Organização gênica e regulação da expressão em

1
Nos eucariotos, os genes que controlam as enzimas de vias metabólicas não estão ligados ou
agrupados nos cromossomos; a transcrição ocorre no núcleo e a tradução, no citoplasma (nos
procariotos, ambas ocorrem em grande proximidade física). O RNAm dos eucariotos também
varia muito em sua estabilidade, sendo alguns bastante estáveis, o que permite pontos múltiplos
de controle.
2
Com algumas exceções, pode-se dizer que todas as células de um organismo contêm os mesmos
genes. No entanto, em um determinado tecido ou órgão, apenas um grupo desses genes é
expresso. Na espécie humana, por exemplo, muitos processos celulares e os genes que os
determinam são comuns a todas as células do nosso corpo, como os genes das proteínas
ribossômicas, cromossômicas (histonas) e do citoesqueleto, constituindo os chamados genes de
manutenção (ou housekeeping). Entretanto, embora teoricamente todas as células tenham os
mesmos genes, algumas se diferenciam em células do sangue, outras em células musculares,
outras em neurônios, etc, devido a um controle coordenado e diferencial da expressão de genes
estruturais, o qual pode ocorrer em diferentes estágios e em diferentes células. Esse controle,
em geral, é exercido por um gene denominado gene regulador, que produz uma proteína
diferente das que são codificadas pelos genes estruturais e cuja única função é controlar a
expressão desses últimos genes por meio de sua ligação a sítios particulares do DNA, agindo
sobretudo na transcrição.
3
4
5
Figura: Representação esquemática de um gene estrutural eucariótico típico, mostrando a
região flanqueadora à montante (à esquerda), que constitui a região promotora do gene; o sítio
de início da transcrição; os éxons e os íntrons; e o sítio de finalização da transcrição. Em genes
codificadores de proteínas, os íntrons em geral interrompem a região codificadora. Além disso,
também podem ocorrer íntrons que interrompem regiões flanqueadoras (5’-UTR e 3’-UTR), que
são transcritas, mas não são traduzidas (UTR – untranslated region = região não traduzida). Em
razão das sequências nucleotídicas presentes, íntrons eucarióticos, em geral, não adotam
estruturas secundárias (por pareamento intercadeia) no contexto de transcritos de RNA. Por
sito, dependem de um complexo ribonucleoproteico (spliceossomo) para a sua remoção.
6
*As histonas se ligam ao DNA graças à interação de seus radicais amino com os radicais fosfato
do DNA. Nem todos os radicais fosfato estão neutralizados pelas histonas, o que confere à
cromatina um caráter ácido (afinidade por corantes básicos).
7
Cada cromossomo contém um único duplex de DNA, compactado em uma fibra que se estende
continuamente ao longo de todo o cromossomo. Assim, no que diz respeito à cromatina
interfásica e ao cromossomo mitótico, podemos explicar a compactação de uma molécula de
DNA única e extremamente longa, em uma forma na qual pode ser transcrita e replicada e
também ser ciclicamente mais ou menos comprimida.
A disposição da cromatina dentro do núcleo e o seu grau de condensação variam de um tipo
celular para outro (são característicos de cada tipo celular). Além disso, a mesma célula pode
apresentar a cromatina com vários graus de condensação, de acordo com o estágio funcional e
com o estado de diferenciação em que se encontra.
8
Os genes localizados na eucromatina podem se expressar ou não, dependendo do tipo celular e
de suas necessidades metabólicas. Existem pelo menos duas formas de eucromatina: cerca de
10% na forma de cromatina ativa, que é menos condensada, e o restante na forma de cromatina
inativa, que é mais condensada. A heterocromatina constitutiva está sempre condensada.
Consiste, na maior parte, de DNA repetitivo e é encontrada nos centrômeros e ao redor deles e
em algumas outras regiões. Ela passa pelo ciclo celular com poucas mudanças no seu grau de
condensação. Forma uma série de massas discretas, mas, frequentemente, as diversas regiões
de cromatina agregam-se em um cromocentro densamente corado.
A heterocromatina facultativa pode existir tanto na forma geneticamente ativa (descondensada)
quanto na forma inativa (condensada), como no caso da inativação do cromossomo X em
mamíferos.
A mesma fibra cromatínica pode apresentar regiões eucromáticas contínuas com regiões
heterocromáticas. Assim, o material genético é organizado de modo que diferentes estados de
compactação sejam mantidos lado a lado, possibilitando a ocorrência de alterações cíclicas no
nível de compactação da cromatina entre a intérfase e a divisão, e entre as diferentes fases da
vida da célula.
9
Os cromossomos normais têm um só centrômero, o qual é visto ao miscroscópio como uma constrição primária, a
região em que as cromátides-irmãs estão unidas. O centrômero é essencial para a segregação durante a divisão
celular.
Funções:
-ponto de ligação das fibras de microtúbulos durante a divisão celular;
-ponto de reunião de cromátides-irmãs;
-motor mecano-químico responsável pelo movimento dos cromossomos para os pólos da célula e conclusão da
divisão celular.
Durante a prófase tardia, um par de cinetócoros forma-se em cada centrômero, cada um ligado a uma das
cromátides-irmãs. Múltiplos microtúbulos ligam-se a cada cinetócoro, ligando o centrômero de um cromossomo aos
dois pólos do fuso. Os cinetócoros desempenham um papel fundamental nesse processo, controlando a reunião e a
separação dos microtúbulos acoplados e, por meio da presença de moléculas motoras, dirigindo o movimento
cromossômico.
Os telômeros são estruturas especializadas, constituídas por DNA repetitivo (repetições em tandem ou agrupadas) e
proteína, que cobrem as extremidades dos cromossomos eucarióticos.
Funções prováveis:
-manter a integridade estrutural do cromossomo: se um telômero for perdido, a extremidade cromossômica
resultante fica instável, tendendo a fundir-se com as extremidades de outros cromossomos quebrados ou envolver-se
em eventos de recombinação ou ser degradada.
-garantir a replicação completa das extremidades codificadoras dos cromossomos: durante a replicação do DNA, a
síntese da fita atrasada é descontínua e requer a presença de algum DNA à frente para um primer de RNA.
