Mucopeptidhydrolasen in Escherichia coli B

956
H. P ELZER
alternierend Acetylglucosamin und Acetylmuraminsäure bestehen („Backbones“ ), an denen die Peptidseitenketten wie Rippen befestigt sind (vgl. auch
S alton und G huysen 34 sowie L eutgeb 5) . Man
könnte nun, ausgehend von einer Anmerkung
W orks 3o, wonach den Aminosäuren Glu und D A P
(bzw. Lysin) in der Bakterienzellwand eine Verzwei­
gungsfunktion zukommen soll, allein aus C 3-Molekülen die zweidimensionale Struktur der Stützmem­
bran ableiten. Von G huysen 36 wurde aus Micrococcus lysodeikticus-ZeWwänden nach Lysozymverdau­
ung ein dem C 3 analoges dimeres Mucopeptid iso­
liert, das ebenfalls durch ein aus Kulturfiltraten von
Streptomyces albus gewonnenes E n zy m 37 mit der
Wirkungsspezifität einer Muramylamidase zwischen
34
35
M. R. J. S a l t o n u . J. M. G h x jy s e n , Biochim. biophysica
Acta [Amsterdam] 45, 355 [I960].
E. W o r k u . D. L. D e w e y , VI. Intern. Congr. Microbiol.,
Rom 1953, Vol. I, 50.
Muraminsäure und L-Alanin gespalten wird. Dimere
Mucopeptide dieser Art sind vermutlich auch in der
Zellwand anderer Bakterien enthalten. Vielleicht ge­
hören sie als Vernetzungsglieder zwischen den Poly­
saccharidketten zum allgemeinen Bauprinzip bakte­
rieller Stützmembranen. Es ist leicht zu erkennen,
daß dann sowohl die Muramylamidase als auch die
Muco-Endopeptidase eine Autolysin-Aktivität entfal­
ten könnte; erstere unter Bildung peptidfreier Poly­
saccharide neben Tetra- und Octapeptiden, letztere
unter Bildung unverzweigter eindimensionaler Polymucopeptide aus C 6-Wiederholungseinheiten.
Fräulein R e n a t e P a c k u l a t hat sich durch fleißige
und gewissenhafte Mitarbeit bei der Durchführung der
Versuche ausgezeichnet.
36
37
J. M. G h u y s e n , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 47,
501 [1961].
J. M. G h u y s e n , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 40,
473 [I960].
Mucopeptidhydrolasen in Escherichia coli B
I I . Q uantitative Bestimmungsverfahren u n d säulenchromatographische Trennung
einiger Mucopeptidhydrolasen
V on H. P elzer *
Aus dem Max-Planck-Institut für Biologie, Abteilung
W e id e l,
Tübingen
(Z. Naturforschg. 18 b, 956— 964 [1963]; eingegangen am 8. M ai 1963)
A quantitative method for the estimation of cell wall mucopeptides
dation products by paper chromatography is described. The procedure
the activities of mucopeptidehydrolases as well as for in vivo studies of
mucopeptides.
A partial purification of E . coli mucopeptidehydrolases was achieved
on DEAE-Sephadex.
Der Nachweis von Mucopeptidhydrolasen in E.
coli B 1 eröffnete neue Möglichkeiten zu Strukturunter­
suchungen an Stützmembranen sowie zum Studium des
Zellwandstoffwechsels in der lebenden Zelle. Während
einige Strukturprobleme bei den niedermolekularen
Mucopeptiden bereits mit Hilfe des Rohenzymgemisches gelöst werden konnten, erfordern Versuche mit
intakten Stützmembranen hochgereinigte Enzympräpa­
rate. Trennungs- und Anreicherungsverfahren von
Enzymgemischen setzen aber Methoden zur quantitati­
ven Bestimmung der interessierenden Enzymaktivitäten
voraus. Wir haben für diesen Zweck die bewährte ein­
dimensionale Papierchromatographie, bei der die An­
wesenheit der einzelnen Enzyme unmittelbar aus den
Rf-Werten der Mucopeptid-Reaktionsprodukte erkenn­
* Neue Anschrift: Biochem. Laboratorium, Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach/Riss.
and their enzymatic degra­
can be used for measuring
the metabolism of cell wall
by column chromatography
bar ist, den Erfordernissen der quantitativen Analyse
angepaßt. Zur quantitativen Bestimmung der iV-Acetylglucosaminidase ist darüberhinaus ein einfacher und
sehr empfindlicher Reagensglastest entwickelt worden.
