TNF-alpha ELISA - IBL international

Instruções de Utilização
TNF-alpha ELISA
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa
do Factor de Necrose Tumoral alfa humano (TNF-α) no soro
e plasma humanos e nos sobrenadantes de culturas celulares.
BE55001
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
D-22335 Hamburg, GermanyFax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
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www.IBL-International.com
TNF-alpha ELISA (BE55001)
PORTUGUÊS
TABELA DE CONTEÚDOS
1.
Aplicações
2
2.
Sumário
2
3.
Princípio do Teste
4
4.
Materiais Fornecidos
5
5.
Instruções de Conservação – Kit ELISA
5
6.
Recolha e armazenamento de Amostras
5
7.
Materiais Necessários Mas Não Fornecidos
6
8.
Avisos e Precauções
6
9.
Preparação de Reagentes
7
10.
Procedimento do Ensaio
9
11.
Cálculo de Resultados
11
12.
Limitações do Procedimento
13
13.
Características de Desempenho
13
14.
Informações para Pedidos
16
15.
Sumário da Preparação de Reagentes
16
16.
Sumário do Procedimento do Ensaio
17
17
Referências Bibliográficas do Produto
18
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TNF-alpha ELISA (BE55001)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
O ELISA para TNF-α humano total é um ensaio imunossorvente ligado a enzima para a deteção
quantitativa de TNF-α humano. O ELISA para TNF-α humano total destina-se ao uso em diagnóstico in
vitro. Não se destina a ser usado em procedimentos terapêuticos.
2.
SÚMARIO
O TNF-α é uma citocina multifuncional envolvida em muitas vias diferentes, na homeostasia e na
patofisiologia dos mamíferos. Pode exibir efeitos biológicos opostos sugerindo mecanismos reguladores
complexos.
O TNF-α, também conhecido como caquetina, foi detetado pela primeira vez como fator citotóxico indutor
de lise de certas células tumorais. O gene do TNF-α é o 2º membro da superfamília do TNF (que consiste
de pelo menos 20 membros distintos).
A libertação de TNF-α é sobretudo despoletada pelas infeções víricas e pelas endotoxinas,
lipopolissacarídeos ou outros componentes bacterianos, por lesões nos tecidos, danos no ADN e pela IL-1,
PDFG e pelo próprio TNF-α. Tem expressão principalmente nos macrófagos, mas também nos monócitos,
neutrófilos, células exterminadoras naturais, mastócitos, células endoteliais e linfócitos ativados. A
expressão do TNF-α nas células endoteliais e nos fibroblastos pode ser induzida pela IL-17.
A expressão de outras citocinas, quemoquinas, espécies reativas ao oxigénio, óxido nítrico e
prostaglandinas é estimulada pelo TNF-α.
A membrana inicialmente ligada ao TNF-α é enzimaticamente dividida por TACE (= ADAM17). Os
monómeros solúveis agregam-se aos homotrímeros e são segregados para o sangue e outros fluidos
biológicos. A membrana ligada e a forma solúvel são biologicamente ativas e ligam-se aos recetores TNF,
TNFR1 ( = TNFRSF1A, p55-60) e TNFR2 ( = TNFRSF1B, TNFBR2, p75-80).
Após a ligação dos ligandos, os recetores formam trímeros que dão origem a mudanças conformacionais,
dissociação proteica (SODD = domínios do silenciador de morte, BAG4, atanógeno 4 associado a Bcl2) e
associação (TRADD = proteína do domínio de morte associada a TNF-R1) e dando origem às seguintes
atividades biológicas:
- transcrição de fatores anti-apoptóticos e proteínas envolvidas na proliferação e inflamação celulares
através da ligação do TRAF2 (fator 2 associado ao TNF-R) e RIPK1 (TNF-R interagindo com a cinase 1
da treonina-serina) e ativação do fator de transcrição NF-κB.
- proliferação celular, diferenciação mas também apoptose via ligação ao TRAF2, ativação de cinases,
ativação de c-Jun e ATF2 (via JNK-MAPK).
- Apoptose através da ligação de FADD (proteína associada a Fas com o domínio de morte) a TRADD e
ativação de caspases (incluindo caspase 8 = FLICE).
- necrose, morte celular independente de caspase, mediada por oxidases NADPH, que formam um
complexo com TRADD e RIPK1, dando origem à geração de espécies reativas ao oxigénio.
- TNF-R2 não contém DD (domínio de morte), mas exibe a sua função através da ligação direta a TRAF.
- Assim, as múltiplas funções biológicas do TNF-α englobam a proliferação e a diferenciação celulares, a
tumorigénese, a morte celular apoptótica ou necrótica (incluindo certas linhas de células tumorais),
atividades imunorreguladoras, metabolismo lipídico, coagulação e função endotelial. Promove a
inflamação sistémica ou local (o TNF-α é um pirógeno potente) e estimula a resposta de fase aguda.
Expressões muito elevadas do TNF-α após a infeção podem levar a choque séptico (o TNF-α é
altamente citotóxico), enquanto níveis baixos contínuos induzem caquexia e inflamação.
