CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE Bacillus

IV Simpósio de Ciências da UNESP –
Dracena
V Encontro de Zootecnia – Unesp Dracena
Dracena, 09 a 11 de setembro de 2008.
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE Bacillus cereus EM
LEITE UHT CAPRIO
Pereira, L. F.1; Zacqui, C. G. T.1; Poiatti, M. L. 1; Schocken-Iturrino, R. P. 2
2
1
Faculdade de Zootecnia, UNESP, Campus Experimental de Dracena.
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,UNESP, Campus de Jaboticabal.
RESUMO
Com o objetivo de detectar a presença de Bacillus cereus, amostras de leite UHT:
integral, light, e achocolatado, bem como de leite em pó, foram analisadas e comparadas
as técnicas de identificação e caracterização do microrganismo, através de métodos
bioquímicos e de PCR. A metodologia para isolamento das estirpes de B. cereus
baseou-se inicialmente no enriquecimento seletivo das amostras e as colônias típicas
foram transferidas para meios específicos, TSA e BHI. As provas bioquímicas como
catalase, utilização anaeróbia da glicose e Voger Proskauer confirmaram os
microrganismos como pertencentes ao grupo do B. cereus. Das amostras analisadas
pertencentes ao grupo do Bacillus spp., 92% foram isoladas de leite em pó N, 3% foram
isoladas de leite em pó I, 76% de leite UHT integral A, 46% de leite integral B, 34% de
leite UHT light e 30% de leite UHT achocolatado; e das estirpes típicas pertencentes ao
grupo B. cereus, 24 (32,4%) foram isoladas de leite em pó N, 35 (72,9%) de leite UHT
integral A, 3 (14,2%) de leite integral B, 6 (30%) de leite UHT light e 5 (25%) de leite
UHT achocolatado. Os resultados evidenciaram 35 estirpes pertencentes ao grupo do B.
cereus, isoladas de leite UHT e realmente confirmadas como pertencentes à espécie B.
cereus. Conclui-se, portanto, que a análise por PCR se mostrou mais eficiente que as
provas bioquímicas na caracterização do B. cereus.
Palavras-Chave: Bacillus cereus, esporulados, leite de cabra, PCR, UHT
ABSTRACT
With the goal of detecting the presence of Bacillus cereus, sample of milk UHT: full,
light and containing chocolate as wellces milk powder, were analysed and compared the
techniques for the identification and characterization of the microorganism through
biochemical methods and PCR. The metgodology for the isolation the strains of B.
cereus it is initially based on selective enrichment of samples and the tipical colonies
were transferred to specific means, TSA and BHI. The biochemicaltests as catalase,
aeróbic uso of glucose and VP Voger Proskauer the microorganism confirmed as
belonging to the group B. Cereus. Of the samples belonging to the group of Bacillus
spp, 92% were isolated from milk powder N, 3% were isolated from milk powder I,
76% of whole milk A UHT , 46% of whole milk B, 34% of UHT milk light and 30%
UHT milk chocolate, and the typiral strains belonging to the group B. Cereus, 24
(32.4%) were isolated from milk powder N, 35( 72.9%) full of UHT milk A, 3 ( 14.2%)
full of UHT milk B, 6 ( 30%) UHT milk light and 5 (25%) UHT milk chocolate. The
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results showed 35 strains belonging to the group of B. Cereus, isolated from UHT milk
and indeed confirmed as belonging to species B. Cereus. It follows therfore that the
analysis by PCR was more efficient than the evidence in biochemical characterization of