Mit Hilfe dieser Methoden war es möglich, alle
unternommenen Reinigungs- und Trennungsschritte
quantitativ zu verfolgen.
Die Auftrennung des Enzymgemisches in seine fünf
Komponenten wurde sehr erleichtert durch die Tat­
sache, daß die Muramylamidase unter den angewandten
Extraktionsbedingungen an die unlösliche Zellwand ge­
bunden bleibt. Im löslichen Teil (Rohextrakt) waren
somit nur noch vier Mucopeptidhydrolasen anwesend.
Ihre partielle Auftrennung gelang durch Säulenchro­
matographie an DEAE-Sephadex.
1
H.
P e lz e r ,
vorangehende Mitteilung,
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung
in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der
Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:
Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland
Lizenz.
This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift
für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the
Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs
3.0 Germany License.
Zum 01.01.2015 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der
Creative Commons Lizenzbedingung „Keine Bearbeitung“) beabsichtigt,
um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher
Nutzungsformen zu ermöglichen.
On 01.01.2015 it is planned to change the License Conditions (the removal
of the Creative Commons License condition “no derivative works”). This is
to allow reuse in the area of future scientific usage.
M U C O P EPT ID H Y D RO LA SEN IN ESCHERICHIA COLI B II
Material und Methoden
Die als Substrate verwendeten Mucopeptide wurden
wie früher beschrieben 2 aus E. co/t'-Zellwänden gewon­
nen und gereinigt. Die enzymatische Inkubation erfolgte
in Glasröhrchen (Höhe 100mm, 0 = 11 mm), die mit
Polyäthylenfilm („Parafilm“) verschlossen wurden. Für
besonders genaue Bestimmungen bewährten sich besser
die Mikrotitrationsbecher mit Deckel (beides aus Poly­
äthylen) der Firma Beckman Instruments. Mit Hilfe
von passenden Einsätzen konnten die Mikrobecher in
unserer Laborzentrifuge (Christ Junior) bequem unter­
gebracht werden.
Folgende Lösungsmittelsysteme für die Papierchro­
matographie wurden verwendet:
System I: n-Butanol/Essigsäure/Wasser ( 4 : 1 : 5 ) ,
System II: n-Butanol/Pyridin/Wasser/Essigsäure
(60 : 40 : 30 : 3),
System III: Pyridin/Wasser ( 4 : 1) ,
System IV : n-Butanol/Pyridin/Wasser/Essigsäure
(60 : 40 : 45 : 3).
Sofern nicht anders vermerkt, wurde auf Macherey
& Nagel-Papier Nr. 2214 chromatographiert und zwar
im System I in Faserrichtung, in den Systemen II —IV
quer zur Faser. Alle verwendeten Lösungsmittel waren
p. a. von E. Merck, Darmstadt. n-Butanol und Pyridin
wurden vor Gebrauch destilliert, letzteres über NaOHPlätzchen.
DEAE-Sephadex A 50 (medium) Lot To 9613 M
stammte von der Deutschen Pharmacia GmbH Frank­
furt/M. Wir danken dieser Firma für die kostenlose
Abgabe kleinerer Versuchsmengen.
Zur Fraktionierung des Säuleneluats in der Kälte
verwendeten wir einen Fraktionensammler von LKB
(Stockholm). Wir danken der Firma Colora für die
probeweise Überlassung eines solchen Geräts.
Zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit bedien­
ten wir uns eines Konduktometers Type LER der Firma
Phywe, Göttingen; Gerätekonstante K = 0,76; Spezifi­
sche Leitfähigkeit x = K jü . Die Proteinbestimmungen
erfolgten nach der Methode von L owry und Mitarbei­
ter 3.
957
tide, die bei ihrer Isolierung2 in der sauren Form
anfallen, drücken in den verwendeten Konzentra­
tionen den pn-Wert einer frischen AmmoniumacetatLösung von 6,7 auf etwa 6,0. Stark proteinhaltige
Rohextrakte aus Co/z-Zellen haben selbst eine genü­
gend hohe Pufferkapazität, um die Mucopeptid-bedingte pn -Verschiebung auszugleichen. Gereinigten
Enzymfraktionen fehlt dieser pn-Schutz weitgehend.
