Thanh filho tofu

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
Agroindustrial
Tese
EFEITOS DO TRATAMENTO HIDROTÉRMICO NA FORMAÇÃO DE
ISOFLAVONAS AGLICONADAS E NAS PROPRIEDADES
FUNCIONAIS DE ISOLADO PROTEICO DE SOJA
Ana Paula do Sacramento Wally Vallim
Pelotas, 2011
1
ANA PAULA DO SACRAMENTO WALLY VALLIM
EFEITOS DO TRATAMENTO HIDROTÉRMICO NA FORMAÇÃO DE ISOFLAVONAS
AGLICONADAS E NAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS DE ISOLADO PROTEICO DE SOJA
Tese
apresentada
Graduação
em
ao
Programa
Ciência
e
de
Pós-
Tecnologia
Agroindustrial da Universidade Federal de
Pelotas, como requisito parcial à obtenção do
Título de Doutor em Ciência e Tecnologia
Agroindustrial.
Orientador: Prof. Dr. Moacir Cardoso Elias
Co-Orientadores: Prof. Dr. Manoel Artigas Schirmer
Pelotas, 2011
2
Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744
)
V188e Vallim, Ana Paula do Sacramento Wally
Efeitos do tratamento hidrotérmico na formação de
isoflavonas agliconadas e nas propriedades funcionais de
isolado protéico de soja/ Ana Paula do Sacramento Wally
Vallim; Orientador Moacir Cardoso Elias; co-orientador
Manoel Artigas Schirmer. Pelotas, 2011. -135f. : il..- Tese
(Doutorado) –Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia Agroindustrial. Faculdade de Agronomia Eliseu
Maciel . Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2011.
1.Isoflavonas 2.Proteínas de soja 3.Encharcamento
hidrotérmico 4. I.Elias, Moacir Cardoso (orientador) II.
Título.
CDD 664.7
3
Comissão examinadora:
Prof. Dr. Moacir Cardoso Elias (orientador)
Prof. Dr. Manoel Artigas Schirmer (co-orientador)
Prof. Dr. Marcelo Zaffalon Peter
Prof. Dra. Márcia Arocha Gularte
Prof. Dr. Ricardo Peraça Toralles
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DEDICATÓRIA
Ao meu EMANUEL, sempre presente.
Aos meus pais Waldino e Olga Pilar (in memoriam) e aos meus irmãos
Luiz Eduardo, Márcio e Raquel.
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AGRADECIMENTOS
A Deus por depositar em mim seu grande amor, ao ponto de ser sacrificial. Não há alegria
maior em ver que Deus foi aquele que te capacitou a estar onde tudo parecia impossível.
Ao meu querido e sempre presente esposo Emanuel, que tem me ensinado muito sobre
Deus e seus meios de nos cuidar e amar. Você nasceu para colorir e alegrar meu jardim.
Grande ideia Deus teve quando nos uniu.
A minha mãe (in memoriam), que com tão pouco, sempre soube estimular-me aos estudos e
a vencer com fé em Deus, os obstáculos da minha vida escolar. Se não fosse esta fé aliada
às orações, não teria chegado até aqui, mas parado de trilhar este caminho escolar já na
quarta série. Ao meu pai, pelo amor em me educar com exemplos que carregaro comigo por
toda a vida. Aos meus irmãos Luiz Eduardo, Márcio e Raquel, por proporcionarem-me aquilo
que chamo de infância feliz e amizades duradouras.
Ao Prof. Dr. Moacir Cardoso Elias, pelo carinho, amizade e incentivo que vieram
acompanhados da orientação não somente deste trabalho, mas daqueles primeiros passos
de iniciação científica. Foram mais do que anos de orientação, foram anos de confiança, de
aprendizado, de inspiração e de grandes oportunidades. Tua persistência, firmeza e
exemplo de vida me possibilitaram trilhar caminhos muito satisfatórios. Hoje, tua vida faz
parte do meu testemunho diário. O meu mais profundo agradecimento.
Ao Prof. Dr. Manoel Artigas Schirmer, pelas inúmeras horas de orientação, que o deixaram
privados de muitos momentos com a família e amigos. Este ato só reafirma a paixão por não
somente produzir ciência, mas também de transformar a percepção e o entendimento das
pessoas. Hoje, sinto-me muito mais madura para receber o título de doutora do que quando
começamos os primeiros diálogos para finalização da tese. E não acaba por aqui minha
demonstração de gratidão - como não agradecer pelas risadas, muitas vezes frutos do
desgaste diário das discussões da tese, ou ainda, frutos da tua inteligência e criatividade.
Iniciei o trabalho tendo um orientador, mas saio dele tendo um grande amigo.
Ao Prof. Dr. Pedro Luis Antunes, pela incessante dedicação nas orientações e, acima de
tudo, pela fé que gerava e depositava em mim.
A Profa. Dra. Márcia Arocha Gularte, pela amizade e auxílio nas análises estatísticas.
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Aos meus colegas e amigos do Laboratório de Pós-Colheita, Industrialização e Qualidade de
Grãos da UFPel, pelo convívio e amizade com que marcaram minha vida. São nomes que
ficarão na minha história de vida. Como não lembrar da Alevina (Alexandra), sempre amiga
e dinâmica. Tua alegria contagiante me fez ser uma pessoa melhor. Quero agradecer
também ao Guilberth, Franciquet, Flavonoca, Fernanda, Schiavo, Mauricio, Bruna, Lariza,
Marcos, Nathan, Andressa, Gabriela e Shanise pela amizade e ajuda concedida na
execução das análises.
Aos meus amigos e amigas do Ministério Casa de Oração, muitas vezes, mais chegados
que irmãos, que sempre oraram e torceram por mim.
Aos meus amigos pastores, por acreditarem e lutarem comigo para a realização dos sonhos
de Deus em minha vida e por não se cansarem de me pastorear ao longo das campinas da
vida.
Á banca de defesa composta por Marcelo Zaffalon Peter, Márcia Arocha Gularte e Ricardo
Peraça Toralles, por representarem exemplos de dedicação, profissionalismo, garra e,
acima de tudo, amor pelo que se faz.
Ao Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, pela disposição do espaço físico
para realização da parte experimental do projeto.
À Universidade Federal de Pelotas, pela oportunidade e por disponibilizar as condições
necessárias para o meu desenvolvimento acadêmico e científico.
Ao CNPq, pela bolsa concedida.
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RESUMO
WALLY-VALLIM, Ana Paula do Sacramento. Efeitos do tratamento hidrotérmico na
formação de isoflavonas agliconadas e nas propriedades funcionais de isolado
proteico de soja. 2011. 135f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência
e Tecnologia Agroindustrial. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A soja pode conter até doze tipos de isoflavonas, dentre as quais somente as formas
desconjugadas, daidzeína, gliciteína e genisteína, são absorvidas diretamente no trato
gastrointestinal. As demais formas devem sofrer ação da enzima β-glicosidase intestinal
antes de serem absorvidas pelo organismo, ou que condições de processamento, como
encharcamento em grãos de soja sejam realizadas a fim de ativar a enzima β-glicosidase,
presente nos grãos, e promover a conversão das isoflavonas conjugadas no próprio grão,
aumentando a biodisponibilidade das isoflavonas. Objetivou-se verificar se o uso de
tratamentos hidrotérmicos realizados em grãos de soja promoveria aumentos no teor de
isoflavonas agliconadas, devido à ativação da enzima β-glicosidase do grão, e se haveria
permanência destes compostos em isolado proteico de soja. Os grãos de soja foram
tratados hidrotermicamente através de seu encharcamento em água na proporção de 1:5
(p/v, soja:água), em duas temperaturas (40 e 60°C) durante 4, 8, 12 e 16 horas. Os grãos
após secos (13%), moídos e desengordurados, originando a farinha desengordurada (FD), a
qual foi destinada à produção do isolado proteico de soja (IPS), originando o isolado e duas
frações do processo: o resíduo insolúvel (RS) e o sobrenadante (SB). A FD, o IPS, o RS e o
SB foram avaliados quanto ao teor de isoflavonas agliconadas e composição química a fim
de verificar a permanencia e a manutenção das isoflavonas no IPS frente aos tratamentos
hidrotérmicos. Os IPSs oriundos dos grãos tratados hidrotermicamente foram também
avaliados quanto suas características funcionais e nutriconais através das análises de
eletroforese, DSC, fenóis totais, atividade antioxidante, digestibilidade proteica, solubilidade,
capacidade de absorção de água, capacidade de formação e estabilidade da espuma,
colorimetria, análise de perfil de textura e microscopia eletrônica de varredura. Concluiu-se
que tratamentos hidrotérmicos realizados a 40°C promovem aumentos no teor de agliconas
na farinha desengordurada (FD) e no IPS, aumentos no rendimento de extração, no teor de
fenóis totais, na digestibilidade, na capacidade de formação e estabilidade da espuma. Os
tratamentos a 60°C, apesar de apresentarem menores rendimentos de extração de IPSs,
promoveram seletividade de proteínas com maior capacidade de interação com as
isoflavonas, produzindo IPSs com maior concentração de agliconas por grama de produto.
8
ABSTRACT
WALLY-VALLIM, Ana Paula do Sacramento. Efeitos do tratamento hidrotérmico na
formação de isoflavonas agliconadas e nas propriedades funcionais de isolado
proteico de soja. 2011. 135f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência
e Tecnologia Agroindustrial. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Soybeans may contain up to twelve types of isoflavones, of which only deconjugated s
forms, daidzein, glycitein and genistein, are absorbed directly into the gastrointestinal
tract. The other isoflavone forms must suffer of the enzyme β-glucosidase hydrolisys i the
gut before being absorbed by the body, or processing conditions, such as soaking in soy
beans are undertaken in order to activate the β-glucosidase enzyme, present in grains, and
promote conversion of conjugated isoflavones in the grain, increasing the bioavailability of
isoflavones. This study assessed the use of hydrothermal treatments performed in soybeans
to promote increases the isoflavone aglycone content due to the activation of the enzyme βglucosidase
of
the
grain,
and
investigates
these
compounds
in
soy
protein
isolate. Soybeans were treated hydrothermically through soaking in water at a ratio of 1:5
(w/v, soy:water), at two temperatures (40 and 60°C) for 4, 8, 12 and 16 hours.The beans
were dried to 13% moisture, milled and defatted, the resulting defatted flour (FD), was
destinatedd to produce the soy protein isolate (IPS), the process generated two fractions:
the insoluble residue (RS) and supernatant (SB). The FD, IPS, RS and SB were evaluated
for isoflavone aglycone and chemical composition in order to check the maintenance of
isoflavones in the IPS. The IPSs from grain treated hydrothermically were also evaluated for
functional and nutricona characteristics and l through electrophoresis analysis, DSC, total
phenolics, antioxidant activity, protein digestibility, solubility, water absorption capacity,
foaming capacity and foam stability, colorimetry , texture profile analysis and scanning
electron microscopy. It was concluded that hydrothermal treatments performed at 40°C
promotes an increase in content of aglycones in the defatted flour (FD). In IPS,
hydrothermal treatments increases its yield from extraction, total phenol content, digestibility,
in foaming capacity and foam stability. The treatments at 60°C, although having lower
extraction yields of IPSs, promoted selective isolation of proteins with greater ability to
interact with isoflavones, producing IPSs with higher concentrations of aglycones per grams
of product.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Estrutura química das isoflavonas presente na soja e possíveis modificações
dos conjugados................................................................................................22
Figura 2
Cinética de degradação da enzima β-Glicosidase nas temperaturas de 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas de tratamento hidrotérmico.........................64
Figura 3
Eletroforese em gel de policrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio
(SDS) dos isolados proteicos de soja proveniente de grãos sem tratamento e
tratados hidrotermicamente.............................................................................75
Figura 4
Termograma de DSC do isolado proteico de soja sem tratamento.................76
Figura 5
Cinética de formação de isoflavonas aglicona nas temperaturas de 40 e 60°C
durante 4, 8, 12 e 16 horas de tratamento hidrotérmico................................. 83
Figura 6
Micrografia dos isolados proteicos de soja tratados hidrotermicamente a 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas...................................................................105
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Estrutura química das 12 formas da isoflavona da soja................................23
Tabela 2
Delineamento experimental dos diferentes tratamentos hidrotérmicos sobre
grãos de soja...................................................................................................49
Tabela 3
Composição centesimal da farinha desengordurada obtida de grãos tratados
hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas..........................58
Tabela 4
Teor de isoflavonas agliconadas (µg/g) da farinha desengordurada de soja
obtida de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16
horas...............................................................................................................61
Tabela 5
Atividade
da
enzima
β-Glicosidase
(UA/g)
dos
grãos
tratados
hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas..........................62
Tabela 6
Dinâmica de extração do isolado proteico de soja (%) proveniente de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas.............65
Tabela 7
Composição centesimal dos isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas...........66
Tabela 8
Distribuição de massa e rendimento de extração da proteína da FD para as
frações IPS, RS e SB......................................................................................68
Tabela 9
Distribuição de massa e rendimento de extração de fibras da FD para as
frações IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100g
de farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas.................70
Tabela 10
Distribuição de massa e rendimento de extração de cinzas da FD para as
frações IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100g
de farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas.................71
Tabela 11
Distribuição de massa e rendimento de extração de carboidratos da FD para
as frações IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de
100g de farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas.......73
Tabela 12
Distribuição de massa e rendimento de extração de lipídios da FD para as
frações IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100g
de farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas................74
11
Tabela 13
Calorimetria diferencial de varredura dos isolados proteicos de soja
provenientes de soja tratada hidrotermicamente............................................77
Tabela 14
Isoflavonas agliconadas totais (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos
de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16
horas...............................................................................................................79
Tabela 15
Total de genisteína (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas............81
Tabela 16
Total de daidzeína (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas............81
Tabela 17
Total de gliciteína (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas.............82
Tabela 18
Distribuição de massa e rendimento de extração de isoflavonas agliconadas
da FD para as frações IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da
proteína de 100g de farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16
horas................................................................................................................84
Tabela 19
Fenóis totais (mg de ácido gálico. 100g-1) de isolados proteicos de soja
obtidos de grãos tratados hidrotermicamente.................................................86
Tabela 20
Atividade antioxidante (%) de isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas...........87
Tabela 21
Correlações entre o conteúdo de isoflavonas agliconadas, fenóis totais e
atividade antioxidante dos IPSs oriundo de grãos tratados hidrotermicamente
a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas.........................................................89
Tabela 22
Digestibilidade (%) de isolados proteicos de soja obtidos de grãos tratados
hidrotermicamente a 40 e 60°C durante de 4, 8, 12 e 16 horas......................90
Tabela 23
Solubilidade proteica (%), em diferentes pHs, de isolados proteicos de soja
obtidos de grãos tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas
temperaturas de 40 e 60°C............................................................................91
Tabela 24
Capacidade de absorção de água dos IPS oriundos de grãos tratados
hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas de 40 e 60°C..............94
12
Tabela 25
Capacidade de formação de espuma de isolados proteicos de soja obtidos de
grãos tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas de 40 e
60°C.................................................................................................................95
Tabela 26
Estabilidade da espuma de isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas de 40 e
60°C.................................................................................................................96
Tabela 27
Cor dos IPSs oriundos de grãos tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas
nas temperaturas de 40 e 60°C.......................................................................97
Tabela 28
Dureza (g) dos IPSs oriundos de grãos de soja tratados hidrotermicamente a
40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas...........................................................100
Tabela 29
Fraturabilidade (g) dos IPSs oriundos de grãos de soja não tratados e tratados
hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas.........................101
Tabela 30
Adesividade dos IPSs oriundos de grãos de soja sem tratamento e tratados
hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas.........................102
Tabela 31
Coesividade dos isolados proteicos de soja tratados hidrotermicamente a 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas...................................................................103
Tabela 32
Elasticidade dos isolados proteicos de soja tratados hidrotermicamente a 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas..................................................................104
13
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................1 6
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................1 8
2.1. Soja............................................................................................................................18
2.2 Benefícios da soja à saúde.........................................................................................19
2.3 Isoflavonas..................................................................................................................20
2.4 Transformações das formas de isoflavonas durante o processamento de
alimento............................................................................................................................24
2.5 Biodisponibilidade das isoflavonas.............................................................................28
2.6 Enzima β-glicosidase e ação sobre as isoflavonas....................................................30
2.7 Estabilidade térmica das isoflavonas e interação com as proteínas..........................31
2.8 Compostos fenólicos em soja.....................................................................................32
2.9 Atividade antioxidante de isoflavonas.........................................................................34
2.10 Isolado proteico de soja............................................................................................36
2.11 Propriedades funcionais e nutricionais de isolados proteicos de soja......................38
2.11.1 Solubilidade...........................................................................................................40
2.11.2 Absorção de água.................................................................................................42
2.11.3 Capacidade de formação de espuma....................................................................43
2.11.4 Digestibilidade........................................................................................................44
2.12 Técnicas para estudo da estrutura e da conformação das proteínas.......................45
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................47
3.1. Materiais...................................................................................................................47
3.2 Métodos......................................................................................................................47
3.2.1 Preparação das amostras................................................................................47
3.2.2 Preparação do isolado proteico de soja...........................................................48
3.2.3 Composição centesimal das frações FD, IPS, RS e SB..................................49
14
3.2.4 Extração e quantificação de isoflavonas..........................................................49
3.2.5 Atividade da enzima β-glicosidase..................................................................50
3.2.6 Eletroforese (SDS-PAGE)................................................................................51
3.2.7 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)....................................................52
3.2.8 Compostos fenólicos totais .............................................................................52
3.2.9 Atividade antioxidante......................................................................................52
3.2.10 Digestibilidade proteica “in vitro” .................................................................53
3.2.11 Solubilidade proteica......................................................................................54
3.2.12 Capacidade de absorção de água (CAA)......................................................54
3.2.13 Capacidade de formação de espuma (CFE) e estabilidade da espuma
(EE)...........................................................................................................................55
3.2.14 Colorimetria....................................................................................................55
3.2.15 Perfil texturométrico.......................................................................................56
3.2.16 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)...................................................57
3.2.17 Análise estatística..........................................................................................57
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES.......................................................................................58
4.1 Composição centesimal da farinha desengordurada (FD).................................58
4.2 Efeitos do tratamento hidrotérmico na formação de isoflavonas agliconadas na
farinha desengordurada............................................................................................60
4.3 Efeitos do tratamento hidrotérmico na atividade da enzima β-glicosidase.........61
4.4 Comportamento cinético da enzima β-glicosidase com o emprego dos
tratamentos hidrotérmicos.......................................................................................63
4.5 Efeitos do tratamento hidrotérmico na dinâmica de extração do isolado proteico
de soja......................................................................................................................64
4.6 Composição centesimal dos isolados proteicos de soja.....................................65
4.7 Efeitos do processamento hidrotérmico sobre a distribuição dos constituintes
químicos da FD para as frações IPS, RS e SB........................................................67
4.8 Eletroforese.........................................................................................................74
15
4.9 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)......................................................76
4.10 Efeitos do tratamento hidrotérmico sobre o conteúdo de isoflavona s
agliconadas nos isolados proteicos de soja..............................................................79
4.11 Comportamento cinético de formação das isoflavonas agliconadas com
emprego dos tratamentos hidrotérmicos .................................................................83
4.12 Distribuição de massa das isoflavonas agliconadas da FD para as frações IPS,
RS e SB....................................................................................................................83
4.13 Fenóis totais .....................................................................................................85
4.14 Atividade antioxidante.......................................................................................87
4.15 Correlação entre isoflavonas aglicona, compostos fenólicos totais e atividade
antioxidante...............................................................................................................89
4.16 Digestibilidade proteica “in vitro” do IPS...........................................................90
4.17 Solubilidade proteica do IPS.............................................................................91
4.18 Capacidade de absorção de água (CAA) ........................................................93
4.19 Capacidade de formação de espuma...............................................................94
4.20 Estabilidade da espuma....................................................................................96
4.21 Colorimetria.......................................................................................................97
4.22 Análise de perfil de textura (TPA) ....................................................................99
4.23 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ...................................................104
5. CONCLUSÕES........................................................................................................107
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................108
APÊNDICES...............................................................................................................134
Apêndice A....................................................................................................135
16
1. INTRODUÇÃO
A soja e seus derivados apresentam grande potencial no mercado de
alimentos funcionais devido à presença de compostos bioativos, tais como as
isoflavonas, as quais têm sido largamente estudadas quanto aos seus efeitos
biológicos
benéficos
à
saúde
humana,
tais
como:
atividade
estrogênica,
hipocolesterêmica e anticarcinogênica (LUI, 2003).
Os grãos de soja podem conter basicamente três tipos de isoflavonas
(daidzina, glicitina, genistina) que se apresentam em quatro diferentes formas, as
glicosiladas; as acetilglicosiladas, as malonilglicosiladas e na forma não conjugada, a
aglicona (WANG & MURPHY, 1994; CARRÃO-PANIZZI, 1996; LEE et al. 2003).
As isoflavonas estão presentes nos alimentos, predominantemente, nas
formas glicosiladas, acetilglicosiladas e malonilglicosiladas. Nestas formas, elas não
são absorvidas diretamente pelo organismo humano, sendo necessária hidrólise das
isoflavonas conjugadas com a sua forma aglicona pela ação da enzima β-glicosidase
produzida pela microbiota intestinal (LIGGINS et al., 1998). De acordo com Izumi et
al. (2000),
as
agliconas
são
absorvidas
mais
rapidamente,
com
melhor
aproveitamento, do que os conjugados malonil e acetil.
No entanto, segundo Setchell (1998), a disponibilidade da enzima no
intestino é limitada e o metabolismo das isoflavonas pode variar entre as populações
e em função da dieta, ingestão de medicamentos e tempo de residência do alimento
no intestino. Devido a esses fatores, o consumo de alimentos com altos níveis de
aglicona é desejável.
Dentre os produtos de soja utilizados para alimentação humana, o isolado
proteico é um ingrediente largamente utilizado na indústria de alimentos devido as
suas propriedades funcionais. Os isolados proteicos de soja apresentam cerca de
80% de suas isoflavonas nas formas não biodisponíveis, além do que, o teor de
17
isoflavonas totais em isolados proteicos de soja tende a ser menor do que o
observado em suas matérias-primas, evidenciando perdas durante o processamento
(WANG & MURPHY, 1996; LUI et al. 2006).
O uso de tratamento hidrotérmico em grãos de soja aumenta a quantidade
de isoflavonas aglicona a partir das formas glicosiladas, acetil e malonil glicosiladas,
devido à ativação da enzima β-glicosidase presente no grão de soja. O tratamento
hidrotérmico aplicado nos grãos utilizados como matéria-prima para produção de
isolado proteico de soja aumenta o teor de isoflavonas aglicona na matéria - prima, o
que leva a maiores teores de aglicona nos derivados proteicos, bem como maior
retenção das isoflavonas que seriam perdidas para os substratos do processo.
Objetivou-se com o estudo, avaliar efeitos da temperatura e do tempo de
tratamento hidrotérmico sobre o teor e propriedades tecnológicas de interesse
nutricional em isoflavonas no isolado proteico de soja.
18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Soja
A soja (Glycine max Merril) constitui uma das plantas mais antigas cultivadas
pelo homem. Teve sua origem na China por volta do século XV a.C., de onde se
expandiu lentamente para outras partes do mundo. O ocidente começou seu cultivo
a partir do século XVI. No Brasil, a soja foi efetivamente introduzida em 1908 no
estado de São Paulo e em 1914 no estado do Rio Grande do Sul. Porém, o
verdadeiro impulso na produção ocorreu somente na década de 60 do século XX
(MORAIS & SILVA, 1996).
Atualmente, o Brasil é o segundo produtor mundial deste grão, com
produção estimada de 70 milhões de toneladas para safra de 2010/2011. A cultura
encontra inúmeras situações vantajosas no país, como extensão territorial,
topografia e clima favoráveis. Atualmente é a principal cultura do Brasil, ocupando
aproximadamente 24 milhões de hectares (CONAB, 2011).
A soja é um alimento praticamente completo, pois contém cerca de 40% de
proteínas de alta qualidade, aproximadamente 20% de lipídeos e 35% de
carboidratos, teores consideráveis de vitaminas do complexo B e minerais como
magnésio, fósforo, ferro e zinco (CARRAÕ-PANIZZI, 2000; MORAES et al., 2006).
O grão, inicialmente cultivado para extração de óleo e de componentes para
ração animal, teve seus produtos proteicos (farinha, concentrados e isolados)
utilizados em grande escala na última década pela indústria de alimentos.
Recentemente, a soja tem sido pesquisada como fonte de substâncias denominadas
de fitoquímicos, entre eles, as isoflavonas. Estudos têm avaliado efeitos das
proteínas
e
das
isoflavonas
da
soja
sobre
doenças
cardiovasculares,
hipercolesterolemicas, câncer, diminuição dos efeitos da menopausa, em que estes
compostos têm sido apresentados como os responsáveis pelas características
19
benéficas da soja em humanos (ZHANG, 2003; ROSELL, et al., 2004; TORRES et
al., 2005).
