desenvolvimento de sistema de análises por injeção em fluxo com

CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA “PAULA SOUZA”
FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA
CURSO DE BIOCOMBUSTÍVEIS
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA DE ANÁLISES POR INJEÇÃO
EM FLUXO COM DIFUSÃO GASOSA PARA DETERMINAÇÃO DE
SULFETO EM MOSTOS FERMENTADOS DE CALDO DE CANA
TATIANE MARIA DOS SANTOS
VANESSA GISELE TEDESCO FAVARIM
VIVIANE GAMBARO FERRACCIU
PIRACICABA
JUNHO/2011
ii
TATIANE MARIA DOS SANTOS
VANESSA GISELE TEDESCO FAVARIM
VIVIANE GAMBARO FERRACCIU
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA DE ANÁLISES POR INJEÇÃO
EM FLUXO COM DIFUSÃO GASOSA PARA DETERMINAÇÃO DE
SULFETO EM MOSTOS FERMENTADOS DE CALDO DE CANA
Trabalho de Graduação apresentado à Faculdade de Tecnologia
de Piracicaba (Fatec), como requisito parcial à obtenção do Título
de Tecnólogo em Biocombustíveis.
Orientador: Prof. Dr. Renato Roveratti
PIRACICABA
JUNHO/2011
iii
AUTORIZAMOS A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE
ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Santos, Tatiane Maria dos; Favarim, Vanessa Gisele Tedesco; Ferracciu, Viviane Gambaro
Desenvolvimento de sistema de análises por injeção em fluxo com difusão gasosa para
determinação de sulfeto em mostos fermentados de caldo de cana / Santos, Tatiane Maria;
Favarim, Vanessa Gisele Tedesco; Ferracciu, Viviane Gambaro; orientador Renato Roveratti.
- - Piracicaba, 2011.
48 p.
Trabalho de Graduação (Graduação – Tecnologia) – Faculdade de Tecnologia de Piracicaba –
Centro Estadual de Educação Tecnológica “Paula Souza”
1. Sulfeto 2. Caldo de cana de açúcar 3. Análise em fluxo (FIA) 4. Difusão gasosa
I. Título
iv
TATIANE MARIA DOS SANTOS
VANESSA GISELE TEDESCO FAVARIM
VIVIANE GAMBARO FERRACCIU
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA DE ANÁLISES POR INJEÇÃO EM FLUXO
COM DIFUSÃO GASOSA PARA DETERMINAÇÃO DE SULFETO EM MOSTOS
FERMENTADOS DE CALDO DE CANA
Monografia aprovada pela banca examinadora.
___________________________________________________
Prof. Dr. Renato Roveratti
Orientador - Presidente
____________________________________________________
Dra. Claudinéia Rodrigues da Silva – CENA/USP
____________________________________________________
Prof. Dr. Paulo Cesar Doimo Mendes
Piracicaba, 14 de Junho de 2011.
v
AGRADECIMENTOS
Nossos sinceros agradecimentos:
 às nossas famílias que nos apoiaram dando conforto nos momentos difíceis, fazendo
com que tivéssemos forças e ânimo para persistir em nossos objetivos, ajudando-nos a
alcançá-los;
 ao Prof. Dr. Elias Ayres Guidetti Zagatto; ao Técnico do Laboratório de Química
Analítica, Valdemir Aparecido Fernandes de Barros; à pós doutoranda Claudinéia
Rodrigues da Silva; à Profª Me Luciana Fischer e ao Prof. Dr. Renato Roveratti, pela
orientação, paciência, amizade e apoio em todas as fases deste trabalho;
 à Faculdade de Tecnologia de Piracicaba (FATEC), pela oportunidade de realização
deste trabalho;
 ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), pela oportunidade de
aprendizado e infraestrutura que nos proporcionou.
Enfim a todos que contribuíram para o sucesso deste trabalho.
Obrigadas!
vi
“Dizem que para bem aprender é preciso esquecer várias vezes. O mundo seguiu esse método.
Tudo o que se questiona em nossos dias havia sido resolvido pelos antigos; anteriores a
nossos anais, suas soluções escritas em hieróglifos não tinham mais sentido para nós; um
homem reencontrou sua chave, abriu as necrópoles da ciência antiga e deu a seu século todo
um mundo de teoremas esquecidos, de sínteses simples e sublimes como a natureza,
irradiando sempre unidade e multiplicando-se como números, com proporções tão exatas
quanto o conhecimento demonstra e revela o desconhecido.
Compreender essa ciência é ver Deus.”
(Eliphas Levi)
vii
RESUMO
Foi proposto um método para determinação de sulfeto em mostos fermentados de caldo de
cana de açúcar. O monitoramento do analito foi realizado em um sistema de análises por
injeção em fluxo (FIA) com difusão gasosa.
O método proposto é baseado na difusão gasosa por meio de uma membrana de
politetrafluoretileno (PTFE) e posterior coleta em fluxo aceptor alcalino. O módulo de
análises apresenta dimensões reduzidas de forma a minimizar o consumo de reagentes e
aumentar a freqüência analítica.
A aplicação de sistemas FIA envolvendo difusão gasosa apresenta-se favorável em relação à
fermentação alcoólica, cujo controle requer o monitoramento de espécies químicas produzidas
durante o processo fermentativo. Nestes sistemas, as condições experimentais são
eficientemente mantidas, o que permite a implementação de membranas de difusão gasosa
para etapas de separação / concentração em linha. Devido à adição de enxofre na fermentação
industrial, torna-se importante a avaliação em tempo real da concentração de sulfeto. O
sulfeto é produzido durante a fermentação, como consequência da redução enzimática de
sulfito. E em concentrações maiores que 50 g L-1 esta espécie química libera um aroma
desagradável às bebidas fermentadas, por isso a importância de sua análise utilizando o
sistema FIA.
Palavras chaves
Sulfeto; caldo de cana-de-açúcar; análise em fluxo (FIA); difusão gasosa.
viii
ABSTRACT
We proposed a method for determination of sulfide in musts fermented of sugar cane juice.
The monitoring of the analyte was performed in a system of flow injection analysis (FIA)
with
gaseous
diffusion.
The proposed method is based on gas diffusion through a membrane of
polytetrafluoroethylene (PTFE) and later collected in alkaline acceptor stream. The analysis
module has reduced dimensions in order to minimize reagent consumption and increasing the
analytical frequency.
The application of FIA systems involving gaseous diffusion is favorable regarding alcoholic
fermentation, whose control requires monitoring of chemical species produced during the
fermentation process. In these systems, the experimental conditions are efficiently maintained,
allowing the implementation of membranes for gaseous diffusion separation steps / in-line
concentration. The addition of sulfur in industrial fermentation is important to real-time
assessment of concentration of sulfide. The sulfide is produced during fermentation, as a
result of enzymatic reduction of sulfite. At concentrations above 50 g L-1 this chemical
species releases an unpleasant smell to fermented beverages, because of that is so important
the analysis using the FIA system.
