Estudo da participação da via de sinalização dependente de ERK5

Transcrição

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Estudo da participação da via de sinalização
dependente de ERK5 na polarização de macrófagos
M2 induzida por IL-4
João Paulo Mesquita Luiz
Ribeirão Preto
2015
João Paulo Mesquita Luiz
Estudo da participação da via de sinalização
dependente de ERK5 na polarização de macrófagos
Dissertação apresentada ao Programa de
pós-graduação em Imunologia Básica e
Aplicada da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São
para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Farias Alves-Filho
Ribeirão Preto
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Luiz, João Paulo Mesquita
Estudo da participação da via de sinalização dependente de ERK5 na
polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. Ribeirão Preto, 2015.
90 p.
Dissertação de mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Programa de Pós-Graduação
em Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Alves-Filho, José Carlos Farias.
1. Macrófagos; 2. Polarização; 3. IL-4; 4. M2; 5. ERK5
FOLHA DE APROVAÇÃO
JOÃO PAULO MESQUITA LUIZ
ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO
DEPENDENTE DE ERK5 NA POLARIZAÇÃO DE MACRÓFAGOS M2
INDUZIDA POR IL-4
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Imunologia Básica e Aplicada da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade São Paulo como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre em Ciência.
Área de concentração: Imunologia
Banca examinadora
________________________________________
Prof. Dr. José Carlos Farias Alves-Filho
FMRP-USP
________________________________________
Profª. Drª. Vânia Luiza Deperon Bonato
FMRP-USP
________________________________________
Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara
ICB-USP
Trabalho realizado no Laboratório de Inflamação e Dor do Departamento
de Farmacologia e associado ao Programa de pós-graduação em Imunologia
Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade
de São Paulo, com auxílio financeiro da CAPES e do CNPq.
“Eu defendo uma maneira pessoal de viver com sobriedade,
porque para viver é preciso ter liberdade
e para ter liberdade devemos ter tempo ..."
José Mujica, o Pepe - Ex-presidente do Uruguai
DEDICATÓRIA
À minha amada família:
Meus pais, Ilaine e Paulo Edgar
Minha irmã Juliane
Ao meu avô Olindor
Minha eterna gratidão pelo seu amor,
dedicação, paciência, incentivo e apoio incondicional.
Agradeço muito a vocês pela ótima vida que me deram.
Obrigado por tudo!
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. José Carlos pela orientação, confiança e ensinamentos que auxiliaram meu
crescimento profissional e intelectual.
Ao Prof. Fernando Cunha, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório e pela
competência cientifica.
A Drª. Priscilla Tartari, Paula Viacava e a Drª. Daniele Nascimento pela colaboração e
execução do presente trabalho.
Aos colegas de laboratório, por proporcionarem discussões produtivas e um ótimo ambiente
de trabalho.
Aos membros da banca, pela atenção e disponibilidade em participar da minha banca
examinadora.
Aos técnicos do Laboratório de Infalmação e Dor: Giuliana, Diva, Kátia, Ieda e Marquinhos,
por todo apoio e companheirismo.
A todos os docentes e funcionários do Programa de pós-graduação em Imunologia Básica e
Aplicada.
Aos amigos da USP: André (capaz), Annie, Flávio, Paula, Rafael (Ferrerinha), Cássia,
Vanessa, Douglas, Paulo, Caio, Rafael (Panda), Alexandre (Kanashiro), Rangel, Priscilla,
Daniele, pelos bons momentos de discussão cientifica e descontração.
Aos amigos Lucas, André (Brandão), Paula e aos demais amigos pelo convívio, amizade,
parceria e pelos bons momentos vividos durante a realização do meu mestrado.
A minha namorada, Nayara, pelo companheirismo, amor, amizade e pelos ótimos momentos
que temos vivido juntos.
Aos meus pais (Paulo Edgar e Ilaine), minha irmã (Juliane), meu avô (Olindor) e a toda minha
familia, por todo apoio e carinho concedido.
Ao CNPq e à CAPES pelo suporte financeiro.
A todos, que diretamente ou indiretamente, contribuiram para meu crescimento pessoal e
profisional e para a realização deste trabalho.
Resumo
I
RESUMO
LUIZ, J. P. M. Estudo da participação da via de sinalização dependente de ERK5 na
polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. Ribeirão Preto, 2015. 90 p. Dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2015.
Os macrófagos são células imunológicas que apresentam uma alta capacidade plástica que
permite sua polarização em diferentes súbtipos celulares em respostas a diversos estímulos
ambientais. Dentre esses súbtipos, os macrófagos M2a desempenham um papel central no
reparação tecidual, na resposta imune contra parasitas e na regulação imunológica. A
polarização de macrófagos M2a é induzida por citocinas tipo-2, IL-4 e IL-13, e envolve a
ativação do receptor da IL-4 e, subsequentemente, o fator de transcrição STAT6. Estudos
recentes têm descrito que a ERK5 regula a expressão de genes relacionados ao perfil M2 em
macrófagos durante o processo de eferocitose. No presente estudo, investigamos se a via
MEK5/ERK5 participa da polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. Nossos
resultados mostraram que a IL-4 induz a fosforilação de ERK5 em macrófagos derivados da
medula óssea (BMDMs). A inibição farmacológica da EKR5, com o inibidor XMD 8-92,
reduziu significativamente a expressão de marcadores M2 clássicos, tais como Fizz-1, Arg-1,
YM-1, bem como a produção de quimiocinas e citocinas CCL17, CCL22 e IGF-1 por
macrófagos ativados por IL-4. Além disso, a inibição de ERK5 reduziu os níveis proteicos de
Arg-1 e a produção de ureia. Investigamos também o papel de MEK5, o ativador imediato à
montante de ERK5, na regulação da expressão de marcadores M2. A inibição da MEK5, com
o inibidor BIX 02189, recapitulou os resultados obtidos com inibidor de ERK5 na polarização
M2 induzida por IL-4, confirmando o envolvimento do eixo MEK5/ERK5 em respostas M2.
Adicionalmente, observamos que macrófagos STAT6-KO tiveram menor capacidade em
polarizar para fenótipo M2. Interessantemente, a inibição de ERK5 não afetou os níveis de
fosforilação de STAT6, nem a expressão gênica de Cebpb, sugerindo que a via de sinalização
de EKR5 regula a expressão de marcadores M2 possivelmente em paralelo ou à jusante da via
de STAT6 e C/EBPβ. Em geral, estes achados revelam um papel central da via MEK5/ERK5
na polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4.
Palavras-chave: Macrófagos, polarização, M2, IL-4, ERK5.
II
ABSTRACT
LUIZ, J. P. M. Study of participation of the signaling pathway ERK5-dependent on the
IL-4-induced M2 macrophage polarization. Ribeirão Preto, 2015. 90 p. Dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2015.
Macrophages are immune cells that have a high plastic capacity which allows its polarization
in different cells subtypes in response to various environmental stimuli. Among these
subtypes, the M2a macrophages play a central role in tissue repair, immune response against
parasite and immune regulation. The polarization of M2a macrophages is induced by Th2
cytokine patterns such as IL-4 and IL-13, and involves the activation of the IL-4 receptor and,
subsequently, the transcription factor STAT6. Recent studies have described that ERK5
regulates the gene expression M2-related profile in macrophages during efferocytosis process.
In the present study, we investigated whether MEK5/ERK5 pathway plays a role in the
polarization of IL-4-induced M2 macrophages. Our results show that IL-4 as well as LPS
induced phosphorylation of ERK5 in bone-marrow-derived macrophages (BMDMs). The
pharmacological inhibition of EKR5, with XMD 8-92 inhibitor, markedly reduced the
expression of classical M2 markers, such as Fizz-1, Arg-1, Ym-1, as well as the production of
M2-related chemokines and cytokines, CCL22, CCL17 and IGF-1 in activated macrophages
by IL-4. Moreover, ERK5 inhibition reduced protein Arg-1 expression and urea production.
We also investigated the role of the MEK5, an immediate upstream activator of ERK5, in the
regulation of M2 markers expression. The inhibition of MEK5, with BIX 02189 inhibitor,
recapitulated the results obtained with ERK5 inhibitor in IL-4 induced M2 polarization,
confirming the involvement of MEK5/ERK5 axis in M2 responses. Additionally, we observed
that STAT6-KO macrophage had lower capacity to polarize for M2 phenotype. Interestingly,
ERK5 inhibition did not affect the phosphorylation levels of STAT6, neither gene expression
of Cebpb, suggesting that EKR5 signling pathway regulates M2-associated genes possibly in
parallel or downstream of the STAT6 and C/EBPβ pathway. Overall, this finding reveals a
central role of MEK5/ERK5 pathway in the IL-4-induced M2 macrophage polarization.
Key words: Macrophages, polarization, M2, IL-4, ERK5.
III
Lista de Abreviaturas
IV
LISTA DE ABREVIATURAS
°C – graus Celsius
µg – micrograma
μL – microlitro
BMDM – macrófagos derivados da medula óssea
bp – pares de base
BSA – Albumina derivada de soro bovino
CCR – receptor de quimiocinas CC
CD – “Cluster of differentiation”
cm – centímetros
DNA – ácido desoxirribonucleico
EDTA – ácido etilenodiamino tetracético
ELISA – “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
g – grama
g – unidade de medida de força centrífuga relativa
h – horas
H2O2 – Água oxigenada
HEPES – 2-4-(2-hidroxietil)-piperazinil-(1) ácido etanosulfônico
IFN-γ – Interferon gama
Ig – Imunoglobulina
IL – Interleucina
kb – kilobase
kg – kilograma
L – litro
M – molar
mg – miligrama
min – minuto
mL – mililitro
mM – milimolar
mRNA – ácido ribonucléico mensageiro
nm – nanometro
V
PBS – tampão fosfato salina
PE – Ficoeritrina
pg – picograma
RNA – ácido ribonucléico
rpm – rotações por minuto
s – segundos
SBF Soro bovino fetal
SDS – dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
TGF-β – Fator de crescimento e transformação β
TNF – Fator de necrose tumoral
Tregs – células T reguladoras
Tris – tris(hidroximetil)aminoglicano
V – volts
WT – animais selvagens (Wild-type) C57BL/6 ou BALB/c
VI
Lista de Figuras
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Interleucina-4 e lipopolissacarídeo induzem fosforilação de ERK5 durante a polarização de
macrófagos. ........................................................................................................................................... 31
Figura 2: Figura 2A via de sinalização de ERK5 participa do processo de polarização de macrófagos.
............................................................................................................................................................... 32
Figura 3: Expressão de marcadores M2 em macrófagos após estimulação com interleucina-4. .......... 34
Figura 4: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia por macrófagos M2 induzidos por IL-4. ....... 35
Figura 5: Expressão de Arginase-1 em macrófagos M2 induzidos por IL-4......................................... 36
Figura 6: A inibição de ERK5 reduz a produção de quimiocinas e fatores marcadores de fenótipo M2
de maneira concentração-dependente.................................................................................................... 38
Figura 7: A sobrevivência e a viabilidade celular de BMDMs não foram alteradas pela inibição de
ERK5. .................................................................................................................................................... 39
Figura 8: A via de sinalização de ERK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de fenótipo M2.
............................................................................................................................................................... 40
Figura 9: A expressão de marcadores M2 induzida por IL-4 envolve a ativação da via de sinalização
de ERK5. ............................................................................................................................................... 43
Figura 10: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da via
de sinalização de ERK5......................................................................................................................... 44
Figura 11: Expressão do receptor de manose (MR) é regulado negativamente pela ativação da via de
sinalização de ERK5. ............................................................................................................................ 45
Figura 12: A via de sinalização de MEK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de fenótipo
M2. ........................................................................................................................................................ 47
Figura 13: A via de sinalização de MEK5/ERK5 a controla a expressão de marcadores de fenótipo
M2. ........................................................................................................................................................ 48
VIII
Figura 14: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da via
de sinalização de MEK5/ERK5............................................................................................................. 49
