10. biologia molecular

10. BIOLOGIA MOLECULAR
10.1 Orientações gerais de coleta e transporte das amostras em relação
ao exame solicitado
EXAMES
MATERIAL BIOLÓGICO
ONDE COLHER
Pesquisa qualitativa do vírus da
Hepatite C (PCR)
sangue (plasma)

em tubo de coleta a vácuo
com EDTA (5 ml)
Teste de Quantificação de Carga
Viral do HIV
sangue (plasma)

em tubo de coleta a vácuo
com EDTA (5 ml)
Teste de Quantificação de Carga
Viral do HCV
sangue (plasma)

em tubo de coleta a vácuo
com EDTA (5 ml)
Genotipagem do HIV
sangue (plasma)

em 2 tubos de coleta a vácuo
com EDTA (2 x 5 ml)
Genotipagem do HCV
sangue (plasma)

em 2 tubos de coleta a vácuo
com EDTA (2 x 5 ml)
10.2 Orientações específicas de coleta, processamento e transporte
10.2.1 HIV Quantitativo (Carga Viral)
10.2.1.1 Coleta da amostra
a) Para os exames de Carga Viral não é necessário jejum ou qualquer
preparo especial do paciente. Entretanto, deve-se evitar a coleta,
após ingestão de alimentos gordurosos nas últimas 3 horas;
b) A amostra clínica é o plasma;
c) Coletar o 5 ml de sangue total em tubos vacuteiner com EDTA;
d) Para a obtenção do plasma, centrifugar o sangue total a 3000 rpm
durante 5 minutos. Não use plasma não centrifugado (separado após
repouso espontâneo) ou hemolizado; não use plasma com vestígios
de sangue;
e) Volume de plasma necessário para o teste: 1 ml (exatamente);
f) O tempo de viabilidade da amostra é aproximadamente de 2 horas
após a coleta do sangue total, durante este período a amostra deve
ser centrifugada o mais rápido possível para evitar que o plasma
fique em contato com as células sanguíneas;
10.2.1.2 Preparo da amostra no Tampão de Lise
a) O Tampão de Lise (Lysis Buffer) faz parte do conjunto de reagentes
utilizados no processamento da amostra no teste de Carga Viral e é
fornecido pelo LACEN;
b) Após o procedimento de coleta, acima citado, a amostra deve ser
processada e colocada no Tampão de Lise no prazo de viabilidade
da mesma;
c) Utilizando luvas novas e limpas;
d) Retirar o Tampão de Lise da geladeira;
e) Agitar e colocar em Banho-Maria a 37ºC por 30 minutos para
dissolução completa dos cristais. Agitar por inversão várias vezes e
verificar contra a luz até o desaparecimento dos cristais. Não use os
tampões com cristais devido a perda funcional;
f) Identificar os tubos com nome, data e hora da coleta;
g) Centrifugar os Tampões por um minuto a 2500 rpm para a retirada do
excesso de líquido na tampa;
h) Pipetar 1 ml de plasma para o tubo de Tampão de Lise utilizando
micropipetas automáticas com ponteiras com barreira, descartáveis,
livres de RNAse e DNAse;
i) Homogeneizar os tubos por inversão ou em agitador;
10.2.1.3 Conservação da Amostra e transporte
a) A amostra em Tampão de Lise deve ser conservada em geladeira (2
a 8ºC) até o momento do processamento, por um período de até 5
dias;
b) Após este período, deve ser mantido em freezer –80ºC por tempo
indeterminado;
c) O transporte deve ser realizado sob refrigeração, no prazo máximo
de 5 dias.
d) NUNCA manter a amostra em Tampão de Lise em freezer com
temperatura de -20ºC.
10.2.2 HIV Genotipagem
10.2.2.1 Coleta da amostra
a) Para os exames de Genotipagem não é necessário jejum ou
qualquer preparo especial do paciente. Entretanto, deve-se evitar a
coleta, após ingestão de alimentos gordurosos nas últimas 3 horas;
b) A amostra clínica utilizada é o plasma;
c) Coletar o sangue total em tubos a vácuo com EDTA – 2 amostras de
5ml de sangue total (total 10ml);
d) Para a obtenção do plasma, centrifugar o sangue total a 1500 rpm
durante 10 minutos. Não usar plasma não centrifugado (separado
após repouso espontâneo) ou hemolizado; não usar plasma com
vestígios de sangue.
10.2.2.2 Preparo da amostra, conservação e transporte
a) Utilizar microtubos, estéreis, livres de RNAse e DNAse, de
preferência com tampa de rosca, próprios para o congelamento;
