Microbiologia Endodôntica – Uma Revisão do Processo

IES – INSTITUTO DE EDUCAÇÃO DA SAÚDE
FERNANDA APARECIDA TAVARES
DANIELA VALÉRIO SILVA
MICROBIOLOGIA ENDODÔNTICA – UMA REVISÃO DO PROCESSO
BELO HORIZONTE
2011
Microbiologia Endodôntica – Uma Revisão do Processo
FERNANDA APARECIDA TAVARES
DANIELA VALÉRIO SILVA
MICROBIOLOGIA ENDODÔNTICA – UMA REVISÃO DO PROCESSO
MONOGRAFIA- ESPECIALIZAÇÃO EM ENDODONTIA
ORIENTADOR: WARLEY LUCIANO FONSECA TAVARES
BELO HORIZONTE
2011
RESUMO
A ecologia microbiana se foca na inter-relação entre microorganismos e o meio onde vivem.
Em um ecossistema em desenvolvimento, certas espécies denominadas organismos
pioneiros são os primeiros colonizadores. Estas espécies geralmente são substituídas por
outras após a modificação de seu habitat, fazendo com que o mesmo seja mais adequado ao
desenvolvimento destas. As doenças infecciosas representam uma categoria de interações
que envolvem um hospedeiro frente à microorganismos com potenciais colonizadores e
patogênicos. m certas situações, tais microorganismos podem invadir locais normalmente
estéreis do nosso organismo, como o tecido pulpar, tornando-se assim microorganismos
oportunistas. As lesões traumáticas e as lesões cariosas são as principais vias de infecção do
tecido pulpar. Uma vez reconhecida a presença de microorganismos e seus subprodutos nos
túbulos dentinários, um processo imuno-inflamatório é arquitetado neste tecido. Existem
vários mecanismos através dos quais os microorganismos se adaptam ao meio. A formação
de biofilmes, modificação fisiológica, resposta ao stress, e a criação de subpopulações de
células estão entre os mecanismos de adaptação usados pelas bactérias juntamente com
vários mecanismos envolvendo trocas genéticas. A interação entre os componentes
bacterianos e não bacterianos de um ecossistema levam à formação de uma estabilização
onde formas microbianas e não microbianas coexistem com seu meio. Esta comunidade
clímax se mantém relativamente estável e reflete uma situação dinâmica, onde células
morrem e são substituídas. A diversidade bacteriana em qualquer ambiente é subestimada
quando analisada por técnicas por meio de cultura. A aplicação de métodos genéticos
moleculares na análise da diversidade bacteriana na cavidade oral tem revelado um spectro
bacteriano maior do que antes apreciado.
Existe então a possibilidade de espécies
incultiváveis e ainda não caracterizadas que permanecem indetectáveis em estudos por
métodos tradicionais de identificação e podem fazer parte de uma larga fração da
microbiota oral que participa da etiologia de doenças orais, incluindo doenças periapicais. O
objetivo deste estudo é fazer uma revisão da literatura de como ocorre a dinâmica das
infecções endodônticas e de como os métodos de identificação molecular ajudam na
avaliação das bactérias presentes nos sistemas de canais radiculares.
ABSTRACT
Microbial ecology focuses on the interrelationship between organisms and their
environment. In a developing ecosystem, certain species known as pioneer organisms are
the first colonizers. These species are often replaced by others after modification of its
habitat, causing it to be more suitable to them. Infectious diseases represent a category of
interactions involving a host against microorganisms with potential colonizers and
pathogens. n certain situations, such microorganisms can invade normally sterile sites in our
body, like the pulp tissue, thus becoming opportunistic microorganisms. Traumatic injuries
and carious lesions are the main routes of infection of the pulp tissue. Once recognized the
presence of microorganisms and their byproducts in the tubules, a process
immunoinflammatory is architected in this tissue. There are several mechanisms by which
microorganisms adapt to the environment. The formation of biofilms, modifying
physiological response to stress, and the creation of subpopulations of cells are among the
coping mechanisms used by bacteria with different mechanisms involving genetic
exchanges. The interaction between bacterial and nonbacterial components of an ecosystem
leads to the formation where a stabilization of microbial forms and microbial not coexist
with his environment. This climax community remains relatively stable and reflects a
dynamic situation, where cells die and are replaced. Bacterial diversity in any environment is
underestimated when analyzed by using culture techniques. The application of molecular
genetic methods in the analysis of bacterial diversity in the oral cavity has revealed a
bacterial spectro higher than before enjoyed. There is then the possibility of species
incultiváveis and not yet characterized in studies that remain undetectable by traditional
methods of identification and may be part of a large fraction of the oral microbiota that
participates in the etiology of oral diseases, including periapical diseases. The aim of this
study is to review the literature on how the dynamics occurs endodontic infections and the
methods of molecular identification assist in the evaluation of bacteria in root canals.