Figura 15: A expressão de marcadores de fenótipo M2 induzida por IL-4 está prejudicada na ausência
de STAT6. ............................................................................................................................................. 52
Figura 16: IL-4 estimula a fosforilação de STAT6 em macrófagos independente de ERK5. ............... 53
Figura 17: IL-4 induz a expressão de C/EBPβ em macrófagos independente de ERK5. ..................... 54
IX
Sumário
X
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 2
1.
1.1.
Macrófagos .............................................................................................................................. 2
1.2.
Polarização de Macrófagos ..................................................................................................... 3
1.2.1.
Ativação clássica de macrófagos ..................................................................................... 4
1.2.2.
Ativação alternativa de macrófagos ................................................................................ 5
1.3.
Macrófagos M2a ..................................................................................................................... 7
1.3.1.
Ativação dos receptores de IL-4 ...................................................................................... 7
1.3.2.
Caracterização dos macrófagos M2a ............................................................................... 8
1.3.3.
Respostas M2 em doenças inflamatórias....................................................................... 10
1.4.
Via de sinalização de MEK5/ERK5 ...................................................................................... 11
1.4.1.
Proteínas MAPK ........................................................................................................... 11
1.4.2.
Via de ERK5 ................................................................................................................. 11
1.4.3.
Sinalização de ERK5 em macrófagos ........................................................................... 12
2.
OBJETIVOS ................................................................................................................................. 15
3.
MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 176
4.
3.1.
Animais de experimentação .................................................................................................. 17
3.2.
Preparo das soluções e reagentes........................................................................................... 18
3.3.
Cultura celular de macrófagos derivados da medula óssea ................................................... 21
3.4.
Detecção de citocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA) ............................................... 22
3.5.
Extração de Proteínas ............................................................................................................ 23
3.6.
Eletroforese e Western Blotting ............................................................................................ 23
3.7.
Extração do RNA total .......................................................................................................... 24
3.8.
Reações de transcrição reversa .............................................................................................. 25
3.9.
PCR quantitativo em tempo real ........................................................................................... 25
3.10.
Citometria de fluxo............................................................................................................ 27
3.11.
Determinação da concentração de uréia ............................................................................ 27
3.12.
Imunofluorescência por Microscopia Confocal ................................................................ 28
3.13.
Análise estatística .............................................................................................................. 28
RESULTADOS ............................................................................................................................. 29
4.1.
Ativação de ERK5 durante a polarização de macrófagos ..................................................... 30
4.2.
Caracterização da ativação alternativa de macrófagos induzida por IL-4 ............................. 33
4.3.
A produção de quimiocinas e mediadores marcadores M2 necessita da ativação de ERK5 . 37
4.4.
A expressão gênica de marcadores M2 depende da ativação de ERK5 ................................ 41
XI
4.5. Envolvimento da via de sinalização de MEK5 na expressão de marcadores M2 ...................... 46
4.6. A via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2 não regula a ativação de
STAT6 nem a expressão de C/EBPβ................................................................................................. 50
4.
DISCUSSÃO ................................................................................................................................. 56
5.
CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 621
6.
REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 643
XII
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1.
Macrófagos
O sistema fagocitário mononuclear é um sistema orgânico com capacidade fagocitária,
que inclui todas as células derivadas de precursores monocíticos da medula óssea, tais como,
monócitos do sangue periférico, macrófagos teciduais e células dendríticas derivadas de
monócitos. Sobre certas condições, os monócitos do sangue podem migrar para os tecidos,
onde se diferenciam em macrófagos e células dendríticas, e participam de respostas
inflamatórias e infeciosas (Gordon e Taylor, 2005; Geissmann et al., 2010). Os macrófagos
estão presentes com distintos fenótipos em quase todos tecidos, incluindo células de
Langerhans na pele, células de Kuppfer no fígado, células da micróglia no cérebro,
osteoclasto nos ossos e macrófagos alveolares nos pulmões (Gordon e Taylor, 2005). Neste
sentido, os macrófagos são componentes essenciais da imunidade inata, atuando nas primeiras
barreiras de resistência contra patógenos, e também da imunidade adaptativa, onde auxiliam
na montagem de uma resposta mais forte e especifica após exposição secundaria a um mesmo
antígeno. Além disso, essas células apresentam uma notável plasticidade e diversidade que
permite alterar sua fisiologia e responder eficientemente a diferentes estímulos ambientais
(Mosser e Edwards, 2008; Biswas e Mantovani, 2010).
Em 1908, Ilya Metchnikoff e Paul Ehrlich receberam o prêmio Nobel de fisiologia
pela descoberta da função dos macrófagos, sendo as primeiras células descritas envolvidas
com defesa do hospedeiro. Metchnikoff propôs que os macrófagos influenciavam o
desenvolvimento do hospedeiro, assegurando a homeostase e protegendo-o de infecções,
através de um processo chamado de fagocitose (Nathan, 2008). Através de vários receptores
de superfície e intracelulares os macrófagos monitoraram e respondem à mudanças no seu
2
ambiente secretando uma série de mediadores inflamatórios. Receptores do tipo Toll,
receptores lectina do tipo C, tipo NOD e scavengers reconhecem produtos microbianos,
substâncias exógenas e células mortas, levando a fagocitose, ativação celular e a liberação de
citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento (Hajishengallis e Lambris, 2011).
Além de participar de respostas imunológicas, os macrófagos exercem um papel
fundamental na preservação da homeostase do organismo (Kawai e Akira, 2011) (Elinav et
al., 2011). Assim, uma das principais funções dos macrófagos é a limpeza de material extracelular no espaço intersticial, como células que entraram em apoptose ou debris celulares
formados durante o remodelamento tecidual. Esse processo ocorre diariamente na ausência de
outras células do sistema imune e resulta em baixa produção de mediadores inflamatórios e
baixa ativação celular (Kono e Rock, 2008). Por outro lado, a fagocitose de debris de células
necróticas, carregadas com sinais de dano endógenos, leva a uma profunda ativação dos
macrófagos e a produção de citocinas e mediadores pró-inflamatórios (Zhang e Mosser,
2008). Desta forma, as funções protetoras e patogênicas dos diferentes fenótipos de
macrófagos revelam uma incrível capacidade de alteração fisiológica em resposta a diferentes
estímulos ambientais.
1.2.
Polarização de Macrófagos
Os macrófagos são capazes de responder rapidamente a uma ampla gama de estímulos
endógenos produzidos após uma lesão ou infecção. Esses primeiros estímulos, geralmente
produzidos por células da imunidade inata, exercem um acentuado e transiente efeito na
fisiologia dos macrófagos, enquanto que estímulos secundários, produzidos por células
antígeno-especificas, são mais direcionados e geram mudanças fenotípicas de longa de
duração (Gordon, 2007). Em publicações anteriores, os macrófagos eram classificados em
3
escala linear com a nomenclatura M1 para macrófagos classicamente ativados e a
nomenclatura M2 para macrófagos alternativamente ativados, para representar os dois
extremos das possíveis formas de ativação de macrófagos (Martinez et al., 2008). No entanto,
essa nomenclatura M2 incluía praticamente todos os outros tipos de ativação de macrófagos,
mesmo possuindo grandes diferenças bioquímicas e fisiológicas (Edwards et al., 2006).
Recentemente, Mosser e colaboradores (2008) sugeriram uma nova classificação baseada nas
três funções fundamentais dos macrófagos: defesa do hospedeiro, reparo tecidual e
imunorregulação.
1.2.1. Ativação clássica de macrófagos
Os macrófagos classicamente ativados, também chamados de macrófagos M1, são
uma população celular com alta capacidade microbicida e tumoricida, com eficiente
apresentação de antígeno e secretam grandes quantidades de citocinas e mediadores próinflamatórios. Esses macrófagos M1 promovem respostas imunológicas de perfil Th1,
medeiam a resistência contra uma variedade de bactérias, protozoários, vírus, mas também
contribuem para a destruição tecidual (Liu et al., 2014). Certos produtos bacterianos como
Lipopolissacarídeos (LPS) e citocinas como interferon-γ (IFN-γ) estimulam a polarização de
macrófagos para fenótipo M1. Como resultado, induzem um forte fenótipo pró-inflamatório
com a produção de citocinas como TNF-α, IL-12 e IL-23, além de aumentar a produção de
intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, a expressão de moléculas do MHC de classe
II e moléculas co-estimulatórias (Dale, Boxer e Liles, 2008); (Wynn, Chawla e Pollard, 2013).
Assim, os macrófagos classicamente ativados são gerados a partir de respostas imunes
celulares, sendo vital para a defesa do hospedeiro. Contudo, uma ativação exacerbada pode
levar ao dano tecidual, como ocorre em várias doenças inflamatórias crônicas e autoimunes,
4
incluindo a doença de Crohn, artrite reumatoide, hepatite autoimune e esclerose múltipla
(Murphy et al., 2003; Smith et al., 2009).
1.2.2. Ativação alternativa de macrófagos
A definição genérica de macrófagos M2 ou macrófagos alternativamente ativados é
baseada no compartilhamento de propriedades funcionais, como a alta expressão de receptor
de manose, IL-10 e fatores angiogênicos, baixa produção de IL-12 e em geral no seu
envolvimento em respostas do tipo II, na regulação imunológica e no remodelamento tecidual
(Mantovani et al., 2002; Mantovani et al., 2004). Baseado em trabalhos anteriores, foram
definidas duas formas de M2: macrófagos M2a, induzidos por IL-4 ou IL-13; e macrófagos
M2b e M2c. Os macrófagos M2b são induzidos por imunocomplexos e agonistas de receptor
tipo-Toll ou IL-1R, enquanto que os macrófagos M2c podem são induzidos por IL-10 e
hormônios glicocorticoides (Mosser e Edwards, 2008; Biswas e Mantovani, 2010).
A polarização de macrófagos M2a ocorre durante respostas imunológicas do tipo Th2,
principalmente na presença de IL-4 e/ou IL-13. Em geral, essas células participam de diversos
processos imunológicos, como na remoção de parasitas, redução da inflamação, promoção de
remodelamento tecidual, progressão tumoral e na regulação imunológica (Lawrence e Natoli,
2011). Macrófagos M2a apresentam maior atividade fagocítica, alta expressão de receptores
scavenger, de manose e galactose, produção de poliaminas e ornitina através da atividade da
arginase, baixa expressão de IL-12 e alta expressão de IL-10 e de quimiocinas CCL17,
CCL22 e CCL24, importantes para a indução de diferenciação de células Th2 e Treg
(Martinez et al., 2006; Gordon e Martinez, 2010). IL-4 promove reparo tecidual, estimulando
a atividade da arginase para a formação de precursores de poliaminas e colágeno, favorecendo
a produção de matriz extracelular (Kreider et al., 2007). Essas células podem também
5
contribuir na defesa do hospedeiro, auxiliando na remoção de helmintos e nematódeos através
do aumento da motilidade intestinal e da secreção do fluído luminal (Zhao et al., 2008).
Além disso, os macrófagos podem também ser polarizados em um fenótipo tipo-M2,
também chamados de macrófagos M2b ou M2c, os quais compartilham alguns, mas não todos
marcadores característicos de M2 (Shaul et al., 2010). Em geral, essas células estão
envolvidas com atividade anti-inflamatória, regulação imunológica, progressão tumoral e
