File

30/07/12
Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças Humanas Quais os componentes de complexos
que ligam RNA?
Graduação -­‐ Farmácia -­‐ Análises Clínicas MicroRNAs e células-­‐tronco Quais os alvos e RBPs?
Mestrado -­‐ Farmácia -­‐ Biologia Molecular-­‐RNA RBP Katlin B. Massirer Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças Humanas Rio-­‐Julho 2012 [email protected] Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças Humanas Quais os componentes de complexos
que ligam RNA?
Lab: RBP, miRNA Doenças humanas hnRNP A1
hnRNP K
SF2/ASF
poliA
RBP neurô
nios Câncer
eIF4E
nios neurô
Sam68
TLS/FUS
NOVA
neurô
nios nios neurô
Ataxias
PABN1
SMA
DM
DMPK
SMN
MBNL
FMRP
OPMD
Atrofias
musculares
PEM/SN
FXS
“Central Dogma” – passos de regulação LIN28
FOX3
ALS
Doenças
neurológicas
FXTAS
FOX2
TET
EWS
TDP-43
POMA
ATXN2
Células-tronco
Translocação
Auto-imunidade
“Central Dogma” Argonautes
Sarcomas
QKI
CTE Proteínas de ligação a RNA e processos celulares
Quais os alvos e RBPs?
RBP poliA
Doutorado -­‐ Biologia/Bioinformá5ca C. elegans miRNAs Pós – doc -­‐ Med Regenera5va CTE, RBP, Bioinformá5ca Centro de Biologia Molecular e Engenharia Gené5ca R BP
RBP
RBP hnRNP A2
CUGBP1
Figure 7-­‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Estrutura gênica “Central Dogma”-­‐ expandido RNA polimerase Dependente de RNA 7-­‐methylguanylate cap Transcrição Reversa
RNAs não-­‐codificantes Figure 7-­‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Figure 7-­‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) hYp://nitro.biosci.arizona.edu/courses/eeb600a-­‐2003/lectures/lecture24/lecture24.html 1
30/07/12
microRNAs: Descoberta e regulação microRNAs: Descoberta e regulação Descoberta dos miRNAs em C. elegans
3’UTR Regulação de mRNAs-­‐alvo específicos 5’
3’
3’UTR ~22nt - miRNAs!
Regulação de mRNAs-­‐alvo específicos seed
5’
3’
~22nt - miRNAs!
seed
Cell, December 1993!
Nature, 2000!
Biogênese e processamento de microRNAs núcleo RNaseIII! RNaseIII!
CAP poliA miRNA primário núcleo RNaseIII! RNaseIII!
Drosha/DGCR8!
lin-41 3’ UTR!
Drosha/DGCR8!
citoplasma Processamento em miRNA precursor CAP poliA miRNA primário citoplasma Processamento em miRNA precursor Maturação em miRNAs 22nt RNaseIII! RNaseIII!
Ago-RISC!
miRNAs exercendo: regulação por degradação de mRNAs-­‐alvo stages of larval!
Development-!
Larva:!
Organismo: C. elegans Northern agarose-­‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-­‐14 3’
~22nt miRNAs!
seed
Proteína!
LIN-41!
let-7 miRNA!
L1!
L2!
L3!
L4!
miRNAs exercendo regulação por degradação de mRNAs-­‐alvo Organismo: C. elegans Northern agarose-­‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-­‐14 Northern agarose-­‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-­‐28 Northern agarose-­‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-­‐28 Northern agarose-­‐ controle membrana sonda seq complementar a eg-­‐2 Northern agarose-­‐ controle membrana sonda seq complementar a eg-­‐2 Northern agarose-­‐controle no gel Northern agarose-­‐controle no gel Northern acrilamida-­‐ microRNA sonda seq complementar a let-­‐7 ~22nt Northern acrilamida-­‐ microRNA sonda seq complementar a let-­‐7 ~22nt Northern acrilamida-­‐ controle no gel rRNA de ~120nt Northern acrilamida-­‐ controle no gel rRNA de ~120nt Bagga et al., Cell 2005!
AUU!
CUGCCUC3’!
GAUGGAGU5’!
AU!
5’UUAUACAACC
3’UUGAUAUGUUGG
Slack et al., 2000; Reinhart et al., 2000!
miRNAs exercendo: regulação por degradação de mRNAs-­‐alvo stages of larval!
Development-!
Larva:!
GUU! A! 3’
CUACCUCA
GAUGGAGU5’
AU!
5’UUAUACAACC
3’UUGAUAUGUUGG
Desenvolvimento larval!
3’UTR 5’
let-7 RNA!
Dicer!
!
Regulação específica de mRNAs-­‐alvo miRNAs inicialmente descrito: regulação por inibição da tradução Nível Proteico Biogênese e processamento de microRNAs Bagga et al., Cell 2005!
2
30/07/12
Funções dos microRNAs LIN-­‐28 é altamente expressa em CTE Pluripotência de células-tronco!
Células - CTE!
Células diferenciadas!
!
Hematopoiese!
Células tronco!
hematopoiética!
miR-181!
!
miRNAs!
específicos!
let-7!
LIN-­‐28 inibe let-­‐7 em CTE (proteína de ligação a RNA) Célula B!
miR-142!
miR-223!
Célula T!
let-7!
(Houbaviy et al., 2003; Suh et al., 2004, 2011)!
(Chen et al., 2004)!
Gregory, 2008!
LIN-­‐28 inibe let-­‐7 em CTE Perfil de miRNA CTE X iPSCs CTE – diferenciação neuronal (reprogramação não é perfeita) CTE neurô
nios neurônios neurô
nios neurônios Gregory; 2008!
Chin et al, 2009 Perfil de miRNAs em CTE e céls derivadas Perfil de miRNAs qPCR miRNA Shi et al., 2007 • hYp://www.systembio.com/microrna-­‐research/expression-­‐profiling/stem-­‐cell-­‐collec5on/technical-­‐details • Biocat Morissey et al, 2011 3
30/07/12
Expressão de miRNAs gerando teratoma (miR-­‐302/miR307) Supressão de Hdac2 por VPA é essencial para a reprogramação por miRNAs Morrisey 2011 Morrisey 2011 Banco público de miRNAs: miRBase.org Predição de alvos de miRNAs Exemplo: TargetScan – conservação da ligação de let-­‐7 Resumo: Reprogramação em iPSCs por miRNAs Chang & Gregory 2011 miRBase.org informação detalhada sobre cada miRNA Predição de alvos de miRNAs Exemplo: TargetScan Agradecimento/Colaborações
Perfil esperado de um profissional no lab • Tenha iniciativa- seja pró-ativo
Lab:
Ricardo Paixão (bioinformática)
Anete Pereira de Souza
Ana Maria Azeredo-Espin • Seja responsável
• Apaixone-se pelo que faz
• Saiba do que está falando – leia artigos, estude os protocolos,
entenda ferramentas de bioinformática
•  Seja crítico: biologia molecular, celular, embriologia,
• bioquímica, epigenética
Adriana Franco Paes Leme
Pasquinelli Lab (UCSD)- microRNA
Yeo Lab (UCSD)-CLIP/sequenciamento
• Saiba inglês - muito bem
• Aproveite seu tempo!
Stem Cell Core Lab (UCSD)
Muotri Lab (UCSD) – CTE e iPSC
4