-auxiliar o estabelecimento da arquitetura tridimencional do núcleo e/ou do pareamento cromossômico: as
extremidades dos cromossomos parecem estar ligadas à membrana nuclear, sugerindo que os telômeros auxiliam no
posicionamento dos cromossomos.
-auxiliar no reconhecimento entre cromossomos homólogos para pareamento na meiose.
Origens de replicação: necessárias para que ocorra a replicação do DNA na fase S da intérfase. São seqüências de DNA
cis-ativas, situadas próximas aos pontos onde a síntese de DNA é iniciada, que controlam o início da replicação. Nos
eucariotos existem várias origens da replicação (replicadores) autônomas (ARS – autonomously replicating
sequences) ao longo de uma única molécula (para cada origem, duas forquilhas de replicação
bidirecionais).
10
As histonas H3 e H4 apresentam seqüências idênticas em organismos tão distintos quanto a
ervilha e o boi, sugerindo que elas desempenham funções idênticas em todos os eucariontes. Os
tipos H2A e H2B possuem também seqüências idênticas, com algumas variações espécieespecíficas.
Em alguns tecidos, a H1 é substituída por histonas especiais. Por exemplo, em eritrócitos
nucleados de aves, a histona H5 é encontrada em substituição à H1.
11
A porção enovelada da molécula das histonas contém alta percentagem de aminoácidos
hidrofóbicos, e sua associação com o DNA deve-se à interações hidrofóbicas. Pode-se separar,
por processos químicos, a molécula de DNA das moléculas de histonas. Mas quando o DNA e as
histonas são colocados juntos em condições favoráveis, ocorre novamente a formação
espontânea de nucleossomos.
12
O nucleossomo é uma partícula de forma cilíndrica achatada, com 10 nm de diâmetro e 6 nm de
altura. Cada nucleossomo é constituído por 200 pb de DNA associados a um octâmero de
histonas e a uma molécula de histona H1. O octâmero é formado por duas moléculas de cada
uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4. A molécula de H1 se associa externamente ao DNA que
envolve o octâmero. Cada nucleossomo é formado por um centro ou cerne, constituído pelo
octâmero de histonas H2A, H2B, H3 e H4, em torno do qual se enrola um segmento de DNA de
aproximadamente 146 pb. Conectando um centro de nucleossomo a outro, encontra-se um
segmento de DNA não associado a proteínas com 15 até 100 pb, chamado DNA de ligação.
13
Dois tipos de fibras cromatínicas são encontradas no núcleo interfásico: a fibra de 10 nm de
diâmetro ou nucleofilamento e a fibra de 30 nm ou solenoide.
A fibra de 10 nm constitui o primeiro nível de compactação da cromatina e é formada pela
associação de nucleossomos adjacentes. A organização dessa fibra depende da interação entre
as histonas H1 de nucleossomos vizinhos. A histona H1 de um nucleossomo liga-se através de
sua extremidade amino-terminal, à extremidade carboxi-terminal da H1 do nucleossomo
adjacente, em um arranjo “cabeça-cauda”. Com essa organização, o DNA de ligação não é mais
observado na fibra de 10 nm.
A fibra de 30 nm constitui o segundo nível de organização da cromatina e é formada pelo
enovelamento da fibra de 10 nm em uma estrutura helicoidal. Cada volta da espiral contém 6
nucleossomos organizados radialmente, ficando a histona H1 localizada no interior da fibra. A
histona H1, juntamente com íons Mg2+ em concentração adequada, tem papel preponderante
na formação e estabilização dessa fibra.
Durante a intérfase, a cromatina que contém os genes ativamente transcritos é formada, em sua
maioria, por fibras de 30 nm, enquanto cerca de 10% estão na forma de fibras de 10 nm,
permitindo o acesso às enzimas envolvidas na transcrição.
14
Ainda no núcleo interfásico, as fibras de 30 nm podem se organizar em grandes alças que se
prendem ao envoltório nuclear através da lâmina nuclear. Cerca de 10% da cromatina interfásica
também se encontra em um estado altamente condensado – a heterocromatina.
Níveis superiores de compactação da cromatina parecem envolver, principalmente, as proteínas
não-histônicas. A histona H1 parece, no máximo, participar também do processo de
compactação, uma vez que a sua fosforilação, durante a prófase, determina a condensação dos
cromossomos.
15
16
As histonas são suscetíveis a uma grande variedade de modificações pós-traducionais, tais como
acetilação, fosforilação, metilação e ubiquitinação. A maioria dessas modificações acontece no
domínio N-terminal das histonas, que é rico nos aminoácidos básicos lisina e arginina (mas
também podem ocorrer nos domínios globulares).
Enzimas como a acetiltransferase, as quinases e as metiltransferases, que depositam
marcadores químicos nas histonas (acetil, fosfato e metil, respectivamente), são reguladores
importantes da atividade gênica, da dinâmica dos cromossomos, da regulação do ciclo celular e
da organização do genoma.
17
As necessidades regulatórias dos organismos superiores podem ser divididas em dois tipos: (a)
regulação com efeitos de longo prazo, que envolve a diferenciação morfológica e funcional
permanente; (b) regulação com efeitos de curto prazo, que resulta em respostas imediatas,
porém transitórias, a um dado estímulo.
18
A diferenciação celular, durante o desenvolvimento ontogenético(*), depende da regulação da
expressão dos genes que as células contêm. No início do desenvolvimento embrionário de
muitas espécies, a diferenciação está controlada por fatores de origem materna encontrados no
citoplasma do ovo. Depois de algum tempo, entretanto, os próprios genes do embrião começam
a se tornar ativos.
(*) Desenvolvimento ontogenético corresponde ao conjunto de transformações que ocorrem
em um organismo, desde que se forma o zigoto, passando por todas as fases embrionárias, até
que se complete a sua formação.
19
No início do desenvolvimento embrionário de muitas espécies, a diferenciação está controlada
por fatores de origem materna encontrados no citoplasma do ovo. Depois de algum tempo,
entretanto, os próprios genes do embrião começam a se tornar ativos.