transformação neoplásica e são induzidas por vários estímulos, como imunocomplexos de
anticorpos junto com LPS ou IL-1, IL-10, glicocorticoides, dando origem a fenótipos
funcionais tipo-M2 que compartilham propriedades com macrófagos ativados por IL-4 e IL13 (Mosser, 2003). O desenvolvimento de células T reguladoras, importante para a inibição
de respostas imunológicas e para frear processos inflamatórios, pode ser induzido direta ou
indiretamente por macrófagos M2b e M2c. A produção da citocina reguladora TGF-β por
macrófagos após eferocitose, fagocitose de células apoptóticas, na presença de estímulo próinflamatório também contribui para a propriedade de regulação imunológica dessas células
(Fadok et al., 1998). A citocina imunossupressora IL-10 também é produzida altos níveis por
essa população de macrófagos, diminuindo a produção de IL-12 e outras citocinas próinflamatórias, predispondo o hospedeiro a infecção (Gerber e Mosser, 2001). Certos
patógenos aprenderam a induzir esse subtipo de macrófago mimetizando alguns estímulos.
Como exemplo, o bacilo Anthracis promove aumento AMPc intracelular, ocasionando uma
reduzida atividade microbicida e consequente aumento da sobrevivência e disseminação de
microorganismos (Kim et al., 2008).
6
1.3.
Macrófagos M2a
1.3.1. Ativação dos receptores de IL-4
O desenvolvimento de macrófagos alternativamente ativados do tipo M2a ocorre na
presença das citocinas IL-4 e IL-13, através da ativação da cadeia α comum do receptor da IL4. São conhecidos dois tipos de receptores de IL-4. O receptor tipo I é composto pela cadeia
IL-4Rα, e pela cadeia IL-2Rγ e é expresso principalmente em células derivadas da medula
óssea, sendo ativado somente pela ligação de IL-4. Por outro lado, o receptor tipo II é
composto pela cadeia IL-4Rα e pela cadeira IL-13Rα1 e é expresso por células não
hematopoiéticas e pode ser ativado tanto por IL-4 quanto por IL-13 (Zurawski et al., 1993)
(Gordon e Martinez, 2010).
A sinalização de IL-4 através do receptor de IL-4 tipo I, induz fosforilação de IRS-2
de forma muito mais potente que IL-13. Em termos de funcionalidade, a sinalização de IL-4
via receptor tipo I resulta em uma maior indução da expressão gênica de marcadores de
ativação alternativa de macrófagos como Arginase 1 (Stein et al., 1992)(Stein et al.,
1992)(Stein et al., 1992), moléculas tipo-quitinase (Ym1/2 e AMCase) e moléculas tiporesistina (RELM) α/FIZZ1, em comparação ao receptor de IL-4 tipo II (Heller et al., 2008).
Basicamente, a cadeia IL-4Rα se associa com JAK1 enquanto IL-2Rγ se associa
exclusivamente com JAK3. A quinase JAK3 é ativada por IL-4 através do receptor tipo I por
associação e heterodimerização de receptores que levam a fosforilação nos resíduos de
tirosina no domínio citoplasmático do IL-4Rα (Nelms et al., 1999). A JAK3 está
constitutivamente associada com a cadeia IL-4Rα e é a única JAK envolvida com a ativação
do receptor de IL-4 tipo I (Kelly-Welch et al., 2003). Além disso, JAK3 seletivamente ativa
IRS-2 (Blaeser et al., 2003), e através da fosforilação preferencial de tirosinas que servem
7
como sítios de acoplamento para o recrutamento e interação com Grb-2 e PI3K (Sun et al.,
1995), facilita a integração com a via de sinalização do transdutor de sinal e ativador de
transcrição 6 (STAT6), fator de transcrição crucial para a regulação gênica de marcadores de
ativação alternativa de macrófagos (Heller et al., 2008). As vias de sinalização em comum
compartilhada por IL-4 e IL-13 envolvem a fosforilação e translocação de STAT6 para o
núcleo, onde regula a transcrição de uma série de genes marcadores M2 (Gordon e Martinez,
2010).
1.3.2. Caracterização dos macrófagos M2a
A ativação alternativa de macrófagos induzida IL-4 foi documentada por Stein e
colegas em 1992 (Stein et al., 1992). Além da IL-4, outras citocinas de padrão Th2 como IL13, e também IL-33 potencializar a polarização de macrófagos alternativamente ativados
(M2a) que são classificados pela expressão de um painel de genes marcadores M2 (Raes et
al., 2002; Gordon, 2003). Esse tipo de polarização de macrófagos contrasta com a ativação
clássica induzida por IFN-γ em ambientes de resposta imunes Th1. Em geral, citocinas de
padrão Th2 são produzidas por basófilos, eosinófilos, células inatas, mastócitos, macrófagos e
outras células. Além disso, células Th2 e células B ativadas, células tumorais e epiteliais são
importantes fontes da produção dessas citocinas nos tecidos (Moro et al., 2010; Neill et al.,
2010). Uma variedade de processos fisiológicos e patológicos, incluindo homeostase,
inflamação, funções metabólicas, câncer e reparo tecidual têm sido relacionados com
macrófagos M2a. Além de seu papel na imunidade, essas células também participam na
hipersensibilidade, infecções parasitárias, fibrose e alergia (Gordon e Martinez, 2010). Ao se
tratar de receptores caracteristicos de M2, citocinas IL-4 e IL-13 desempenham o papel em
aumentar a expressão do receptor de manose (MR) e moléculas do MHC de classe II,
8
estimulando a fagocitose e a apresentação de antígeno, e induzem a produção de quimiocinas
de padrão M2a – (MDC; também conhecida como CCL22), TARC (CCL17) e o fator de
crescimento semelhante à insulina (IGF-1). As quimiocinas CCL17 e CCL22, ambas ligantes
do receptor CCR4, são fortes quimioatraentes de células Th2 e monócitos, e outras células
que expressam CCR4, como as células T reguladoras (Mantovani et al., 2002; Wirnsberger et
al., 2006). Uma outra citocina produzida por macrófagos M2a é IGF-1, um fator de
crescimento indutor de proliferação e diferenciação que desempenha um papel crucial na
regeneração tecidual em lesões renais, pulmonares e musculares. (Lu et al., 2011).
Uma assinatura de marcadores gênicos de macrófagos murinos tratados com IL-4,
Arg1, Ym1, Fizz1 e Mrc1, têm sido utilizada para estabelecer a ativação alternativa de
macrófagos. Arginase-1 é uma enzima intracelular expressa durante a ativação alternativa,
principalmente por IL-4 e IL-13, mas também por outras vias de sinalização. Através da
atividade da arginase a arginina é convertida em ornitina e uréia, formando poliaminas e
prolina, um importante precursor de colágeno (Munder, Eichmann e Modolell, 1998; Pesce et
al., 2009). FIZZ1 (também conhecido como RELMα ou Retnla) e Ym1 são induzidos
fortemente na ativação alternativa de macrófagos in vivo e in vitro (Sanson, Distel e Fisher,
2013). FIZZ1 é uma proteína secretada tipo-resistina produzida por macrófagos, eosinófilos e
no epitélio alveolar durante inflamação alérgica pulmonar e asma (Nair et al., 2009). Estudos
anteriores identificaram efeitos contraditórios de RELMα na regulação da inflamação,
podendo promover a inflamação pulmonar, mas também regulando negativamente inflamação
mediada por citocinas Th2 no pulmão (Nair et al., 2009). Ym1 é uma lectina secretória tipoquitinase que forma cristais nos espaços alveolares e em macrófagos e células gigantes
hiperreativas do pulmão fortemente induzidas por estímulos de células Th2. Essas moléculas
ligam-se a quitina de insetos, nematódeos e ovos de helmintos, forte indutor de respostas Th2
(Reese et al., 2007). O receptor de manose (MR, ou também chamado de CD206) é um
9
importante receptor fagocítico que aumenta a ingestão de microorganismos com resíduos de
manose na superfície. No entanto pode também contribuir para infecção. Embora seja
expresso principalmente em macrófagos M2a, o receptor de manose pode também ser
expresso por outros subtipos de macrófagos (Gordon e Martinez, 2010; Murray e Wynn,
2011).
1.3.3. Respostas M2 em doenças inflamatórias
Para controlar a resposta inflamatória excessiva, os macrófagos podem sofrer apoptose
ou polarizar para o fenótipo M2 para proteger o hospedeiro de lesões exarcebadas e facilitar a
regeneração tecidual. Os macrófagos M2a induzidos por IL-4/IL-13 são importantes
reparadores teciduais, os quais expressam altos níveis de arginase, alguns componentes de
matriz extracelular e TGF-β, um potente ativador da produção de colágeno e aumento da
proliferação de fibroblastos. Após a exposição a algum agente tóxico ou estresse mecânico, os
macrófagos podem ser gerados facilitando a recuperação de tecidos, inibidindo citocinas próinflamatórias e formando matriz extracelular. Uma série de fatores como TGF-β, EGF e
VEGF são produzidos por macrófagos M2a para promover angiogênese, regeneração tecidual
e reparo. Entretanto, a liberação desses mediadores deve ser finamente regulada, pois a
produção excessiva pode levar ao desenvolvimento de patologias como fibrose e tumor
(Murray e Wynn, 2011; Novak e Koh, 2013).
O perfil de citocinas Th2 na asma, uma doença pulmonar crônica, contribui para o
aparecimento de macrófagos M2, que com seus fatores pró-alergicos contribuem para as
respostas inflamatórias e na remodelação das vias aéreas. Macrófagos alveolares de pacientes
asmáticos produzem altos níveis de IL-13 (Prieto et al., 2000) assim como em camundongos
asmáticos induzidos com Aspergillus fumigatus expressam altos níveis de marcadores M2
10
como FIZZ1 e Ym1, que quando ativadas em excesso essas células podem causar aumento do
recrutamento celular, secreção de muco e hiperresponsividade das vias aéreas (Moreira e
Hogaboam, 2011).
1.4.
Via de sinalização de MEK5/ERK5
1.4.1. Proteínas MAPK
A cascata de proteínas quinases ativadas por mitogenos (MAPKs) constituem uma
complexa rede de vias de sinalização altamente conservada envolvidas em varias funções
celulares, incluindo proliferação celular, diferenciação e migração. Estímulos extracelulares
como fatores de crescimento e uma série de estresses induzem ativação sequencial de MAPK
quinase quinase (MAPKKK), MAPK quinase (MAPKK) e MAPK (Chang e Karin, 2001).
Pelo menos quatro membros da família das MAPK já foram identificados: quinase regulada
por sinal extracelular 1/2 (ERK1/2), quinase c-Jun N-terminal (JNK), p38 e ERK5, a mais
nova MAPK descrita. Os ativadores de MAPK incluem MEK1 e MEK2 para ERK1/2, MEK5
para ERK5, MKK4 e MKK7 para JNK, e MKK3 e MKK6 para a MAPKs p38 (Robinson e
Cobb, 1997; Chen et al., 2001).
1.4.2. Via de ERK5
A via MEK5/ERK5 é ativada por uma variedade de estímulos incluindo estresse
oxidativo e osmótico, fatores de crescimento, ativação de receptores tirosina quinases, entre
outros. ERK5, também conhecida como grande MAPK (MAPK-1, BMK1 ou MAPK7) é uma
molécula de 98 kDa, quase duas vezes maior que as outras MAPK, que compartilha uma alta
11
homologia com ERK1/2 (Lee, Ulevitch e Han, 1995; Zhou, Bao e Dixon, 1995). A molécula
ERK5 desempenha um papel importante na regulação numa série de funções celulares, como
sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. Assim como outros membros da família
das MAPKs, ERK5 contem dois sítios de fosforilação em resídios de treonina (T) e tirosina
(Y) dentro de um motivo T-X-Y que são críticos para a ativação e um domínio conservado
serina/treonina quinase (Widmann et al., 1999). A molécula ERK5 também contem um
domínio de oligomerização, um sinal de localização nuclear e uma região rica em prolina
(Yan et al., 2001). MEKK2 e MEKK3, mas não MEKK1, membros da família das
MAPKKK, são capazes de ativar MEK5, uma MAPKK especifica para ERK5, em resposta ao
uma série de estímulos diferentes (Nakamura e Johnson, 2003). Após a ativação por MEK5,
ERK5 transloca para o núcleo e fosforila um número de proteínas a jusante, incluindo
MEF2C, c-Fos, Sap1, c-Myc e NF-κB (Nishimoto e Nishida, 2006; Wang e Tournier, 2006).
Compreender os mecanismos de regulação e função da via de sinalização de ERK5 fornecem
informações importantes para o estudo de uma variedade de desordens patológicas, incluindo
doenças cardiovasculares e câncer.
1.4.3. Sinalização de ERK5 em macrófagos
Estudos recentes mostram que a ativação da via de sinalização de MEK5/ERK5 pode
ser essencial para direcionar os macrófagos para fenótipo mais anti-inflamatório ou
imunorregulador. A proliferação e sobrevivência de macrófagos induzida por M-CSF são
dependentes da ativação de ERK5, que rapidamente transloca do citosol para o núcleo, onde
aumenta a expressão de c-Jun e reduz p27, afetando o controle do crescimento celular (Rovida
et al., 2008). Além disso, a fagocitose de células apoptóticas (eferocitose) por macrófagos
induz a expressão de ARG II através da ativação da sinalização de ERK5/CREB, competindo
12
com iNOS pela L-arginina, reduzindo a produção de óxido nítrico (Barra et al., 2011).
Adicionalmente, ERK5 participa também do aumento da eferocitose de células apoptóticas
induzida por estatinas, drogas com ação preventiva em doenças cardiovasculares. De fato, a
deleção de ERK5 em macrófagos de camundongos suscetíveis ao desenvolvimento de
aterosclerose resultou no aumento da expressão de genes associados a polarização de
macrófagos M1 e numa acelerada formação de placas ateroscleróticas (Heo et al., 2014).
(Kozicky et al., 2015). Embora já tenha sido descrito a participação de ERK5 na ativação e
diferenciação de macrófagos, nenhum trabalho até o presente momento havia demonstrado o
envolvimento da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2 induzida por
IL-4.
13
Objetivos
14
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral:
Investigar a participação da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos
2.2. Objetivos Específicos:

