centro universitário do maranhão pró-reitoria de pós

Transcrição

CENTRO UNIVERSITÁRIO DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
RONALDO DOERING MOTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE PRODUTOS OBTIDOS A
PARTIR DA POLPA DA SACCHARUM OFFICINARUM (CANA DE AÇÚCAR)
São Luís
2014
RONALDO DOERING MOTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE PRODUTOS OBTIDOS A
PARTIR DA POLPA DA SACCHARUM OFFICINARUM (CANA DE AÇÚCAR)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.
Orientadora: Profª. Drª. Patrícia de Maria Silva
Figueiredo
Co-orientadora: Profª. Drª. Cristina de Andrade
Monteiro
São Luís
2014
AGRADECIMENTOS
A todos que contribuíram direta ou indiretamente com este trabalho.
Aos professores e colegas do UNICEUMA, especialmente Andréia e Professora
Cristina pela paciência e colaboração.
Aos colegas de turma, especialmente Roseane, Martina e Patrícia pela amizade.
À Professora Patrícia pelo apoio incondicional nos momentos mais difíceis.
Aos meus grandes amores Neon, Ronaldo, Neia, Diego e Fernando.
“A humildade exprime uma das raras certezas de
que estou certo: a de que ninguém é superior a
ninguém”.
Paulo Freire
RESUMO
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) é uma planta que produz, em curto período, um
alto rendimento de matéria verde, energia e fibras, sendo considerada uma das plantas com
maior eficiência fotossintética. Seu plantio em larga escala é tradicional em vários países das
regiões tropical e subtropical para a produção de açúcar, álcool e outros subprodutos. O
objetivo deste trabalho foi verificar a atividade antimicrobiana de três fórmulas farmacêuticas
(óvulo, creme e solução) manipuladas provenientes do extrato etanólico (EE) da polpa da
cana-de-açúcar, sobre bactérias e fungos de interesse clínico. Inicialmente foi realizado um
teste de triagem em Agar com os produtos manipulados A partir desde resultado, foi utilizado
o produto com maior atividade antimicrobiana e o extrato etanólico (EE) para a determinação
da concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM),
concentração fungicida mínima (CFM) e a capacidade de degradação de biofilme formado
pelos microrganismos analisados (10 amostras de bactérias e 10 amostras de fungos). A
solução foi o produto que apresentou melhor atividade antimicrobiana no teste de triagem,
pois todas as amostras bacterianas analisadas (Escherichia coli ATCC 2592, Streptococcus
agalactiae ATCC 13813, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27883, K. pneumoniae ATCC
700.003 e Staphylococcus aureus ATCC 25923) foram sensíveis a ela. As amostras de S.
pyogenes, K. pneumoniae e S. aureus foram sensíveis ao creme e nenhuma das amostras foi
sensível ao óvulo. Em relação à solução, a menor CIM encontrada foi de 7 mg/mL para os
isolados clínicos de Candida rugosa, Trichosporon mucoides e Candida parapsilosis. A CFM
da solução foi de 370 mg/mL para os seguintes patógenos: Candida glabrata, Candida
parapsilosis, Cryptococcus laurentii (amostras 1 e 2), Trichosporon mucoides, Trichosporon
asahii, Candida albicans (ATCC 18804) e Candida rugosa. A menor CBM para a solução foi
de 750 mg/mL para os seguintes patógenos: MRSA - Staphylococcus aureus resistente à
meticilina (ATCC 343602), Staphylococcus aureus, S. pyogenes e K. pneumoniae. Foi
verificada uma atividade na degradação do biofilme formado nas cepas de MRSA,
Pseudomonas
aeruginosa
e
nas
amostras
clínicas
de
Acinetobacter
baumannii,
Stenotrophomonas maltophilia e Trichosporon mucoides tanto pela solução quanto pelo EE.
Esse grande espectro de ação e sua atuação no biofilme formado de cepas multiressistentes
mostram a importância da utilização dos produtos derivados do extrato de S. officinarum
contra as bactérias e fungos de interesse clínico testados.
Palavras-chave: Antimicrobiano; Biofilme; Saccharum officinarum; Extrato etanólico.
ABSTRACT
The sugarcane (Saccharum officinarum) is a plant that produces, in short, a high yield of
green energy and fiber material, is considered one of the plants with higher photosynthetic
efficiency. Its large-scale planting is traditional in many countries of the tropical and
subtropical regions for the production of sugar, ethanol and other by products. The objective
of this study was to investigate the antimicrobial activity of three pharmaceutical formulations
(ovule, cream and solution) manipulated from the ethanol extract (EE) of pulp sugarcane
against bacteria and fungi of clinical interest. Initially a screening test with modified products
was conducted and it was verified that the solution showed the best antimicrobial activity,
because all bacterial samples (Escherichia coli ATCC 2592, Streptococcus agalactiae ATCC
13813, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27883, K. pneumoniae ATCC 700003 and
Staphylococcus aureus ATCC 25923) were sensitive to it. The samples of S. pyogenes, S.
aureus and K. pneumoniae were sensitive to the cream, and none of the samples was sensitive
to ovule. As a result from the EE and the solution was used for the determination of minimum
inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC), minimum
fungicidal concentration (MFC) and the ability to degrade the biofilm formed by
microorganisms (10 bacteria samples 10 and fungi samples ). In relation to the solution, the
lowest MIC was 7 mg / mL for the clinical isolates of Candida rugosa, Candida parapsilosis
and Trichosporon mucoides. A CFM solution was 37 mg / mL for the following pathogens:
Candida glabrata, Candida parapsilosis, Cryptococcus laurentii (samples 1 and 2),
Trichosporon mucoides, Trichosporon asahii, Candida albicans (ATCC 18804) and Candida
rugosa. The lowest MBC for the solution was 75 mg / mL for the following pathogens: MRSA
- methicillin-resistant Staphylococcus aureus (ATCC 343602), Staphylococcus aureus, K.
pneumoniae and S. pyogenes. An activity was observed in the degradation of the biofilm
formed in strains of MRSA, Pseudomonas aeruginosa and clinical samples the A. baumannii,
Stenotrophomonas maltophilia and Trichosporon mucoides the solution as both the EE. This
broad spectrum of action and its performance in the biofilm of multiresistant strains show the
importance of using products derived from this EE against these bacteria and fungi of clinical
interest.
Keywords:
Antimicrobial;
Biofilm;
Saccharum
officinarum;
Ethanol
extract.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Formação do halo de inibição sobre a P. aeruginosa pela técnica de difusão em
meio sólido pelo óvulo (O), creme (C) e solução (L) obtidos do extrato etanólico
da S. officinarum .................................................................................................... 35
Figura 2 - Degradação do biofilme formado em vidro pelo extrato etanólico e pela solução 45
Figura 3 - Degradação do biofilme formado em vidro pelo extrato etanólico e pela solução 45
Figura 4 - Biofilme em vidro da amostra de Pseudomonas aeruginosa ................................ 46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classes de metabólitos analisados na prospecção fitoquímica do extrato da polpa da
cana-de-açúcar ........................................................................................................... 28
Tabela 2 - Prospecção fitoquímica do extrato etanólico da polpa da cana-de-açúcar................. 33
Tabela 3 - Halo de inibição formado pelo extrato etanólico e pela solução sobre
microrganismopela técnica de difusão em meio sobre cepas padrão e isolados
clínicos de bactérias ................................................................................................. 34
Tabela 4 - Formação de halo de inibição pelo extrato etanólico da S. officinarum e da solução
sobre cepas padrão e isolados clínicos de bactérias no teste de difusão em meio
sólido ....................................................................................................................... 36
Tabela 5 - Formação de halo de inibição pelo extrato etanólico da S. officinarum e da solução
em cepas padrão e isolados clínicos de fungos no teste de difusão em meio sólido 37
Tabela 6 - Concentração inibitória mínima in vitro do extrato etanólico da Saccharum
officinarum e da solução sobre cepas padrão e isolados clínicos de bactérias ........ 39
Tabela 7 - Concentração inibitória mínima in vitro do extrato etanólico da polpa da
Saccharum officinarum e da solução sobre cepas padrão e isolados clínicos de
fungos ...................................................................................................................... 40
Tabela 8 - Concentração bactericida Mínima (CBM) do extrato etanólico da polpa da S.
officinarum e da solução .......................................................................................... 42
Tabela 9 - Concentração Fungicida Mínima (CFM) do extrato etanólico da polpa da S.
