CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE Cryptosporidium parvum

XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004.
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE Cryptosporidium parvum
Márcia Benedita de Oliveira Silva
Professora de Parasitologia da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro
Uberaba – Minas Gerais
A Criptosporidiose é considerada um problema de saúde
pública tanto em países em do Brasil, a doença exerce maior impacto na saúde infantil. Nesta população, em adição à ocorrência de
diarréia, a criptosporidiose tem sido associada com desnutrição e
perda de crescimento. Dados sobre a prevalência da criptosporidiose
entre as crianças no país assinalam taxas em torno de 5,2% a 17%
(Franco & Cordeiro, 1996; Oshiro et al., 2000), podendo em alguns
casos chegar até 85,1% (Schnack et al., 2003), enquanto em paises
desenvolvidos essas taxas se encontram entre 3 e 3,6% (Franco &
Cordeiro, 1996).
Estudos de prevalência tem demonstrado que a infecção
em populações não portadoras de HIV com diarréia, em paises desenvolvidos, varia entre 0,3% e 4,3% e, nos paises em desenvolvimento entre 1,3 e 22,2%. Na população infectada pelo HIV, esses
índices são maiores, sobretudo nos países em desenvolvimento, onde
cerca de 50% das diarréias são causadas pelo Cryptosporidium; Nos
países desenvolvidos esse índice varia entre 8% e 30% (Andrade
Neto & Assef, 1996). Em estudo recente avaliamos a ocorrência de
criptosporidiose em pacientes HIV da região do Triângulo Mineiro,
entre os anos de 1993 e 2003 e encontramos uma taxa média de
9,47% (Silva et al, 2004). Estes dados estão abaixo do que já foi
relatado em outras regiões do país que assinalam uma ocorrência em
torno de 12,1 e 19,1% (Dias et al., 1988; Moura et al., 1989).
Em países desenvolvidos, surtos de criptosporidiose por
veiculação hídrica tem elevado impacto econômico. Um estudo
recente estimou que no surto de Milwalkee (Wisconsin – EUA) o
custo com medicamentos e perda em produtividade ficou em torno
de 96,2 milhões de dólares (Corso et al. 2003). Outro trabalho realizado no Reino Unido estimou que o gasto anual requerido para remoção de Cryptosporidium de águas para consumo humano está em
torno de 23 milhões de libras por ano (Prethy et al., 2000).
No Brasil, não temos dados concretos do impacto da criptosporidiose na economia, mas sabemos que os dados de prevalência
na população infantil e portadores do vírus HIV são maiores que
aqueles encontrados em países desenvolvidos e poucos são os estudos realizados na pesquisa de Cryptosporidium em águas de consumo humano (Newman et al., 1994; Gamba et al., 1997; Tomps,
1998; Dias Junior, 1999; RÉ, 1999; Muller, 1999; Farias, 2000). Até
então não temos dados específicos de surtos de criptosporidiose por
veiculação hídrica.
Recentes estudos têm demonstrado uma heterogeneidade
de Cryptosporidium sp. nas infecções humanas e animais e tem
sugerido uma conexão íntima entre a presença destas infecções, a
eliminação de grandes quantidades de oocistos no ambiente por
animais domésticos e a contaminação de águas superficiais.
A importância da criptosporidiose em animais domésticos é traduzida não só pelo potencial zoonótico de algumas espécies
como também pela perda econômica que esta infecção promove na
produção animal. O Cryptosporidium parvum é o enteropatógeno
mais comumente encontrado durante as primeiras semanas de vida
de bovinos, ovinos e caprinos e é considerado um importante agente
na etiologia das síndromes diarréicas neonatais nestas espécies. O
parasita freqüentemente age sozinho, mas a doença é mais pronunciada quando outros patógenos estão presentes. Perda econômica por
criptosporidiose está associada com um retardo no crescimento e
mortalidade e um custo difícil de estimar resultante de intervenções
por problemas de diarréia. A prevalência da criptosporidiose em
bovinos e caprinos no Brasil é considerada alta e já foi relatada em
torno de 36% e 12,7%, respectivamente (Guimarães et al., 2000;
Vieira et al., 2000).
Criptosporidiose em aves é um problema de saúde emergente. Em galinhas e outros galináceos a criptosporidiose é freqüentemente traduzida por doença respiratória, embora em perus e patos
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as formas intestinais da doença também já foram colocadas como
responsável pela morbidade e mortalidade nas granjas. É alarmante a
alta prevalência de C. baileyi encontrada em granjas de galinhas e o
aumento da patogenicidade quando agentes imunossupressores ou
outros patógenos respiratórios estão presentes, ou quando as aves
são submetidas à vacinação contra outros patógenos (Graaf et al.,
1999).
Em suínos e coelhos, Cryptosporidium sp. foi relatado
causar doença clínica somente quando administrado experimentalmente a animais recém-nascidos, sendo de forma geral a criptosporidiose assintomática nestas criações (Graaf et al., 1999).
