anéis beta-ionona; B01D11/02: Métodos
de extração com solvente de sólidos; C12N15/09: Mutação ou engenharia genética utilizando a tecnologia de DNA
recombinante; C12N1/02: Separação dos microrganismos de sues meios de cultura; A61K9/48: Preparações medicinais
em forma de capsulas; C12M1/33: Aparelho para cultivo de microrganismos para a produção de biomassa
(desintegração); B01D11/04: Métodos de extração com solvente de soluções que são liquidas; C12M1/12: Aparelho
para cultivo de microrganismos para a produção de biomassa (esterilização, filtração e diálise); C12P7/64: Preparação
de oxigênio contendo compostos orgânicos (gorduras e óleos gordos); A61P39/06: Ciência médica ou veterinária agentes captadores de radicais livres ou antioxidantes. Fonte: Autoria Própria (2012).
Nota-se que o código internacional de patente (CIP) mais empregado nos documentos de
patentes é o CP12P23/00 que se refere à preparação de compostos contendo átomos de carbono
ligados por duplas ligações conjugadas como, por exemplo, carotenoides.
4. Conclusões
Percebe-se que o Japão é o país com maior número de documentos de patentes, isso
significa interesse deste país em proteger a tecnologia de interesse e garantir direito de
exclusividade aos depositantes. Nota-se que o Brasil não apresenta patentes depositadas sobre esta
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tecnologia e isto pode estar associado à falta de cultura local a respeito do tema, e a falta de
interesse do mercado brasileiro e incentivos financeiros que poderiam contribuir para a mudança
deste cenário.
O “input” evolutivo no depósito anual de patentes é percebido a partir da década de 80. As
principais áreas de aplicação dos documentos de patentes são: extração, cultivo e biotecnologia
respectivamente. Todavia esta situação tende a modificar devido ao interesse na produção de
tecnologias com recursos biológicos e com grande potencial de crescimento, como é o caso da
utilização de microalgas. Esse emprego é devido principalmente à capacidade que estes
microrganismos têm em converter energia solar em biomassa rica em compostos de interesse nos
diversos setores industriais e tecnológicos.
Verifica-se que o Brasil por ser um país emergente, precisa estar à frente do seu tempo do
ponto de vista competitivo e comparativo em questões biotecnológicas e macroeconômicas, dessa
forma é preciso que haja a difusão de informações sobre a produção de tecnologias e a combinação
de políticas mais efetivas para possibilitar a criação de um ambiente propício para impulsionar a
realização de atividades voltadas para este fim.
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