Blut und Blutgerinnung

Blut
und
Blutgerinnung
Teil 4
1
INHALT
(I)
Bestandteile und Funktionen des Blutes
(II)
Blutgerinnung und Fibrinolyse
(III) Regulation der Blutgerinnung
(IV)
Wechselwirkung von Gerinnung und Entzündung
(V)
Antikoagulation und Methoden der Blutreinigung
2
Spezifische Inhalte, Vorlesung Einheit 4
- Gerinnungstests
- Gerinnung und Entzündung
Komplementsystem, SIRS und Sepsis,
- Plasmaprodukte & Transfusionsmedizin
Blutspende, Blutprodukte, Apherese
- Methoden der Blutreinigung
Prinzipien der Hämodialyse und der therapeutischen
Apherese
3
Gerinnungstests
4
aPTT
QUICK
5
Globale Tests
• Quick-Test (nach Armand James Quick)
-> misst das extrinsische System der Blutgerinnung
Synonym: Thromboplastinzeit, Prothrombinzeit
• Partielle Thromboplastinzeit (PTT)
-> misst das intrinsische System
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Blutabnahmesystem
(Vacuette)
Glasröhrchen mit Schraubdeckel (Septum), Vakuum,
Farbcodierung je nach Verwendung bzw. je nach Antikoagulation
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VACUETTE® Serum Tubes
Serum tubes are coated with silica particles, which activate clotting when tubes are gently inverted.
Serum tubes with gel contain a barrier gel that is present in the bottom of the tube. The specific
gravity of this material lies between the blood clot and the serum. During centrifugation the barrier
gel moves upward to the serum - clot interface, where it forms a stable barrier separating the serum
from fibrin and cells. Serum may be aspirated directly from the collection tube, eliminating the need
for transfer to another container. This barrier allows for the stability of certain parameters in the
primary tube under the recommended storage conditions for up to 48 hours.
Serum tubes with beads contain polystyrene beads, which are present in the bottom of the tube. The
specific gravity of the beads lies between that of the blood clot and serum. During centrifugation the
beads move upwards to form a layer between the serum and blood clot.
8
VACUETTE® Coagulation Tubes
Coagulation tubes are filled with
buffered tri-sodium citrate solution.
Citrate concentration of 0.109 mol/l
(3.2%) is available. The choice of the
concentration depends upon the
policies of the laboratories. The mixing
ratio is 1 part citrate to 9 parts blood.
VACUETTE® Heparin tubes
The interior of the tube wall is coated with lithium heparin, ammonium heparin
or sodium heparin.
The anticoagulant heparin activates antithrombins, thus blocking the coagulation cascade
and producing a whole blood / plasma sample instead of clotted blood plus serum.
Plasma tubes with lithium heparin and gel contain a barrier gel in the tube.
The specific gravity of this material lies between that of the blood cells and plasma.
During centrifugation the gel barrier moves upwards providing a stable barrier separating
the plasma from cells. Plasma may be aspirated directly from the collection tube,
eliminating the need for manual transfer to another container. This barrier allows for the
stability of certain parameters in the primary tube under the recommended storage conditions
for up to 48 hours.