20
Em mamíferos, por exemplo, a síntese do mRNA inicia-se no estágio de quatro células, embora
os embriões continuem a usar o mRNA de origem materna por bom período de tempo.
Normalmente, os genes estão cuidadosamente regulados para se tornarem ativos no momento
específico em que um dado produto gênico é necessário.
21
Os genes reguladores podem ser distinguidos dos estruturais pelos efeitos das mutações. Uma
mutação em um gene estrutural modifica uma proteína específica codificada por esse gene. Já
uma mutação em um gene regulador influi na expressão de todos os genes estruturais que ele
regula. A natureza dessa influência revela o tipo de regulação: negativa ou positiva.
22
Na regulação dita negativa, os genes são transcritos, a menos que sejam desativados pela
proteína reguladora. Assim, uma mutação que inative o regulador faz com que os genes
estruturais permaneçam se expressando. Visto que a função do regulador, nesse caso, é impedir
a expressão dos genes estruturais, ele é denominado repressor.
Por outro lado, na regulação positiva, os genes estruturais só são transcritos se os genes
reguladores os ativarem. Na ausência do regulador, os genes não se expressam.
23
Os mecanismos e as moléculas que executam os vários tipos de controle ainda não são
totalmente conhecidos, mas alguns deles já foram descritos.
A regulação da expressão gênica nos eucariotos pode ocorrer em qualquer uma das etapas que
vão do DNA aos produtos proteicos. A Figura mostra os principais modos de regulação e os
momentos em que podem ocorrer, todos afetando o grau da expressão dos genes. Certas
características das células eucarióticas possibilitam-lhes a utilização de vários modos de
regulação:
(a) o alto conteúdo de DNA associado com as histonas e outras proteínas, formando estruturas
compactas de cromatina, que são modificadas durante a expressão gênica, no interior do
núcleo; (b) antes de serem transportados para o citoplasma, os mRNAs são encadeados,
capeados (CAP) e poliadenilados, e cada um desses processos pode ser regulado de modo a
influir na quantidade e nos tipos de mRNAs disponíveis para a tradução; (c) depois da
transcrição, o transporte dos mRNAs para o citoplasma também pode ser regulado para modular
a disponibilidade desses RNAs à tradução; (d) os mRNAs têm meias-vidas variáveis, podendo ser
regulados para retardar sua degradação; (e) as taxas de tradução podem ser moduladas, bem
como o processamento, as modificações e a degradação das proteínas.
24
O DNA eucariótico combina-se com histonas e outras proteínas, formando a cromatina, que
integra e forma os cromossomos. O maior grau de compactação da cromatina pode inibir a
replicação, a transcrição e o reparo, do DNA. A capacidade de ser alterada a associação entre o
DNA e outros componentes da cromatina é essencial para permitir o acesso das proteínas
reguladoras do DNA; por isso o remodelamento (ou remodelagem) da cromatina é importante
na regulação gênica.
25
Epigenética: estudo de mudanças na função gênica, herdáveis mitoticamente e/ou
meioticamente e não vinculadas a mudanças na sequência do DNA.
O remodelamento pode ocorrer de várias maneiras, por exemplo: alteração da composição ou
do posicionamento dos nucleossomos (unidades básicas da cromatina), facilitando a transcrição
gênica; modificações das histonas, relaxando sua associação com o DNA; metilação do DNA, isto
é, adição de grupamentos metila às suas bases (com mais frequência à citosina), reprimindo a
transcrição mediante inibição da ligação dos fatores de transcrição ao DNA. Há uma relação
inversa entre o grau de metilação e o grau de expressão gênica, ou seja, os genes que são
transcritos ativamente estão desmetilados ou com baixo nível de metilação.
26
27
In vivo, os resíduos de lisina podem ser mono, di ou trimetilados, enquanto os de arginina, mono
ou bimetilados.
28
Em 1993, Alan Wolffe mostrou que acetilases/desacetilases formam complexos com fatores de
transcrição que ligam/desligam os genes.
Em 1998 Adrian Bird et al. mostraram que as desacetilases podem funcionar em conjunto com
metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inativa os genes.
29
Formas ubiquitiladas de histonas H2A e H2B foram associadas especificamente
com genes ativos, tornando a ubiquitilação de histona um dos primeiros
marcadores de cromatina transcricionalmente activo a ser reconhecido
A ubiquitilatição da histona H2B, mediada pela enzima ubiquitina-conjugante
(Ubc) Rad6, é implicada na repressão transcricional do gene argininosuccinato
sintase (ARG1) e manutenção do silenciamento telomérico em Saccharomyces
cerevisiae. A ubiquitilação de da histona H2B (uH2B) é necessária para a
metilação da histona H3 nos resíduos de lisina 4 (K4) e 79 (K79). A metilação
histona H3, por sua vez, é necessária para o silenciamento do gene-telomérico.
Figura: A histona H2B é reconhecida pela Rad6 e suas proteínas auxiliares e é
ubiquitilada na sua lisina 123. Esta ubiquitinação serve como um sinal de
reconhecimento direto ou indireto para COMPASS, que catalisa a metilação da
quarta lisina da histona H3, resultando no silenciamento transcriptinal de genes
localizados perto do telômero.
COMPASS: a metilação de lisina 4 na cauda amino-terminal da histona H3,
mediada por um complexo multiproteico chamdo compass, é necessária para
silenciar a expressão de genes localizados perto dos telômeros cromossômicos e
dentro do rDNA.
30
O grupo fosfato é fortemente negativo, então sua adição induz forças na cadeia
protéica que podem levar a uma radical alteração em sua conformação. Desse
modo, uma proteína pode expor os aminoácidos antes escondidos em seu centro
e mudar muito suas características. Por exemplo, uma proteína apolar e
hidrofóbica pode se tornar polar e hidrofílica.
Figura de cima: após a estimulação pelo fator de crescimento, a via da MAP
quinase é ativada, resultando na fosforilação da histona H3 em dois resíduos
específicos de serina (S10 e S28). Estes eventos de fosforilação correlacionam
com a ativação da transcrição de genes.
