Materiais e métodos - Instituto Evandro Chagas

Transcrição

Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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à dieta aproteica
4 Material e métodos
4.1 Material
4.1.1 Animais
O trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com animais do
Instituto Evandro Chagas (IEC), Belém-PA (Anexo A).
Todos os animais foram cuidados conforme preconizado na publicação
“Princípios éticos na experimentação animal” recomendado em 1991, pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e com base na Lei Federal nº 6.638 de
1979 que estabelece as normas para a prática didático-científica da vivissecção animal.
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus Norvegicus albinus), machos, jovens,
sadios, com peso individual variando entre 100g e 150g cedidos pelo Biotério do IEC.
Os experimentos passaram por diversas etapas sendo que de acordo com as
necessidades a pesquisa foi realizada nos Laboratórios de Cirurgia Experimental – LCE
e Bioquímica do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS da Universidade do
Estado do Pará – UEPA e no Laboratório de Toxicologia da Seção de Meio Ambiente –
SEMAM / IEC.
Os animais estudados foram acondicionados em gaiolas plásticas e mantidos
em sala com refrigeração à temperatura de 22°C e passaram por um período de
adaptação de 15 dias, nas mesmas condições de umidade, temperatura, ruído, ração e
água ad libitum.
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à dieta aproteica
Material e métodos
Sessenta ratos foram distribuídos randomicamente em grupos de 20 animais
e estes, divididos em seis subgrupos com dez ratos cada (Figura 3).
subgrupo P
n = 10
normonutridos
n = 20
subgrupo A
n = 10
subgrupo D
n = 10
GRUPOS
n = 60
desnutridos
n = 20
subgrupo DA
n = 10
subgrupo DC
n = 10
desnutridos com
correção n = 20
subgrupo DAC
n = 10
Figura 3 – Distribuição dos animais por grupos e subgrupos.
4.1.1.1 Normonutridos
a) subgrupo P – determinado como padrão de normalidade, sendo os
animais mantidos com dieta composta de 22% de proteína
(normoproteica) por período de 25 dias e;
b) subgrupo A – constituído por animais submetidos à secção e anastomose ileal à 3
centímetros (cm) montante da junção ileocecal no 21º dia após o início da dieta
normoproteica (Anexo B, Quadro 2).
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à dieta aproteica
Material e métodos
4.1.1.2 Desnutridos
a) subgrupo D – representado por animais que foram alimentados com
dieta aproteica por 25 dias; e
b) subgrupo DA – animais desnutridos, submetidos à secção e
anastomose ileal à 3cm montante da junção ileocecal no 21º dia
após o início da alimentação aproteica (Anexo B, Quadro1).
4.1.1.3 Desnutridos com correção da dieta
a) subgrupo DC – animais desnutridos que foram alimentados com
dieta aproteica por 21 dias, seguidos da correção com alimentação
normoproteica por quatro dias; e
b) subgrupo DAC – animais desnutridos que foram alimentados com
dieta aproteica por 21 dias e submetidos à secção com anastomose
ileal à 3cm montante da junção ileocecal, também, no 21º dia,
seguido da correção alimentar normoproteica por quatro dias.
O estudo consistiu em se trabalhar com um animal de cada subgrupo,
perfazendo um total de seis ratos. Portanto, a divisão por gaiola obedeceu a seguinte
distribuição: um animal de cada subgrupo foi juntado ao de outro quando pertencente ao
mesmo grupo. Após a intervenção cirúrgica cada animal foi isolado em gaiola
individual.
4.2 Métodos
4.2.1 Desnutrição
Os animais induzidos à desnutrição protéico-calórica foram submetidos a
dieta aproteica – biscoito de polvilho (marca Tia Sula ) – ad libitum (Figura 4), durante
o tempo de 21 dias (PANTOJA et al., 2003).
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à dieta aproteica
Material e métodos
O fundo das gaiolas foi protegido com tela de arame galvanizado (Figura 5).
Figura 4 – Biscoito de polvilho aproteico.
Figura 5 – Gaiola com tela de arame galvanizado.