Lista de Figuras
Figura 1 – Preparação de um ápice radicular associado à infecção crônica observado com microscopia
eletrônica de varredura. ....................................................................................................................15
Figura 2 - Exemplos de técnicas moleculares utilizadas no estudo de infecções endodônticas. ..........21
Figura 3 - Gráfico bilateral da contagem média (105) das 77 espécies em amostras não amplificadas
(n=46) e amplificadas (n=66). ............................................................................................................25
Figura 4 - Prevalência de espécies encontradas em infecções endodônticas de dentes decíduos.......27
Sumário
1.
Princípios da Ecologia Microbiana ............................................................................................. 7
2.
Sucessão Microbiana ................................................................................................................. 8
3.
Colonização e Infecção Endodôntica.......................................................................................... 9
4.
Nutrição como um Fator Ecológico ...........................................................................................12
5.
Mecanismos de Adaptação Bacteriana e a Formação de Biofilmes ..........................................14
6.
A Comunidade Clímax...............................................................................................................18
7.
A biologia Molecular na Identificação de Microorganismos nas Infecções Endodônticas .........19
8.
Vantagens dos Métodos Moleculares Sobre os Outros Métodos de Identificação Microbiana 20
9.
Infecções Endodônticas Primárias ...........................................................................................23
10.
Infecções Endodônticas em Dentes Decíduos .......................................................................26
11.
Infecções Refratárias ao Tratamento Endodôntico ...............................................................28
1. Princípios da Ecologia Microbiana
A ecologia microbiana se foca na inter-relação entre microorganismos e o meio onde vivem.
O ecossistema pode ser considerado uma peça chave neste processo, sendo constituído
pelos microorganismos presentes em um determinado meio e pelos constituintes não
microbianos dos arredores onde os mesmos se encontram. O ecossistema inclui o
conglomerado de espécies e os constituintes orgânicos e inorgânicos característicos daquele
determinado sítio, como por exemplo, o sistema de canais radiculares. Os organismos
habitantes de um determinado sítio constituem uma comunidade. O conglomerado de
organismos que constitui uma comunidade possui populações de espécies microbianas
individuais. Como resultado, temos uma hierarquia que vai do ecossistema passando pela
comunidade, pela população até que se chegue à célula individual.
O habitat consiste do sítio onde uma população ou comunidade cresce, se reproduz, e
sobrevive. O papel do organismo no habitat é o seu nicho. Desta forma o nicho não conota
localização, mas sim função. Sendo assim, uma determinada espécie pode possuir um nicho
em um habitat, e outro diferente em outro habitat (Alexander 1971).
7
2. Sucessão Microbiana
Em um ecossistema em desenvolvimento, certas espécies denominadas organismos
pioneiros são os primeiros colonizadores. Estas espécies geralmente são substituídas por
outras após a modificação de seu habitat, fazendo com que o mesmo seja mais adequado ao
desenvolvimento destas. Alguns fatores contribuintes da sucessão microbiana são:
• Provisão por uma comunidade de nutrientes que conferem uma vantagem ecológica
para as espécies da próxima fase de sucessão.
• A produção por uma população de um constituinte presente em quantidade
insuficiente para garantir a sobrevivência de uma população anterior.
• Alteração na concentração de nutrientes orgânicos.
• Modificação de substratos heterógenos, como os tecidos do hospedeiro.
• Efeito auto-intoxicante.
• Eliminação física de organismos.
8
3. Colonização e Infecção Endodôntica
As superfícies protetoras do corpo humano como a pele, mucosas e esmalte dentário são
altamente colonizadas por microorganismos. Estima-se que o número médio de células
bacterianas supera em 10 vezes o número de células humanas em nosso corpo (1013, S 1014
células). Os microorganismos não patogênicos compõem a microflora do hospedeiro. A
mesma não possui meramente uma relação passiva com o hospedeiro, mas contribui direta
e indiretamente para o desenvolvimento normal da fisiologia, nutrição e sistema de defesa
do corpo humano (Marsh, 2000a; McFarland, 2000; Rosebury, 1962). Como exemplo, a
interrupção da microflora por antibióticos pode resultar em deficiências de absorção ou no
metabolismo de vitaminas, em super crescimento de bactérias resistentes ou colonização
por espécies exógenas (e mesmo patogênicas) devido à perda de resistência de colonização
(Lacey et al., 1983; Sanders & Sanders, 1984; Woodman et al., 1985).
A composição da microflora residente é característica para habitats distintos como a boca,
pele, intestino, etc., apesar da contínua transferência de organismos entre estes sítios,
(Tannock, 1995). Uma vez estabelecida, a microflora residente de cada sítio permanece
relativamente estável por tempos. Tal estabilidade (que tem sido nomeada homeostase
microbiana) resulta não por indiferenças biológicas entre o hospedeiro e a microflora, mas
sim de um equilíbrio dinâmico que surge de numerosas relações intermicrobianas e
hospedeiro-microbianas (Alexander, 1971; Marsh, 1989). Mudanças no habitat ou nos meios
podem pertubar tal equilíbrio.
Recentemente, a “hipótese da placa ecológica” surgiu nos conceitos clássicos de infectologia
para explicar a etiologia de cáries e doença periodontal. Tal hipótese sugere que organismos
associados com a doença podem também estar presentes em sítios sadios, porém em níveis
muito baixos para representar uma ameaça clínica. Em outras palavras, a doença é
produzida como um resultado de mudanças nas condições locais do meio que irão alterar o
equilíbrio da flora residente (Marsh, 1994,1997).