A desregulação do TNF-α está envolvida em muitas doenças:
Cancro: Têm sido descritas diversas funções do TNF-α no cancro, dependendo do tipo de tumor, do
microambiente do tumor e dos níveis globais de expressão do TNF-α e da cinética da expressão. Foi
proposto um modelo, no qual níveis únicos muito elevados de TNF-α levam à regressão do tumor e níveis
baixos crónicos estão associados à progressão do tumor.
Lúpus eritematoso sistémico (LES): Modelos murinos de LES apresentam efeitos contraditórios de TNF-α:
efeito anti-autoimune a níveis baixos de TNF-α (a administração de TNF-α dá origem a uma atenuação dos
sintomas e a um bloqueio do TNF-α para a criação de sintomas de LES), efeito pró-inflamatório a níveis
elevados de TNF-α (bloqueio de TNF-α amortece a doença).
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PORTUGUÊS
Inflamação crónica do intestino (doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, Colite ulcerativa): Foi
demonstrado um efeito essencial da atividade do TNF-α/TNF-R1 na indução da inflamação intestinal
crónica. Na doença inflamatória do intestino, tem sido descrita a sobre-expressão do TNF-α nos
monócitos/macrófagos do tecido intestinal e visceral.
Psoríase: Em doentes psoriáticos, verificou-se que o TNF-α era aumentado sistemicamente e no tecido
cutâneo. A expressão do TNF-α nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) era
extremamente elevada em doentes na fase ativa da doença e elevada na psoríase crónica. Num modelo
animal, ficou demonstrado que a ativação, dependente do TNF-α, das células T residentes era essencial
para o desenvolvimento da psoríase.
Doenças pulmonares (Fibrose cística (FC), Asma): Observaram-se níveis elevados de TNF-α na fibrose
cística. O TNF-α é sobre-expressado na asma grave persistente. Na asma alérgica, em exposição baixa
aos antígenos, o TNF-α contribui para a libertação de níveis elevados de histamina. Num modelo de rato
para a asma, a inflamação das vias respiratórias deveu-se à ativação, mediada pelo TNF-α, da fosfolipase
A2.
Artrite reumatoide, Espondilite anquilosante: O TNF-α tem efeitos estimulantes nas proteases de
degradação da matriz (metaloproteinases de matriz, MMPs), remodelação de tecidos e osteoclastos,
causando reabsorção óssea que por sua vez dá origem a erosão das articulações. Num modelo de rato
para a artrite reumatoide, foram observados níveis elevados de TNF-α na medula óssea. As citocinas,
sintetizadas pelas células sinoviais ativadas pelo TNF-α, mostraram não ser indutoras da artrite reumatoide.
Em doentes com espondilite anquilosante, a concentração de TNF-α mostrou ser elevada na articulação
sacroilíaca.
Transplante (doença do enxerto contra hospedeiro, rejeição do aloenxerto):
A medição dos níveis de TNF-α demonstrou ser útil na investigação sobre transplantes. Houve relatos de
níveis de TNF-α acentuadamente elevados na rejeição de aloenxerto renal. Foram apresentadas evidências
sobre os níveis aumentados de TNF-α nos transplantes de medula óssea. Os doentes com transplantes de
medula óssea e complicações graves relacionadas com o transplante, como pneumonite intersticial e
doença grave do enxerto versus hospedeiro revelaram níveis significativamente aumentados de TNF-α.
Aterosclerose, calcificação arterial: O risco aumentado de enfarte do miocárdio, espessamento
aterosclerótico da íntima-média da carótida, perturbações nos triglicerídeos e homeostasia glicémica e
aterosclerose relativa à idade têm sido relacionados com os níveis circulantes de TNF-α. Os mecanismos
induzidos do TNF-α dão origem a acumulação de cálcio na aorta nos animais com diabetes mellitus de tipo
2.
Resistência à insulina (RI) e Obesidade: Observou-se a expressão aumentada dos níveis de TNF-α no
tecido adiposo de modelos de roedores quanto à obesidade e em indivíduos com adiposidade. Verificou-se
uma inflamação de baixo grau no tecido adiposo e na resistência à insulina crónica. Níveis aumentados do
TNF-α afetam a regulação da via de insulina.
Doenças neurodegenerativas (Esclerose múltipla (EM), doença de Alzheimer, doença de Prion, doença de
Parkinson): O TNF-α é produzido a partir das células microgliais ativadas e dá origem à degeneração
neuronal, apoptose do tecido neuronal e aumento da inflamação. A administração de TNF-α causou a
morte celular dos oligodendrócitos – um sintoma de esclerose múltipla – em co-cultura com astrócitos e
microglia.
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3.
PORTUGUÊS
PRINCÍPIO DO TESTE
Figura 1
Um anticorpo de revestimento anti-TNF-α humano é adsorvido
nos micropoços.
Micropoços Revestidos
Anticorpo do Revestimento
Figura 2
Primeira Incubação
O TNF-α humano presente na amostra ou no padrão liga-se aos
anticorpos adsorvidos nos micropoços. Um anticorpo anti-TNF-α
humano conjugado com biotina é adicionado, ligando-se à TNF-α
humano capturada pelo primeiro anticorpo.
Padrão o Amostra
Conjugado de Biotina
Figura 3
Segunda Incubação
Após a incubação, o anticorpo anti-TNF-α humano conjugado
com biotina não ligado é removido durante a lavagem. É
adicionada Estreptavidina-HRP que se liga ao anticorpo antiTNF-α humano conjugado com biotina.