Keywords
Sulfide; sugar cane juice; flow injection (FIA); gaseous diffusion.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Câmara de difusão gasosa tipo “sandwich”...................................................... 18
Figura 2 – Injetor-comutador em acrílico........................................................................... 18
Figura 3 – Sistema FIA e seus componentes...................................................................... 25
Figura 4 – Processo de fermentação em andamento.......................................................... 26
Figura 5 – Reação de oxirredução que ocorre no sistema FIA para detecção de sulfeto em
mosto................................................................................................................................... 41
Figura 5 – Esquema do sistema de análises por injeção em fluxo..................................... 43
x
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Variação do tamanho da alça de amostragem................................................. 27
Gráfico 2 - Variação do tamanho das bobinas de reação................................................... 28
Gráfico 3 - Variação do volume da amostra....................................................................... 29
Gráfico 4 - Variação da vazão da solução transportadora..................................................30
Gráfico 5 - Variação da vazão de R1.................................................................................. 31
Gráfico 6 - Variação da vazão de R2...................................................................................32
Gráfico 7 - Variação da vazão de R3...................................................................................33
Gráfico 8 - Variação da concentração de R1....................................................................... 34
Gráfico 9 - Variação da concentração de R2....................................................................... 35
Gráfico 10 - Variação da concentração do Fe(III).............................................................. 36
Gráfico 11 - Variação da concentração do HCl na presença de Fe(III).............................. 37
Gráfico 12 - Variação da concentração de DMPD............................................................. 38
Gráfico 13 - Variação da concentração de HCl na presença de DMPD............................. 39
Gráfico 14 - Variação da temperatura.................................................................................40
Gráfico 15 - Registro do monitoramento da fermentação.................................................. 44
Gráfico 16 - Curva analítica (relação entre absorbância e concentração de sulfeto).......... 45
xi
LISTA DE SIGLAS
CENA – Centro de Energia Nuclear na Agricultura
DMPD – N,N-dimetil-p-fenilenidiamino
ESALQ – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
FATEC – Faculdade de Tecnologia de Piracicaba
FIA – Flow Injection Analyses
FMA - acetato de mercúrio fluoresceína
MB – Azul de Metileno
PRS – Procariotas Redutoras de Sulfato
PTFE – Politetrafluoretileno
S2- – Sulfeto
SAOB - Sulfide Anti-Oxidant Buffer
USP – Universidade de São Paulo
UV-Vis – Espectroscopia de absorção no ultravioleta visível
VRCPD - Voltametria de Redissolução Catódica de Pulso Diferencial
λ – Comprimento de onda
µl – Microlitro
xii
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................................... vi
ABSTRACT .......................................................................................................................vii
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................viii
LISTA DE GRÁFICOS .........................................................................................ix
LISTA DE SIGLAS................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................13
2. OBJETIVO .................................................................................................................... 16
3. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 17
3.1 Contextualização do sistema fia.................................................................................... 17
3.2 Outros métodos utilizados para determinação de compostos sulfurados...................... 20
3.3 Espectrofotômetro e Lei de Beer-Lambert ................................................................... 22
4. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................... 24
4.1 Instrumentos e acessórios ............................................................................................. 24
4.2 Reagente e soluções-padrão .......................................................................................... 25
4.3 Principais reações ......................................................................................................... 26
4.4 Amostras ....................................................................................................................... 27
4.5 Metodologia Desenvolvida ........................................................................................... 27
4.6 Funcionamento do Sistema FIA ................................................................................... 28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 29
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS QUÍMICAS E FÍSICAS .................................. 29
5.1.1 Comprimento da alça de amostragem.................................................................... 29
5.1.2 Comprimento das bobinas de reação...................................................................... 30
5.1.3 Volume da amostra .................................................................................................. 31
5.1.4 Vazão (velocidade) da bomba.................................................................................. 31
5.1.4.1 Vazão do fluxo transportador (água)....................................................................... 32
5.1.4.2 Vazão de R1 (HCl)................................................................................................... 33
5.1.4.3 Vazão de R2 (NaOH)............................................................................................... 34
5.1.4.4 Vazão de R3 ............................................................................................................. 35
5.1.5 Concentração.............................................................................................................36
5.1.5.1 Concentração de R1 (HCl) ...................................................................................... 36
5.1.5.2 Concentração de R2 (NaOH)................................................................................... 37
5.1.5.3 Concentração de Fe (III).......................................................................................... 38
xiii
5.1.5.4 Concentração de HCl na presença de Fe(III)......................................................... 39
5.1.5.5 Concentração de DMPD.......................................................................................... 40
5.1.5.6 Concentração de HCl na presença de DMPD.........................................................41
5.1.6 Temperatura ............................................................................................................ 42
5.2 Parâmetros estudados e selecionados na otimização do Sistema FIA .......................... 43
5.3 Curva analítica .............................................................................................................. 44
5.4 Concentração de sulfeto obtida .....................................................................................45
6. CONCLUSÃO................................................................................................................ 46
REFERÊNCIAS................................................................................................................. 47
13
1. INTRODUÇÃO
A fermentação alcoólica é o principal procedimento adotado para a obtenção de etanol
em nosso país, por ser um processo bioquímico simples e eficiente. Conduzida em larga
escala transforma a sacarose (C12H22O11), extraída da cana de açúcar, através da hidrólise
ácida ou enzimática em etanol (C2H5OH) e gás carbônico (CO2) (GUTIERREZ, 1997).
O caldo de cana obtido no processo de extração apresenta quantidade e qualidade
variável de impurezas. Areia, argila e bagacilho são algumas das impurezas insolúveis
eliminadas através do tratamento primário que inclui peneiramento e centrifugação do caldo
(COPERSUCAR, 2008).
Nas etapas seguintes de preparação do mosto para fermentação o caldo de cana passa
pelo o tratamento químico, onde acontece a sulfitação do caldo adicionando dióxido de
enxofre (SO2), que visa o controle da acidez e assepsia do caldo, pois é um bacteriostático.
Esse processo, além de baixar o pH ácido do caldo a aproximadamente 4,0, auxilia na
coagulação, floculação e precipitação das impurezas, que são eliminadas por sedimentação
(ALVES et al, 2006, p. 231). E em seguida, o caldo passa pelo tratamento biológico, no qual
é acrescentado ao mosto a levedura Saccharomyces cerevisiae, que faz com que a sacarose se
transforme em etanol através da ação de enzimas. A maioria dos compostos sulfurados já
identificados em bebidas alcoólicas é oriunda diretamente da matéria-prima, contudo, alguns
podem ser derivados do metabolismo das leveduras (BERRY, 1995, p. 32).
As bactérias procariotas redutores de sulfato (PRS) são responsáveis por reduzir
metabolicamente íons sulfato ou outras espécies oxidadas do enxofre (sulfito, tiosulfato ou
enxofre elementar) a ácido sulfídrico (H2S) (GIBSON, 1990, p. 769). Durante a fermentação,
o sulfeto (S2-) é produzido como consequência da redução enzimática do sulfito (SO32-). A
redução do sulfito a sulfeto por uma enzima sulfito redutase é um processo de oxirredução,
que envolve a transferência de seis elétrons (RABUS et al., 2006, p. 659).
Nas últimas três décadas a demanda referente à determinação de compostos de enxofre tem
sido crescente. Um fator responsável por isso é a preocupação com a qualidade ambiental, já que
compostos de enxofre voláteis constituem uma fonte significativa de poluição atmosférica e,
consequentemente, podem ser responsáveis por danos ambientais, incluindo participação na
deposição ácida. Tais constituintes ácidos presentes na atmosfera, dissolvem-se nas nuvens e nas
gotas de chuva para formar a chuva ácida, uma solução com pH inferior a 5,6 (CRUZ & CAMPOS,
14
2008). O controle da poluição ambiental tem exigido cada vez mais a determinação de enxofre em
grande variedade de matrizes a níveis menores do que 1000 g l-1 (RATH, 1986, p.4).