2.2 Benefícios da soja à saúde
A relação entre consumo de soja e saúde humana tem sido pesquisada
devido às características nutricionais que apresenta.
O FDA (Food and Drug Administration), órgão que controla a produção de
alimentos e medicamentos nos Estados Unidos, aprovou em 1999 a alegação de
benefício à saúde para a proteína de soja na redução de risco de doenças
coronarianas. Estes fatores têm levado a um aumento no interesse por alimentos à
base de soja (U.S.A., 1999).
Estudos epidemiológicos demonstram que em populações que consomem
dietas ricas em soja e seus produtos, a incidência de determinados tipos de câncer
(cólon, mama e próstata, principalmente) e de osteoporose em mulheres pósmenopausa são menores, quando comparadas com a incidência em populações que
não consomem esses tipos de alimentos (POTTER, et al., 1998; ESTEVES &
MONTEIRO, 2001; SAKTHIVELU et al., 2008). No Japão, onde é elevado o
consumo de soja (cerca de 100 mg por dia de isoflavonas), a mortalidade por câncer
de próstata é baixa (ADLERCREUTZ et al., 2000; BROUNS, 2002).
Anderson et al. (1999) realizaram 38 estudos clínicos e concluíram que o
consumo de proteínas da soja é capaz de diminuir o colesterol LDL em 12,9%.
Potter et al. (1998) relatam que as proteínas da soja podem, quando consumidas,
promover o aumento de HDL colesterol, além de diminuir o colesterol LDL.
Torres et al. (2005), estudando a relação entre metabolismo lipídico, proteína
de soja e implicações em doenças coronarianas, relataram que não somente a
proteína da soja,
mas a associação entre compostos fitoquímicos e proteína,
principalmente as isoflavonas, estão envolvidos no mecanismo de redução da
concentração lipídica no plasma. O efeito acentuado promovido pela associação
das isoflavonas junto às proteínas da soja também foi observado por Badger et al.
(2002), quando isolados proteicos suplementados com isoflavonas, administrados
20
para ratos com tumores induzidos, apresentaram efeito mais significativo na redução
da multiplicação celular do que os isolados que não continham isoflavonas.
Segundo Shukla, et al. (2007), quanto maior é a quantidade de isoflavonas
na soja ou em seus derivados proteicos, maior é o beneficio que esta desempenha,
e que elas isoladas da proteína, também desempenham um efeito menor. Desta
forma, as isoflavonas precisariam das proteínas da soja para desempenhar funções
no organismo humano e vice-versa.
Os mecanismos que as isoflavonas e proteínas utilizam para que este fato
aconteça ainda tem sido alvo de muitas pesquisas, apesar de os benefícios das
proteínas da soja e isoflavonas à saúde já serem cientificamente comprovados
(TORRES et al., 2005).
2.3 Isoflavonas
As isoflavonas são moléculas biologicamente ativas encontradas na soja, as
quais desencadeiam efeitos benéficos à saúde, tais como baixa incidência de câncer
hormônio-dependente, efeitos sobre a osteoporose e redução dos riscos de doenças
cardiovasculares e aterosclerose (SETCHELL & CASSIDY, 1999).
Por apresentar semelhança estrutural e de peso molecular com os
hormônios estrogênicos, as isoflavonas mimetizam sua ação ligando-se aos mesmos
receptores (MOLTENI et al., 1995; HELFERICH, 1996), que são incapazes de
reconhecer a diferença entre o hormônio endógeno e o isômero de isoflavona. Ao se
ligarem aos receptores o bloqueiam impedindo a ligação do estrógeno endógeno
(HELFERICH, 1996; KOLES, 2011). Assim, na ausência de estrógeno as células não
são estimuladas à proliferação, prevenindo o desenvolvimento de células
cancerosas (LI et al.,1999). Entretanto, em mulheres com níveis baixos de
estrógenos, por exemplo, na pós-menopausa, as isoflavonas produzem efeitos
estrogênicos (MESSINA, 2003). Portanto, as isoflavonas podem atuar como
agonistas ou como antagonistas do hormônio endógeno 17 β-estradiol nos
receptores celulares, dependendo de sua concentração e do tecido em que se
localizam estes receptores (MOLTENI et al., 1995; NEVEN, 1998; SETCHELL et al.,
1998).
21
Isoflavonas também têm sido associadas beneficamente à osteoporose, uma
desordem óssea em que a razão de degeneração óssea é maior do que a razão de
formação dos ossos, resultando em perda de massa óssea, tornando os ossos
fracos e quebradiços. Esta doença é bastante grave em mulheres pós-menopausa,
pois baixos níveis de estrógenos estimulam a perda de massa óssea (NEVEN, 1998;
CHAMBÔ FILHO et al., 2000). Potter et al. (1998) relatam efeito benéfico sobre os
ossos após o consumo de 50 e 90 mg por dia de isoflavonas. Segundo Messina
(2003), além das isoflavonas, proteínas da soja também contribuem para a
diminuição da perda de massa óssea, reduzindo a excreção de cálcio através da
urina, provavelmente devido ao baixo teor de aminoácidos sulfurados que apresenta.
Além dos efeitos anticarcinogênicos e de redução da perda de massa óssea,
isoflavonas têm sido associadas à redução dos riscos de doenças cardiovasculares
e aterosclerose, atuando em conjunto com as proteínas da soja (TIKKANEN et al.
apud REN et al., 2001). Estudos têm demonstrado que proteínas da soja estão
envolvidas na diminuição dos riscos de doenças cardiovasculares através da
diminuição dos níveis de LDL colesterol e diminuição da pressão sanguínea
promovendo maior vascularização no endotélio arterial (ANDERSON et al., 1999;
ANTHONY, 2000).
Tikkanen et al. apud Ren et al. (2001), realizaram estudos com ingesta de
proteína de soja contendo 60 mg de isoflavonas totais e observaram diminuição da
oxidação do LDL colesterol. A oxidação das partículas de LDL constitue um prérequisito para a formação de placas de ateroma nas paredes arteriais.
Considerando que a deficiência de estrógenos está associada com
alterações significantes no metabolismo lipoproteico levando ao aumento da
concentração de colesterol plasmático, e que isoflavonas desempenham função
agonista ou antagonista dos hormônios estrogênios, vários estudos sugerem que
isoflavonas e proteínas da soja quando associadas, desencadeiam respostas
fisiológicas mais acentuadas na redução do colesterol do que quando são ingeridas
isoladamente (SETCHELL, 1998; SETCHELL & CASSIDY, 1999; ANTHONY et al.,
2000).
22
Apesar dos efeitos benéficos relatados na literatura, as quantidades
necessárias de isoflavonas na dieta para produzir efeitos biológicos no organismo
humano ainda não foram estabelecidas e, com isso, a preconização de ingesta
permanece sem normatização. Porém, com base em diferentes estudos e no
consumo de populações orientais em que a soja constitui a base da alimentação,
Setchell (1998) considera que a ingesta de 30 a 50 mg de isoflavonas por dia seria
suficiente para desencadear reações clínicas positivas.
Quimicamente, as isoflavonas são compostos fenólicos, pertencentes ao
grupo dos flavonóides. Apresentam uma estrutura composta por dois anéis
benzênicos ligados a um terceiro anel pelo carbono três, formando uma estrutura C6
– C3 – C6. Estão amplamente distribuídos no reino vegetal, cujas concentrações são
relativamente maiores na soja (SETCHEL, 1998).
Segundo Liu et al. (1997) na soja, as isoflavonas (Figura 1) podem existir em
quatro formas químicas, a aglicona (sem a molécula de açúcar), β-glicosídicas com
uma glicose ligada ao seu anel benzeno ou, ainda, conjugada com grupos malonil e
acetil, portanto, 12 isômeros de isoflavonas.
Figura 1 - Estrutura química das isoflavonas presente na soja e possíveis modificações
dos conjugados.
23
Tabela 1 – Estrutura química das 12 formas da isoflavona da soja
Isoflavonas
Daidzeína
Genisteína
Gliciteína
Daidzina
Genistina
Glicitina
6”O-Acetil-Daidzina
H
H
OCH3
H
H
OCH3
H
R1
H
OH
H
H
OH
H
H
6”O-Acetil-Genistina
H
OH
COCH
6”O-Acetil- Glicitina
OCH
H
COCH
6”O-Malonil-Daidzina
H
H
COCH COOH
6”O-Malonil-Genistina
H
OH
COCH COOH
OCH
H
COCH COOH
6”O-Malonil-Glicitna
R
3
3
R2
H
H
H
COCH
3
3
3
2
2
2
Fonte: Lui (1997).
A distribuição das isoflavonas nos grãos de soja varia conforme sua
estrutura. Dependendo da cultivar, as isoflavonas não estão presentes no tegumento
da semente ou são detectadas apenas em quantidades traços (KUDOU et al., 1991;
TSUKAMOTO et al., 1995; LIU, 1997). Segundo Tsukamoto et al. (1995), o teor de
isoflavonas totais é de 5,5 a 6,0 vezes maior no hipocótilo da semente que nos
cotilédones. Porém, 80 a 90% do total de isoflavonas dos grãos estão localizados
nos cotilédones, considerando que o hipocótilo corresponde a 2% do peso seco da
semente. Ainda, segundo os autores, a gliciteína e seus conjugados ocorrem
somente no hipocótilo.
A concentração de isoflavonas nos grãos de soja é geneticamente
controlada e influenciada pelas condições ambientais, sendo a temperatura durante
o desenvolvimento do grão o fator de maior importância (WANG & MURPHY, 1994;
TSUKAMOTO et al., 1995; CARRÃO-PANIZZI, 1996; LEE et al., 2003).
Carrão-Panizzi et al. (1996) quantificaram isoflavonas em 100 cultivares
comerciais de soja de ciclo de maturação precoce, semi-precoce, médio e tardio
semeadas na safra de 2004 em Londrina, Paraná, e observaram diferenças
significativas quanto ao teor de isoflavonas, variando de 121,4 a 35,8 mg/100g nas
cultivares de ciclo precoce e semi-precoce, de 121,7 a 29,6 mg/100g nas cultivares
de ciclo médio e de 172,9 a 16,8 mg/100g nas cultivares de ciclo tardio. Segundo os
24
pesquisadores, esta variabilidade foi independente do ciclo de maturação e atribuída
às diferenças genéticas das cultivares.
Estudando a influência ambiental sobre o teor de isoflavonas, Carrão-Panizzi
et al. (1999) verificam que sojas plantadas em regiões com temperaturas médias de
20°C apresentam concentrações médias de isoflavonas entre 147,8 mg/100g e
180,1 mg/100g e, quando plantadas em regiões com temperatura média de 25°C,
apresentam concentrações entre 73,5 mg/100g e 85,5 mg/100g. Resultados
semelhantes são obtidos por Lee et al. (2003) ao analisarem 15 cultivares de soja
semeadas em 3 locais diferentes por três anos consecutivos. Estes pesquisadores
concluíram que a temperatura ambiental foi a principal causa das diferenças
observadas.
Wang & Murphy (1994) observam que malonil genistina constitui o isômero
de isoflavonas encontrado em maior concentração nos grãos (25 a 42%), seguido
pelos
β-glicosídios
genistina,
malonil
daidzina
e
β-glicosídios
daidzina
respectivamente, representando entre 83 a 93% do total de isoflavonas. Já Kudou et
al. (1991) relatam que as formas malonil daidzina e malonil genistina compreendem
66% do total de isoflavonas da soja.
2.4 Transformações das formas de isoflavonas durante o processamento de
alimentos
A concentração e a distribuição das diferentes formas químicas das
isoflavonas nos alimentos derivados da soja são determinadas, entre outras, pela
variedade da soja, diluição com outros ingredientes, porém, a principal causa está
relacionada às condições de processamento que a soja sofre, pois quando
submetida a diferentes processos para obtenção de alimentos derivados, tal
proporção pode sofrer alterações (WANG & MURPHY, 1996; GÓES-FAVONI et al.,
2004 e CHIEN et al., 2005).
Barnes et al. (1994) constatam que conjugados malonil são termicamente
instáveis e podem sofrer reações de desesterificação das ligações éster entre o
grupo carboxila-malonato e o grupo 6”hidroxila da glicose, produzindo β-glicosídeos,
ou sofrer reações de descarboxilação dando origem aos respectivos conjugados
25
acetil glicosídeos. A forma de aquecimento empregada durante o processamento
dos grãos de soja interfere significativamente na transformação das formas químicas
de isoflavonas. Conforme Chien et al. (2005) em aquecimento seco conjugados
malonil são convertidos, preferencialmente, em acetil enquanto em aquecimento
úmido a conversão se dá em β-glicosídeos. Conjugados acetil não estão presentes
em grãos de soja e alimentos derivados de soja minimamente processados, mas são
detectados em alimentos submetidos a aquecimento durante sua produção
(COWARD et al., 1998).
Nakamura et al. (2000) determinaram os níveis de isoflavonas em doze tipos
de alimentos processados. O conteúdo mais alto de isoflavonas foi verificado no
kinako (pó de soja tostado) e o mais baixo no molho de soja. Segundo os
pesquisadores, o conteúdo e a composição de isoflavonas nos alimentos
processados variaram de acordo com o método de preparo e os ingredientes
utilizados.
Coward et al. (1993) observam que o teor e a distribuição das isoflavonas
em farinha integral de soja são semelhantes aos dos grãos in natura. Góes-Favoni et
al. (2004) observaram que em farinha de soja integral os conjugados malonil e βglicosídeos constituem as principais isoflavonas, correspondendo a 64 e 33% do
total de isoflavonas, respectivamente. Quando a farinha de soja é desengordurada,
os conjugados malonil e β-glicosídeos continuam como os principais compostos,
porém, os conjugados malonil diminuem, passando a representar 55% do total de
isoflavonas, enquanto que os conjugados β-glicosídeos aumentam para 42%.
Conforme Wang & Murphy (1996), a extração de óleo realizada sob
aquecimento leva à diminuição dos conjugados malonil que se convertem nos
respectivos β-glicosídeos. Segundo Coward et al. (1993), isoflavonas não estão
presentes no óleo de soja, sugerindo que o desengorduramento da farinha não
altera a concentração destes compostos. Segundo Góes-Favoni et al. (2004) o teor
de agliconas em farinha de soja desengordurada e tostada corresponde, em média,
a 3% do total de isoflavonas, sendo similar aos valores observados em grãos de
soja. Em proteínas texturizadas de soja, o teor de agliconas não sofre alterações
26
significativas em relação à sua matéria-prima, representando em média, 5 a 8% do
total de isoflavonas.
Segundo Wang & Murphy (1996), isolados proteicos de soja apresentam teor
de isoflavonas menor do que o encontrado em suas matérias-primas devido às
perdas ocasionadas durante a extração alcalina, pois o pH alcalino pode modificar
as cargas das moléculas de proteínas e alterar ligações com as isoflavonas.
Observando estas alterações e por conta da importância das isoflavonas na saúde,
novas tecnologias têm sido empregadas para extração de proteínas da soja. De
acordo Faraj & Vasanthan (2004), processos de extração utilizando água levam a
produção de isolados proteicos com teor de isoflavonas maiores em função da
retenção destes compostos na matriz do produto.
Conforme Wang & Murphy (1994), concentrados proteicos de soja
apresentam em média 70% de proteínas e podem ser obtidos a partir de flocos ou
farinha de soja desengordurados, por lavagem alcoólica (etanol 60-80%), água
acidificada (pH 4,5) ou água fervente. Quando a remoção dos carboidratos é
realizada em água quente e pH neutro, o teor de isoflavonas permanece quase
inalterado em relação à matéria-prima (COWARD et al., 1993). Porém, se esta
remoção ocorre em meio alcoólico, as isoflavonas são praticamente eliminadas no
resíduo, evidenciando a solubilidade destes compostos. Resultados similares
também foram obtidos por Wang & Murphy (1994); Liu (1997) e Genovese & Lajolo
(2002).
Em extratos solúveis de soja, conhecidos popularmente como “leite de soja”,
as isoflavonas estão presentes principalmente como β-glicosídeos. Os extratos
solúveis de soja podem ser obtidos a partir de diferentes processos, utilizando grãos
de soja, farinha desengordurada, concentrados ou isolados proteicos. O processo
básico de obtenção de extratos de soja consiste em hidratação da matéria-prima,
cozimento, filtração e separação do resíduo insolúvel (SINGLETARY et al. 2000).
Toda et al. (2000), analisando extratos de soja comerciais concluem que o
maior teor de β-glicosídeos (62% do total de isoflavonas) em relação aos grãos de
soja (21%) ocorre devido à desesterificação dos conjugados malonil, em função de
temperaturas elevadas (85 a 130°C) durante o processamento. Wang & Murphy
27
(1996) observam que o teor de agliconas em isolados proteicos aumenta cerca de 6
vezes em relação à sua matéria-prima, porém, o teor de isoflavonas totais diminui
cerca de 70%.
Em estudo de balanço de massa durante a obtenção de extrato aquoso e
tofu, Wang & Murphy (1996) observam que durante o processamento de extrato
aquoso de soja ocorrem perdas insignificantes de isoflavonas para o resíduo
insolúvel (okara), sugerindo que as isoflavonas podem estar associadas a
componentes solúveis, provavelmente proteínas solúveis da soja.
No tofu, produto obtido pela coagulação do extrato de soja aquoso, os
mesmos autores relatam que o teor de isoflavonas sofre redução de 33% em relação
aos grãos de soja, sendo que a maior perda ocorre na etapa de coagulação do
extrato aquoso de soja. Embora o teor total de isoflavonas tenha sido menor em tofu,
a distribuição destes compostos manteve-se semelhante à observada no extrato de
soja: β-glicosídeos > malonil > agliconas > acetil. Os autores quantificaram cerca de
11 e 20% do teor total de isoflavonas como agliconas nos extratos e tofu,
respectivamente, registrando aumento de 3,7 e 2,2 vezes em relação a matéria prima, respectivamente.
No tempeh, alimento fermentado à base de soja, obtido em etapas
subsequentes de descascamento dos grãos de soja, hidratação em água,
cozimento, drenagem e inoculação com o fungo Rhizopus oligosporus, o teor de
agliconas pode atingir 50% da massa molar total de isoflavonas (MURPHY et al.,
2002). Conforme Wang & Murphy (1996) durante a fermentação do tempeh ocorre
uma redistribuição das isoflavonas, originando um produto final com 6,5 vezes mais
agliconas e menores teores de β-glicosídeos, provavelmente devido à ação
hidrolítica da enzima β-glicosidase fúngica atuando em conjunto com β-glicosidases
endógenas da soja.
Para Wang & Murphy (1996) a concentração de isoflavonas em alimentos
não fermentados é de duas a três vezes maior do que em alimentos fermentados,
sendo as isoflavonas conjugadas as principais formas encontradas nos produtos não
fermentados. Segundo Murphy et al. (2002) as agliconas são as principais
isoflavonas presentes em produtos fermentados.
28
Durante o processamento os grãos de soja são submetidos a diferentes
condições que podem favorecer a atuação de β-glicosidases ou promover sua
inativação (GOÉS-FAVONI, 2004).
Ao quantificarem isoflavonas em diferentes alimentos à base de soja, Wang
& Murphy (1994) observaram que β-glicosídeos correspondem a 49, 22 e 9% do
total de isoflavonas em PTS, tofu e tempeh, respectivamente, enquanto as agliconas
presentes nestes produtos variam entre 3, 21 e 41% do total de isoflavonas,
respectivamente. Estas alterações podem ocorrer durante o processamento de
alimentos à base de soja devido à conversão de conjugados β-glicosídeos em
agliconas, numa reação catalizada por enzimas β-glicosidases endógenas da soja
ou de origem microbiana (MATSUURA et al., 1989; MURPHY et al., 2002).
Durante hidratação de grãos de soja, β-glicosidases endógenas podem ser
ativadas e atuar sobre β-glicosídeos convertendo-os em agliconas (TODA et al.,
2000; GÓES-FAVONI et al., 2004).
2.5 Biodisponibilidade das isoflavonas
As isoflavonas conjugadas, quando ligadas a açúcares ou β-glicosídeos, não
são absorvidas diretamente pelo organismo humano. Somente as isoflavonas não
conjugadas, as denominadas agliconas, são capazes de atravessar a membrana
plasmática (ANDERSON & GARNER, 1997). Segundo Setchell et al. (2001), as
formas conjugadas precisam ser hidrolizadas por enzimas β-glicosidases presentes
no intestino humano para liberação das principais formas bioativas – as agliconas
daidzeína e genisteína.
Conforme Izumi et al. (2000) a desconjugação das isoflavonas é essencial
para absorção e biodisponibilidade das isoflavonas. Experimentos sobre a ingesta
de tabletes de soja contendo β-glicosídeos ou agliconas concluem que agliconas são
absorvidas mais rapidamente e em maior quantidade do que seus conjugados βglicosídeos.
Cassidy et al. (2006), em estudos com humanos comparando a
biodisponibilidade de isoflavonas em três alimentos de soja (extrato de soja aquoso,
29
PTS e tempeh), todos com quantidades equivalentes de isoflavonas totais (0,44 mg
de isoflavonas/Kg de massa corpórea) observam que a matriz do alimento (tipo) bem
como a distribuição das isoflavonas nesta matriz tem forte influência sobre a
biodisponibilidade destes compostos.
Quando as isoflavonas ingeridas estão presentes no extrato aquoso, a
absorção destes compostos é mais rápida do que quando ingeridas sob matriz sólida
(PTS ou tempeh). Na comparação de dois alimentos sólidos, PTS e tempeh, os
picos de concentração plasmática são maiores e alcançados mais rapidamente após
a ingestão de tempeh, alimento fermentado que, segundo Murphy et al. (2002),
contém, em média, 50% de agliconas em relação à massa molar total de
isoflavonas.
Kawakami et al. (2005) incluem isoflavonas na forma β-glicosídica e na
forma aglicona na dieta de ratos e observaram diminuição de triglicérides e LDL
colesterol (Low Density Lipoprotein) e aumento de HDL colesterol (High Density
Lipoprotein) quando os ratos são alimentados com as duas dietas, porém, numa
proporção maior quando a dieta administrada contém agliconas. Os pesquisadores
sugerem que a diferença entre a dieta contendo agliconas e a dieta contendo βglicosídeos pode ser resultado de diferenças na biodisponibilidade destas formas
químicas. Ao comparar a eliminação das isoflavonas após o metabolismo, teores
maiores de isoflavonas são observados nas fezes dos ratos alimentados com βglicosídeos do que com agliconas, sugerindo que os β-glicosídeos não são
eficientemente hidrolizados no intestino e, portanto, são excretados em maior
quantidade, sendo este o motivo da resposta fisiológica menos eficiente.
Conforme estudos realizados por Setchell (1998), a disponibilidade de βglicosidases no intestino humano é limitada e variável entre populações e em função
de dieta, ingesta de medicamentos e tempo de permanência do alimento no
intestino. Assim, a ingestão de alimentos com maiores concentrações de agliconas
torna o processo de absorção mais rápido. Segundo Setchell et al. (2001), o pico de
concentração de agliconas no plasma de adultos ocorre de 4 a 7 horas após a
ingestão, enquanto após a ingestão de β-glicosídeos esse tempo passa a ser de 8 a
11 horas.
30
Trabalhos demonstram a eficiência do tratamento hidrotérmico na formação
de agliconas em grãos de soja a partir da ativação da enzima β-glicosidase (TODA
et al., 2000; GÓES-FAVONI, 2002; CARRÃO-PANIZZI et al., 2003, 2004). Matsuura
& Obata (1993) realizam estudos com β-glicosidases da soja e constatam que
durante hidratação de grãos de soja, sob condições ideais de temperatura e pH
(50°C e pH 6,0), tais enzimas podem atuar sobre β-glicosídeos, convertendo-os em
formas agliconadas.
O emprego de tratamento hidrotérmico em grãos de soja possibilita que
produtos que utilizam esta matéria-prima sejam enriquecidos em isoflavonas
bioativas.
2.6 Enzima β-glicosidase e ação sobre as isoflavonas
A β-glicosidase é uma enzima que catalisa a hidrólise de terminais não
redutores de compostos contendo resíduos de β-D-glicose, com liberação de
glicose. É produzida no intestino humano, por microrganismos e também encontrada
em vegetais, inclusive em leguminosas, participando de inúmeras funções (ESEN,
1992).
Conforme Matsuura et al. (1989), β-glicosidases endógenas da soja
apresentam atividade máxima em temperatura de 50°C e pH 6,0. Quando
purificadas, podem atuar em faixas diferentes de pH e temperatura, como atividade
máxima em pH 5,5 e temperatura de 45°C. Na temperatura de 55°C, 80% da
atividade enzimática permanece ativa sendo que a partir de 60°C são inativadas.
Alimentos à base de soja submetidos a elevadas temperaturas durante seu
processamento tendem a apresentar teor de agliconas inalterados em relação à sua
matéria-prima, em função da inativação da β-glicosidase (WANG & MURPHY, 1996;
ZHANG et al., 2004).