Estreptavidina-HRP
Figura 4
Terceira Incubação
Após a incubação, a Estreptavidina-HRP não ligada é removida
durante a lavagem e adiciona-se aos poços um substrato reativo
com HRP.
Substrato
Figura 5
Forma-se um produto colorido em proporção à quantidade de
TNF-α humano presente na amostra ou no padrão. A reação é
terminada pela adição de ácido e a absorvância é medida a
450 nm. Uma curva padrão é preparada a partir de 7 diluições
padrão de TNF-α humano e determina-se então a concentração
da amostra de TNF-α humano.
Substrato reagiu
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4.
MATERIAIS FORNECIDOS
1
bolsa de alumínio com uma placa de micropoços revestidos com anticorpo monoclonal
PORTUGUÊS
TNF-α humano
1
frasco (70 μL) Conjugado de Biotina anticorpo policlonal anti-TNF-α humano
1
frasco (150 µL) Estreptavidina-HRP
2
frascos Padrão TNF-α humano liofilizados, 3000 pg/mL após reconstituição
1
frasco Controle niveis altos, liofilizado
1
frasco Controle niveis baixos, liofilizado
1
frasco (12 mL) Diluente de Amostras
1
frasco (5 mL) Tampão de Reacção Concentrado 20x
(PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA)
1
frasco (50 mL) con Tampão de Lavagem Concentrado 20x
(PBS con 1 % Tween 20)
1
frasco (15 mL) Solução de Substrato (tetrametilbenzidina)
1
frasco (15 mL) Solução de Paragem (1M Ácido Fosfórico)
4
Película Aderente
5.
INSTRUÇÕES DE CONSERVAÇÃO – KIT ELISA
Conserve os reagentes do kit entre 2 °C e 8 °C exceto os controlos. Conserve os controlos liofilizados a
-20 °C. Imediatamente após a utilização, os reagentes remanescentes devem ser colocados de novo no frio
(2 °C a 8 °C), e os controlos a -20 °C, respetivamente. A data de validade do kit e dos reagentes está
indicada nos rótulos.
A data de validade dos componentes do kit só pode ser garantida se os componentes forem devidamente
armazenados e, no caso de utilização repetida de um componente, se este reagente não for contaminado
pela primeira manipulação.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Sobrenadante de cultura celular, soro e plasma (EDTA, citrato, heparina) foram testados com este ensaio.
Outros fluidos corporais podem ser adequadas para utilização no ensaio. Remova o soro do coágulo logo
que possível após a coagulação.
Tome atenção a um possível “Efeito Gancho” devido a concentrações elevadas da amostra (consulte o
capítulo 11).
As amostras que contenham um precipitado visível devem ser clarificadas antes de utilizadas no ensaio.
Não utilize espécimes grosseiramente hemolisados ou lipémicos.
As amostras devem ser aliquotadas e conservadas congeladas a -20 °C para evitar perda de TNF-α
humano bioativo. Se as amostras forem testadas num prazo de 24 horas, podem ser conservadas a uma
temperatura entre 2-8 °C (para estabilidade da amostra, consulte a secção 13.5).
Evite ciclos repetidos de congelação-descongelação. Antes do ensaio, a amostra congelada deve atingir a
temperatura ambiente lentamente e ser misturada suavemente.
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8.
-
-
-
-
PORTUGUÊS
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
Pipetas graduadas de 5 mL e 10 mL
Micropipetas de canal único ajustáveis de 5 µL a 1000 µL com ponteiras descartáveis
Micropipetas multicanais ajustáveis de 50 µL a 300 µL com ponteiras descartáveis
Reservatório de micropipeta multicanais
Provetas, balões de vidro, cilindros necessários para a preparação dos reagentes
Dispositivo para descarga de solução de lavagem (garrafa de esguicho multicanal ou sistema de
lavagem automática)
Leitor de tiras de micropoços com capacidade para ler a 450 nm (620 nm como comprimento de onda
de referência opcional)
Agua bidestilada o deionizada
Calculadora estatística com programa para realizar análise de regressão
AVISOS E PRECAUÇÕES
Todos os produtos químicos devem ser considerados como potencialmente perigosos. Recomendamos,
portanto, que este produto seja manuseado apenas por pessoas com formação em técnicas
laboratoriais e que seja manuseado de acordo com os princípios das boas práticas laboratoriais.
Use vestuário protetor adequado, como bata de laboratório, óculos de proteção e luvas. Deve usar-se
de cuidado para evitar o contacto com a pele ou os olhos. Em caso de contacto com a pele ou os olhos,
lave imediatamente com água. Consulte a(s) ficha(s) de dados de segurança do material e/ou as
declarações de segurança para obter instruções específicas.
Os reagentes destinam-se ao uso em diagnóstico in vitro e não se destinam a ser usados em
procedimentos terapêuticos.
Não misture nem substitua os reagentes com os de outros lotes ou outras origens.
Não utilize os reagentes do kit depois de vencida a data de validade indicada no rótulo.
Não exponha os reagentes do kit à luz forte durante o período de armazenamento ou incubação.
Não pipete com a boca.
Não coma nem fume em áreas onde os reagentes ou as amostras do kit são manuseados.
Evite o contacto da pele ou das membranas mucosas com os reagentes ou os espécimes do kit.