Officinarum e da solução fitoterápica ........................................................................ 43
Tabela 10 - Após degradação do biofilme formado em poliestireno pelo EE da cana-de-açúcar e
solução derivada deste extrato ................................................................................. 44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Culture Collection
BHI
- Brain Heart Infusion
DMSO - Dimetilsulfóxido
EDTA - Etilenodiamina-tetra ácido acético
EE
- Extrato Etanólico
ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay
CBM
- Concentração Bactericida Mínima
CFM
- Concentração Fungicida Mínima
CIM
- Concentração Inibitória Mínima
MRSA - Staphylococcus aureus resistente à meticilina
PBS
- tampão salina fosfato (phosphate buffered saline)
PCR
- Reação em cadeia de polimerase (Polimerase Chain Reaction)
pH
- potencial hidrogeniônico
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO........................................................................................................... 12
2
REFERENCIAL TEORICO ..................................................................................... 16
2.1
Biodiversidade ............................................................................................................. 16
2.2
Plantas Medicinais ...................................................................................................... 16
2.3
Atividade antimicrobiana .......................................................................................... 17
2.4
Resistência antimicrobiana ........................................................................................ 20
2.5
Métodos para determinação da atividade antimicrobiana ..................................... 21
2.6
A cultura de cana-de-açúcar ...................................................................................... 23
3
OBJETIVOS ............................................................................................................... 26
3.1
Geral ........................................................................................................................... 26
3.2
Específicos ................................................................................................................... 26
4
METODOLOGIA ....................................................................................................... 27
4.1
Tipo de estudo e local da pesquisa............................................................................. 27
4.2
Material Botânico ....................................................................................................... 27
4.3
Obtenção do Extrato Etanólico ................................................................................. 27
4.4
Estudo Fitoquímico do Extrato Etanólico ................................................................ 27
4.5
Manipulação dos produtos obtidos a partir do EE.................................................. 28 4.6
Cepas bacterianas e fúngicas ..................................................................................... 28
4.7
Preparo das suspensões microbianas ........................................................................ 29
4.8
Triagem pelo Método de difusão em Agar ............................................................... 29
4.9
Método de difusão do EE e da solução em Agar ...................................................... 30
4.10
Concentração Inibitória Mínima (CIM) do EE e da solução ................................. 30
4.11 Concentração Bactericida Mínima (CBM) ou Concentração Fungicida Mínima
(CFM) do EE e da solução ............................................................................................ 31
4.12
Degradação do Biofilme pelo EE e solução .............................................................. 31
4.12.1 Análise da degradação do biofilme formado em poliestireno ...................................... 31
4.12.2 Análise da degradação do biofilme formado em vidro ................................................. 31
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 33
5.1
Análise fitoquímica do EE.......................................................................................... 33
5.2
Triagem pelo Método de difusão em Agar ............................................................... 34
5.3
Método de difusão do EE e da solução em Agar ...................................................... 35
5.4
Concentração Inibitória Mínima (CIM) .................................................................. 38
5.5
Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Concentração Fungicida Mínima
(CFM) .......................................................................................................................... 41
5.6
Degradação do Biofilme ............................................................................................. 43
5.6.1 Análise da degradação do biofilme formado em poliestireno ...................................... 43
5.6.2 Análise da degradação do biofilme formado em vidro ................................................. 44
6
CONCLUSÃO ............................................................................................................. 47
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 48
ANEXO ........................................................................................................................ 54
12
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial, sendo
considerado o maior do planeta em número de espécies. Dados estatísticos indicam ainda que
existam 55 mil espécies de plantas, 517 anfíbios (294 endêmicos), 1622 aves (192
endêmicas), 524 mamíferos (cerca de 130 endêmicos), 468 répteis (172 endêmicos), 3000
espécies de peixes de água doce e cerca de 15 milhões de insetos, muitos completamente
desconhecidos. No entanto o maior produto de exportação comercial do país refere-se a
espécies de plantas exóticas, que foram introduzidas como, por exemplo, laranja, soja, canade-açúcar e eucalipto (BARREIRO; BOLZANI, 2009).
A biodiversidade desempenha papel fundamental na manutenção de processos
ecológicos. Além disso, o valor econômico ou utilitário da biodiversidade se apoia na
dependência do homem sobre seus recursos, por exemplo, na madeira, fibras, resinas,
produtos químicos orgânicos, genes, assim como conhecimento para aplicação em
biotecnologia, incluindo medicamentos e subprodutos cosméticos. A biodiversidade
compreende também a regulação do clima, habitats alimentares e reprodutivos para a pesca
comercial e alguns organismos que contribuem para a fertilidade do solo por meio de ciclos
interativos complexos, com a participação de organismos do solo (minhocas, cupins,
bactérias, fungos) que atuam na ciclagem de nitrogênio, fósforo e enxofre, tornando-os
disponíveis para serem absorvidos pelas plantas. Estes são alguns dos benefícios fornecidos
indiretamente da função dos ecossistemas naturais (ALHO, 2008).
Fungos, plantas, insetos, organismos marinhos e bactérias são fontes importantes
de substâncias biologicamente ativas, sendo que a maioria dos fármacos em uso clínico ou são
de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada a partir de produtos
naturais (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Muitos metabólicos secundários ou especiais se
notabilizam como matérias primas valiosas para a produção de inúmeros medicamentos
contemporâneos. Com isto, torna-se extremamente importante a colaboração entre grupos
multidisciplinares, os quais se destacam a fitoquímica, farmacologia, microbiologia,
toxicologia, farmacotécnica e outras áreas afins (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), planta medicinal é "todo e qualquer
vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins
terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semissintéticos" (VEIGA JUNIOR;
PINTO; MACIEL, 2005).
13
O uso de plantas medicinais no tratamento de diversas patologias tem aumentado
devido ao fato das plantas apresentarem um menor custo de tratamento, da aceitação da
população por terapias não convencionais e também pelo aumento da divulgação de trabalhos
científicos demonstrando a sua eficácia. Na década de 1990, 65% a 80% da população em
países desenvolvidos já utilizavam plantas medicinais como única alternativa de cuidados
básicos de saúde (BUTLER, 2008).
O governo federal aprovou a Política Federal de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos, composta por políticas publicas de saúde, meio ambiente, desenvolvimento
econômico e social, por meio do Decreto Presidencial n° 5.813, de 22 de junho de 2006. O
objetivo dessa política é “garantir à população brasileira o acesso seguro e uso racional de
plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o
desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional” (COUTO et al., 2010).
Cerca de 50% dos medicamentos empregados mundialmente na clínica médica
são obtidos de produtos naturais e seus derivados. Isto demonstra a importância e o grande
potencial químico das plantas medicinais. Sabe-se, porém que somente 15% das espécies do
mundo foram estudas fitoquimicamente e 6% biologicamente (GURIB-FAKIM, 2006). Com
o passar dos anos também tem sido observado um aumento na utilização de terapias
alternativas ou complementares por parte da população. Vários compostos naturais sejam de
origem vegetal ou animal tem apresentado atividade biológica relevante, possibilitando que
estes se tornem potenciais candidatos ao desenvolvimento de novos medicamentos (RASKIN
et al., 2002; NIERO et al., 2010).
A utilização de substâncias antibióticas ou antimicrobianas representa talvez um
dos maiores avanços da farmacoterapia. Estas substâncias estão entre os fármacos mais
utilizados em ambulatórios e hospitais e têm reduzido drasticamente a incidência de muitas
doenças infecciosas (FRANCO et al., 2007). Uma das principais causas de mortalidade no
mundo têm sido as doenças infecciosas, representando em alguns países metade dos casos de
óbitos. Este quadro é mais comum entre os países em desenvolvimento, embora também se
tenha observado um aumento no número de óbitos por infecções em países desenvolvidos. O
Brasil é o país que mais apresenta mortes por sepse grave, ocupando o 1° lugar no ranking
mundial. Na maioria destes casos as infecções são adquiridas dentro do próprio ambiente
hospitalar (BELLA CRUZ et al., 2010).
A adesão bacteriana à superfície de um biomaterial é um processo em que a
bactéria se liga firmemente à superfície e pode ser descrita como um processo de duas fases,
sendo a primeira, a fase física, instantânea e reversível e a segunda, a fase molecular e celular,
14
dependente do tempo é irreversível. Tais características, na presença de substrato, resultam
por fim na formação de microcolônias embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares
(exopolissacarídeos - EPS), o biofilme. Este tipo de disposição é vantajosa a qualquer espécie
de micro-organismo, por ocasionar proteção contra adversidades como desidratação,
colonização por bacteriófagos e antimicrobianos (MUKHERJEE, 2005). Um biofilme maduro
pode tolerar os antibióticos, em concentrações de 10-1000 vezes mais do que os necessários
para controlar as bactérias. Bactérias em biofilmes são resistentes à fagocitose, tornando
biofilmes extremamente difíceis de erradicar a partir de hospedeiros vivos. Bactérias
organizadas em biofilmes colonizam uma grande variedade de dispositivos médicos, como
cateteres, marca-passos cardíacos artificiais, válvulas cardíacas protéticas e aparelhos
ortopédicos, e está associada a várias doenças humanas, como a endocardite, infecções de
feridas e queimaduras, otite média crônica com efusão e fibrose cística (LEWIS, 2001).
O crescente número de pacientes imunocomprometidos, sobretudo transplantados,
eleva o grau de atenção a infecções causadas por leveduras patogênicas oportunistas. Em sua
maioria, estes patógenos são do gênero Candida sp. Dados revelam que 60% das espécies de
leveduras isoladas de pacientes com infecções por fungos, são da espécie C. albicans, o que
torna a infecção por este microrganismo a mais prevalente dentre os fungos. Estas infecções
são particularmente sérias, pois as células organizadas em biofilme são resistentes a
antifúngicos. A resistência a antifúngicos é adquirida no início da formação do biofilme, e
aparentemente é regida por diferentes mecanismos em biofilme novo e maduro. Sendo assim,
novas terapias são necessárias para eliminar o biofilme (MUKHERJEE, 2005).
Os microrganismos em geral possuem habilidade genética de adquirir resistência
aos fármacos utilizados como agentes terapêuticos. O problema desta resistência vem
aumentando e a perspectiva para o uso de antibióticos é indefinida. Sendo assim, pesquisas
voltadas para o estudo e avaliação de produtos naturais como terapêuticos e principalmente
com atividade antibiótica devem ser estimulados no intuito de criar novas drogas ou adaptar
as já existentes para que voltem a ter atividade (COUTINHO et al., 2004). Para que o
tratamento de uma doença infecciosa seja bem sucedido, deve-se primeiramente escolher o
antimicrobiano adequado para o micro-organismo causador da patologia. O uso inadequado
ou abusivo de agentes antimicrobianos é o principal causador de microrganismo resistente
(POWERS, 2004).
Pesquisas com plantas têm comprovado seu potencial antimicrobiano no
tratamento de várias doenças infecciosas (LIMA et al., 2006). Como principais responsáveis
pela atividade antimicrobiana de plantas medicinais têm-se os flavonóides, taninos, alcalóides,
15
saponinas e terpenos (SOUZA et al., 2007). Os flavonóides são uma classe muito extensa de
produtos naturais distribuída no reino vegetal. Estão presentes em todas as partes das plantas,
desde as raízes até as flores e frutos, sendo encontrados nos vacúolos das células. Essa ampla
classe de substâncias de origem natural, cuja síntese não ocorre na espécie humana, possui
importantes propriedades farmacológicas que atuam sobre o sistema biológico, tais como ação
antioxidante, anti-inflamatória, antialérgica, antiviral e anticarcinogênica (YAO, 2004). As
classes de flavonóides mais abundantes na cana-de-açúcar são as flavonas e seus derivados
metilados e glicosilados, estando presentes tanto os O-glicosídeos como os C-glicosídeos
(HARDY, 2000). Estudos de Vila (2006) mostraram que polpa da cana-de-açúcar possui
atividade antioxidante, porém não há registros na literatura a cerca da atividade
antimicrobiana da polpa da cana-de-açúcar e não há relatos do seu uso na medicina popular.