MAP quinase (Mitogen Activated Protein Kinases): Proteínas-quinase ativadas
por mitógenos. É uma subfamília de proteínas-quinase específicas de
serina/treonina que respondem a estímulos extracelulares (mitógenos) e
regulam várias atividades celulares, como expressão gênica, mitose,
diferenciação, sobrevivência celular e apoptose (morte celular).
Figura de baixo: a fosforilação de H3 promove também a acetilação da mesma
histona e estas modificações funcionam em conjunto para ativar a expressão do
gene.
A desfosforilação é realizada pelas fosfatases.
31
SAH: S-adenosil-homocisteína, produzida por desmetilação da SAM.
A natureza das desmetilases é desconhecida.
A metilação consiste em uma modificação covalente do DNA na qual um
grupamento metil (CH3) é transferido da S-adenosilmetionina para o carbono 5
de uma citosina (5-Mec ou 5-metil-citosina) que geralmente precede uma
guanina (dinucleotídeo CpG), pela ação de uma família de enzimas que recebe o
nome de DNA metiltransferases (DNMT).
32
As DNA metiltransferases estão divididas em duas classes de representantes:
aquelas envolvidas na metilação de fitas hemimetiladas do DNA (fitas de DNA em
processo de replicação), conhecidas como metilases de manutenção como a
DNMT1; e outro grupo, responsável pela maioria dos processos de metilação de
novo, que ocorre em sítios com nenhum tipo de indicação de metilação, ou seja,
sem a presença de metilação prévia, como as DNMT2, DNMT3A e DNMT3B.
Os doadores de radical metil são obtidos pela dieta e são principalmente a
metionina, seguido do folato, colina e vitamina B12.
A desmetilação pode ocorrer na ausência de DNMT1 com rodadas contínuas de
replicação do DNA (desmetilação passiva), bem como ativamente (sem a
replicação do DNA). O processo denominado de desmetilação ativa envolve as
desmetilases e parece ser necessário para ativar genes específicos ou apagar a
marca epigenética durante o desenvolvimento ou em respostas a perturbações
ambientais. A desmetilação ainda pode ser passiva quando não há envolvimento
de desmetilases e ocorre quando a manutenção pelas metiltransferases é
inativada durante o ciclo celular. Assim, o nível e o padrão de 5-Mec são
determinados por ambos os processos de metilação e desmetilação, e as
enzimas envolvidas nesses processos devem estar altamente reguladas.
33
Os dinucleotídeos CpG aparecem esparsos pelos genomas eucariotos ou
agrupados em regiões definidas como ilhas CpG. Essas ilhas são frequentes em
regiões promotoras de certos genes, incluindo genes housekeeping. A transcrição
gênica pode ser fortemente inibida pela adição de radical metil. A presença de
um “capuz” metil sobre uma citosina que precede a uma guanina pode inibir a
ligação de fatores de transcrição a essas regiões. A não ligação de fatores de
transcrição aos seus sítios específicos resulta na ausência de transcrição gênica.
Ao contrário, a desmetilação leva ao aumento da transcrição gênica. Assim, CpGs
metilados estão associados com DNA silenciados (transposons, genes
imprintados), enquanto CpGs não-metilados estão associados a genes ativos.
Definindo: “ilhas CpG” são regiões do DNA com mais de 200 pares de bases (pb),
contendo aproximadamente 50% de bases C e G e com uma presença esperada
de proximadamente 60% de dinucleotídeos CG.
Em células embrionárias indiferenciadas, a porcentagem de metilação em CpA,
CpT ou CpC é alta e isso poderia estar relacionado com a pluripotência dessas
células.
34
35
Imprinting genômico: processo normal, no qual genes específicos são geralmente
marcados por metilação (imprinting), seguindo um padrão (materno ou paterno)
durante a gametogênese. Progenitores podem contribuir com genes exatamente
iguais aos seus descendentes, mas se estes genes forem marcados
diferentemente (imprinting), não terão efeitos idênticos. Sua expressão irá
depender da origem (materna ou paterna) desse gene.
36
Exemplos na natureza:
égua + jumento = mula ( ) ou burro ( )
égua + cavalo = égua ( ) ou cavalo ( )
jumenta + jumento = jumenta ( ) ou jumento ( )
37
38
Ambas síndromes são mais frequentemente causadas por microdeleções na
região cromossômica 15q11-q13 que é sujeita a impressão genômica. Por causa
da impressão genômica, há expressão monoalélica diferencial de genes nos
cromossomos homólogos 15 paterno e materno, e assim as microdeleções
resultam em completa deficiência de expressão de genes críticos.
Síndrome de Prader-Willi (SPW) e a Síndrome de Angelman (SA) são doençasneurogenéticas
relacionadas ao fenômeno de impressão genômica na região cromossômica 15q11-13. É
considerada uma alteração cromossômica dominante, resultante de uma deleção de um ou
vários genes do braço longo proximal do cromossomo 15 paterno ou materno (70% dos casos).
No entanto, em cerca de 25% dos casos, trata-se de uma dissomia uniparental materna ou
paterna do cromossomo 15, ou seja, o indivíduo apresenta dois cromossomos 15 de um genitor
e nenhum do outro genitor.
39
40
41
O produto de XIST (TsiX) é um RNA com 15 Kb não-codificante transcrito a partir da fita antisenso do gene Xist, que fica associado ao X inativo, envolvendo-o. Esse RNAm é apenas
transcrito, não sendo traduzido em proteína. A expressão do gene XIST determina o
silenciamento dos outros genes do cromossomo X. O gene XIST não age sozinho na iniciação da
inativação, sofrendo influência de outros genes.
Cerca de 16 genes do cromossomo X inativado escapam à inativação: 12 deles têm homólogos
no cromossomo Y. Além disso, alguns genes apresentam inativação variável entre diferentes
indivíduos.
Em células embrionárias após o 13º-16º a não inativação de um dos cromossomos X, isto é, a
permanência de dois cromossomos X ativos, é um evento letal. Em células somáticas é um
evento raro, podendo ocorrer em células normais ou neoplásicas.