b) Identificar os tubos com o nome do paciente, data e hora da coleta;
c) Utilizar luvas novas e limpas para manipular os tubos e a amostra;
d) Transferir o plasma para os microtubos utilizando micropipetas
automáticas com ponteiras com barreira, descartáveis, livres de
RNAse e DNAse;
e) Distribuir o total de plasma obtido em alíquotas de aproximadamente
1 ml por microtubo;
f) Manter os microtubos armazenados a 4ºC até o momento de envio
ao laboratório, mantidos a -20ºC no prazo máximo de 2 dias;
g) Acondicionar individualmente os tubos em sacos plásticos
transparentes e com boa vedação;
h) Encaminhar as amostras para o LACEN/SC em caixa de isopor,
contendo 4 unidades de gelo reciclável congelados;
i) Após período de 2 dias a -20ºC, a amostra se não processada pode
ser mantida no freezer –80ºC até o momento da reação por tempo
indeterminado.
10.2.3 Testes Qualitativos, Quantitativos (Carga Viral) e Genotipagem do
RNA do
HCV
10.2.3.1 Coleta e preparo da amostra
a) Não é necessário jejum ou qualquer preparo especial do paciente.
Entretanto, deve-se evitar a coleta, após ingestão de alimentos
gordurosos nas últimas 3 horas;
b) Coletar 5 ml de sangue total, específico para os exames de biologia
molecular, em tubo a vácuo com EDTA e gel separador. Centrifugar
e encaminhar diretamente ao laboratório;
c) Nos casos onde não for possível usar tubos com gel separador,
colher em tubo a vácuo, com EDTA (não usar HEPARINA como
anticoagulante);
d) Para a obtenção do plasma, centrifugar o sangue total a 1500 rpm
por 20 minutos. Não usar plasma não centrifugado (separado após
repouso espontâneo) ou hemolizado; não usar plasma com vestígios
de sangue;
e) Identificar o tubo com nome, tipo do exame, origem e data da coleta;
Nota:
É importante que a amostra seja específica para os testes quantitativo,
qualitativo e genotipagem do HCV para que não haja manuseio e
conseqüentemente contaminação da amostra e o resultado seja confiável.
10.2.3. 2 Armazenamento da Amostra
a) A amostras de plasma podem ser armazenadas em geladeira (2 a
8ºC) durante até 72 horas, ou congelada a –70ºC;
Notas Importantes:
 Se não existir freezer –70ºC, o sangue não pode ser congelado a –
20ºC, devendo ser enviado ao LACEN, o mais rápido possível, dentro
do período das 6 horas após a coleta.
 As amostras de plasma só podem ser submetidas a dois ciclos de
congelamento e descongelamento, sem perda do RNA-HCV.
10.2.3.3 Transporte da amostra
a) O sangue total deve ser transportado ao laboratório entre 2 e 25ºC,
se houver tempo para ser processado até 6 horas após a coleta;
b) O plasma deve ser transportado entre 2 e 8ºC.
Notas:
 Nunca utilizar tubos de coleta reciclados;
 Nunca utilizar microtubos e ponteiras reciclados;
 As amostras de plasma que chegarem ao LACEN/SC com pacotes
de gelo reciclável à temperatura ambiente serão descartadas como
inadequadas.
10.2.4 Condições para Solicitação de Testes Bio-moleculares para
Hepatite C
CASO
CONDIÇÕES
Genotipagem
Resultado do Teste PCR-Qualitativo
Resultado da Biópsia ou Avaliação Médica
Requisição: laudo médico para emissão de
APAC (Ver item 10.2.4.1)
PCR-Quantitativo (Indicação de
tratamento) se Genótipo 1
Resultado da biópsia
Requisição do laudo médico para emissão de
APAC (Ver item 10.2.4.1)
PCR-Quantitativo para monitorar
tratamento
Requisição de laudo médico para emissão de
APAC (Ver item 10.2.4.1)
PCR-Qualitativo para monitorar
tratamento
Requisição de laudo médico para emissão de
APAC (Ver item 10.2.4.1)
Diagnóstico (PCR-HCV Qualitativo)
Número da notificação
Resultado de Anti-HCV
Requisição: laudo médico para emissão de
APAC (Ver item 10.2.4.1)
10.2.4.1 Requições de APAC, específicas para Hepatite C
Requisição de APAC para Genotipagem do HCV – pág. 89
Requisição de APAC para Teste Quantitativo do HCV – pág. 90
Requisição de APAC para Teste Qualitativo do HCV – pág. 91