Estudos têm demonstrado que após a hidratação de grãos de soja em água,
as isoflavonas apresentam alterações quanto à sua distribuição e, sobretudo, na
diminuição do teor de β-glicosídeos e no aumento de agliconas (WANG & MURPHY,
31
1996; TODA et al., 2000; CARRÃO-PANIZZI et al., 2003; GÓES-FAVONI et al.,
2004; ZHANG et al., 2004).
Matsuura et al. (1989) em estudos com extratos aquosos de soja mantêm
grãos de soja em hidratação por 16 horas a 20°C e observam aumentos nos teores
de agliconas que passaram de 3,3% para 12,4% do total de isoflavonas após a
hidratação, havendo concomitantemente diminuição de β-glicosídeos. Apesar da
baixa temperatura de hidratação, estas alterações são atribuídas à ação de βglicosidases endógenas da soja, pois ao ser adicionado 0,5% glucona-δ-lactona
(inibidor de β-glicosidase) à água de hidratação o teor de agliconas não se altera
significativamente.
Toda et al. (2000) mantêm grãos de soja em hidratação por 1, 2, 5, 10 e 15
horas a 20°C e observam aumento significativo no teor de agliconas e diminuição de
β-glicosídeos, sendo que estas alterações aumentam com a ampliação do tempo de
hidratação. Ao adicionarem 0,5% de glucona-δ-lactona à água de hidratação, não
detectam alterações na distribuição das formas de isoflavonas, evidenciando a ação
de β-glicosidases endógenas da soja sobre os β-glicosídeos.
Góes-Favoni (2004) mantiveram grãos de soja sob hidratação a 45, 50, 55 e
60°C por 12 horas e observam que a 50°C ocorre o maior aumento de agliconas em
relação aos grãos de soja não hidratados, 33,4 vezes, enquanto o teor dos
conjugados β-glicosídeos e malonil glicosídeos diminuem, passando de 216,8
mg.100g-1 nos grãos não hidratados para 73,9 mg.100g-1 após a hidratação.
2.7 Estabilidade térmica das isoflavonas e interação com as proteínas
As condições de processamento térmico podem causar desnaturação e
desdobramento das proteínas, afetando potencialmente a sua associação com as
isoflavonas. Quando a proteína é desnaturada, ocorre desdobramento de sua
conformação, permitindo maior dissociação das isoflavonas, o que as torna mais
propensas à degradação térmica (RAWEL, et al. 2002).
De acordo com Rawel et al., (2002), devido à sua natureza fenólica, as
isoflavonas interagem com o interior hidrofóbico das proteínas globulares de soja e,
32
portanto, são escondidas da fase aquosa. Quanto maior é o teor de proteínas na
soja e seus derivados, maior o potencial das isoflavonas em se associar com o
interior hidrofóbico da proteína globular, tornando sua extração difícil de ocorrer.
Acredita-se que esta associação seja função do teor de proteínas e do estado de
desnaturação dessas, que, por sua vez, são dependentes das condições de
processamento.
As isoflavonas podem estabelecer vários tipos de interações com as
proteínas por causa da sua polaridade e hidrofobicidade, bem como de sua
capacidade de estabelecer pontes de hidrogênio (RICKERT, et al., 2004).
Malaypally & Ismail (2010) investigam efeitos do teor de proteína, sobre
desnaturação térmica, ação enzimática na extração e estabilidade das isoflavonas
de soja. Os autores confirmaram associação entre as isoflavonas com a porção
interior da proteína da soja e que o seu estado de desnaturação, em certos níveis,
influencia na extração das isoflavonas, promovendo sua liberação ao meio aquoso,
antes associadas ao interior hidrofóbico da proteína. Segundo os mesmos autores,
junto da eficiência na extração pode ocorrer, também, maior exposição das
isoflavonas à degradação térmica em consequência desta maior exposição, o que
promove destruição das isoflavonas junto da desnaturação proteica.
2.8 Compostos fenólicos em soja
Os compostos fenólicos englobam desde moléculas simples até as de alto
grau de polimerização (BRAVO, 1998). Estão presentes nos vegetais na forma livre
ou ligados a açúcares (glicosídios) e proteínas (CROFT, 1998).
A presença dos compostos fenólicos em alimentos tem sido muito estudada
por estes apresentarem atividades farmacológica e antinutricional e também por
inibirem a oxidação lipídica e a proliferação de fungos (NAGEM et al., 1992;
GAMACHE et al., 1993; AZIZ et al., 1998; FERNANDEZ et al., 1998; HOLLMAN &
KATAN, 1998), além de participarem de processos responsáveis por cor,
adstringência e aroma em vários alimentos (PELEG et al., 1998).
33
Segundo Genovese et al. (2005), as isoflavonas são os fenóis mais
expressivos na soja. Segundo Soares (2002), as isoflavonas são polifenóis
englobados no grupo dos flavonóides, que possuem uma estrutura básica formada
por C6-C3-C6, sendo os compostos mais diversificados do reino vegetal.
Os fenóis desempenham várias funções no organismo humano, sendo a
ação antioxidante a mais importante, onde funcionam como sequestradores de
radicais e, algumas vezes, como quelantes de metais (SHAHIDI, et al., 1992).
Os benefícios que os fenóis da soja causam à saúde humana são
totalmente dependentes do tipo de processamento que a mesma sofre. A soja deve
ser processada antes do consumo, melhorando o sabor e a palatabilidade
dos alimentos, bem como o aumento da biodisponibilidade de nutrientes, através da
inativação de fatores antinutricionais.
O cozimento da soja é um dos métodos mais tradicionais utilizados para
disponibilizá-la ao consumo humano em países do leste asiático. Antes do processo
propriamente dito, é realizado uma imersão preliminar que ajuda a suavizar a textura
e a encurtar o tempo de cozimento da soja.
Xu & Chang (2008) relatam que processamento térmico pode causar
reações físicas e químicas complexas como liberação de fenóis das formas
complexas, lixiviação de fenóis para a água (fenóis solúveis), degradação e
transformação de polifenóis e reações de Maillard.
O escurecimento químico ou enzimático é uma das reações de degradação
mais importantes dos fenóis. Segundo Manzocco et al. (2000), os principais grupos
de reações que conduzem ao escurecimento em alimentos são a oxidação
enzimática de fenóis e o escurecimento não enzimático. O último é favorecido por
tratamentos com calor e inclui uma ampla variedade de reações, como reação de
Maillard, caramelização e oxidação química dos fenóis.
De acordo com Whitehead & Swardt (1982), a oxidação enzimática de
compostos fenólicos ocorre pela ação das enzimas peroxidase e polifenoloxidase
sobre o escurecimento de tecidos vegetais.
34
2.9 Atividade antioxidante de isoflavonas
Os seres humanos estão expostos a uma série de agentes oxidantes que
podem causar danos oxidativos a biomoléculas (lipídios, proteínas e ácidos
nucléicos), que poderiam levar a um grande número de patologias ─ incluindo
câncer e arteriosclerose. Assim, presume-se que a ingestão de antioxidantes
capazes de neutralizar os radicais livres possa ter um papel importante na
prevenção destas doenças (HARBORNE et al., 2000; FRITZ, 2003). Dessa forma, a
identificação de fontes vegetais com alta capacidade antioxidante é de extrema
importância.
Segundo Krinsky (1994), antioxidante é todo e qualquer composto capaz de
proteger o sistema biológico contra o efeito nocivo de processos ou reações que
causam oxidação excessiva.
As isoflavonas são reconhecidas como antioxidantes naturais com potencial
na proteção de várias doenças relacionadas ao estresse oxidativo. A capacidade
antioxidante das isoflavonas tem sido relacionada com o número de grupos hidroxila
presentes em sua estrutura química. Naim et al. (1976) afirmam que a capacidade
antioxidante das isoflavonas decresce com a glicosilação ou a substituição do grupo
hidroxila pelo grupo metoxila. As isoflavonas podem inibir a peroxidação lipídica in
vitro por ação do sequestro de radicais livres ou por atuar como agentes quelantes
de metais (HENDRICH, et al., 1999).
Sakthivelu et al. (2008), ao testarem a capacidade antioxidante de padrões
purificados de isoflavonas, descobrem que a genisteína e a daidzeína apresentam
comportamentos
semelhantes
em
relação
à
atividade
antioxidante. Em
contrapartida, a gliciteína apresenta diferente atividade, provavelmente devido à
presença de um grupo metoxila em seu anel fenólico.
Ruiz-Larrea et al. (1997) informam que a capacidade antioxidante das
isoflavonas segue a seguinte ordem: genisteína > daidzeína > genistina > daidzina,
ou seja, está associada ao número de hidroxilas livres do anel A. Os β-glicosídeos,
ao apresentarem O-glicosilação na posição 7 do anel A, apresentam redução na
capacidade antioxidante. Hassimotto et al. (2005) também verificam que a
35
glicosilação afeta negativamente a capacidade antioxidante, já que a quercetina é
mais efetiva em inibir a oxidação do β-caroteno do que a rutina, sua forma
glicosilada.
Recentemente, Yen & Lai (2003) reportam que a suplementação com
isoflavonas purificadas (daidzeína e genisteína) ou extrato metanólico 80% obtido a
partir de alguns produtos de soja, como tofu, inibe a oxidação de espécies de
nitrogênio reativo in vitro e in vivo. A inibição é correlacionada positivamente com o
conteúdo total de isoflavonas nos extratos.
Pratt & Birat (1979) reportam que farinha desengordurada, concentrado e
isolado proteicos de soja apresentam atividade antioxidante significativa pelo método
de cooxidação do β-caroteno/ácido linoléico e que, dentre as três agliconas, a
genisteína apresenta a maior capacidade antioxidante, determinada pelo mesmo
método.
Barboza et al. (2006), estudando teores de isoflavonas e capacidade
antioxidante
em
produtos
derivados
da
soja
(farinha
integral,
farinha
desengordurada, isolado proteico de soja, proteína texturizada e suplemento
comercial de isoflavonas) demonstram que suplementos à base de gérmen de soja
são os derivados com maior capacidade antioxidante, que tem como forma principal,
as isoflavonas β-glicosídicas e alto conteúdo total de isoflavonas. Já os isolados
proteicos de soja apresentam menor capacidade antioxidante pelos métodos de
cooxidação do β-caroteno/ácido linoléico e pelo sequestro de radicais livres (DPPH)
apesar de terem o maior teor de agliconas dentre as amostras analisadas (37% do
total), condizente com seu menor teor de fenólicos totais. Os autores afirmam que
embora não haja relatos na literatura, há diferenças entre as atividades antioxidantes
dos derivados malonilados, acetilados e desesterificados. Desta forma, a capacidade
antioxidante dos derivados de soja resultaria não apenas dos teores de isoflavonas,
mas sim de sua distribuição e das formas presentes.
Hubert et al. (2008) constatam que os compostos antioxidantes encontrados
em soja possuem diferentes mecanismos de ação quando comparados por
diferentes métodos. Estes métodos são baseados em diferentes mecanismos, como
captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), pelo poder de redução do metal (FRAP;
36
CUPRAC), captura do radical hidroxila (método de desoxirribose), captura do radical
orgânico (ABTS, DPPH), quantificação de produtos formados durante a peroxidação
de lipídios (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do β-caroteno) (FRANKEL &
MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003). Dentre estes
métodos, o ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são os mais usados atualmente (PÉREZJIMÉNEZ & SAURA-CALIXTO, 2006).
O método DPPH (BRAND-WILLIAMS et al., 1995) é baseado na tranferência
de elétrons de um composto antioxidante para o radical DPPH, que ao se reduzir,
perde sua coloração púrpura, com redução da absorbância na região do visível em
comprimento de onda de 517nm.
De acordo com Kao & Chen (2006), as isoflavonas apresentam atividade
antioxidante mais forte contra o radical ânion superóxido do que contra o radical
DPPH. Resultados semelhantes já haviam sido observados por Mitchell et al, (1998)
mostrando que isoflavonas conjugadas e não conjugadas exibem baixa potência em
capturar os radicais livres DPPH em comparação com outros compostos fenólicos,
devido à sua baixa capacidade de doar hidrogênio para o radical livre.
Huang et al. (2006) relatam que certos processamentos, como esterilização,
pasteurização, desidratação e cozimento diminuem o potencial antioxidante de seus
agentes devido aos tratamentos. Para Hubert et al. (2008), o processo de
fermentação resulta em uma ligeira perda de atividades antioxidante.
Xu & Chang (2008) relatam que, em certos casos, o processamento não
resulta em destruição dos compostos antioxidantes, mas na sua transformação em
outros compostos que não possuem atividade antioxidante.
2.10 Isolado proteico de soja
A maior parte da proteína de soja utilizada na indústria alimentícia está na
forma de isolados. Estes têm sido amplamente utilizados na formulação de produtos,
devido a certas propriedades funcionais características, que incluem solubilidade,
geleificação e coagulação, poder de espuma, capacidade de retenção de água e
óleo, e propriedades de superfície, além de enriquecerem nutricionalmente alimentos
37
e bebidas (KINSELLA, 1976; VOUTSINAS et al., 1983; ACHOURI et al., 1998; LIU,
et al., 2000).
O isolado proteico de soja (IPS) contém pelo menos 90% de proteína (N x
6,25), sendo geralmente livre de lipídios e carboidratos. Constitui um produto de alto
valor agregado e é amplamente utilizado pela indústria alimentícia na formulação de
alimentos infantis, bebidas e produtos lácteos, por apresentar características
emulsificantes, de suspensão e estabilização (WOLF, 1970; GENOVESE & LAJOLO,
2002).
As globulinas de soja são constituídas de quatro frações, 2S (15%), 7S
(34%), 11S (41,9%) e 15S (9,1%), segundo as taxas de sedimentação, em que S é a
unidade de Evedberg (KOSHIYAMA, 1972; PEARSON, 1983; RADOVIC, 1999).
A fração 2S é composta por proteínas biologicamente ativas, inibidores de
protease e várias enzimas. A fração 7S é composta pelas enzimas β-amilase e
lipoxigenase e globulinas que são conhecidas como β-conglicinina. A β-conglicinina
é uma glicoproteína de reserva e representa 91% da fração 7S. A fração 11S,
comumente conhecida como glicinina, é também uma proteína de reserva e constitui
grande parte da fração da soja, correspondendo a 41%. A fração 15S (urease e
globulina 15S) compõe 5 a 10% do total de proteínas (WOLF, 1970; NIELSEN,
1996).
A glicinina apresenta massa molecular que pode variar de 180 a 350 KDa,
dependendo das condições de temperatura e pH. É constituída por polipeptídios de
caráter ácido (A1a, A1b, A2, A3, A4 e A5) e de caráter básico (B1a, B1b, B2, B3,
B4), que se encontram associados de modo específico, por meio de ligações
dissulfídicas, formando as subunidades A1aB2, A1bB1b, A2B1a, A3B4 e A5B3
(MOREIRA et al., 1979) atualmente denominadas respectivamente de G1, G2, G3,
G4 E G5. O peso molecular dos polipeptídios básico pode variar de 19 – 22 KDa e
os polipeptídios ácido de 34 – 45 KDa (BADLEY, et al., 1975; QI & SUN, 2011).
A β-conglicina é uma glicoproteína com massa molecular estimada em 150170 KDa. Possui três subunidades, α’ (57- 72 KDa), α (57 – 68 KDa) e β (45 – 52
KDa). As subunidades α e α’ possuem dois e três resíduos de metionina,
respectivamente e a subunidade β não possui esse aminoácido (COATES et al.,
38
1985).
Estas subunidades são mantidas por ligações hidrofóbicas e pontes de
hidrogênio (THAN & SHIBASAKI, 1978; GUERRERO et al., 2011). A β-conglicinina
corresponde a mais de 90% da fração 7S.
A fração 7S possui apenas 4 átomos de enxofre que formam duas pontes
dissulfeto intramoleculares. Contudo, pontes dissulfeto parecem não fazer parte das
ligações entre as subunidades (BOGRACHEVA, et al., 1996, GUERRERO et al.,
2011). Já a fração 11S contém 48 átomos de enxofre e as ligações dissulfeto
parecem participar das ligações entre os pares de subunidades ácidas e básicas
(BADLEY et al., 1975; QI & SUN, 2011). Segundo Bogracheva et al. (1996), a fração
7S contém apenas 2 ligações dissulfídicas por molécula, enquanto que a fração 11S
contém 20 ligações dissulfídicas por molécula.
As pontes dissulfeto desempenham importante papel na manutenção da
estrutura nativa das proteínas e a sua estabilidade térmica. A redução das pontes
dissulfeto pode levar ao aumento da suscetibilidade das proteínas às reações
proteolíticas catalisadas pelas enzimas, reduzir a capacidade de geleificação quando
a concentração de proteína é pequena e aumentar esta capacidade quanto existem
altas concentrações proteicas no meio (LIU, 1997).
2.11 Propriedades funcionais e nutricionais de isolados proteicos de soja
O termo propriedade funcional tem sido definido como qualquer propriedade
de um alimento ou componente de um alimento, excetuando-se as nutricionais, que
afeta sua utilização como ingrediente em um alimento, principalmente sobre o
caráter sensorial (HALL, 1996). As propriedades funcionais das proteínas
determinam seu desempenho e comportamento em sistemas alimentícios durante o
processamento, a estocagem e o consumo do produto e estão relacionadas a
fatores como tamanho, composição e sequência aminoacídica, distribuição de
cargas e hidrofobicidade superficial.
Os benefícios potenciais da adição de proteína, nas mais variadas formas, a
um sistema alimentício incluem emulsificação, formação de espuma e poder de
geleificação, aumento da viscosidade, além de melhorar a aparência, o flavour, a
textura e a capacidade de retenção de água ou óleo, contribuíndo também para
39
aumentar o valor nutritivo do produto. Qualquer modificação capaz de alterar uma ou
mais características da proteína pode também mudar uma ou a maioria das
propriedades funcionais (KESTER et al. 1989).
Durante sua obtenção comercial, os isolados sofrem diferentes tratamentos,
os quais causam alterações físico-químicas nas proteínas, conferindo-lhes
propriedades funcionais distintas (KINSELLA, 1979). A desnaturação é o efeito mais
significativo e, de acordo com sua extensão, pode haver o fenômeno de agregação
das cadeias polipeptídicas desnaturadas (ARRESE ET AL, 1991; PETRUCELLI &
ANÕN,
1994).
Além
das
diferenças no
processamento
determinarem
as
características finais dos IPSs, as condições da matéria-prima ou processos que ela
tenha passado também podem influenciar as propriedades físico-químicas e
estruturais dos IPSs (GENOVESE & LAJOLO, 2001).
Tratamentos podem modificar a estrutura da proteína e alterar as
propriedades funcionais das mesmas (OHREN, 1981; WU & INGLET, 1984;
YAMAUCHI et al, 1991; RHEE, 1994). As propriedades funcionais de isolados
proteicos de soja são reflexos da composição e da estrutura dos seus componentes
principais, as globulinas 11S e 7S (KINSELLA et al, 1985;. RHEE, 1994). A estrutura
da proteína pode ser modificada por diferentes tratamentos para melhorar as
propriedades funcionais, sendo o tratamento térmico o mais usado para esse fim
(YAMAUCHI et al., 1991).
Muitos pesquisadores têm estudado o efeito do tratamento térmico sob
diferentes condições (temperatura, tempo, pH, concentração, força iônica) em
propriedades funcionais tais como solubilidade, absorção de água, gelificação,
emulsificação e formação de espuma (HERMANSSON, 1978; KINSELLA, 1979;
PETRUCCELLI & AIIBN, 1994). Foi demonstrado que a funcionalidade depende,
basicamente, do grau de dissociação, desnaturação e agregação das globulinas 7S
e 11S (UTSUMI et al. 1984; ARRESE et al, 1991).
A desnaturação é definida como uma modificação na estrutura secundária
ou terciária das proteínas que não envolva ruptura de ligações covalentes em geral,
não afetando, assim, a sua estrutura primária. A conformação após a desnaturação
pode ser uma estrutura peptídica total ou parcialmente desdobrada. Privalov (1979)
40
propôs um modelo para a desnaturação das proteínas globulares da soja, segundo o
qual, a conversão de uma molécula nativa de proteína para um estado desnaturado
envolve, primeiramente, dissociação da estrutura proteica em subunidades e ruptura
de ligações hidrofóbicas (desnaturação parcial) seguida por agregação das regiões
hidrofóbicas expostas anteriormente. Nesta última fase (desnaturação irreversível)
há formação de grandes agregados de proteína.
O tratamento térmico causa variado grau de desnaturação, resultando na
dissociação e no desenrolamento parcial ou total das moléculas proteicas, bem
como na formação de agregados, o que pode alterar sua solubilidade (WOLF, 1970,
KINSELLA, 1979, KEERATI-U-RAI, et al., 2010).
Segundo Wolf (1970) no aquecimento da farinha de soja pode haver
formação de agregados proteicos através de ligações dissulfeto. Durante a etapa de
extração aquosa estes agregados são extraídos, ocorrendo mais agregação na
etapa de precipitação isoelétrica, insolubilizando as proteínas. A composição dos
agregados pode variar, sendo alguns deles constituídos, basicamente, por
subunidades da β-conglicinina unidas por ligação hidrofóbica e dissulfeto, além de
outros compostos ligados a estas subunidades mais o polipeptídio ácido da glicinina
(PETRUCELLI & AÑON, 1994, 1995).
Segundo Petrucelli & Añon (1994) tratamentos térmicos drásticos (98°C/5’ e
98°C/30’) empregados em IPSs em pH 7,0 e 9,0 resultam em desnaturação proteica
e polimerização, o que resulta na diminuição da capacidade de retenção de água
(CRA) e na baixa solubilidade. Porém, estes mesmos autores relatam que as
propriedades emulsificantes dos isolados melhoram quando sofrem tratamentos
térmicos menos drásticos (80°C/6’ e 92°C/12’), tanto em pH 7,0 como em pH 9,0.
2.11.1 Solubilidade
A solubilidade é uma propriedade funcional importante, pois se relaciona
diretamente com outras características funcionais, tais como capacidade de
formação de espuma, capacidade de geleificação, poder de emulsificação e
viscosidade (MATTIL, 1971). Segundo Vojdani (1996), as proteínas utilizadas pela
sua funcionalidade devem ter, de maneira geral, uma alta solubilidade para
41
proporcionar boa emulsão, capacidade de formação de espuma, geleificação e de
dispersão.
As maiores interações que influenciam as características de solubilidade das
proteínas são de natureza hidrofóbica e iônicas. As interações hidrofóbicas
favorecem as interações proteína-proteína, que resultam em decréscimo na
solubilidade, enquanto interações iônicas favorecem as interações proteína-água e
resultam em aumento de solubilidade. A mudança de pH, portanto, altera a
distribuição de sítios polares catiônicos, aniônicos e não-iônicos na molécula de
proteína, que afetam as interações água-proteína e proteína-proteína (FENNEMA,
1993).
No ponto isoelétrico (PI), a molécula de proteína possui carga líquida igual a
zero, apresentando máxima interação eletrostática entre os grupos carregados e
interações mínima com a água ocorrendo, portanto, agregação e precipitação. No PI,
os grupos carregados não estão disponíveis para interagir com as moléculas de
água, enquanto em valores de pH maiores ou menores a proteína apresenta cargas
elétricas positivas e negativas, respectivamente, e as moléculas de água podem
interagir com cargas, contribuindo para a sua solubilização. Geralmente, a
solubilidade de uma proteína aumenta com a temperatura de 0 a 40°C. Acima disso,
a proteína pode desnaturar, expondo, consequentemente, os grupos não-polares
(hidrofóbicos), o que ocasiona agregação e precipitação, decrescendo a solubilidade
(ORDONÊZ, 2005).
Segundo Sorgentini et al. (1995) podem ocorrer mudanças na superfície
hidrofóbica da proteína como resultado da desnaturação térmica, acarretando em
insolubilização das proteínas, que é decorrente da exposição e da agregação das
zonas hidrofóbicas antes orientadas para o interior da molécula. Os mesmos autores
propuseram três modelos para as interações hidrofóbicas possíveis de ocorrer em
altas e baixas concentrações de proteína, promovidas pela desnaturação:
(A) em uma forte tendência em direção à agregação das proteínas como
resultado das interações hidrofóbicas, promovida pelo alto grau de desnaturação
alcançado em altas temperaturas. É chamada desnaturação irreversível;
42
(B) em baixa concentração de proteína (5% e 8%) nem todas as zonas
hidrofóbicas expostas pela desnaturação são envolvidas para formação de
agregados proteicos devido ao baixo número de pontos de interação entre cadeias
polipeptídicas e;
(C) em altas concentrações de proteína (11% a 13%, e 15%), a
hidrofobicidade é significativamente diminuída durante o aquecimento, por causa do
alto grau de agregação atingido (número elevado de zonas hidrofóbicas envolvidas
nas interações entre cadeias polipeptídicas).