Die pn-Optima aller bisher näher untersuchten E.
co/z-Mucopeptidhydrolasen liegen oberhalb von 7,0
(bei pn 6 ist ihre Enzymaktivität stark verringert
oder fast n u ll), weshalb für eine reproduzierbare
quantitative Bestimmung während der Inkubation
ein konstanter pn-Wert von 7 oder höher aufrecht
erhalten werden muß.
Auch erste Versuche zur chromatographischen
Trennung der Proteine an DEAE-Sephadex mit Ammoniumacetat-Lösungen steigender Konzentration
oder m it Ammoniumchlorid-Konzentrationsgradienten ließen sich nicht genau reproduzieren. Da die
Trennung der Mucopeptidhydrolasen an DEAESephadex bei pn 6,6 — 6,7 optimal war (vgl. auch
L ee und E n gelsberg 4) , versuchten wir, für diese
Trennung einen Puffer vom pn-Wert 6,6 zu finden,
der die papierchromatographische Auswertung der
enzymatischen Mucopeptid-Abbauprodukte nicht be­
einträchtigt.
Ergebnisse
A) Q u a n t i t a t i v e
Testmethoden
Frischbereitetes n/10-Ammoniumacetat hat einen
PH-Wert von 6,6 — 6,8. Bei längerem Stehen an der
Luft oder beim kurzzeitigen Durchleiten von C 0 2Gas fällt der pn-Wert auf 5,5. Auch die Mucopep2
3
J. P r i m o s i g h , H. P e l z e r , D. M a a s s u . W . W e i d e l , Biochim.
biophysica Acta [Amsterdam] 46,68 [1961].
O . H. L o w r y , N. J. R o s e b r o u g h , A. L . F a r r u . R . J. R a n ­
d a l l , J. biol. Chemistry 193, 265 [1951].
Abb. 1. Quantitative Auswertung eines Butanol/EssigsäureChromatogramms (System I) variierender Mengen eines Ge­
misches nicht-vorfraktionierter Mucopeptide (MPG) aus E .
coZt-Zellwänden. Den Proben 50, 200 und 300 [xg waren
10 /ug Alanin zugesetzt.
4
5
6
N. L e e u . E . E n g l e s b e r g , Proc. nat. Acad. Sei. USA 48,
335 [1961].
J. H e i l m a n n , J. B a r r o l l i e r u . E. W a t z k e , Hoppe-Seyler’s
Z. physiol. Chem. 309, 219 [1957].
W . L e u t g e b , persönliche Mitteilung.
958
H. P ELZER
Abgesehen von ihrer großen Empfindlichkeit ge­
gen Pufferionen lassen sich Butanol-Essigsäure-Chromatogramme nicht direkt für quantitative Bestim­
mungen verwenden. Die nach A nfärbung mit Ninhydrin ausgeschnittenen und mit methanolischer
Cadmiumacetat-Lösung5 extrahierten Fraktionen
unterliegen nach L eutgeb 6 großen quantitativen
Schwankungen, wahrscheinlich infolge des nur
schlecht definierten pn-Wertes bei der Reaktion mit
Ninhydrin. Diese Störung kann leicht umgangen
werden, wenn man die getrockneten Chromato­
gramme im System II rechromatographiert (Lauf­
zeit etwa 8 Stdn.) und erst dann mit N inhydrin an­
färbt. Die Rf-Werte der Mucopeptide und deren
Spaltprodukte werden dadurch nur geringfügig ver­
ändert und das günstige Pyridin/Essigsäure-Verhält­
nis ermöglicht nun eine quantitative Auswertung
nach P r im o sig h et al. 2. Abb. 1 zeigt das Diagramm
einer auf diese Weise durchgeführten Bestimmung
der Mucopeptidkomponenten variierender Mengen
eines Gemisches aller Mucopeptide aus E. coli-Zell­
wänden. Die angeführten Mengen wurde in 0,05 ml
eines 0,01-/n. Phosphatpuffers pn 7 gelöst, zusam­
men mit 10 f.ig A lanin auf einer Startbreite von
2 cm chromatographiert und quantitativ ausgewer­
tet. Zugesetztes NaCl oder N H 4C1, die als Salze für
den Konzentrationsgradienten bei der Enzymtren­
nung an DEAE-Sephadex in Frage kommen, erlaub­
ten schon in kleinsten Mengen keine Alaninbestim­
mung mehr. Die Bestimmung von C 4 und C 6 wird
von einer Salzmenge bis zu 0.02 ml einer 0,2-m. L ö ­
sung (Tab. 1) nicht behindert.