B. Cereus.
Key Words: Bacillus cereus, esporulados, caprine milk, PCR, UHT
ITRODUÇÃO
O gênero Bacillus encontra-se bastante difundido na natureza e suas espécies podem ser
isoladas do solo, água, poeira, ar e muitos alimentos. Este gênero caracteriza-se pela
formação de esporos termorresistentes, fato este de alta relevância na deterioração de
alimentos industrializados. Este microrganismo causa toxinfecções alimentares pela
capacidade de produzir diferentes tipos de toxinas: enterotoxinas, hemolisinas
(cereolisina e hemolisina II), fosfolipase C(fosfatidilinositol hidrolase, fosfatidilcolina
hidrolase e esfingomielinase) e toxina emética; portanto é considerado um
contaminante. A detecção do B. cereus pode ser caracterizada por métodos bioquímicos
que demandam tempo e consistem numa série de análises para determinar as reações
produzidas por enzimas. Sendo assim, essas técnicas são substituídas por métodos
moleculares (PCR) mais rápidos, que permitem respostas mais eficientes aos sistemas
de controle para produtos alimentícios Mantynen e Lindstrom (1998). O presente
trabalho teve por objetivos detectar a presença de B. cereus em diferentes tipos de leite
caprino, através dos métodos tradicionais e de PCR comparando a viabilidade prática
das técnicas.
MATERIAL E MÉTODOS
As análises microbiológicas foram conduzidas junto ao laboratório de Microbiologia da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Unesp de Jaboticabal. Foram
analisados uns totais de 600 amostras em diferentes tipos de leite caprinos: 200-UHT
integral, provenientes de duas empresas nacionais, sendo 100 amostras da região
sudeste (A) e outras 100 do sul (B) do Brasil; 100-UHT light, obtidas somente do
sudeste; 100-UHT achocolatado, também do sudeste; 200-de leite em pó, provenientes
de duas empresas, sendo 100 sob patente nacional (N) e outras 100, importadas (I). Foi
retirada uma amostra de 25 ml, transferida para um frasco contendo 225 ml de água
peptonada. Seguiu-se à homogeneização por simples agitação, sendo posteriormente
efetuadas as diluições seriadas até 10 –3 . Para o isolamento do Bacillus as diluições
foram submetidas a um choque térmico para ativação dos esporos, em seguida, 0,1 ml
de cada diluição foi colocada em superfície contendo agar nutriente NA e incubadas de
acordo com o método proposto por Brasil (1993). Para o isolamento de Bacillus cereus
10 ml de cada amostra foi transferida para um frasco contendo 90 ml de caldo de soja
triptona (TSB) adicionado de polimixina B na proporção de 20 ug/ml. Para o
plaqueamento seletivo, uma alíquota de 0,1 ml da cultura de enriquecimento seletivo foi
semeada em placas de petri contendo agar manitol-gema de ovo-polimixina B (MYP),
segundo Mossel (1967). Quando houve desenvolvimento microbiano, estas foram
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consideradas colônias sugestivas, transferidas em agar soja triptona (TSA) e em caldo
de infusão de cérebro e coração (BHI). Os esfregaços realizados foram corados pelo
método de Wirtz-Concklin, de acordo com Bier (1975). Confirmada a presença de
bastonete Gram positivos foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: prova da
catalase, provas da motilidade e redução do nitrato a nitrito e provas de VogesProskauer (VP). Para a extração de DNA, as estirpes de B. cereus foram solubilizadas
em 100 ul de água estéril conforme descrito por Kniehl et al. (2003). As reações de
amplificação foram feitas de acordo com protocolo descrito por Manzano et al. (2003) e
após foi feita a eletroforese em gel de agarose 1%.