A relação entre o meio e a comunidade microbiana não é unidirecional. Apesar das
propriedades do meio ditarem quais microorganismos podem ocupar um determinado sítio,
o metabolismo da comunidade microbiana pode modificar as propriedades físico-químicas
9
dos tecidos (Alexander, 1971). Sendo assim, as condições do meio se modificam durante o
desenvolvimento da placa dental com o metabolismo dos colonizadores iniciais anaeróbios
facultativos, diminuindo a concentração de oxigênio e produzindo dióxido de carbono e
hidrogênio. Tal modificação reduz o potencial de óxido-redução e cria um ambiente mais
propício ao desenvolvimento de colonizadores tardios, que são em sua maioria anaeróbios
estritos.
Similarmente, o meio bucal também irá variar em saúde e doença. Com a
progressão da lesão cariosa, acontece sua penetração em tecido dentinário. As fontes
nutricionais sofrerão alteração e as condições locais ficarão mais ácidas e anaeróbias devido
à acumulação de produtos do metabolismo bacteriano.
As doenças infecciosas representam uma categoria de interações que envolvem um
hospedeiro frente à microorganismos com potenciais colonizadores e patogênicos
(Socransky & Hafffajee, 2005). Em certas situações, tais microorganismos podem invadir
locais normalmente estéreis do nosso organismo, como o tecido pulpar, tornando-se assim
microorganismos oportunistas (Henderson & Wilson, 1998). O grau de patogenicidade de
tais microorganismos é denominado virulência, que é a capacidade de um microrganismo
produzir formas graves da doença. Relaciona-se com a produção de toxinas e à sua
capacidade de multiplicação no organismo parasitado.
As lesões traumáticas e as lesões cariosas são as principais vias de infecção do tecido pulpar.
Uma vez reconhecida a presença de microorganismos e seus subprodutos nos túbulos
dentinários, um processo imuno-inflamatório é arquitetado neste tecido. As espécies
bacterianas que inicialmente penetram o tecido dentinário são as anaeróbias facultativas,
como aquelas pertencentes aos gêneros Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus e
microrganismos filamentosos (SIQUEIRA Jr., 2001). Dependendo do grau e intensidade da
invasão bacteriana e do processo inflamatório, o tecido pulpar pode se tornar necrótico,
propiciando assim a invasão do espaço pulpar pelos microorganismos.
Na dinâmica de uma infecção endodôntica, anaeróbios estritos são invasores secundários.
Nos estágios iniciais, bactérias anaeróbias facultativas são a maioria. Em, aproximadamente,
sete dias após o estabelecimento da infecção, 50% da microbiota já é composta de
anaeróbios obrigatórios. Em três meses, a proporção desses anaeróbios pode chegar a 85%
e, em seis meses, 90% (FABRICIUS, 1982).
10
Oxigênio e produtos oxigenados exercem papel importante como determinantes ecológicos
no desenvolvimento de proporções específicas da microflora de canais radiculares
(Loesche 1968, 1983; Carlsson et al 1977). O consumo de oxigênio e a produção de dióxido
de carbono e hidrogênio juntos com a diminuição do potencial de óxido-redução pelas
espécies colonizadoras pioneiras favorecem o desenvolvimento de microorganismos
anaeóbios.
11
4. Nutrição como um Fator Ecológico
A disponibilidade e o tipo de nutrientes são importantes no estabelecimento do crescimento
bacteriano. Os nutrientes podem ser derivados da cavidade oral, tecido conjuntivo em
degradação, conteúdos dos túbulos dentinários, ou do fluido seroso periapical. Nutrientes
exógenos, como carboidratos fermentáveis, afetam a ecologia microbiana na parte coronal
de um tecido pulpar exposto promovendo o crescimento de microrganismos que
primariamente obtém energia da fermentação de carboidratos. Proteínas endógenas e
glicoproteínas são os principais nutrientes no canal principal, o que determina o crescimento
de microorganismos anaeróbios capazes de fermentar aminoácidos e peptídeos. A sucessão
de anaeróbios estritos sobre anaeróbios facultativos com o tempo é mais provável devido à
mudanças na disponibilidade de nutrientes assim como uma redução na disponibilidade de
oxigênio(Fabricius 1982). Anaeróbios facultativos dominados pelo gênero streptococci
crescem bem em anaerobiose, entretanto, sua fonte primária de energia são os
carboidratos. Uma redução na disponibilidade de carboidratos nos canais radiculares
acontece quando não há comunicação direta com a cavidade oral, o que severamente limita
a oportunidade de crescimento de anaeróbios facultativos. O crescimento de populações
bacterianas mistas dependem da cadeia alimentar, onde o metabolismo de uma espécie
supre nutrientes essenciais ao crescimento de outros membros da população. (Grenier D,
Mayrand, 1986).
