ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO METANOLICO de Thuya

ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO METANOLICO de Thuya occidentalis
Geyse do Carmo Diniz SAMPAIO1(PG) – [email protected]
Luziane da Cunha BORGES2(IC) (Bolsista PIBIC/CNPq)
Wannigleice de Sousa AMORIM2(IC) (Bolsista PIBIC/CNPq).
Milton Nascimento da SILVA3(PQ) (Orientador)
1 – Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Pós-graduação em Química.
2 – Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Curso de Química Industrial.
3 – Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Pesquisador-CNPq/UFPA.
RESUMO: Thuja occidentalis (Cupressaceae), é usada principalmente como fitoterápico, na forma de
capsulas, tintura ou diluição; baseando-se em evidências fitoterápicas para infecções agudas e crônicas do
trato respiratório superior, e como um adjuvante para antibióticos em grave infeções bacterianas, tais como
bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. Por tanto se faz necessária a investigação química da
planta para determinar, que ou quais compostos lhe confere estas bioatividades, assim foi possível obter a
partir do extrato etanólico da espécie substancias da classe dos flavonóides; estes pertencem a uma classe de
compostos naturais de considerável interesse científico e terapêutico.
Palavras-chaves: Thuya occidentalis, flavonoides, CLAE.
Área: Química
Sub-área: Química Orgânica
Área temática: PRODUTOS NATURAIS (PNAT)
1. INTRUDUÇÃO
Thuya occidentalis é uma planta da família das Cupressaceae, também conhecida como
pinheiro de cemitério, árvore-da-vida, cedrinho, ciprestes, tuia americana. Trata-se de árvore
frondosa, de ramos folhosos mais ou menos horizontais e com copa no formato de pirâmide. Seu
crescimento é lento e pode atingir até 20 metros de altura. Os ameríndios usavam a tuia para
problemas como dores de cabeça, febre e reumatismo e queimavam-na para "limpar" o ar.
Atualmente, ela é usada principalmente como fitoterápico, na forma de capsulas, tintura ou diluição.
Em combinação com outras plantas imunomoduladores; esta planta medicinal também é usada
como baseada em evidências fitoterapia para infecções agudas e crônicas do trato respiratório
superior, e como um principio ativo para antibióticos em grave infeções bacterianas, tais como
bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. A tuia é sobre tudo usada em verrugas, embora
698
seja útil em outros problemas infecciosos, especialmente na sinusite, abcessos nos dentes,
bronquite, cistite e infecções fúngicas (NASER, 2005).
Várias propriedades terapêuticas dos flavonóides, principalmente da quercetina, têm sido
estudadas nas últimas décadas, destacando-se o potencial antioxidante, anticarcinogênico e seus
efeitos protetores aos sistemas renal, cardiovascular e hepático, e sobre a quercetina, se destacam
suas fontes dietéticas, consumo alimentar, metabolismo, biodisponibilidade e efeitos benéficos à
saúde (BEHLING, 2004).
2. OBJETIVOS
Investigar a composição química das partes aéreas de Thuya occidentalis; e desenvolver,
tratamento de amostra e métodos cromatográficos via CLAE semi-preparativo que sejam eficientes
para obtenção das substancias puras, em menor espaço de tempo e com menor custo. Caracterizar as
estruturas químicas isoladas por técnica espectrométrica de Ressonância Magnética Nuclear;
desenvolver a valorização da espécie quanto a sua composição química.
3. METODOLOGIAS
Procedimentos gerais
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono-13, homo e
heteronuclear, foram obtidos em espectrômetros Mercury Plus NMR, operando em 75 MHz para o
13
C e 300 MHz para o 1H. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência analítico, da marca Shimadzu,
constituído por uma bomba solenóide com quatro canais modelo LC-20AT, detector de arranjo de
diodo modelo SPD-M20A, degaseificador de membrana modelo DGU-20As, auto-injetor de
amostras modelo SIL-20A, interface de comunicação modelo CBM-20A acoplado a
microcomputador Pentium IV com software de integração LCsolution. Cromatógrafo Líquido de
Alta Eficiência semi-preparativo, da Shimadzu, composto por duas bombas, modelo LC-6 AD,
degaseificador de membrana DGU-20A- SR, detector com duplo canal de absorbância na região do
ultravioleta e do visível, modelo SPD-10AV, operando com comprimento de onda 254 nm, injetor
de amostras Rheodyne 7752, com alça de amostragem de 200 e 500 μL. Interface de comunicação
CBM-20A, acoplado a um microcomputador com software de integração LC solution versão
1.25SP1.