Desta forma, o presente trabalho foi feito no intuito de determinar a atividade antimicrobiana
de produtos obtidos da polpa da cana de açúcar (Saccharum officinarum) frente a uma seleção
de microrganismo de interesse clínico e cepas de referência (ATCC) organizados na forma
planctônica e biofilme.
16
2 REFERENCIAL TEORICO
2.1 Biodiversidade
Considerando a biodiversidade genética do Brasil, as plantas superiores surgem
como importante fonte de novos fitoterápicos. O potencial terapêutico da flora brasileira vem
sendo comprovado pelo número de publicações em revistas científicas na área de produtos
naturais, atingindo destaque em relação aos países da América Latina (CALIXTO, 2005).
O Cerrado e a Mata Atlântica são de grande importância devido a grande
biodiversidade e pelas imensas áreas de matas destruídas pelo avanço da ocupação humana e
suas atividades exploratórias A Floresta Amazônica é o bioma brasileiro com maior destaque
nacional e internacional, devido à diversidade biológica, e principalmente pela grande área
territorial e reserva de água doce (VIEIRA; MARTINS, 2002).
Diversas plantas vêm sendo empregadas na medicina popular devido ao esperado
poder curativo e preventivo a elas atribuídos, e para tal, diversas pesquisas são realizadas até
que sejam disponibilizadas para o consumo como medicamento (LANGLEY, 2000). A
utilização de produtos naturais pelo homem é tão antiga quanto sua própria história. Seu uso
se dava tanto para fins nutricionais como para fins terapêuticos. Produtos naturais de algumas
plantas, fungos, bactérias e outros organismos continuam a ser usados em preparações
farmacêuticas, e em composto puro ou extratos (ARAUJO, 2001).
2.2 Plantas Medicinais
A descoberta de novos compostos farmacologicamente ativos a partir da pesquisa
com plantas medicinais têm apresentado grande sucesso, levando a um aumento no
faturamento das indústrias farmacêuticas (NIERO, 2010). Além de que a diversidade
molecular dos produtos naturais é muito superior àquelas derivadas de produtos sintéticos
(NOVAIS et al., 2003). Isto é devido principalmente ao baixo poder aquisitivo da maioria da
população que procura uma medicina alternativa a menores custos, preocupações ecológicas e
a confirmação da eficácia das mesmas, comprovadas em estudos experimentais, clínicos e
pré-clínicos (BUTLER, 2008).
Somente por meio de um estudo químico e de um estudo detalhado de suas
propriedades biológicas, é possível a confirmação da eficácia, qualidade e segurança na
terapêutica das plantas medicinais. No entanto o uso indiscriminado pode promover efeitos
17
adversos relacionados à presença de algumas substâncias nocivas, ou até mesmo a
possibilidade de ocorrer algumas interações medicamentosas entre planta e fármaco comercial
(GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Surge assim, a necessidade do desenvolvimento de métodos
de otimização e padronização de preparações vegetais, na tentativa de obter um material
apropriado para o consumo, buscando investigar a qualidade, segurança, eficácia, pureza,
identidade e estabilidade (CRAGG; NEWMAN, 2007).
2.3 Atividade antimicrobiana
Antimicrobianos são produtos elaborados durante o metabolismo microbiano
capazes de inibir parcial ou totalmente a multiplicação de microrganismos. Estas substâncias
são classificadas como antibióticos (substâncias químicas produzidas por microrganismos) e
como quimioterápicos (substâncias sintetizadas ou produtos microbianos modificados
estruturalmente em laboratório). O uso dessas substâncias químicas revolucionou a
abordagem das infecções e o seu sucesso gerou grande otimismo em relação à prevenção e ao
tratamento dos processos infecciosos. Entretanto, a prescrição nem sempre criteriosa ou
racional desses antimicrobianos, rapidamente gerou dificuldades para seu uso, devido à
progressiva resistência bacteriana a essas drogas (MONTELLI, 2001).
Em 1940, ocorreu o primeiro caso de resistência antimicrobiana relatado com o
uso das penicilinas. A resistência antimicrobiana tem causado vários problemas terapêuticos,
visto que algumas bactérias apresentam resistência intrínseca a vários antimicrobianos e
também sofrem mutações genéticas causando problemas ainda mais graves de resistências
(BUSH, 2004). Novas tecnologias são necessárias para o combate das infecções,
especialmente frente ao microrganismo resistentes, como o desenvolvimento de novos
antimicrobianos mais eficazes que possibilitem a prospecção de novas classes de moléculas
naturais e/ou sintéticas capazes de neutralizar ou de danificar o patógeno-alvo ao invés de
inviabilizá-lo geneticamente, inibindo assim o desenvolvimento de resistência (GIBBONS,
2005). Devido ao elevado numero de casos de doenças infecciosas, a grande quantidade de
efeitos colaterais dos antimicrobianos disponíveis na clínica e a resistência antimicrobiana
tornam-se extremamente importante a busca por novos agentes antimicrobianos (BELLA
CRUZ et al., 2010).
Rice (2008) cria um conjunto que seis microrganismos multirresistentes, dentre
eles o S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii e P. aeruginosa, enfatizando duas
18
características que lhes são comuns, capacidade de persistência no meio ambiente em
condições adversas e tratamento difícil.
A espécie A. baumannii tem sido foco de atenção da comunidade médica e
científica. A sua permanência em ambientes hospitalares, a relação que estabelece com o
hospedeiro e a multirresistência a quase todas as classes de antimicrobianos, exibindo taxas
sempre crescentes de resistência, converteu-a num dilema para a saúde pública, agravado pela
falta de opções terapêuticas.
O gênero Staphylococcus compreende cerca de 40 espécies e está associado a uma
ampla variedade de doenças, sendo que aproximadamente 20 delas são responsáveis por
causar infecções oportunistas. As principais espécies causadoras de doenças são S. aureus, S.
epidermidis e S. saprophyticus (TRABULSI et al., 2005). S. aureus é uma bactéria de grande
importância na clínica, visto que esta apresenta grande potencial em desenvolver resistência
bacteriana e é responsável por diversas patologias como infecções cutâneas, intoxicação
alimentar e até infecções sistêmicas fatais (XAVIER et al., 2007). Dentre as infecções
causadas pelo S. aureus tem-se a osteomielite, bacteremia, endocardite, pneumonia, artrite
bacteriana e meningite. Estas infecções geralmente ocorrem em pacientes que sofreram algum
tipo de trauma físico, queimadura ou ainda que estejam com baixa imunidade (SILVA et al.,
2007).
O S. pyogenes se destaca devido à frequência e diversidade de infecções que
causa. Adere e infecta as células do trato respiratório e da pele, podendo desenvolver
faringotonsilite, piodermite, algumas vezes disseminar-se entre os tecidos e desenvolver
doenças invasivas graves como pneumonia, meningite, fasceíte necrosante, ou ainda
desencadear doenças de caráter autoimune como febre reumática e glomerulonefrite aguda. A
febre reumática é em geral debilitante, de alto custo para o sistema de saúde em todo o mundo
e suas complicações ocasionam problemas socioeconômicos relevantes, principalmente em
países em desenvolvimento (MUSSER et al., 2009)
A E. coli é um habitante normal do trato intestinal de da espécie humana e
animais e exerce um efeito benéfico sobre o organismo, suprimindo a multiplicação de
bactérias prejudiciais e sintetizando uma considerável quantidade de vitaminas. Dentre as
cepas de E. coli, entretanto, há um grupo capaz de provocar doenças em indivíduos humanos,
coletivamente chamadas de E. coli enteropatogênicas. Essas cepas ocupam hoje o segundo
lugar entre os principais agentes de doenças de origem alimentar nos Estados Unidos (OLSEN
et al., 2000). A infecção por E. coli é geralmente transmitida por meio do consumo de água ou
alimentos contaminados, tais como produtos de carne mal cozida e leite cru.
19
O S. agalactiae é causador de infecção em neonatos que pode ocasionar quadros
de septicemia, pneumonia e meningite. O risco de infecção precoce e dez a quinze vezes
maiores em recém-natos prematuros, particularmente, aqueles de baixo peso onde ocorre o
favorecimento da multiplicação rápida do EGB com evolução fulminante da doença (GRASSI
et al., 2001).
As bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos são responsáveis por
diferentes processos patológicos tanto em pacientes imunocompetentes quanto em pacientes
imunodeprimidos (ANTUNES, 2006). A E. coli é uma bactérias gram-negativa responsável
por causar infecções no trato urinário e bacteremia em pacientes hospitalizados (TIBA;
NOGUEIRA; LEITE, 2009).
O reino Fungi, compreende cerca de 50.000 espécies de fungos (JAWETZ;
MELNICK; ADELBERG, 2000). Devido as suas características existe a dificuldade de se
elaborar novas estratégias terapêuticas específicas contra o microrganismo e inerte para o
hospedeiro, visto que as células fúngicas apresentam grande semelhança às células do
hospedeiro (SCHAECHTER et al., 2002). A grande maioria dos fungos é benéfica aos seres
humanos, sendo responsáveis pela produção de alimentos e bebidas alcoólicas, além de
apresentar características essenciais para o incremento da medicina, como o desenvolvimento
de fármacos, agentes imunossupressores e metabólitos bioativos úteis. No entanto, também
existem os fungos patogênicos, que causam as infecções fúngicas, conhecidas também como
micose (JAWETZ; MELNICK; ADELBERG, 2000). As micoses superficiais e cutâneas são
infecções fúngicas mais comuns e acometem principalmente pele, cabelos e unhas. As
micoses superficiais acometem as camadas superiores queratinosas da pele e cabelos e são
infecções assintomáticas. Já as micoses cutâneas são causadas principalmente pela Candida
sp e são sintomáticas afetando, e muitas vezes destruindo, as camadas epidérmicas
(FISCHER; COOK, 2001).