Cocos anaeróbios produtores de pigmento negro (Prevotella e Porphyromonas) são
exemplos de bactérias que possuem requerimentos nutricionais muito específicos. Os
mesmos são dependentes de vitamina K e hemina. A vitamina K pode ser produzida por
outras bactérias (Gibbons et al 1964). A hemina se torna disponível quando a hemoglobina é
quebrada, porém algumas bactérias podem produzi-la. Uma grande quantidade de
interações são reconhecidas entre bactérias orais, o que pode também influenciar as
associações microbianas no sistema de canais radiculares (Carlsson 1990; Sundqvist 1992
a,b). Após a degradação do tecido pulpar, uma fonte sustentável de proteínas é
desenvolvida, uma vez que as bactérias induzem uma inflamação periapical que resulta no
influxo de um exsudato seroso para o interior dos canais. Tal fluido é rico em proteínas e
12
glicoproteínas, e os microorganismos dominantes neste estágio da infecção são aqueles com
capacidade proteolítica ou mantém um sinergismo com aqueles que podem utilizar tal
substrato como fonte de energia.
13
5. Mecanismos de Adaptação Bacteriana e a Formação de Biofilmes
Existem vários mecanismos através dos quais os microorganismos se adaptam ao meio. A
formação de biofilmes (Costerton et al 1987), modificação fisiológica (Drenkard et al 2002),
resposta ao stress (Svensäter et al 2000), e a criação de subpopulações de células (Lewis
2005) estão entre os mecanismos de adaptação usados pelas bactérias juntamente com
vários mecanismos envolvendo trocas genéticas (Sedgley et al 2004). A exploração destes
mecanismos podem nos ajudar a entender a sobrevivência bacteriana em meios
extremamente limitados, como o encontrado nos canais radiculares. Uma das mais
relevantes características de adaptação de bactérias orais é a adesão em superfícies que leva
à formação de placas ou biofilmes, que tem a função não só de ajudar sua retenção na
cavidade oral, mas também de aumentar sua capacidade de sobrevivência (Bowden, 1998).
A união entre os microrganismos acontece através de expopolissacarídeos extracelulares
que configuram uma união extremamente forte entre as bactérias, aumentando assim seu
gura de virulência (Svensäter and Bergenholtz, 2004).
Interessantemente, esta habilidade de formar comunidades em biofilmes complexos não é
perdida quando microorganismos orais colonizam outros sítios no corpo humano. Por
exemplo, espécies como Streptococcus oralis e S. gordonii, foram encontradas na formação
de biofilmes no endocárdio e válvulas cardíacas, sendo assim considerados como principais
agentes etiológicos da endocardite bacteriana (Presterl et al 2005, Scheld et al 1995).
Similarmente, microorganismos orais são capazes de colonizar canais radiculares através da
aderência às paredes dentinárias como demonstrado em microfotografias de um ápice
radicular associado a uma infecção crônica tiradas com microscópio eletrônico de varredura
(Fig. 1) (Chavez de la Paz 2007).
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Figura 1 – Preparação de um ápice radicular associado à infecção crônica observado com
microscopia eletrônica de varredura. Sobrevista em (a) com magnificação de 80x demonstra
um canal radicular acessório (seta). Magnificação de 400x em (b) demonstra uma parede do
canal acessório evidenciando um biofilme bacteriano, uma secção é demarcada para maior
magnificação. Imagens (c) e (d) demonstram a secção demarcada em magnificação de
3000x. Acúmulos de células bacterianas aderidas à parede do canal são observados. Figura
retirada de Chavez de La Paz. Redefining the Persistent Infection in Root Canals: Possible
Role of Biofilm Communities J Endod 2007; 33:652– 662.
Agregações de microorganismos podem ser vistas aderidas às paredes internas de canais
acessórios sob alta magnificação, demonstrando assim a retenção de comunidades em
biofilme mesmo após o tratamento endodôntico. Biofilmes se formam quando bactérias
planctônicas em sua fase livre natural são depositadas sobre uma superfície contendo um
condicionamento orgânico de matriz polimérica ou um “filme condicionante”. Neste
processo dinâmico, vários outros organismos co-aderem à superfície, se desenvolvem e
multiplicam. Com o tempo, algumas células passam a se destacar do biofilme (Bowden et al
1979, Brecx et al 1983, Gilbert et al 1993, Lee et al 1996, Svensäter and Bergenholtz 2004).
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A formação do biofilme em canais radiculares, como hipotetizado por Svensäter e
Bergenholtz (2004), é provavelmente inicializada pouco após a primeira invasão da câmara
pulpar por microorganismos orais planctônicos após rompimento tecidual. Neste ponto, o
tecido em degeneração e o processo inflamatório desenvolvido proveniente da região
periapical, podem prover o veículo fluido necessário à invasão de microorganismos
planctônicos, fazendo com que os mesmos tenham condições de se multiplicar e continuar o
processo de aderência às paredes radiculares.