Devem usar-se luvas de latex descartáveis ou de borracha ao manusear os reagentes ou os espécimes
do kit.
Evite o contacto do substrato com agentes oxidantes e com metal.
Evite salpicos ou a criação de aerossóis.
De modo a evitar a contaminação microbiana ou a contaminação cruzada de reagentes ou espécimes
que possam invalidar o teste, use ponteiras nas pipetas e/ou pipetas descartáveis.
Utilize tabuleiros de reagentes limpos exclusivos para distribuir o conjugado e o reagente do substrato.
A exposição ao ácido inativa o conjugado.
Deve usar-se água destilada em vidro ou água desionizada na preparação dos reagentes.
O substrato deve estar à temperatura ambiente antes de ser usado.
Descontamine e elimine os espécimes e todos os materiais potencialmente contaminados, uma vez que
podem conter agentes infeciosos. O método preferencial de descontaminação é por autoclavagem
durante no mínimo 1 hora a 121.5 °C.
Os resíduos líquidos que não contenham ácido e os resíduos neutralizados podem ser misturados com
hipoclorito de sódio em volumes tais desde que a mistura final contenha 1.0 % de hipoclorito de sódio.
Espere 30 minutos para uma descontaminação eficaz. Os resíduos líquidos que contenham ácido
devem ser neutralizados antes da adição de hipoclorito de sódio.
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9.
PORTUGUÊS
PREPARAÇÃO DE REAGENTES
Os concentrados de tampão devem atingir a temperatura ambiente e ser diluídos antes de iniciar o
procedimento de teste.
Se houver formação de cristais nos concentrados de tampão, aqueça-os ligeiramente até que fiquem
totalmente dissolvidos.
9.1. Tampão de Lavagem (1x)
Deite o conteúdo total (50 mL) do Concentrado de Tampão de Lavagem (20x) num cilindro graduado
limpo de 1000 mL. Encha até ao volume total de 1000 mL com água destilada em vidro ou água
desionizada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma.
Transfira para um frasco para lavagem limpo e conserve a uma temperatura entre 2 °C e 25 °C. Tenha em
atenção que o Tampão de Lavagem (1x) se mantém estável durante 30 dias.
O Tampão de Lavagem (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela:
Número de tiras
Tampão de Lavagem (20x) (mL)
Agua bidest. (mL)
1-6
25
475
1 - 12
50
950
9.2. Tampão de Reacção (1x)
Deite o conteúdo total (5 mL) do Concentrado de Tampão de Reacção (20x) num cilindro graduado limpo
de 100 mL. Encha até ao volume total de 100 mL com água destilada. Misture suavemente para evitar a
formação de espuma.
Conserve entre 2 °C e 8 °C. Tenha em atenção que o Tampão de Reacção (1x) se mantém estável durante
30 dias.
O Tampão de Reacção (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela:
Número de tiras
1-6
1 - 12
Tampão de Reacção (20x) (mL)
2.5
5.0
Agua bidest. (mL)
47.5
95.0
9.3. Conjugado de Biotina
Tenha em atenção que o Conjugado de Biotina deve ser usado no máximo de 30 minutos após a
diluição.
Faça uma diluição de 1:100 da solução concentrada de Conjugado de Biotina com Tampão de Reacção
(1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela:
Número de tiras
1-6
1 - 12
Conjugado de Biotina (mL)
0.03
0.06
Tampão de Reacção (1x) (mL)
2.97
5.94
9.4. Estreptavidina-HRP
Tenha em atenção que a Estreptavidina-HRP deve ser usada no máximo de 30 minutos após a
diluição.
Faça uma diluição de 1:100 da solução concentrada de Estreptavidina-HRP com Tampão de Reacção (1x)
num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela:
Número de tiras
1–6
1 - 12
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Streptavidina-HRP (mL)
0.06
0.12
Tampão de Reacção (1x) (mL)
5.94
11.88
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PORTUGUÊS
9.5. Padrão IL-6 Humana
Reconstitua o Padrão TNF-α humano adicionando água destilada.
O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de vidro do padrão. Agite ou misture
suavemente para garantir a solubilização completa e homogénea (concentração do padrão reconstituído =
3000 pg/mL).
Deixe que o padrão se reconstitua durante 10-30 minutos. Misture bem antes de fazer as diluições.
O padrão tem de ser usado imediatamente após o tempo de reconstituição e não pode ser guardado.
As diluições do padrão podem ser preparadas diretamente na placa do micropoço (consulte a secção
10.c) ou, em alternativa, em tubos (consulte a secção 9.5.1).
9.5.1. Diluição Padrão Externa
Rotule 7 tubos, um para cada ponto do padrão.
S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Depois prepare diluições em série de 1:2 para a curva padrão da seguinte forma:
Pipete 225 µL de Diluente de Amostras para cada tubo.
Pipete 225 µL de padrão reconstituído (concentração = 3000 pg/mL) para o primeiro tubo, rotulado S1, e
misture (concentração do padrão 1 = 1500 pg/mL).
Pipete 225 µL desta diluição para o segundo tubo, rotulado S2, e misture bem antes da próxima
transferência. Repita as diluições em série mais 5 vezes criando assim os pontos da curva padrão (veja a
Figura 6).
O Diluente de Amostras serve como teste em branco.