A C. albicans é um fungo normalmente encontrado no corpo humano sem,
contudo, ocasionar um processo patológico em indivíduos saudáveis. Este microrganismo
pode facilmente ser recuperado da mucosa oral, trato gastrointestinal, vagina e pele.
Entretanto, em certas circunstâncias, este microrganismo pode causar uma infecção,
conhecida como candidose, que acomete principalmente pacientes imunodeficientes, podendo
evoluir para infecção sistêmica (SENEVIRATNE, 2008).
Além disso, a incidência de infecções hospitalares por fungos tem aumentado
expressivamente nas últimas décadas. Até 60% dos óbitos oriundos de infecções hospitalares
são causadas por fungos. Neste contexto, as espécies do gênero Candida têm sido os agentes
20
mais frequentemente encontrados, correspondendo à cerca de 80% das infecções fúngicas de
origem hospitalar e são a quarta causa de infecção da corrente sanguínea (precedida apenas
pela estafilococus coagulase-negativa, S. aureus e enterococus), conduzindo ao óbito em
torno de 25 a 38% dos pacientes que desenvolvem candidemia. A capacidade da levedura em
aderir, infectar e causar doença em conjunto é definida como potencial de virulência ou
patogenicidade. Um dos principais mecanismos de virulência deste fungo é a sua versatilidade
de adaptação, e capacidade de adesão em sítios variados. Principalmente a formação, em uma
superfície, de comunidades microbianas denominadas biofilme (TAMURA, 2007).
2.4 Resistência antimicrobiana
A resistência antimicrobiana é fenômeno complexo e refere-se a cepas de
microrganismos que são capazes de multiplicar-se em presença de concentrações de
antimicrobianos maiores do que das doses terapêuticas dadas a humanos (TAVARES, 2008).
Tem sido motivo de preocupação em todo o mundo, principalmente no ambiente hospitalar.
Dados publicados em estudos realizados nos Estados Unidos, Europa e América Latina
mostram um número crescente de resistência bacteriana nos hospitais (ALVAREZ et al,
2006).
A luta dos seres humanos contra os microrganismopatogênicos existe durante toda
a história da humanidade. Como exemplos têm-se a peste bubônica, tuberculose, malária e
mais recentemente, a síndrome de imunodeficiência adquirida, causando um grande número
de mortes em todo o mundo. Um avanço no desenvolvimento de agentes antimicrobianos
ocorreu no século XX, porém este sucesso no tratamento de infecções durou pouco tempo,
uma vez que as bactérias logo desenvolveram mecanismos de resistência. Sendo assim, a
resistência bacteriana torna-se um fator importante e preocupante à sociedade, visto que os
mecanismos de resistências desenvolvidos pelos patógenos estão cada vez mais complexos
(TENOVER, 2006). Os avanços relacionados aos procedimentos clínicos e o aparecimento de
microrganismomultirresistentes aos antimicrobianos usados rotineiramente na prática médica
tornaram as infecções hospitalares um grave problema de saúde pública. Estudos realizados
nos Estados Unidos pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC) mostraram que as
infecções hospitalares aumentam consideravelmente as taxas de morbimortalidade e
prolongam a permanência de um paciente no hospital (SILVA et al., 2007). Tem-se observado
na última década um aumento acentuado de infecções, contribuindo com o aumento da taxa
de mortalidade em pacientes imunocomprometidos (CANTON; VIUDES; PEMÁN, 2001). A
21
utilização de substâncias antimicrobianas representa talvez um dos maiores avanços da
farmacoterapia. Estas substâncias estão entre os fármacos mais utilizados, tanto em
ambulatórios quanto em hospitais, e têm reduzido drasticamente a incidência de muitas
doenças infecciosas. Muitas infecções causadas por microrganismo emergentes ou
multirresistentes, principalmente infecções fúngicas, permanecem sem opções terapêuticas
efetivas, aliado aos sérios efeitos colaterais produzidos pela farmacoterapia (TAVARES,
2008). O uso indiscriminado de antibióticos e quimioterápicos antimicrobianos, e a facilidade
dos microrganismo em desenvolver resistência natural e causar doenças oportunistas em
pacientes imunodeprimidos, torna necessária a permanente investigação de novos fármacos
com potencial antimicrobiano que não sejam tóxicos em doses fisiologicamente aceitas.
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da
determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o crescimento
do microrganismo-teste; esse valor é conhecido como Concentração Mínima Inibitória (CIM).
Um aspecto bastante relevante na determinação da CIM de extratos vegetais é a preocupação
em relação aos aspectos toxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostos
naturais ou suas combinações (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
2.5 Métodos para determinação da atividade antimicrobiana
A determinação da atividade antimicrobiana de um composto geralmente é
realizada através ensaios in vitro. Os microrganismos testados são cepas padrões ou isolados
de materiais biológicos (RIOS; RECIO, 2005). A Organização Mundial de Saúde (OMS)
incentiva, desde 1977, a busca por novos produtos de origem natural com atividade
antimicrobiana, principalmente contra microrganismo resistentes aos fármacos utilizados na
clínica (BELLA CRUZ et al., 2010). Atualmente existem diversas técnicas de triagem para
definir se o extrato de uma determinada planta ou substância possui atividade antimicrobiana,
desde as mais simples, que podem ser realizadas rotineiramente, até as mais sofisticadas, que
muitas vezes se tornam indisponíveis em alguns laboratórios (ALVES et al., 2008). Os mais
difundidos incluem método de difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição
(OSTROSKY et al., 2008). Os procedimentos para determinar a atividade inibitória podem
ser realizados tanto pelas técnicas de diluição em caldo ou em ágar. Os agentes
antimicrobianos são geralmente testados em diluições consecutivas, e a menor concentração
capaz de inibir o crescimento de um organismo é considerada como a CIM (PHILLIPS, 1991;
PIDDOCK, 1991).
22
As variações referentes à determinação da CIM de extratos de plantas podem ser
atribuídas a vários fatores. Dentre eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e as
cepas utilizadas no teste, à origem da planta, época da coleta, se os extratos foram preparados
a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada. As CIMs são
consideradas excelentes ferramentas para determinar a susceptibilidade dos organismos aos
antimicrobianos e, portanto, usadas para julgar o desempenho de todos os outros métodos de
susceptibilidade. Nos laboratórios de diagnóstico, as CIMs são também usadas como uma
ferramenta de pesquisa para determinar a atividade in vitro de novos antimicrobianos
(PHILLIPS, 1991; PIDDOCK, 1990). Vários fatores podem interferir nos resultados da
determinação da CIM para determinado antimicrobiano. Como exemplos, tem-se o tipo de
meio de cultura utilizado, a forma de diluição do fármaco, a padronização do inóculo
bacteriano e a temperatura de incubação (ALDERMAN; SMITH, 2001). A temperatura pode
alterar a estabilidade dos agentes antimicrobianos, a fisiologia e metabolismo bacteriano e as
bases genéticas de regulação e expressão gênica (MICHEL; BLANC, 2001). Adicionalmente,
isolados de uma mesma espécie bacteriana, adaptados diferencialmente a climas tropicais ou
temperados podem apresentar características distintas de crescimento in vitro (ALDERMAN;
SMITH, 2001).
Os órgãos regulamentadores exigem para que um novo composto seja aceito no
tratamento de patologias, que este seja tão eficiente quanto os que já estão disponíveis na
clínica. (BELLA CRUZ et al., 2010). Para a classificação da atividade antimicrobiana, de
extratos e/ou seus produtos de fracionamento podem ser empregados os seguintes critérios:
CIM entre 10 e 100 μg/mL, é considerado como boa; entre 100 e 500 μg/mL como atividade
moderada; entre 500 e 1000 μg/mL como fraca atividade; e quando a concentração for maior
que 1000 μg/mL esses produtos podem ser considerados como inativos (MACHADO et al.,
2009). Embora ainda seja um critério discutível, ele se baseia no fato de que a grande maioria
dos antimicrobianos de uso clínico disponível apresenta atividade contra microrganismos
sensíveis em concentração de até 10μg/mL (RIOS; RECIO, 2005), bem como também se leva
em consideração que os extratos e frações de produtos naturais geralmente possuem
composição complexa, e muitas vezes os compostos ativos estão presentes em quantidades
muito pequenas (BELLA CRUZ et al., 2010).
A forma de como a preparação do extrato, fracionamento ou composto é obtido
podem influenciar nos testes de atividade antimicrobiana. Isto se deve ao fato de que
dependendo do tipo de solvente empregado para a obtenção dos extratos, bem como os
procedimentos de extração e fracionamento utilizados, é possível se alcançar melhores índices
23
de extração dos princípios ativos ou o contrário. Consequentemente isto interfere nos
resultados da avaliação da atividade (COS et al., 2006). É importante lembrar que para os
testes de atividade antimicrobiana os extratos, frações e compostos devem estar totalmente
isentos de solventes utilizados durante sua obtenção, bem como também devem ser mantidos
protegidos da luz, umidade e temperatura excessiva antes do teste (BELLA CRUZ et al.,
2010). Diversos são os fatores que afetam a suscetibilidade do método de difusão e de
diluição. Há assim, a necessidade do conhecimento das condições experimentais e
padronização rigorosa na execução do teste. Os aspectos importantes a serem considerados
são: meios de cultura, pH, disponibilidade de oxigênio, inóculo, condições de incubação,
soluções diluentes, entre outras (ALDERMAN; SMITH, 2001).