Avaliar a ativação da via de sinalização de ERK5 em macrófagos estimulados com
IL-4 e LPS

Avaliar se a inibição de ERK5 afeta a expressão de marcadores M2a induzida por IL4 em macrófagos

Avaliar se a inibição de MEK5 afeta a expressão de marcadores M2a induzida por IL4 em macrófagos

Avaliar o envolvimento da via ERK5 na ativação da via de STAT6 induzida por IL-4
15
Materiais e métodos
16
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.
Animais de experimentação
No presente estudo foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6
(wild type, WT) e BALB/c (wild type, WT), machos, com 6 a 8 semanas de idade. Esses
camundongos foram fornecidos pelo Serviço de Biotério da Prefeitura do Campus da USPRP. Foram utilizados camundongos machos, de 6 a 8 semanas de idade, deficientes para
STAT6 (STAT6-/-) (linhagem Balb/c) adquiridos da Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e
gentilmente cedidos pelo Prof. João Santana da Silva (Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, USP). Além disso, também utilizamos camundongos transgênicos machos YARG
(Arg1-YFP) (linhagem C57BL/6), de 6 a 8 semanas de idade, nos quais a proteína
fluorescente YFP é expressa sob o controle do promotor para o marcador de M2, Arg1. Esses
animais também foram adquiridos da Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e gentilmente
cedidos pelo Prof. Niels Olsen Câmara (Instituto de Ciências Biomédicas, USP). Os
camundongos deficientes e transgênicos foram criados e fornecidos pelo Centro de Criação de
Camundongos Especiais do Departamento de Genética da FMRP-USP. Todos os animais para
experimentação foram mantidos no biotério do Departamento de Farmacologia da FMRPUSP, sob condições de temperatura (23-25 ºC) e o ciclo claro/escuro controlados, com livre
acesso à água e ração. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais estão de
acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro
de Experimentação Animal (COBEA), e foram aprovados pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal (CETEA) do hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – USP.
17
3.2.
Preparo das soluções e reagentes
Solução de Ketamina e Xilazina:
Cetamina 10% (Agener União) ................................................................................1,25 mg/mL
Xylazina 2% (Agener União) .....................................................................................0,5 mg/mL
Salina 0.9 % q.s.p ............................................................................................................100 mL
A solução estocada a 4 ºC.
Solução de Tampão Salina-fosfato (PBS) 10X (Solução Mãe):
Cloreto de Sódio (NaCl, Merck) ...........................................................................................80 g
Cloreto de Potássio (KCl, Merck)............................................................................................2 g
Fosfato de Sódio dibásico (Na2HPO4, Merck)....................................................................11,5 g
Fosfato de Potássio monobásico (KH2PO4, Merck)...............................................................20 g
Água deionizada Milli-Q q.s.p. .....................................................................................1000 mL
A solução estocada a 4 ºC.
PBS 1X:
PBS10X ...........................................................................................................................100 mL
Água Milli-Q q.s.p. ..........................................................................................................900 mL
O pH ajustado para 7.2, filtrada e estocada à 4 °C.
PBS/EDTA (1mM):
PBS 1X q.s.p. ...................................................................................................................100 mL
Etilenodiaminotetracético (EDTA, Merck) ....................................................................37,2 mg
O pH ajustado para pH 7.2, filtrada e estocada a 4 °C.
18
Meio RPMI incompleto:
Hepes (C8H18N2O4S, Sigma) ..............................................................................................2,38 g
RPMI 1640 (Sigma) – 1 frasco ..........................................................................................10,4 g
Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Vetec) ........................................................................... 2,20 g
Água de Milli-Q q.s.p.....................................................................................................1000 mL
Meio RPMI completo:
Soro Bovino Fetal inativado (SBF-I, Difco) .....................................................................10 mL
Estreptomicina (10mg/mL)/penicilina (10 unidades) (antibiótico, Sigma) .........................1 mL
Fungizona (antifúngico, Sigma) .......................................................................................120 µL
L--Gultamina (200mM, Sigma) ........................................................................................1,3 mL
Gentamicina (Sigma) ........................................................................................................100 µL
RPMI incompleto q.s.p. ...................................................................................................100 mL
A solução foi preparada no dia do uso.
Tampão de citometria de fluxo (Tampão de FACS):
Soro Bovino Fetal inativado (SBF-I, Difco) 2% .................................................................2 mL
PBS 1X q.s.p. ...................................................................................................................100 mL
A solução foi preparada no dia do uso e utilizada gelada.
Tampão de bloqueio (ELISA)
Albumina derivada de soro bovino (BSA, Sigma) 1 % ..........................................................1 g
PBS 1X q.s.p. ...................................................................................................................100 mL
19
Tampão de lavagem (ELISA)
Teewn 20 (Sigma) 0,05 % ...................................................................................................1 mL
PBS 1X q.s.p. .................................................................................................................2000 mL
Tampão de lise:
Cloreto de amônio (NH4Cl, Merck) ...................................................................................4,01 g
EDTA (Labsynth) ..............................................................................................................0,18 g
Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Vetec) ............................................................................0,42 g
Água de Milli-Q q.s.p. .....................................................................................................500 mL
20
3.3.
Cultura celular de macrófagos derivados da medula óssea
Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) foram obtidos como descrito
previamente por Kurowska (2009). As células foram isoladas da medula óssea do fêmur e
cultivadas em meio RPMI (Sigma) contendo 10% de SFB (v/v) e 20% (v/v) do sobrenadante
de cultura de células L929, rico em fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF). As
culturas de macrófagos foram realizadas em placa de petri especificas para a cultura (BD
OPTILUX) por 6 a 8 dias na estufa a 37ºC e 5% CO2. Após 8 dias de cultura, os macrófagos
foram removidos com auxilio de suporte plástico, contados e ajustados para a densidade
celular requerida para o experimento. Como controle, os macrófagos para controle foram
cultivados em meio RPMI completo para manter estado de M0. Por outro lado, para a
polarização de M2, os macrófagos foram incubados com IL-4 (10 ou 30 ng/mL; R&D), e em
alguns experimentos, utilizamos LPS (100 ng/mL; Sigma) e IFN-γ (200 ng/mL; R&D) para
polarização de M1. Após a incubação com os diferentes estímulos polarizantes, a
diferenciação das células foi confirmada por citometria de fluxo.
Inicialmente, os macrófagos foram plaqueados em placas Costar (Sigma) de 96 poços
(3 x 105 células/poço) ou 12 poços (3 x 106 células/poço)em meio RPMI-completo. Após 2
horas de descanso, os macrófagos foram pré-tratados com os inibidores por 1 hora antes da
adição dos estímulos. Todos os inibidores foram preparados em meio RPMI completo onde a
droga XMD 8-92 (10 µM; Tocris) foi utilizada para inibir a ativação da ERK5; a droga BIX
02189 (10 µM; Tocris) para inibir MEK5, e para inibir MEK1/2, foi utilizado a droga
PD98059 (10 µM; Cell Signalling). Como controle as células foram pré-tratadas com DMSO
em concentração máxima de 0,05%, uma vez que o DMSO foi o diluente das drogas. Após o
pré-tratamento as células foram estimuladas com IL-4 ou LPS + IFN-γ por 24 ou 48 horas.
21
3.4.
Detecção de citocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA)
As quantificações de CCL17, CCL22 e IGF-1 murinos no sobrenadante de cultura de
macrófagos (3 x 105 células/poço) foram realizadas com material coletado 48 horas após a
polarização de macrófagos. A determinação dos níveis destas citocinas foi realizada por
método imunoenzimático (ELISA) utilizandos kits DuoSet ELISA Development Systems
(R&D Systems) de acordo com as informações do fabricante. Resumidamente, as placas de
microtitulação (96 poços) foram recobertas com 50 µL/ poço do anticorpo específico antiCCL17, anti-CCL22 e anti-IGF-1 na concentração descrita pelo fabricante. Esses anticorpos
foram diluídos em PBS pH 7.4 e incubados overnight a 4 ºC. As placas foram lavadas por
quatro vezes com PBS/Tween-20 (0,05 % Sigma). As ligações não-especificas foram
bloquedas com 100 µL de PBS contendo BSA 1% durante 1 hora a 37 ºC. A curva padrão
iniciou-se com concentrações conhecidas de CCL17 (8000 pg/mL), CCL22 (1000 pg/mL),
IGF-1 (4000 pg/mL) foram colocadas nas placas (50 µL) e incubados overnight 4 ºC. Após
esse período, as placas foram lavadas com PBS/T e 50 µL dos anticorpos biotinilados
específicos para cada citocina foram adicionados nas concentrações descritas pelo fabricante.
Após uma hora, as placas foram lavadas com PBS/T e o conjugado estreptavidina-peroxidase,
na diluição de 1:200 foi adicionado a cada poço e incubadas por 45 min. Novamente as placas
foram lavadas com PBS/T e foi adicionado o substrato TMB (KPL, USA). A densidade ótica
foi medida a 630 nm no espectrofotômetro SpectraMAX 190 Microplate Reader (Molecular
Devices) e os dados foram analisados usando o software SoftMax Pro 5. A concentração de
citocinas contidas nas amostras foi calculada a partir de uma curva padrão com 10 pontos
obtidos por diluição seriada. O resultados foram expressoss em pg/mL.
22
3.5.
Extração de Proteínas
Para avaliar a expressão de arginase I, macrófagos foram cultivados em meio RPMI
com 10% de SFB em placa de 6 poços (3x106/mL) e submetidos aos tratamentos com IL-4
(10 ng/mL) ou LPS (1 µg/mL) + IFN-γ (200 ng/mL) por 48 horas. Para avaliar a ativação de
ERK5, macrófagos foram cultivados em meio RPMI com 10% de SFB em tubos eppendorf de
2 mL (2,5 x 106 células/tubo) e submetidos aos tratamentos com IL-4 (30 ng/mL) ou LPS
(300 ng/mL) por 5, 15, 30 e 60 minutos. Após este período, o sobrenadante foi coletado e
separado para posterior dosagem de citocinas, e as células foram coletadas com PBS1x
gelado, centrifugadas e seguidas por lise em tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NP-40
1%, desoxicolato de sódio 0,25%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM pH 7,4) contendo os
inibidores de protease (Roche) e fosfatase (Calbiochem) sob leve agitação por 10 min a 4º C.
Uma alíquota do lisado foi separada para dosagem de proteínas pelo método colorimerico
Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL USA).
3.6.
Eletroforese e Western Blotting
As amostras proteicas, correspondentes a 30 ou 50 ug de proteínas foram incubadas
com tampão de amostras na proporção de 1:2, a 95°C por 10 minutos, condição desnaturante.
Posteriormente, as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida de 10-8% dependendo
da proteína a ser investigada na presença de SDS (SDS-PAGE) para separação por
eletroforese (Mini-Protean II Eletrophoresis Cell, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA)
As proteínas separadas foram transferidas para membrana de nitrocelulose 0.2µm (Amersham
Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), utilizando o sistema de transferência Trans Blot
Turbo (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA). Após transferência as membranas foram
23
lavadas em água deionizada e o bloqueio dos sítios antigênicos inespecíficos foi realizado
pela incubação das membranas com TBST (Tris-HCl 100 mM pH 7,5, NaCl 150 mM,
Tween20 0,05%) com 5% de leite em pó desnatado ou BSA 5% por 2 h. Após o bloqueio, as
membranas foram lavadas três vezes com TBST, por 5 minutos. Em seguida foram incubadas
com anticorpos primários por 18-24 h sob leve agitação a 4º C. Para a caracterização dos
macrófagos foram utilizados anticorpos primários contra ARG1 (AF5868; R&D), iNOS
(N7782; Sigma), β-actin (A1978; Sigma), p-Erk5 (#3371; CellSignaling). Anticorpos
secundários apropriados conjugados a HRP foram adicionados e incubados de 1-2 h
atemperatura ambiente. Após esta incubação as membranas foram novamente lavadas com
TBST por 5 minutos. Para revelar as membranas, foi utilizado substrato Luminata (Millipore)
para a detecção por quimioluminescência utilizando o equipamento ChemiDoc™ XRS com o
software ImageLab 3.0 (Bio-Rad). Como controle de carregamento proteico foi utilizado a βactina.