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à dieta aproteica
Material e métodos
4.2.2 Avaliação nutricional
Os animais foram avaliados utilizando as variáveis: peso e albumina sérica.
Sendo os ratos pesados em balança eletrônica (Filizola modelo MF3) com unidade em
grama (g), no 21º e 25º dias do experimento. E a albumina no sangue foi dosada em
grama por decilitro (g/dl) no 25º dia. Utilizou-se o kit de albumina − PP Método Verde
de Bromocresol (Gold Analisa Diagnóstica).
4.2.3 Procedimento operatório
4.2.3.1 Anestesia
No 21º dia do experimento, os animais foram anestesiados por inalação
contínua de éter sulfúrico com indução realizada em recipiente saturado tendo sua
manutenção sido feita por meio do vaporizador artesanal, invento atribuído e descrito
por BRITO et al. (1998).
4.2.3.2 Ato cirúrgico
Após epilação na região abdominal, foi realizada incisão mediana de 3cm
(Figura 6) com isolamento da alça ileal à 3cm montante da junção íleocecal (Figura 7).
Figura 6 – Animal submetido a laparotomia mediana.
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à dieta aproteica
Material e métodos
Figura 7 – Isolamento da alça ileal.
A figura 8 demonstra a secção transversal total do íleo, e a figura 9 a anastomose
extramucosa com pontos separados, tendo sido utilizado fio prolene nº 7-0.
Figura 8 – Secção transversal total da alça ileal.
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à dieta aproteica
Material e métodos
Figura 9 – Anastomose término-terminal extramucosa.
Neste procedimento (Figura 10) foi utilizada magnificação de imagem
por microscópio cirúrgico (D. F. Vasconcellos M 900).
Figura 10 – Procedimento realizado sob magnificação.
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à dieta aproteica
Material e métodos
4.2.4 Coleta das amostras
Após a indução anestésica, todos os grupos tiveram suas amostras coletadas
no 25º dia após o início da alimentação ou quarto dia do pós-operatório com a finalidade
de dosar:
a) no sangue – albumina e o MDA; e
b) no tecido – MDA.
Vale ressaltar que o 25º dia acima mencionado corresponde ao quarto dia de
pós-operatório dos animais pertencentes aos subgrupos A, DA e DAC.
O esquema do experimento pode ser observado na figura 11.
Subgrupos
0
P
Dia
21º
25º ou 4º pós-op.
A
D
DA
DC
DAC
normoproteica
dieta aproteica
anastomose
coleta do tecido
e sangue
Legenda
P = padrão
A = anastomose
D = desnutrido
DA = desnutrido com anastomose
DC = desnutrido com correção da dieta
DAC = desnutrido com anastomose e correção da dieta
Figura 11 – Padronização do experimento em todos os subgrupos.
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à dieta aproteica
Material e métodos
4.2.4.1 Coleta e homogeneização do tecido
O tecido foi coletado à 3cm montante da junção íleocecal, obedecendo duas
formas:
a) ressecção transversal total de segmento ileal em animais sem
anastomose (Figura 12) e;
b) ressecção transversal total de segmento do íleo contendo
anastomose ileal nos animais operados previamente (Figura 13).
Figura 12 – Segmento ressecado do íleo sem anastomose à 3cm
montante da junção ileocecal.
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à dieta aproteica
Material e métodos
Figura 13 – Segmento ressecado contendo a anastomose ileal
à 3cm montante da junção ileocecal.
O tecido coletado foi pesado em balança eletrônica (Gehaka modelo BG
400). O peso do tecido variou entre 78mg a 88mg (Apêndice).
Imediatamente após o tecido coletado cada peça foi introduzida em tubo de
ensaio de vidro previamente preparado com 400 microlitros (µL) da solução tampão
(Anexo C) e 40µL da solução de Butil-Hidroxi-Tolueno (BHT) descrito no anexo E, e
posteriormente mantida resfriada em isopor com gelo.
Os volumes das soluções tampão e BHT foram proporcionais à quantidade
coletada de tecido em grama.