De acordo com o Órgão Internacional de Padronização (International Standard
Organization), ISO 10993, o ensaio de citotoxicidade in vitro é o primeiro teste para avaliar a
biocompatibilidade de qualquer material para uso em dispositivos biomédicos e depois de
comprovada a sua não toxicidade é que o estudo da biocompatibilidade do produto pode ter
continuidade realizando-se os ensaios necessários em animais de laboratório. Preconiza-se
que novos produtos ou produtos de ação ainda desconhecida devem ser analisados quanto a
sua citotoxicidade, por meio de estudos in vitro de cultivo celular – o mais utilizado para
testes de toxicidade – e de experimentos em animais para, em seguida, serem aplicados
clinicamente em humanos (FRESHNEY, 2000).
2.6 A cultura de cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) é um vegetal semiperene que pode ser
cultivada em áreas subtropicais, entre 15° e 30° de latitude e pertence à seguinte classificação
botânica (CASTRO; KLUGE, 2001): divisão: Magnoliophyta; subdivisão: Angiosperma;
classe:
Liliopsida;
subclasse:
Commilinidae;
família:
Poaceae
(Graminae);
tribo:
Andropogonae; subtribo: Saccharininae e gênero: Saccharum.
A cana-de-açúcar apresenta pelo menos seis espécies, cultivada comercialmente,
um híbrido multiespecífico, recebendo a designação Saccharum sp.. É uma cultura que
produz, em curto período, um alto rendimento de matéria verde, energia e fibras, sendo
considerada uma das plantas com maior eficiência fotossintética. Seu plantio em larga escala
é tradicional em vários países das regiões tropical e subtropical para a produção de açúcar,
álcool e outros subprodutos. Entretanto, a presença de plantas com características
24
desfavoráveis nas plantações pode reduzir drasticamente o rendimento da cultura
(ENRIQUEZ-OBREGÓN, 1998).
Planta herbácea de raiz geniculada e em parte fibrosa; colmo arqueado na base,
cilíndrico, simples, articulado e um pouco mais grosso nos internós, carnoso e com epiderme
lenhosa de cor amarelada, verde ou violácea; folhas amplexicantes, dísticas, planas, lineares,
ápice agudo, ásperas, nervura central saliente e bainha espinescente; espiguetas com flores
pequenas, hermafroditas; fruto do tipo cariopse ovóide (DI STASI, 2002).
A origem da cana de açúcar ainda é muito discutida, porém, alguns pesquisadores
consideram que ela seja nativa das ilhas do Arquipélago da Polinésia (CESNIK, 2004). As
variedades de cana são usadas na indústria na produção de açúcar, álcool, aguardente, cachaça
ou forragem (ANDRADE, 2003). Os subprodutos da cana (bagaço, vinhaça e tona de filtro)
são de grande importância socioeconômica na geração de energia, ração animal, aglomerados,
fertilizantes, entre outros. A primeira espécie de cana-de-açúcar introduzida no Brasil foi
Saccharum officinarum L., que foi trazida da ilha da madeira, em 1502. Essa espécie era uma
cana conhecida como nobre ou cana tropical, caracterizada pelo seu alto teor de açúcar, porte
elevado, colmo grosso e pouco teor de fibras. Devido a essas características S. officinarum foi
cultivada nos três primeiros séculos da colonização, provavelmente uma única variedade, que
no século XlX recebeu o nome de cana “Creoula” ou “Mirim” ou ainda “Cana da terra”, para
distinguir dos novos cultivares importados que começaram a chegar no país (LIMA, 1984).
Segundo Miocque e Machado Junior (1977), o ciclo da creoula estendeu-se desde 1532 a
1810 e por ser pouco rústica e susceptível a várias doenças, seu cultivo estava limitado a
terras virgens com alta fertilidade. A substituição por híbrido interespecífico do gênero
Saccharum se deu em função do sucessivo cultivo. Dessa forma, cultivares dessa espécie
começou a sofrer problemas com doenças, pragas e falta de adaptações ambientais.
Nunes Junior (1987) relata que a variedade Creoula começou a ser substituída
pela cana Caiana a partir do ano de 1810, nos principais Estados produtores (Bahia,
Pernambuco e Rio de Janeiro). Por ser uma variedade mais produtiva e rica em sacarose,
proporcionou ganhos significativos para a indústria açucareira no Brasil, tendo sido
considerada como o principal fator que levou este segmento á expansão. O ciclo da caiana
durou até próximo do ano de 1880 quando essa variedade foi submetida a um severo ataque
de Gomose, doença causada por Xanthomonas axonopodis, nas principais regiões canavieiras
do país.
A partir da criação do PROALCOOL, década dos anos setenta do século 20, um
novo ciclo de pesquisa se iniciou dando suporte a expansão da cultura no país. Em poucos
25
anos, as áreas plantadas com a cana-de-açúcar triplicaram, invadindo áreas consideradas
menos aptas principalmente nas regiões de cerrados. Para enfrentar os novos desafios
advindos dessa expansão iniciaram-se os programas de melhoramento genético visando à
obtenção de novas variedades (MACHADO, 2009). A safra de cana-de-açúcar (2010/2011)
foi de 629 milhões de toneladas processado pelo setor sucroalcooleiro, representando um
aumento de 10% do obtido na safra 2009/2010. A região Centro-Sul produziu
aproximadamente 90% do total nacional, ou seja, 550 milhões de toneladas de cana de açúcar.
Do total produzido no Brasil, 44,7% foi destinada à fabricação de açúcar e 55,3% a produção
de álcool, segundo a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2013). Os cálculos
apontam que entre 1975 a 2008, o álcool substituiu 280,88 bilhões de litros de gasolina no
Brasil, ou 1,77 bilhões de barris, o que correspondente a 13% das reservas de petróleo do
País. As receitas com exportações de açúcar, álcool e melaço em 2008 somadas à gasolina
substituída geraram divisas de US$ 18,7 bilhões. Assim, fica evidente a importância
econômica da cana-de-açúcar para o Brasil.
26
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a atividade antimicrobiana de produtos manipulados obtidos a partir do
extrato etanólico da polpa da cana de açúcar (Saccharum officinarum)
3.2 Específicos
a) Comparar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico da polpa da cana-deaçúcar com os produtos obtidos do mesmo;
b) Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) do produto com melhor
atividade antimicrobiana no teste de triagem;
c) Analisar a atividade antimicrobiana do melhor produto no teste de triagem,
através da determinação da concentração bactericida mínima (CBM) e
concentração fungicida mínima (CFM).
d) Analisar a ação na degradação do biofilme formado em poliestireno e vidro
pelo EE e pelo melhor produto com atividade antimicrobiana no teste de
triagem.
27
4 METODOLOGIA
4.1 Tipo de estudo e local da pesquisa
O presente trabalho consistiu em um estudo experimental descritivo, realizado no
Laboratório de Microbiologia Médica da Universidade CEUMA, São Luís, MA, Brasil.
4.2 Material Botânico
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) usada para a elaboração do EE foi
catalogada e identificada no herbário botânico Rosa Mochel da Universidade Estadual do
Maranhão sob a numeração (4026).
4.3 Obtenção do Extrato Etanólico
O extrato etanólico (EE) bruto da polpa da Saccharum officinarum (cana de
açúcar) foi obtido a partir da planta fresca pelo processo de maceração a frio. Para tanto,
foram utilizados 0,3 g/mL na concentração de extrato bruto que foram obtidos a partir de
300g da planta e 1000 mL de álcool (99,9%). Inicialmente, a polpa foi devidamente
selecionada, higienizada, cortada, pesada em balança eletrônica, e acondicionada em vidros
com tampa rosqueada e protegido da luz com papel alumínio por sete dias com o solvente
extrator, sendo agitados periodicamente. Após esse período, o mesmo foi filtrado e o extrato
bruto obtido foi colocado em estufa (40ºC) para secagem, obtendo-se um peso seco de
140,031g, sendo acondicionado em recipientes apropriados de vidro âmbar. O preparo dos
extratos foi realizado no Laboratório de Alimentos do Instituto Florence de Ensino Superior e
encaminhado ao laboratório de Microbiologia Médica e de Alimentos – Núcleo de Doenças
Endêmicas e Parasitárias da Universiddade- UNICEUMA, para os testes da atividade
antimicrobiana.
O processo de obtenção deste EE, e assim como os produtos obtidos deste extrato
teve a patente requerida pelo n° BR 10 2013 029245 1.
4.4 Estudo Fitoquímico do Extrato Etanólico
28
A triagem fitoquímica qualitativa foi realizada segundo o método descrito por
Matos (2009), conforme Tabela 1. Este tente possui a finalidade de detectar a presença de
classes de metabólitos secundários. Para identificar o grupo de estreróides e triterpenos foi
usada a reação de Lieabermann-Buchard; na classe dos fenóis e taninos foi usada a reação
com solução alcoólica de cloreto férrico; para as classes de antocianinas, antocianidinas,
flavonóides, leocoantocianianidinas, catequinas, flavonóis, xantonas e flavononas foi usado a
mudança de pH.
Para a reação com cloreto férrico foi adicionado de 3 a 5 gotas de solução aquosa
de cloreto férrico 1% em 1 mL do extrato aquoso. O desenvolvimento de coloração azul
ocorre na presença de taninos; coloração verde, na presença de flavonóides; e coloração
marrom na presença de poli fenóis. A reação de Libermann Bouchard em evaporar 30 mL do
EE em banho-maria até a secura. Dissolver os resíduos em 5 mL de clorofórmio e filtrar. Com
o auxílio de uma pipeta, levar, de cada uma das frações, as seguintes quantidades a três tubos
de ensaio diferentes: 0,1 mL; 0,5 mL; 1,0 mL. Em seguida, completar os volumes com
clorofórmio até 2 mL. Em capela, adicionar 1 mL de anidrido acético e 2 mL de ácido
sulfúrico (H2SO4) concentrado. A mudança da coloração do extrato para rósea ou azul indica
a presença de esteróides ou triterpenos com função carbonila (C=O) no carbono 3 e dupla
ligação entre os carbonos 5 e 6 da estrutura.
Foram transferidos 2 mL do EE para cinco tubos de ensaio e procedeu-se à
pesquisa de alcaloides adicionando 2 gotas dos seguintes reativos: reativo de Mayer (mercúrio
tetraiodeto de potássio) e reativo de Dragendorff (tetraiodeto bismuto de potássio). Observouse se houve a formação de precipitado branco ou leve turvação branca para o reativo de
Mayer e precipitado de cor tijolo para o reativo de Dragendorff.