Extinktionen bei 492 m/t
[ml NaCl (0.2 m .) l
0.005
0 . 0 1 0 | 0 ,0 2 0
C4
C6
0.032
0,273
0.029
0,285
0.029
0,270
[ml N H 4C1 (0 ,2 -m.]
0 ,0 2 0
0,005
0.027
0,277
System I. Die Mucopeptidpaare C 3 /C 4 , C 5/C 6
und SC 5/SC 6 haben hier aber fast identische RfWerte und selbst die befriedigende Trennung der
Paare voneinander erfordert eine Chromatographie­
dauer von mindestens 72 Stunden. In dieser Zeit ist
dann das schnellwandernde Alanin bereits mit dem
Lösungsmittel abgetropft, was eine Bestimmung der
D-Alanin-Carboxypeptidase unter diesen Bedingun­
gen ausschließt.
Besser bewährte sich das Lösungsmittelsystem IV ,
eine wasserreichere Modifikation des Systems II.
Zwar trennen sich auch hier die genannten Paare
nicht auf, ihre gemeinsamen 7?/-Werte sind aber sehr
viel höher als in System II, während der Rf-Wert
des Alanins kaum verändert ist. Zum Unterschied
von System I wird im System IV das für die Be­
stimmung der Muramylamidase notwendige Tri- bzw.
Tetrapeptid von C 5 / C 6 abgetrennt. Die /?cß-Werte
sind 0,67 (Tripeptid) bzw. 0,79 (Tetrapeptid).
Die Empfindlichkeiten des Systems IV gegen P uf­
fer- und Salzionen sind in Tab. 2 zusammengestellt.
Höchstgrenzen
in ml einer
0.1-m. Lösung
TRIS-HCl, 7 - 9
TRIS-Maleat, 5,5-9
(ohne NaOH)
Xa, K-Phosphat, 5—9
XaCl
> 0.4a)
> 0 ,4
0 ,0 2
b)
0,04
Tab. 2. Höchstgrenzen von Puffer- und Salzkonzentrationen,
die im System IV auf einer Startbreite von 2 cm noch eine
quantitative Bestimmung aller aus Mucopeptiden enzymatisch
abspaltbaren Komponenten gestatten. a Nach Anfärbung mit
Ninhydrin entsteht ein gelber Fleck mit einem /?Ala — 2.
b Der /?Ala von Kaliumphosphat ist 0,70, der von Natrium­
phosphat 0,80. In diesem Bereich liegt keine der interessanten
Mucopeptid-Reaktionsprodukte.
0 ,0 2 2
0.273
Tab. 1. Quantitative Auswertung von C 4 und C 6 in einem
Butanol-Essigsäure-Chromatogramm (System I) von je 210/^
E . co/i-Mucopeptidgemisch nach Zusatz verschiedener Mengen
NaCl oder NH 4C1.
Dieses Verfahren liefert gut reproduzierbare E r­
gebnisse, ist aber für Reihenbestimmungen zu zeit­
raubend. Auch läßt sich mit ihm keine Muramylamidase-Bestimmung durchführen, da hier die RfWerte von Substrat (C 5 oder C 6) und Reaktions­
produkt (Tri- bzw. Tetrapeptid) gleich sind 1.
