O processo de replicação do DNA

Replicação do DNA
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Mitose / Meiose
Como acontece a síntese do
DNA?
Meselson-Stahl experiment
• 1957
• Cresceram E. coli em meio
com N-15 e depois voltaram
pra N-14
• Purificação do DNA das
bactérias
• Três tipos de DNA
– N-15 + N-15
– N-15 + N-14
– N-14 + N-14
• Ao aquecer o N-15 + N-14 e
separar as fitas ficava claro
que uma fita continha N-15 e
outra N-14
Replicação semi-conservativa
Origens de replicação
• Locais com um
contexto de
sequência específico
• Ligam proteínas
específicas
• Quando acionadas,
essas proteínas
permitem o início da
replicação
Origens de replicação
Replicação
• DNA Polimerase III
• Sentido 5’ → 3’
• Nucleotídeos 3P
são adicionados
– Liberação de
Pirofosfato
http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf
Primase
• Ribonucleoproteína
• Liga-se à helicase em
procariotos formando o
chamado primossomo
• Sintetiza um primer de
RNA contendo
aproximadamente 11
bases; fornece 3’ OH
• DNA polimerase lenta e
sujeita a erros
• Evita a progressão da
forquilha uma vez que a
fita líder anda mais rápido
Micrografia, bolha de
replicação
Forquilhas de replicação
Forquilha de replicação
Replicação das fitas
• Fita líder
– Primase age uma vez
• Fita retardada
– Primase age várias vezes
– 1967, Fragmentos de Okasaki
Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication
possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967
Jun;20(3):255-60
Primase na fita retardada
• Deslocamento da forquilha de replicação
• Primase faz primer
Direções de
replicação na Forquilha
Desenovelamento do DNA
• Retirada das histonas
• Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)
• DNA helicase
– Quebra pontes de H
• DNA topoisomerases
– Tiram a tensão
Forquilha de replicação
Polaridade da síntese define fitas
líder e retardada (descontínua)
DNA polimerase
• Enzimas que catalisa a reação
de síntese do DNA
• Adiciona nucleotídeos trifosfato à extremidades 3’OH
livre
• Alongamento da cadeia de
DNA sempre é feito na direção
5’>3’ (endonuclease 5’>3’)
• Incapaz de fazer DNA do zero
(precisa ter extremidade 3’OH
livre)
• Possui mecanismo de
correção de erros
(exonuclease 3’>5’)
Tipos de DNA polimerase
• DNA polimerase I
– Descoberta em 1956 (Kornberg pai)
– Função precisa descoberta apenas em 1969: remove
o primer de RNA da fita descontínua
• DNA polimerase III
– Descoberta em 1970 (Kornberg filho)
– Principal enzima que realiza a replicação em
procariotos
• DNA polimerase II
– Lenta, envolvida em reparo do DNA
DNA Replication
• DNA Pol precisa de um
molde inicial
• Primase: gera um molde
de RNA complementar
• A DNA Pol III agora é
capaz de adicionar bases
à extremidade 3’OH
Eliminação
dos
fragmentos
de Okasaki
DNA Pol I
Mecanismo da enzima Ligase
Visão geral
Repare na
posição do
primer de
RNA
Reparo pela
Polimerase
• Mecanismo de verificação
(Proof-reading)
• DNA-polimerase possui
– Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’
– Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’
Reparo pela
Polimerase
• Mecanismo de verificação
(Proof-reading)
• DNA-polimerase possui
– Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’
– Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’
DNA
Repair
• Checagem de
pareamento
incorreto
(eucariotos)
• Proteínas
especiais para
reparo do erro
E as extremidades dos cromossomos?
Doenças causadas por problemas
no mecanismos de replicação
• Ataxia de Friedreich's
– dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares,
na fala e doenças no coração)
– forma mais comum das ataxias herdadas
– A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40
repetições, o indivíduo apresenta a doença.
• Xeroderma pigmentosum
– envelhecimento precoce
– aumento na incidência de câncer
– Falha no mecanismo de reparação
do DNA causado pela luz UV
Ciclo celular
• A replicação do DNA
é regulada
temporalmente
• Fase S do ciclo
celular
• Checkpoints do ciclo
celular
• Ciclinas
Conclusões
•
•
•
•
•
•
•
•
Replicação semi-conservativa
Bolha de replicação avança em duas direções
Fita líder e fita retardada
Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA
Primase faz o primer
DNA polimerase III, DNA polimerase I
DNA ligase
Telomerase