29
Tabela 1 – Classes de metabólitos analisados na prospecção fitoquímica do extrato da polpa
da cana-de-açúcar.
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
TESTES
Fenóis
Teste com o cloreto férrico
Taninos hidrolisáveis
Taninos condensados
Antocianidina, antocianina e flavonóides
Teste de mudança de pH (pH 3; 8,5 e 11)
Flavonas, flavonóis e xantonas
Chaconas e auronas
Leucoantociacianidinas, catequinas
Esteróides
Teste de Libermann-Bouchard
Triterpenóides
Teste de Libermann-Bouchard
Alcalóides
Teste com Dragendorff, Mayer e Hager
4.5 Manipulação dos produtos obtidos a partir do extrato etanólico Foram manipulados três produtos a partir do EE: uma solução, um creme e um
óvulo. Os produtos foram preparados em uma farmácia de manipulação de São Luís. 4.6 Cepas bacterianas e fúngicas
As amostras bacterianas são oriundas do Laboratório de Microbiologia Médica do
UNICEUMA e as amostras fúngicas do Laboratório de Micologia Médica do UNICEUMA.
Para realização dos testes foi utilizados cepas padrão (ATCC) e isolados clínicos. As amostras
bacterianas testadas foram: Staphylococcus aureus (25923), MRSA - Staphylococcus aureus
resistente à meticilina (ATCC 343602), Streptococcus pyogenes (ATCC 13613),
Streptococcus agalactiae (ATCC 13813), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27883),
Escherichia coli (ATCC 2592) e Klebsiella pneumoniae (ATCC 700.003). As amostras
multirresistentes oriundas de isolados clínicos são: Stenotrophomonas maltophilia (amostra
sanguínea), Acinetobacter baumannii (secreção traqueal) e B. cepacia. (amostra sanguínea).
As amostras fúngicas testadas foram: Candida albicans ATCC (18804) e amostras
clínicas de: Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida rugosa,
Candida tropicallis, Trichosporon asahii, Trichosporon mucoides e duas amostras de
Cryptococcus laurentii. As amostras de Trichosporon asahii, T. mucoides e as duas amostras
30
de Cryptococcus laurentii foram provenientes da lesão de pele de pacientes infectados com
AIDS.
4.7 Preparo das suspensões microbianas
Os microrganismos foram inicialmente reativados a partir das suas culturas
originais e mantidos em meio líquido BHI (Brain Heart Infusion) a 37°C por 24h.
Posteriormente, as amostras foram cultivadas em placas de Ágar Nutriente a 37°C por 18-24
horas. Colônias isoladas foram então ressuspendidas em 3 mL de solução fisiológica (NaCl
0.9 %) estéril até atingir uma turbidez equivalente na escala 0,5 de McFarland (1,5 x 108
UFC/mL).
4.8 Triagem pelo Método de difusão em Agar
Para a realização deste teste foram utilizadas as seguintes amostras bacterianas P.
aeruginosa (ATCC 27883), E. coli (ATCC 2592), K. pneumoniae (ATCC 700003) e S.
aureus (ATCC 25923).
O potencial antimicrobiano da solução, creme e óvulo foram inicialmente avaliados
pela técnica da difusão em meio Müller Hinton. Os poços foram identificados, e adicionou-se
com o auxílio de pipeta 30 µL de cada uma das três formas (CLEELAND; SQUIRES, 1991).
Como controle positivo foi usado o cloranfenicol (0,01g/mL) e como controle negativo o
álcool 50% e o DMSO. Em seguida o material foi levado à estufa a 35°c por 24 horas. No dia
seguinte, mediu- se os halos formados em milímetros com auxílio de um paquímetro. Dentre
os três produtos testados (solução, creme e óvulo), escolheu-se o que melhor obteve resultado
para dar prosseguimento aos demais testes.
Após o teste de triagem, para todos os demais testes foram utilizadas as seguintes
amostras: S. aureus (ATCC 25923), MRSA - Staphylococcus aureus resistente à meticilina
(ATCC 343602), S. pyogenes (ATCC 13613), S. agalactiae (ATCC 13813), P. aeruginosa
(ATCC 27883), E. coli (ATCC 2592), K. pneumoniae (ATCC 700.003), Stenotrophomonas
maltophilia, Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, C. albicans (ATCC 18804), C.
albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. rugosa, C. tropicallis, T. asahii, T. mucoides e duas
amostras de Cryptococcus laurentii.
4.9 Método de difusão do extrato etanólico e da solução em Agar
31
O potencial antimicrobiano do EE e da solução foram avaliados pela técnica de
difusão em meio Müller Hinton (CLEELAND; SQUIRES, 1991), conforme descrito no item 4.8.
4.10 Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato etanólico e da solução
A determinação da CIM foi feita através da técnica de Macrodiluição (PHILLIPS,
1991; PIDDOCK, 1990). Para isto, cada suspensão bacteriana e fúngica foi homogeneizada
em caldo BHI na proporção 1:1000 (v/v), onde foi obtido uma concentração bacteriana em
torno de 1-2 x 105 UFC/mL. A diluição dos tubos de vidro estéreis foram preparados com 5
mL de diluições seriadas de razão 2 do EE e da solução. Após a diluição, 5 µL de cada
inóculo foram transferidos para os tubos. Foi utilizado como controle positivo o meio BHI e
como controle negativo o etanol 99,9%. Os tubos foram em seguida homogeneizados com
auxílio de um vórtex em baixa velocidade e incubados nas mesmas condições descritas
anteriormente. A CIM foi a menor concentração do extrato ou da solução onde não houve
crescimento bacteriano ou fúngico visível.
4.11 Concentração Bactericida Mínima (CBM) ou Concentração Fungicida Mínima
(CFM) do EE e da solução
Utilizaram- se os tubos incubados para determinação da CIM em meio líquido
para determinação da CBM ou CFM (PHILLIPS, 1991; PIDDOCK, 1990). Uma alíquota (1
mL) de cada tudo foi inoculada em placas de Ágar Müeller Hinton e posteriormente estas
placas foram incubadas em ambiente à 37°C
por 18-24h. As CBM ou CFM foram
consideradas para a menor concentração do extrato ou da solução onde não houve
crescimento celular sobre a superfície do ágar inoculado (99,9% de morte microbiana).
4.12 Degradação do Biofilme pelo EE e solução
4.12.1 Análise da degradação do biofilme formado em poliestireno
Após preparo da suspensão conforme item 4.7, uma amostra foi adicionada em
microplacas com 96 poços com fundo em U, em volume de 200 μL/cavidade, depois de
preenchidas as placas foram incubadas a 37°C por 24 horas em estufa. Após tempo de
32
incubação, as placas foram lavadas por três vezes com tampão PBS e deixadas à temperatura
ambiente, então o extrato bruto e o produto manipulado foram adicionados aos poços para
análise da ação antimicrobiana nos biofilmes formados e novamente as placas incubadas a
37°C por 24 horas. Após esse período adicionou-se às placas 200μL/cavidade de cristal
violeta, que foram incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente e depois foram lavadas
com água destilada por três vezes, e deixadas secar em temperatura ambiente. As placas
coradas com cristal violeta foram submetidas à espectrofotometria com filtro de 540nm para
aferir as respectivas absorbâncias (Ab) de cada poço. Em que uma maior absorbância
relaciona-se com uma maior formação de biofilme. Como controle negativo foi utilizado o
meio de cultura BHI e como controle positivo o fluconazol (0,00128g/mL) para as amostras
fúngicas e o cloranfenicol (0,01g/mL) para as amostras bacterianas segundo a metodologia de
Stepanovic et al., com alterações (2004). Todos os testes foram realizados em triplicata, em
dias diferentes.
4.12.2 Análise da degradação do biofilme formado em vidro
Para a análise da degradação do biofilme em vidro, foi utilizado a metodologia de
Garcia et al. (2002 apud MORAES, 2013), com algumas modificações. Lamínulas redondas
de vidro foram colocadas em poços de microplacas (24 poços) contendo BHI. Posteriormente,
os poços foram inoculados com 40μL da suspensão bacteriana previamente crescida em BHI,
em cada poço e a placa foi incubada por 24 h à37 ºC. Decorrido este período, as placas foram
lavadas três vezes com PBS (pH 7,2) e então adicionado 600μL do extrato e do produto
manipulado nos poços para analise da ação antimicrobiana nos biofilmes formados e
novamente incubadas a 37°C. Após 24 horas de incubação as placas foram coradas por cristal
violeta por 10 minutos e então lavada novamente com PBS (pH 7,2), as lamínulas foram
retiradas e fixadas em lâminas para serem examinadas por microscopia de luz.
33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise fitoquímica do EE
A análise fitoquímica fornece informações relevantes a cerca da presença de
metabólitos secundários nas plantas, para que assim possa chegar ao isolamento de princípios
ativos importantes na produção de novos fitoterápicos. Os resultados são classificados em
positivo fraco (+), positivo moderado (++) e positivo forte (+++). A análise fitoquímica do EE
mostrou a presença de Flavonas, Flavonóides e Xantonas, classificados como fraco positivo,
conforme mostrado na Tabela 2.
Tabela 2 - Prospecção fitoquímica do Extrato etanólico da polpa da cana-de-açúcar.