Figura 6
Transferir 225 µL
S1
TNF-α Humana
Padrão Reconstituído
S2
S3
S4
Diluente de Amostras (1x) 225 µL
-
S7
Eliminar
225 µL
9.6. Controlos
Reconstitua adicionando 500 μL de água destilada aos controlos liofilizados (10-30 minutos). Agite ou
misture suavemente para garantir a solubilização completa e homogénea. Continue a tratar os controlos
como as suas amostras do ensaio. Para os intervalos dos controlos, consulte o certificado de análise ou o
rótulo do frasco de vidro. Conserve os controlos reconstituídos aliquotados a -20 °C. Evite ciclos repetidos
de congelação e descongelação.
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10.
PORTUGUÊS
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
a.
Determine o número de tiras de micropoços necessário para testar o número desejado de amostras
mais o número apropriado de poços necessários para executar os brancos e os padrões. Cada
amostra, padrão, branco e amostra opcional de controlo deve ser testado em duplicado. Remova as
tiras extra do micropoço do suporte e guarde num saco de alumínio com o dessecante fornecido a uma
temperatura de 2-8 °C fechado hermeticamente.
b.
Lave as tiras do micropoço duas vezes com aproximadamente 400 μL de Tampão de Lavagem por
poço realizando uma aspiração completa do conteúdo do micropoço entre as lavagens. Permita que o
tampão de lavagem repouse nos poços durante cerca de 10-15 segundos antes de aspirar. Tome
cuidado para não arranhar a superfície dos micropoços.
Após o último passo de lavagem, esvazie os poços e bata com as tiras dos micropoços em papel
absorvente ou toalhas de papel para remover o tampão de lavagem em excesso. Utilize as tiras dos
micropoços imediatamente após a lavagem. Em alternativa, as tiras dos micropoços podem ser
colocadas invertidas sobre um papel absorvente húmido durante 15 minutos no máximo. Não deixe
que os poços sequem.
c.
Diluição de padrão na placa do micropoço (Em alternativa, a diluição de padrão pode ser preparada
em tubos – consulte a secção 9.5.1):
Adicione 100 μL de Diluente de Amostras em duplicado em todos os poços de padrão.
Pipete 100 μL do padrão preparado (consulte Preparação de Padrão na secção 9.5, concentração =
3000 pg/mL) em duplicado no poço A1 e A2 (consulte a Tabela 1). Misture o conteúdo dos poços A1 e
A2 por aspiração e ejeção repetida (concentração do padrão 1, S1 = 1500 pg/mL), e transfira 100 μL
para os poços B1 e B2, respetivamente (consulte a Figura 7).
Tenha cuidado para não arranhar a superfície interior dos micropoços.
Continue este procedimento 5 vezes, criando duas filas de diluições padrão de TNF-α humano
variando entre 1500 e 23 pg/mL. Elimine 100 μL do conteúdo dos últimos micropoços (G1, G2)
utilizados.
Figura 7
Transferir 100 µL
S1
TNF-α Humana
Padrão Reconstituído
27.11.14 (23)
S2
S3
Diluente de Amostras
100 µL
S4
-
S7
Eliminar
100 µL
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PORTUGUÊS
No caso de uma diluição de padrão externo (consulte a secção 9.5.1), pipete 100 μL destas diluições de
padrão (S1 - S7) nos poços de padrão de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1
A tabela representa um exemplo da disposição de testes em branco, padrões e amostras nas tiras dos
micropoços:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
Padrão 1
(1500 pg/mL)
Padrão 2
(750 pg/mL)
Padrão 3
(375 pg/mL)
Padrão 4
(188 pg/mL)
Padrão 5
(94 pg/mL)
Padrão 6
(47 pg/mL)
Padrão 7
(23 pg/mL)
Padrão 1
(1500 pg/mL)
Padrão 2
(750 pg/mL)
Padrão 3
(375 pg/mL)
Padrão 4
(188 pg/mL)
Padrão 5
(94 pg/mL)
Padrão 6
(47 pg/mL)
Padrão 7
(23 pg/mL)
Blanco
Blanco
3
4
Amostra 1
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 2
Amostra 3
Amostra 3
Amostra 4
Amostra 4
Amostra 5
Amostra 5
Amostra 6
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 8
d.
Adicione 100 μL de Diluente de Amostras em duplicado aos poços em branco.
e.
Adicione 50 μL de Diluente de Amostras aos poços da amostra.
f.
Adicione 50 μL de cada amostra em duplicado aos poços da amostra.
g.
Prepare o Conjugado de Biotina (consulte Conjugado de Biotina na secção 9.3).
h.
Adicione 50 μL de Conjugado de Biotina a todos os poços.
i.
Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas, num
agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm.
j.
Prepare a Estreptavidina-HRP (consulte a preparação de Estreptavidina-HRP na secção 9.4).
k.
Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 6 vezes de acordo com o
ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo.
l.
Adicione 100 µL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços, incluindo os poços em branco.
m. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora num
agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm.
n.
Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 6 vezes de acordo com o
ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo.
o.
Pipete 100 μL de Substrato TMB para todos os poços.
p.
Incube as tiras do micropoço à temperatura ambiente (18-25 °C) durante cerca de 10 min. Evite a
exposição direta à luz intensa.