2.11.2 Absorção de água
Segundo Pilosof (2000) a absorção de água ou a capacidade de retenção de
água indicam a capacidade de um material absorver a água em sua estrutura de
uma forma espontânea, quando em contato com a água através de uma superfície
que se mantém úmida por imersão. A capacidade de absorção de água é um
fenômeno importante na tecnologia de alimentos, pois a água absorvida em
pequenas quantidades não atua como solvente, mas contribui para dar corpo e
aumentar a viscosidade (CÂNDIDO, et al. 1998).
As proteínas interagem com a água por meio da formação de ligações, como
as pontes de hidrogênio, ligações dipolo-dipolo ou cadeias laterais dos aminoácidos
(interação com grupos ionizáveis). Assim, quando há proporção maior de
aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas, a proteína apresenta menor
capacidade de hidratação do que quando é composta por aminoácidos com cadeias
laterais hidrofílicas, que podem formar mais facilmente ligações de hidrogênio com a
água. Os diferentes processamentos, tais como tratamentos térmicos, extrusão e
texturização podem ocasionar decréscimo na capacidade de absorção de água, em
razão da agregação das proteínas desnaturadas (ORDONÊZ, 2005).
Remondetto et al. (2002) relatam que isolados proteicos de soja,
contendo um elevado teor de proteínas desnaturadas, exibem maior capacidade
de absorção de água.
43
Hou & Chang (1997) relatam que a absorção de água em produtos proteicos
de soja pode estar relacionada com as frações 7 e 11S da globulina da soja. Os
autores verificam que no tofu a absorção de água diminui em virtude do aumento da
fração 11S, que por apresentar maior quantidade de aminoácidos cisteína permite
maior formação de pontes dissulfeto, impedindo que moléculas de água sejam
absorvidas pela proteína. Comportamentos semelhantes foram observados por Hou
et al. (2004a 2004b), os quais verificam que o armazenamento da soja em condições
adversas (85% de umidade e 30°C) promove diminuição da hidrofobicidade
superficial e aumento das pontes dissulfeto nas frações 7 e 11S.
2.11.3 Capacidade de formação de espuma
A capacidade de formação de espuma das proteínas consiste em dispersar
bolhas de ar em meio líquido, cuja propriedade depende, segundo Zavarese et al.
(2000), da natureza aminoacídica da proteína, do pH, da solubilidade, da
temperatura (desnaturação) e da presença de sais junto à proteína. Uma proteína
com boa qualidade para formação de espuma é aquela capaz de fixar rapidamente o
ar durante o batimento da proteína, proporcionando rápida mudança conformacional
do sistema, reorganizando a interface ar-água com a redução da tensão superficial,
formando uma película viscoelástica coesa através de interações intermoleculares
(HETTIARACHCHY & ZIEGLER, 1994).
A capacidade de formação de espuma pode ser determinada por medidas
diretas do volume de espuma produzida após aeração de uma solução de proteína
(WANISKA & KINSELLA, 1979; PATEL, et al., 1988) ou por métodos indiretos
(condutividade). A estabilidade da espuma, medida como o tempo necessário para
uma redução de 50% do volume da espuma, indica a capacidade de estabilização
contra efeitos gravitacionais e mecânicos (DAMODARAN, 1997).
Segundo Kinsela (1984), o ideal para que uma proteína apresente o melhor
desempenho na formação e na estabilidade de espuma é que esta possua peso
molecular maior do que 20 KDa, um mínimo de carga líquida, presença de sítios
para interações hidrofóbicas, e uma conformação flexível. Furtado et al. (2001)
relatam que as espumas são mais estáveis na região do ponto isoelétrico das
44
proteínas, em razão da falta de interação repulsivas que promovem uma interação
mais favorável entre proteína-proteína, formando um filme mais viscoso.
Nielsen et al. (1997) estudando a funcionalidade das proteínas hidrolisadas,
verificam que a estabilidade da espuma diminui e a capacidade de formação de
espuma aumenta como resultado da desnaturação. Segundo os autores, isso
demonstra que a desnaturação afeta a capacidade de formação e a estabilidade de
espuma das proteínas de forma diferente. A desnaturação parcial das proteínas
frequentemente proporciona melhora nas propriedades de espuma devido à
exposição de grupos hidrofóbicos que antes estavam protegidos na estrutura original
da proteína.
2.11.4 Digestibilidade
A digestibilidade é a medida da porcentagem das proteínas que são
hidrolisadas pelas enzimas digestivas e absorvidas na forma de aminoácidos ou de
qualquer composto nitrogenado. Proteínas cujas ligações peptídicas não são
hidrolisadas pelo processo digestivo, em razão de terem estruturas mais
organizadas e resistentes ao ataque enzimático, são excretadas nas fezes ou sofrem
transformações no intestino grosso (MONTEIRO, 2000).
O valor nutricional de uma proteína é aumentado pelo processamento
térmico, especialmente pelo calor úmido. Isso decorre, provavelmente, da
desnaturação dos fatores antinutricionais de natureza proteica das proteínas, já que
para exercer os seus efeitos biológicos de inibição in vivo esses fatores precisam
manter sua integridade estrutural. Além disso, o aumento do valor nutricional pode
ser resultante de maior acessibilidade das proteínas ao ataque enzimático, devido à
desnaturação térmica (POEL et al., 1990).
A desnaturação, por mudar a conformação das proteínas mantendo somente
a estrutura primária intacta, expõe novos sítios para o ataque enzimático, que acaba
por melhorar a digestibilidade proteica. As proteínas de soja na forma natural (nãodesnaturada) são mais resistentes ao ataque das enzimas proteolíticas do que a
proteína desnaturada pelo calor (MONTEIRO, 2000). Portanto, o efeito do
tratamento térmico no aumento da qualidade proteica é devido não somente à
45
inativação dos inibidores de protease, mas também por desnaturar a proteína de
soja, rompendo a sua estrutura interna e permitindo que a molécula de proteína
esteja mais disponível ao ataque enzimático (LUI, 1997).
2.12 Técnicas para estudo da estrutura e da conformação das proteínas
Um dos métodos mais comuns de analisar os componentes das proteínas é
a técnica de eletroforese em gel. Este método tem a vantagem de uma maior
diferenciação das subunidades das proteínas. Baseia-se no princípio da separação
de partículas de massa diferente através de corrente elétrica. O aparecimento das
bandas em géis de poliacrilamida, da análise de eletroforese representa a presença
de determinada proteína, bem como sua concentração, ambas determinadas pelo
princípio da atração elétrica realizada por correntes elétricas no gel, em que as
proteínas de maior peso molecular percorrem menores distâncias no gel do que as
de menor peso molecular (LAEMMLI, 1970).
Quando são realizados tratamentos térmicos, químicos, físicos ou
enzimáticos na proteína, as bandas que caracterizam as subunidades de uma
proteína podem desaparecer, tornando-se mais fracas ou ainda mais fortes devido
às reações de agregação ocorridas na proteína. Quando as bandas desaparecem ou
tornam-se mais fracas na região em que deveriam ser marcadas no gel, isso pode
significar que ela tenha sido fragmentada, fazendo com que apareça em outra região
de menor peso molecular, ou ainda se sobrepor em uma banda já marcada, que a
partir de então, se torna mais forte (LAEMMLI, 1970).
Outra técnica muito utilizada para estudar a estrutura e a conformação das
proteínas é a microscopia eletrônica de varredura (MEV), devido à alta resolução
demonstrada nas imagens microscópicas dos produtos (CASTRO, 2000).
A Calorimetria Diferencial de Varredura (CDV) é também uma técnica muito
utilizada em estudo de proteínas, principalmente em relação à desnaturação
(SOUZA, 2000).
A desnaturação da proteína, bem como algumas outras mudanças de
estrutura e conformação decorrentes da ação da temperatura é registrada através de
46
um fluxo de diferencial térmico na forma de um pico em um termograma
(HARWALKAR, 1987), sendo possível determinar temperatura de desnaturação,
entalpia e grau de desnaturação da proteína.
O pH exerce forte influência sobre a funcionalidade das proteínas, visto que
várias propriedades funcionais dependem do estado de ionização de grupos
ionizáveis na molécula proteica e deveria ser sempre indicado em todas as
descrições de métodos utilizados (HALL, 1996).
47
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
No experimento foram utilizados grãos de soja (Glicyne max L. Merril),
colhidos na safra de 2008, no município de Capão do Leão, no Sul do Rio Grande do
Sul, Brasil.
Foram utilizados reagentes de grau analítico ou para cromatografia. Os
padrões daizeína, genisteína e gliciteína foram obtidos de Sigma Chemical Co (St.
Louis, MO).
3.2 Métodos
3.2.1 Preparação das amostras
Os grãos de soja depois de colhidos foram submetidos à secagem na
temperatura de 40°C até 13% de umidade em sistema estacionário de escala piloto
no
Laboratório
de
Pós-Colheita,
Industrialização
e
Qualidade
de
Grãos.
Posteriormente, os grãos secos foram submetidos a um tratamento hidrotérmico de
encharcamento em que 1 Kg de grãos foi distribuído em saquinhos perfurados,
contendo 100 g de soja em cada um, os quais foram imersos em água destilada na
proporção de 1:5 (p/v) respectivamente, em duas temperaturas (40 e 60°C) durante
4, 8, 12 e 16 horas. O controle da temperatura foi realizado com um termômetro,
com precisão de 0,1°C. Após o encharcamento, os grãos foram secos em secador
estacionário de escala piloto, na temperatura de 40°C até umidade de 13% e
seguido de trituração em triturador para obtenção da farinha integral de soja.
As temperaturas testadas para o tratamento hidrotérmico pretenderam
compreender uma faixa térmica inferior e outra superior à temperatura crítica de
desnaturação das proteínas da soja, visando a detectar possíveis alterações
48
decorrentes da temperatura nas características nutricionais e nas funcionais das
proteínas.
3.2.2 Preparação do isolado proteico
Para obtenção do isolado proteico de soja (IPS), a farinha integral,
imediatamente após a moagem, foi desengordurada em éter de petróleo para
obtenção da farinha desengordurada de soja (FD). O IPS foi preparado de acordo
com o método descrito por Lui et al. (2003), em que 50g de farinha desengordurada
de soja (FD) foi suspensa em 1 L de água destilada, com ajuste do pH da mistura
para 9,0 por adição de solução de NaOH 4 N.
A extração do IPS foi realizada em 45 minutos, a 55ºC, sob leve agitação,
sendo a suspensão centrifugada a 13.000 x g (25ºC) por 20 minutos, havendo coleta
e liofilização do resíduo (RS). O sobrenadante (SB) proveniente da centrifugação
teve seu pH ajustado para 4,1 por adição de solução de HCl 6 N, sendo agitado por
1 hora em temperatura ambiente, para precipitação da proteína no seu ponto
isoelétrico.
Após a precipitação ácida, a suspensão foi centrifugada novamente por 20
minutos a 13.000 x g (5ºC), e o precipitado (isolado proteico de soja - IPS) foi
coletado e liofilizado.
A
tabela
2
contém
o
delineamento
experimental
dos
tratamentos
hidrotérmicos realizados nos grãos de soja como matéria-prima para obtenção de
isolados protéicos ricos em isoflavonas agliconadas, bem como as análises
realizadas nos diferentes produtos gerados na extração da proteína para produção
do IPS.
49
Tabela 2 - Delineamento experimental dos diferentes tratamentos hidrotérmicos em
grãos de soja
Variáveis Independentes
Tratamentos
Temperatura
1
Tempo
Testemunha
2
4 horas
40°C
3
8 horas
4
12 horas
60°C
5
16 horas
6
4 horas
40°C
7
8 horas
Variáveis Dependentes
No grão: Atividade β-glicosidase
No isolado
Composição química
Isoflavonas e suas formas
Digestibilidade protéica
Solubilidade proteíca
Rendimento de extração
Capacidade de absorção de água
Capacidade de formação de espuma
Solubilidade
Atividade antioxidante
Fenóis totais
Eletroforese
DSC
No sobrenadante
Composição química
Isoflavonas e suas formas
No Resíduo
8
12 horas
60°C
9
16 horas
Composição química
Isoflavonas e suas formas
Balanço de massa
Estatística
3.2.3 Composição centesimal das frações FD, IPS, RS e SB
A composição química das frações FD, IPS, RS e SB foi determinada através
das análises de umidade, cinzas, gordura, proteínas e fibras sendo que todos os
métodos foram realizados de acordo com a AACC (1995). O teor de carboidratos foi
avaliado por diferença, conforme método AOAC (2000).
3.2.4 Extração e quantificação de isoflavonas
As isoflavonas das frações FD, IPS, RS e SB da precipitação ácida do IPS
foram extraídas de acordo com método descrito por Fukutake et al (1996), com
modificações. Cada amostra de 1 g foi transferida para balão volumétrico de 10 mL.
Adicionou-se metanol 80% nos balões até completar o volume, deixando a amostra
em contato com o solvente por duas horas em temperatura ambiente para completa
extração. Cada amostra foi transferida do balão para tubos de eppendorf, sendo
centrifugada a 9000 rpm por 6 minutos (Microcentrífuga - NT800, Nova Técnica). O
50
sobrenadante foi transferido para vial de 1,5 mL e utilizado para quantificação das
isoflavonas agliconadas.
A quantificação das isoflavonas agliconas foi feita de acordo com
procedimento descrito por Carrão-Panizzi et al (2004).
Foram injetados 10 μL de amostra em sistema de cromatografia líquida de
alta eficiência (Shimadzu), contendo coluna analítica de fase reversa, Supelcosil TM
LC-18 (25 cm x 4,6 mm x 5 µm), tendo como fase estacionária grupamentos
octadesil. Utilizou-se o detector espectrofotométrico UV/V a 260 nm (SPD-10AVVP).
Os dados foram obtidos e processados com o uso do software Class-VP.
Utilizou-se fluxo constante de 0,9 mL.min-1, com fase móvel inicial de ácido acético
0,1% em água, ácido acético 0,1% em acetonitrila (80:20) por 15min, alterando-se
linearmente para ácido acético 0,1% em água, ácido acético 0,1% em acetonitrila
(50:50) permanecendo até 25 min, alterando-se para ácido acético 0,1% em
água:ácido acético 0,1% em acetonitrila (0:100) mantendo-se por 35 min; e
retornando linearmente para a fase móvel inicial, totalizando 40 min. de análise. A
temperatura da coluna variou de 25 a 35°C.
Para identificação e quantificação das isoflavonas foram construídas curvas
de calibração externa para daidzeína (Sigma Aldrich, na pureza de 98%), gliciteína
(Sigma Aldrich, na pureza de 98%) e genisteína (Sigma Aldrich, na pureza de 98%),
cujos tempos de retenção para daidzeína, gliciteína, genisteína foram de 15,3; 15,6
e 18,9 minutos respectivamente.
3.2.5 Atividade da enzima β-glicosidase
A atividade da enzima β-glicosidase foi realizada de acordo com GóesFavoni (2010), onde 100 mg de amostra foi adicionado 1,5 mL de tampão citrato
0,05 M em pH 4,5, contendo NaCl 0,1 M e mantidos por 1 hora em temperatura
ambiente. As amostras foram centrifugadas e o sobrenadante usado como solução
de enzima para a determinação da atividade enzimática. Dois mililitros do substrato
p-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo (p-NPG) a 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis,
E.U.A.) em solução tampão de fosfato citrato a 0,1 M e pH de 5 ─ foram transferidos
51
para tubos de ensaio e mantidos em banho-maria a 30°C por 10 minutos. Em
seguida, 0,5 mL da solução de enzima foi adicionada ao substrato e mantida a 300C
por 30 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 2,5 mL de carbonato de
sódio a 0,5 M e seguida de leitura imediata. A atividade foi acompanhada em
espectrofotômetro (Cecil Instruments, England, Mod. 3000) a 420 nm contra a prova
em branco.
O para-nitrofenol (p-NP) liberado pela ação da enzima foi determinado
tomando-se como referência uma curva de calibração preparada a partir do p-NP
(Sigma-Aldrich Co. St Louis, E.U.A.) em concentrações de 5 a 300 μM, conforme
Matsuura et al. (1989), cuja linearidade foi alta (r2 > 0,99). Uma unidade de atividade
(UA) foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μM de p-NP
por minuto sob as condições do experimento. Os resultados foram expressos em
níveis de atividade (UA/g de amostra em base seca).
3.2.6 Eletroforese (SDS-PAGE)
A determinação do perfil eletroforético dos isolados proteicos de soja
proveniente de grãos tratados hidrotermicamente foi feita de acordo com
procedimento descrito por Laemmli (1970) com algumas modificações. Cinco
miligramas de proteína total foram dissolvidas em 1 mL de tampão contendo 0,5 M
Tris-HCl (pH 6,8), 10% de SDS, 10% de glicerol, 5% β-mercaptoetanol e 0,1% de
azul de bromofenol e aquecidas a 90°C por 3 minutos e depois resfriadas; 6µL foram
aplicados no gel. A SDS-PAGE foi realizada utilizando-se um sistema tampão de
SDS-Tris-Glicina. A concentração do gel de empilhamento foi de 4% e do gel de
separação em gradiente de 8-15%. Os pesos moleculares das proteínas foram
determinadas utilizando-se o padrão da Sigma Aldrich: albumina bovina (66 KDa);
ovalbumina (45 KDa); gliceraldeido 3-fosfato deidrogenase (36 KDa); tripsinogêneo
de pâncreas bovino (24 KDa); inibidor de tripsina (20 KDa) e α-lactoalbumina (14
KDa).
52
3.2.7 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
A calorimetria diferencial de varredura foi realizada de acordo com o método
descrito por Souza (2000). Os isolados proteicos de soja, 45 mg por amostra, foram
suspensos em água destilada na proporção em peso de 1:3 e colocados em
cápsulas de alumínio hermeticamente fechadas. As amostras foram aquecidas de 20
a 110°C na velocidade de 10°C por minuto. Uma cápsula vazia foi usada como
referência.
A temperatura de desnaturação foi determinada pelo pico do termograma. A
diferença de entalpia (ΔH), a temperatura de desnaturação (Td) e a temperatura
máximo do pico (Tp) foram determinadas através de programa computacional do
Universal V4.1D TA Instrument.
3.2.8 Compostos fenólicos totais
A determinação dos compostos fenólicos totais nos isolados proteicos de
soja provenientes de grãos tratados hidrotermicamente foi realizada de acordo com
o método descrito por Zielinski e Kozlowska (2000), com algumas modificações. Os
compostos fenólicos foram extraídos com metanol 80% (20:1 v/p) por 2 horas a 4°C.
Depois de centrifugado o extrato metanólico (10.000 x g/20min.), uma alíquota de
0,25mL foi misturada com 0,25 mL do reagente Folin-Ciocalteu e 2 mL de água
destilada. Depois de 3 minutos à temperatura ambiente, 0,25 mL da solução
saturada de carbonato de sódio (Na2CO3) foi adicionado. A amostra foi mantida sob
agitação por 30 minutos em banho-maria a 37°C. A absorbância foi medida em 750
nm, usando espectrofotômetro modelo Ultrospect 2000 UV-Visivel. Cada amostra foi
analisada em triplicata e os resultados foram expressos em miligramas de ácido
gálico por 100 g de amostra, através da curva de calibração do ácido gálico.
3.2.9 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante dos isolados proteicos de soja provenientes de
grãos tratados hidrotermicamente foi medida através da atividade do mesmo em
capturar radicais livres usando DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil) segundo Chen & Ho
53
(1995). As amostras dos diferentes isolados proteicos de soja foram dissolvidas em
solução metanólica 50% (2,0 g/ml). Uma alíquota de 0,5 mL da solução metanólica
contendo o isolado protéico de soja foi misturada com 2,5 mL de DPPH em solução
etanólica (400 µM). Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente e na
ausência de luz, foi medida a habilidade do extrato em consumir o DPPH em
absorbância de 517 nm. A atividade antioxidante foi medida segundo a equação 1.
Atividade antioxidante (%) = (Aa – Ab) x 100
Ab
onde,
Aa: Absorbância da amostra contendo somente DPPH
Ab: Absorbância da amostra a analisar
3.2.10 Digestibilidade proteica “in vitro”
A digestibilidade proteica “in vitro” foi realizada de acordo com Pinto et al.
(2005). As amostras de IPS obtidos dos diferentes tratamentos hidrotérmicos foram
colocadas em solução de HCl 0,1 N (10 mg/mL) e hidrolisadas com pepsina durante
3 horas a 37°C, sob leve agitação. A proporção entre enzima e substrato foi de 1:25.
A hidrólise foi interrompida com adição de ácido tricloroacético até obter uma
concentração de 5% na relação de peso por volume. Depois, a amostra foi
centrifugada a 10000 x g por 20 minutos.
Uma alíquota de 2 mL do sobrenadante foi utilizada para determinação do
nitrogênio total digerido em método micro-Kjeldahl (AOAC, 1995). Uma amostra em
branco foi preparada contendo todos os reagentes da análise juntamente com a
pepsina. A correlação entre o nitrogênio total e o nitrogênio do hidrolisado
(sobrenadante) permite a estimativa da digestibilidade proteica através da equação
2.
54
Digestibilidade (%) = (Ndigerido x 100)/Ntotal
(2)
onde,
Ndigerido: Nitrogênio contido no sobrenadante da amostra
Ntotal: Nitrogênio total da amostra de isolado proteico de soja
3.2.11 Solubilidade proteica
A solubilidade proteica foi determinada através do método de Morr et al.
(1985), com variação do pH de 3 a 11. Amostras de 500 mg são homogeneizadas
com 2 mL de solução de NaCl 0,1 M, obtendo-se uma pasta homogênea. A seguir,
são adicionados 40 mL de tampão fosfato em pH 3, 5, 7, 9 e 11. A suspensão é
mantida sob agitação por 45 minutos em agitador magnético e o volume é
completado em balão volumétrico de 50 mL. Após isso, a suspensão foi centrifugada
a 960 x g por 30 minutos e no sobrenadante é determinada a concentração de
nitrogênio solúvel pelo método de micro-Kjeldahl (AACC, 2000), com fator de
conversão 6,25. A porcentagem de proteína solúvel é calculada de acordo com a
equação 3.
P.S. (%) = [ A x 50 ]
[W x S ]
100
x100
(3)
onde,
A = concentração proteíca do sobrenadante em mg.mL-1;
W = peso da amostra em mg;
S = concentração de proteína na amostra em %.
3.2.12 Capacidade de absorção de água (CAA)
A capacidade de absorção de água foi determinada segundo Sosulski et al.
(1976). Uma amostra de 500 mg foi homogeneizado com 5 mL de água destilada em
tubo de centrífuga por 1 minuto e deixada em repouso por 30 minutos à temperatura
55
ambiente (22 – 25°C) e, em seguida, centrifugada por 30 minutos a 1200 x g. A água
retida após a centrifugação foi considerada como a água absorvida. O sedimento no
tubo da centrífuga, após separação do sobrenadante, foi pesado e a capacidade de
absorção de água (CAA) foi calculada de acordo com equação 4.
% CAA: Peso do sedimento (g) x 100
(4)
Peso da amostra (g) )
3.2.13 Capacidade de formação de espuma (CFE) e estabilidade da espuma
(EE)
A capacidade de formação de espuma (CFE) e estabilidade da espuma (EE)
foram avaliadas por uma combinação dos métodos de Philips et al. (1987) e Dipak &
Kumar (1986). Três gramas de amostra foram misturadas com 100 mL de água
destilada deixando em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente (22 -25°C).
A suspensão proteica foi submetida á agitação em um blender por 1 minuto e em
seguida, foi transferida para uma proveta de 250 mL, medindo-se o volume antes e
após o batimento. O estudo da estabilidade da espuma foi feito através do repouso
da amostra após o batimento com leitura do volume total após o intervalo de 15
minutos. As fórmulas para o cálculo da CFE e EE estão descritas nas equações 5 e
6, respectivamente.
CFE: (B-A) x 100
A
(5)
EE: (V15) x 100
V0
(6)
A: Volume antes de bater
V15: Volume medido em 15 minutos
B: Volume depois de bater
V0: Volume medido depois de bater
3.2.14 Colorimetria
A cor dos isolados proteicos de soja obtida dos diferentes tratamentos foi
determinada usando um colorímetro MINOLTA modelo CR-300, o qual indica as
56
cores em um sistema tridimensional. O eixo vertical L* indica a cor da amostra numa
faixa que varia do preto ao branco, o eixo a* da cor verde ao vermelho e o eixo b* da
cor azul ao amarelo. Foram feitas 5 determinações para cada amostra, as quais
foram realizadas colocando as amostras em um recipiente de 5 cm de diâmetro e 1
cm de altura, certificando-se que os isolados proteicos cobriam completamente o
fundo do recipiente. A amostra foi medida em uma área de 19,6 cm2. O índice de
diferença de cor (ΔE*) foi calculado a partir dos eixos L*, a* e b* através da equação
7.