699
Material vegetal
O material botânico foi coletado no dia 13 de julho de 2011 ás 11 horas em Itajai Santa
Catarina; a identificação botânica foi feita por comparação com exsicata, do herbário virtual
REFLORA. A amostra foi submetida ao processo de secagem em estufa a 40ºC durante seis dias
para retirada de umidade, obtendo-se assim 200g de material seco e triturado.
Extração e isolamento dos constituintes químicos
Testes de extração foram realizados e analisados demostrando que o material sendo
submetido a extração primeiramente com o solvente orgânico pouco polar para este retirar as
gorduras e clorofila presente na planta, tornando o material em condições favoráveis para ser
tratado em CLAE. Após esta limpeza do material, para obtenção dos constituintes químicos este
passou por duas extrações por maceração com 1 litro de metanol grau PA, em um tempo fixo de 2
dias x 24 horas, seguido de filtração simples, seguido de filtração e evaporação em evaporador
rotativo, mantendo a temperatura do banho-maria em 45° C, obtendo-se 32,45g de extrato
metanólico.
Uma alíquota de 1 mg do extrato foi injetada em CLAE em modo gradiente com fase móvel
composta por solvente A = H2O e B = ACN, variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico, no
tempo de 60 minutos. A vazão da fase móvel foi de 1 mL/minuto, Como fase estacionária, utilizouse uma coluna analítica Gemini C18 (150 x 4,6 mmDI), com partículas de 5 μm, dotada de précoluna e detector de absorbância na região do ultra-violeta operando em 200 a 400 nm. Pela
estimativa do % do solvente B para eluição isocrática, baseada no tempo de retenção da última
banda trz do gradiente inicial (CASS, 2011); Considerando o estudo de SNYDER e colaboradores
(1997), é possível propor valores desejáveis para o fator de retenção k (k=5; k=10; k=20), com base
nos tempos de retenção da última banda. O tempo de retenção da última banda para o extrato
metanólico de T. occidentalis foi próximo a 25 minutos. Com isso, foi calculado um valor teórico
baseado nos estudos de SNYDER. Para se estimar um valor de percentual do modificador orgânico,
optou-se por uma separação com k=20 e foi sugerido um sistema isocrático. O sistema escolhido
para iniciar as analises foi H2O/ACN 70:30; o cromatograma não demostrou boa seletividade para
os componentes da amostra, se fez necessário enfraquecer o modificador orgânico em percentual de
cinco, dez, quinze; porém o aumento no principio da hidrofobicidade que confere a separação em
CLAE foi inversamente proporcional a resolução do cromatograma. Mediante as analises foi
possível perceber que picos correspondentes aos compostos majoritários estavam demonstrando um
alargamento na banda, o que é indicativo de substancias que conforme a eluição com a fase móvel
transformam-se na sua forma ionizada. Por tanto os solventes foram levemente acidificados com
700
ácido fórmico à 0,1 %, tornando assim o sistema de fase móvel constituído por H2O/ACN/ácido
fórmico 69:29:2. Este demonstrou-se eficiente para separação dos constituintes; entretanto, houve a
necessidade de ajustar o modificador orgânico para otimizar o método de isolamento. O sistema
H2O/ACN/ácido fórmico 79:19:2 foi o mais satisfatório para o isolamento da S1, S2 e S3. O
resultado pode ser observado no cromatograma.