27.11.14 (23)
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TNF-alpha ELISA (BE55001)
PORTUGUÊS
O desenvolvimento de cor na placa deve ser monitorizado e a reação do substrato interrompida
(veja o próximo ponto deste protocolo) antes que os poços positivos não possam ser
devidamente registáveis.
A determinação do período de tempo ideal para o desenvolvimento da cor tem de ser feita
individualmente para cada ensaio.
Recomenda-se adicionar a solução de paragem quando o padrão mais elevado tiver desenvolvido uma
cor azul-escura. Em alternativa, o desenvolvimento da cor pode ser monitorizado a 620 nm pelo leitor
de placas ELISA. A reação do substrato deve ser parada logo que o Padrão 1 atingiu uma DO de
0.9-0.95.
q
Pare a reação da enzima ao pipetar rapidamente 100 μL de Solução de Paragem para cada poço.
É importante que a solução de paragem seja espalhada rápida e uniformemente pelos micropoços
para inativar completamente a enzima. Os resultados devem ser lidos imediatamente após a
solução de paragem ser adicionada ou no período de uma hora se as tiras dos micropoços forem
guardadas a uma temperatura de 2-8 °C no escuro.
r.
Leia a absorvância de cada micropoço num espectrofotómetro usando 450 nm como o comprimento
de onda principal (opcionalmente 620 nm como o comprimento de onda de referência; 610 nm a
650 nm é aceitável). Limpe o leitor de placas de acordo com as instruções do fabricante ao usar os
poços para testes em branco. Determine a absorvância das amostras e dos padrões.
Nota: No caso de incubação sem agitação, os valores da D.O. obtidos podem ser inferiores aos
indicados abaixo. Não obstante os resultados continuam a ser válidos.
11.
CÁLCULO DE RESULTADOS
- Calcule os valores médios de absorvância para cada conjunto de padrões e amostras em duplicado. Os
duplicados devem estar a 20 por cento do valor médio.
- Crie uma curva padrão ao representar graficamente a absorvância média para cada concentração de
padrão na ordenada face à concentração da TNF-α humano na abcissa. Desenhe a curva que melhor se
ajusta através dos pontos no gráfico (recomenda-se um ajuste de curva de 5 parâmetros).
- Para determinar a concentração de TNF-α humano em circulação para cada amostra, encontre primeiro
o valor médio de absorvância na ordenada e prolongue uma linha horizontal para a curva padrão. No
ponto de interseção, prolongue uma linha vertical para a abcissa e leia a concentração correspondente
de TNF-α humano.
- Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1:2
(50 μL amostra + 50 μL Diluente de Amostras), a concentração lida da curva padrão deverá ser
multiplicada pelo fator de diluição (x 2).
- O cálculo das amostras com uma concentração que exceda o padrão 1 poderá resultar em níveis
de TNF-α humano baixos e incorretos. Tais amostras exigem uma pré-diluição externa adicional
de acordo com os valores esperados da TNF-α humano com o Diluente de Amostras de modo a
quantificar com precisão o nível real de TNF-α humano.
−
Tem-se sugerido que cada instituição de teste determine uma amostra de controlo da concentração
conhecida de TNF-α humano e execute este controlo adicional com cada ensaio. Se os valores obtidos
não se encontrarem dentro do intervalo esperado do controlo, os resultados do ensaio podem ser
inválidos.
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−
PORTUGUÊS
A Figura 8 mostra uma curva padrão representativa. Esta curva não pode ser usada para obter
resultados de teste. Cada laboratório deve preparar uma curva padrão para cada grupo de tiras de
micropoços usadas no ensaio.
Figura 8
Curva padrão representativa do ELISA para TNF-α humano. O TNF-α humano foi diluída duas vezes em
série em Diluente de Amostras. Não use esta curva padrão para obter resultados de teste. Deve ser
executada uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio.
Dados típicos usando o ELISA para TNF-α humano ELISA
Comprimento de onda: 450 nm
Comprimento de onda de referência: 620 nm
Tabela 2
1
Concentração da
TNF-α Humana (pg/mL)
1500
2
750
3
375
4
188
5
94
6
47
7
23
Blanco
0
Padrão
D.O.
(450 nm)
2.312
2.278
1.304
1.314
0.768
0.720
0.424
0.417
0.291
0.276
0.190
0.170
0.147
0.145
0.090
0.092
D.O.
Media
2.295
C.V.
(%)
0.7
1.309
0.4
0.744
3.3
0.420
0.8
0.284
2.7
0.180
5.5
0.146
1.0
0.091
1.4
Os valores da D.O. da curva padrão podem variar de acordo com as condições de execução do ensaio
(p. ex., funcionário, técnica de pipetagem, técnica de lavagem ou efeitos da temperatura). Além disso, a
vida útil do kit pode afetar a atividade enzimática e, assim, a intensidade da cor. Os valores medidos
continuam a ser válidos.
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TNF-alpha ELISA (BE55001)
12.
-
-
-
-
PORTUGUÊS
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Uma vez que as condições exatas podem variar de um ensaio para outro, deve ser criada uma curva
padrão para cada série de testes.
A contaminação bacteriana ou fúngica das amostras a testar ou dos reagentes ou a contaminação
cruzada entre os reagentes pode dar origem a resultados erróneos.