Interessantemente, bactérias foram observadas se destacando das superfícies internas dos
canais e ocasionalmente se misturando no fluido inflamatório per se (Nair et al 2005). Tal
observação poderia explicar como o processo inflamatório serve como uma fonte fluida de
microorganismos que se destacaram e colonizaram outros sítios inacessíveis do sistema de
canais radiculares. Sendo assim, quando biofilmes são formados em superfícies localizadas
além do alcance de instrumentos endodônticos , irrigantes, e medicações intracanal,
proteínas derivadas do hospedeiro provenientes do tecido pulpar em degeneração e
substâncias adesivas produuzidas pelos microorganismos irão promover os pré-requisitos
básicos para a sobrevivência bacteriana. Biofilmes em canais radiculares foram confirmados
através de exames de dentes extraídos com lesões periapicais. Por exemplo, quando secções
de dentes foram examinadas com microscopia eletrônica de varredura, densos agregados de
cocos e bastonetes embebidos na matriz extracelular foram encontrados ao longo das
paredes dentinárias (Nair et al 1987). Dessa forma, o conceito de biofilme à microbiologia
endodôntica é considerado como um passo importante no entendimento de infecções de
canais radiculares, especialmente aquelas refratárias ao tratamento endodôntico, uma vez
que microorganismos em forma de biofilme são mais protegidos frente às mudanças
ambientais e aos antimicrobianos (Gilbert et al 1997). Além da proteção física gerada pela
matriz extracelular (Branda et al 2005) uma proteção adicional é gerada pelas mudanças
fisiológicas iniciadas pelas bactérias após sua adesão à superfície (Costerton et al 1987,
Fletcher 1991, Goodman 1995). Tais mudanças fenotípicas pelas bactérias em biofilme
usualmente resultam no aumento de resistência aos agentes antimicrobianos, em alguns
casos numa razão 1000 vezes maior do que aqueles microorganismos que sobrevivem em
forma planctônica (Gilbert et al 1997, Johnson et al 2002). Evidências existem demonstrando
16
que biofilmes orais são mais resistentes à clorexidina, amina fluorida, amoxicilina, doxiciclina
e metronidazol que células planctônicas (Larsen 2001,Shani et al 2000).
17
6. A Comunidade Clímax
A interação entre os componentes bacterianos e não bacterianos de um ecossistema levam
à formação de uma estabilização onde formas microbianas e não microbianas coexistem
com seu meio. Esta comunidade clímax se mantém relativamente estável e reflete uma
situação dinâmica, onde células morrem e são substituídas. O clímax pode ser modificado de
tempos em tempos devido a forças exógenas, além de poder ser irreversivelmente alterado
pela realização do tratamento endodôntico (Socransky & Hafffajee, 2005).
Hipoteticamente, todas as espécies microbianas presentes no SCR infectado podem ser
consideradas patogênicas, pois são capazes de induzir inflamação nos tecidos periapicais
(Tani Ishii et al., 1994). Nesse aspecto, parece que algumas associações microbianas são
claramente mais virulentas que outras, estando as espécies dos gêneros Prevotella,
Porphyromonas e Peptostreptococcus fortemente associadas à destruição óssea periapical
(Griffe et al., 1980; van Winkelhoff et al., 1985; Dahlén et al, 1987; Sundqvist et al.,1989;
Yamasaki et al., 1992; Baumgartner et al. 1992). A capacidade de agredir o hospedeiro pode
se relacionar à habilidade de determinados microrganismos de lesar as células diretamente
através das enzimas e toxinas por eles produzidas ou pela indução de reações imunológicas
de hipersensibilidade ou de imunosupressão (Shenker & Datar, 1995; Jiang et al., 1999;
Kurita-Ochiai et al., 2000; Sheikhi et al., 2000, Jewett et al., 2000; Ribeiro Sobrinho et al.,
2005; Silva et al., 2007).
Atualmente, temos encontrado muitos estudos comprovando a presença de fungos, como
Candida Albicans. Estes microrganismos têm sido relacionados á infecções persistentes, mas
podem aparecer em canais que não foram submetidos ao tratamento endodôntico (Bezerra
da Silva et al, 2000).
18
7. A biologia Molecular na Identificação de Microorganismos nas Infecções Endodônticas
A diversidade bacteriana em qualquer ambiente é subestimada quando analisada por
técnicas que utilizam meio de cultura (Munson et al. 2002, Papapanou 2002). Canais
radiculares infectados possuem um máximo de 10-12 espécies quando analisados essas
técnicas (Sundqvist 1976, Gomes et al. 2004), enquanto este nível aumenta para 42-51
espécies em estudos que utilizam métodos de biologia molecular (Siqueira et al. 2000, Brito
et al. 2007, Tavares et al 2011).
A aplicação de métodos genéticos moleculares na análise da diversidade bacteriana na
cavidade oral tem revelado um spectro bacteriano maior do que antes apreciado. De
maneira geral, mais de 700 espécies bacterianas diferentes, pertencentes a 11 divisões (ou
filos) do domínio Bacteria foram detectados na cavidade oral de humanos. Cerca de 50%
destas bactérias são conhecidas somente pela sequência genética 16S rRNA (23), Tal fato
emerge a interessante possibilidade de espécies incultiváveis e ainda não caracterizadas que
permanecem indetectáveis em estudos por métodos tradicionais de identificação. As
mesmas podem fazer parte de uma larga fração da microbiota oral que participa da etiologia
de doenças orais, incluindo doenças periapicais.