Este material foi submetido à homogeneização, pelo tempo de 1min. à 2.500
rotações por minuto (rpm), por meio do homogeneizador portátil mecânico / manual
(ULTRA TURRAX T8, modelo S8N5G) – figura 14. Para evitar a contaminação das
amostras teciduais subseqüentes, o rotor do homogeneizador passou por processo de
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à dieta aproteica
Material e métodos
higienização pela imersão em água deionizada por meio do sistema de purificação MilliQ (Millipore, modelo MILLI-Q PLUS ZFMQ05001) e acetonitrila para HPLC
/ultravioleta (UV) marca Vetec.
Figura 14 – Homogeneizador tecidual portátil.
Em seguida, foi adicionado ao homogeneizado 440µL de acetonitrila para
HPLC /UV e centrifugado sobre refrigeração constante à 4ºC e 3.500rpm, durante
10min.
O sobrenadante foi aspirado com seringa de insulina e filtrado através da
unidade filtrante com membrana durapore de 0,22 micrômetros (µm) de poro, 13
milímetros (mm), fêmea.
O homogeneizado foi armazenado em tubo de ensaio tipo Eppendorf de 0,5
mililitro (ml) estocado em freezer com temperatura à -70°C para posterior análise
cromatográfica do MDA. Após análise, os valores das dosagens do MDA no tecido,
expressos em micromolar (µM) foram corrigidos para o peso em miligrama (mg) de
cada segmento tecidual estudado, obedecendo o fator de correção de acordo com a
formulação:
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à dieta aproteica
Material e métodos
MDA tecidual (µM) . 1000
Peso do tecido (mg)
4.2.4.2 Coleta e preparação do sangue
Ainda com o animal anestesiado, a coleta de sangue foi realizada por
punção cardíaca com seringa de vidro de 5ml e agulha de 25mm x 8mm (Figura 15).
Figura 15 – Animal submetido à punção cardíaca.
A coleta de sangue – 1,5ml – foi realizada em todos os animais no 25º dia
após o início da dieta.
O sangue coletado foi conservado em tubo Vacutainer padrão com gel e
centrifugado sobre refrigeração à 4ºC e 3.500rpm durante 10min. Em seguida, foi
retirado 150µL do sobrenadante – plasma – e introduzido em tubo de ensaio tipo
Eppendorf de 2ml, onde foi adicionado 15µL de solução de BHT (Anexo E), e 165µL de
acetonitrila para HPLC / UV e posteriormente submetido à centrifugação refrigerada à
4°C e 3.500rpm durante 10min.
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à dieta aproteica
Material e métodos
Os volumes das soluções tampão e BHT foram proporcionais à quantidade
coletada de soro em ml.
O sobrenadante foi aspirado com seringa de insulina e filtrado através da
unidade filtrante com membrana durapore de 0,22µm de poro, 13mm fêmea (Millex /
Millipore).
O homogeneizado foi armazenado em tubo de ensaio tipo Eppendorf de
0,5ml e estocado em freezer à temperatura de -70°C a fim de efetuar posteriormente a
análise cromatográfica do MDA.
4.2.4.3 Cromatografia líquida de alta precisão
Na realização da análise cromatográfica foi necessário proceder a uma curva
de calibração na obtenção do padrão desejado do MDA (Anexo D).
As separações foram feitas em cromatógrafo (Varian Pro Star) com estação
de trabalho conectada ao microcomputador na versão 6.0 do programa Workstation
(Figura 16), e ao equipamento foi acoplado duas bombas (Varian Pro Star – modelo
210) com detector UV.
Figura 16 – Cromatógrafo para HPLC.
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à dieta aproteica
Material e métodos
A coluna utilizada foi do tipo 5C 18 (Varian – modelo Microsorb 100) cujo
comprimento é de 250mm e 4,6mm de diâmetro interno, equipada com pré-coluna.
A eluição foi feita isocraticamente por meio da mistura das soluções tampão
e acetonitrila para HPLC / UV, na proporção 9:1 respectivamente, como fase móvel e as
separações cromatográficas foram realizadas a temperatura ambiente em fluxo de 1ml/
min.
O comprimento de onda foi calibrado em 270 nanômetros (nm) e o tempo
de retenção de 2min. e 35 segundos (s).