E*
L*
2
a*
2
b*
2 1/ 2
(7)
Onde: ΔL* = L*1 – L*2; Δa* = a*1 – a*2; e Δb* = b*1 – b*2. Valores iniciais de
cor de isolados proteicos sem tratamento de L*, a* e b* estão subscritos pelo
número 1 e os valores de cada tempo de hidratação estão subscritos pelo número 2.
O ângulo Hue (°Hue*) foi calculado segundo a equação 8:
°Hue*= actg (a*/b*) (–1) +90
(8)
O Chroma (C*) foi calculado segundo a equação 9:
C*: [a2 + b2]1/2
(9)
3.2.15 Perfil texturométrico
O perfil texturométrico foi realizado utilizando um texturômetro (modelo TAXT2, Stable Micro Systems, Surrey, Inglaterra) segundo método proposto por Liu et.
al., (2008). Os parâmetros do teste foram: velocidade de carga fixada em 1,00 mm.
s-1. Um êmbolo cilíndrico (5 cm de diâmetro) foi usado para compactar as amostras.
A deformação da amostra foi fixada em 30% da altura da amostra original. Uma
pausa de três segundos foi permitida entre a primeira e a segunda compressão.
Cada amostra foi avaliada 5 vezes.
Os parâmetros avaliados foram dureza, fraturabilidade, adesividade,
elasticidade, coesividade e gomosidade. Para análise de perfil de textura, os
isolados proteicos, após elaborados, foram colocados em placas de alumínio, com 5
cm de diâmetro e 1 cm de altura. A pasta de isolado foi colocada a 0,5 cm do topo
57
das placas e analisadas no texturômetro. O texturômetro TA-XT2, equipado com um
software,
forneceu
os
resultados
dos
5
parâmetros
analisados
(dureza,
fraturabilidade, adesividade, elasticidade e coesividade).
3.2.16 Microscopia eletronica de varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura foi realizada de acordo com o método
descrito por Castro (2002), em que as amostras foram secas em dessecador
contendo sílica gel, sem a utilização de fixador químico para microscopia eletrônica.
Na etapa seguinte, o material foi colocado nos suportes porta-amostras do
microscópio (“stub”), em diferentes posições, considerando a melhor orientação em
relação ao feixe de varredura e o coletor de elétrons secundários. Para fixação foi
utilizada etiqueta adesiva bordejada com um filete de prata coloidal para melhorar a
condutividade. O trabalho de montagem foi feito sob lupa estereoscópica.
Posteriormente, todas as amostras foram cobertas com uma fina camada
de ouro para melhorar a condutividade térmica e elétrica, utilizando o sistema
sputtering, em que o depósito do metal é eficiente, mesmo em objetos muito
irregulares, pois os átomos atingem a superfície, oriundos de todas as direções.
No
microscópio
eletrônico
de
varredura
foram
utilizados
elétrons
secundários (baixa energia) provenientes da interação do feixe primário com a
camada de ouro que recobre o material a ser analisado. No estudo foi utilizada
tensão aceleradora de 10 KV e distância de trabalho de 30 milímetros. Foi utilizado
um microscópio eletrônico de Varredura Zeiss, modelo DMS 940.
3.2.17 Análise estatística
Para a avaliação estatística foi realizada análise de variância (ANOVA),
onde as diferenças estatísticas foram analisadas por comparação de médias pelo
teste de Tukey, todos em 5% de significância (Programa Statfoft, versão 7.0). Para
verificação de correlações entre as avaliações e as amostras foi aplicado o teste de
Correlação de Pearson (p<0,05).
58
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Composição centesimal da farinha desengordurada (FD)
Este estudo foi realizado para averiguar a influência do tratamento
hidrotérmico no grão de soja associado à formação de isoflavonas agliconadas,
devido à ativação da β-glicosidase do próprio grão, bem como a manutenção e a
permanência desses compostos no isolado proteico de soja, produzidos a partir da
farinha desengordurada deste grão.
A Tabela 3 contém os valores da composição centesimal da farinha
desengordurada (FD) obtidos de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC
durante 4, 8, 12 e 16 horas.
Tabela 3 - Composição centesimal da farinha desengordurada obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tratamento
Proteínas
Sem tratamento 55,29 ab
4 horas
49,20 bB
8 horas
55,61 abB
12 horas
55,03 abB
16 horas
56,25 aB
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
55,29 d
66,76 aA
63,89 bA
62,64 bA
58,63 cA
Lipídeos
Fibras
40°C
3,42 b
7,4 b
1,94 cB
6,9 bB
1,86 cB
7,3 bB
3,81 bB
8,7 aB
6,36 aB
8,2 aB
60°C
3,42 c
7,4 d
3,41 cA
8,2 cA
4,40 bA
9,8 bA
4,33 bA 10,0 aA
8,03 aA 11,3 aA
Cinzas
Carboidratos
5,55 a
5,93 aA
6,10 aA
5,56 aA
5,49 aA
28,37b
37,01 aA
29,15 bA
26,92 bA
23,70 bA
5,55 a
4,14 bB
4,04 bB
2,89 cB
3,08 cB
28,37 a
17,53 bB
17,88 bB
20,44 bB
18,97 bB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p <
0,05). As letras minúsculas comparam diferentes tempos de tratamento na mesma temperatura e às
letras maiúsculas comparam diferentes temperaturas no mesmo tempo de tratamento.
Conforme é possível ser observado na Tabela 3, o teor de proteínas da FD
está de acordo com a legislação (BRASIL, 1978), que estabelece um teor de no
59
mínimo 50% de proteínas. Não houve mudança significativa no teor de proteínas das
farinhas desengorduradas tratadas a 40°C, no entanto, a 60°C, o teor proteico
aumentou significativamente em relação à FD sem tratamento. Houve um rápido e
significativo aumento do teor proteico em 4 horas de tratamento a 60°C e posterior
decréscimo até 16 horas de tratamento, no entanto, todos os valores de proteína a
60°C superaram ao teor protéico da FD sem tratamento. O tratamento térmico
favorece a concentração de proteína na FD, sendo que na temperatura de 60°C
significativamente mais do que a 40°C.
O teor de fibras (Tabela 3) também aumentou com o tempo e temperatura
de tratamento hidrotérmico, apresentando diferenças significativas a partir das 8
horas de tratamento a 40°C e a partir de 4 horas na temperatura de 60°C.
O teor de cinzas não sofreu mudanças significativas durante o tratamento a
40°C, no entanto a 60°C, já nas primeiras horas de tratamento, houve diminuição
significativa, vindo a diminuir ainda mais ao longo do tratamento, com perdas que
variaram de 1 a 53%.
O teor de carboidratos (Tabela 3) não apresentou mudanças significativas
durante o tratamento a 40°C, com exceção do tempo de 4 horas, o que
provavelmente seja ocasionado pela perda significativa de proteínas lixiviada para
água de encharcamento nesta mesma condição, ocorrendo concentração deste
constituinte na FD. Na temperatura de 60°C houve diminuição significativa de 38%
dos carboidratos existentes na FD nas primeiras horas de tratamento, mantendo-se
até 16 horas de tratamento.
Quanto ao teor de lipídios na FD foi possível observar que até 8 horas de
tratamento a 40°C houve redução do conteúdo de lipídios, possivelmente facilitado
pelo carreamento promovido pelo lixiviamento das proteínas e que, a partir deste
tempo, não houve perda de proteína. Na temperatura de 60°C, já nas primeiras
horas de tratamento, não houve perda de proteínas fazendo com que os lipídios
permanecessem em maior quantidade na FD, acentuando-se até 16 horas de
tratamento. É possivel concluir que em tempos mais prolongados e temperatura
mais intensa, a proteína se rearranje através de interações hidrofóbicas e, neste
processo, retenha lipídios em seu interior.
60
Os teores de proteínas e fibras provavelmente tenham aumentado na FD em
virtude da diminuição do teor de cinzas e carboidratos, por estes serem mais fáceis
de lixiviarem para a água de encharcamento. Aumentos percentuais de um
constituinte tanto podem ocorrer por seu aumento específico como pela diminuição
da concentração de outros constituintes. As proteínas e as fibras são polímeros de
alto peso molecular, portanto, difíceis de serem lixiviados do grão de soja durante o
tratamento hidrotérmico. Este fato indica que o tratamento empregado promove
lixiviação diferencial e, portanto, uma forma de obtenção de proteína concentrada.
Goés-Favoni et al. (2007) também observaram aumento do teor de proteínas
em grãos de soja tratados hidrotermicamente por 12 horas a 50°C. Os autores
atribuíram o aumento em função da passagem de componentes não nitrogenados
para a água de hidratação durante a imersão dos grãos de soja, promovendo
concentração dos demais constituintes. Trabalhos anteriormente realizados por
Goés-Favoni (2002) demonstraram que grãos de soja encharcados em quantidade
de água reduzida (1:2 grão:água, p:p) absorvem praticamente toda a água de
hidratação pelos cotilédones e, portanto, o teor de proteínas se mantém inalterado.
4.2
Efeitos
do
tratamento
hidrotérmico
na
formação
de
isoflavonas
agliconadas na farinha desengordurada
O tratamento hidrotérmico realizado nos grãos de soja visou à obtenção de
uma farinha desengordurada como matéria-prima enriquecida de aglicona para
produção de um isolado proteico de soja (IPS).
A Tabela 4 mostra o teor de isoflavonas agliconadas (µg/g) encontradas na
farinha desengordurada (FD) obtidos de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60
ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas.
61
Tabela 4 – Teor de isoflavonas agliconadas (µg/g) da farinha desengordurada de
soja obtidos de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16
horas
Temperatura (°C)
40
60
Tempo (horas)
Sem Tratamento
4
8
12
16
321,98 aD
345,08 aD 420,82 aB 460,43 aA 382,09 aC
321,98 aD
326,85 bD 360,36 bB 400,72 bA 352,52 bC
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
O teor de isoflavonas agliconadas na FD (Tabela 4) apresentou aumento até
12 horas de tratamento hidrotérmico nas duas temperaturas estudadas, sendo que
na temperatura de 40°C o efeito foi mais significativo do que a 60°C, com aumentos
de
aproximadamente
43
e
24%
respectivamente.
Houve
decréscimo
na
concentração de agliconas em 16 horas de tratamento para as duas temperaturas
estudadas.
O decréscimo do teor de isoflavonas agliconadas na FD em tempos maiores
de 12 horas de tratamento possivelmente esteja associado à estabilidade térmica
das agliconas em tempos maiores de exposição à temperatura. Malaypally & Ismail
(2010) investigaram efeitos da desnaturação térmica das proteínas na extração e
estabilidade das isoflavonas de soja e verificaram que, à medida que as proteínas
sofrem ação da temperatura, ao ponto de desnaturá-las promovem liberação das
isoflavonas, antes associadas no seu interior hidrofóbico, ao meio aquoso,
permitindo que as isoflavonas fiquem mais expostas à degradação térmica,
promovendo destruição das isoflavonas simultaneamente com a desnaturação.
4.3 Efeitos do tratamento hidrotérmico na atividade da enzima β-glicosidase
A quantificação da atividade da enzima β-Glicosidase visa avaliar a sua
contribuição para a formação de isoflavonas agliconadas na FD durante o
tratamento hidrotérmico.
62
A Tabela 5 contém os valores da atividade da enzima β-Glicosidase (UA/g)
obtidos dos grãos de soja tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e
16 horas.
Tabela 5 - Atividade da enzima β-Glicosidase (UA/g) dos grãos tratados
hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas
Temperatura (°C)
40
60
Sem Tratamento
1883,05 A
1883,05
Tempo (horas)
4
8
1236,31 B 1184,36 B
ND
ND
12
1007,85 C
ND
16
822,68 D
ND
Médias de três repetições seguidas por letras iguais maiúsculas na linha não diferem entre si pelo
teste de Tukey (p < 0,05).
ND: Não detectado
É possível observar na Tabela 5 que a atividade enzimática medida nos
grãos não tratados hidrotermicamente foi de 1883,05 UA/g e que o tratamento
hidrotérmico realizado a 40°C promoveu redução significativa (p<0,05) dessa
atividade já nas primeiras horas de tratamento, com percentuais que variaram de 34
a 57%. Na temperatura de 60°C não foi detectada atividade da enzima βGlicosidase.
Comparando os resultados obtidos para o teor de isoflavonas agliconadas
na FD (Tabela 4) com os de atividade enzimática (Tabela 5), pode-se afirmar que,
provavelmente, o aumento da concentração de isoflavonas agliconadas a 40°C seja
pela ativação da enzima β-glicosidase durante o tratamento hidrotérmico. Esses
resultados diferem dos relatados por Coward (1998), segundo o qual o aumento das
isoflavonas agliconadas em grãos de soja, tratados hidrotermicamente, se dá pela
ativação de uma enzima endógena, a β-glicosidase, em pH que varia de 4,3 a 7,0 e
temperatura ótima de 45°C, a qual hidrolisa as formas glicosiladas, malonil e acetil
glicosiladas à forma aglicona. Segundo Matsuura & Obata (1993) a hidrólise das
enzimas β-glicosidase é tempo dependente e promove o aumento das agliconas até
12 horas de tratamento hidrotérmico a 50ºC. Carrão-Panizzi et al (2003) ao
avaliarem os efeitos do tratamento hidrotérmico na concentração de isoflavonas
agliconadas em grãos de soja encontraram maiores concentrações de aglicona em
grãos tratados a temperatura de 50°C contra aqueles tratados a 60°C.
63
A redução do nível da atividade enzimática a 40°C possivelmente se deve à
migração da enzima para a água de hidratação. Goés-Favoni (2004) observaram
diminuição de 80%, em média, no nível de atividade da enzima β-Glicosidase após
12 horas de tratamento a 50°C em grãos de soja inteiros. Toda et al. (2000)
constataram que a atividade da enzima na água de hidratação aumentou com o
aumento do tempo em que grãos de soja foram mantidos em hidratação a 15°C por
10 e 20 horas, evidenciando lixiviação da enzima para a água. Quanto às
isoflavonas agliconadas (Tabela 4), o aumento da sua concentração após
tratamento hidrotérmico se deve, provavelmente, a ação da enzima e a maior
retenção das isoflavonas nos cotilédones, permanecendo nos tecidos maior
quantidade de agliconas.
O aumento da concentração de isoflavonas agliconadas na FD a 60°C
(Tabela 4) provavelmente se deva à concentração das isoflavonas agliconadas na
FD decorrente da perda seletiva de proteína, e a perda de cinzas e carboidratos da
FD para a água de encharcamento (Tabela 3), e não à ação da enzima, pois nesta
temperatura a enzima não foi detectada, provavelmente pela sua inativação (Tabela
3). Matsuura & Obata (1993) relataram que a enzima β-Glicosidase é inativada a
60°C. Possivelmente, ocorra uma retenção seletiva de proteínas que tem maior
afinidade com as isoflavonas. O aumento da concentração de isoflavonas
agliconadas também pode ser devido à hidrólise ácida das formas glicosiladas
ocorrida nesta temperatura de tratamento. Testes preliminares permitiram verificar
aumento da acidez nas farinhas desengorduradas à medida que aumentou o tempo
e temperatura de hidratação. Vários autores (WANG & MURPHY, 1994; MURPHY,
1999; GENOVESE & LAJOLO, 2001; MURPHY, 2002) relataram que é possível
hidrolisar as formas conjugadas em agliconas por meio enzimático (β-glicosidase) ou
por meio ácido.
4.4 Comportamento cinético da enzima β-glicosidase com o emprego dos
tratamentos hidrotérmicos
Na Figura 2 é possível observar o comportamento cinético da enzima βGlicosidase frente os tratamentos hidrotérmicos realizados a 40 e 60°C durante 4, 8,
12 e 16 horas.
64
Figura 2 - Cinética de degradação da enzima β-Glicosidase nas temperaturas de 40 e 60°C durante 4,
8, 12 e 16 horas de tratamento hidrotérmico.
É possível observar na Figura 2 que ocorreu degradação da enzima em
ambas as temperaturas, sendo que a velocidade de degradação da enzima foi maior
a 60°C. A cinética de degradação foi bem descrita usando o modelo cinético de
primeira ordem, com comportamento linear, onde o coeficiente de determinação (R 2)
foi de 0,9216 para a temperatura de 40°C. Os intervalos de tempo adotados no
tratamento a 60ºC não permitiu uma análise adequada.
4.5 Efeitos do tratamento hidrotérmico na dinâmica de extração do isolado
proteico de soja
Os valores da dinâmica de extração do IPS a partir da farinha
desengordurada de soja tratada a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas são
apresentados na Tabela 6.
65
Tabela 6 - Dinâmica de extração do isolado proteico de soja (%) proveniente de
grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
40
Sem Tratamento
4
8
12
16
40,01 aA
41,46 aA
38,75 aAB
36,02 aB
32,05 aC
60
40,01 aA
28,27 bBC
22,44 bD
26,95 bC
29,29 bB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A extração do isolado proteico de soja a partir da FD sem tratamento foi de
40,01% (Tabela 6). Esse rendimento foi semelhante ao de 38% obtido por Lui et al.
(2003) nas mesmas condições. As diferenças na dinâmica de extração de 17,8% e
28,9% obtidos por Wang & Murphy (1996) e Wang et al. (1998), respectivamente se
devem, provavelmente, às condições de extração utilizadas, como pH (8,5 e 8,0
respectivamente) e temperatura (ambiente) utilizada por estes autores.
O tratamento hidrotérmico teve influência significativa sobre a extração dos
isolados, com diminuição do rendimento de extração de aproximadamente 21% na
temperatura de 40°C e de 45% na de 60°C, o que está de acordo com Barbosa et al.
(2006), o qual relata haver uma faixa térmica inferior e uma superior a temperatura
critica cujas condições promovem desnaturação irreversível (drástica).
O efeito da temperatura de tratamento do grão de soja na extração das
proteínas solúveis da FD talvez esteja relacionado à desnaturação ocorrida nessas
proteínas, promovendo sua insolubilização.
4.6 Composição centesimal dos isolados proteicos de soja
A Tabela 7 contém os valores da composição centesimal dos isolados
proteicos de soja obtidos de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante
4, 8, 12 e 16 horas.
66
Tabela 7 - Composição centesimal dos isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tratamento
Proteínas
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
95,26 a
94,35 bB
93,40 cB
92,63 dB
92,60 dB
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
95,26 a
96,04 aA
95,99 aA
96,35 aA
96,06 aA
Lipídios
40°C
0,54 c
1,15 bA
1,32 bA
1,78 aA
1,68 aA
60°C
0,54 c
0,86 aB
0,83 aB
0,67 bB
0,69 bB
Fibras
Cinzas
Carboidratos
2,12 a
2,17 aA
2,53 aA
2,63 aA
2,44 aA
2,07 d
2,30 cA
2,74 bA
2,89 bA
3,28 aA
ND
ND
ND
ND
ND
2,12 a
1,55 bB
1,42 bB
1,46 bB
1,59 bB
2,07 a
1,55 bB
1,76 bB
1,72 bB
1,66 bB
ND
ND
ND
ND
ND
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p <
0,05). As letras minúsculas comparam diferentes tempos de tratamento na mesma temperatura e as
letras maiúsculas comparam diferentes temperaturas no mesmo tempo de tratamento.
ND: Não detectado
A composição centesimal do IPS oriunda de grãos não tratados está de acordo
com valores encontrados na literatura (HENN & NETTO, 1998; SOUZA, 2000;
MARTINS, 2005).
Os valores de proteína (Tabela 7) encontrados nos isolados variaram de 92,63
a 96,15%. Os IPS obtidos correspondem à definição de isolado proteico de soja
(BRASIL, 2005; CODEX ALIMENTARIUS, 2011) que estabelece que isolados proteicos
devam conter no mínimo 90% de proteína (N x 6,25) em base seca.
O tratamento hidrotérmico a 60°C proporcionou extrações de isolados com
maiores teores de proteína que os obtidos de grãos não tratados e aqueles tratados a
40°C. Nesta temperatura, o percentual de proteínas caiu significativamente ao longo do
tempo de tratamento. É possivel que determinadas temperaturas modifiquem a
estrutura conformacional das proteínas acarretando mudanças em suas características
funcionais, o que pode levar a diferenças na extração da proteína. Barbosa et al.
(2006) verificaram que a temperatura de extração influencia no teor de proteínas em
isolados proteicos de soja após avaliarem rendimentos de extração proteica em
diferentes temperaturas (4 – 50°C). Seus resultados demonstraram que quanto maior
67
a temperatura de extração, nesta faixa estudada, maior é o teor de proteínas no isolado
proteico.
O teor de lipídios dos IPSs (Tabela 7) apresentou aumento significativo com
emprego dos tratamentos hidrotérmicos tanto a 40°C quanto a 60°C, sendo que a 40°C
o aumento foi gradual ao longo do tempo e a 60°C houve aumento máximo até 8 horas
de tratamento e leve decréscimo a partir deste tempo, no entanto, em todos os tempos
de tratamento a 60°C, o teor de lipídios foi superior ao do IPS sem tratamento.
O teor de fibras dos IPSs não foi influenciado com o emprego dos tratamentos
hidrotérmicos a 40°C e a 60°C já nas 4 primeiras horas de tratamento, com redução de
aproximadamente 26%.
Quanto ao teor de cinzas dos IPS, o tratamento hidrotérmico a 40°C promoveu
aumento significativo em todos os tempos de tratamento e a 60°C redução significativa
somente nas primeiras 4 horas, mantendo-se constante até 16 horas.
4.7 Efeitos do processamento hidrotérmico sobre a distribuição dos
constituintes químicos da FD para as frações IPS, RS e SB
Com objetivo de investigar o efeito do tratamento hidrotérmico na redução do
rendimento de extração do IPS, avaliou-se a distribuição de massa dos constituintes
químicos (proteínas, carboidratos, cinzas, lipídios e fibras) a partir da FD para as
frações IPS, RS e SB.
A massa dos constituintes químicos (proteínas, carboidratos, cinzas, lipídios
e fibras) das frações IPS, RS e SB representam o fracionamento promovido pelo
processo de isolamento dos conteúdos encontrados na matéria-prima (FD) oriunda
dos grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas, secos, moídos
e desengordurados.
A distribuição de massa e concentração de proteína da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC durante 4, 8, 12 e 16 horas são apresentados
na Tabela 8.
68
Tabela 8 - Distribuição de massa e concentração da proteína da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas
Tratamento
IPS
1
Massa FD
1
Massa
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
55,29
49,20
55,61
55,03
56,25
38,1 a
39,11 aA
36,19 aA
33,37 bA
29,68 bA
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
55,29
66,76
63,89
62,64
58,63
38,1 a
27,17 bB
21,12 cB
25,97 bB
27,93 bB
2
Conc.
40°C
68,9
79,5
65,1
60,6
52,8
60°C
68,9
40,7
33,1
41,5
47,6
RS
Massa
1
2
Conc.
SB
Massa 2Conc.
1
3
Outros
6,07 c
6,25 cB
6,13 cB
8,21 bB
12,03 aB
11,0
12,7
11,0
14,9
21,4
1,87 a
1,26 cB
1,39 bcB
1,72 aA
1,66 abA
3,4
2,6
2,5
3,1
3,0
9,2
2,6
11,9
11,7
12,9
6,07 d
21,39 bcA
26,97 aA
20,70 cA
21,61 bA
11,0
32,0
42,2
33,0
36,9
1,87 c
2,34 aA
2,31 bA
1,26 dB
1,71 cA
3,4
3,5
3,6
2,0
2,9
9,2
15,9
13,5
14,7
7,4
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre pelo teste de Tukey (p < 0,05).
As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos diferentes tempos de tratamento
na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nas
diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
IPS: isolado proteico de soja
RS: resíduo insolúvel
SB: sobrenadante
1
Valores expressos em gramas
2
Concentração expressa em %
3
Materiais não identificados
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 8 é possível observar
que o IPS é a fração que contém a maior parte das proteínas da FD (68,9%) seguido
do RS (11%) e SB (3,4) e que ao longo do tratamento houve mudanças
significativamente na distribuição de massa proteica nestas frações. A proteína do
IPS não apresentou mudança significativa em seu conteúdo (g) até 8 horas de
tratamento a 40°C, no entanto, a partir das 12 horas começou a haver redução
significativa de aproximadamente 17%, vindo a diminuir ainda mais em 16 horas
(22%). Houve redução mais intensa nos tratamentos realizados a 60°C do que a
40°C e naqueles já nas primeiras horas de tratamento, com perdas que chegaram a
45%. Simultaneamente à perda de proteica no IPS, houve aumento significativo de
proteínas no RS a partir das 12 horas de tratamento a 40°C e a 60°C já nas
primeiras horas.