Das Lösungsmittelsystem II ist gegen Puffer- und
Salzionen verschiedenster Art unempfindlicher als
Die Vorteile des Systems IV liegen somit in der
Möglichkeit zur Abtrennung des Tri- und Tetrapep­
tids von C 5 / C 6 und in der hohen TRIS-HCl-Konzentration. die bei der Enzyminkubation verwendet
werden kann. Die Spezifität des Verfahrens wird
durch die Ähnlichkeit der Rf-Werte von Mucopeptidpaaren nicht beeinflußt. Die Messung der D-AlaninCarboxypeptidase erfolgt hier über das aus C 6 ab­
gespaltene Alanin, die der Muco-Endopeptidase über
das Mucopeptidpaar C 5/C 6 nach Inkubation mit
C 3 und die der Muramylamidase über das Tripep­
tid nach Spaltung von C 5. Die Muramylamidase
kann gleichzeitig mit der Alanin-Carboxypeptidase
M U C O P EPT ID H YD RO LA SEN IN ESCHERICHIA COLI B II
gemessen werden, wenn man C 6 als Substrat ver­
wendet und an Stelle des Tripeptids die Summe aus
Tri- und Tetrapeptid in Betracht zieht. Eine Bestim­
m ung des Lysozyms kann, soweit erforderlich, statt
durch die Reaktion C 4 —>■C 3 auch durch die Spal­
tung des über y S (l—> 4 ) verknüpften C 6-Dimeren
erfolgen. Dieses hat im System IV einen kleineren
R f- Wert als C 3/C 4 und wird aus C 4 durch Ink u­
bation mit Lysozym-freier Muco-Endopeptidase ge­
wonnen.
Aus den genannten Faktoren ergeben sich die
Grundlagen für eine Methode zur quantitativen Be­
stimmung aller Mucopeptidhydrolasen mit Hilfe der
Papierchromatographie. Die zu prüfenden Protein­
lösungen werden gegen 0,1-m. TRIS-HCl-Puffer
eines geeigneten pn-Wertes dialysiert und 0,1 bis
0,4 ml hiervon mit C 3, C 6 oder dem C 6-Dimeren
inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion durch
Hitze-Inaktivierung der Enzyme zentrifugiert man
das ausgefallene Protein ab und chromatographiert
den Überstand im Lösungsmittelsystem IV . Nach
dem Trocknen über konz. Schwefelsäure und N a­
triumhydroxyd 2 werden die Streifen m it einer L ö ­
sung von 0,5% N inhydrin in Aceton getränkt, an
der Luft getrocknet und genau 20 M in. in einem
Trockenschrank auf 70° erhitzt. Die den einzelnen
Reaktionsprodukten zugehörigen Flecken werden
ausgeschnitten, mit 0,5% Cadmiumacetat in Metha­
nol (5 ml) eluiert und die Farbintensitäten gemes­
sen. Diese sind für alle in Frage kommenden Ver­
bindungen im Bereich von 0 bis mindestens 0,1 (wMol
der zu bestimmenden Substanzmenge proportional.
Ist es bei einer Enzymaufbereitung von Vorteil,
bei pH-Werten kleiner als 7,0 zu arbeiten (wie z. B.
bei der Ionenaustausch-Chromatographie an DEAESephadex) und will man zur Zeitersparnis auf eine
Dialyse verzichten, so verwendet man am besten
0,02-m. Phosphatpuffer und entnimmt für die E n­
zymbestimmung jeweils 0,05 ml, die dann mit einem
Überschuß von TRIS-HCl-Puffer auf den gewünsch­
ten Inkubations-pn-Wert gebracht werden. Die K on­
zentration des TRIS-Puffers muß dabei so hoch sein,
daß auch der eingangs erwähnte Säuerungseffekt der
Substrate kompensiert wTird.
Bei der W ahl des Inkubations-pn-Wertes ist zu be­
achten, daß die als Substrate verwendeten Mucopeptide in alkalischer Lösung nicht ganz beständig
sind. Durch Alkali-Abbau entstehen Ninhydrin-positive Substanzen, deren /?/-Werte z. T. m it denen der
enzymatischen Abbauprodukte übereinstimmen. Sie
959
bilden sich auch während der Hitzedenaturierung
der Proteine.
Um diese schwer zu kontrollierende Fehlerquelle
auszuschalten, wurde ohne Rücksicht auf das alkali­
sche pn-Optimum von D-Alanin-Carboxypeptidase,
Muco-Endopeptidase und Glucosaminidase bei pn
7.0 inkubiert. Als Standard-Verfahren bewährte sich
die Inkubation von 0,05 ml Enzymlösung (in
0,02-m. Phosphatpuffer pn 6,6) bei 37° mit 100
bis 200 ,ug Mucopeptid, gelöst in 0.0 1 m l 1-m.
TRIS-HCl-Puffer p n 7,0.