A determinação de compostos de enxofre é principalmente importante na indústria
sucroalcooleira, isto devido ao fato do sulfeto em concentrações superiores a 50 g l-1 conferir um
aroma desagradável às bebidas fermentadas (WALKER, 1998). No álcool combustível, o excesso de
sulfeto condiciona características corrosivas ao produto final, devido a formação de compostos
sulfurados, como por exemplo, ácido sulfúrico (H2SO4) ou sulfuroso (H2SO3), prejudicando sua
utilização (LIMA et al, 2001, p. 43). Quando aços de alta resistência e aços de baixo carbono
estiverem expostos à concentrações superiores a 1000 g l-1 de H2S o risco de falha por corrosão sob
tensão é bastante significativo (SANDRES & MAINIER, 2009)
Com relação aos métodos para determinação de sulfeto em materiais fermentescíveis,
sistemas FIA envolvendo separação/concentração em linha ganham destaque (FERRER et al, 2006, p.
391). Esse método analítico permite a quantificação de sulfeto e sulfito em tempo real, podendo-se
constituir em fator adicional para o controle da fermentação (KRUG et al, 1986, p. 103).
Para a análise da quantidade de sulfeto no mosto fermentado, insere-se a amostra no
percurso analítico através do injetor comutador. A amostra sofre dispersão ao ser conduzida pelo
fluxo transportador, juntamente com o ácido clorídrico (HCl). Segundo Arrhenius (1884), o HCl
funciona como doador, pois é um ácido, ou seja, substância que forma íons hidrogênio [H+] quando
dissolvida em H2O, é um doador de próton (H+).
Após passar pela bobina reacional ocorre a formação ácido sulfídrico (H2S), o qual
permeia a membrana encontrando-se com o fluxo aceptor, hidróxido de sódio (NaOH), que
coleta o gás formando sulfeto (S2-) novamente, se confluindo com Fe(III) e DMPD, formando
azul de metileno o qual é detectado, em 668 nm, no espectrofotômetro.
Nesse sistema, o processamento das amostras é feito de forma reprodutível e sem
contato com o ambiente externo, bem como o monitoramento de processos envolvendo
formação de espécies químicas que podem ser convertidas a formas gasosas
(TROJANOWICZ, 2000). Devido ao uso de membranas de difusão gasosa para
separação/concentração em linha e ao transporte do analito pelo fluxo aceptor, as condições
reacionais podem ser eficientemente definidas e as perdas em sensibilidade são compensadas
pelos ganhos em seletividade (FANG, 1993).
15
16
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizando e adaptando, o sistema de análises por
injeção em fluxo (FIA) com difusão gasosa, para quantificar, analisar e monitorar a formação de
sulfeto em mostos fermentados de caldo de cana de açúcar. Já que compostos sulfurados são
contaminantes indesejados no etanol, sendo necessário haver um controle destas substâncias, no
caso estudado, o sulfeto.
17
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Contextualização do Sistema FIA
A partir dos anos 70, a crescente demanda por métodos rápidos e com baixo risco de
contaminação para análises clínicas, agroindustriais e farmacêuticas propiciou a investigação e
desenvolvimento de vários tipos de equipamentos automatizados. Estes apresentam como
vantagens o aumento da precisão e exatidão, além da diminuição do custo operacional. Muitos
equipamentos foram produzidos e propostos, visando a análise de um grande número de soluções
de amostras (SILVA, 2004).
Em 1975, foi proposto um novo conceito de análise em fluxo (Ruzicka & Hansen,1975, p. 145) o
qual foi denominado Flow Injection Analysis (FIA), sendo o termo traduzido para o português como
Análise por Injeção em Fluxo.
Desde o princípio, percebeu-se que eram grandes as potencialidades e a praticidade desse
processo, uma vez que as amostras e os reagentes não eram mais manipulados diminuindo,
portanto, os riscos de contaminação. O princípio do processo é muito simples e baseia-se na inserção
de uma alíquota da solução da amostra no percurso analítico, a qual sofre dispersão ao ser conduzida
através do mesmo, por ser uma solução carregadora, até o detector, que pode ser o próprio
reagente (SILVA, 2004).
Sistemas de análises por injeção em fluxo ganham destaque quando falamos em métodos
estabelecidos para determinação dos compostos de enxofre que podem ser convertidos a espécies
gasosas (sulfeto e sulfito), já que exploram técnicas de separação e/ou concentração, principalmente
difusão gasosa. Também possuem adaptação simples e de fácil aplicação, sobretudo quando
utilizados para determinação de compostos voláteis (FANG,1993).
18
C
M
B
M
A
D
W
Figura 1 – Câmara de difusão gasosa tipo “sandwich”. A = entrada do fluxo doador; B = entrada do fluxo
aceptor; C = canais; M = membrana; D = saída para o detector; W = descarte.
Fonte: MENESES (2008)
Os sistemas FIA são basicamente constituídos por uma unidade propulsora de fluidos (em geral é
uma bomba peristáltica operando em vazões no intervalo de 0,1 a 10,0 mL min-¹, devendo manter a
vazão constante), uma unidade de inserção de amostra, de reação/mistura e uma de detecção.
Opcionalmente, estas unidades podem ser controladas por uma unidade de controle e aquisição de
dados a qual pode estar acoplada a uma unidade de processamento e arquivo (SILVA, 2004).
O injetor é o dispositivo fundamental do sistema de análise química por injeção em fluxo. É
através dele que se introduz a amostra no percurso analítico. Dois tipos de injetores são os mais
utilizados, o de válvula rotatória desenvolvida por Ruzicka e Hansen (1975) e o injetor proporcional
(ou injetor comutador) desenvolvido pelos pesquisadores da Seção de Química Analítica do
CENA/USP, mostrado na figura 2.
19
Figura 2. Injetor-comutador em acrílico
Fonte: Laboratório de Química Analítica CENA/USP. Piracicaba - 2010
Este último, além de ser muito versátil, é muito fácil de ser construído. Consiste em três peças de
acrílico, sendo duas fixas e uma móvel. A peça central pode ser deslocada em relação às laterais, um
passo para frente ou para trás, ou vice-versa. Por meio desse movimento o injetor coleta a amostra e
a insere no percurso analítico. (REIS et al, 1988)
O percurso analítico é a unidade do sistema FIA onde ocorrem as etapas de reação e/ou mistura.
Em sistemas simples, como esse, os dispositivos normalmente empregados são conectores para
entrada de reagentes, confluências e reatores (ou bobinas) helicoidais. Os procedimentos envolvem
a inserção da amostra em um fluxo transportador, a dispersão da zona de amostra estabelecida e a
temporização, o que possibilita a consecução das etapas inerentes à determinação analítica
específica com menor ingerência do operador e menor possibilidade de contaminação pelo ambiente
laboratorial. Em sua versão mais simples, os sistemas FIA compreendem uma bomba peristáltica para
impulsionar o fluxo transportador e os reagentes, um injetor para introduzir com precisão uma
alíquota pré-definida da amostra, uma bobina de reação, onde a zona de amostra se dispersa
formando as espécies químicas a serem monitoradas, um detector e um dispositivo para registrar o
sinal analítico gerado durante a passagem da amostra processada através do mesmo (ALVES et al,
2005, p. 74).