Metabólitos Secundários
Resultado 1
Fenóis
-
Taninos hidrolisáveis
-
Taninos condensados
-
Flavonas, flavonóis e xantonas
+
Chaconas e auronas
-
Leucoantociacianidinas, catequinas
-
Esteróides
-
Triterpenóides
-
Alcalóides
-
1
+ ++ fortemente positivo, ++moderadamente positivo, +positivo, -negativo
Os flavonóides são classificados em 10 classes de compostos, de acordo com seu
processo de formação: antocianinas, leucoantocianidinas, flavonóis, flavonas, glicoflavonas,
biflavonilas, chalconas, auronas, flavanonas e isoflavonas. Possuem propriedades químicas
dos fenóis, sendo relativamente solúveis em água, principalmente quando possuem moléculas
de açúcares ligadas à sua estrutura (YAO et. al. 2004). Dentre os interesses farmacêuticos, os
flavonóides têm lugar de destaque devido às propriedades antitumorais, antialérgicos,
intiinflamatórios e antivirais, sendo atualmente estudados no combate à AIDS (PEREIRA,
2002). As classes de flavonóides mais abundantes na cana-de-açúcar são as flavonas e seus
derivados metilados e glicosilados, estando presentes tanto os O-glicosídeos como os
Cglicosídeos (MCGHIE, 1993). Cowan (1999) sugere que as classes de compostos presentes
34
na cana-de-açúcar –flavonas – sejam responsáveis pela potencial atividade contra vírus,
bactérias e fungos.
Este resultado foi encontrado também por Leme et al. (2010), em que a
abordagem fitoquímica da cana de açúcar mostrou a presença de flavonóides, estes
responsáveis pela atividade antimicrobiana. Resultados de Vila et al. (2006) sugerem que a
polpa da cana-de-açúcar apresenta uma quantidade relevante de flavonóides, vários com
atividade antioxidante. Em um estudo realizado por Lorenze (2002), foi encontrado que o EE
da espécie Cymbopogon citratus (Capim-limão) da família Poaceae, da mesma família da
cana-de-açúcar, apresentou-se positiva para taninos, flavonóides e alguns ácidos fenólicos.
Porém, um estudo de Schuck (2001), analisou-se a atividade antimicrobiana dos EE de C.
citratus sobre os microrganismos: S. aureus, E. coli e C. albicans, onde o EE não apresentou
nenhum efeito sobre os microrganismo testados.
Estudo de Oliveira (2010) mostrou que a grande atividade antifúngica e o baixo
potencial citotóxico das flavonas, classe predominante na cana-de-açúcar, revelam esta classe
de compostos químicos promissora para desenvolvimento de novos antifúngicos.
5.2 Triagem pelo Método de difusão em Agar
A solução, o creme e o óvulo derivados do EE foram testados em ágar. A
formação de halo de inibição está apresentado na Tabela 3. Nota-se a sensibilidade das
amostras de E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae e S. aureus à solução. Devido a essa maior
atividade do produto na forma de solução, esta foi selecionada para o prosseguimento com os
demais testes de atividade antimicrobiana. A solução teve uma maior ação inibitória do que o
creme provavelmente devido a melhor difusão da molécula ativa constituinte do EE
(flavonóides) em meio líquido, já que a concentração do EE é a mesma no creme e na
solução. A ação antimicrobiana do óvulo foi menor do que o creme e da solução
provavelmente porque a concentração do EE no óvulo é menor do que a do creme. Como
controle negativo, foram utilizados os componentes usados na manipulação da solução, creme
e óvulo: Álcool a 50% e o DMSO. Como padrão ouro foi usado o cloranfenicol (0,01g/mL).
A figura 1 destaca a formação do halo de inibição pela solução.
35
Tabela 3 - Atividade inibitória dos subprodutos do extrato etanólico da S. officinarum contra
cepas de referência através do teste de difusão em ágar.
Amostra
Halo de inibição (mm)
Cloranfenicol1
1
Óvulo2
Creme2
Solução2
E. coli
18
-
-
8
P. aeruginosa
15
-
-
8
K. pneumoniae
35
-
11
15
S. aureus
33
-
10
25
Controle Positivo: Cloranfenicol (0,01g/mL), 2 Produto obtidos do extrato etanólico da polpa da S. officinarum.
Figura 1 – Atividade antimicrobiana da Pseudomonas aeruginosa pela
técnica de difusão em meio sólido pelo óvulo (O), creme (C) e
solução (L) obtidos do extrato etanólico da S. officinarum.
5.3 Método de difusão do EE e da solução em Agar
Verificou-se atividade antimicrobiana da solução em meio sólido em cinco das
dez amostras bacterianas utilizadas (Tabela 4). As amostras bacterianas sensíveis à solução
foram: S. aureus, S. agalactiae, P. aeruginosa, E. coli e K. pneumoniae Em relação ao EE, as
amostras sensíveis foram as de E. coli, K. pneumoniae, S. aureus e S. agalactiae.
36
Tabela 4 – Atividade inibitória do extrato etanólico da S. officinarum e da solução contra
cepas de referência e contra isolados clínicos de bactérias através do teste de
difusão em ágar.
Microrganismos
Extratoa
Soluçãob
CNc
Staphylococcus aureus
8
22
0
Streptococcus pyogenes
0
0
0
Streptococcus agalactiae
9
20
0
Stenotrophomonas maltophilia
0
0
0
MRSA
0
0
0
Acinetobacter baumannii
0
0
0
Pseudomonas aeruginosa
0
7
0
Burkholderia cepacia
0
0
0
Escherichia coli
8
8
0
Klebsiella pneumoniae
15
13
0
a
b
Extrato etanólico da polpa da S. officinarum, Solução obtida do extrato etanólico da polpa da S. officinarum,
Controle negativo-etanol 50%.
c
Dentre os fungos, verificou-se atividade antimicrobiana da solução e do EE em
nove das dez amostras estudadas, todas as amostras fúngicas foram sensíveis tanto ao EE
quanto a solução com exceção da C. glabrata (Tabela 5).
37
Tabela 5 - Atividade inibitória do extrato etanólico da S. officinarum e da solução contra cepa
de referência e contra isolados clínicos de fungos através do teste de difusão em
ágar.
Micro-organismos
Extratoa
Soluçaob
CNc
Candida glabrata
0
0
0
Candida albicans
13d
15
0
Candida parapsilosis
13
15
0
Candida tropicalis
10
8
0
Cryptococcus laurentii (amostra 1)
10
15
0
18
10
0
Trichosporon mucoides
10
10
0
Trichosporon asahii
10
8
0
Candida albicans ATCC 18804
20
10
0
Candida rugosa
8
12
0
a
b
Extrato etanólico da polpa da S. officinarum, Solução obtida do extrato etanólico da polpa da S. officinarum,
Controle negativo-etanol 50%.
c
De acordo com Martins et al (2010) os extratos de plantas frequentemente
possuem baixas propriedades de difusão, ressaltando que a técnica de diluição em caldo é a
melhor maneira de estabelecer a real potencia de um composto. Este fato não verificado com
o nosso EE e com a solução, vista que houve a formação de halo de inibição na maioria das
amostras testadas.
5.4 Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Em relação à solução, a menor CIM encontrada foi de 14 mg/mL para as amostras
de MRSA, S. aureus e S. pyogenes. Para as bactérias S. agalactiae, P. aeruginosa, B. cepacia,
A. baumannii, Stenotrophomonas maltophilia e K. pneumoniae, a CIM foi de 28 mg/mL. A
CIM do ciprofloxacino pode chegar até 0,004 mg/mL, essa diferença de CIM do medicamento
de referência e da solução pode ser explicada pelo fato de que na solução o principio ativo não
estar de forma isolada. Estudos futuros são necessários para a determinação da CIM dos
princípios ativos isolados encontrados na polpa da cana-de-açúcar.
38
Os resultados da CIM estão descritos na Tabela 6. Quanto ao EE, a menor CIM
encontrada foi de 187 mg/mL para as amostras de MRSA, S. aureus e S. pyogenes,
demonstrando uma ação antimicrobiana maior da solução para as bactérias Gram positivas.
Tabela 6 - Concentração inibitória mínima in vitro do extrato etanólico da Saccharum
officinarum e da solução sobre cepas de referência e isolados clínicos de bactérias.
Microrganismo
CIM (mg/mL)
Extrato1
Solução2
CN3
187
14
0
187
14
0
1500
28
0
750
28
0
MRSA
187
14
0
750
28
0
375
28
0
375
28
0
Escherichia coli
750
112
0
750
28
0
1
Extrato etanólico da polpa da Saccharum officinarum,
officinarum, 3 Controle negativo – etanol 50%.
2
Solução obtida do EE da polpa da Saccharum
Quanto as amostras fúngicas, os dados estão exibidos na Tabela 7, em que a CIM
encontrada para o EE foi de 187 mg/mL para o isolado clínico de T. mucoides. Enquanto, para
as amostras de C. glabrata, C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. albicans ATCC e C.
rugosa a CIM encontrada foi de 375 mg/mL.
Para a solução, a menor CIM encontrada foi de 7 mg/mL para os isolados clínicos
de C. rugosa e T. mucoides. Para as amostras de C. laurentii (amostra 2), T. asahii e C.
albicans ATCC a CIM encontrada foi de 14 mg/mL. Valor esse maior que a CIM do
fluconazol, que pode chegar a 0,016 mg/mL.
39
Tabela 7 - Concentração inibitória mínima in vitro do extrato etanólico da polpa da
Saccharum officinarum e da solução contra cepas de referencia e isolados
clínicos de fungos.
Microrganismo
CIM (MG/mL)
Extrato 1
Solução 2
CN3
Candida glabrata
375
28
0
Candida albicans
750
112
0
375
7
0
Candida tropicalis
375
28
0
750
28
0
750
14
0
187
7
0
Trichosporon asahii
375
14
0
375
14
0
Candida rugosa
375
7
0
1
Extrato etanólico da polpa da Saccharum officinarum, 2 Solução obtida do EE da polpa da Saccharum
officinarum, 3 Controle negativo – etanol 50%, 4 Concentração mínima para inibição de 50% do crescimento
microbiano em mg/mL
Observa-se a diminuição da CIM da solução em relação EE para uma mesma
amostra. Essa redução foi observada em todas as amostras de fungos e bactérias estudados,
com exceção da C. albicans. De acordo com estudos de Duarte (2005) a atividade
antimicrobiana de vários compostos frente aos diversos microrganismos foram propostos
valores que têm sido considerados como referência e que seguem a seguinte interpretação:
inibição alta - CIM até 5 mg/mL; inibição moderada- CIM entre 6 e 15 mg/mL; inibição baixa
– CIM acima de 16 mg/mL (DUARTE, 2005). Baseado neste estudo, a solução possui uma
inibição moderada para as amostras bacterianas: MRSA, S. aureus, S. pyogenes e K.
pneumoniae; e inibição baixa para as demais amostras.