Foi utilizado o sistema de injeção automática auto sampler (Varian Pro Star
– modelo 410 ) de 20µL de cada amostra com tempo de leitura em 7min.
4.2.5 Análise estatística
Os resultados obtidos na pesquisa foram coletados em protocolos préestabelecidos no programa Microsoft Excel 2000® realizado no Núcleo de Planejamento
da Fundação Hospital de Clínicas Gaspar Vianna do Estado do Pará.
De acordo com a natureza das variáveis foram aplicados os métodos
estatísticos: descritivo e comparativo pela análise de variância, sendo utilizado o teste
não paramétrico por postos de Kruskal-Wallis (KW) indicado por SIEGEL (1975) para
o qual foi necessário utilizar o Software BioEstat versão 2.0.
Em todos os testes, foi fixado em 0,05% ou 5% (p < ou = 0,05) o nível
para a rejeição da hipótese de nulidade.
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à dieta aproteica
Referências bibliográficas
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76
à dieta aproteica
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JOHNSTON, D. Decreased total antioxidant capacity but normal lipid hydroperoxide
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à dieta aproteica
Anexo A – Comitê de Ética em Pesquisa com animais do Instituto
Evandro Chagas - (IEC), Belém- Pa
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à dieta aproteica
Anexo B – Informação nutricional das dietas
Quantidade por porção de 40g
Valor calórico
%VD*
180 Kcal
7%
34g
9%
Proteínas
–
–
Gorduras totais
5g
6%
Gorduras saturadas
–
–
5mg
2%
1g
3%
Cálcio
22,5mg
3%
Ferro
0,1mg
1%
Sódio
250mg
10%
Carboidratos
Colesterol
Fibra alimentar
Quadro 1 – Composição do biscoito de polvilho.
*VD − Valores diários de referência como base de uma dieta com 2500 kcals.
Distribuição dos macronutrientes da dieta normoproteica
Valor calórico total
3,2 Kcal/g
Carboidratos
63,4%
Proteína bruta
22%
Lipídios
11%
Fibra
8%
Quadro 2 – Composição da ração Nuvilab CR 1 de acordo com o fabricante.
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à dieta aproteica
Anexo C – Preparação da Solução Tampão – fase móvel
Técnica de ESTERBAUER et al. (1984).
Por meio da diluição de 3,6 g do tampão TRIZMA-BASE (SIGMA) em 1 litro de água
bidestilada (milli-Q). Desta preparação, foi retirado 900ml e adicionado 100ml de
acetonitrila para cromatografia líquida de alta precisão (HPLC /UV), correspondendo uma
relação 9:1. Em seguida esta solução foi filtrada utilizando-se unidade filtrante 47mm e
0,45µm de poro (ZETAPOR). A solução permaneceu armazenada em frasco de vidro de 1
litro à temperatura ambiente validada até uma semana.
90
à dieta aproteica
Anexo D  Preparação da Solução Padrão / Curva de calibração
Em um frasco de vidro com 99ml de água deionizada (milli-Q), foi adicionado 1ml de
ácido sulfúrico a 1%. Em seguida, 239µl da solução de malondialdeído diacetal
(SIGMA).
O frasco foi envolvido com papel laminado e mantido em temperatura ambiental pelo
tempo de 2 horas, onde neste período foi agitada por 2 vezes e armazenada sobre
refrigeração com validação até uma semana.
Alíquotas desta solução foram diluídas para se construir uma curva de calibração entre
1µM e 200µM de malondialdeído. O coeficiente de correlação para a curva de
calibração foi de 0,99.
Gráfico 1 – Curva de calibração
91
à dieta aproteica
Anexo E – Preparação da solução de butil hidroxi tolueno (BHT)
Consistiu na diluição de 4mg de BHT em 2ml de etanol à 96%. Armazenada em frasco
de vidro e conservada em refrigeração com validação até uma semana.