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Quick-Test
Durchführung:
• Blutabnahme in Citratröhrchen
• Zentrifugation-> Citratplasma
• Zusatz von Ca++ im Überschuss und Tissue
factor (=Gewebsthromboplastin)
• Zeit bis zum Auftreten von Fibrinbildung wird
gemessen
• normal: 11 – 16 sec
• Problem der Standardisierbarkeit
(unterschiedliche Gewebsthromboplastin-Präparate;
Testergebnisse der Labors untereinander oft schwer
vergleichbar)
10
Quick-Test
Angaben (Maßeinheiten):
- Zeit (sec)
normal 10-16 sec
- Quick(%) Gerinnungsaktivität
normal 70-120%
- Prothrombinzeit-Ratio
= Quick (Patientenplasma)/Quick
(Normalplasmapool)
mit Referenzthromboplastin
11
Quick-Test
Verminderter Quick-Wert durch:
- Mangel an Faktoren II, VII, X, (I, V)
- Mangel an Gerinnungsfaktoren allgemein
(Synthesestörung, z.B. Lebererkrankung)
- Cumarintherapie (hemmt Synthese der
Gerinnungsfaktoren)
12
13
aPTT
Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
• Erfasst das intrinsische System (VIII, IX, X, XI,
XII)
• Zur Überwachung der Therapie mit UFH verwendet
• Suchtest für Hämophilie, Faktor V-Leiden
14
aPTT
Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
• Citratplasma
• Zusatz von „partiellem Thromboplastin“ =
proteinfreier Phospholipidextrakt, sowie einer
oberflächenaktiven Substanz (Kaolin) und Ca++
• Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen
• Normalwert unter 38 sec
15
16
Gerinnung und Entzündung
17
Das Komplementsystem
Teil der angeborenen Immunabwehr
Funktionen:
Infektionsabwehr
Brücke zw. angeborener und erworbener Immunität
Clearance von Immunkomplexen und apoptotischen Zellen
besteht aus ca. 30 Proteinen im Plasma und auf Zelloberflächen
Aktivierung erfolgt durch 3 Wege (klassisch, alternativ, Lektin)
- wird durch die gleichen Stimuli aktiviert, die auch Entzündung
auslösen (z.B. Bakterien: PAMPS, pathogen associated molecular
patterns)
18
Markiewski et al. 2007
19
Aktivierung des Komplementsystems
• Klassischer Weg: C1q an Immunkomplexe
• Lektinweg: mannose binding lectin an
Glykanstrukturen auf OF von Bakterien
• Alternativer Weg: spontane Hydrolyse von C3
• zentral: Bildung von C3a und C5a
• „Anaphylatoxine“ -> Vermittler von
Entzündungsreaktionen
• terminaler Komplex: C5b-9 „membrane attack
complex“ : induziert Lyse von Zellen
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Terminaler Komplementkomplex
„membrane attack complex“ C5b-9
-> Porenbildung, Einstrom von Na+ und Wasser,
Platzen der Zelle
21
Gerinnung und Komplementsystem
• Zahlreiche Verbindungen zwischen den beiden
Systemen; Aktivierung erfolgt meist gleichzeitig
Das ist physiologisch sinnvoll!
-> z.B. lokale Thrombusbildung im Gefäßsystem:
verhindert Ausbreitung von Bakterien (-> manche
Bakterienstämme scheiden fibrinolytische Faktoren
aus)
• Sowohl Gerinnungs- als auch Komplementsystem sollen
lokal wirken; Ausbreitung der Wirkung auf den
gesamten Organismus (in Folge gestörter
Regulationsmechanismen) hat schwerwiegende Folgen
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Gerinnung und Komplementsystem
• Gemeinsame Stimuli (z. B. Verletzung, Bakterien)
• Aktivierung in ähnlichen pathophysiologischen
Situationen
• Direkte Interaktionen zwischen Komponenten der
beiden Systeme
• Beide laufen kaskadenartig ab, Aktivierung von
inaktive Proenzymen durch aktive Proteasen
„upstream“
• Haben sich phylogenetisch aus einem gemeinsamen
Vorläufersystem entwickelt
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Pro-koagulatorische Eigenschaften des
Komplementsystems
• Operationen, Trauma, schwere Infektionen ->
erhöhte Aktivierung der Gerinnung
• Thrombotische Komplikationen sind oft
schwerwiegender als die Grundkrankheit
selbst
• viele der Mediatoren, die als Reaktion auf
Infektion gebildet werden, haben prokoagulatorische Wirkung
• Komplementsystem wirkt auf mehreren
Ebenen pro-koagulatorisch
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Pro-koagulatorische Eigenschaften des
Komplementsystems
(i)
Modifikation von Phospholipidmembranen von Zellen
(vgl. Oberflächen für den Ablauf der Gerinnung!)