É preferível usar ponteiras de pipetas descartáveis, frascos ou material de vidro; o material de vidro
reutilizável deverá ser lavado e todos os detergentes deverão ser eliminados antes de o material ser
usado novamente.
A lavagem inadequada ou insuficiente em qualquer fase do procedimento dará origem a resultados
falso positivos ou falso negativos. Esvazie os poços completamente antes de distribuir solução de
lavagem fresca, encha com tampão de lavagem conforme indicado para cada ciclo de lavagem e não
deixe que os poços fiquem destapados ou sequem durante períodos prolongados.
O uso de imunorradioterapia tem aumentado significativamente o número de doentes com anticorpos
humanos IgG anti-rato (HAMA). HAMA pode interferir nos ensaios que utilizam anticorpos monoclonais
murinos, dando origem tanto a resultados falso positivos como falso negativos.
Amostras de soro contendo anticorpos de imunoglobulinas murinas ainda podem ser analisadas em tais
ensaios quando as imunoglobulinas murinas (soro, fluido ascítico ou anticorpos monoclonais de
especificidade irrelevante) são adicionadas à amostra.
13.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
13.1. Sensibilidade
O limite de deteção da TNF-α humano definida como a concentração do analito que resulta numa
absorvância significativamente maior do que a do meio de diluição (média mais 2 desvios padrão) foi
determinado como 5.0 pg/mL (média de 6 ensaios independentes).
13.2. Reprodutibilidade
13.2.1. Intra-Ensaio
A reprodutibilidade dentro do ensaio foi avaliada em 3 experiências independentes. Cada ensaio foi
realizado com 6 réplicas de 8 amostras de soro contendo concentrações diferentes de TNF-α humano.
Foram executadas 2 curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da
TNF-α humano e o coeficiente de variação para cada amostra (veja a Tabela 3). O coeficiente de variação
global calculado intra-ensaio foi de 7.7 %
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PORTUGUÊS
Tabela 3
A concentração média do TNF-α humano e o coeficiente de variação de cada amostra.
Amostra
Experimento
1
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
4
5
6
7
8
Concentração Média de
TNF-α Humano (pg/mL)
5328
4990
5474
4818
4149
4558
3523
2967
3478
2236
2207
2381
1528
1379
1310
889
805
827
607
492
507
216
286
267
Coeficiente de
Variação (%)
6.6
9.4
3.4
6.4
9.9
11.3
12.2
5.3
5.7
5.1
2.8
5.9
6.7
11.6
8.4
2.0
9.0
7.4
14.9
8.2
7.3
6.3
10.7
8.0
13.2.2. Inter-Ensaio
A reprodutibilidade de ensaio para ensaio no mesmo laboratório foi avaliada em 3 experiências
independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 8 amostras de soro contendo concentrações
diferentes de TNF-α humano. Foram executadas 2 curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo
mostram a concentração média da TNF-α humano e o coeficiente de variação calculados em 18
determinações de cada amostra (veja a Tabela 4). O coeficiente de variação global calculado entre ensaios
foi de 8.1 %.
Tabela 4
A concentração média do TNF-α humano e o coeficiente de variação de cada amostra.
Amostra
Concentração Média de TNF-α Humano (pg/mL) Coeficiente de Variação (%)
1
5264
4.7
2
4508
7.5
3
3323
9.3
4
2275
4.1
5
1405
7.9
6
840
5.2
7
535
11.7
8
256
14.0
13.3. Recuperação do reforço
A recuperação do reforço foi avaliada ao reforçar 4 níveis de TNF-α humano no soro. As recuperações
foram determinadas em 3 experiências independentes com 8 réplicas cada.
O soro não reforçado foi usado como branco nestas experiências.
A recuperação variou entre 76 % e 115 % com uma recuperação global média de 90 %.
Recuperações mostraram-se depender do soro utilizado.
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PORTUGUÊS
13.4. Paralelismo de diluição
Amostras de soro com diferentes níveis de TNF-α humano foram analisadas em 2 diluições em série com 4
réplicas cada.
A recuperação variou entre 97.1 % e 128.6 % com uma recuperação global média de 112.7 %
(veja Tabela 5).
Tabela 5
Amostra
1
2
3
4
Diluição
Concentração Esperada
do TNF-α humano
(pg/mL)
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
2469
1498
890
2295
1463
791
2993
1721
876
2775
1560
757
Concentração
Observada TNF-α
humano (pg/mL)
4937
2996
1781
975
4590
2925
1582
1017
5986
3442
1751
969
5550
3119
1514
766
Recuperação da
Concentração
Esperada (%)
121.4
118.9
109.5
127.5
108.2
128.6
115.0
101.8
110.6
112.4
97.1
101.2
Recuperações mostraram-se depender do soro utilizado.
13.5. Estabilidade da amostra
13.5.1. Estabilidade durante a congelação-descongelação
Alíquotas de soro (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -20 °C e descongeladas 5 vezes, e
determinaram-se os níveis de TNF-α humano. Foi detetado um decréscimo significativo da
imunorreatividade do TNF-a humano. Portanto, as amostras devem ser conservadas em alíquotas a uma
temperatura de -20°C e descongeladas apenas uma vez.