X inativado tem replicação tardia.
42
43
A regulação da transcrição do DNA em uma molécula de mRNA envolve vários tipos diferentes
de sequências de DNA, a interação de muitas proteínas, o remodelamento da cromatina e a
formação de alças e dobramentos de sequências de DNA.
44
Os genes eucarióticos têm diversos tipos de sequências reguladoras, como os promotores,
silenciadores e reforçadores.
45
Os promotores são sequências de DNA que funcionam como sítios de reconhecimento para a
maquinaria da transcrição, com localização adjacente aos genes por eles regulados. Geralmente
têm centenas de nucleotídeos e especificam o início e a direção da transcrição ao longo do DNA.
46
As sequências mais conhecidas (chamadas boxes) incluem: (1) TATA box, que frequentemente
contém 7 a 8 pb na sequência-consenso TATAAAA, localizando-se cerca de 25 a 30 pb 5' à
montante ou à esquerda do sítio de início da transcrição; mutações nessas sequências reduzem
a transcrição e deleções podem alterar o sítio de início da transcrição.
O elemento TATA é o sítio onde se liga o fator de transcrição TFIID. A proteína de ligação a TATA
é uma das subunidades de TFIID, e se liga primeiro ao elemento TATA.
47
(2) CAT (CAAT ou CCAAT) box, sequência-consenso localizada aproximadamente 70 a 8 pb 5'
acima ou à esquerda do sítio de início da transcrição, sendo menos presente do que o TATA box;
quando presente, contribui para uma transcrição quantitativamente mais eficiente.
As sequências reguladoras localizadas no promotor são consideradas de atuação cis, quando
afetam apenas a expressão do gene adjacente, e de atuação trans, quando atuam sobre genes
distantes, geralmente sobre ambas as cópias de um gene em cada cromossomo. Em alguns
genes humanos, como o da distrofia muscular Duchenne, existem vários promotores, situados
em diferentes regiões do gene. Dessa forma, a transcrição gênica pode começar em pontos
distintos, produzindo proteínas também diferentes. Isso permite que a mesma sequência gênica
codifique variantes de uma proteína em tecidos diferentes (p. ex., no tecido muscular versus
tecido cerebral).
48
(3) GC box ou GGGCGGG, sequência-consenso particularmente presente na região promotora
dos genes de manutenção, alguns dos quais não possuem os TATA e CAT boxes, mas são
extremamente ricos em GC na região promotora. Os elementos CAAT e GC ligam-se aos fatores
de transcrição e funcionam também aproximadamente como reforçadores.
49
As sequências reguladoras localizadas no promotor são consideradas de atuação cis, quando
afetam apenas a expressão do gene adjacente, e de atuação trans, quando atuam sobre genes
distantes, geralmente sobre ambas as cópias de um gene em cada cromossomo.
Promotor de ação em trans significa que pode regular todos os genes estruturais, estejam eles
residindo em uma mesma molécula ou em moléculas diferentes.
50
Em alguns genes humanos, como o da distrofina (distrofia muscular Duchenne), existem vários
promotores, situados em diferentes regiões do gene. Dessa forma, a transcrição gênica pode
começar em pontos distintos, produzindo proteínas também diferentes. Isso permite que a
mesma sequência gênica codifique variantes de uma proteína em tecidos diferentes (p. ex., no
tecido muscular versus tecido cerebral).
51
Os reforçadores (também chamados acentuadores ou enhancers) são sequências de DNA
situadas a uma distância variável dos genes estruturais, que aumentam o nível da transcrição de
genes que lhes estão próximos ou distantes, e interagem com os promotores. Essas sequências
podem estar localizadas acima (5’, upstream, à montante ou à esquerda), abaixo (3’,
downstream, à jusante ou à direita) ou dentro do gene a ser transcrito e podem também estar
distantes muitos milhares de pares de base deste, e em qualquer uma das fitas. São sítios de
ligação de proteínas ativadoras, que são colocados em proximidade ao gene pelo dobramento
do DNA.
Exemplos: os primeiros reforçadores descobertos foram os de certos vírus de DNA, como o
SV40, capazes de aumentar a transcrição de um grande número de genes em praticamente
todos os tecidos testados. Mais recentemente, foram descobertos reforçadores específicos para
alguns tecidos ou células, como, por exemplo, o reforçador localizado no gene da
imunoglobulina, o qual é funcional nas linfócitos B, mas não em outros tipos de células.
52
Uma vez que os reforçadores se situam a distâncias variáveis dos promotores, existe um
mecanismo de dobramento ou inversão do DNA, que permite a interação simultânea de vários
elementos reguladores, pela formação de uma ou mais alças ou laços complexos do DNA. A
interação reforçador-promotor também pode ocorrer quando uma proteína reguladora se liga
primeiramente ao reforçador e depois desliza no DNA até se ligar a um promotor. Acredita-se
que as proteínas que se ligam a enhancers causem uma curvatura no DNA e permitam um
acesso mais fácil das proteínas da maquinaria de transcrição a um determinado promotor.
53
Os silenciadores são sequências curtas de DNA, também de atuação cis, que reprimem o nível da
transcrição. Frequentemente agem de modo tecido-específico ou cromossomo-específico para
controlar a expressão gênica. Um exemplo de silenciador é o do gene da tireotropina humana,
que codifica uma subunidade do hormônio tireotropina e só se expressa nas células produtoras
de tireotropina (os tireotrofos) da glândula hipófise. Sua transcrição restringe-se aos tireotrofos,
por efeito do silenciador, situado a 140 pb a montante do sítio de início da transcrição. Esse
silenciador liga-se ao fator celular Oct-1 que, no âmbito do promotor do gene da tireotropina ,
reprime a transcrição em todos os tipos celulares, exceto os tireotrofos. Nestes, a ação do
silenciador é suplantada pela ação do reforçador localizado a mais de 1,2 kb acima do promotor.