3.7.
Extração do RNA total
Para analisar a expressão gênica, o RNA total dos macrófagos (5 x 105 células/poço)
derivados da medula óssea de murinos foi extraído usando utilizando o RNeasy Mini Kit 250
(Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 200 μl de clorofórmio
(Gibco BRL) foram adicionados à suspensão, a qual foi centrifugada a 13000 g, por 15
minutos, a 4 °C. A fase aquosa formada foi transferida para um novo tubo, no qual foram
adicionados isopropanol na proporção de 3:1 e, após agitação em Vortex, a mistura foi
incubada overnight a -20 °C para precipitação do RNA contido na fase aquosa. Após
incubação e centrifugação a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C, o sobrenadante foi
descartado. O precipitado foi ressuspenso em etanol 75%, e centrifugado a 7500 g por 5
24
minutos a 4 °C. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado ressuspenso em
água livre de RNAse. A concentração de RNA foi determinada pela densidade ótica no
comprimento de onda de 260 nm, por meio do aparelho Nanovue (GE). As amostras foram
armazenadas no -70 °C. O RNA total foi utilizado para as reações de transcrição reversa. Para
garantir a ausência de DNA genômico, as amostras foram tratadas com DNAsel (Invitrogen)
seguindo as indicações do fabricante.
3.8.
Reações de transcrição reversa
As reações de transcrição reversa foram realizadas com 1 μg de RNA total, 1 μl de
oligo (dT) e 1 μl de DNTP mix 10 nM, em um volume de 12 μl, através da utilização do kit
High-Capacityc DNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) de acordo com as
instruções fornecidas pelo fabricante e protocolo estabelecido no nosso laboratório. As
amostras permaneceram a 65 °C durante 5 minutos e, depois, foram colocadas imediatamente
no gelo. Posteriormente, adicionou 4 μl de Buffer 5x firststrand, 2 μl de dTT e 1 μl de
RNAsin, seguida da incubação por 2 minutos a 42 °C. Após esta incubação, foi adicionado 1
μl de enzima Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation,
Carlsbad, CA, USA) em volume final de 20 μl. Esta reação permaneceu a 42 °C por 50
minutos, e depois a 70 °C por 15 minutos.
3.9.
PCR quantitativo em tempo real
O
PCR
quantitativo
em
tempo
real
foi
realizado
usando
kit
TaqMan
(AppliedBiosystems) ou kit SYBR Green (Life Technologies) e o sistema Viia7 Real-Time
25
PCR (Life Technologies). O protocolo de ciclagem térmica foi: 1 x 95 ºC durante 1 minuto
(Holdingstage); 40x: desnaturação a 95 ºC, 15 segundos e anelamento 60 ºC, 1 minuto
(Cyclingstage); obtenção da curva de melting (Melting curve stage). A curva foi obtida após
três passos, sendo o primeiro a 95 ºC, 15 segundos; o segundo a 60 ºC, 1 minuto e o terceiro a
95 ºC, 15 segundos; para verificar se apenas um produto foi amplificado. Amostras que
obtiveram mais de um pico foram excluídas. Os resultados foram analisados através do
método comparative cyclethreshold (CT). Para realizar os qPCRs foram usados
primersTaqman
(Mm00485148_m1),
(AppliedBiosystems)
Cebpb
para
Arg1
(Mm00843434_s1),
Gapdh
(Mm00475988_m1),Mrc1
(Mm99999915_g1),
Retlna
(Mm00445109_m1) e pares de primersSYBR Green (Life Technologies) mostrados na tabela.
Tabela – Primers utilizados nas reações de qPCR e seus respectivas sequências sense e antisense:
Primers
Sense
Anti-sense
Ym1
5´-CATGAGCAAGACTTGCGTGAC-3´
5´-GGTCCAAACTTCCATCCTCCA-3´
Gapdh
5´-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3´
5´-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3´
Todos dados foram normalizados em relação aos valores de Gapdh, e a quantificação das
diferenças entre os grupos foi calculada de acordo com as instruções do fabricante. A
expressão gênica foi apresentada baseada na quantidade de vezes que aumentou em relação
aos macrófagos não-estimulados. A expressão de GAPDH foi utilizada como controle interno
para cada reação de PCR.
26
3.10. Citometria de fluxo
Macrófagos de animais WT e YARG (3 × 106 células/poço) da linhagem C57BL/6
foram plaqueados em placas de 6 poços e estimulados com RPMI-C ou IL-4 (10 ng/mL) por
48 horas. Para avaliar a fosforilação de STAT6 induzida por IL-4, macrófagos de animais WT
(1,2 x 106 células/tubo) foram colocados em tubos FACS e estimulados com RPMI-C ou IL-4
(30 ng/mL) por 15 e 60 minutos. Após esse estímulo, os macrófagos foram lavados uma vez
com PBS pH 7,4 gelado e coletados para marcação celular. As suspensões celulares foram
marcadas com a combinação dos seguintes anticorpos: anti-F4/80 conjugado à APC
(eBioscience; San Diego, CA), anti-F4/80 conjugado à FITC (eBioscience; San Diego, CA),
anti-CD206 (MMR) conjugado à APC (Biolegend;San Diego, CA), anti-p-STAT6(pY641)
conjugado à AlexaFluor647 (BD Biosciences, San Jose, CA), anti-CD11b conjugado à FITC
(BD Biosciences, San Jose, CA). As células foram fixadas em formalina 2% e analisadas
usando o citometro BD FACSVerse™ (BD Bioscience) e o software FCS Express V3 (De
Novo Sotware; Glendale, CA). Os resultados foram expressos como intensidade média de
fluorescência (quantitativo) ou porcentagem (qualitativo) de expressão de marcadores de
macrófagos.
3.11. Determinação da concentração de uréia
A formação de uréia foi dosada dos sobrenadantes das culturas de macrófagos após 24
ou 48 horas na presença ou não de IL-4. A quantificação foi conduzida utilizando o ensaio
colorimétrico enzimático Uréia CE LABTEST Diagnóstica conforme recomendação do
fabricante. As absorbâncias foram determinadas em leitor de ELISA (Espectra Max-250,
Molecular Devices), no comprimento de onda de 600 nm e os valores expressos em mg/dL.
27
3.12. Imunofluorescência por Microscopia Confocal
A fim de verificar a polarização de macrófagos para o perfil M2 com a Incubação com
IL-4, tais células, ou seja, macrófagos de camundongos YARG (5 × 105 células/poço) foram
plaqueadas em poços contendo lamínulas (13mm) e incubados com IL-4 (30 ng/mL). Meio
RPMI-C foi utilizado como controle. Após 48h de estimulação, os sobrenadantes da cultura
foram removidos e a expressão de arginase I foi avaliada por imunofluorescência como
descrita a seguir. Depois do tempo de estímulo, as células foram lavadas duas vezes com PBS,
fixadas por 15 minutos com PBS contendo 2% de paraformaldeído, A marcação do núcleo
celular foi realizada usando 4’,6-diamidino-2- phenylindole, 2 HCl (DAPI; Calbiochem)
durante 15 minutos. Após a marcação, as lâminas foram montadas usando Acqua Poly/Mount
(Polysciences) e examinadas por microscopia confocal a laser Leica DMI6000B (Wetzlar,
Alemanha). Imagens individuais foram obtidas objetivas de 20X e 40X.
3.13. Análise estatística
Os dados foram apresentados como média ± DP de três experimentos independentes.
A significância estatística foi estimada por teste t de Student não-pareado para comparação
entre dois grupos. Para comparação entre três ou mais grupos foi usado ANOVA de uma via,
seguido pelo pós-teste de Bonferroni. O teste ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de
Bonferroni foi utilizado para avaliar análises agrupadas. Diferenças com p<0,05 foram
consideradas
significativas.
Todas
analises
estatísticas
foram
conduzidas
usando
GraphPadPrism 5.0 (GraphPad Software).
28
Resultados
29
4.
4.1.
RESULTADOS
Ativação de ERK5 durante a polarização de macrófagos
O envolvimento da participação da via de sinalização de ERK5 já foi descrito em
vários processos biológicos em macrófagos, como sobrevivência, proliferação e ativação
celular (Zhu et al., 2000; Rovida et al., 2008). Para avaliar o papel de ERK5 na ativação de
clássica e alternativa de macrófagos, estimulamos macrófagos derivados da medula óssea
(BMDMs) com lipopolissacarídeo (LPS) ou interleucina-4 (IL-4), respectivamente. O padrão
de fosforilação de ERK5 em macrófagos com estímulo de LPS e IL-4 foi determinado por
western blot. Como mostrado na Fig. 1, ambos os estímulos, LPS ou IL-4, foram capazes de
induzir a fosforilação de ERK5 em BMDMs. O estímulo de LPS promoveu ativação de ERK5
a partir de 5 minutos com pico de ativação mais tardio (60 min), enquanto que IL-4 promoveu
ativação de ERK5 nos primeiros minutos com um pico de fosforilação em 15 minutos (figura
1).
Para investigar o papel da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos
M1 e M2, foi determinado os níveis proteicos de iNOS e Arg-1 por western blot. Para isso os
macrófagos foram pré-tratados com um inibidor de ERK5 (XMD 8-92) por 1 hora e então
estimulados com LPS/IFN-γ ou IL-4 por 48 horas. O pré-tratamento com XMD reduziu a
expressão de Arg-1 induzida por IL-4 e aumentou a expressão de iNOS induzida por LPS e
IFN-γ (figura 2). Esses resultados sugerem que a via de sinalização de ERK5 pode estar
envolvida controle diferencial da polarização de macrófagos M1 e M2. No presente estudo,
concentramos nossos esforços no entendimento do papel da ERK5 na polarização de
macrófagos M2 induzida por IL-4.
30
Figura 1: Interleucina-4 e lipopolissacarídeo induzem fosforilação de ERK5 durante a
polarização de macrófagos.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57Bl/6 foram estimulados com LPS (300
ng/mL) e IL-4 (30 ng/mL) nos tempos indicados. Os níveis de fosforilação foram determinados por
Western Blot. As imagens foram cortadas para apresentação. A intensidade das bandas de Western
blot foi analisada por densitometria, normalizada pelos níveis de β-actina. Os valores relativos de
densidade ótica de cada banda em relação ao controle não tratado foram mostrados sob cada banda.
Um de dois experimentos independentes com resultado idêntico foi mostrado.
31
Figura 2: A via de sinalização de ERK5 participa do processo de polarização de macrófagos.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57Bl/6 foram pré-tratados com inibidor de
ERK5 (XMD8-92, 5 µM) por 1 hora, seguido pelos estímulos de LPS+IFN-γ (1 µg/mL e 200 ng/mL)
e IL-4 (10 ng/mL) por 48 horas. Os níveis de expressão de iNOS (marcador de M1) e ARG1
(marcador de M2) foram determinados por Western Blot. As imagens foram cortadas para
apresentação. A intensidade das bandas de Western blot foi analisada por densitometria, normalizada
pelos níveis de β-actina. Os valores relativos de densidade ótica de cada banda em relação ao controle
não tratado foram mostrados sob cada banda. DMSO foi utilizado como veículo (<0,05%). Um de dois
experimentos independentes com resultado idêntico foi mostrado.
32
4.2.
Caracterização da ativação alternativa de macrófagos induzida por IL-4
Para avaliar a ativação alternativa de macrófagos induzida por IL-4, realizamos uma
caracterização e examinamos os níveis de diversos marcadores de fenótipo M2. Por ensaio de
ELISA, observamos que a produção da quimiocina CCL22 e do fator IGF-1 foi nitidamente
aumentada após estimulação de macrófagos usando diferentes concentrações de IL-4 (figura
3A). Após esses resultados determinamos a concentração de 10 ng/mL de IL-4 como padrão
para os experimentos seguintes. O aumento na produção desses mediadores pela indução com
IL-4 foi tempo-dependente com uma ótima indução entre 24 e 48 horas (figura 3B). Em
adição ao ELISA, a regulação da expressão e da atividade de Arg-1 foi também analisada por
citometria de fluxo e pela produção de uréia.
Os níveis de expressão de Arg-1 foram detectáveis após 12 horas de tratamento com
máxima indução em 48 horas (figura 4A). Além disso, de acordo com níveis aumentados de
Arg-1, observamos aumento na atividade da arginase através da formação de uréia por
macrófagos estimulados com IL-4 (figura 4B). Esses dados foram confirmados também por
imunofluorescência utilizando BMDMs de camundongos repórter para Arg1-YFP, nos quais
o gene repórter YFP é expresso sob o controle do promotor de Arg-1 (Reese et al., 2007).
Nesse experimento observamos maior quantidade de macrófagos Arg1-YFP+ no grupo
estimulado com IL-4 do que no grupo controle (figura 5). De acordo com outros estudos
confirmamos que durante a polarização de macrófagos M2, IL-4 induz a expressão de uma
série de marcadores M2, como Arginase I, CCL22, IGF-1, entre outros.
33
Figura 3: Expressão de marcadores M2 em macrófagos após estimulação com interleucina-4.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57Bl/6 foram estimulados com IL-4 pelos
tempos indicados. A) Os níveis de produção de CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após
48 horas de estimulo com IL-4 (10, 30 e 100 ng/mL). B) Os níveis de produção de CCL22 e IGF-1
foram determinados por ELISA nos tempos indicados após estímulo com IL-4 (10 ng/mL). Dados
foram mostrados como média ± EPM (n=3). ###p < 0,001 comparado com controle RPMI. Diferenças
foram analisadas por (A) one-way ANOVA e (B) two-way ANOVA, seguido por pós-teste
Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.
34
Figura 4: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia por macrófagos M2 induzidos por IL-4.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos YARG e WT (linhagem C57Bl/6) foram
estimulados com IL-4 pelos tempos indicados. A) Porcentagem de expressão de ARG-1 em BMDMs
YARG foi avaliada por citometria de fluxo nos tempos indicados com IL-4 (10 ng/mL). O Dot plot
acima é uma imagem representativa de BMDMS controle e estimulados com IL-4 após 48 horas. B) A
atividade de ARG-1 em BMDMs WT foi avaliada pela produção de uréia após 48 horas de estímulo
com IL-4 (10 ng/mL). Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). #p < 0,05 e
###
p < 0,001
comparado com controle RPMI. Diferenças foram analisadas por (A) two-way ANOVA, seguido por
pós-teste Bonferroni e (B) teste t de student.
35