Dentre as características favoráveis dos sistemas FIA, destacam-se as possibilidades de
automação, o baixo custo, a facilidade operacional, a possibilidade de miniaturização, o baixo
consumo de amostras e de reagentes, a versatilidade e a alta freqüência analítica. Nestes sistemas,
20
os equilíbrios químicos podem não ter sido atingido quando a zona de amostra é quantificada, o que
expande a aplicabilidade dos métodos (RUZICKA & HANSEN, 1975, p. 150).
Com relação às técnicas de detecção em sistemas FIA, seu emprego crescente se deve ao
aprimoramento instrumental e à disponibilidade comercial de novos reagentes (Troijanowicz, 2000).
Uma característica importante na análise por injeção em fluxo, é obtermos resultados rápidos e
repetitivos (HARRIS, 2005, p. 398).
Os sistemas FIA apresentam a beleza da simplicidade instrumental e operacional, sendo
aceitos mundialmente como ferramenta importante para análises de rotina em larga escala. Este
aspecto pode ser confirmado pelas inúmeras publicações, livros, teses acadêmicas e analisadores
comerciais disponíveis (TROJANOWICZ, 2000; RUZICKA & HANSEN, 1975, p. 157).
3.2 Outros métodos utilizados para determinação de compostos sulfurados
Muitos são os casos em que se faz necessária a rápida determinação de pequenas quantidades
de enxofre. Os métodos utilizados para a determinação de enxofre em compostos orgânicos
baseiam-se principalmente nos processos de oxidação e redução, fornecendo íons sulfato e sulfeto
respectivamente (RATH, 1986). Neste trabalho é apresentada a determinação de sulfeto utilizando o
sistema FIA, o qual se baseia no método Fischer, recomendado em 1883 para identificação de H2S,
onde os compostos de enxofre são determinados espectrofotometricamente como azul de metileno.
Os compostos uma vez reduzidos a sulfeto reagem com DMPD (N, N-dimetil-p-fenilenodiamina) na
presença de Fe(III) produzindo o corante azul de metileno, cuja absorção ocorre a 668 nm.
Titulação iodimétrica
No processo de titulação iodimétrica, baseada na volumetria, o sulfeto é adicionado a uma
solução acidificada de iodo e o excesso de iodo é titulado com uma solução-padrão de tiossulfato,
usando-se o amido como indicador. Os pesquisadores Sharma, Gupta e Talanta desenvolveram em
1976 um método iodimétrico para a determinação de sulfeto, empregando o perclorato ou sulfato
de tálio (III) e o iodeto de potássio (RATH, 1986, p.7).
21
Redução a sulfeto pelo níquel de Raney
Em 1951 Granatelli desenvolveu um método para a determinação de compostos de enxofre,
baseado na redução a sulfeto pelo níquel de Raney. O sulfeto era liberado na forma de H 2S mediante
a adição de ácido. O gás sulfídrico era então absorvido em uma solução de hidróxido de sódio e
acetona, onde o sulfeto era titulado com acetato de mercúrio, usando a ditizona como indicador
(RATH, 1986, p.8).
Digestão alcalina de uma amostra de níquel de Raney
Um método para a determinação de pequenas quantidades de enxofre reduzido em água,
baseado na digestão alcalina de uma amostra de níquel Raney como redutor, foi desenvolvido em
1982 por Steudler e Kijowski. O ácido clorídrico é adicionado à mistura de digestão para liberar gás
sulfídrico,
que
está
preso
em
uma
solução
de
acetato
de
zinco
e
determinado
espectrofotometricamente (RATH, 1986, p.8).
Espectrometria de fluorescência molecular
Este método baseia-se na diminuição da fluorescência de complexos de acetato de mercúrio
fluoresceína (FMA), resultante da ação de supressão da fluorescência causada pelo sulfeto. Ou seja, o
acetato de mercúrio fluoresceína reage com sulfeto em meio alcalino, e a fluorescência da solução
resultante é determinada com um espectrofluorímetro. Os métodos fluorimétricos possuem
sensibilidade de uma a três ordens de grandeza maiores que os métodos espectrofotométricos e são
os mais utilizado na análise de sulfeto (LAWRENCE et al., 2000, p. 771)
Ácido fosfotungstico
Segundo Borges (2011), na Fermentec, empresa de consultoria especializada em fermentação
alcoólica e controle laboratorial para a produção de açúcar e álcool, utiliza-se o ácido fosfotungstico
(H3PW12O40), através do qual prepara-se soluções corantes para avaliar a presença de sulfeto no
mosto fermentado.
Voltametria de Redissolução Catódica de Pulso Diferencial (VRCPD)
22
Rath (1986), desenvolveu um método analítico para a análise de enxofre orgânico e
elementar em amostras de etanol baseado na determinação de sulfeto por Voltametria de
Redissolução Catódica de Pulso Diferencial (VRCPD). Neste método as amostras foram
tratadas com níquel de Raney, para converter o enxofre orgânico e elementar a sulfeto. O
sulfeto foi liberado na forma de H2S e absorvido em uma solução tampão de SAOB II 10%
(sulfide anti-oxidant buffer) e determinado por VRCPD.
3.3 Espectrofotômetro e Lei de Beer-Lambert
A equação A= εbc que expressa a essência da espectroscopia quando aplicada a
química analítica, é denominada lei de Beer. A absorvância é uma grandeza adimensional,
mas algumas pessoas escrevem “unidades de absorvância” depois do valor da absorvância. A
concentração da amostra c, é geralmente expressa em moles por litro (M). O caminho óptico
b, é geralmente expresso em centímetros. A grandeza ε (épsilon) é conhecida como
absortividade molar (ou, na literatura mais antiga, coeficiente de extinção) e é expressa nas
unidades M-1cm-1, o que torna o produto εbc adimensional. A absortividade molar é a
característica de uma substância que indica qual a quantidade de luz que é absorvida em um
determinado comprimento de onda, pois quanto maior a absortividade molar, maior a
absorbância (HARRIS, 2005, p. 402).
23
Espectrofometria consiste em usar o espectro radiante para inspecionar sistemas
biológicos, especialmente soluções. No procedimento básico, um feixe de energia atravessa a
solução, e a sua absorção oferece informações sobre a quantidade e qualidade dos
componentes do sistema (HENNEINE, 2001).
Espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática (de
um único comprimento de onda, ou quase) através de uma solução, e mede a quantidade de
luz que foi absorvida por essa solução (HARRIS, 2005, p. 427).
A radiação incidente (IO) pode sofrer reflexão, refração, espalhamento ou ser
absorvida pelo material. Disso resulta que somente uma parte da radiação incidente é
transmitida (I) através do material. O processo de absorção ocorre ao nível molecular
(ATKINS & PAULA, 2004).
Assim, como acontece num átomo, cada molécula caracteriza-se por possuir níveis de
energia moleculares quantizados, os quais podem ser ocupados pelos elétrons das moléculas.