69
As concentrações expressas na Tabela 8 demonstram quanto da proteína da
FD foi distribuída nas frações IPS, RS ou SB. O rendimento proteico do IPS a partir
da massa de proteína existente em 100 gramas da FD (b.s.) é de 79,49% em 4
horas a 40°C, superior ao 68,91% do IPS sem tratamento, caindo até 52,76% em 16
horas nessa temperatura. O tratamento térmico por até 4 horas aumenta a extração
de proteínas, no entanto, ao longo dos tratamentos nas duas temperaturas esta se
reduz o que se pode atribuir à sua insolubilização permanecendo no resíduo, em
temperaturas mais altas e em longos tempos de tratamento. Verificou-se, portanto,
que houve aumento no teor de proteína do RS ao longo do tratamento a 40°C e a
60°C atingindo um valor máximo em 12 horas de tratamento.
A perda da massa proteica do IPS talvez esteja relacionada com mudanças
que podem ocorrer com as proteínas em determinadas temperaturas, como as
temperaturas de desnaturação. A desnaturação, em determinada intensidade, pode
insolubilizar as proteínas, fazendo com que elas permaneçam no material insolúvel
do processo de extração de isolados proteicos de soja. Este fato pode ser observado
no presente estudo (Tabela 8) com o aumento da massa proteica no RS (material
insolúvel do processo de extração) ao longo do tempo e temperatura de tratamento,
que foi de aproximadamente 4 vezes mais.
A distribuição de massa e concentração de fibras da FD para as frações IPS,
RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas são apresentados na Tabela
9.
70
Tabela 9 - Distribuição de massa e concentração de fibras da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidas do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas
Tratamento
1
Massa FD
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
7,38
6,92
7,29
8,70
8,20
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
7,38
8,17
9,79
9,99
11,29
IPS
RS
2
1
Massa
Conc.
Massa
40°C
0,85 cd
11,5
3,50 c
0,90 bcA 13,0
3,41 cB
0,98 bA
13,4
3,49 cB
1,27 aA
14,6
4,22 bB
0,78 dA
9,5
5,20 aB
60°C
0,85 a
11,5
3,50 c
0,44 cB
5,4
7,04 bA
0,55 bB
5,6
8,41 aA
0,29 dB
2,9
8,62 aA
0,46 cB
4,1
8,51 aA
1
SB
2
3
47,4
49,3
47,9
48,5
63,4
0,63 a
0,37 bA
0,39 bA
0,30 cA
0,32 cA
8,5
5,3
6,4
2,3
3,9
2,4
2,2
2,4
3,3
1,9
47,4
86,2
85,9
86,3
75,4
0,63 a
0,38 bA
0,16 cB
0,18 cB
0,20 cB
8,5
4,7
1,6
1,8
1,8
2,4
0,3
0,9
0,8
2,1
Massa
2
Outros
Conc.
1
Conc.
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos diferentes tempos de tratamento
na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nas
diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
IPS: isolado proteico de soja
RS: resíduo insolúvel
SB: sobrenadante
1
Valores expressos em gramas
2
Concentração expressa em %
3
Materiais não identificados
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 9 é possível observar
que o RS é a fração que concentra a maior parte das fibras da matéria-prima (47%),
seguida do IPS (11%) e SB (8,5%).
Com o emprego dos tratamentos hidrotérmicos, a massa de fibras da FD foi
deixando de ser carreada para o IPS e sendo retida no RS, sendo que a 40°C a
retenção de fibras foi diretamente proporcional ao aumento do tempo de tratamento,
com valores de retenção de aproximadamente 64% em 16 horas. O tratamento a 60°C
foi ainda mais significativo na retenção das fibras da FD para o RS, com mais de 85%
já nas primeiras horas de tratamento, cujo percentual manteve-se constante por até 12
horas. Provavelmente, a fibra forma um complexo insolúvel com as proteínas que estão
se insolubilizando com o tratamento hidrotérmico, aumentando o teor de fibras no RS.
Na temperatura de 40°C, as proteínas por manterem-se solúveis, arrastam as fibras
para o sobrenadante.
71
Através da análise de correlação foi possível observar uma relação alta e
positiva (0,96) entre as fibras e as proteínas do IPS, comprovando que as proteínas
arrastam fibras no momento de extração do IPS.
A distribuição de massa e concentração de cinzas da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas são apresentados na Tabela
10.
Tabela 10 - Distribuição de massa e concentração de cinzas da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas
Tratamento
IPS
1
Massa FD
1
Massa
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
5,55
5,93
6,10
5,56
5,49
0,83 b
0,95 aA
1,06 aA
1,04 aA
1,05 aA
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
5,55
4,14
4,04
2,89
3,08
0,83 a
0,44 cdB
0,40 dB
0,52 bB
0,48 bcB
RS
2
1
Conc.
Massa
40°C
15,0
1,40 a
16,0
1,28 bB
17,4
1,28 bB
18,7
1,04 cB
19,1
1,13 cB
60°C
15,0
1,40 d
10,6
1,76 bA
9,9
2,46 aA
18,0
1,78 bA
15,6
1,62 cA
2
SB
Massa 2Conc.
3
Outros
Conc.
1
25,2
21,6
21,0
18,7
20,6
1,53 c
1,56 cA
1,88 bA
1,80 bA
2,22 aA
27,6
26,3
30,8
32,4
40,4
1,8
2,1
1,9
0,6
1,0
25,2
42,5
60,9
61,6
52,6
1,53 a
0,94 bB
0,56 cB
0,59 cB
0,56 cB
27,6
22,7
13,9
20,4
18,2
1,8
1,0
0,6
0,0
0,4
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos diferentes tempos de tratamento
na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nas
diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
IPS: isolado proteico de soja;
RS: resíduo insolúvel
SB: sobrenadante
1
Valores expressos em gramas
2
Concentração expressa em %
3
Materiais não identificados
De acordo com a Tabela 10 é possível observar que o SB é a fração que
concentra a maior parte das cinzas da matéria-prima (27%), contra outros 25% que
ficam no RS e 15% no IPS, no entanto, com o emprego dos tratamentos
hidrotérmicos ocorrem mudanças nestes percentuais. Na temperatura de 40°C
ocorreram aumentos da massa de cinzas nos IPSs e SBs e diminuição em RSs com
72
aumento do tempo de tratamento e na temperatura de 60°C ocorreu o processo
inverso, onde o RS começou a reter mais da metade (60%) das cinzas da matériaprima, e os IPS e SB perderam massa de cinzas.
A diminuição da massa de cinzas no IPS na temperatura de 60°C (Tabela
10) provavelmente esteja relacionada com a perda de fibras ocorrida no IPS, isto
porque pode ocorrer uma interação entre cinzas e fibras, em que as cinzas, por
serem componentes químicos de baixo peso molecular, podem ser carreadas junto
com as fibras no processo de isolamento proteico. Este fato pode ser comprovado
pelo aumento de cinzas no RS de mais de 1,8 vezes.
Através da análise de correlações (Apêndice A) é possível observar que a
massa total de fibras possui relação alta e positiva com a massa total de cinzas, nas
temperaturas de 40 e 60°C (0,97 e 0,99) respectivamente, confirmando a hipótese
acima.
A distribuição de massa e concentração de carboidratos da FD para as
frações IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100 g de
farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas são apresentados na
Tabela 11.
73
Tabela 11 - Distribuição de massa e concentração de carboidratos da FD para as
frações IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100 g de
farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas
Tratamento
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
1
Massa FD
28,37
37,01
29,15
26,92
23,70
28,37
17,53
18,63
20,94
18,97
RS
Massa
13,58 b
12,74 bB
13,52 bB
15,91 aB
15,76 a B
13,58 c
14,28 cA
18,63 bA
20,94 aA
18,48 bA
1
SB
2
Conc.
47,9
34,4
46,4
59,1
66,5
47,9
81,5
100,0
100,0
100,0
1
Massa
14,79 bc
24,26 aA
15,62 b
8,74 cd
7,94 d
14,79 a
3,24 bB
0,00
0,00
0,00
3
2
Conc.
52,1
65,5
53,6
32,5
33,5
52,1
18,5
0,0
0,0
0,0
Outros
0,0
0,0
0,0
2,3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,5
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si a 5% de significância pelo
teste de Tukey (p < 0,05). As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos
diferentes tempos de tratamento na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo
constituinte de cada produto nas diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
IPS: isolado proteico de soja
RS: resíduo insolúvel
SB: sobrenadante
1
Valores expressos em gramas
2
Concentração expressa em %
3
Materiais não identificados
Na fração IPS não foram identificados carboidratos.
O produto que concentra a maior fração de carboidratos da matéria-prima é
o SB (Tabela 11), com 52% de seu percentual e o RS o restante, pois no IPS não foi
detectado massa de carboidratos. Com o emprego dos tratamentos hidrotérmicos a
partir de 8 horas a 60°C é possível observar que os carboidratos ficam totalmente
retidos no RS. A drasticidade dos tratamentos hidrotérmicos provavelmente
promoveu a insolubização dos carboidratos fazendo com que ficassem retidos
totalmente no RS (material insolúvel do processo).
A distribuição de massa e concentração de lipídios da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas são apresentados na Tabela
12.
74
Tabela 12 - Distribuição de massa e concentração de lipídios da FD para as frações
IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100 g de farinha
desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas
Tratamento
1
Massa FD
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
3,42
1,94
1,86
3,81
6,36
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
3,42
3,41
4,40
4,33
8,02
IPS
RS
2
1
2
Massa
Conc.
Massa
Conc.
40°C
0,22 b
6,4
0,10 d
2,9
0,48 aA
24,7
0,35 bB
18,0
0,51 aA
27,4
0,14 cdB
7,5
0,60 aA
15,7
0,31 bcB
8,1
0,54 aA
8,5
1,22 aB
19,2
60°C
0,22 ab
6,4
0,10 c
2,9
0,24 aB
7,0
0,69 bA
20,2
0,19 cB
4,3
0,65 bA
14,8
0,18 cB
4,2
0,71 bA
16,4
0,20 bcB
2,5
1,93 aA
24,0
1
SB
Massa 2Conc.
1
3
Outros
0,18 c
0,50 aA
0,42 bA
0,38 bB
0,24 cA
5,3
25,8
22,6
10,0
3,8
2,9
0,6
0,8
2,5
4,4
0,18 d
0,42 bB
0,35 cB
0,73 aA
0,10 eB
5,3
12,3
8,0
16,9
1,2
2,9
2,1
3,2
2,7
5,8
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si a 5% de significância pelo
teste de Tukey (p < 0,05). As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos
diferentes tempos de tratamento na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo
constituinte de cada produto nas diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
IPS: isolado proteico de soja
RS: resíduo insolúvel
SB: sobrenadante
1
Valores expressos em gramas
2
Concentração expressa em %
3
Materiais não identificados
A massa lipídica (Tabela 12) não apresentou correlação definida com os
tratamentos hidrotérmicos, com excessão do RS, que apresentou tendência ao
aumento conforme aumento da temperatura e do tempo de tratamento.
4.8 Eletroforese
Os perfis eletroforéticos (SDS-PAGE) dos isolados proteicos de soja
oriundos de grãos tratados hidrotermicamente estão apresentados na Figura 3.
75
PM (KDa)
A
66 KDa
B
45 KDa
C
36 KDa
24 KDa
20 KDa
D
14 KDa
1
2
4
3
5
6
7
8
9
11
10
0
Figura 3 - Eletroforese em gel de policrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) dos
isolados proteicos de soja proveniente de grãos sem tratamento e tratados hidrotermicamente.
Coluna 1: Padrão; Coluna 2: sem tratamento; Coluna 3: 4h/40°C; Coluna 4: 8h/40°C; Coluna 5:
12h/40°C; Coluna 6: 16h/40°C; Coluna 7: 4h/60°C; Coluna 8: 8h/60°C; Coluna 9: 12h/60°C; Coluna 10:
16h/60°C; Coluna 11: Padrão.
Banda A: subunidades α’ e α (~70KDa) da fração 7S; Banda B: subunidade β (~ 51KDa) da fração 7S.
Bandas C e D: correspondem, respectivamente, às subunidades ácida (~ 37KDa) e básica (~ 23KDa)
da fração 11S.
Os valores dos pesos moleculares estimados para os IPSs estão em
concordância com resultados publicados por outros autores (WOLF, 1972; SOUZA,
2000;
GENOVESE
foram identificados
&
de
LAJOLO,
acordo
2002) e
com
QI &
os
isolados proteicos
SUN,
2011
e
são
de
soja
formados,
majoritariamente, por globulinas 7S (β-conglicinina) e 11S (glicinina).
De acordo com a Figura 3 é possível observar que o IPS sem tratamento,
bem como aqueles obtidos de grãos tratados hidrotermicamente apresentam as
frações 7 e 11S bem definidas no gel de eletroforese. Estes resultados, além de
demonstrarem que os IPS obtidos no presente estudo apresentam as principais
globulinas presentes em isolados proteicos de soja, sugerem também que o
aquecimento não foi capaz de provocar agregação que acarretasse em alteração de
peso molecular das frações 7 e 11S destes isolados.
Souza (2000) ao estudar o efeito do tratamento térmico nas características
de isolados proteicos de soja e seus hidrolisados proteicos também não observou
76
agregações entre as subunidades das proteínas quando tratadas a 70°C. Keerati-urai & Corredig (2010), ao analisarem a estabilidade da glicinina e β-conglicinina
frente ao calor induzido também verificaram não haver agregação das frações
glicinina e β-conglicinina após aquecimento nas temperaturas de 75 e 95°C, apesar
de verificar desnaturação das frações analisadas em DSC.
4.9 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
As proteínas isoladas das FD oriundas de grãos tratados hidrotermicamente
(IPS) foram avaliadas quanto às alterações termicamente induzidas pelo tratamento
hidrotérmico, como sua desnaturação e registradas como um fluxo diferencial
térmico na forma de um pico de termograma (DSC), como pode ser visto na Figura
4.
Figura 4 - Termograma de DSC do isolado proteico de soja sem tratamento.
O termograma do IPS sem tratamento apresentou dois picos, 72,54°C e
83,60°C, cuja representação encontra-se na Figura 4. Segundo Keerati-U-Rai &
Corredig (2010), estes picos correspondem à fração 7S (β-conglicinina) e à fração
11S (glicinina), respectivamente.
Sorgentini et al. (1995) relataram temperaturas de desnaturação para βconglicinina de 74°C e de 83°C para a glicinina. Keerati-U-Rai & Corredig (2010)
77
relataram temperaturas de desnaturação de 69 e 85°C respectivamente para βconglicinina e glicinina. Renkema et al. (2000) ao estudar o efeito do pH sobre a
desnaturação e formação de gel nas propriedades da proteína de soja verificaram
que a temperatura de desnaturação das duas maiores frações da proteína da soja
(β-conglicinina e glicinina) são diferentes, onde a primeira se desnatura entre 63 a
68°C e segunda entre 80 e 88°C.
Os valores de variação de entalpia (ΔH), temperatura de desnaturação (Td)
e temperatura máxima do pico (Tp), dos IPSs obtidos de grãos tratados, secos e
desengordurados encontram-se na Tabela 13.
Tabela 13 - Calorimetria diferencial de varredura dos isolados proteicos de soja
provenientes de soja tratada hidrotermicamente
β-Conglicinina (7S)
Td (°C) Tp(°C) ΔH (J/g)
Sem tratamento 72,54
76,20
0,66
4h/40°C
73,19
77,71
0,43
8h/40°C
74,38
78,48
0,10
12h/40°C
74,98
77,23
0,84
16h/40°C
73,22
77,74
0,58
4h/60°C
74,52
78,78
0,19
8h/60°C
75,17
77,97
0,17
12h/60°C
70,94
71,54
0,15
16h/60°C
ND
ND
ND
Tratamentos
Glicinina (11 S)
Td (°C) Tp(°C) ΔH (j/g)
83,60
90,69
2,19
84,73
91,90
1,57
83,62
90,64
1,37
84,53
90,96
1,73
84,97
92,27
2,26
85,19
92,42
0,84
84,61
90,79
1,77
85,37
90,62
2,49
84,54
91,34
1,66
Entalpia total
ΔH (j/g)
2,85
2,00
1,47
2,57
2,84
1,03
1,94
2,64
1,66
ND: Não detectado.
A entalpia (ΔH) da fração 7S apresentou um valor menor do que a da fração
11S (Tabela 13), o que está de acordo com Liu et al. (2008). A entalpia corresponde
à energia requerida para alterar a estrutura da proteína e/ou desnaturá-la. Quando o
valor da entalpia diminui, a desnaturação é parcial e quando a entalpia não é mais
observada, a desnaturação é total (SORGENTINI et al. 1995).
O isolado proteico obtido em 16 horas de tratamento a 60°C apresentou
somente um pico, correspondente à fração glicinina (11S), provavelmente devido à
desnaturação total da fração β-conglicinina promovida pelo tratamento hidrotérmico.
Sorgentini et al. (1995) encontraram resultados semelhantes ao analisarem o efeito
do tratamento térmico em isolados proteicos de soja e suas implicações nas
características de
solubilidade
e estrutura
dos
isolados. Seus resultados
78
demonstraram que o pico referente à fração 7S desapareceu em 80°C enquanto que
o pico relacionado à fração 11S permaneceu inalterado. Esses autores atribuíram o
desaparecimento da fração 7S, à desnaturação ocorrida.
Segundo autores como Maruyama et al. (1999) e Lakemond et al. (2000), a
glicinina é mais estável ao calor do que β-conglicinina. A maior estabilidade térmica
da fração 11S é devido à presença de 21 pontes dissulfeto, das quais, 15 são
intramoleculares. A globulina 7S não possui estas ligações e, como consequência,
sua temperatura de desnaturação é menor e mais suscetível ao tratamento térmico
(DAMODARAN, 1988; SCILINGO & AÑON, 1996; OLIVEIRA, 2010).
Para este estudo, a entalpia total (entalpia da β-conglicinina e da glicinina)
observada para o IPS sem tratamento foi de 2,85 J/g, inferior ao encontrado por
Souza (2000), 3,7 J/g; por Puppo & Añon (1999), 18,3 J/g; e Sorgentini et al. (1996)
17,6 J/g.
Na temperatura de 40°C houve uma diminuição da entalpia provavelmente
devido a uma desnaturação parcial das proteínas, no entanto, houve um aumento da
entalpia nos tempos mais prolongado de tratamento, o que pode ter ocorrido em
função de uma reorganização da proteína, apresentando um perfil de entalpia total
do IPS igual a sem tratamento. Lakemond et al. (2000) e Mill et al. (2003) sugeriram
que outras
alterações
estruturais, que a desnaturação, podem ocorrer após o
aquecimento da glicinina. Outros autores (PRIVALOV & KLECHINASCHVILE, 1974;
TAKEITI, 2002; KEERATI-U-RAI & CORREDIG, 2010), citaram que devido ao
tratamento
térmico,
haveria
mudanças
estruturais
e
conformacionais
do
desdobramento das moléculas da proteína promovendo diminuição da entalpia.
Os tratamentos hidrotérmicos levaram à obtenção de isolados com
diferentes graus de desnaturação. Uma possível explicação para as diferenças
encontradas para entalpia pode ser o tratamento térmico e/ou químico sofrido pela
farinha durante o processo de sua obtenção.
A desnaturação térmica conduz à dissociação da proteína em subunidades,
ao desdobramento de sua estrutura e à exposição de seus grupos hidrofóbicos, o
que pode levar a maior facilidade de solubilização e eventual precipitação das
proteínas (WOLF, 1979; KINSELLA, 1979).
79
O que poderia ter ocorrido ainda é a formação de agregados proteicos
através de ligações dissulfeto. Segundo Wolf (1970), no aquecimento da farinha de
soja, pode haver formação de agregados proteicos através de ligações dissulfeto.
Durante a etapa de extração aquosa estes agregados são extraídos, ocorrendo mais
agregação na etapa de precipitação isoelétrica, insolubilizando as proteínas.
4.10 Efeitos do tratamento hidrotérmico sobre o conteúdo de isoflavonas
agliconadas nos isolados proteicos de soja
Os valores de isoflavonas agliconadas totais (daidzeína, gliciteína e
genisteína), expressos em µg de aglicona por g de IPS (bs) estão apresentados na
Tabela 14.
Tabela 14 - Isoflavonas agliconadas totais (µg.g-1) em isolados proteicos de soja
obtidos de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Temperatura (°C)
40
Tempo (horas)
Sem tratamento
4
8
12
16
220,27 aE
278,52 bD
447,4 bC
626,98 bA
556,27 aB
60
220,27 aE
314,69 aD
488,87 aC
669,55 aA
585,38 aB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A concentração inicial de isoflavonas agliconadas totais no IPS (Tabela 14)
oriundos de grãos sem tratamento foi de 220,27 µg.g-1, superior aos resultados
encontrados por outros autores, como Lui et al. (2003), que encontraram valores
próximos a 140 µg.g-1,, e Shao et al. (2009) com valores entre 114,8 e 242,62 µg.g-1.
Estes autores atribuem as diferenças nos valores de isoflavonas agliconadas
provavelmente às condições dos métodos de extração de isoflavonas da amostra,
como pH e temperatura ou, ainda, devido à variabilidade genética nas cultivares
utilizadas nos estudos, o que pode apresentar concentração inicial diferenciada e,
consequentemente, no teor final de aglicona nos produtos derivados.
A
concentração
de
isoflavonas
agliconadas
(µg.g-1)
aumentou
consideravelmente nos isolados proteicos de soja provenientes de grãos tratados
hidrotermicamente em comparação àqueles não tratados (Tabela 14), apresentando
aumentos de 3,0 e 3,1 vezes, nas temperaturas de 40°C e 60°C respectivamente,
80
com aumento máximo em 12 horas de tratamento e uma diminuição significativa (16
e 12%) em 16 horas nas temperaturas de 40 e 60°C respectivamente.
Estes
resultados estão de acordo com Coward (1998), Matsuura & Obata (1993) e CarrãoPanizzi et al. (2003) que relataram que tratamentos hidrotérmicos promovem
aumento de isoflavonas agliconadas pela ativação da enzima β-glicosidase.
Foi observada uma tendência ao decréscimo do teor de isoflavonas
agliconadas no IPS em tempos maiores do que 12 horas de tratamento a 60°C, o
que possivelmente esteja associado à sua instabilidade térmica. Estes resultados
estão de acordo com Malaypally et al. (2010) que verificaram que as isoflavonas
tornam-se instáveis frente à degradação térmica das proteínas, uma vez que a
proteína protege as isoflavonas.
Foi encontrada maior quantidade de µg de aglicona por g de IPS a 60°C
(Tabela 14) do que a 40°C. Os tratamentos hidrotérmicos realizados a 60°C
proporcionaram menores concentrações de proteínas no IPS do que a 40°C (Tabela
12), devido à insolubilização de parte destas, que ficaram retidas no resíduo
insolúvel (RS). É possível afirmar que os tratamentos promoveram o isolamento
seletivo de proteínas que tenham mais afinidade com as agliconas. Estes resultados
estão de acordo com Wolf (1979) e Kinsella (1979) que relataram que a
desnaturação térmica e a dissociação das proteínas em subunidades promovem o
desdobramento de sua estrutura e à exposição de seus grupos hidrofóbicos, que
segundo os autores, possuem afinidade com as agliconas.
Complementarmente, Wang & Murphy (1996) e Faraj & Vasanthan (2004),
relatam que o rearranjo proteico inicialmente facilita a solubilização e isolamento de
parte das frações, em especial a fração 11S, que carreia consigo as isoflavonas. Por
sua vez tratamentos mais longos rearranjam e insolubilizam frações de proteínas,
que neste caso promovem a retenção de agliconas no resíduo.
Os valores das agliconas genisteína, expressos em µg de aglicona por g de
IPS (bs) estão apresentados na Tabela 15.
81
Tabela 15 - Total de genisteína (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos de
grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Temperatura (°C)
Tempo (horas)
Sem tratamento
4
8
12
16
97,84 aE
144,8 bD
220,0 bC
295,1 bA
230,9 bB
40
60
97,8 aE
153,4 aD
235,43 aB
312,4 aA
242,9 aC
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
As agliconas genisteína (Tabela 15), quantificadas nos diferentes isolados
proteicos, variaram de 97,84 a 312,38 µg.g-1 com aumento de 3 vezes maior em
relação à quantidade inicial (sem tratamento) com emprego dos tratamentos
hidrotérmicos.
Os valores de daidzeína estão apresentados na Tabela 16, cujos resultados
foram expressos em µg de aglicona por g de IPS (bs).
Tabela 16 - Total de daidzeína (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos de
grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Temperatura (°C)
40
Tempo (horas)
Sem tratamento
4
8
12
16
93,03 aD
99,74 bD
161,84 bC
223,93 bA
207,82 bB
60
93,03 aE
112,95 a D
170,77 aC
243,09 aA
219,72 aB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
As agliconas daidzeína (Tabela 16), quantificadas nos diferentes isolados
proteicos, variaram de 93,03 a 243,09 µg.g-1 com aumento de 2,6 vezes mais em
relação a quantidade inicial com emprego dos tratamentos hidrotérmicos.
As agliconas genisteína (Tabela 15) e daidzeína (Tabela 16) apresentaram,
nas temperaturas de 40°C e 60°C, um aumento significativo do seu conteúdo até 12
horas e leve decréscimo nas 16 horas, sendo que na tempertura de 60°C, a
concentração foi significativamente maior que 40°C.