Als eine Enzym-Einheit wird diejenige Menge
Mucopeptidhydrolase definiert, die unter diesen Be­
dingungen pro Stde. 1 //Mol des betreffenden Mucopeptids spaltet. Es sei bemerkt, daß sich bei der In ­
kubation von C 3 m it einem Enzymgemisch, in wel­
chem neben der Muco-Endopeptidase auch Glucos­
aminidase enthalten ist, die Aktivität der ersteren
aus der Summe von C 5/C 6 plus SC 5/SC 6 ergibt.
Ist zusätzlich Muramylamidase anwesend (z. B. in
Acetontrockenpulver oder in Zellwandpräparation e n ), so muß man auch den Extinktionsanteil der
Aminozucker-freien Peptide (Tri- und Tetrapeptid)
hinzurechnen, um eine genaue Aussage über die
Endopeptidase-Aktivität machen zu können. Bei
gleichzeitiger Anwesenheit von Muramylamidase
und Glucosaminidase kann die Aktivität der letzte­
ren m it dieser Methode nicht bestimmt werden, da
sowohl C 5/C 6 als auch SC 5/SC 6 zu den freien
Peptiden abgebaut werden.
Die molaren Extinktionen der in Frage kommen­
den Verbindungen und des Alanins sind nur dann
reproduzierbar, wenn das etwas komplizierte Trock­
nungsverfahren für die Chromatogramme2 genau
eingehalten wird. Für größere Analysenreihen hat
sich recht gut folgende Vereinfachung bewährt: Man
trägt auf große Chromatographiebögen nebeneinan­
der in etwa 2 cm Abstand mehrere Inkubations­
ansätze mit den dazu gehörenden Fermentblindpro­
ben und einer Standard-Alaninmenge (z. B. 0,1 ^uMol)
auf. Die Trocknung der Bögen kann über Nacht in
einem belüfteten (ammoniak- und aminfreien) A b­
zug erfolgen. Die bei der quantitativen Auswertung
erhaltenen absoluten Extinktionen sind dann zwar
nicht streng reproduzierbar, können aber auf die
Extinktion des Standard-Alanins bezogen werden.
Die molaren Extinktionen von Alanin und C 5/C 6
verhalten sich wie 1,0/0,71. Für jedes Chromato­
gramm errechnet sich somit die Extinktion von
0.1 //Mol C 5 / C 6 aus der Extinktion des Standard-
960
H. P ELZER
Alanins (0.1 //Mol) multipliziert mit dem Faktor
0.71. Das Mucopeptid C 3 war noch nicht in völlig
reiner Form zugänglich. Seine molare Extinktion im
papierchromatographischen Ninhydrintest konnte je­
doch durch quantitative Überführung in C 5/C 6 mit
Hilfe der Muco-Endopeptidase errechnet werden.
Die absolute Extinktion wurde hierbei verdoppelt,
woraus folgt, daß die molaren Extinktionen von C 3
und C 5/C 6 gleich sind.
Quantitative Messungen der Extinktion von SC 5/
SC 6 stehen noch aus. Es wird angenommen, daß sie
mit der von C 5 /C 6 übereinstimmt. Dagegen dürften
das Tri- und das Tetrapeptid mit ihren zwei A m ino­
gruppen höhere Farbintensitäten ergeben als C 5/C 6
und es wird unter Vorwegnahme einer genauen Mes­
sung postuliert, daß sie doppelt so groß ist.
Beim Umsatz von C 5 oder C 6 m it E h r l i c h s
Reagens nach E l s o n und M o r g a n in einer M o­
difikation von R eissig et al. 7 zeigen beide Mucopep­
tide eine relativ schwache Farbreaktion. Äquimolare
Mengen von freiem AcGA bilden unter gleichen Be­
dingungen ein sehr viel intensiveres Chromogen.
M an kann diesen Unterschied zu einem einfachen
und empfindlichen Bestimmungsverfahren für Acetylglucosaminidase benutzen. Etwa 100 /ig C 5 oder
C 6 werden bei 37° und einem pn-Wert von 7,5 in
einem Endvolumen von 0.2 ml mit dem Enzym inku­
biert. Zur Beendigung der Reaktion setzt man 0,2 ml
einer 0,4-m. Borax-Lösung zu und erhitzt sofort
3 Min. im kochenden Wasserbad. Nach A bkühlung
fügt man 3 ml E h r l i c h s Reagens zu (10 g Dimethylaminobenzaldehyd gelöst in 100 ml Eisessig/
10-n. HCl 87,5 : 12,5) und erwärmt für genau
20 Min. auf 37°. Nach dem Abkühlen in Leitungs­
wasser wird bei 585 m/i gemessen. Statt C 5 oder
C 6 kann man hier als Substrat auch ein nicht frak­
tioniertes Mucopeptidgemisch verwenden.