Apêndice
93
à dieta aproteica
Apêndice
Peso 21dias Peso 25 dias Albuminemia MDA sangue
Subgrupos Rato
MDA / 1000
Peso do tecido
(g)
(g)
(g/dl)
(µM)
peso do tecido mg
(mg)
A
1
214,5
224
1,6
11,36
592,00
85
DA
1
95
96,5
1
6,07
357,26
84
A
2
216,5
2235
1,6
9,87
527,29
85
P
1
274
274
2
2,21
608,66
82
P
2
263,5
279
2
3,08
732,44
82
D
1
91
92,5
1,6
5,59
701,63
80
D
2
95,5
91,5
1,8
4,62
463,78
82
DC
1
89
105
2,1
15,01
517,35
83
A
3
227,5
261,5
1,8
2,56
853,53
85
DA
2
88
85
1,4
3,34
384,53
78
DAC
2
104
112,5
1,6
2,14
610,37
82
A
4
230
229
2,1
2,51
643,57
84
P
3
224
238,5
2,1
7,48
940,80
87
P
4
240,5
240,5
2,3
7,63
1083,10
84
D
3
91
89
1,8
2,38
478,50
80
D
4
115
118
2,5
2,79
757,90
81
DC
3
93
113,5
1,6
8,19
590,35
85
DC
4
103
122,5
2,1
4,26
413,07
88
A
5
290
305
3,9
9,46
1028,75
80
DA
3
95
120
2,7
3,69
353,57
84
DAC
3
109
101,5
1,8
4,27
156,34
82
A
6
198
207,5
2,7
6,44
635,48
84
(continua)
Quadro 1 – Registro das variáveis encontradas nos animais pesquisados.
94
à dieta aproteica
Subgrupos Rato
MDA /1000
Peso do tecido
(g)
(g)
(g/dl)
(µM)
peso do tecido mg
(mg)
P
5
272,5
290
3
5,25
972,05
83
P
6
236
251
2,7
4,76
998,86
88
D
5
95,5
100
1,8
0
837,01
87
D
6
105
114
2,3
3,1
578,35
85
DC
5
116
158
2,5
4,29
855,86
87
DC
6
114
153
2,8
0
1193,57
84
DA
4
108
104
1,2
0
652,03
79
DAC
4
100,5
114,5
1,9
7,43
748,40
81
DA
5
120,5
115
1,9
1,5
280,62
81
DA
6
124
115,5
2,1
8
591,92
78
DAC
5
116
128
2,1
0
1021,13
80
DA
7
110
166
1,9
3,24
825,93
81
DAC
7
128
139
2,3
9,02
1052,50
85
A
7
236
245
1,9
8,88
788,82
85
DC
7
118
116,5
2,3
2,73
1101,18
85
P
7
259
298
2,1
0
1283,72
85
P
8
234
260,5
2,3
0
766,71
85
D
9
143
143,5
1,8
0,45
506,05
81
DC
9
160
165,5
1,8
5,35
1820,98
82
A
8
217,5
214
1,9
0
368,59
85
D
10
153
154
2,8
2,98
1104,53
86
D
7
119
118,5
2,3
1,18
818,97
87
DC
10
153
154
2,7
0,96
1094,82
83
(continuação)
95
à dieta aproteica
MDA /1000
Peso do tecido
Subgrupos Rato
(g)
(g)
(g/dl)
(µM)
peso do tecido mg
(mg)
A
9
267,5
257
2,1
3,83
1187,83
83
A
10
296
267
2,1
2,17
975,98
87
DA
10
130,5
126,5
1,6
0,79
412,87
87
DC
2
150
156
1,8
0,77
829,29
85
DAC
9
120,5
141,5
3
6,66
765,75
87
DAC
10
106,5
115
2,7
1,01
1153,64
88
DAC
1
111,5
119
2,1
1,96
660,90
78
P
9
235
250
2,5
2,32
1187,90
81
P
10
250
272
2,3
1,32
1238,31
83
D
8
127
127,5
1,8
1,56
839,62
78
DC
8
124
126,5
1,8
2,05
648,86
88
DA
8
113
107,5
1,9
2,56
562,84
88
DA
9
150,5
117
1,9
3,25
921,38
80
DAC
6
115,5
118
3
0,33
870,73
82
DAC
8
107
120
2,3
2,56
946,93
88
(conclusão)

Materiais e métodos - Instituto Evandro Chagas

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