Os valores das agliconas gliciteína, expressos em µg de aglicona por g de
IPS (b.s.) estão apresentados na Tabela 17.
82
Tabela 17 - Total de gliciteína (µg.g-1) em isolados proteicos de soja obtidos de
grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Temperatura (°C)
40
Tempo (horas)
Sem tratamento
4
8
12
16
29,4 aD
33,9 aD
66,4 bC
98,0 bB
117,6 aA
60
29,4 aE
48,3 bD
82,7 aC
114,1 aB
122,8 aA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
As agliconas gliciteína nos IPSs (Tabela 17) apresentaram concentrações
que variaram de 29,41 a 122,76 µg.g-1, cujo aumento foi de 4,2 vezes mais em
relação à quantidade inicial com o emprego dos tratamentos hidrotérmicos. O
aumento, diferentemente das agliconas genisteína e daidzeína, foi crescente até as
16 horas de tratamento.
É possível observar através das Tabelas 15, 16 e 17, que a fração da
aglicona que foi quantificada em maior quantidade nos IPSs sem tratamento, bem
como nos obtidos após tratamentos foi a genisteína (102,71 a 336,70 µg.g-1),
seguida da daidzeína (97,66 a 266,94 µg.g-1) e gliciteína (30,87 a 127,80 µg.g-1),
demonstrando que o perfil das frações de isoflavonas agliconadas não mudou ao
longo dos tratamentos. Resultados semelhantes foram relatados por Shao et al.,
(2009) e Barbosa et al (2006) ao quantificarem as frações agliconas em isolados
proteicos de soja. Particularmente, Genovese et al. (2005) relataram que a
distribuição original de agliconas em variedades de soja brasileira demonstram que a
genisteína é a aglicona presente em maior quantidade, seguida da daidzeína e
gliciteína. Carrão-Panizzi e al. (2003) relataram que apesar da aplicação de
tratamento hidrotérmico em grãos de soja, o perfil de isoflavonas permanece
inalterado em relação à matéria-prima e que os produtos alimentícios derivados da
soja mantêm esta semelhança entre as frações aglicona (daidzeína, gliciteína e
genisteína), com suas respectivas matérias-primas.
83
4.11 Comportamento cinético de formação das isoflavonas agliconadas com
emprego dos tratamentos hidrotérmicos
Na Figura 5 é possível observar o comportamento cinético de formação das
isoflavonas agliconadas frente os tratamentos hidrotérmicos realizados a 40 e 60°C
durante 4, 8, 12 e 16 horas.
Figura 5 – Cinética de formação de isoflavonas aglicona nas temperaturas de 40 e 60°C durante 4, 8,
12 e 16 horas de tratamento hidrotérmico.
É possível observar na Figura 5 que ocorreu formação de isoflavonas
agliconadas em ambas as temperaturas, sendo que a velocidade de formação por g
de produto foi maior a 60°C. A cinética de formação foi bem descrita usando o
modelo cinético de primeira ordem, com comportamento linear, em que os
coeficientes de determinação (R2) foram de 0,8770 e 0,8633 para as temperaturas
de 40 e 60°C respectivamente.
4.12 Distribuição de massa das isoflavonas agliconadas da FD para as frações
IPS, RS e SB
Com o objetivo de investigar o efeito dos tratamentos hidrotérmicos na
distribuição de massa das isoflavonas agliconadas, bem como a retenção dessas ao
longo do processo de obtenção do isolado, o teor de isoflavonas agliconadas foi
quantificado em todas as etapas do processo de produção do IPS, o que permitiu
verificar onde se concentram os teores de isoflavonas a partir da matéria-prima (FD),
no resíduo (RS), no sobrenadante (SB) e no isolado proteico de soja (IPS).
84
A distribuição de massa (µg) e concentração (%) de isoflavonas agliconadas
da FD para as frações IPS, RS e SB são apresentadas na Tabela 18.
Tabela 18 - Distribuição de massa e concentração de isoflavonas agliconadas da FD
para as frações IPS, RS e SB obtidos do processo de isolamento da proteína de 100
g de farinha desengordurada de soja a 40 e 60 ºC por 4 a 16 horas
1
IPS
Massa
Tratamento
Massa
FD
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
32198,8
35308,2
42082,8
46043,5
42209,1
8807,7 d
11549,1 cA
17340,3 bA
22584,4 aA
17822,0 bA
Sem tratamento
4 horas
8 horas
12 horas
16 horas
32198,8
32685,6
36036,9
40072,5
35252,4
8807,7 d
8896,1 dB
11020,6 cB
18041,0 aB
17018,7 bB
1
RS
1
Conc.
Massa
40°C
27,4
2143,2 d
32,7
1611,1 eB
41,2
4893,5 cB
49,1
6207,7 bB
42,2
7523,3 aB
60°C
27,4
2143,2 d
27,2
2839,2 cA
30,6
7842,9 aA
45,0
7131,0 bA
48,3
7800,1 aA
2
2
Conc.
SB
Massa
1
3
2
Conc.
Outros
6,7
4,5
11,6
13,5
17,8
19611,2 b
22148,0 aA
16100,0 dA
14280,0 eA
17500,0 cA
60,9
64,7
38,3
31,0
41,4
1636,8
0,000
3748,9
2971,3
0,000
6,7
8,7
21,8
17,8
22,1
19611,2 b
20102,1 aB
11200,0 cB
8120,0 dB
6300,0 eB
60,9
61,5
31,1
20,3
17,9
1636,8
848,1
5973,3
6780,5
4133,5
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p <
0,05). As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos diferentes tempos de
tratamento na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto
nas diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
IPS: isolado proteico de soja
RS: resíduo insolúvel
SB: sobrenadante
1
Valores expressos em microgramas
2
Concentração expressa em %
3
Materiais não identificados
De acordo com os resultados demonstrados na Tabela 18 é possível
verificar que o sobrenadante do processo de obtenção do IPS contém 60,1% das
isoflavonas agliconas presentes na FD sem tratamento, fato também observado por
Eldridge et al. (1982); Wang & Murphy (1996) e Lui et al. (2003).
O IPS contém 27,4% das isoflavonas agliconadas da FD sem tratamento e
após a aplicação dos tratamentos hidrotérmicos, ocorreu maior carreamento das
isoflavonas agliconadas para o IPS, chegando ao máximo valor de 49,1% (12 horas
a 40°C) do total de agliconas da matéria-prima (FD), e 48,3% (16 horas a 60°C)
demonstrando que estes tratamentos evitam perdas excessivas deste composto na
85
água de descarte (SB) do processo de isolamento reduzindo-os a 31,0 e 17,9%
respectivamente.
O resíduo insolúvel (RS), composto por fibras e proteínas insolúveis contém
6,7% das isoflavonas agliconadas da FD sem tratamento, vindo a aumentar até
22,1% com o emprego dos tratamentos hidrotérmicos a 60°C por 16 horas de
tratamento, o que torna atrativo o aproveitamento industrial do resíduo,
considerando que parte das agliconas estava sendo perdida para o SB.
A produção de IPS se tornou importante por sua diversidade de aplicação e
pelo alto conteúdo de proteína (acima de 90%) com boa qualidade nutricional,
complementarmente tem sido identificado que isoflavonas e agliconas ficam
associadas a este produto. Vários autores relatam a perda de mais de 50% das
isoflavonas presentes na FD para a água do processo de isolamento (SB). Os
tratamentos hidrotérmicos são sugeridos como promotores da forma ativa da
isoflavonas (aglicona) quando são respeitadas as condições ideais para atividade da
enzima β-glicosidase, portanto, é esperado que se acumulem agliconas com o
tratamento e que as farinhas assim processadas gerem isolados enriquecidos deste
composto. O tratamento hidrotérmico aumentou as agliconas na matéria-prima e
ajudou a reter mais aglicona no IPS e no seu resíduo insolúvel (RS).
4.13 Fenóis totais
A Tabela 19 contém os resultados da quantificação de fenóis totais dos IPSs
oriundo de grãos de soja tratados hidrotermicamente, expressos em mg de ácido
gálico por 100 g de amostra, usando o método colorimétrico que se baseia na
habilidade dos compostos fenólicos em reduzir o reagente Folin-Ciaulteau.
86
Tabela 19 – Fenóis totais (mg de ácido gálico. 100g-1) de isolados proteicos de soja
obtidos de grãos tratados hidrotermicamente
Temperatura (°C)
40
Tempo (horas)
Sem Tratamento
4
8
12
16
8,01 aE
15,10 bD
23,70 bC
43,13 bA
36,67 bB
60
8,01 aE
19,86 aD
28,37 aC
52,18 aA
40,25 aB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
O teor de fenóis totais (Tabela 19) encontrado no IPS oriundo de grão sem
tratamento foi de 8,01 mg de ácido gálico por 100g de amostra e está abaixo dos
valores encontrados por Barbosa et al. (2006), que foi de 101 mg de ácido gálico em
100 g de isolado proteico de soja.
O emprego dos tratamentos hidrotérmicos por até 12 horas proporcionou
aumento do teor de fenóis totais nos IPSs, sendo que a 40°C o aumento foi de 4,4
vezes e a 60°C de 6,5 vezes e com decréscimo em 16 horas para ambas
temperaturas.
O aumento do conteúdo de fenóis totais devido ao tratamento hidrotérmico
provavelmente se deve à transformação das isoflavonas malonil, acetil, βglicosídicas em sua formas agliconadas, que segundo Naim (1976), tem maior
habilidade fenólica de reduzir o reagente Folin-Ciaulteau. No entanto, é esperado
que as agliconas sem a proteção dos conjugados glicosídicos, malonil e acetil, sejam
menos estáveis vindo a se degradar a partir de 12 horas de tratamento, o que
justificaria o decréscimo observado em 16 horas.
O comportamento encontrado para o teor de fenóis totais já havia sido
observado para as isoflavonas (Tabela 14) o que está de acordo com vários autores
(RICE-EVANS et al. 1995; TIKKANEM & ADLERCREUTZ, 2000; SOARES, 2002)
que afirmam que os compostos fenólicos são isoflavonas.
87
4.14 Atividade antioxidante
A Tabela 20 contém os resultados da determinação da atividade antioxidante
dos IPS oriundo de grãos de soja tratados hidrotermicamente, expressos em %,
avaliado pelo método de sequestro de radicais livres através do reagente DPPH.
Tabela 20 - Atividade antioxidante (%) de isolados proteicos de soja obtidos de
grãos tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Sem tratamento
4
8
12
16
40
12,0 aA
12,7 aA
9, 9 aB
6,7 aC
5,5 aC
60
12,0 aA
4,8 bC
5,3 bB
5,7 bB
5,8 aB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
Temperatura (°C)
A atividade antioxidante (Tabela 20) do IPS oriundo de grãos sem
tratamento hidrotérmico foi de 12,02%, inferior aos valores encontrados por outros
pesquisadores como Lee et al. (2005) e Devi et al. (2009) que encontraram 27,5 e
32% de atividade antioxidante em soja e isolado proteicos de soja, respectivamente.
A diferença entre os valores encontrados no presente estudo e aqueles
reportados na literatura pode ser devido às modificações dos métodos de
determinação. No caso do estudo realizados por Lee et al. (2005), as isoflavonas
foram purificadas e usadas em concentração maior e o tempo de incubação foi
superior a 1 hora e meia de reação contra somente 30 minutos do presente estudo,
o que pode ter proporcionado mair atividade antioxidante.
Observou-se que o potencial antioxidante dos IPSs permaneceu inalterado
até 4 horas de tratamento a 40°C sendo reduzido a partir deste tempo até 16 horas
de 12,73% para 5,52%. Já na temperatura de 60°C ocorreu redução de forma
abrupta nas primeiras 4 horas de tratamento. O percentual de diminuição relativos
ao IPS sem tratamento foi de aproximadamente 54% e 52% nas temperaturas de 40
e 60°C respectivamente.
Estes resultados podem ser comparados com os estudos de Pinto et al.,
(2005) que avaliaram os efeitos do armazenamento em diferentes temperaturas (-18
a 42°C) de isolados proteicos de soja sem tratamento na sua capacidade
antioxidante em que encontratam uma diminuição de até 40% na atividade com
88
aumento da temperatura. Autores como Huang et al. (2006) e Hubert et al (2008)
relataram que certos processamentos, tais como
esterilização, pasteurização,
desidratação, cozimento ou fermentação diminuem o potencial antioxidante de seus
agentes devido aos tratamentos. Xu & Chang (2008) relataram que, em certos
casos, o processamento não resulta em destruição dos compostos antioxidantes,
mas na sua transformação em outros compostos que não possuem atividade
antioxidante.
No entanto, Lee et al. (2005) ao estudarem a atividade antioxidante das
isoflavonas de soja e seus glicosídeos constataram que as isoflavonas glicosiladas e
acetil glicosiladas apresentam maior poder antioxidante que suas respectivas
agliconas genistéina e daidzeína, medido pelo método DPPH e FRAP. Segundo o
mesmo autor, há um mecanismo inverso quando se mede a atividade antioxidante
pelo método de oxidação de LDL.
A diminuição da atividade antioxidante nos IPS oriundos de grãos tratados
hidrotermicamente pode estar relacionada a conversão as isoflavonas glicosiladas,
acetil e malonil glicosiladas às agliconas, que segundo Lee et al. (2005), apresentam
menor poder antioxidante que suas formas conjugadas medida pelo método DPPH.
De acordo com Zubik & Meydani (2003) apesar das formas agliconadas da
isoflavona serem as únicas a atravessar a parede do intestino e serem
metabolizadas,
os
autores
sugerem que
as
isoflavonas
devem
ser, preferencialmente, ingeridas nas formas conjugadas porque os conjugados βglicosídicos podem atuar como um grupo de proteção contra a biodegradação das
isoflavonas antes de atingir o intestino e promover seus efeitos no organismo.
Possivelmente, devido à desconjugação ocorrida nas isoflavonas durante o
tratamento térmico, as agliconas perdem rapidamente sua capacidade antioxidante,
não podendo ser mais quantificada pelo método DPPH.
89
4.15 Correlação entre isoflavonas aglicona, compostos fenólicos totais e
atividade antioxidante
As correlações entre o conteúdo de isoflavonas agliconadas, compostos
fenólicos totais e atividade antioxidante foram estatisticamente analisadas através da
correlação de Pearson e se encontram na Tabela 21.
Tabela 21 - Correlações entre o conteúdo de isoflavonas agliconadas, fenóis totais e
atividade antioxidante dos IPSs oriundos de grãos tratados hidrotermicamente a 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Correlações
Fenóis Totais
AA (DPPH)
Agliconas
Daidzeína
Gliciteína
AA (DPPH)
-0,80*
Agliconas
0,908*
-0,654*
Daidzeína
0,907*
-0,628*
0,994*
Gliciteína
0,869*
-0,699*
0,944*
0,948*
Genisteína
0,878*
-0,616*
0,977*
0,955*
0,858*
*Correlações significativas ao nível de p < 0,05.
AA: Atividade antioxidante
De acordo com a Tabela 21 existe uma alta e positiva correlação (p < 0,05)
entre os compostos fenólicos e o conteúdo de aglicona totais (r=0,908). Os valores
de correlação sugerem que as agliconas contribuem para o aumento dos compostos
fenólicos na seguinte ordem: daidzeína (r = 0,907), genisteína (r = 0,878) e gliciteína
(r = 0,869).
Barbosa et al. (2006), Devi et al. (2009) e Tyug et al. (2010) relataram
correlação positiva entre isoflavonas e fenóis totais em produtos derivados da soja.
Segundo Genovese et al. (2005) os principais compostos fenólicos presentes na
soja são as isoflavonas, confirmando essa correlação.
É possível observar que existe negativa correlação entre agliconas e
atividade antioxidante, bem como entre o conteúdo de fenóis totais e atividade
antioxidante. A correlação, inversamente proporcional, provavelmente se deva ao
efeito do processamento hidrotérmico realizado no estudo, o que promove a
conversão de isoflavonas aglicona, a partir de suas formas conjugadas, confirmado
por outros autores, como Lee et al. (2005) e Xu & Chang (2008).
90
4.16 Digestibilidade proteica “in vitro” do IPS
A Tabela 22 contém os resultados da determinação de digestibilidade
proteica dos IPS oriundos de grãos tratados hidrotermicamente, cujos valores estão
expressos em % de proteína digerida.
Tabela 22 - Digestibilidade (%) de isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante de 4, 8, 12 e 16 horas
Temperatura
(°C)
40
Tempo (Horas)
Sem
Tratamento
72,0 aC
4
8
12
16
71,4 aC
85,5 aB
86,2 aB
88,7 aA
60
72,0 aB
66,5 bC
70,5 bB
72,7 bAB
74,6 bA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
É possível observar na Tabela 22 que a digestibilidade proteica do IPS
oriundos de grãos sem tratamento foi de 72,03%, cujo resultado está de acordo com
Aranha Filho (2005) que encontrou digestibilidade proteica para isolado proteico de
soja de 77%.
O tratamento hidrotérmico proporcionou aumento da digestibilidade dos IPSs
tratados a 40°C, com crescimento de até 23% em 16 horas de tratamento,
diferentemente dos IPS oriundos de grãos tratados a 60°C, em que a digestibilidade
caiu ligeiramente nas 4 primeiras horas de tratamento, vindo a aumentar apenas 6%
em 16 horas de tratamento.
Provavelmente, o aumento seja decorrente da maior suscetibilidade ao
ataque enzimático, promovida pela desnaturação térmica das proteínas. Segundo os
dados de DSC (Tabela 13), é possível observar que houve desnaturação das
proteínas com emprego dos tratamentos hidrotérmicos, sendo que na temperatura
de 60°C a desnaturação foi mais intensa do que a 40°C.
Possivelmente, devido à desnaturação intensa ocorrida a 60ºC, a proteína
tenha se reestruturado provocando diminuição na digestibilidade dos isolados
proteicos de soja. Já na temperatura de 40°C, a desnaturação foi parcial, mantendo
a proteína relaxada, acessível ao ataque enzimático e, portanto, aumentando a sua
91
digestibilidade. Isto está de acordo com Privalov (1979), que propôs que a
desnaturação da proteína globular pode-se dar em dois estágios: primeiramente, de
forma branda, pela conversão de uma molécula nativa de proteína para um estado
desnaturado, envolvendo dissociação da proteína em subunidades e ruptura de
interações hidrofóbicas. Posteriormente, se a temperatura for maior, a desnaturação
ocorre de forma mais intensa e irreversível, caracterizada por reagregação através
das regiões hidrofóbicas expostas e ligações dissulfídicas.
Lui (1997) e Monteiro (2000) também relataram que a desnaturação, por
mudar a conformação das proteínas, mantendo somente a estrutura primária intacta,
expõe novos sítios para o ataque enzimático, o que acaba por melhorar
a digestibilidade proteica.
4.17 Solubilidade proteica do IPS
A Tabela 23 contém os valores de solubilidade, expressos em % dos
isolados proteicos de soja oriundos de grãos tratados hidrotermicamente medidos
em diferentes pHs.
Tabela 23 - Solubilidade proteica (%), em diferentes pHs, de isolados proteicos de
soja obtidos de grãos tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas
de 40 e 60°C
Amostra
pH 3
pH 5
pH 7
pH 9
pH 11
40°C
Sem tratamento
25,8 a
4,17 a
70,98 a
78,22 a
93,52 a
4 horas
29,06 aA
3,28 aA
80,52 aB
79,16 aA
86,64 bB
8 horas
23,81 aB
4,07 aA
74,46 aB
81,53 aA
85,12 bB
12 horas
24,16 aA
4,34 aA
51,31 bB
81,22 aA
83,01 bB
16 horas
30,54 aA
2,58 bA
71,62 aB
84,08 aA
89,01 bB
60°C
Sem tratamento
25,8 b
4,17 a
70,98 b
78,22 a
93,52 a
4 horas
37,53 aA
4,18 aA
89,28 aA
83,33 aA
95,32 aA
8 horas
31,91 abA
3,47 aA
81,52 aA
82,49 aA
93,79 aA
12 horas
24,61 bA
3,39 aA
61,26 cA
82,81 aA
98,04 aA
16 horas
28,29 bA
2,98 bA
84,76 aA
86,76 aA
97,36 aA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p <
0,05). As minúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto nos diferentes tempos de
tratamento na mesma temperatura e as maiúsculas comparam o mesmo constituinte de cada produto
nas diferentes temperaturas, no mesmo tempo de tratamento.
92
Observa-se na Tabela 23, que os IPSs apresentam um comportamento
típico para proteína de soja, com baixa solubilidade em pH 5, região do ponto
isoelétrico (PI), aumentando nos pHs acima e abaixo deste valor. Este
comportamento também foi citado por diversos autores (BERNARDI et al. 1991;
ELIZALDE et al. 1996; CHIANG et al. 1999; BABIKER et al. 2000). A ocorrência de
baixa solubilidade próxima à região do PI, segundo Damodaran (1996) é devida,
principalmente, à falta de repulsão eletrostática, que provoca agregação via
interação hidrofóbica.
Observa-se, ainda na Tabela 23, que para qualquer tempo e temperatura de
tratamento, a maior solubilidade dos IPSs se deu em pH 11, seguido dos pHs 9, 7 e
3, o que está de acordo com Elizalde et al. 1996, que relataram que o pH afeta a
densidade das cargas e o balanço eletrostático intra e intermolecular, modificando a
habilidade da proteína em participar das interações hidro e lipofílicas. O aumento da
densidade de cargas da proteína em pHs, afastadas da região do ponto isoelétrico,
favorece as interações proteína-água, resultando num aumento das propriedades de
solubilidade.
Os tratamentos hidrotérmicos realizados a 40°C não proporcionaram
mudanças significativas na solubilidade dos IPS nos diferentes pHs, exceto no pH 7,
em 12 horas de tratamento e no pH 11, que apresentou diminuição da solubilidade
com aumento do tempo de
tratamento. Na temperatura de 60°C, ocorreram
mudanças na solubilidade dos IPSs somente no pH 3, com diminuição significativa
dessa com aumento do tempo de tratamento. Comparando os tratamentos a 40 e
60°C, é possível verificar que houve aumento da solubilidade nos pHs 7 e 11 com a
temperatura
de
tratamento.Possivelmente,
o
aumento
da
solubilidade
em
temperaturas maiores se deva a desnaturação parcial ocorrida da fração 11S e total
da 7S a 60°C, confirmadas pelos dados de DSC (Tabela 13). Segundo Cheftel et al.
(1993) a conformação das proteínas da soja pode ser afetada não somente pelo pH,
mas também por outros fatores, tais como a
temperatura, que pode promover
desnaturação branda ou irreversível na proteína.
O comportamento observado para solubilidade encontra a mesma
fundamentação estabelecida por Privalov (1979) para a digestibilidade, a qual
93
também é relacionada com a desnaturação, que inicia pela dissociação das
proteínas em subunidades e ruptura de ligações hidrofóbicas, o que promove
aumento da solubilidade. Se a desnaturação for mais intensa, ocorre a desnaturação
irreversível, caracterizada por agregação através das regiões hidrofóbicas antes
expostas, formando proteínas insolúveis e menos digeríveis.
Geralmente, a solubilidade de uma proteína aumenta com elevação da
temperatura até que seja alcançada a temperatura de desnaturação, sendo que
acima disso, a proteína pode desnaturar-se, expondo, consequentemente, os grupos
não polares (hidrofóbicos), o que ocasiona agregação e precipitação, decrescendo
sua solubilidade (ORDONEZ et al. 2005).
A β-conglicinina mesmo desnaturada (Tabela 13) não se torna insolúvel,
segundo vários autores (MILL et al. 2003; MARUYAMA 2004; KEERATI-U-RAI &
CORREDIG, 2010), e a fração glicinina desnaturou-se parcialmente e reorganizouse (Tabela 13. Sendo assim, é bem provável que as temperaturas empregadas nos
tratamentos hidrotérmicos, desestabilizem as interações hidrofóbicas no interior da
proteína permitindo, assim, entrada de água no interior dessa bem como interações
com diversos grupamentos, incluindo resíduos não polares, via hidratação
hidrofóbica, conforme relatos de Damodarann (1996).
Takeiti (2002) observou que tratamentos térmicos nas temperaturas de 80 e
90°C resultaram em diminuição significativa da solubilidade de isolados proteicos de
soja, enquanto que tratamentos térmicos menos intensos (70°C) apresentaram
maior solubilidade em todos os pHs estudados (3, 5 e 7), superando a solubilidade
do IPS nativo.
4.18 Capacidade de absorção de água (CAA)
A capacidade de absorção de água (CAA), quantificada nos IPSs oriundos
de grãos de soja tratados hidrotermicamente encontram-se na Tabela 24, cujos
valores estão expressos em g de água absorvida por g de amostra.