Por outro lado a radiação carrega energia, sendo que o valor dessa energia depende do
comprimento de onda da radiação. A absorção da radiação se dá quando a energia que ela
transporta é igual á diferença entre os dois níveis de energia da molécula; nessa situação, a
energia da radiação é transferida para a molécula e ocorre a chamada absorção de radiação
(ATKINS & PAULA, 2004).
O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada
comprimento de onda. O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para
um composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância. Uma vez
que diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria permitenos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite também
quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a
concentração da substância, ou seja:
(1) A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada
(2) A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe
luminoso através das amostras
Juntando (1) e (2), temos a lei de Beer-Lambert, ou seja, a absorvância da luz a cada
comprimento de onda (λ) é directamente proporcional à concentração da solução contida na
cuvette. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentrações muito elevadas da substância,
podendo nesses casos diluir previamente a amostra a medir (HARRIS, 2005, p. 434).
24
4. MATERIAIS E MÉTODOS
25
Para o desenvolvimento da pesquisa científica realizada no Labaratório de Química Analítica
do CENA/USP (Piracicaba, SP), houve um alto nível de controle da situação, isolando cada
componente, monitorando a temperatura e vazão, gerando assim maior confiabilidade em seus
resultados. Para que tal estudo pudesse ser realizado, foram utilizados materiais e métodos
específicos.
4.1 Instrumentos e acessórios
O sistema FIA, para a determinação de sulfeto utilizado neste trabalho foi composto por:
- Injetor-comutador em acrílico;
- Confluência para junção dos fluxos;
- Tubos de polietileno com diferentes diâmetros;
- Alças de amostragem;
- Reator;
- Câmara de difusão gás-líquido tipo “sandwich” confeccionada em acrílico (70 mm de largura; 1,5
mm de espessura; 0,5 mm de profundidade)
- Fita de teflon PTFE marca TFEThread Seal Tape (EUA), utilizada como unidade de difusão;
- Espectrofotômetro Femto modelo 432, equipado com cela de fluxo Hellma, modelo 178 OS, com
passo óptico de 10 mm e volume interno de 80 ml, utilizado como unidade de detecção;
- Registrador potenciométrico Kipp & Zonen modelo 111, ao qual o espectrofotômetro era
conectado;
- Balança analítica Metter (modelo AE 100);
- Capela de fluxo laminar (marca VECO);
- Deionizador Millipore (modelo Milli- Q Plus );
- pHmetro Digital PG1800;
- Vidrarias específicas de laboratórios de química.
26
Figura 3 – Sistema FIA e seus componentes. (1) bomba peristáltica, (2) descarte de reagentes, (3)
injetor- comutador em acrílico, (4) detector espectofotométrico, (5) bobinas helicoidais e
(6) descarte da amostras.
Fonte: Laboratório de Química Analítica CENA/USP. Piracicaba - 2010
4.2 Reagentes e soluções-padrão
Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram fornecidos pela Aldrich, Merck, Sigma e
Carlo Erba. As soluções foram preparadas com água deionizada e reagentes de qualidade analítica.
O reagente cromogênico1 foi preparado dissolvendo 0,1 g de DMPD (N,N-dimetil-pfenilenidiamino) em aproximadamente 50 mL de água, adicionando 8,3 mL de ácido clorídrico (HCl)
concentrado e diluindo a solução em água até 100 mL.
A solução de 2,0 mol L-1 DMPD foi elaborada semanalmente por diluição adequada da
solução estoque com 1,0 mol L-1 de HCl .
A solução contendo Fe (III) foi preparada semanalmente diluindo 0,34 g de cloreto de ferro
(FeCl3*6H2O) em 50 mL de água, adicionando 8,3 mL de HCl concentrado e completando com água
até o volume de 100 mL.
A solução-padrão estoque de sulfeto (S2-) 1000 mg L-1 foi preparada diariamente dissolvendo
0,75 g de sulfeto de sódio (Na2S*9H2O) em 100 mL de uma solução 0,1 mol L-1 NaOH. Soluçõespadrão de trabalho (0,5 - 6,0 mg L-1 S2-) foram preparadas por diluições adequadas da solução-padrão
estoque de sulfeto com 0,025 mol L-1 NaOH.
27
A solução 0,5 mol L-1 de HCl foi preparada a partir de HCl concentrado diluido em água. O HCl
se dissocia em água para dar íons H+, portanto essa solução é chamada de solução doarora.
A solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,01 mol L-1 foi preparada a partir de uma solução
de 0,1 mol L-1 NaOH, sendo utilizada como fluxo aceptor, pois a base se dissocia em água formando
íons hidróxido.
1
4.3 Principais
reações Substância que da coloração em uma reação.
Reagente
cromogênico:
O método utilizado para determinação do sulfeto em mostos tem como principal reação a de
DMPD em presença de Fe (III) como agente oxidante, em meio ácido de HCl, produzindo desta forma
o azul de metileno (MB) para evidenciar a presença de sulfeto, conforme a equação da reação
química (2).
Figura 5 – Reação de oxirredução que ocorre no sistema FIA para detecção de sulfeto em
mosto.
Métodos espectrofotométricos em sistemas de análises em fluxo envolvendo difusão gasosa
podem ser aplicados para o monitoramento do sulfeto durante o processo de fermentação (YUAN &
KURIYAMA, 2000, p. 795). De acordo com a concentração do analito, a detecção é
espectrofotométrica, já que este método possibilita a determinação de baixas concentrações de
28
sulfeto. Na equação, da reação química acima, o azul de metileno em linha é conduzido ao sistema
de detecção.
4.4 Amostras
As amostras fermentadas de caldo de cana foram preparadas nos Laboratórios de Bioquímica
da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, ESALQ/USP, sob a supervisão do Prof. Dr. Luis
Carlos Basso. As fermentações foram realizadas utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae.
Foram pesados 5,0 g de fermento, e adicionado 15 mL de água e 30 mL de mosto, o qual possuía 20%
de açúcares redutores totais, através dessa solução iniciou-se o processo de fermentação. Tais
valores utilizados de fermento, água e mosto estão de acordo com os parâmetros utilizados na
fermentação industrial. Na figura 4, observa-se o processo de fermentação ocorrendo.
Figura 4. Processo de fermentação em andamento
29
Fonte: Laboratório de Bioquímica da ESALQ/USP. Piracicaba – 2010.
4.5 Metodologia Desenvolvida
Os métodos utilizados envolveram difusão gasosa em linha e detecção espectrofotométrica
no UV-Vis.
Foi estudada a influência dos principais parâmetros envolvidos no método de análise, tais
como: volume de amostra, tamanho do reator, temperatura, vazão, concentração dos reagentes, pH
do ambiente reacional e intervalos de tempo disponíveis para o desenvolvimento das reações.
Também estimou-se as principais características dos métodos envolvidos: exatidão e frequência
analítica; faixa útil de concentrações; limites de determinação; dispersão da amostra; consumo de
reagentes; repetibilidade das medidas; e linearidade de curva analítica.
4.6 Funcionamento do Sistema FIA
O diagrama do sistema de análises por injeção em fluxo com câmara de difusão gasosa (FIA)
utilizado para determinar sulfeto nas amostras coletadas após o processo fermentativo é mostrado
na Figura 6. A solução de sulfeto (amostra), de 500 microlitros, foi introduzida no fluxo transportador
com auxílio de um injetor-comutador. Água deionizada fluindo a 0,5 mL min-1 foi usada como fluxo
transportador.