Em relação aos fungos, a solução possui inibição moderada para as amostras de:
C. glabrata, C. parapsilosis, C. laurentii (amostra 2), T. mucoides, T. asahii, C. albicans
ATCC e C. rugosa. Para as demais amostras de fungos, a inibição da solução foi baixa.
Em relação ao EE, a inibição foi baixa para todas as amostras bacterianas e
fúngicas. No entanto a real eficácia de uma planta medicinal pode não ser devido a um
40
componente ativo principal, mas a ação combinada de diferentes compostos originalmente na
planta. Em estudos para análise de antibacterianos foi observado que as interações menores in
vitro podem não resultar em efeito significativo in vivo, mas podem fazer a diferença para a
duração de um efetivo nível do fármaco in vivo e podem muito facilmente ocorrer em extratos
de plantas naturais (NENAAH, 2010). Existem estudos na literatura a respeito do efeito
sinérgico entre extratos com potencial antioxidante juntamente com antibióticos, onde há um
aumento na eficácia clínica destes antibióticos por parte dos extratos (OKUSA et al., 2007).
Sabe-se que a cana-de-açúcar é rica em antioxidantes, conforme mostrou Vila (2006). Fato
este demonstra a importância de estudos futuros no intuito de selecionar uma mistura
sinérgica de ativos com as melhores propriedades terapêuticas do EE.
5.5 Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Para a solução, a menor CBM encontrada foi de 750 mg/mL para as seguintes
bactérias: MRSA, S. aureus, S. pyogenes, K. pneumoniae e E. coli (Tabela 8).
A menor CBM do EE foi de 750 mg/mL para as amostras de MRSA, S. aureus, S.
pyogenes e Eschericha coli.
Destaca-se
a
ação
bacteriostática
nas
amostras
de
isolados
clínicos
multirresistentes de S. maltophilia, B. cepacia e A. baumannii. Mostrando a importância desta
solução como uma possível opção terapêutica, visto que estas bactérias são de alta prevalência
entre as bactérias multirresistentes encontradas em ambiente hospitalar. Um estudo de
Andrade (2006) mostrou que entre as bactérias multirresistentes encontradas em UTI, 14,3%
eram A. baumannii, 10,2% de Klebsiella sp. e 6,1% de Stenotrophomonas maltophilia.
41
Tabela 8 - Concentração bactericida Mínima do extrato etanólico da polpa da S. officinarum e
da solução.
Microrganismo
CBM (mg/mL)
Extrato1
Solução2
CN3
750
750
0
750
750
0
1500
1500
0
>1500
>1500
0
>1500
>1500
0
>1500
>1500
0
1500
1500
0
MRSA
750
750
0
Escherichia coli
750
750
0
1500
750
0
1
Extrato etanólico da polpa da Saccharum officinarum,
Saccharum officinarum, 3 Controle negativo – etanol 50%.
Fonte: Elaborado pelo autor (2013)
2
Solução obtida do extrato etanólico da polpa da
Em relação aos fungos, a CFM da solução foi de 370 mg/mL para os seguintes
patógenos: C. glabrata, C. parapsilosis, T. mucoides, T. asahii, C. albicans (ATCC 18804),
C. rugosa e as duas amostras de C. laurentii (Tabela 9). Destacando a ação fungicida sobre as
amostras isoladas de lesões de pele de pacientes com AIDS (T. mucoides, T. asahii e as duas
amostras de C. laurentii) devido à dificuldade de tratamento desses pacientes e a alta
porcentagem de falha terapêutica. Este resultado mostra a atividade antimicrobiana contra
fungos e bactérias desta solução, possuindo grande potencial para utilização comercial além
da sua viabilidade econômica. Os dados mostram o aumento do espectro de ação da solução
quando comparado ao extrato bruto.
42
Tabela 9 - Concentração Fungicida Mínima do extrato etanólico da polpa da S. officinarum e
da solução fitoterápica
Microrganismo
CFM (mg/mL)
Extrato1
Solução2
CN3
Candida glabrata
>1500
3704
0
Candida albicans
>1500
750
0
1500
370
0
Candida tropicalis
>1500
>1500
0
1500
370
0
1500
370
0
750
370
0
Trichosporon asahii
750
370
0
>1500
370
0
750
370
0
Candida rugosa
1
Extrato etanólico da polpa da Saccharum officinarum, 2 Solução obtida do extrato etanólico da polpa da
Saccharum officinarum 3 Controle negativo – etanol 50%.
Nas amostras fúngicas, somente para C. tropicalis não se obteve uma CFM da
solução, mostrando que a solução tem efeito fungicida para todos os outros fungos. Durante a
realização dos experimentos não foram encontrados dados similares na literatura sobre
atividade antibacteriana ou antifúngica do EE da polpa da cana-de-açúcar, por esse motivo foi
dada entrada em um pedido de patente relacionado ao modo de preparação do extrato e dos
produtos obtidos do mesmo com fins antimicrobianos.
5.6 Degradação do Biofilme
5.6.1 Análise da degradação do biofilme formado em poliestireno
Observa-se no Gráfico 1, uma atividade da solução e do EE na degradação do
biofilme nas cepas de MRSA, Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas e T. mucoides.
Sendo que na amostra de MRSA, a degradação do biofilme pelo EE e pela solução foi superior
ao medicamento de referência. Nas demais amostras não se verificaram ação na degradação
do biofilme.
Novamente observa-se a ação da solução sobre o biofilme formado por cepas
multirresistentes de MRSA, A. baumannii e Stenotrophomonas maltophilia, uma ação
43
semelhante ao do medicamento de referência.
Gráfico 1 - Degradação do biofilme formado em poliestireno, onde se tem: controle positivo
(CP) representado pelo cloranfenicol (0,01g/mL) para bactérias e fluconazol
(0,00128g/mL) para fungos; extrato etanólico (EE) da polpa da Saccharum
officinarum, (0,3g/mL); solução - obtida do EE da polpa da Saccharum
officinarum; controle negativo (CN) – etanol 50%.
100
80
60
40
20
0
MRSA
P. aeruginosa
CN
A. baumannii
CP
S. maltophilia
Solução
T. mucoides
EE
5.6.2 Análise da degradação do biofilme formado em vidro
Na análise macroscópica evidenciou a diminuição do biofilme formado (Figuras 2
e 3). Resultado este comprovado pela microscopia óptica (Figura 4). Foi feito um controle
somente com o EE e outro com a solução. Biofilmes são notoriamente difíceis de erradicar e é
fonte de infecções crônicas. De acordo com o Instituto Nacional de Saúde, biofilmes são
clinicamente importantes, representando mais de 80% das infecções microbianas do corpo
(LEWIS, 2001).
Sabe-se que o biofilme é uma das causas de falha terapêutica, e o resultado deste
estudo mostra a importância da solução manipulada, pois a mesma teve eficiência tanto na
bactéria ou fungos na forma planctônica quanto atuando na degradação de biofilme formado
podendo ser usado como antibiótico isolado ou em terapia conjugada. Há a necessidade de
pesquisas futuras para melhor esclarecimento a cerca do mecanismo de ação do EE e da
solução.
44
Figura 2 – Análise da degradação do biofilme formado em vidro pelo extrato etanólico e pela
solução. Linha A - Pseudomonas aeruginosa, Linha B - Burkholderia cepacia,
Linha C - Acinetobacter baumannii, Linha D - Stenotrophomonas maltophilia,
Coluna 1 - controle negativo na formação do biofilme formado em 48h, Coluna
4 – biofilme obtido após 24h sem o EE e posteriormente 24h em contato com o
EE, Coluna 5 - biofilme obtido após 24h sem a solução e posteriormente 24h em
contato com a solução.
Figura 3 – Degradação do biofilme formado em vidro pelo extrato etanólico e pela solução.
Linha A - E. coli, Linha B - K. pneumoniae, Linha C - Candida glabrata Linha C
- Candida albicans, Coluna 1 –controle negativo na formação do biofilme formado
em 48h, Coluna 4 – biofilme obtido após 24h sem o EE e posteriormente 24h em
contato com o EE, Coluna 5 - biofilme obtido após 24h sem a solução e
posteriormente 24h em contato com a solução.
Figura 4 - Biofilme formado em superfície vítrea da amostra de Pseudomonas aeruginosa.
Em A, temos o controle da formação do biofilme em vidro após 48h e em B a degradação do
45
biofilme formado após 24h de formação do biofilme seguido de 24h em contato com a
solução. Aumento 1000x.
A
B
46
6 CONCLUSÃO
a) Dos produtos obtidos do EE da polpa da cana-de-açúcar, a solução apresenta
melhor ação antimicrobiana no teste de triagem.
b) A menor CIM da solução é de 14 mg/mL para as amostras de MRSA, S. aureus
e S. pyogenes. Para as amostras fúngicas, a menor CIM é de 7 mg/mL para os
isolados clínicos de C. rugosa e T. mucoides e C. parapsilosis
c) A menor CBM da solução é de 750 mg/mL para as seguintes bactérias: MRSA,
S. aureus, S. pyogenes e K. pneumoniae. A menor CFM da solução foi de 370
mg/mL para os seguintes fungos: C. glabrata, C. parapsilosis, T. mucoides, T.
asahii, C. albicans ATCC 18804, C. rugosa e as duas amostras de C.
laurentii.
d) Observa-se a ação da solução na degradação do biofilme formado em
poliestireno por cepas multirresistentes de MRSA, Acinetobacter baumannii e
Stenotrophomonas maltophilia. Mostrando ação da solução no biofilme
formado por cepas causadoras de infecção hospitalar.
47
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53
ANEXO
54
ANEXO A – Depósito de Pedido de Patente

centro universitário do maranhão pró-reitoria de pós

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