13.5.2. Estabilidade de conservação
Alíquotas de soro (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -20 °C, 2-8 °C, à temperatura
ambiente e a 37 °C, e o nível do TNF-α humano foi determinado após 24 h. Não se detetou perda
significativa de imunorreatividade do TNF-α humano durante o período de conservação a 2-8 °C. Detetouse uma perda significativa da imunorreatividade do TNF-α humano durante o período de conservação à
temperatura ambiente e a 37 °C após 24 h.
13.6. Especificidade
O ensaio deteta simultaneamente o TNF-α humano nas formas natural e recombinante.
A interferência dos fatores circulantes do sistema imunitário foi avaliada pelo reforço destas proteínas em
concentrações fisiologicamente relevantes de soro positivo de TNF-α.
Não foi detetada qualquer interferência, nomeadamente não com o TNF-R (60 kDa e 80 kDa).
13.7. Valores esperados
Um painel de 40 amostras de soro de dadores aparentemente saudáveis e aleatoriamente selecionados (do
sexo masculino e feminino) foi testado quando ao TNF-α.
Não foram encontrados níveis detetáveis de TNF-α humano. Os níveis elevados de TNF-α humano
dependem do tipo de perturbação imunológica.
27.11.14 (23)
15/18
TNF-alpha ELISA (BE55001)
14.
PORTUGUÊS
INFORMAÇÕES PARA PEDIDOS
Para encomendas entre em contacto com:
Veja a última página.
Para obter informações técnicas, por favor contacte:
e-mail: [email protected]
http://www.IBL-International.com
15.
SUMARIO DA PREPARAÇÃO DE REAGENTES
15.1. Tampão de Lavagem (1x)
Adicione Concentrado de Tampão de Lavagem 20x (50 mL) a 950 mL de água destilada.
Número de tiras
1-6
1-12
Tampão de Lavagem Concentrado (mL)
25
50
Agua Bidest. (mL)
475
950
15.2. Tampão de Reacção (1x)
Adicione Concentrado de Tampão de Reacção 20x (5 mL) a 95 mL de água destilada.
Número de tiras
1-6
1-12
Tampão de Reacção Concentrado (mL)
2.5
5.0
Agua Bidest. (mL)
47.5
95.0
15.3. Conjugado de Biotina
Faça uma diluição de 1:100 de Conjugado de Biotina em Tampão de Reacção (1x):
Número de tiras
1-6
1-12
Conjugado de Biotina (mL)
0.03
0.06
Tampão de Reacção (1x) (mL)
2.97
5.94
15.4. Streptavidina-HRP
Faça uma diluição de 1:200 de Estreptavidina-HRP em Tampão de Reacção (1x):
Número de tiras
1-6
1-12
Estreptavidina-HRP (mL)
0.06
0.12
Tampão de Reacção (1x) (mL)
5.94
11.88
15.5. Padrão TNF-α Humana
Reconstitua o padrão de TNF-α humano liofilizado com água destilada.
(O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de padrão.)
15.6. Controlos
Adicione 500 μL de água destilada aos controlos liofilizados.
27.11.14 (23)
16/18
TNF-alpha ELISA (BE55001)
16.
PORTUGUÊS
SUMÁRIO DO PROCEDIMENTO DO ENSAIO
1.
Determine o número de tiras de micropoços necessário.
2.
Lave as tiras dos micropoços duas vezes com Tampão de Lavagem.
3.
Diluição de padrão na placa do micropoço: Adicione 100 μL de Diluente de Amostras, em duplicado,
a todos os poços de padrão. Pipete 100 μL do padrão preparado para os primeiros poços e crie
diluições de padrão para transferir 100 μL de poço para poço. Elimine 100 μL dos últimos poços.
Em alternativa, diluição de padrão externa em tubos (consulte a secção 9.5.1): Pipete 100 μL destas
diluições de padrão nas tiras dos micropoços.
4.
Adicione 100 μL de Diluente de Amostras, em duplicado, aos poços em branco.
5.
Adicione 50 μl de Diluente de Amostras aos poços com as amostras.
6.
Adicione 50 μL da amostra em duplicado aos poços de amostra designados.
7.
Prepare o Conjugado de Biotina.
8.
Adicione 50 μL de Conjugado de Biotina a todos os poços
9.
Cubra as tiras dos micropoços e incube 2 horas à temperatura ambiente (18 °C a 25 °C).
10.
Prepare Estreptavidina-HRP.
11.
Esvazie e lave as tiras dos micropoços 6 vezes com Tampão de Lavagem.
12.
Adicione 100 μL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços.
13.
Cubra as tiras dos micropoços e incube 1 hora à temperatura ambiente (18 °C a 25 °C).
14.
Esvazie e lave as tiras dos micropoços 6 vezes com Tampão de Lavagem.
15.
Adicione 100 μL de Solução de Substrato TMB a todos os poços
16.
Incube as tiras dos micropoços durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente (18-25 °C).
17.
Adicione 100 μL de Solução de Paragem a todos os poços.
18.
Ponha em branco o leitor dos micropoços e meça a intensidade da cor a 450 nm.
Nota: Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1:2
(50 μL amostra + 50 μL Diluente de Amostras), a concentração lida da curva padrão deverá ser
multiplicada pelo fator de diluição (x 2).
27.11.14 (23)
17/18
TNF-alpha ELISA (BE55001)
17.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
PORTUGUÊS
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DO PRODUTO
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27.11.14 (23)
18/18
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθμός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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