(ii) Aktivierung von Plättchen (-> Aggregation u. Adhäsion)
(iii)
(iv)
Induktion der Expression von Tissue factor auf verschiedenen
Zelltypen (Neutrophile, Monozyten, Endothel)
Induktion der Expression von PAI auf basophilen Granulozyten
und Mastzellen (Inhibition der Fibrinolyse; normalerweise
produzieren Mastzellen t-PA: switch des Phänotyps)
(v)
(vi)
C5a induziert shedding von Heparansulfat von der
Endotheloberfläche
C4-binding Protein: Protein der Komplementkaskade, kann
Protein S binden (dadurch wird Protein S inaktiviert-> Protein C
ebenso -> Abbau von FVa und VIIIa wird unterbunden)
25
Markiewski et al. 2007
26
Gerinnung – Entzündung
• Proinflammatorische Zytokine -> Aktivierung
der Gerinnung
• TNF:
blockt TFPI, APC, AT (also alle
Antikoagulantien)
aktiviert PAI (inhibiert Fibrinolyse)
-> Entzündung aktiviert Gerinnung
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PARs
Protease activated receptors
• Proteasen des Gerinnungssystems
interagieren mit PARs
• PARs = Transmembranproteine auf Monozyten
und Endothelzellen
• Spaltung der PARs durch aktivierte Protease
legt neuen N-Terminus in PAR frei ->
autokatalytische Aktivierung
28
• Thrombin wirkt v.a. über PAR-1
• Signalweiterleitung im Zellinneren -> verstärkte
Sekretion von Zytokinen
(IL-6, IL-8, Expression von Adhäsionsmolekülen)
-> Gerinnung aktiviert Entzündung
29
Gerinnung
Entzündung
30
SIRS
Systemic inflammatory response syndrome
mindestens 2 der folgenden Kriterien:
Temperatur > 38 °C oder < 36 °C
Tachykardie (> 90 Schläge/min)
Respirationsrate > 20 min
WBC >12000/µL oder < 4000/µL
31
SIRS
-> Sepsis -> Multiorganversagen
Hauptursache von Todesfällen in Intensivmedizin
ca. 350.000 Todesfälle/Jahr in den USA
Zentrale Rolle von Komplement und Gerinnung
Aktivierung von Blutzellen (Monozyten) durch PAMPS (Bindung an Toll-like
Rezeptoren) -> Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine, Aktivierung von
Endothelzellen
Verlust der Barrierefunktion des Endothels
Aktivierung des Komplementsystems (durch Bakterien)->
C5a -> Upregulation von Tissue factor-Expression auf Monozyten ->
Gerinnungsaktivierung
Gegenseitiges „Aufschaukeln“ der beiden Kaskaden
32
Sepsis
• Steigende Häufigkeit trotz (oder wegen ??)
Fortschritten in der Intensivmedizin
33
Plasmaprodukte und Transfusionsmedizin
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Bluttransfusion
Zuführen von Blut oder Blutbestandteilen (als intravenöse Infusion)
- Fremdblutspende
- Eigenblutspende (Autotransfusion)
Vollbluttransfusionen heute nur mehr selten durchgeführt; Blut
wird in Komponenten aufgetrennt und komponentenweise
transfundiert
Vorteile:
a) Patient erhält nur die tatsächlich benötigten Blutbestandteile
(Plasma bei Faktorenmangel, Erythrozyten bei Anämie,...)