19
8. Vantagens dos Métodos Moleculares Sobre os Outros Métodos de Identificação
Microbiana
a) Detecção não somente de microorganismos cultiváveis, mas também daqueles que
são considerados incultiváveis ou fastidiosos.
b) Maior especificidade e identificação acurada de cepas microbianas com
comportamentos fenotípicos ambíguos, incluindo cepas convergentes ou divergentes.
c) Detecção de espécies microbianas diretamente das amostras clínicas, sem a
necessidade de cultivo.
d) Maior sensibilidade.
e) Maior rapidez.
f) Diagnóstico rápido, o que é particularmente uma vantagem em casos de doenças
com risco de morte ou doenças causadas por microrganismos de crescimento lento.
g) Não necessitam de controles cuidadosos durante a coleta e o transporte anaeróbio.
h) Podem ser utilizados durante tratamento antimicrobiano.
i) Quando um número grande de espécies precisa ser analisado, principalmente em
estudos epidemiológicos, as amostras podem ser guardadas e analisadas de uma só vez.
A aplicabilidade de métodos moleculares não é efetiva somente na detecção de bactérias
incultiváveis, mas também na identificação mais confiável de diversas espécies bacterianas,
particularmente aqueles que necessitam de nutrientes específicos e são consequentemente
difíceis de crescer em meios de cultura. Várias espécies bacterianas fastidiosas somente
recentemente foram reportadas em infecções endodônticas através da biologia molecular.
Dentre as mesmas se incluem Tannerella forsythia (6, 34), várias espécies Treponema s, ,
Prevotella tannerae, Filifactor alocis, Dialister pneumosintes, Haemophilus aphrophilus,
Eubacterium infirmum, e Centipeda periodontii, todos reconhecidos como patógenos
periodontais.
Existe uma plethora de métodos moleculares para o estudo de microorganismos e a escolha
por uma técnica específica depende dos objetivos do estudo (Fig. 2). A Reação de cadeia da
polimerase (PCR) seguida do seqüenciamento genético pode ser utilizada para investigar a
diversidade microbiana de um meio. A estrutura da comunidade microbiana pode ser
analisada por técnicas de impressão como a eletroforese em gel por gradiente de
20
desnaturação (DGGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento por restrição terminal
(T-RFLP). A hibridização por fluorescência in situ (FISH) pode medir a abundância de espécies
a prover informação da distribuição espacial nos tecidos. Dentre outras aplicações, os micro
e macro ensaios de hibridização DNA-DNA, PCR espécie-específica, nested PCR, Multiplex
PCR, e real- time PCR são técnicas que podem ser utilizadas para avaliar um grande número
de amostras clínicas frente a várias espécies alvo.
Figura 2 - Exemplos de técnicas moleculares utilizadas no estudo de infecções endodônticas.
A amplificação por PCR de regiões da seqüência genética 16s do rRNA conservadas, seguidas
de clonagem e seqüenciamento dos produtos do PCR, tem sido amplamente utilizada no
estudo da diversidade bacteriana em diversos tecidos humanos. Entretanto, a técnica de
clonagem é demorada e possui alto custo, sendo virtualmente impraticável para a análise de
múltiplas amostras em investigações epidemiológicas.
O Checkerboard DNA–DNA hybridization é uma técnica molecular que permite a
identificação de uma grande variedade de espécies bacterianas de várias amostras clínicas
21
utilizando apenas uma única membrana de nylon. Esta técnica tem sido utilizada com
sucesso no estudo da microbiota da saliva (Sachdeo et al. 2008), na placa supragengival
(Haffajee et al. 2008), placa subgengival (Haffajee et al. 2008, Teles et al. 2008), tecidos
moles orais (Mager et al. 2003, Sachdeo et al. 2008), dentaduras (Sachdeo et al. 2008),
implantes (Gerber et al. 2006) e infecções endodônticas (Siqueira et al. 2000, Brito et al.
2007, Sassone et al.2007, 2008, Tavares et al 2011).
O nível de detecção do Checkerboard DNA–DNA hybridization está entre 104 e 107 células
bacterianas em cada amostra. O conteúdo bacteriano das amostras presentes em infecções
endodônticas pode estar abaixo deste limite de identificação. Desta forma, uma técnica de
amplificação chamada multiple displacement amplification (MDA) pode ser utilizada para
atingir tais limites de identificação (Dean et al. 2002, Brito et al. 2007, Teles et al. 2007). O
MDA pode amplificar todo o DNA presente em amostras de biofilmes orais com o mínimo de
viés (Dean et al. 2002, Hawkins et al. 2002, Yan et al. 2004). Amostras menores que 1 ng
podem ser amplificadas de 1.000 a 10.000 vezes, fazendo com que esta técnica seja utilizada
com efetividade quando associada ao Checkerboard DNA–DNA hybridization em infecções
endodônticas (Brito et al. 2007, Teles et al. 2007, Tavares et al 2011).