Figura 5: Expressão de Arginase-1 em macrófagos M2 induzidos por IL-4.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos YARG (linhagem C57Bl/6) foram
estimulados com IL-4. A expressão de Arg1 em BMDMs YARG foi avaliada por imunofluorescencia
após 48 horas de estímulo com IL-4 (30 ng/mL). A presença de macrófagos M2 (Arg1-YFP+) esta
mostrada em amarelo e o núcleo em azul. A barra de escala representa 50 µM (20x) e 25 µM (40x).
36
4.3.
A produção de quimiocinas e mediadores marcadores M2 necessita da ativação
de ERK5
A ativação da MAPK ERK5 por células apoptóticas, imunogobulinas e outros
estímulos induz polarização para um fenótipo anti-inflamatório/regulador e promove a
expressão de marcadores M2, como Arg-1 e IL-10 (Barra et al., 2011; Heo et al., 2014;
Kozicky et al., 2015). Para investigar o papel da via de sinalização de ERK5 na regulação da
produção de quimiocinas e mediadores marcadores de fenótipo M2, pré-tratamos os
macrófagos com inibidor de ERK5, XMD 8-92. A produção de marcadores M2, como as
quimiocinas CCL17 e CCL22 e do mediador IGF-1 por macrófagos estimulados com IL-4 foi
reduzida em resposta ao tratamento com inibidor de ERK5 de maneira concentraçãodependente (figura 6). As diferentes concentrações do inibidor de ERK5 não tiveram efeito na
sobrevivência celular de BMDMs não-estimulados e estimulados com IL-4 (figura 7A e B). A
redução da produção das quimiocinas e mediadores M2, CCL17, CCL22 e IGF-1 induzida
por IL-4 foi tempo-dependente com ótima inibição entre 12 e 24 horas, e como mostrado
anteriormente também em 48 horas (figura 8). Nossos achados sugerem o envolvimento via
de sinalização de ERK5 na regulação da produção de quimiocinas e mediadores
característicos de macrófagos M2 estimulados com IL-4.
37
Figura 6: A inibição de ERK5 reduz a produção de quimiocinas e fatores marcadores de
fenótipo M2 de maneira concentração-dependente.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT (linhagem C57Bl/6) foram pré-tratados
com inibidor de ERK5 (XMD8-92) por 1 hora, e em seguida foram estimulados com IL-4 (10 ng/mL).
Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após 48 horas de
estimulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3).
###
p <0,001 comparado com
controle RPMI. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4.
Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três
experimentos independentes foi mostrado.
38
Figura 7: A sobrevivência e a viabilidade celular de BMDMs não foram alteradas pela inibição
de ERK5.
com inibidor de ERK5 (XMD8-92) por 1 hora, seguido pelo estímulo IL-4 (10 ng/mL). Viabilidade
celular, expressa em porcentagem, após tratamento com inibidor de ERK5 foi avaliada em BMDMs
(A) controle e (B) estimulados com IL-4 por 48 horas. Dados foram mostrados como média ± EPM
(n=3). Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de
três experimentos independentes foi mostrado.
39
Figura 8: A via de sinalização de ERK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de fenótipo
M2.
com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida foram estimulados com IL-4 (10
ng/mL). Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após a
estimulação com IL-4 nos tempos indicados. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). ##p
<0,01,
###
p <0,001 comparado com controle RPMI. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao
grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA, seguido por pós-teste
40
4.4.
A expressão gênica de marcadores M2 depende da ativação de ERK5
Durante a ativação alternativa, macrófagos estimulados com IL-4 expressam arginase I
(Arg-1), Fizz1 e YM1, marcadores característicos de macrófagos M2 (Mosser e Edwards,
2008). Adicionalmente, (Heo et al., 2014) descreveram recentemente o envolvimento da via
de sinalização de ERK5 na regulação de marcadores M2 e na polarização alternativa de
macrófagos induzida por fagocitose de células apoptóticas. Para investigar o papel da via de
sinalização de ERK5 na regulação da expressão de marcadores de M2, usamos um inibidor de
ERK5. Macrófagos derivados da medula óssea foram tratados com inibidor de ERK5 antes do
estimulo com IL-4. O tratamento com inibidor de ERK5 reduziu os níveis de expressão gênica
de marcadores M2, Retnla (Fizz1), Ym1 induzido por IL-4 (figura 9). Além disso, o mRNA e
os níveis proteicos de Arg-1 também foram reduzidos na presença do inibidor de ERK5
(figura 10A e C). Assim como a redução nos níveis de arginase I, também observamos
diminuição na atividade da enzima, verificado pela menor produção de ureia por macrófagos
tratados inibidor de ERK5 (figura 10B). Esses resultados sugerem o envolvimento da via de
sinalização de ERK5 na regulação da expressão gênicos de marcadores M2.
O receptor de manose (MR) é outro importante marcador de macrófagos M2, induzido
por IL-4 e também por uma série de outros estímulos (Mantovani et al., 2002). Ao contrário
do observado na expressão gênica dos outros marcadores M2, o tratamento com inibidor de
ERK5 aumentou os níveis de mRNA do receptor de manose em relação ao grupo não tratado
(figura 11A). Confirmando nossos resultados, observamos que a inibição de ERK5 aumentou
a frequência de macrófagos que expressam receptor de manose (figura 11B). Esse achado
sugere que a expressão do receptor de manose é regulada por um mecanismo dependente de
ERK5 diferente do que o dos outros marcadores de M2 e por isso novos experimentos devem
ser realizados para comprovar esta relação. Portanto, nossos resultados confirmam o papel da
41
via de sinalização de ERK5 controle da expressão de marcadores, exceto MR, durante a
polarização de macrófagos M2.
42
Figura 9: A expressão de marcadores M2 induzida por IL-4 envolve a ativação da via de
sinalização de ERK5.
ng/mL). Os níveis de expressão de Retlna e Ym1 foram determinados por PCR quantitativo após a
estimulação com IL-4 nos tempos indicados. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). #p
<0,05,
##
p <0,01,
###
p <0,001 comparado com controle no tempo 0 h. *p <0,05, **p <0,01, ***p
<0,001 comparado ao grupo pré-tratado com veículo. Diferenças foram analisadas por two-way
ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.
43
Figura 10: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da
via de sinalização de ERK5.
ng/mL). O nível de expressão de Arg1 foi determinado por (A) PCR quantitativo após a estimulação
com IL-4 nos tempos indicados e (C) Western blot após 48 horas. B) A atividade de ARG-1 foi
avaliada pela produção de uréia após 48 horas de estímulo com IL-4 (10 ng/mL). Dados foram
mostrados como média ± EPM (n=3). #p <0,05,
##
p <0,01,
###
p <0,001 comparado com controle no
tempo 0 h ou RPMI. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao grupo pré-tratado com veículo.
Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três
experimentos independentes foi mostrado.
44
Figura 11: Expressão do receptor de manose (MR) é regulado negativamente pela ativação da
via de sinalização de ERK5.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT (linhagem C57Bl/6 e BALB/c) foram
pré-tratados com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida foram estimulados
com IL-4 (10 ng/mL). A) Os níveis de expressão de Mrc em BMDM WT (linhagem C57Bl/6) foi
determinado por PCR quantitativo após a estimulação com IL-4 nos tempos indicados. B) A
porcentagem de expressão de MR em BMDM WT (linhagem BALB/c) foi avaliada por citometria de
fluxo após 48 horas de estímulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3).
###
p
<0,001 comparado com controle no tempo 0 h. **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao grupo prétratado com veículo. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA, seguido por pós-teste
45
4.5. Envolvimento da via de sinalização de MEK5 na expressão de marcadores M2
Em resposta ao uma série de diferentes estímulos MEK5, uma MAPKK, promove a
ativação de ERK5 através de fosforilação, que transloca para o núcleo e fosforila uma série de
proteínas alvos (Wang e Tournier, 2006). Para investigar o possível papel da via de
sinalização de MEK5 na produção de quimiocina e mediadores de marcadores de ativação
alternativa, macrófagos derivados da medula óssea foram pré-tratados com inibidor de MEK5
(BIX 02189) antes do estimulo com IL-4. A produção de quimiocinas e mediadores de perfil
M2 foram detectados usando ensaio de ELISA. O tratamento com o inibidor de MEK5
reduziu a produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 induzida por IL-4 (figura 12).
Como mostramos acima, a sinalização de ERK5 é importante para a expressão de
marcadores M2 em macrófagos estimulados com IL-4. Para avaliar a participação do eixo
MEK5/ERK5 na regulação da expressão de arginase I em macrófagos induzida por IL-4. Os
níveis de expressão de arginase I foram determinados por citometria de fluxo usando BMDMs
de camungongos YARG. Ambos os inibidores, de ERK5 e de MEK5, reduziram fortemente
os níveis de expressão de arginase I em macrófagos estimulados com IL-4, tanto em
frequência relativa quanto em níveis de expressão (figura 13A e B). Para confirmar nossos
resultados, foram também determinados os níveis proteicos de arginase I por western blot. Da
mesma maneira, ambos os inibidores, de ERK5 e MEK5, reduziram profundamente os níveis
proteicos de arginase I induzida por IL-4 (figura 14A). Além disso, assim como o inibidor de
ERK5, o inibidor de MEK5 diminui produção de uréia por macrófagos estimulados com IL-4
(figura 14B). Dessa forma, nossos resultados mostram que a inibição da sinalização de ERK5
e MEK5 resulta em baixa ativação alternativa de macrófagos e confirmam a participação do
eixo MEK5/ERK5 na polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4.
46
Figura 12: A via de sinalização de MEK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de
fenótipo M2.
com inibidor de MEK5 (BIX02189) por 1 hora, e em seguida foram estimulados com IL-4 (10
ng/mL). Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após 48
horas de estimulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3).
###
p <0,001
comparado com controle RPMI. ***p <0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças
foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos
independentes foi mostrado.
47
Figura 13: A via de sinalização de MEK5/ERK5 controla a expressão de marcadores de fenótipo
M2.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos YARG (linhagem C57Bl/6) foram prétratados com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) e MEK5 (BIX02189, 10 µM) por 1 hora, e em
seguida foram estimulados com IL-4 (30 ng/mL). A) A frequência de BMDMs Arg1-YFP+ foi
avaliada por citometria de fluxo após 48 horas de estimulo com IL-4. O Dot plot acima é uma imagem
representativa da frequência de BMDMS Arg1-YFP+. B) Os níveis de expressão de ARG1 por
intensidade média de fluorescência em YARG BMDMs foram expressos em histograma. Dados foram
mostrados como média ± EPM (n=3).
###
p <0,001 comparado com controle RPMI. ***p <0,001
comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA,
seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.
48
Figura 14: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da
via de sinalização de MEK5/ERK5.
com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) e MEK5 (BIX02189, 10 µM) por 1 hora, e em seguida
foram estimulados com IL-4 (10 ng/mL). A) O nível de expressão de Arg1 foi determinado por
Western blot após 48 hs de estimulo com IL-4. B) A atividade de ARG-1 foi avaliada pela produção
de uréia após 48 horas de estímulo com IL-4 (10 ng/mL). Dados foram mostrados como média ± EPM
(n=3).
###
p <0,001 comparado com controle RPMI. *p <0,05, ***p <0,001 comparado ao grupo
estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste
49
4.6.
A via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2 não regula a
ativação de STAT6 nem a expressão de C/EBPβ
O fator de transcrição STAT6 desempenha um papel central na expressão de genes
marcadores de M2 induzida por IL-4, como Arg1, Ym1 e Fizz1 (Mantovani et al., 2002).
Assim, investigamos o papel de STAT6 na produção de quimiocionas e mediadores
marcadores de M2 induzida por IL-4 em BMDMs de camundongo deficientes para STAT6.
Após estimulação com IL-4, BMDMs deficientes para STAT6 apresentaram uma dramática
redução na produção das quimiocinas e mediadores M2, como CCL17, CCL22 e IGF-1
comparado com os BMDMs WT (figura 15A). Adicionalmente, foi demonstrado que em
macrófagos a expressão de arginase I induzida por IL-4 depende da ativação de STAT6 (Gray
et al., 2005). De acordo com essa informação, observamos também menor produção uréia
pelos macrófagos deficientes para STAT6 (figura 15B). Nossos resultados juntos de outros
publicados anteriormente confirmam o papel essencial de STAT6 na regulação da expressão
de marcadores M2.
A ligação da IL-4 no seu receptor ativa proteínas tirosina quinases da família JAK,
levando a uma rápida fosforilação e ativação de STAT6, o qual transloca para o núcleo e se
liga em regiões especificas de promotores de genes marcadores de M2 (Heller et al., 2008).
Baseado nessa informação, investigamos se a polarização de macrófagos M2 mediada pela
sinalização de ERK5 está envolvida com a ativação de STAT6 induzida por IL-4. Os níveis
de fosforilação de STAT6 foram determinados usando citometria de fluxo. A estimulação de
macrófagos com IL-4 induz rapidamente (15 min) a fosforilação de STAT6 com pico de
ativação após 1 hora. Os macrófagos tratados com inibidor de ERK5 apresentaram os mesmos