54
Resumindo, os promotores, reforçadores e silenciadores influem no início da transcrição, por
consistirem em sítios de ligação para proteínas conhecidas como fatores de transcrição, que se
ligam ao DNA e podem ter efeitos variados sobre a transcrição, aumentando, diminuindo ou
modulando o nível da expressão gênica. Esses fatores de transcrição são produzidos por genes
que controlam a transcrição do DNA para o RNA e, ativados por sinais extracelulares, ligam-se ao
promotor, formando complexos que iniciam a transcrição, com o auxílio da RNA-polimerase. A
Figura apresenta de forma esquemática o complexo de iniciação da transcrição, mostrando os
principais elementos reguladores.
Figura: Representação esquemática da formação do complexo de iniciação da transcrição. A Uma proteína de ligação TATA liga-se ao TATA box no promotor de um determinado gene. B Proteínas coativadoras reúnem-se em torno da proteína referida no item A. C - Proteínas
ativadoras e repressoras ligam-se ao conjunto assim formado, para controlar o ritmo da
transcrição, e sua presença é transmitida ao gene que deverá ser expresso, pelas proteínas
coativadoras referidas no item B e unidas à proteína de ligação TATA. D - Finalmente, proteínas
denominadas fatores basais ou gerais de transcrição unem-se à proteína de ligação TATA, de
modo a fazerem espaço para a RNA-polimerase ligar-se ao promotor.
55
A regulação pós-transcricional se dá durante o processamento do hnRNA ou pré-mRNA em
mRNA, que inclui a remoção dos íntrons, o encadeamento dos éxons e a adição de cap à
extremidade 5' do mRNA e da cauda poli-A à sua extremidade 3'. Depois, o mRNA é enviado ao
citoplasma, onde é traduzido e degradado. Cada passo desse processamento pode ser regulado
para controlar a quantidade de mRNA funcional disponível para sintetizar o produto proteico,
com consequências para a velocidade de tradução e a estabilidade e atividade desse produto.
56
Os principais mecanismos de regulação pós-transcricional são o encadeamento (splicing)
alternativo, o controle da estabilidade do mRNA e o silenciamento mediado pelo RNA.
57
O encadeamento (splicing) alternativo produz diferentes moléculas de mRNA a partir do mesmo
pré-mRNA, gerando maior número de produtos proteicos por gene, com funções similares ou
diferentes. Esse tipo de encadeamento é bastante comum em vertebrados, inclusive os
humanos.
Há muitas formas de recombinar os exons, desde que mantida a ordem em que aparecem na
sequência de DNA.
Figura: Variedade de eventos básicos de splicing alternativo. Em amarelo estão os exons que
sempre permanecem na sequência final do mRNA; em laranja os exons que podem ser retirados
(e, neste caso, são considerados introns pela maquinaria de splicing) ou não; e em linha preta os
íntrons. Os padrões de splicing estão indicados pelas linhas tracejadas. Um dos mecanismos
alternativos possíveis é a excisão de um exon interno à sequência do gene, como mostrado em
(a). Neste caso, ele se comporta como um intron, e a proteína resultante será mais curta. Outra
forma comum é a presença de sítios 5' (mostrado em b) ou 3' (mostrado em c) alternativos de
splicing, que levam à inclusão ou não de um exon. Empregando diferentes sítios 5' aceptores de
splicing é possível também trocar o promotor de um gene (d). Analogamente, empregando sítios
alternativos 3‘ de splicing podemos mudar o sítio de poliadenilação do mensageiro final (e).
Exons internos podem ser incluídos ou não na sequência final do mRNA, independente dos
demais exons (f). Alternativamente, exons mutuamente excludentes podem permutar de lugar
na forma madura mo mRNA (g).
Múltiplos sítios de poliadenilação: o processamento diferencial da extremidade 3’ é uma forma
de gerar diferentes mRNA maduros por splicing alternativo, podendo ocorrer a adição da cauda
poli(A) em dois ou mais sítios, de acordo com o sítio de poliadenilação do éxon incluído no
splicing alternativo.
58
As modificações no encadeamento (splicing) podem alterar a atividade enzimática, a capacidade
de ligação com o receptor ou a localização de uma proteína na célula. Por isso, constituem
eventos reguladores importantes que ajudam a controlar diversos aspectos como, por exemplo,
o desenvolvimento pluricelular, a apoptose e a conexão entre os neurônios.
59
O controle da estabilidade do mRNA relaciona-se com a quantidade de um mRNA na célula, que
é determinada pela combinação entre a taxa de transcrição do gene e a taxa de degradação
desse mRNA. A duração de um mRNA, definida em termos de meia-vida, pode variar bastante e
pode ser regulada em resposta às necessidades da célula. Por exemplo, a grande quantidade de
algumas proteínas envolvidas na regulação da transcrição gênica, no crescimento e na
diferenciação celulares é determinada mais pelo controle da taxa de degradação dos mRNAs
dessas proteínas do que pela regulação da taxa de transcrição gênica.
60
61
A degradação do mRNA pode dar-se por três vias gerais, cada uma sujeita à regulação: (a)
enzimas que encurtam a cauda de poli-A; em mRNAs recém-sintetizados, essa cauda tem cerca
de 200 nucleotídeos e se liga a uma proteína de ligação à poli-A, que ajuda a estabilizar o mRNA,
mas se a cauda for encurtada para menos de 30 nucleotídeos, esse mRNA se torna instável e é
logo degradado pelas exonucleases; (b) enzimas que removem o cap, tornando instável o mRNA;
(c) clivagem interna do mRNA por uma endonuclease, expondo extremidades desprotegidas, por
meio das quais a degradação pode continuar. Como um mRNA normal pode tornar-se alvo de
degradação? Um modo de alterar sua meia-vida é por intermédio do elemento rico em
adenosina-uracil (ARE, de adenosine-uracil rich element), uma sequência de ribonucleotídeos A e
U, localizada geralmente nas regiões 3' não traduzidas dos mRNAs que têm meias-vidas curtas e
reguladas. Esses mRNAs codificam proteínas envolvidas no crescimento celular ou no controle
da transcrição, que precisam ser moduladas rápida e abundantemente.