O gênero Cryptosporidium tem sido classificado como
pertencente ao filo Apicomplexa e todas as espécies são protozoários
parasitas intracelulares obrigatórios com um desenvolvimento endógeno que culmina na produção de formas encistadas denominadas
oocistos, que são descarregadas nas fezes do hospedeiro. Para a
maioria das espécies deste filo, o estágio de oocisto é de grande
importância para a dispersão, sobrevida e infectividade do parasita.
É também, o estagio importante para a detecção do parasita e identificação das espécies.
Segundo Fayer et al. (2000), para gêneros semelhantes a
Caryospora, Cyclospora, Eimeria, Isospora, Sarcocystis e Toxoplasma, características biológicas (incluindo especificidade de hospedeiro), combinadas com o tamanho e conformação dos oocistos e
das estruturas internas destes (consistindo de esporocistos e esporozoítos), permitem aos especialistas a identificação de muitas espécies. Diferenças no tamanho ou nas estruturas internas destes oocistos podem ser vistas com microscopia comum ou de alta resolução.
Embora a avaliação morfométrica seja freqüentemente utilizada
como uma boa ferramenta para identificação de espécies dentro do
filo Apicomplexa, dificuldades podem ocorrer quando o tamanho
dos oocistos, a sua configuração ou as suas estruturas internas não
podem distinguí-lo de outras espécies. Este é o caso do Cryptosporidium que possuem oocistos relativamente pequenos e de difícil distinção entre pequenas partículas de plantas, leveduras, algas e fungos
freqüentemente presentes nas fezes e espécimes ambientais. Além
disso, muitos oocistos medem de 4 a 6 µm, apresenta-se de conformação esférica e possuem estruturas internas de difícil visualização
a microscopia comum e com poucas ou nenhuma diferença morfométrica capaz de diferenciar espécies. Embora a parede dos oocistos
possua antígenos que facilitam a sua identificação nas fezes, muitos
desses antígenos são conservados dentro do gênero Cryptosporidium
e aparecem em várias espécies, tornando difícil a produção de anticorpos específicos capazes de diferenciar.
Comparações de enzimas e ácidos nucléicos de esporozoítos dentro dos oocistos tem promovido outro meio de identificar
espécies e subespécies de Cryptosporidium. Entretant, a classificação de espécies baseada apenas em diferenças enzimáticas e moleculares também não tem sido suficiente.
Características biológicas clássicas, semelhantes à
especificidade de hospedeiro utilizadas para identificar outras
espécies do filo Apicomplexa, tem ajudado no gênero
Cryptosporidium, mas estas determinações requerem alto custo e
tempo, além de grandes quantidades de oocistos e uma variedade de
espécies de hospedeiros potencialmente susceptíveis.
Segundo Fayer et al. (2000), para solucionar esta dificuldade de detecção, identificação e nomeação de espécies de
Cryptosporidium seria necessária uma combinação de dados das três
ferramentas (morfométricos, técnicas moleculares e especificidade
de hospedeiro).
A importância do conhecimento da taxonomia de Cryptosporidium sp está na determinação da extensão da contaminação
de águas superficiais com espécies de Cryptosporidium que infec-
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tam o homem, no estabelecimento da identidade das espécies que
causam infecção humana e na determinação de forma precisa da
importância das espécies de Cryptosporidium de animais na saúde
publica. Tudo isto pode promover o conhecimento da transmissão e
epidemiologia da criptosporidiose humana e animal, para assim
desenvolver medidas preventivas eficazes para minimizar exposição
à infecção.
Apesar de 23 espécies de Cryptosporidium já terem sido
descritas, recentes trabalhos utilizando a combinação de critérios
morfométricos, especificidade de hospedeiro e estudos com base em
DNA, sugerem que apenas 13 espécies são aceitas dentro do gênero
Cryptosporidium: C. muris, C. andersoni, C. parvum, C. hominis,
C. wrairi, C. felis e C cannis em mamíferos, C. baileyi, C. galli e C.
meleagridis em pássaros, C. serpentis e C. saurophilum em répteis e
C. molnari em peixes (Monis & Tthompson, 2003; Xiao et al.,
2004).
Estudos moleculares tem promovido consideráveis evidências da heterogeneidade genética dentro dos isolados de Cryptosporidium de diferentes espécies de vertebrados, e existem hoje
evidências de que exista uma série de genótipos/espécies de parasitas que se tornam gradualmente adaptados a um grupo particular de
animais e desenvolvem alguma especificidade de hospedeiro.(Morgan et al., 1999; Fayer et al., 2000; Xiao et al., 2002, 2004).