O fluxo doador (HCl) é adicionado no ponto de confluência X a 0,42 mL min-1. O fluxo aceptor
de 0,01 mol L-1 NaOH é adicionado após a primeira bobina reacional a 0,8 mL min-1. O comprimento
da membrana de difusão gasosa para a permeação de sulfeto foi de 7 cm. A solução de sulfeto foi
injetada e transportada pelo fluxo transportador, interagindo com a solução de ácido clorídrico (HCl)
para formar gás sulfídrico (H2S) que permeou a membrana.
A solução 0,06 mol L-1 Fe(III) em 1,0 mol L-1 HCl fluindo a 0,096 mL min-1 e a solução 2,0 mol L1
DMPD em 1,0 mol L-1 HCl fluindo a 0,096 mL min-1 foram introduzidas na confluência Y. Na segunda
bobina de reação o fluxo aceptor (NaOH) coletou o sulfeto como H2S, o qual reagiu com Fe(III) e
30
DMPD, formando o azul de metileno. Este foi medido a 668 nm (freqüência de radiação
eletromagnética na faixa) no detector espectrofotométrico.
Figura 6. Esquema do sistema de análises por injeção em fluxo
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa
A = amostra ou solução padrão; C = fluxo transportador (água); L = alça de amostragem; R1 = HCl; R2 =
NaOH; R3 = FeCl3 + DMPD; B1 e B2 = bobinas reacionais; E: detector espectrofotométrico.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS QUÍMICAS E FÍSICAS
Foram analisadas todas as variáveis químicas e físicas do Sistema FIA, tais como:
comprimento da alça de amostragem, comprimento das bobinas de reação, volume da amostra,
vazão da bomba, vazão do fluxo transportador, vazão de HCl, vazão de NaOH, vazão dos reagente
Fe(III)/DMPD, concentração de HCl, concentração de NaOH, concentração de Fe(III), concentração de
HCl na presença de Fe(III), concentração de DMPD, concentração de HCl na presença de DMPD e
temperatura. Através desta análise observou-se quais os melhores parâmetros aplicando-os na
otimização do sistema FIA para a determinação de sulfeto em mostos fermentados de cana.
5.1.1 Comprimento da alça de amostragem
31
Com relação à influência do tamanho da alça de amostragem foi verificado que um aumento
no comprimento aumenta a sensibilidade do método, como se pode observar no Gráfico 1. O
comprimento da alça de amostragem selecionado foi de 50 cm. É importante citar que um aumento
exagerado do comprimento da alça de amostragem pode reduzir a sensibilidade do método, pois
favorece a dispersão da amostra.
Estudo da alça de amostragem
0,040
0,035
Abs
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
cm
Gráfico 1. Variação do tamanho da alça de amostragem
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.2 Comprimento das bobinas de reação (reatores)
O sistema foi composto por duas confluências e, por conseguinte, foram escolhidas duas
bobinas de reação. Foram realizados vários estudos referentes ao tamanho dessas bobinas, variando
de 20 até 110 cm (Gráfico 2). Os tamanhos de bobinas de reação selecionados foram de 50 cm e de
75 cm, pois obtiveram um bom sinal analítico.
É importante citar que um aumento exagerado do comprimento dos reatores pode reduzir a
sensibilidade do método, pois favorece a dispersão da amostra.
32
Estudo da bobina reacional
0,050
0,045
0,040
0,035
Abs
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
cm
Gráfico 2. Variação do tamanho das bobinas de reação
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.3 Volume da amostra
O volume de amostra foi variado entre 125 e 1000 µL, alterando-se o comprimento da alça
de amostragem no injetor. Os sinais analíticos aumentaram quando o volume de amostra variou
entre 125 e 625 µL, mas não foi observado incremento para maiores volumes da amostra. Sendo
assim, optou-se por utilizar um volume de amostra de 625 µL (Gráfico 3).
33
0,026
0,024
0,022
Abs
0,020
0,018
0,016
0,014
0,012
0,010
125
250
375
500
625
750
875
1000
volume de amostra injetado/ uL
Gráfico 3. Variação do volume da amostra.
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.4 Vazão (velocidade) da bomba
Na determinação do sulfeto, baseado nos estudos realizados, observou-se que a redução da
vazão resulta em aumento do tempo de permanência da amostra no sistema e, consequêntemente,
em picos registrados mais largos. Em menores vazões é possível captar mais facilmente os resultados
no espectrofotômetro, isto se deve aos efeitos combinados do aumento do intervalo de tempo para
o desenvolvimento da reação e para o processo de difusão gasosa (dispersão do sulfeto).
O sinal analítico diminui com o aumento da vazão. Deste modo, quanto mais lento o fluxo
doador (HCl) maior será a difusão do analito de interesse. O analito permanecerá mais tempo na
célula de fluxo, portanto o fluxo aceptor (NaOH) também não pode ser rápido. O fato da velocidade
da bomba ser preferencialmente lenta é característico de sistemas que utilizam difusão gasosa.
5.1.4.1 Vazão do fluxo transportador (água)
34
Com o aumento da vazão houve uma redução significativa nos sinais analíticos, como podese observar no Gráfico 4. Foram observadas as vazões na faixa de 0,2 à 0,8 mL min-1. Apesar do fluxo
em 0,2 mL min-1 apresentar a maior absorbância, foi selecionado o valor 0,6 mL min-1, sem
comprometer os resultados das amostras já que a variação de absorbância é baixa, enquanto que a
frequência analítica aumentará significativamente.
Gráfico 4. Variação da vazão da solução transportadora
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.4.2 Vazão de R1 (HCl)
A vazão da solução doadora (HCl) influenciou significativamente o resultado analítico, pois é
de fundamental importância para ajustar a sensibilidade analítica. Quanto menor a vazão da solução,
35
maior a sensibilidade, mais o gás sulfídrico (H2S) se difunde através da membrana. Para uma solução
4,0 mg L-1 S2- variou-se esta vazão de 0,16 até 0,8 mL min-1, como pode-se observar no Gráfico 5. O
valor selecionado foi de 0,42 mL min-1, pois apresentou melhor sinal analítico.
0,058
0,056
Abs
0,054
0,052
0,050
0,048
0,046
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Fluxo doador / ml m-1
Gráfico 5. Variação da vazão de R1.
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.4.3 Vazão de R2 (NaOH)
36
A vazão do fluxo aceptor (NaOH) foi estudada na faixa de 0,42 e 1,6 ml min-1 (Gráfico 6). Foi
definido o valor de 0,8 ml min-1 como sendo o mais apropriado, pois apresentou maior absorbância.
0,12
0,10
Abs
0,08
0,06
0,04
0,02
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
-1
Fluxo aceptor/ ml m
Gráfico 6. Variação da vazão de R2
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.4.4 Vazão de R3
37
Foi estudada a vazão do reagente R3 (Fe(III) / DMPD) entre 0,032 e 0,128 ml min-1 (Gráfico 7).
A vazão selecionada foi de 0,096 ml min-1 , pois apesar de não apresentar a maior absorbância, não
comprometeu os resultados das amostras, e aumentou significativamente a frequência analítica do
sistema.