22
9. Infecções Endodônticas Primárias
Siqueira et al 2000 avaliou a microbiota de infecções endodônticas primárias utilizando a
técnica do checkerboard DNA-DNA hybridization para 42 espécies bacterianas. As amostras
foram coletadas de 26 dentes unirradiculares com lesões periapicais assintomáticas. O
número de espécies encontradas por canal variou de 1 a 17 (média 4,7). As espécies mais
prevalentes encontradas foram: T. forsythia (42% dos casos), Haemophilus aphrophilus
(19%), Porphyromonas gingivalis (19%), Corynebacterium matruchotii (15%), Treponema
denticola (15%), Capnocytophaga gingivalis (12%), e Streptococcus intermedius (12%). As
bactérias do “complexo vermelho” (T. forsythia, P. gingivalis, and T.denticola), que são
frequentemente associadas a doenças periodontais severas, foram encontradas em dois
casos.
Da Silva et al. (24) através do checkerboard, avaliaram a presença de 40 espécies bacterianas
em canais de 30 dentes com lesões periapicais assintomáticas. Trinta e cinco espécies foram
detectadas ao todo, com um número de espécies por canal variando de 5 a 31. As mesmas
amostras foram analisadas por meio de cultura, onde 42 microorganismos foram
encontrados ao todo. O número de espécies encontradas por canal através do meio de
cultura variou de 0 a 6. T. forsythia, Campylobacter showae, Fusobacterium naviforme, e
Actinobacillus actinomycetemcomitans estiveram presentes em mais de 90% dos canais.
Outros microorganismos periodontopatogênicos como P. gingivalis (60%), Campylobacter
rectus (80%), Prevotella intermedia (50%), Selenomonas noxia (60%), Peptostreptococcus
micros (70%), Treponema socranskii (70%), e T. denticola (40%) também foram encontrados.
Os microorganismos pertencentes ao “complexo vermelho” estiveram presentes em 40%
dos canais. O P. endodontalis foi detectado em 30% dos canais.
Siqueira et al 2001 avaliou, pela técnica do Checkerboard, espécies bacterianas presentes
em abscessos de origem endodôntica. O número de espécies encontradas variou de 1 a 33
(média 5,9). As espécies mais prevalentes foram: T. forsythia (30% dos casos); P. gingivalis
(30%); Streptococcus constellatus (26%), P. intermedia (22%), Prevotella nigrescens (22%),
Fusobacterium periodonticum (19%), Fusobacterium nucleatum ss nucleatum (19%),
23
Eikenella corrodens (19%), P. endodontalis (15%), Actinomyces gerencseriae (15%), e
Neisseria mucosa (15%).
Através da associação das técnicas do MDA e Checkerboard, Brito et al 2007 avaliou a
microbiota de 66 amostras de dentes com infecção endodôntica. Amostras não amplificadas
e amplificadas pelo MDA foram analisadas pela técnica do Checkerboard. As espécies mais
comumente encontradas em níveis >104 foram Prevotella tannerae e Acinetobacter
baumannii em frequências entre 89-100%. O número médio de espécies encontrados por
dente em níveis >104 foi 51,2 em amostras amplificadas, enquanto em amostras não
amplificadas o número médio foi 14,5. (Figura 3)
24
Figura 3 - Gráfico bilateral da contagem média (105) das 77 espécies em amostras não
amplificadas (n=46) e amplificadas (n=66).
25
10. Infecções Endodônticas em Dentes Decíduos
Vários estudos avaliaram a microbiota associada a infecções endodônticas em adultos
(Sundqvist 1976, Baumgartner & Falkler 1991, Siqueira et al. 2000, Lana et al. 2001, Rolph et
al. 2001, Munson et al. 2002, de Souza et al. 2005, Brito et al. 2007, Sassone et al. 2007,
2008). Entretanto, poucos estudos se propuseram a avaliar a microbiota endodôntica em
dentes decíduos. Recentemente, Tavares et al 2011 avaliaram, através do MDA e do
Checkerboard, a presença de 83 espécies bacterianas em infecções de dentes primários.
Foram avaliados 32 dentes apresentando necrose pulpar. O número médio de espécies
encontradas por dente em contagem >194 foi 19.
Aggregatibacter (Haemophilus)
aphrophilus e Helicobacter pylori não foram detectados em nenhuma das amostras. A figura
4 demonstra a porcentagem média das 81 espécies encontradas.
A espécies mais prevalentes foram Prevotella intermedia, encontradas em 96.9% das
amostras, seguida pela Neisseria mucosa (65.2%), Prevotella nigrescens (56.2%), Tannerella
forsythia (56.2%), Prevotella denticola (53.1%) e Fusobacterium nucleatum ss vincentii
(50.0%). As espécies menos prevalentes foram Enterococcus faecalis (3.2%) e Eikenella
corrodens (3.1%).
26
Figura 4 - Prevalência de espécies encontradas em infecções endodônticas de dentes
decíduos.
27
11. Infecções Refratárias ao Tratamento Endodôntico
Estudos que investigam microorganismos remanescentes em canais pós preparo mecânicoquímico e medicação intracanal podem identificar aqueles microorganismos que tem o
poder de influenciar o prognóstico do tratamento, participando assim da etiologia de
infecções refratárias.