Genótipos de Cryptosporidium associados a esta adaptação com
hospedeiro específico incluem genótipos de ganso, pato, suíno,
gambá, furão, genótipo bovino B e genótipo C. canis em raposas e
coiotes (Xiao et al., 2002; Enemark et al., 2003; Ryan et al., 2003;
Jellison et al., 2004), todos encontrados em um grupo particular de
animais sendo que muitos deles foram previamente considerados C.
parvum. Com isso, novas espécies são descritas e a subdivisão de C.
parvum em 2 espécies, C. parvum e C. hominis, tem recentemente
sido proposta para representar as designações de subespécies tipo 1 e
tipo 2 , sendo a primeira antroponótica, ocorrendo apenas no homem
e a segunda designada zoonótica infectando uma variedade de mamíferos inclusive o homem. Estas novas definições de espécies são
adotadas rapidamente. Entretanto, embora sugerido por numerosas
analises de polimorfismo genético, a separação reprodutiva entre os
tipos de C. parvum não tem sido testada experimentalmente e, nem
todos os genótipos adaptados a um hospedeiro podem ser considerados espécies separadas. O Cryptosporidium parasita de coiotes e um
dos 2 genótipos de raposas são geneticamente muito semelhantes ao
C. canis em cães e podem ser considerados variantes do C. canis e
não espécies novas (Xiao et al. 2004) e a identificação de que parece
ser C. parvum Tipo 1- Tipo2 haplotipos híbridos de 2 lócus (Strong
et al., 2000, Widmer et al., 1999) abrem algumas questões relevantes na taxonomia deste gênero e na origem do Tipo1 (C. hominis) e
Tipo 2 (C. parvum).
É também de considerável interesse observar que a passagem de genótipo Tipo 1 em suínos gnobióticos freqüentemente
resulta na emergência do genótipo Tipo 2, sendo sugerido então que
esta sub-população Tipo 2 pode originariamente fazer parte do Tipo
1 e como nas técnicas de biologia molecular a replicação do DNA é
feita em progressão geométrica, o genótipo com maior quantidade de
DNA sobrepõe aquele com menor quantidade e isto pode explicar a
raridade de infecções mistas com diferentes genótipos. Reforçando
esta idéia, recentemente GUK et al. (2004), utilizando isolado humano de uma infecção mista natural com genótipos Tipo 1 e 2, observou que ambos genótipos foram preservados com nenhuma mudança nos perfis genéticos durante várias passagens em diferentes
hospedeiros animais. Também demonstrou que diferentemente do
que tem sido relatado para à susceptibilidade a infecção por C. parvum, bovinos e camundongos imunossuprimidos são susceptíveis à
infecção com o genótipo Tipo 1.
No Brasil existem poucos dados e os que existem são referentes à caracterização genética dos tipos de Cryptosporidium que
circulam na população humana (Brantley et al., 2003; Gatei et al.,
2003). Entretanto, em estudo recente com bovinos e humanos HIVAIDS da região do Triângulo Mineiro, encontramos que duas das
nove amostras humanas positivas para Cryptosporidium eram de
genótipo Tipo 2 e sete de genótipo Tipo 1. Em bovinos encontramos
até então o genótipo Tipo 2 apenas. Uma amostra humana (TBM8)
com genótipos Tipo1 e outra com genótipo Tipo 2 (TBM6) foram
passadas em camundongos para avaliar infectividade e variabilidade
genética dos dois genótipos quando passados em animais. Nesse
experimento apenas camundongos inoculados com a amostra TBM6
(genótipo Tipo 2) se infectaram e apresentaram oocistos nas fezes e
quando avaliados na PCR-Multiplex (MORGAN et al.,1997), estes
oocistos apresentaram genótipo semelhante ao da amostra TBM6,
demonstrando uma alta reprodutibilidade do genótipo Tipo 2 quando
passado em animais. Nesse estudo foi demonstrado ainda que utilizando a técnica de PCR-Multiplex com iniciadores mistos descritos
por Morgan et al. (1997), em um pool de amostras contendo os dois
genótipos, ocorreu a amplificação preferencial do genótipo com
maior quantidade de DNA, no caso genótipo Tipo 2, reforçando
assim a hipótese de que na replicação do DNA, o genótipo com
maior quantidade sobrepõe o de menor quantidade e, por isso esse
último não é detectado pelas técnicas de PCR comumente utilizadas.
Atualmente estamos tentando avaliar a possibilidade de
infecção mista tanto em humanos quanto em bovinos naturalmente
infectados com C. parvum. Estamos utilizando para tanto iniciadores
específicos de genótipo Tipo 1 e genótipo Tipo 2 descritos por
Morgan et al. (1997) na técnica de PCR-Multiplex. Até então, temos
alguns resultados parciais que nos sugerem uma maior ocorrência de
infecção mista em humanos assim como encontrou GUK et al.
(2004) na República da Coréia e, aind, a presença do genótipo Tipo
1 em bovinos naturalmente infectados, dados que contradizem a
literatura atual, mas confirmam os achados de Guk et al. (2004) e a
hipótese que o genótipo Tipo 1 pode infectar bovinos e outras espécies animais.
Portanto, de acordo com estes achados acreditamos que
mais estudos são necessários, utilizando não só uma, mas várias
ferramentas para que se possa fazer uma reclassificação adequada do
C. parvum e ainda determinar se existem dois subtipos dentro da
espécie ou se são realmente, como dizem alguns pesquisadores,
espécies diferentes.
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