Estudo da vazão dos reagentes Fe(III)/ DMPD
0,20
0,18
0,16
Abs
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
-1
mL m
Gráfico 7. Variação da vazão de R3
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
38
5.1.5 Concentração
A concentração dos reagentes tem grande influência na absorbância, a qual diminui ou
aumenta dependendo do tipo de reagente e sua concentração.
5.1.5.1 Concentração de R1 (HCl)
Foi estudada a influência da concentração de HCl na faixa entre 0,25 e 2,5 mol L -1, como
pode-se observar no Gráfico 8. Os valores que obtiveram maior sinal analítico foram de 0,5 e 1,0 mol
L-1, sendo a concentração de 0,5 mol L-1 a escolhida.
0,145
Abs
0,140
0,135
0,130
0,125
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
HCl / mol L-1
Gráfico 8. Variação da concentração de R1
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
39
5.1.5.2 Concentração de R2 (NaOH)
A influência da concentração de hidróxido de sódio (NaOH) no fluxo aceptor foi estudada na
faixa entre 0,005 e 0,1 mol L-1 (Gráfico 9). O sinal de absorbância obteve um aumento elevando a
concentração de NaOH até 0,01 mol L-1. Para a concentração de 0,005 mol L-1 o sinal de absorbância
apresentou-se maior, porém não seria viável utilizar uma concentração tão pequena. Desta forma,
utilizou-se a concentração de 0,01 mol L-1, a qual apresentou ótima sensibilidade. Para maiores
concentrações houve um decréscimo na absorbância.
0,182
0,180
Abs
0,178
0,176
0,174
0,172
0,170
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
NaOH / mol L-1
Gráfico 9. Variação da concentração de R2
0,10
0,12
40
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.1.5.3 Concentração de Fe(III)
Variou-se a concentração do Fe(III) de 0,02 até 0,10 mol L-1. Enquanto que a concentração do
HCL foi mantida em 0,5 mol L-1. A concentração de Fe(III) selecionada foi de 0,06 mol L-1 , pois
apresentou maior absorbância (Gráfico 10).
0,195
0,190
0,185
Abs
0,180
0,175
0,170
0,165
0,160
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Fe3+/ mol L-1
Gráfico 10. Variação da concentração do Fe(III)
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
41
5.1.5.4 Concentração de HCl na presença de Fe(III)
Variou-se concentração do HCl de 0,0 até 3,0 mol L-1, como pode-se observar no Gráfico 11. A
concentração que apresentou melhor sinal analítico foi de 1,0 mol L-1, sendo a escolhida.
42
0,250
0,245
0,240
Abs
0,235
0,230
0,225
0,220
0,215
0,210
0,0
0,5
1,0
1,5
3+
HCl/Fe
2,0
2,5
3,0
-1
mol L
Gráfico 11. Variação da concentração do HCl na presença de Fe(III)
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
43
5.1.5.5 Concentração de DMPD
Foram realizados testes com diferentes concentrações de DMPD, variando-se entre 0,44 e 15
mol L-1 (Gráfico 12). A concentração escolhida, apresentando melhor viabilidade e boa absorbância
foi de 2 mol L-1.
0,055
0,050
0,045
Abs
0,040
0,035
0,030
0,025
0,020
0,015
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
DMPD/ mol L-1
Gráfico 12. Variação da concentração de DMPD
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
44
5.1.5.6 Concentração de HCl na presença de DMPD
Utilizou o HCl como meio ácido, pois este ácido é comumente utilizado já que é facilmente
purificado. Variou-se a concentração de HCl de 0,5 até 2,5 mol L-1, fixando-se a concentração do
DMPD em 250 mgL -1 (Gráfico 13). A concentração de HCl que apresentou maior absorbância foi de
1,0 mol L-1, sendo a selecionada. Tal concentração garantiu que o sulfeto presente na amostra fosse
convertido à forma gasosa.
0,042
0,040
Abs
0,038
0,036
0,034
0,032
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
HCl/DMPD mol L-1
Gráfico 13. Variação da concentração de HCl na presença de DMPD
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
45
5.1.6 Temperatura
Variou-se a temperatura entre 5 e 50ºC, visando avaliar o desenvolvimento das reações em
diferentes temperaturas. Temperaturas abaixo de 5ºC não apresentavam variações significativas, e
temperaturas acima de 50ºC foram consideradas indesejáveis pelo fato de haver formação excessiva
de bolhas que, ao passarem pelo detector, prejudicavam a mensuração do sinal analítico. A câmara
de difusão gasosa foi imersa em um banho de água (“banho maria”) com temperatura controlada.
Após cada ajuste de temperatura, esperava-se aproximadamente 5 minutos para que o equilíbrio
térmico fosse alcançado.
Apesar de que pequenas variações nos valores de absorbância puderam ser observadas, a
temperatura não exerceu grande influência (gráfico 14). A temperatura selecionada, portanto, foi de
30ºC a qual foi ajustada pelo sistema de condicionamento de ar do laboratório de química analítica
onde o estudo foi realizado.
46
0
Temperatura C
0,040
0,035
0,030
Abs
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
10
20
30
40
50
oC
Gráfico 14. Variação da temperatura
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
5.2 Parâmetros estudados e selecionados na otimização do Sistema FIA
O efeito das variáveis como vazões dos fluxos doador, aceptor e de reagentes, e o volume da
amostra, foram investigados considerando as condições de melhor compromisso entre a intensidade
de absorbância, repetibilidade e frequência analítica. Os intervalos estudados e os valores
selecionados são apresentados na tabela abaixo:
Tabela 1. Parâmetros químicos e físicos estudados e selecionados na otimização do sistema.
Parâmetros estudados
Faixa
Selecionado
47
Comprimento da alça de amostragem (cm)
20 – 110
50
Comprimento das bobinas de reação (cm)
20 – 110
50 e 75
Volume da amostra (ml)
125 - 1000
625
Vazão do fluxo transportador (mL min-1)
0,2 – 0,8
0,6
Vazão de R1 (mL min-1)
0,16 – 0,8
0,42
Vazão de R2 (mL min-1)
0,42 – 1,6
0,8
Vazão de R3 (mL min-1)
0,032 – 0,128
0,096
Concentração de R1 (mol L-1)
0,25 – 2,5
0,5
Concentração de R2 (mol L-1)
0,005 – 0,1
0,01
Concentração de Fe(III) (mol L-1)
0,02 – 0,1
0,06
Concentração de R1 na presença de Fe(III) (mol L-1)
0,1 – 3,0
1,0
Concentração de DMPD (mol L-1)
0,44 – 15
2,0
Concentração de R1 na presença de DMPD (mol L-1)
0,5 – 2,5
1,0
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
48
5.3 Curva analítica
A curva analítica serve para a verificação da faixa linear do método proposto. Adotando-se as
condições especificadas na Tabela 1, a curva analítica foi linear no intervalo de concentrações entre
0,25 e 6,0 mg L-1 S2-.