b) Bessere Lagerfähigkeit (Plättchen und Erythrozyten bei
mindestens 4 °C, Plasmaproteine eingefroren)
35
Gewinnung von Blutprodukten aus
a) Vollblut (Pool vieler Blutspenden)
b) Apherese (kontinuierlicher Prozess)
36
Transfundiert werden:
•
•
•
•
•
•
•
Erythrozyten-Konzentrate (bei Anämie)
Granulozyten-Konzentrate (bei Granulozytopenie)
Thrombozyten-Konzentrate (bei Thrombozytopenie)
Plasma (FFP, fresh frozen plasma)
Stammzell-Präparate
Gerinnungsfaktor-Konzentrate
Immunoglobuline
37
Erythrozytenkonzentrat
38
Thrombozytenkonzentrat
39
Indikationen
• Blutersatz nach Unfall/Operation
• Blutkrankheiten (Anämien; ab Hb von 6g/dL)
normal: 14-18 bzw. 12-16 g/dL
• Mangel od. Funktionsstörungen von
- Thrombozyten
- Plasma
- Gerinnungsfaktoren
40
Risken
• Übertragung von Bakterien oder Viren
(Hepatitis B & C, HIV)
HIV, HC -> Antikörpertests
(ELISA od. Western Blot gegen virale Proteine)
„diagnostisches Fenster“: Antikörper sind im Blut
erst mehrere Wochen nach der Infektion
nachweisbar
-> Einführung von molekularbiologischen Testmethoden
(RT-PCR)
41
RT-PCR
- es werden direkt die viralen Nukleinsäuren
nachgewiesen
- 1. Schritt: virale RNA wird durch Reverse
Transkriptase in DNA umgeschrieben
- DNA wird durch Polymerasekettenreaktion
vervielfältigt
42
Kompatibilität/AB0 System
Universalspender für Erythrozyten: 0
Universalempfänger für Erys: AB
Universalspender für Plasma: AB
Universalempfänger für Plasma: 0
43
Transfusionszwischenfälle
Verwechslung von Blutkonserven -> hämolytische
Transfusionsreaktion, Zerstörung der Erythrozyten
bei Transfusion von AB0-inkompatiblem Blut
- Bedside-Test vor Transfusion daher Vorschrift
-> Restrisiko heute 1:1 Mio
44
Leukozytendepletion
= Entfernung von Leukozyten aus Blutpräparaten vor der
Transfusion
Leukozytengehalt < 106/Konserve (Paul Ehrlich-Institut, Dtl.)
Gründe:
1) Zellständige Viren (z.B. CMV) werden damit ausgeschaltet
2) Graft-versus-host-disease wird vermieden: Immunzellen des
Spenders erkennen Körperzellen des Spenders als fremd und
greifen diese an
Leukozytenabreicherung wird vor der Lagerung durchgeführt
(Filtration oder Zentrifugation)
45
Blutprodukte
•
•
•
•
•
Plasma
Erythrozytenkonzentrat
Plättchenkonzentrat
Konzentrate von Gerinnungsfaktoren
Proteine (z.B. HSA)
46
Plasma
Fresh frozen plasma:
laut Definition innerhalb von 8 h eingefroren; Realität: < 24 h
(dadurch Reduktion von FV und VIII um ca. 15%)
Verwendung:
- Ersatz für spezifische Gerinnungsfaktoren
- Gegenmittel von Warfarin
- Behandlung von Blutungen bei Lebererkrankungen
- Behandlung von DIC
- Plasmaaustausch bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen
47
Plättchenkonzentrate
• Gewinnung durch Zentrifugation von Vollblut (gepooltes
Spenderblut) oder durch Apherese (kontinuierliche
Aufarbeitung großer Blutvolumina)
• 50 mL Konzentrat -> ca. 5,5 x 1010 Plättchen
• Cryopreservation oder Lyophilisation (Plättchen als
Lipidoberflächen), ansonsten Lagerung bei 22 °C, max. 5 d
• Anwendung:
Therapie von Thrombozytopenie
(verschiedene Ursachen: Autoimmunerkrankung -> erhöhte
Zerstörung der Plättchen durch Autoantikörper; DIC;
induziert durch bestimmte Medikamente)
48
Erythrozytenkonzentrate
• aus Frischblut durch Entfernung von Plasma gewonnen
• Hämatokrit ca. 75%
• Lagerung: 42 d bei 4 °C
49
Plasmaderivate
-Plasma als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Gerinnungsfaktoren
- FVII, FVIII, FIX werden heute rekombinant hergestellt
- Gefahr der Krankheitsübertragung durch Verwendung
von gepooltem Plasma -> PCR-Testung
- Reinigung der Einzelfaktoren durch verschiedene Präzipitationsund Chromatographieschritte
-seit 1970ern Lyophilisierung der Produkte (Vorteil: keine Kühllagerung
erforderlich
50
Plasmafraktionierung
- FFP wird gepoolt und langsam aufgetaut
- Kryopräzipitat durch Zentrifugieren entfernt
(enthält FVIII, vWF, Fibrinogen)
- -> Reinigung dieser Proteine durch weitere Fäll- und
Chromatographieschritte
- aus dem Überstand -> FII, VII, IX, X mittels DEAEAdsorption gewonnen
- weitere Proteine durch Fraktionierung nach Cohn
51
Fraktionierung nach Cohn
52
53
Fraktionierung nach Cohn
• Plasma (ohne Kryopräzipitat) wird Ethanol in
steigender Konzentration zugesetzt, Temperatur wird
abgesenkt
• 8% Ethanol -> Faktor XIII
• aus Überstand: Antithrombin durch Adsorption an
Heparin gewonnen
• 20-25% Ethanol -> IgG
• 40-42% Ethanol -> Albumin
54
Inaktivierung von Viren
- Entwickelt seit den frühen 1980er Jahren (HIV !)