S2
S1
S3
Cromatograma no modo de eluição isocrático do extrato metanólico. Fase móvel H2O/ACN/ácido fórmico
79:19:2 e vazão de 1 mL/min. Detecção de UV, λ = 235 nm, λ = 280 nm e λ = 320 nm.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
No estudo fitoquímico das partes aéreas de T. occidentalis foi desenvolvido o método de
pré-tratamento de amostra que simplificou o isolamento via CLAE, de uma substância (S2),
pertencente a classe dos flavonóides. A S1 foi obtida em mistura, e de S3 obteve-se pouca massa, o
que torna inviável a analise em equipamento de RMN, porém o espectro de hidrogênio das
substancias demostraram valores de deslocamentos químicos característico de flavonóides. A
determinação estrutural da substância S2, quercetina-3-raminosídio foi realizado com base na
análise dos dados espectrométricos de RMN de 1H,
13
C e por comparação com informações
encontradas na literatura.
701
OH
O
HO
OH
O
O
OH
O
HO
OH
OH
Estrutura química do composto isolado.
Dados de RMN de 13C
C
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
4’
5’
6’
1’’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’
1
157,5
136,8
178,5
164,4
99,9
165,7
93,0
161,0
105,4
121,5
116,9
145,6
145,6
115,3
121,5
102,4
71,1
71,6
72,9
72,1
17,4
2
158,4
136,2
179,6
163,1
99,8
165,8
94,7
159,2
105,8
122,9
116,9
146,3
149,7
116,3
122,8
103,5
71,8
72,1
73,2
72,0
17,6
1- Dados obtidos experimentalmente em DMSO.
2- Dados da literatura em CD3OD (ALBUQUERQUE, 2014)
702
5. CONCLUSÃO
Os flavonóides têm recebido muita atenção nos últimos anos devido aos vários efeitos
benéficos observados. Por causa do efeito antioxidante, eles tornaram-se importantes compostos
dietéticos com promissor potencial terapêutico. Relatos e evidências epidemiológicas sugerem que
dietas ricas em flavonóides, como a quercetina, têm efeitos na prevenção e no tratamento de
doenças cardiovasculares, câncer e insuficiências renal e hepática. Neste trabalho foi possível isolar
e caracterizar tal composto, realizando o estudo fitoquímico do extrato metanólico das partes aéreas
de Thuya occidentalis, com os desenvolvimentos de métodos: de pré-tratamento de amostra e
cromatográficos via CLAE, foram fundamentais para obtenção da substância purificada com menos
gastos e em menor tempo; quercetina 3-ramnosídeo, segundo a literatura. A qual foi identificada por
análise de dados espectroscópicos de RMN e por comparação com dados da literatura.
6. AGRADECIMENTOS
Os autores deste trabalho agradecem, ao Laboratório de Cromatografia Líquida (UFPA) pela
infra-estrutura que possibilitou a execução deste trabalho.
7. REFERENCIAS
Albuquerque, C. H.; Tavares, J. F.; Oliveira, S. L.; Silva, T. S.; Gonçalves, G. F.; Costa, V. C. O.;
Agra, M. F.; Pessôa, H. L. F.; Silva, M. S. FLAVONOIDES GLICOSILADOS DE Erythroxylum
pulchrum A. St.-Hil. (Erythroxylaceae). Quim. Nova, Vol. 37, No. 4, 663-666, 2014
BEHLING, E. B.; SENDÃO, M. C.; FRANCESCATO, H. D. C.; ANTUNES, L. M. G.; BIANCHI,
M. L. P. FLAVONÓIDE QUERCETINA: ASPECTOS GERAIS E AÇÕES BIOLÓGICAS.
Alim. Nutr., v. 15, n. 3, p. 285-292, 2004
CASS; Q. B.; DEGANI, A.L.G. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS POR HPLC.
FUNDAMENTOS, E ESTRATÉGIAS E VALIDAÇÃO, 1ª Ed. da UFSCar. Série
Apontamentos, São Carlos, 77 págs., 2001.
http://reflora.jbrj.gov.br/jabot/PrincipalUC/PrincipalUC.do;jsessionid=D08FF1634EE267DD9ACE
AD33C51703A3
703
Naser, B.; Bodinet, C.; Tegtmeier, M.; Lindequist, U. THUJA OCCIDENTALIS: A REVIEW OF
ITS PHARMACEUTICAL, PHARMACOLOGICAL AND CLINICAL PROPERTIES.
eCAM ;2(1)69–78- 2005.
SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. PRACTICAL HPLC METHOD
DEVELOPMENT. 2ª Ed. John Wiley & Sons. New York, 765 pp., 1997.
704