níveis de fosforilação de STAT6 comparado com o grupo controle (figura 16). Esses
resultados demonstram que a IL-4 induz fosforilação de STAT6 de forma independente da
50
ativação de ERK5, sugerindo que a via de sinalização de ERK5 age em paralelo ou à jusante
da via de STAT6 para regular a polarização de macrófagos M2.
C/EBPβ exerce também um papel importante na polarização de macrófagos M2
induzida por IL-4 (Gray et al., 2005). A indução da expressão de Cebpb mediada por CREB é
necessária para regulação expressão gênica marcadores M2, como IL10, Arg-1, IL13ra e
Msr1 (Ruffell et al., 2009). Por esta razão, avaliamos se a ativação de ERK5 regula a
expressão de Cebpb durante a polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. A expressão
gênica de Cebpb foi determinada por PCR quantitativo. O tratamento com inibidor de ERK5
não alterou os níveis de mRNA de Cebpb em macrófagos estimulados com IL-4 (figura 17).
Assim, esses dados mostram que a expressão de C/EBPβ em macrófagos induzida pela
estimulação com IL-4 não necessita da ativação de ERK5.
51
Figura 15: A expressão de marcadores de fenótipo M2 induzida por IL-4 está prejudicada na
ausência de STAT6.
Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT e STAT6-/- (linhagem BALB/c) foram
pré-tratados com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida estimulados com IL4 (10 ng/mL). A) Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA e
(B) a atividade de ARG-1 pela produção de uréia após 48 horas de estímulo com IL-4 (10 ng/mL).
Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3).
###
p <0,001 comparado com controle RPMI. ***p
<0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA,
seguido por pós-teste Bonferroni. Um de dois experimentos independentes foi mostrado.
52
Figura 16: IL-4 estimula a fosforilação de STAT6 em macrófagos independente de ERK5.
com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida estimulados com IL-4 (30
ng/mL) nos tempos indicados. Os níveis de fosforilação de STAT6 foram determinados por citometria
de fluxo após estimulo com IL-4. Os níveis de fosforilação por intensidade média de fluorescência em
BMDMs CD11b+ foram expressos em histograma, representado pelo tempo 60 minutos. Dados foram
mostrados como média ± EPM (n=3). #p <0,05, ###p <0,001 comparado com controle RPMI. *p <0,05,
***p <0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por two-way
ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de dois experimentos independentes foi mostrado.
53
Figura 17: IL-4 induz a expressão de C/EBPβ em macrófagos independente de ERK5.
ng/mL). A) O nível de expressão de C/EBPβ foi determinado por PCR quantitativo após 48 hs de
estimulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). #p <0,05,
##
p <0,01,
###
p
<0,001 comparado com controle do tempo 0 h. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA,
seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.
54
Discussão
55
4.
DISCUSSÃO
Os macrófagos desempenham um papel crucial na homeostase tecidual e na iniciação
e resolução de respostas inflamatórias. Estas células são dinâmicas, pois polarizam para
fenótipos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios, dependendo do microambiente de citocinas,
enxercendo diferentes funções fisiológicas (Biswas e Mantovani, 2010). Em um estudo
publicado anteriormente, os macrófagos foram classificados basicamente em três subtipos de
acordo com suas funções: defesa do hospedeiro, reparo tecidual e imunoregulação (Mosser e
Edwards, 2008). Macrófagos alternativamente ativados (macrófagos M2) estão envolvidos
com regulação imunológica, remodelamento tecidual, destruição de parasitas e promoção
tumoral. Os macrófagos M2 podem ser divididos em dois tipos: macrófagos M2a e
macrófagos M2b e M2c. Os macrófagos M2a, induzidos por IL-4 e IL-13, regulam o reparo
tecidual e tem função anti-inflamatória. Por outro lado, os macrófagos M2b e M2c exercem
funções imunoreguladoras, contribuem para a progressão tumoral e podem secretar grandes
quantidades de IL-10 em resposta a imuno-complexos, células apoptóticas, entre outros
(Gerber e Mosser, 2001). Macrófagos M2a e M2b/M2c são claramente distintos, tanto
funcional quanto bioquimicamente. Macrófagos M2a contribuem para a produção de matriz
extracelular, enquanto que macrófagos M2b e M2c expressam altos níveis de moléculas coestimulatórias (CD80 e CD86) e por isso podem apresentar antígenos a células T. Embora
existam diferenças entre os subtipos de macrófagos M2, a principal característica em comum
é a atividade de regulação imunológica (Edwards et al., 2006).
A via de sinalização da ERK5 participa de uma série de processos celulares, como
ativação, proliferação e polarização em diferentes tipos celulares, incluindo macrófagos.
Anteriormente, um estudo demonstrou que em resposta ao estímulo com LPS, macrófagos
murinos da linhagem RAW264.7 ativam diferentes vias de MAPK, incluindo a via de ERK5
56
(Zhu et al., 2000).
No entanto, outro trabalho observou que potentes ativadores de
macrófagos como LPS e IFN-γ, bem como outros citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e IL6 falham em ativar ERK5 em linhagem de macrófagos murinos BAC1.2F5 (Rovida et al.,
2008). No presente estudo, investigamos a ativação de ERK5 induzida por LPS e IL-4 em
macrófagos derivados da medula óssea. Nossos resultados demonstram que embora tenham
cinéticas diferentes, tanto IL-4 quanto LPS induzem a ativação da via de sinalização de ERK5
em macrófagos derivados da medula óssea, sugerindo o envolvimento da via de ERK5 na
polarização de macrófagos M1 e M2.
Recentemente,
foi
demonstrado
que
a
estimulação
de
macrófagos
com
imunoglobulinas polarizam para um estado anti-inflamatório, através da sinalização de ERK5,
(Kozicky et al., 2015). Embora alguns trabalhos já tenham demonstrado o papel de ERK5 na
regulação da expressão de marcadores M2 (Heo et al., 2014), ainda não havia sido descrito o
envolvimento da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2a induzida por
IL-4. Uma vez observada a ativação de ERK5 em macrófagos estimulados com IL-4, a
próxima etapa foi investigar os efeitos da inibição farmacológica de ERK-5. Para tanto,
utilizamos XMD, um inibidor de ERK5, e observamos que esses macrófagos produziram
menores quantidades de mediadores inflamatórios M2, CCL17, CCL22, IGF-1 por um
período prolongado quando comparado aos macrófagos não tratados, indicando que
macrófagos com a via de ERK5 inibida são altamente resistentes a polarização M2, sugerindo
que ERK5 é um ativador intrínseco de respostas inflamatórias M2. Além disso, também
demonstramos que macrófagos tratados com inibidor de ERK5 apresentam menor polarização
para M2, representada pela baixa expressão de marcadores M2 como Arg-1, Fizz1 e Ym2
após estimulação com IL-4. A baixa resposta inflamatória de macrófagos tratados com
inibidor de ERK5 é consistente com um trabalho recente que observou diminuição de
marcadores M2 em macrófagos isolados de camundongos com deleção especifica de ERK5
57
em células mieloides (ERK5-MKO) (Heo et al., 2014). De fato, camundongos ERK5-MKO
são mais suscetíveis ao desenvolvimento de aterosclerose induzida por dieta hipercalórica e
apresentam uma baixa capacidade eferocitica e pobre polarização M2 (Heo et al., 2014).
A MAPK quinase MEK5 é o ativador imediato a montante de ERK5, promovendo sua
fosforilação e translocação para o núcleo onde regula uma série de fatores de transcrição
(Nishimoto e Nishida, 2006; Wang e Tournier, 2006). Assim como o tratamento com inibidor
de ERK5, macrófagos derivados da medula óssea tratados com um inibidor de MEK5 também
foram mais resistentes em polarizar para fenótipo M2. A inibição da via de MEK5 resultou
em baixa expressão de Arg-1 e diminuição da produção de mediadores inflamatórios M2,
CCL17, CCL22, IGF-1 após ativação com IL-4. Dessa forma, MEK5 é também essencial para
a polarização de macrófagos M2 e reforça a importância da via de sinalização de
MEK5/ERK5 no controle da polarização de macrófagos M2. Contudo, experimentos futuros
serão necessários para investigar através de qual transdutor de sinal à ativação do receptor de
IL-4 promove a ativação de MEK5/ERK5.
STAT6 e C/EBPβ desempenham um papel central, bem estabelecido, na polarização
de macrófagos M2 (Gray et al., 2005). A ativação de STAT6 induzida por IL-4 é crucial para
a expressão de marcadores característicos de M2, como Arg-1, Ym1, Fizz1, IRF-4 (Biswas e
Mantovani, 2010). Em concordância com esses estudos, observamos que a estimulação com
IL-4 promove uma rápida ativação de STAT6 em macrófagos WT. Macrófagos deficientes
para STAT6 foram menos responsivos a estimulação com IL-4. De fato, os macrófagos
STAT6-KO produziram menores quantidades de quimiocinas e mediadores M2, CCL17,
CCL22, IGF-1 após ativação in vitro com IL-4, indicando que a depleção genética de STAT6
em macrófagos torna-os altamente resistentes a polarização M2, confirmando o papel central
de STAT6 na regulação de respostas inflamatórias M2. Além disso, foi detectada menor
produção de uréia pelos macrófagos STAT6-KO, possivelmente devido a uma menor
58
expressão de Arg-1, marcador M2 fortemente regulado por STAT6. Curiosamente, não
observamos diferença nos níveis de fosforilação de STAT6 induzidos por IL-4 em
macrófagos WT tratados e não-tratados com inibidor de ERK5, sugerindo que ERK5 possa
regular a polarização de macrófagos M2 em paralelo ou à jusante da sinalização de STAT6.
Embora a maior parte das atividades de IL-4 seja regulada pela ativação da via de
JAK/STAT6, estudos indicam que outras moléculas de sinalização, tais como as MAPK
também podem estar envolvidas (Kelly-Welch et al., 2003). Recentemente, demonstraram
que a MAPK p38, mas não ERK1/2 e JNK, regula a polarização de macrófagos induzida por
IL-4 através de mecanismo dependente tanto da via de STAT6, quanto da via de PI3K/Akt,
ambas independentes uma da outra (Jiménez-Garcia et al., 2015). E assim como a via
PI3K/Akt ativada por p38, observamos que a MAPK ERK5 pode controlar a polarização de
macrófagos M2 induzida por IL-4 por uma via de sinalização paralela ou à jusante de STAT6.
A expressão C/EBPβ induzida por CREB é necessária para regeneração de músculo
lesionado e para regulação de genes associados ao fenótipo M2, como Arg-1, IL-10 e MR
(Ruffell et al., 2009). De fato, após a eferocitose de células apopticas, ERK5 é capaz de
promover a ativação de CREB e a subsequente expressão de Arginase II, polarizando os
macrófagos para um fenótipo regulador (Barra et al., 2011). Entretanto, em macrófagos
estimulados com IL-4, a tratamento com inibidor de ERK5 não alterou os níveis de expressão
gênica de cebpb, sugerindo que a baixa polarização M2 promovida pela inibição de ERK5 não
é regulada pela expressão de C/EBPβ, apesar de já ter sido demonstrado que a depleção de
sítios para ligação de CREB no promotor de Cebpb (Ruffell et al., 2009), e consequentemente
sua expressão, reduz a aquisição de fenotipo M2. Portanto, os dados indicam que a deficiente
polarização M2 em macrófagos tratados com inibidor de ERK5 não é mediada pela via
CREB-C/EBPβ.
59
Embora neste estudo não tenha sido possível identificar por qual mecanismo ERK5
regula a polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4, algum entre os diversos fatores de
transcrição com papel bem estabelecido na ativação alternativa pode esta participando no
controle desta via de sinalização. Dentre os fatores conhecidas envolvidos com a polarização
de macrófagos M2, além de STAT6 e CREB-C/EBP-β, destacam-se: PPARγ, IRF4, o cMYC, KLF4. A atividade de PPARγ pode ser regulada positivamente por ERK5 e a ativação
de ERK5 pode inibir respostas pró-inflamatórias através da ativação de PPARγ (Woo et al.,
2006). De fato, a depleção de PPAR-γ em macrófagos prejudica a polarização para fenótipo
M2 (Odegaard et al., 2007). Além disso, IRF-4 também é um dos fatores que exercem um
papel crucial na polarização de macrófagos M2, o qual regula uma série de genes com
funções imunológicas (El Chartouni et al., 2010), e pode ser induzido por IL-4, M-CSF,
quitina e durante a defesa do hospedeiro contra infecções helmínticas (Satoh et al., 2010).
Adicionalmente, outro fator está envolvido com a indução de genes associados com ativação
alternativa por IL-4 (Pello et al., 2012), c-MYC, o qual a expressão pode ser regulada pela
ativação de ERK5 (Takaoka et al., 2012). Em conjunto, esses estudos podem nos auxiliar na
identificação do mecanismo molecular pelo qual ERK5 controla a polarização de macrófagos
M2 induzida por IL-4.
Entender os mecanismos que participam na polarização dos macrófagos M2a é um
passo importante para o desenvolvimento de diagnóticos em doenças e estratégias terapêuticas
contra respostas infecciosas, câncer e fibrose. No presente estudo, demonstramos que
macrófagos derivados da medula óssea tratados com um inibidor de ERK5 ou MEK5 foram
mais resistentes em polarizar para fenótipo M2. Sendo assim, nosso trabalho demonstrou que
a via de sinalização de MEK/ERK5 é um regulador crítico que controla a polarização de
macrófagos M2 induzida por IL-4 e pode ser uma importante molécula alvo para o controle da
polarização de macrófagos M2 em diferentes desordens patológicas.
60
Conclusão
61
5.
CONCLUSÃO
Concluímos que a ativação da via de sinalização de MEK5/ERK5 é crítica para a
expressão de marcadores M2 durante a polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4.