-trockene Hitze (68 °C, 32-72 h)
-feuchte Hitze (60 °C, 10 h)
-Detergentien (zerstört Lipidhülle von Viren)
55
Apherese
• griech. „wegnehmen“
• Verfahren zur Entfernung von Substanzen aus dem
Blut oder Plasma des Patienten
(Proteine, Protein-gebundene Substanzen, Zellen)
Therapeutische Apherese (siehe hinten: Verfahren der
Blutreinigung; pathogene Komponenten werden entfernt)
Diagnostische Apherese (Gewinnung z.B. von Zellen aus dem Blut)
56
Apherese zur Gewinnung von Zellen
•
•
•
•
•
Blut wird aus Armvene entnommen
in steriles Schlauchsystem geleitet
Antikoagulation mit Citrat
Mischung wird in Zellzentrifuge geleitet
Blutbestandteile werden entsprechend der Dichte
aufgetrennt und gesammelt
• nicht benötigte Komponenten zum Spender zurück
57
Dichte der Blutzellen
58
Dichte der Blutzellen
59
Zentrifugation
Zentrifugenmit
te
Niedrigste gKraft
Größte g-Kraft
RZB = (n/1000)²x r x 1,118
n...rpm
r..Radius in mm
RZB...relative Zentrifugalbeschleunigung
Die g-Kraft in der Zentrifuge variiert mit der Geschwindigkeit und dem
Radius. Die g-Kraft ist am größten am äußeren Rand und am
niedrigsten am inneren Rand, nahe dem Zentrum. Die g-Kraft verstärkt
sich mit zunehmender Zentrifugengeschwindigkeit.
60
Zentrifugation
61
Zellzentrifuge
comtec
62
Verfahren der Blutreinigung
63
Hämodialyse: Entfernung (kleiner, wasserlöslicher)
Substanzen aus dem Blut
- Akutdialyse
- Chronische Dialyse
Therapeutische Apherese: Entfernung größerer, meist
proteingebundener Substanzen
-
Behandlung von Autoimmunerkrankungen
Leberunterstützung
Therapie von Sepsis, MOF
Vergiftungen
Hypercholesterolämie
64
Prinzip der
Hämodialyse
Blut
Semipermeable
Membran
Dialysat
Gegenstrom von Blut und Dialysat
Flüssigkeitsentzug durch Unterdruck auf der Dialysatseite
65
Standard-Hämodialyse (HD)
Gerinnungshemmer
Dialysator
Blutpumpe
(gebrauchtes)
Dialysat
(frische)
Dialysierflüssigkeit
Blut zum
Patienten
Blut vom
Patienten
66
Dialysator
Technischer Aufbau:
Kapillarbündel
Einlass
Dialysierflüssigkeit
Auslass
Dialysat
Auslass
Blut
Einlass
Blut
67
Materialien
• früher Cellulose (Aktivierung des
Komplementsystems)
• heute meist synthetische Membranen
(Polysulfon)
68
Aktivierung des Komplementsystems
C5b-9 (ng/ml)
3000
2500
Regenerierte Cellulose
2000
1500
1000
SMC
500
PSu
0
0
30
60
90
120
150
180
Behandlungsdauer (min)
69
70
Siebkoeffizient
S = cFiltrat / cPlasma
Solute 1
Solute 2
Solute 3
cf = cp
cf = 0.5 • cp
cf = 0
S=1
S = 0.5
S=0
71
Dialysator: Siebkoeffizient
Semipermeable Membranen:
Siebkoeffizient (SC)
1
Plasmaflilter
0,9
Niere
0,8
0,7
0,6
high-flux
Filter zur Leberunterstützung
0,5
0,4
low-flux
0,3
0,2
0,1
0
104
103
Inulin
Myoglobin
106
105
Albumin
IgG
Fibrinogen
Molekulargewicht
72
Antikoagulation
Komplikationen der Heparinisierung:
• Blutungen
• Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ I und II
HIT II
führt zu lebensbedrohlichen Thromboembolien
ist eine absolute Kontraindikation gegen die Weiterführung
der Heparin-Antikoagulation
73
Antikoagulation
Hirudin:
• rekombinantes Polypeptid (Lepirudin, Desirudin)
• lange Halbwertzeit
• direkter Inhibitor von Faktor IIa
• bei HIT II eingesetzt
• Monitoring: aPTT und Ecarin-Test (ECT)
74
Antikoagulation
Citrat:
• physiologischer Metabolit
• effektive Metabolisierung zu Bicarbonat
• komplexiert Ca++
• dialysabel
75
Citrat
76
Therapeutische Apherese
77
Therapeutische Apherese
• Plasmaaustausch
unselektiv; entfernt auch wertvolle Komponenten des Plasmas,
Substitutionslösungen erforderlich; potentielle Gefahr von
allergischen Reaktionen oder Infektionen
• Kombinierte Membran-Adsorptionssysteme
-Hämapherese
Vollblut über Adsorber geleitet, pathogene Komponenten
gebunden, gereinigtes Blut zurück zum Patienten
- Plasmapherese
Trennung in Zell- und Plasmafraktion, nur Plasma in Kontakt mit
Adsorbermaterial -> bioverträglicher
78
TABLE 1: Adsorbent Systems for therapeutic apheresis
Target
Ligand/Matrix (commercial name)
Indication (examples)
anti-Ig-ab-Sepharose (Ig Therasorb)
ProteinA-Sepharose (Immunosorba)
ProteinA-silica (Prosorba)
IgG-binding peptide-Sepharose (Globaffin)
Peptide domains β1-AR-Sepharose (Coraffin)
DCM, SLE, antiFVIII-ab
DCM, SLE
Rheumatoid arthritis
DCM
DCM
Elimination of LDL
anti-ApoB-Sepharose (LDL Therasorb)
Dextransulfate-cellulose (Liposorber)
Polyacrylate-Eupergit (DALI)
Heparin precipitation (HELP)
Hypercholesterolemia
Hypercholesterolemia
Hypercholesterolemia
Hypercholesterolemia, sudden hearing loss
Elimination of AB0 antibodies
blood group antigen A or B (Glycosorb)
AB0 incompatible kidney transplantation
Elimination of immunoglobulins
Global immunoadsorption
Specific immunoadsorption
Elimination of toxins in liver failure
single pass albumin diaylsis (SPAD)
selective plasma filtration (SEPET)
albumin dialysis (MARS)
FPSA (PROMETHEUS)
Biologic DT
Liver failure
Elimination of pathogenic factors in sepsis
Endotoxin
Polymyxin B-polystyrene (Toraymyxin)
Cytokines
Combination of factors
Polystyrene-Divinylbenzene (CPFA)
MIAS (anti-endotoxin, anti-IL-6, antiC5a)
Sepsis
ab, antibody; AMD, ApoB, apoliprotein B; CPFA, coupled plasma filtration adsorption; DCM, dilative cardiomyopathy; FPSA, fractionated plasma separation
and andsorption; HELP, heparin-induced extracorporeal LDL adsorption; Ig, immunoglobulin; IL-6, interleukin 6; MARS, molecular adsorbent recirculating
system; SLE, systemic lupus erythematosus; SPAD, single pass albumin dialysis.
79
Prometheus Leberunterstützungssystem
FPSA circuit
Prometh01
AlbuFlow
Prometh02
Patient
dialysis circuit
high-flux
dialyser
80
81
82