Da diese Methode zum Unterschied vom papier­
chromatographischen Verfahren das abgespaltene
Acetylglucosamin erfaßt, wird das Ergebnis durch
die gleichzeitige Anwesenheit von Muramylamidase
nicht beeinflußt.
B) V e r s u c h e z u r A n r e i c h e r u n g
Enzyme
der
1. Gewinnung des Rohextraktes
in
2-mal 20 ml einer Übernachtkultur von E. coli B
synthetischem M 9-Medium wurden in 2-mal
7 J. L . R e i s s i g , J. L . S t r o m i n g e r
mistry 217, 959 [1955].
u
. L.
F.
L
e l o ir
,
J. biol. Che­
300 ml M 9-Medium übergeimpft und 2 x/2 Stdn. bei
37° stark belüftet. Nach nochmaliger Uberimpfung
dieser nun in der logarithmischen Wachstumsphase
befindlichen Zellen in 2-mal 15 / M 9-Medium wurde
bis zur optischen Dichte von 1,7 —2,0 (650 m/i) be­
lüftet und dann in einer Sharples-Durchlaufzentrifuge bei 32 0 0 0 U /M in . abgeschleudert. Die Aus­
beute an Feuchtbakterien war 120 g; 21 des Medium-Überstandes wurden bei 2° aufbewahrt.
Je 60 g Feuchtbakterien wurden nun mit 160 g
Glasperlen ( 0 = 0.17 — 0,18 mm, Firma Braun,
Melsungen) und 60 ml 0,02-m. Phosphat-Puffer pn
6,7 mit etwas EDTA 10 Min. lang bei 2° in einem
M ultim ix (Firm a Braun, Frankfurt) mit der Ge­
schwindigkeit I I I desintegriert. Der Behälter mußte
gelegentlich in einem Eisbad gekühlt werden, da­
mit die Temperatur des Inhaltes nicht über 24°
stieg. Nach Abgießen von den Glasperlen wurden
diese 2-mal mit 100 ml Puffer gewaschen. Beim A b ­
schleudern der vereinigten Überstände (1 Stde.
4500 U /M in.) in einer Kältezentrifuge bildeten sich
3 Schichten: ein trüber Überstand, ein lockeres Sedi­
ment und ein festes Sediment. Der Überstand und
das lockere Sediment konnten abgegossen werden.
Das feste Sediment (wahrscheinlich ganze Zellen)
wurde dann noch einmal im M ultim ix behandelt,
zentrifugiert und das nun noch verbleibende geringe
feste Sediment verworfen. Die vereinigten Über­
stände und lockeren Sedimente konnten bei 19 000
U /M in. in der Ultrazentrifuge (Spinco Modell L)
innerhalb 1 Stde. in einen festen Niederschlag und
einen grünlichen Überstand mit starkem T y n d a l l Effekt aufgetrennt werden. Der Rückstand wurde
1-mal mit 400 ml gewaschen und erneut in der
Ultrazentrifuge abgeschleudert. Die vereinigten
Überstände hatten nun ein Volumen von 920 M illi­
liter. Der Rückstand wurde als „Zellwand“ -Frak­
tion weiterverarbeitet.
2. /. Ammoniumsulj atfällung
920 ml Rohextrakt wurden bei 2° unter Rühren
langsam mit 1250 ml einer bei 2° gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung (in 0,02-m. Phosphatpuffer,
mit N aOH neutralisiert und mit 200 mg EDTA /l vor
Schwermetallionen geschützt) auf 50-proz. Sättigung
gebracht und nach 2 Stdn. bei 4500 U/M in. 45 Min.
zentrifugiert. Nach 2-maligem Waschen mit je
120 ml 50% gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung
wurde das Sediment in etwa 150 ml 0,02-m. Phos­
phatpuffer pn 6,6 gelöst und dialysiert (5 50 ).