RESULATDOS E DISCUSSÃO
Os resultados referentes ao isolamento de Bacillus spp., obtidos em análises de
diferentes tipos de leite caprino, bem como as estirpes confirmadas pelas provas
bioquímicas de pertencerem ao grupo do Bacillus cereus, evidenciam que, das 600
amostras analisadas 281 (46,8%) foram positivas para o grupo Bacillus cereus e das
184 estirpes encontradas, 73 (39,7%) foram confirmadas como pertencentes ao referido
grupo de microorganismos. Dos isolados de Bacillus spp., foram separadas somente as
estirpes pertencentes ao grupo do B. cereus, baseadas nas características morfológicas e
fisiológicas das colônias de bactérias típicas segundo Varnam e Evans (1991). Das
amostras analisadas pertencentes ao grupo do Bacillus spp., 92% foram isoladas de leite
em pó N, 3% foram isoloadas de leite em pó I, 76% de leite UHT integral A, 46% de
leite integral B, 34% de leite UHT light e 30% de leite UHT achocolatado; e das
estirpes típicas pertencentes ao grupo B. cereus, 24 (32,4%) foram isoladas de leite em
pó N, 35 (72,9%) de leite UHT integral A, 3 (14,2%) de leite integral B, 6 (30%) de
leite UHT light e 5 (25%) de leite UHT achocolatado. Das amostras de leite em pó I,
nenhuma foi confirmada como pertencente ao do grupo B. cereus. Acredita-se que o
controle de qualidade da matéria-prima seja mais rigoroso na elaboração desses
produtos. Entretanto, os resultados das amostras de leite UHT integral A são
preocupantes, uma vez que apresentam elevado número com estirpes positivas para o
grupo desse microorganismo, alertando para o risco que tal produto pode trazer à saúde
pública, visto que nas análises realizadas as porcentagens da ordem de 72,9% . Nas
análises microbiológicas, das amostras de leite caprino, foram confirmadas 35 estirpes
como pertencentes ao grupo do B. cereus, das 48 testadas pelas provas bioquímicas.
Isso levou a escolha destas estirpes positivas para comparar a acurácia do método de
PCR na identificação do microorganismo. A eletroforese em gel de agarose possibilitou
a visualização da presença do fragmento de 325 pb, específico para amplificação do
gene gyr B do Bacillus cereus, em 26 (74,3%) das 35 amostras analisadas como
observado na Figura 2. Das amostras que haviam sido classificadas pelos métodos
bioquímicos como pertencentes ao grupo do B. cereus, somente 26 foram realmente
confirmadas pelo método do PCR, permitindo confirmar que esta técnica diferenciou de
forma conclusiva a presença de B. cereus dentro de um grupo de organismos. Fato este
comprovado somente pela capacidade de manifestar a proteína gyr B somente pelos
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organismos da espécie B. cereus. A metodologia utilizada é fácil de ser realizada, já que
existem primers desenhados para este gene.
COCLUSÕES
O leite integral UHT caprino apresentou uma contaminação de 76% para Bacillus spp.,
bem maior que a do leite UHT light que teve 34%, sendo 72,9% para B. cereus quando
analisados pelos métodos bioquímicos. O método do PCR, utilizando o gene gyr B
adequado para codificar a subunidade da proteína gyrase, permitiu separar o B. cereus
do grupo entre os quais ele estava inserido.
REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 BIER, O. Bacteriologia e Imunologia: em suas aplicações à medicina e à higiene. 16ª
edição São Paulo: Melhoramentos, 1975. p. 842-843.
2 BRASIL, Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária,
Métodos Analíticos para o Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes
– Métodos Microbiológicos. Portaria no 101, Diário Oficial, 17 de Agosto de 1993.
3 KNIEHL, E. et al. Pseudo-outbreak of toxigenic Bacillus cereus isolated from stools
of three patients with diarrhoea after oral administration of a probiotic medication. J.
Hosp. Infec.,v. 64, p. 33-38, 2003.
4 MANTYNEN, V.; LINDSTROM, K. A rapid PCR-basead DNA test for enterotoxic
Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol., v.64, n. 1634-1639, 1998.
5 MOSSEL, D. A.A., Enumeration of Bacillus cereus in foods. Appl. Microbiol.,v. 15,
n. 3, p.650-653, 1967.
6 VARNAM, A. W., EVANS, M. G. Bacillus. In: Food borne pathogens. London:
Mosby Year Book, 1991. p. 267-288.