O limite de detecção foi estimado como 0,043 mg L-1 (três desvios-padrão da inclinação /
branco da curva analítica) e o coeficiente de variação referente à solução de sulfeto injetada de 4,0
mg L-1 foi de 2,18%, isto após 20 determinações (n = 20). A freqüência analítica foi de 15
determinações por hora. A relação entre absorbância e concentração de sulfeto é indicada no gráfico
16.
mg L-1 S2Gráfico 16. Curva analítica (relação entre absorbância e concentração de sulfeto)
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
49
5.4 Concentração de sulfeto obtida
Neste trabalho a concentração de sulfeto durante a fermentação foi experimentalmente
monitorado. Foi coletada uma alíquota de hora em hora para monitorar a quantidade de sulfeto
produzido durante a fermentação, e verificou-se que após 4 horas a produção de sulfeto estagnouse.
O teor máximo de sulfeto produzido foi de 0,4 mg L-1, ou seja, 400 g L-1, após 4 horas de
fermentação (Gráfico 15). Esta quantidade de sulfeto obtida esta fora dos parâmetros ideais, já que
concentrações superiores a 50 g L-1 S2- é considerado preocupante, conferindo aroma desagradável
às bebidas. Este monitoramento é de suma importância no controle da fermentação visando
produção de etanol, pois permite verificar a qualidade de uma levedura. No caso estudado a
levedura apresentou-se ruim, havendo a necessidade de passar por um tratamento específico.
50
Gráfico 15. Registro do monitoramento da fermentação
Fonte: Baseado nos resultados da pesquisa. CENA/USP (Piracicaba, 2010)
6. CONCLUSÃO
O sistema de análise por injeção em fluxo, explorando difusão gasosa, para a determinação
espectrofotométrica de sulfeto demonstrou viabilidade e pode ser sugerido para a análise de sulfeto
em mostos fermentados, e consequente seleção de leveduras em função da produção de sulfeto.
Todos os parâmetros investigados neste trabalho indicaram que o método é potencialmente
aplicável, principalmente devido a sua característica de simplicidade operacional, praticidade,
velocidade analítica e versatilidade, conduziu-se com êxito o sistema FIA.
51
REFERÊNCIAS
ALVES, E.R.; FORTES, P.R.; BORGES, E.P.; ZAGATTO, E.A.G. Spectrophotometric flowinjection determination of total reducing sugars exploiting their alkaline degradation.
Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v. 564, p. 231-235, 2006.
ALVES, E.R.; BORGES, E.P.; BARROS, V.A.F.; .ZAGATTO, E.A.G. Determinação de açúcares redutores
totais empregando sistemas de análises por injeção em fluxo: aplicação a amostras de relevância
sucro-alcooleira. Revista Analytica, São Paulo, ed. 19, p. 74-77, 2005.
ARRHENIUS, S.A. Ácidos e Bases, conceito de Arrhenius.
Disponível em:
http://www.portoseguro.cefetba.br/doc_professores/marucs_bandeira/quimica_organica/AULA%20
03-TEORIAS%20%20%20%20%20%20%C3%81CIDO%20BASE.pdf. Acesso em: 12/mar/2011.
52
ATKINS, P; PAULA. J.de. Físico-Química. v.2. Rio de Janeiro, 2004.
BERRY, D.R. Alcoholic beverage fermentations. Fermented beverage production. London: Blackie
Academic & Professional, 1995. p. 32-44.
BORGES, E. Publicação eletrônica [concentração de sulfeto em leveduras]. Mensagem recebida por <
[email protected] > em 06/maio/2011.
COPERSUCAR.
Academia
do
açúcar
e
do
álcool.
Disponível
\\www.copersucar.com.br\instuticional\por\academia\moderna_agroind.asp. São
Acesso em: 18/fev/2011.
em:
Paulo,
http:
2008.
CRUZ, L. P. S.; CAMPOS, P. V. Métodos de amostragem e análise para compostos reduzidos de
enxofre atmosférico. Quím. Nova, vol.31, no.5. São Paulo, 2008.
FANG, Z.L. Flow injection separation and preconcentration. Weinheim: VCH, 1993.
FERRER, L.; ESTELA, J.M.; CERDÀ, V. A smart multisyringe flow injection system for analysis of sample
batches with high variability in sulfide concentration. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v. 573574, p. 391-398, 2006.
GIBSON, G. R. "Physiology and Ecology of the Sulfate-Reducing Bacteria." Journal of Applied
Bacteriology, v. 69, p. 769-797, 1990.
GUTIERREZ, L.E. Bioquímica de leveduras. Piracicaba: ESALQ\USP, 1997.
HARRIS, D.C. Fundamentos de Espectrofotometria. Análise Química Quantitativa, China Lake, v. 6, p.
398-434, 2005.
HENNEINE, F.I. Biofísica Básica. Editora Atheneu. São Paulo, 2006.
KRUG, F.J.; BERGAMIN, H.; ZAGATTO, E.A.G. Commutation in flow injection analysis. Analytica
Chimica Acta, Amsterdam, v. 179, p. 103-118, 1986.
LAWRENCE, N. S.; DAVIS, J.; COMPTON, R. G.; Analytical strategies for the detection of sulfide: a
review. Talanta 2000, Volume 52, pag 771.
LIMA, U.A.; BASSO, L.C.; AMORIM, H.V. Biotecnologia industrial: processos fermentativos e
enzimáticos. São Paulo: Edgard Blücher, 2001. v. 3, p. 1-43.
MENESES, S.R.P. Monitoramento de espécies químicas produzidas durante a fermentação alcoólica
utilizando sistemas de análises em fluxo. 2008. 58 p. Tese (Doutorado em Ciências) - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2008.
RABUS, R., HANSEN, T.A., e WIDDEL, F., Dissimilatory Sulfate- and SulfurReducing Prokaryotes. In: DWORKIN, M., FALKOW, S., ROSENBERG, E., SCHLEIFER, K., e
STACKEBRANDT, E., (Editores). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria. 3a. ed. New
York, NY: Springer Science+business Media, Llc; 2006, v. 2, p. 659-768.
53
RATH, S. Determinação de traços de enxofre orgânico e elementar, através de redução a
sulfeto pelo níquel de Raney e detecção por voltametria de redissolução catódica.
Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP. Campinas, SP, Brasil, 1986.
REIS, B.F.; JACINTO, A.O.; MORTATTI, J.; KRUG, F.J.; ZAGATTO, E.A.G.; BERGAMIN FILHO, H.; RUZICKA,
J.; HANSEN, E.H. Flow injection analysis. 2. ed. New York: Wiley-Interscience, 1988.
RUZICKA, J.; HANSEN, E. Flow injection analysis: Part I. A new concept of fast continuous flow
analysis. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v. 78, p. 145-157, 1975.
SANDRES, G. C. & MAINIER, F. B. Sistema de gestão integrado interno contra
vazamentos acidentais de sulfeto de hidrogênio (H2S) em refinarias de petróleo. Niterói,
2009.
SILVA, C.R. Desenvolvimento de procedimentos analíticos limpos para determinação de cloreto e
demanda química de oxigênio em águas. São Carlos, 2004.
TROJANOWICZ, M. Flow injection analysis: instrumentation and applications. Singapura: World
Scientific, 2000.
WALKER, G.M. Yeast physiology and biotechnology. New York: Wiley, 1998.
YUAN, Y.J.; KURIYAMA, H. Determination of hydrogen sulfide in a yeast culture solution by flow
analysis utilizing methylene blue spectrophotometric detection. Biotechnology Letters, Kew, v. 22, p.
795-799, 2000.