Em células com baixos níveis de expressão gênica, as sequências ARE do mRNA se ligam a
complexos específicos que realizam o encurtamento da cauda de poli-A e a rápida degradação
do mRNA. As doenças autoimunes, algumas condições inflamatórias e certos tipos de câncer
parecem estar associados a defeitos no controle da estabilidade do mRNA por meio das
sequências ARE.
62
O silenciamento mediado pelo RNA, também conhecido como interferência por RNA (RNAi), é a
regulação da expressão gênica exercida por pequenas moléculas de RNA de fita dupla (com
pouco mais de 20 nucleotídeos) no citoplasma, por meio de repressão da tradução e indução da
degradação do mRNA, quando esse tem uma sequência complementar a uma das fitas do RNA
de fita dupla. Bastam poucas moléculas de fita dupla para realizar a degradação de grandes
quantidades de mRNA. Recentemente, foi demonstrado que esses pequenos RNAs (pequeno
RNA interferente [siRNA], microRNA [miRNA] e o RNA associado à proteína Piwi [piRNA]) agem
também no núcleo, alterando a estrutura da cromatina e reprimindo a transcrição.
Aparentemente, os mecanismos de RNAi se conservaram em todos os eucariotos, inclusive os
humanos, nos quais constituem um mecanismo de defesa natural contra infecções virais.
63
O RNAi é sistêmico em plantas e nematóides, espalhando-se de célula para célula. Em C.
elegans, o RNAi é também hereditário: o silenciamento pode ser transferido para a progênie do
verme que foi originalmente injetado com o dsRNA.
64
As características que definem os pequenos RNAs de silenciamento são o seu pequeno tamanho
(~20–30 nucleotides) e a sua associação com os membros da família de proteínas argonautas,
que os guiam para seus alvos de regulação, tipicamente resultando em expressão reduzida de
genes-alvo. Além dessas características definidoras, diferentes classes de pequenos RNA
orientam esquemas diversos e complexos de regulação gênica. Alguns pequenos RNAs de
silenciamento, tais como os pequenos RNAs de interferência (siRNAs), derivam de dsRNA,
enquanto outros, como os RNAs de interação com proteínas Piwi (piRNAs), não o fazem.
Proteínas argonautas: componentes fundamentais de um complexo ribonucleoprotéico
chamado RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA, do inglês RNA-induced silencing
complex), cujos alvos são moléculas de RNA mensageiro, onde atuam impedindo o processo de
tradução.
65
Proteínas argonautas: componentes fundamentais de um complexo ribonucleoprotéico
chamado RISC, cujos alvos são moléculas de RNA mensageiro, onde atuam impedindo o
processo de tradução.
66
67
A presença RNA de fita dupla (dsRNA) pode induzir a degradação de RNAs mensageiros (mRNA)
homólogos por dois tipos de moléculas distintas (siRNA e miRNA), um processo conhecido como
silenciamento gênico pós-transcricional (Post transcriptional gene silencing, PTGS) em plantas e RNA
de interferência (RNA interference, RNAi) em animais. O destino do mRNA alvo nem sempre é a
degradação. Está só ocorrerá se a hibridização com a cadeia anti-senso do siRNA com o mRNA for perfeita.
Se existirem zonas despareadas, ocorrerá o bloqueio da tradução.
siRNA: pequenos RNAs de interferência, do inglês small interfering RNAs. São produzidos a partir da
clivagem de longas moléculas de dsRNA de origem exógena (como aquelas provenientes de vírus de RNA)
ou endógena – endo-siRNA (originados, por exemplo, de transposons ou de elementos repetitivos em
tandem tais como genes de RNA ribossomal 5S, entre outros). Estão envolvidos na degradação de RNA
viral, interferindo ou mesmo bloqueando o ciclo de infecção.
miRNAs: micro RNAs. São produtos naturais da transcrição em muitos eucariotos e se originam a partir de
mRNA primários (pré-mRNA) de cadeia simples que formam uma estrutura secundária tipo “grampo de
cabelo” de ~70 nucleotídeos. Uma vez processados a miRNAs, seu tamanho é similar aos siRNAs. Em
moscas, vermes e mamíferos, alguns pré-miRNAs são produzidos pela via de splicing nuclear pré-mRNA.
Regulam a expressão gênica negativamente por meio do pareamento de bases específicos a mRNAs alvo,
resultando na clivagem do mRNA ou na repressão de sua tradução. miRNAs regulam diversas vias
bioquímicas celulares e é acreditado que regulam a maioria dos processos em plantas e animais, desde
funções housekeeping (responsáveis pela fisiologia fundamental da célula) até respostas ao estresse
ambiental.
stRNAs: pequenos RNA temporais, do inglês small temporal RNA. São miRNAs envolvidos no controle do
tempo do desenvolvimento do estágio larval (controle de expressão temporal) de C. Elegans.
Mamíferos e C. elegans possuem uma única Dicer, que produz ambos, os microRNAs (miRNAs) e siRNAs,
enquanto as espécies de Drosophila têm duas Dicers: DCR-1, que produz miRNAs, eDCR-2, especializada
na produção de siRNA.
RISC: complexo de silenciamento induzido por RNA (do inglês, RNA-induced silencing complex). O
mecanismo de RNA de interferência envolve a formação de um complexo denominado RISC (complexo de
silenciamento induzido por RNA) no qual ocorre o pareamento da sequência do RNA mensageiro e a fita
de RNA complementar do siRNA (denominada fita guia). A enzima Argonauta catalisa a degradação do
RNA mensageiro, mediando o silenciamento gênico.
68
69
70
71
A tradução pode ser regulada por intermédio dos níveis intracelulares de proteínas, o que é
conhecido como autorregulação, também conhecida como regulação autógena. Um de seus
exemplos mais conhecidos é o das tubulinas
e , componentes das subunidades dos
microtúbulos de eucariotos, que inibem a tradução do mRNA da tubulina. O tratamento de uma
célula com colchicina causa rápida desagregação de seus microtúbulos e aumento da
concentração de subunidades e livres; nessas condições, a síntese de tubulinas e diminui
consideravelmente. No entanto, quando a célula é tratada com vimblastina, uma substância que
também causa desagregação dos microtúbulos, e a síntese de tubulinas aumenta. Apesar de
ambas as substâncias causarem desagregação dos microtúbulos, a vimblastina precipita as
subunidades que não estão em solução, reduzindo as concentrações das subunidades e p livres.