94
Tabela 24 - Capacidade de absorção de água dos IPS oriundos de grãos tratados
hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas de 40 e 60°C
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
Sem tratamento
4
8
12
16
40
3,35 aA
2,96 bB
3,09 bB
3,12 bB
2,97 bB
60
3,35 aB
3,07 aC
3,43 aB
4,09 aA
3,58 aB
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A capacidade de absorção de água (Tabela 24) do IPS oriundos de grãos
não tratados foi de 3,35 g de água absorvida por grama de isolado, semelhante ao
encontrado por Silva (2007).
O tratamento hidrotérmico proporcionou diminuição da CAA (Tabela 22) dos
IPSs tratados a 40°C em todos os tempos, diferentemente do ocorrido a 60°C, que
foi de apresentar aumento crescente até as 12 horas de tratamento.
A diminuição da CAA a 40°C, possivelmente, seja devido à desnaturação
parcial ocorrida nas proteínas medida pelo DSC (Tabela 13), que se caracteriza,
segundo Wagner et al. (2000) por aumentar a hidrofobicidade superficial,
promovendo a repulsão da água. Já na temperatura de 60°C ocorreu desnaturação
total da fração 7S e parcial da 11S (Tabela 13), possivelmente promovendo
dissociação destas frações em subunidades e subsequente reinteração, umas com
as outras, formando novas zonas hidrofóbicas. A formação de zonas hidrofóbicas
promove a diminuição da hidrofobicidade superficial e da repulsão por água dos
IPSs. Estas observações estão de acordo com diversos autores, como Damodaran,
(1996) e Takeiti, et al. (2004) que relataram que em condições brandas de
desnaturação ocorre a exposição às regiões hidrofóbicas da proteína, diminuindo a
CAA.
4.19 Capacidade de formação de espuma
A capacidade de formação de espuma (CFE), quantificada nos isolados
proteicos de soja oriundos de grãos de soja tratados hidrotermicamente encontramse na Tabela 25, cujos valores estão expressos em %.
95
Tabela 25 – Capacidade de formação de espuma de isolados proteicos de soja
obtidos de grãos tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas de
40 e 60°C
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
Sem tratamento
4
8
12
16
40
66,67 aE
70,27 bD
80,24 bC
84,26 bB
106,33 aA
60
66,67 aB
90,33 aA
90,33 aA
92,27 aA
90,10 bA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha
não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A CFE do IPS (Tabela 25) oriundos de grãos não tratados foi de 66,67%,
inferior aos valores reportados por Silva (2007) que encontrou 148,17% para IPS
comercial. A diferença encontrada entre os valores encontrados no presente estudo
e aqueles reportados na literatura podem ser devido ao tipo de método utilizado para
obtenção dos isolados proteicos de soja ou, ainda, pela aplicação de tratamento
térmico nos grãos de soja destinados a produção dos isolados proteicos comerciais,
que tem por objetivo eliminar compostos antinutricionais. Estas diferenças também
foram observadas por outros autores, como Kinsella (1976); Ohren (1981) e
Mutilangi et al. (1995). Esses autores relataram que, geralmente IPS comerciais, por
serem submetidos a diferentes tratamentos, sofrem alterações físico-químicas nas
proteínas, conferindo-lhes propriedades funcionais distintas.
A CFE dos IPSs teve aumentos de 5, 20, 26 e 53% para os tempos de 4, 8,
12 e 16 horas de tratamento na
temperatura de 40°C, respectivamente. Já na
temperatura de 60°C houve aumento da CFE nas primeiras horas de tratamento
(35%), mantendo-se constante até as 16 horas de tratamento. Verificou-se que o
tratamento a 60°C foi mais significativo na CFE dos IPSs do que o tratamento a
40°C, com exceção do tempo de 16 horas.
O aumento da CFE a 40°C, possivelmente, seja devido à desnaturação
parcial ocorrida nas proteínas medida pelo DSC (Tabela 13). Segundo Zavareze et
al. (2009) a CFE das proteínas pode ser influenciada pelo grau de desnaturação.
Sorgentini & Wagner (2002) reportaram que a desnaturação melhora a CFE por
provocar maior hidrofobicidade superficial das proteínas. No entanto, a 60°C a
96
reestruturação das proteínas dos IPSs, medida no DSC, foi suficiente para
estabilizar a CFE em qualquer tempo de tratamento.
4.20 Estabilidade da espuma
A estabilidade da espuma (EE), após o período de 15 minutos, foi
determinada nos isolados proteicos de soja oriundos de grãos de soja tratados
hidrotermicamente e encontra-se na Tabela 26, cujos valores estão expressos em
%.
Tabela 26 – Estabilidade da espuma de isolados proteicos de soja obtidos de grãos
tratados hidrotermicamente de 4 a 16 horas nas temperaturas de 40 e 60°C
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
Sem tratamento
4
8
12
16
40
76,16 aB
76,42 bB
90,04 bA
89,29 bA 90,66 aA
60
76,16 aD
93,27 aA
93,27aA
91,32 aB
83,6 bC
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha
não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A EE do IPS (Tabela 26) oriundos de grãos não tratados foi de 76,16% e
sofreu significativa influência com emprego dos tratamentos hidrotérmicos, que na
temperatura de 40°C acarretou aumento significativo na EE a partir das 8 horas de
tratamento (aproximadamente 18%), mantendo-se constante até 16 horas de
tratamento. Na temperatura de 60°C houve significativo e acentuado aumento na EE
já nas primeiras horas de tratamento (22%), permanecendo constante até 8 horas de
tratamento e vindo a diminuir significativamente em 12 e 16 horas. Estes resultados
diferiram dos relatados por Nielson (1997) o qual verificou que a estabilidade da
espuma diminui e a capacidade de formação de espuma aumenta como resultado
da desnaturação.
No entanto, Wagner et al. (2000) propuseram uma correlação positiva entre
hidrofobicidade e estabilidade de espuma em isolados proteicos de soja.
Possivelmente, os tratamentos a 60°C por proporcionarem desnaturação mais
intensa, comprovada pelos dados de DSC (Tabela 13), o interior hidrofóbico da
proteína, antes exposto ao meio pela ação da desnaturação branda ou parcial
ocorrida na temperatura de 40°C, agora começam a interagir entre si e formar
97
agregados insolúveis de proteína, diminuindo a hidrofobicidade do meio.
Possivelmente, a hidrofobicidade influencia mais efetivamente a estabilidade da
espuma do que a formação dessa.
4.21 Colorimetria
A cor dos isolados proteicos de soja oriundos de grãos tratados
hidrotermicamente foram analisados no colorimetro MINOLTA, cujos resultados se
encontram na Tabela 27.
Tabela 27 – Cor dos IPSs oriundos de grãos tratados hidrotermicamente de 4 a 16
horas nas temperaturas de 40 e 60°C
Temperatura
40°C
60°C
Tempo
Sem tratamento
4
8
12
16
4
8
12
16
L*
Ângulo Hue (h°) Chroma (C)
ΔE*
75,1
90,06
18,92
0
88,05 aA
90,22 bA
18,07 aA
13,32 aA
83,36 aB
90,26 aA
18,05 aA
9,14 bA
83,58 aB
90,23 bA
17,97 aA
9,13 bA
83,62 aB
90,18 cA
18,08 aA
8,94 bA
84,01 bA
90,18 cB
17,75 aB
9,26 aB
79,13 bB
90,26 aA
17,07 bB
5,80 bB
79,79 bB
90,21 bB
17,23 abB
5,70 bB
79,48 bB
90,18 cA
17,62 abA
5,08 cB
No padrão C.I.E. L*a*b*, a coordenada L* expressa o grau de luminosidade da cor (L* = 100 =
branco; L* = 0 = preto). Chroma (C), expressa intensidade da cor. Valores de Chroma menores ao
padrão correspondem à intensidade de cor mais fraca (aspecto fosco) e valores mais altos ao
padrão de intensidade mais forte (aspecto de brilho). Ângulo hue representa a tonalidade de cor da
amostra, onde o ângulo 0° representa a cor vermelha, 90° , a cor amarela, 180°, a cor verde e 270°a
cor azul. ΔE*: diferença de cor.
Segundo os dados apresentados na Tabela 27 e com base nos padrões de
cor do colorimetro minolta (MCGUIRE, 1992) é possivel caracterizar o IPS sem
tratamento como de tonalidade amarela clara (°hue próximo a 90° e L* próximo a
100). Os resultados encontrados para cor do IPS no presente estudo são
semelhantes aos citados por Paucar-Managro et al. (2008), cujos valores de L* e
ângulo hue para isolado proteico de soja comercial foram de 86,4 e 90,02,
respectivamente.
A cor dos IPSs foi influenciada pelo tratamento hidrotérmico. Todos os IPSs
oriundo de grãos tratados hidrotermicamente apresentaram luminosidade (L*) mais
98
clara do que o IPS sem tratamento. Possivelmente, pigmentos encontrados na soja
sejam perdidos no encharcamento, o que permite obter isolados mais claros.
A luminosidade dos IPSs tratados a 60°C foi menor do que aqueles tratados
a 40°C demonstrando que a 60°C ocorrem reações de escurecimento de forma mais
intensa do que a 40°C. Em ambas as temperaturas, a partir de 8 horas de
tratamento, os IPSs tornaram-se mais escuros. Mesmo com o escurecimento
ocorrido pelos tratamentos, a luminosidade dos IPSs tratados foi maior do que
aquele sem tratamento demonstrando que o lixiviamento de pigmentos contribuiu
para maior luminosidade dos isolados e que mesmo tendo reações de
escurecimento, estas não foram suficientes para escurecer os IPSs como aquele
sem tratamento.
Os valores de ângulo hue para os IPSs tratados mostraram-se próximos a
90°, evidenciando uma tonalidade amarela clara (creme) para todos os isolados, no
entanto, observou-se aumento significativo (p<0,05) da tonalidade com emprego dos
tratamentos hidrotérmicos e em 8 horas este efeito foi mais acentuado, para ambas
as temperaturas. Cabe ressaltar que apesar dos valores de ângulo hue serem
significativamente diferentes (p<0,05), não são tecnologicamente expressivos, pois
tonalidades de cor medidas pelo colorimetro MINOLTA que apresentam diferenças
decimais em seus valores dificilmente serão percebidas a olho nu.
Possivelmente, o aumento da coloração creme nos IPSs oriundo de grãos
tratados seja devido à mudança de pH no momento dos tratamentos. Bobbio &
Bobbio (2003) relatam que os flavonóides, pigmentos encontrados na soja, cujo
grupo contém as isoflavonas, apresentam coloração diferenciada com mudanças de
pH, passando de incolor para amarela com aumento da acidez do meio. Com o
emprego dos tratamentos hidrotérmicos, a acidez das farinhas desengorduradas
(FD) aumentou, o que pode ser a causa do significativo aumento da coloração
amarela dos IPSs oriundo de grãos tratados.
Os IPSs demonstraram perda de brilho (Chroma) com o emprego dos
tratamentos hidrotérmicos, tendo em 60°C a maior redução. O ΔE representa a
diferença de cor entre o isolado sem tratamento e aqueles tratados, evidenciando
diferenças na cor decorrentes dos tratamentos empregados. Foi possível observar
99
que nos tratamentos a 40 e 60°C as diferenças na cor (ΔE) foram significativamente
(p<0,05) observadas a partir de 8 horas de tratamento e que a 60° esta diferença foi
mais intensa do que a 40°C, confirmando os dados de ângulo hue e chroma.
Segundo Bobbio & Bobbio (2003), o escurecimento em IPS pode ser
explicado pela oxidação dos fenóis pelas enzimas peroxidase e polifenoloxidase,
presentes na soja. Segundo esses autores, o escurecimento de leguminosas, tais
como o feijão, durante o armazenamento, é decorrente da ação das enzimas
peroxidase e polifenoloxidase sobre os fenóis. Dentre as espécies de vegetais com
tais características encontra-se a soja, o que nos leva a concluir que ambas as
leguminosas possuam o mesmo tipo de comportamento em relação ao exposto
anteriormente. Reforçando os relatos citados acima, Brackmann (2002) e Laderoza
et al. (1989) evidenciaram que temperaturas elevadas aceleraram as oxidações
enzimáticas.
Sendo assim, duas possibilidades são válidas para o escurecimento dos
IPSs oriundos de grãos tratados, a saber: a oxidação enzimática dos fenóis pelas
enzimas peroxidase e polifenoloxidase; ou as mudanças ocorridas na estrutura das
isoflavonas agliconadas decorrentes das mudanças de pH.
4.22 Perfil texturométrico
O perfil texturométrico foi realizado nos IPS utilizando o texturômetro modelo
TA-XT2.
A dureza, definida como a força necessária para quebrar determinada
amostra (VINCENT, 2004; HOU & CHANG, 2004a, HOU & CHANG, 2004b) foi
avaliada nos IPSs oriundos de grãos de soja tratados hidrotermicamente a 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas e está apresentada na Tabela 28.
100
Tabela 28 - Dureza (g) dos IPSs oriundos de grãos de soja tratados
hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
40
Sem tratamento
4599,9 aE
4
5236,25 aD
8
6836,5 aC
12
16
10570,3 aB 14113,0 aA
60
4599,9 aE
4800,016 bD
6547,32 bC
8461,5 bB
11236,4 bA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
O tratamento hidrotérmico influenciou nas características de dureza dos
IPSs (Tabela 28), apresentando aumento significativo (p>0,05) e crescente em todos
os tempos de tratamento, para as duas temperaturas, sendo que a 40°C o aumento
foi de até 3 vezes, enquanto que a 60°C, o aumento foi de aproximadamente 2
vezes.
Comparando os dados de DSC (Tabela 13) com os de dureza dos IPSs
(tab.26) é possível dizer que o aumento da dureza dos IPSs oriundos de grãos
tratados a 40°C, possivelmente, esteja relacionado à desnaturação branda ocorrida
nesta temperatura, em que a proteína fica relaxada, expondo os sítios hidrofóbicos
que, por sua vez, não permitem que no momento de centrifugação do IPS, parte da
água fique retida junto ao IPS, tornando os IPSs mais duros. Já a 60°C, devido à
desnaturação drástica ocorrida, a proteína se orienta a formar novas interações,
como as pontes dissulfeto decorrentes da fração 11S, sendo que nestas novas
interações hidrofóbicas formadas aglomeram-se moléculas de água no seu interior,
deixando o IPS com menor dureza. Estes resultados também foram observados por
Ji et al. (1999) e De Graaf et al. (2000), em que a fração 11S produz maior interação
por pontes dissulfeto do que a fração 7S, por ter a fração 11S, maior quantidade de
aminoácidos cisteína em sua estrutura.
Segundo Damodaran (1988) após o resfriamento da proteína, os
grupamentos expostos do polipeptídeo desnaturado interagem, conduzindo a
formação de uma rede complexa que irá atuar como matriz, capaz de reter água e
outros componentes.
Tang et al. (2005) ao analisarem as propriedades de géis de isolado proteico
de soja ricos nas frações proteicas glicinina e β-conglicina verificaram que a dureza
101
dos géis está relacionada à fração glicinina. Tsumura et al. (2005) também
observaram efeito da glicinina sobre a dureza de géis de isolado proteico de soja ao
avaliarem as propriedades funcionais de isolados proteicos hidrolisados por
proteólise seletiva.
A fraturabilidade, definida como a força necessária para fraturar determinado
material (VAN VLIET, 1991; HOU & CHANG, 2004a, HOU & CHANG, 2004b) foi
determinada nos IPSs oriundos de grãos de soja, tratados hidrotermicamente, a 40 e
60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas e está apresentada na Tabela 29.
Tabela 29 - Fraturabilidade (g) dos IPSs oriundos de grãos de soja não tratados e
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
40
Sem tratamento
3976,2 aD
60
3976,2 aC
4
8
12
16
4206,93 aD 5401,1 aC 12676,0 aB 15177,05 aA
1136,91 bE 2576,9 bD
8349,3 bB
11403,0 bA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
O tratamento hidrotérmico influenciou nas características de fraturabilidade
dos IPSs (Tabela 29). Na temperatura de 40°C houve aumento significativo (p<0,05)
a partir de 8 horas de tratamento e crescente até as 16 horas, cujo aumento foi de
2,8 vezes. Na temperatura de 60°C houve uma significativa (p<0,05) diminuição na
fraturabilidade em 4 e 8 horas de tratamento que foi de aproximadamente 70%. No
entanto, em 12 e 16 horas houve aumento de aproximadamente 1,8 vezes,
superando as condições iniciais de fraturabilidade dos IPSs.
Provavelmente, houve aumento na fraturabilidade dos IPSs decorrente da
reorganização da fração glicinina, que por conter 21 pontes dissulfeto permite
estabilidade e reorganização da fração glicinina por pontes dissulfeto, após
aquecimento das proteínas.
Tang et al. (2005) relataram que géis de isolado proteico de soja ricos em
glicinina apresentaram maior fraturabilidade do que aqueles ricos com a fração βConglicinina.
A adesividade, definida como a capacidade que um material tem de se aderir
a outro (VAN VLIET, 1991; HOU & CHANG, 2004a, HOU & CHANG, 2004b) foi
102
medida
nos IPSs oriundos de grãos de soja tratados hidrotermicamente, cujos
valores encontram-se na Tabela 30.
Tabela 30 - Adesividade dos IPSs oriundos de grãos de soja sem tratamento e
tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
40
Sem tratamento
- 582,2 aE
4
- 451,5 aD
8
- 286,3 bC
12
- 141,8 bB
16
- 94,62 bA
60
- 582,2 aE
- 477,9 aD
- 352,2 aC
- 216,3 aB
- 143,8 aA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A adesividade consiste na medida instrumental da força necessária para
superar as forças de atração entre a superfície de um alimento e a superfície do
probe em contato com o alimento. Os resultados numéricos de adesividade devem
ser vistos em módulo, pois como é a medida da força necessária para descolar o
probe da amostra, seus valores são expressos com sinal negativo. Desta forma, a
maior adesividade é aquela que apresenta o maior valor em módulo, não
considerando o sinal negativo que acompanha o mesmo (VAN VLIET, 1991; HOU &
CHANG, 2004a, HOU & CHANG, 2004b).
Segundo os dados da Tabela 30, a adesividade diminuiu significativamente
(p<0,05) com aumento do tempo de tratamento, sendo que na temperatura de 60°C,
este fenômeno foi mais intenso do que a 40°C.
Devido à desnaturação ocorrida na proteína da soja a 60°C, confirmada
pelos dados de DSC (Tabela 13), provavelmente tenha ocorrido agregação proteica
no momento da precipitação isoelétrica dos IPSs, aprisionando água do processo de
isolamento no interior da proteína, levando os IPSs oriundos de grãos tratados a
60°C a apresentar maior adesividade do que aqueles advindos de grãos tratados a
40°C, já que nessa temperatura ocorre somente relaxamento da estrutura proteica.
No entanto, com o tempo, possivelmente as proteínas agregadas foram
aproximando-se umas das outras por interações hidrofóbicas,
impedindo as
moléculas de permanecerem no interior da proteína, tornando os IPSs
adesivos com o tempo de tratamento.
menos
103
A coesividade, definida como sendo a medida do grau de dificuldade de
quebrar as ligações internas estabelecidas em determinado material (Lau et al.
2000) foi medida nos IPSs oriundos de grãos de soja tratados hidrotermicamente,
cujos resultados encontram-se na Tabela 31.
Tabela 31 – Coesividade dos isolados proteicos de soja tratados hidrotermicamente
a 40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
40
Sem tratamento
0,39 aD
4
0,47 aC
8
0,48 aBC
12
0,56 aAB
16
0,56 aA
60
0,39 aC
0,45 aBC
0,49 aB
0,54 aAB
0,60 aA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
No presente estudo, a coesividade (Tabela 31) aumentou significativamente
ao longo do tempo, numa relação de 53% em comparação a coesividade inicial dos
isolados para as duas temperaturas estudadas, demonstrando que a temperatura
não influenciou na coesividade dos IPSs, mas somente o tempo.
O aumento na coesividade pode estar relacionada a agregação da fração
11S, pois segundo Kang et al. (1991), esta fração é a responsável pela coesividade
dos géis de isolados proteicos de soja.
Possivelmente, agregações tenham ocorrido nas proteína, em especial na
glicinina, com o emprego dos tratamentos hidrotérmicos sendo, talvez, a causa do
aumento da coesividade nos IPSs, assim como foi para o aumento da dureza e
fraturabilidade dos IPSs.
Na Tabela 32 constam os resultados de elasticidade dos IPSs oriundos de
grãos de soja não tratados e tratados hidrotermicamente, sendo que elasticidade é
definida com a força máxima aplicada a um material sem que haja seu rompimento.
104
Tabela 32 - Elasticidade dos isolados proteicos de soja tratados hidrotermicamente a
40 e 60°C durante 4, 8, 12 e 16 horas
Tempo (horas)
Temperatura (°C)
Sem tratamento
4
8
12
16
40
0,93 aA
0,98 aA
1,02 aA
1,05 aA
1,07 aA
60
0,93 aA
0,97 aA
0,98 aA
0,99 aA
1,01 aA
Médias de três repetições seguidas por letras iguais minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não
diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
Os resultados apresentados na Tabela 32 demonstraram não haver
diferença significativa na elasticidade dos diferentes isolados proteicos de soja. A
elasticidade é a velocidade com que o material deformado retorna a sua condição
inicial após ser retirada a força deformante. Estes resultados estão de acordo com
Kang et al. (1991) que também não observaram variação na elasticidade de géis de
proteína com diferentes umidades e géis elaborados em diferentes temperaturas
respectivamente.
4. 23 Microscopia eletronica de varredura
As micrografias obtidas por MEV dos isolados proteicos de soja oriundos dos
diferentes tratamentos hidrotérmicos realizados nos grãos de soja são mostradas na
Figura 6.
A
105
BB
C
D
E
F
G
H
H
I
Figura 6 – Micrografia dos isolados proteicos de soja tratados hidrotermicamente a 40 e 60°C durante
4, 8, 12 e 16 horas.
A: Sem tratamento; B: 4h-40°C; C: 4h-60°C; D: 8h-40°C; E: 8h-60°C; F: 12h-40°C; G: 12h-60°C; H: 16h40°C; I: 16h-60°C
106
As micrografias (Figura 6) não permitiram revelar se os tratamentos
hidrotérmicos influenciam na formação de isolados proteicos com maior porosidade,
como era esperado nos IPSs, pois em produtos com maior quantidade de água,
como tem se atribuído aos IPSs oriundos de grãos tratados a 60°C, os poros são
criados em maior quantidade pelos cristais de gelo que sublimam na liofilização,
deixando aberturas ou poros em seu lugar.
Embora não tenha sido observada uma relação direta entre microestrutura e
características físico-químicas, alguns dos resultados da análise de solubilidade
mostraram alta solubilidade proteica em relação aos demais isolados em todos os
pHs estudados, sugerindo que a diferença na estrutura contribui para a solubilidade.
107
4. CONCLUSÕES
Tratamentos hidrotérmicos realizados a 40°C promovem aumentos no teor
total de agliconas na farinha desengordurada e no isolado proteico de soja devido à
ativação da enzima β-glicosidase.
Tratamentos hidrotérmicos realizados a 40°C promovem aumentos no
rendimento de extração, no teor de fenóis totais, na digestibilidade proteica, na
formação e estabilidade da espuma dos isolados proteicos de soja.
Os tratamentos hidrotérmicos realizados a 60°C promovem formação de
agliconas por um mecanismo diferente da ativação da enzima β-glicosidase,
possivelmente pela hidrólise ácida.
Tratamentos hidrotérmicos realizados a 60°C, apesar de apresentarem
menores extrações de isolados proteicos de soja, promovem aumento no teor de
proteínas, deixando-os mais puros.
Tratamentos hidrotérmicos realizados a 60°C selecionam frações de
proteínas com maior capacidade de interação com as isoflavonas, produzindo
isolados proteicos com maior concentração de agliconas por grama de produto.
Tratamentos hidrotérmicos realizados a 60°C promovem novas interações
entre as proteínas, capazes de reter as isoflavonas.
108
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134
APÊNDICES
135
APÊNDICE A
Correlações
Sem tratamento
Sem tratamento
Proteínas 40°C
1,00
Proteínas 40°C
Proteínas 60°C
Lipídios 40°C
Lipídios 60°C
Fibras 40°C Fibras 60°C Cinzas 40°C Cinzas 60°C
0,10
0,99*
-0,95*
0,43
0,85*
0,99*
0,88*
-0,74
1,00
0,09
-0,13
-0,48
0,03
0,07
-0,08
-0,38
1,00
-0,95*
0,39
0,83*
0,97*
0,86*
-0,76
1,00
-0,17
-0,83*
-0,94*
-0,74
0,81*
1,00
0,27
0,43
0,73
0,17
1,00
0,91*
0,56
-0,87*
1,00
0,83*
-0,77
1,00
-0,34
Proteínas 60°C
Lipídios 40°C
Lipídios 60°C
Fibras 40°C
Fibras 60°C
Cinzas 40°C
Cinzas 60°C
* Correlações significativas ao nível de p<0,05.
1,00