Mesmo quando o tratamento não é bem sucedido na remoção por completo da infecção, a
maioria dos microorganismos são eliminados e o meio sofre um desequilíbrio. Para que
microorganismos sobrevivam, os mesmos devem resistir aos procedimentos de desinfecção
do canal e rapidamente se adaptarem ao novo ambiente com características completamente
modificadas pelo tratamento endodôntico. Bactérias encontradas em amostras póstratamento endodôntico são remanescentes de uma infecção inicial, tendo resistido aos
efeitos dos instrumentos, irrigantes, e da medicação intracanal. As mesmas ainda podem ter
sido introduzidas nos canais por quebra da cadeia asséptica por parte do operador ou por
infiltração da restauração temporária. Microorganismos encontrados em amostras pósobturação são altamente adaptados ao novo ambiente em que se encontram.
Infecções persistentes podem ser responsáveis por problemas clínicos como exsudação
persistente, sintomatologia dolorosa, exacerbações entre consultas, e persistência de lesão
mesmo após o tratamento.
Estudos através de meios de cultura observaram que tais infecções eram associadas a uma
ou duas espécies. Bactérias Gram-positivas facultativas, particularmente Enterococcus
faecalis, são as predominantes. Fungos também foram encontrados em frequências
relativamente altas quando comparados às infecções primárias.
Poucos estudos utilizaram a biologia molecular na identificação de microorganismos
em lesões refratárias ao tratamento endodôntico. Através do uso do PCR, Rolph et al.
observaram que cinco casos de insucesso produziram clones relacionados aos gêneros
Capnocytophaga,
Mogibacterium,
Cytophaga,
Dialister,
Peptostreptococcus,
Eubacterium,
Prevotella,
Fusobacterium,
Propionibacterium,
Gemella,
Selenomonas,
Solobacterium, Streptococcus, e Veillonella e dois clones representando bactérias
incultiváveis. Várias espécies microbianas foram encontradas em casos de insucesso pela
28
técnica do PCR, além de confirmar o E. faecalis como a espécie mais encontrada. Tal espécie
foi encontrada em 77% dos casos . Quatro espécies anaeróbias fastidiosas —P. alactolyticus,
P. propionicum, F. alocis e D. pneumosintes—estiveram presentes em pelo menos metade
dos casos.Todas as amostras possuíam pelo menos uma das seguintes espécies grampositivas; E. faecalis, P. alactolyticus, eP. Propionicum .A Candida albicans foi encontrada em
9% dos casos. O número médio de espécies encontrados em casos bem obturados foi 3
(variação de 1 a 5), enquanto que os casos com obturação deficiente possuíam em média
cinco espécies (variando de 2 a 11).
Em outro trabalho, Roças et al. avaliou através de PCR a ocorrência de nove patógenos em
canais obturados associados com lesão perirradicular em pacientes Sul-Coreanos. Quatorze
canais
obturados
com
presença
de
lesão
perirradicular
foram
selecionados.
Microorganismos estiveram presentes em todos os casos como revelado pela amplificação
genômica. Os microorganismos mais encontrados foram E. faecalis (64%), seguidos pelo
Streptococcus spp. (21%) e T. forsythia (14%).
29
12. Conclusões
A sobrevivência de microorganismos em canais radiculares após o tratamento é baseada na
capacidade individual de certas células em se adaptarem ao meio como um consórcio. O
estudo de mecanismos adaptativos usados por microorganismos para sobreviver em meios
inóspitos, com limitação de nutrientes associado ao efeito antibacteriano de medicamentos,
é importante para o nosso entendimento sobre infecções endodônticas persistentes. A
habilidade de organismos em tais infecções de formar biofilmes pode ser vista como o
mecanismo de adaptação mais importante utilizado por bactérias para sobreviver às
mudanças ambientais causadas pelos protocolos de tratamento. Sendo assim, uma vez que
todos os microorganismos orais são capazes de formar biofilmes, e que essas comunidades
superfície-associadas existem em canais radiculares, é possível aplicar o conceito de biofilme
ao tratamento clínico; ou seja, esforços não devem ser direcionados especificamente para
organismos individuais, mas para um grupo de microorganismos bem adaptados que
certamente possuem resistência a uma variedade de agentes antimicrobianos.
Indubitavelmente, o uso bem direcionado dos métodos de biologia molecular irão gerar
informações adicionais valiosas na identificação e entendimento dos fatores causais
associados a doenças periapicais. O conhecimento sobre as infecções endodônticas passou a
ficar mais acurado após a introdução da biologia molecular, uma vez que as mesmas
trouxeram maior sensibilidade e especificidade aos exames. Em adição, os métodos
moleculares tem o potencial de gerar diagnósticos mais rápidos e direcionar terapias
antimicrobianas como uma realidade. Sendo assim, o futuro reserva vários desafios,
enquanto o conhecimento tem o potencial de gerar novas estratégias para que sejam
atingidos índices mais altos de sucesso na terapia endodôntica.
30
13. Referências Bibliográficas
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