A síntese das tubulinas é estimulada nas baixas concentrações de subunidades livres e inibida
nas altas concentrações.
72
A tradução pode ser regulada por intermédio dos níveis intracelulares de proteínas, o que é
conhecido como autorregulação, também conhecida como regulação autógena. Um de seus
exemplos mais conhecidos é o das tubulinas
e , componentes das subunidades dos
microtúbulos de eucariotos, que inibem a tradução do mRNA da tubulina. O tratamento de uma
célula com colchicina causa rápida desagregação de seus microtúbulos e aumento da
concentração de subunidades e livres; nessas condições, a síntese de tubulinas e diminui
consideravelmente. No entanto, quando a célula é tratada com vimblastina, uma substância que
também causa desagregação dos microtúbulos, e a síntese de tubulinas aumenta. Apesar de
ambas as substâncias causarem desagregação dos microtúbulos, a vimblastina precipita as
subunidades que não estão em solução, reduzindo as concentrações das subunidades e p livres.
A síntese das tubulinas é estimulada nas baixas concentrações de subunidades livres e inibida
nas altas concentrações.
73
O ponto final da expressão gênica é a presença ou a atividade do produto proteico do gene. Em
alguns casos, a tradução de um mRNA pode ser regulada pelo grau de demanda da proteína pela
célula. Um bom exemplo desse tipo de regulação pós-traducional é o controle da tradução do
mRNA dos receptores de ferritina e de transferrina. Para o funcionamento de muitas enzimas
celulares são necessários átomos de ferro solúvel, mas o excesso de ferro é tóxico para as
células.
Por não existir fisiologicamente um mecanismo de excreção do ferro, a absorção diária é
altamente regulada para fornecer apenas o necessário e para evitar a toxicidade, uma vez que o
excesso de ferro pode levar à geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), enquanto a
diminuição dos níveis de ferro pode levar à anemia.
74
No interior do corpo, o ferro está ligado a uma proteína chamada transferrina. As moléculas
receptoras de transferrina situam-se na superfície celular e interagem com o complexo
transferrina/ferro, transportando-o para o citoplasma, onde o ferro é liberado. Para se
protegerem dos altos níveis de ferro intracelular, as células sintetizam a proteína ferritina, que
se liga aos átomos de ferro, inativando-os no citoplasma (armazenamento).
75
Assim, os níveis de ferritina precisam estar bem sintonizados para responder aos níveis de ferro
e para garantir a quantidade necessária de átomos de ferro livres para o metabolismo celular.
Igualmente, os níveis de receptores de transferrina precisam estar regulados para fornecer
ferro intracelular suficiente. Essa dupla regulação é atingida pela modulação da capacidade de
tradução dos mRNAs dos receptores de transferrina e de ferritina.
76
A Figura 1.28 ilustra esse exemplo de regulação da expressão gênica. Na região 5' não traduzida do mRNA
da ferritina há uma sequência de 30 nucleotídeos conhecida como elemento de resposta ao ferro (IRE, de
iron response element). Esse elemento dobra-se em uma estrutura de alça-haste que se liga à proteína
reguladora de ferro. Quando não há excesso de ferro na célula, essa proteína reguladora se liga ao IRE do
mRNA da ferritina, bloqueando o início da tradução do mRNA da ferritina. Havendo excesso de ferro, suas
moléculas se ligam à proteína reguladora de ferro, o que faz com que essa se dissocie do IRE. Assim, o
mRNA da ferritina fica disponível para a tradução.
O IRE também está presente na região 3’ não traduzida do mRNA do receptor de transferrina. Quando
não há excesso de ferro, o IRE se liga à proteína reguladora de ferro. Essa ligação não afeta diretamente a
tradução, como ocorria com o mRNA da ferritina; ao contrário, a presença da proteína reguladora de ferro
aumenta a estabilidade do mRNA do receptor de transferrina, resultando em aumento dos níveis de
mRNA, que se traduz em aumento dos níveis desse receptor. A presença de mais receptores acelera o
transporte de ferro para a célula. Quando há excesso de ferro, suas moléculas se ligam à proteína
reguladora de ferro, dissociando-a do mRNA do receptor de transferrina e tornando instáveis esse mRNA.
Nesse caso, é transportado menos ferro para a célula.
Legenda Figura 1.28: Regulação da expressão gênica de (A) ferritina e (B) receptor de transferrina. A
proteína reguladora de ferro liga-se à estrutura em alça-haste dos mRNAs da ferritina e do receptor da
transferrina. A - Em ausência de ferro livre, a proteína reguladora de ferro inibe a tradução do mRNA da
ferritina, mas estabiliza o mRNA do receptor de transferrina. B - Em presença de ferro livre (representado
por círculos vermelhos), a proteína reguladora de ferro se dissocia do IRE, resultando em aumento da
tradução da ferritina e desestabilização do mRNA do receptor da transferrina.
77
Em outros casos, ocorrem modificações posteriores nas proteínas, incluindo clivagem e ligação
covalente a carboidratos e lipídeos, que são importantes para a função e a localização correta
das proteínas no interior da célula. Além disso, a regulação da função proteica, como a da
atividade enzimática, exerce um papel-chave no controle do comportamento celular.
78
Em geral, o nível das proteínas reguladoras pode ser modificado por diferentes fatores: (a)
velocidade da transcrição do gene em RNA; (b) processamento desse RNA; (c) transporte do
mRNA do núcleo para o citoplasma; (d) velocidade da tradução do mRNA em cadeia
polipeptídica; (e) velocidade de degradação do mRNA; (f) processamento pós-traducional do
polipeptídeo; e (g) velocidade de degradação da proteína.
Todos esses mecanismos de controle correspondem a situações específicas. Entretanto, talvez o
método de controle mais econômico e mais difundido nos eucariotos seja o de controlar a
produção da proteína no nível da transcrição do gene.
79
80
81
82
83