Desta forma, nossos achados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos
envolvidos nas respostas de macrófagos M2a, e assim auxiliam no desenvolvimento de novas
abordagens terapêuticas para o tratamento de uma série de doenças inflamatórias.
62
Referências
63
6.
REFERÊNCIAS
BARRA, V. et al. Apoptotic cell-derived factors induce arginase II expression in murine macrophages
by activating ERK5/CREB. Cell Mol Life Sci, v. 68, n. 10, p. 1815-27, May 2011. ISSN 1420-9071.
BISWAS, S. K.; MANTOVANI, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets:
cancer as a paradigm. Nat Immunol, v. 11, n. 10, p. 889-96, Oct 2010. ISSN 1529-2916.
BLAESER, F. et al. Targeted inactivation of the IL-4 receptor alpha chain I4R motif promotes allergic
airway inflammation. J Exp Med, v. 198, n. 8, p. 1189-200, Oct 2003. ISSN 0022-1007.
CHANG, L.; KARIN, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature, v. 410, n. 6824, p. 37-40,
Mar 2001. ISSN 0028-0836.
CHEN, Z. et al. MAP kinases. Chem Rev, v. 101, n. 8, p. 2449-76, Aug 2001. ISSN 0009-2665.
DALE, D. C.; BOXER, L.; LILES, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood, v. 112, n. 4,
p. 935-45, Aug 2008. ISSN 1528-0020.
EDWARDS, J. P. et al. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage
populations. J Leukoc Biol, v. 80, n. 6, p. 1298-307, Dec 2006. ISSN 0741-5400.
EL CHARTOUNI, C.; SCHWARZFISCHER, L.; REHLI, M. Interleukin-4 induced interferon regulatory
factor (Irf) 4 participates in the regulation of alternative macrophage priming. Immunobiology, v.
215, n. 9-10, p. 821-5, 2010 Sep-Oct 2010. ISSN 1878-3279.
ELINAV, E. et al. Regulation of the antimicrobial response by NLR proteins. Immunity, v. 34, n. 5, p.
665-79, May 2011. ISSN 1097-4180.
FADOK, V. A. et al. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory
cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF. J
Clin Invest, v. 101, n. 4, p. 890-8, Feb 1998. ISSN 0021-9738.
GEISSMANN, F. et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science, v. 327,
n. 5966, p. 656-61, Feb 2010. ISSN 1095-9203.
GERBER, J. S.; MOSSER, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc
gamma receptors. J Immunol, v. 166, n. 11, p. 6861-8, Jun 2001. ISSN 0022-1767.
GORDON, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol, v. 3, n. 1, p. 23-35, Jan 2003.
ISSN 1474-1733.
64
GORDON, S. The macrophage: past, present and future. Eur J Immunol, v. 37 Suppl 1, p. S9-17, Nov
2007. ISSN 0014-2980.
GORDON, S.; MARTINEZ, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.
Immunity, v. 32, n. 5, p. 593-604, May 2010. ISSN 1097-4180.
GORDON, S.; TAYLOR, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol, v. 5, n. 12,
p. 953-64, Dec 2005. ISSN 1474-1733.
GRAY, M. J. et al. Induction of arginase I transcription by IL-4 requires a composite DNA response
element for STAT6 and C/EBPbeta. Gene, v. 353, n. 1, p. 98-106, Jun 2005. ISSN 0378-1119.
HAJISHENGALLIS, G.; LAMBRIS, J. D. Microbial manipulation of receptor crosstalk in innate immunity.
Nat Rev Immunol, v. 11, n. 3, p. 187-200, Mar 2011. ISSN 1474-1741.
HELLER, N. M. et al. Type I IL-4Rs selectively activate IRS-2 to induce target gene expression in
macrophages. Sci Signal, v. 1, n. 51, p. ra17, 2008. ISSN 1937-9145.
HEO, K. S. et al. ERK5 activation in macrophages promotes efferocytosis and inhibits atherosclerosis.
Circulation, v. 130, n. 2, p. 180-91, Jul 2014. ISSN 1524-4539.
JIMÉNEZ-GARCIA, L. et al. Critical role of p38 MAPK in IL-4-induced alternative activation of
peritoneal macrophages. Eur J Immunol, v. 45, n. 1, p. 273-86, Jan 2015. ISSN 1521-4141.
KAWAI, T.; AKIRA, S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection
and immunity. Immunity, v. 34, n. 5, p. 637-50, May 2011. ISSN 1097-4180.
KELLY-WELCH, A. E. et al. Interleukin-4 and interleukin-13 signaling connections maps. Science, v.
300, n. 5625, p. 1527-8, Jun 2003. ISSN 1095-9203.
KIM, C. et al. Antiinflammatory cAMP signaling and cell migration genes co-opted by the anthrax
bacillus. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 105, n. 16, p. 6150-5, Apr 2008. ISSN 1091-6490.
KONO, H.; ROCK, K. L. How dying cells alert the immune system to danger. Nat Rev Immunol, v. 8, n.
4, p. 279-89, Apr 2008. ISSN 1474-1741.
KOZICKY, L. K. et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10producing activation state. J Leukoc Biol, Jul 2015. ISSN 1938-3673.
KREIDER, T. et al. Alternatively activated macrophages in helminth infections. Curr Opin Immunol, v.
19, n. 4, p. 448-53, Aug 2007. ISSN 0952-7915.
65
LAWRENCE, T.; NATOLI, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity
with identity. Nat Rev Immunol, v. 11, n. 11, p. 750-61, Nov 2011. ISSN 1474-1741.
LEE, J. D.; ULEVITCH, R. J.; HAN, J. Primary structure of BMK1: a new mammalian map kinase.
Biochem Biophys Res Commun, v. 213, n. 2, p. 715-24, Aug 1995. ISSN 0006-291X.
LIU, Y. C. et al. Macrophage polarization in inflammatory diseases. Int J Biol Sci, v. 10, n. 5, p. 520-9,
2014. ISSN 1449-2288.
LU, H. et al. Macrophages recruited via CCR2 produce insulin-like growth factor-1 to repair acute
skeletal muscle injury. FASEB J, v. 25, n. 1, p. 358-69, Jan 2011. ISSN 1530-6860.
MANTOVANI, A. et al. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and
polarization. Trends Immunol, v. 25, n. 12, p. 677-86, Dec 2004. ISSN 1471-4906.
MANTOVANI, A. et al. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for
polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol, v. 23, n. 11, p. 549-55, Nov 2002. ISSN
1471-4906.
MARTINEZ, F. O. et al. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage
differentiation and polarization: new molecules and patterns of gene expression. J Immunol, v. 177,
n. 10, p. 7303-11, Nov 2006. ISSN 0022-1767.
MARTINEZ, F. O. et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci, v. 13, p. 453-61, 2008.
ISSN 1093-9946.
MOREIRA, A. P.; HOGABOAM, C. M. Macrophages in allergic asthma: fine-tuning their pro- and antiinflammatory actions for disease resolution. J Interferon Cytokine Res, v. 31, n. 6, p. 485-91, Jun
2011. ISSN 1557-7465.
MORO, K. et al. Innate production of T(H)2 cytokines by adipose tissue-associated c-Kit(+)Sca-1(+)
lymphoid cells. Nature, v. 463, n. 7280, p. 540-4, Jan 2010. ISSN 1476-4687.
MOSSER, D. M. The many faces of macrophage activation. J Leukoc Biol, v. 73, n. 2, p. 209-12, Feb
2003. ISSN 0741-5400.
MOSSER, D. M.; EDWARDS, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev
Immunol, v. 8, n. 12, p. 958-69, Dec 2008. ISSN 1474-1741.
66
MUNDER, M.; EICHMANN, K.; MODOLELL, M. Alternative metabolic states in murine macrophages
reflected by the nitric oxide synthase/arginase balance: competitive regulation by CD4+ T cells
correlates with Th1/Th2 phenotype. J Immunol, v. 160, n. 11, p. 5347-54, Jun 1998. ISSN 0022-1767.
MURPHY, C. A. et al. Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint
autoimmune inflammation. J Exp Med, v. 198, n. 12, p. 1951-7, Dec 2003. ISSN 0022-1007.
MURRAY, P. J.; WYNN, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev
Immunol, v. 11, n. 11, p. 723-37, Nov 2011. ISSN 1474-1741.
NAIR, M. G. et al. Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator
of type 2 inflammation in the lung. J Exp Med, v. 206, n. 4, p. 937-52, Apr 2009. ISSN 1540-9538.
NAKAMURA, K.; JOHNSON, G. L. PB1 domains of MEKK2 and MEKK3 interact with the MEK5 PB1
domain for activation of the ERK5 pathway. J Biol Chem, v. 278, n. 39, p. 36989-92, Sep 2003. ISSN
0021-9258.
NATHAN, C. Metchnikoff's Legacy in 2008. Nat Immunol, v. 9, n. 7, p. 695-8, Jul 2008. ISSN 15292916.
NEILL, D. R. et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2
immunity. Nature, v. 464, n. 7293, p. 1367-70, Apr 2010. ISSN 1476-4687.
NELMS, K. et al. The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol,
v. 17, p. 701-38, 1999. ISSN 0732-0582.
NISHIMOTO, S.; NISHIDA, E. MAPK signalling: ERK5 versus ERK1/2. EMBO Rep, v. 7, n. 8, p. 782-6, Aug
2006. ISSN 1469-221X.
NOVAK, M. L.; KOH, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol, v. 93, n. 6, p.
875-81, Jun 2013. ISSN 1938-3673.
ODEGAARD, J. I. et al. Macrophage-specific PPARgamma controls alternative activation and improves
insulin resistance. Nature, v. 447, n. 7148, p. 1116-20, Jun 2007. ISSN 1476-4687.
PELLO, O. M. et al. Role of c-MYC in alternative activation of human macrophages and tumorassociated macrophage biology. Blood, v. 119, n. 2, p. 411-21, Jan 2012. ISSN 1528-0020.
PESCE, J. T. et al. Arginase-1-expressing macrophages suppress Th2 cytokine-driven inflammation
and fibrosis. PLoS Pathog, v. 5, n. 4, p. e1000371, Apr 2009. ISSN 1553-7374.
67
PRIETO, J. et al. Increased interleukin-13 mRNA expression in bronchoalveolar lavage cells of atopic
patients with mild asthma after repeated low-dose allergen provocations. Respir Med, v. 94, n. 8, p.
806-14, Aug 2000. ISSN 0954-6111.
RAES, G. et al. Differential expression of FIZZ1 and Ym1 in alternatively versus classically activated
macrophages. J Leukoc Biol, v. 71, n. 4, p. 597-602, Apr 2002. ISSN 0741-5400.
REESE, T. A. et al. Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with
allergy. Nature, v. 447, n. 7140, p. 92-6, May 2007. ISSN 1476-4687.
ROBINSON, M. J.; COBB, M. H. Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr Opin Cell Biol, v. 9,
n. 2, p. 180-6, Apr 1997. ISSN 0955-0674.
ROVIDA, E. et al. ERK5/BMK1 is indispensable for optimal colony-stimulating factor 1 (CSF-1)-induced
proliferation in macrophages in a Src-dependent fashion. J Immunol, v. 180, n. 6, p. 4166-72, Mar
2008. ISSN 0022-1767.
RUFFELL, D. et al. A CREB-C/EBPbeta cascade induces M2 macrophage-specific gene expression and
promotes muscle injury repair. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 106, n. 41, p. 17475-80, Oct 2009. ISSN
1091-6490.
SANSON, M.; DISTEL, E.; FISHER, E. A. HDL induces the expression of the M2 macrophage markers
arginase 1 and Fizz-1 in a STAT6-dependent process. PLoS One, v. 8, n. 8, p. e74676, 2013. ISSN
1932-6203.
SATOH, T. et al. The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses
against helminth infection. Nat Immunol, v. 11, n. 10, p. 936-44, Oct 2010. ISSN 1529-2916.
SHAUL, M. E. et al. Dynamic, M2-like remodeling phenotypes of CD11c+ adipose tissue macrophages
during high-fat diet--induced obesity in mice. Diabetes, v. 59, n. 5, p. 1171-81, May 2010. ISSN 1939327X.
SMITH, A. M. et al. Disordered macrophage cytokine secretion underlies impaired acute
inflammation and bacterial clearance in Crohn's disease. J Exp Med, v. 206, n. 9, p. 1883-97, Aug
2009. ISSN 1540-9538.
STEIN, M. et al. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a
marker of alternative immunologic macrophage activation. J Exp Med, v. 176, n. 1, p. 287-92, Jul
1992. ISSN 0022-1007.
SUN, X. J. et al. Role of IRS-2 in insulin and cytokine signalling. Nature, v. 377, n. 6545, p. 173-7, Sep
1995. ISSN 0028-0836.
68
TAKAOKA, Y. et al. Forced expression of miR-143 represses ERK5/c-Myc and p68/p72 signaling in
concert with miR-145 in gut tumors of Apc(Min) mice. PLoS One, v. 7, n. 8, p. e42137, 2012. ISSN
1932-6203.
WANG, X.; TOURNIER, C. Regulation of cellular functions by the ERK5 signalling pathway. Cell Signal,
v. 18, n. 6, p. 753-60, Jun 2006. ISSN 0898-6568.
WIDMANN, C. et al. Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from
yeast to human. Physiol Rev, v. 79, n. 1, p. 143-80, Jan 1999. ISSN 0031-9333.
WIRNSBERGER, G. et al. IL-4 induces expression of TARC/CCL17 via two STAT6 binding sites. Eur J
Immunol, v. 36, n. 7, p. 1882-91, Jul 2006. ISSN 0014-2980.
WOO, C. H. et al. ERK5 activation inhibits inflammatory responses via peroxisome proliferatoractivated receptor delta (PPARdelta) stimulation. J Biol Chem, v. 281, n. 43, p. 32164-74, Oct 2006.
ISSN 0021-9258.
WYNN, T. A.; CHAWLA, A.; POLLARD, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and
disease. Nature, v. 496, n. 7446, p. 445-55, Apr 2013. ISSN 1476-4687.
YAN, C. et al. Molecular cloning of mouse ERK5/BMK1 splice variants and characterization of ERK5
functional domains. J Biol Chem, v. 276, n. 14, p. 10870-8, Apr 2001. ISSN 0021-9258.
ZHANG, X.; MOSSER, D. M. Macrophage activation by endogenous danger signals. J Pathol, v. 214, n.
2, p. 161-78, Jan 2008. ISSN 0022-3417.
ZHAO, A. et al. Th2 cytokine-induced alterations in intestinal smooth muscle function depend on
alternatively activated macrophages. Gastroenterology, v. 135, n. 1, p. 217-225.e1, Jul 2008. ISSN
1528-0012.
ZHOU, G.; BAO, Z. Q.; DIXON, J. E. Components of a new human protein kinase signal transduction
pathway. J Biol Chem, v. 270, n. 21, p. 12665-9, May 1995. ISSN 0021-9258.
ZHU, W. et al. Regulation of TNF expression by multiple mitogen-activated protein kinase pathways.
J Immunol, v. 164, n. 12, p. 6349-58, Jun 2000. ISSN 0022-1767.
ZURAWSKI, S. M. et al. Receptors for interleukin-13 and interleukin-4 are complex and share a novel
component that functions in signal transduction. EMBO J, v. 12, n. 7, p. 2663-70, Jul 1993. ISSN 02614189.
69

Estudo da participação da via de sinalização dependente de ERK5

Transcrição

Documentos relacionados

conheça nossa religião

Setembro 2007 - Teia de Thea

0 070509 AHT Auto Hemoterapia Luiz Moura 1 COLUNAREVISADO

Interferência de ondas curtas pulsadas na adesividade e na

tecido conjuntivo

Ativação do Sistema de Gerenciamento Empresarial

WebQualis - Consulta Periódicos

Micobactérias

Comparando o tamanho dos planetas anões com a Terra em uma

Membros do Laboratório - CRID