961
M U C O P EPT ID H YD RO LA SEN IN ESCHERICHIA COLI B II
D-Alanin-Carboxypeptidase
Protein
[mg]
Rohextrakt
S 50
S 80
PS 50
PS 50 T
PS 50 K
2508
1248
1225
1150
4320
Zellwand­
sediment
1360
1200
Einheiten
r0 , -j
L/oJ
Muco-Endopeptidase
Einheiten
pro mg Pr. Einheiten
100
! 0.244
85,2
0.359
9,1
0,077
66,3
0,582
nicht gemessen
42,6 j 0,392
450
276
241
33
140,5
127,5
62,0
272
112
1056
900
96
700
0 ,2 0 0
[%]
100
87,5
1 2 ,0
50.8
46,2
22.4
-
Acetylglucosaminidase
Einheiten
Einheiten
pro mg Pr.
0.064
0.096
0,0026
0,117
0,104
0,054
197
89
40
0,082
[%]
100
45
Einheiten
pro mg Pr.
0,045
0,035
0,032
20
6
0 ,0 1 0
—
—
—
—
—
—
-
—
12
—
Tab. 3. Ausbeuten und spezifische Aktivitäten von D-Alanin-Carboxypeptidase, Muco-Endopeptidase und Acetylglucosaminidase
in den Schritten der Vorreinigung und Nucleinsäureentfemung.
Aus dem schwach trüben Überstand der 50%-Fällung fiel bei Zusatz von festem Ammoniumsulfat bis
zur 80-proz. Sättigung ein weiterer Niederschlag aus.
der ebenfalls in 0,02-m. Phosphatpuffer gelöst und
dialysiert wurde (S 80).
3. Protaminsulfat-Fällung
Die Entfernung der Nucleinsäuren aus S 50
(220 m l) erfolgte durch Zusatz von 250 ml einer
1-proz. Lösung von Protaminsulfat (Mann-Research)
in 0,02-m. Phosphatpuffer pn 6,6. Das flockige Se­
diment ließ sich nach 2 Tagen sehr leicht bei 4500
U /M in. abzentrifugieren. Es wurde mit 30 ml P uf­
fer gewaschen und verworfen, nachdem qualitative
Versuche gezeigt hatten, daß es nur sehr geringe
Mengen von mitgerissenen Mucopeptidhydrolasen
enthielt.
4. 11. Ammoniumsulfat-Fällung
500 ml Protaminsulfat-Überstand wurden durch
langsames Zutropfen von 680 ml gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung auf 50% Sättigung gebracht und
3 Stdn. später bei 4500 U /M in. zentrifugiert. Das
feste gelbe Sediment löste sich mit starkem T y n ­
d a l l -Effekt ohne Trübung in 10 ml 0,02-m. Phos­
phatpuffer pn 6,6. Bei der nun folgenden Dialyse
gegen diesen Puffer fiel eine große Menge eines
schmutzig braunen Niederschlages aus, der nach dem
Zentrifugieren (20 Min. 5000 U/M in.) m it 10 ml
Puffer gewaschen wurde. Er konnte durch Phosphat­
puffer höherer Konzentration mit oder ohne Zusatz
von Ammoniumsulfat nicht wieder in Lösung ge­
bracht werden. Sein Gehalt an aktiven Mucopeptid­
hydrolasen ist nicht überprüft worden.
Die vereinigten klaren Überstände (50 ml, PS 50)
wurden eingefroren und bis zur Weiterverwendung
2 Wochen bei — 20° aufbewahrt. Nach dem A uf­
tauen war die Lösung stark trüb (PS 50 T ). Es wur­
den Proben für die Enzymbestimmungen entnom­
men und der Rest zentrifugiert. Der klare Über­
stand (PS 50 K) kam auf die Ionenaustauscher­
säule, das Sediment wurde verworfen.
Die Proteinkonzentrationen und Enzymaktivitä­
ten in den Lösungen der beschriebenen Reinigungs­
stufen sind in Tab. 3 wiedergegeben.
5. Aufarbeitung des Medium-Überstandes
Dieser wurde durch Zentrifugieren (4500 U /M in..
1 Stde.) von den restlichen Coli -Zellen befreit und
im Vakuum-Rotationsverdampfer bei 20° Badtem­
peratur auf 1/10 Volumen eingeengt. Bei der D ia ­
lyse des intensiv gelben Konzentrats gegen 0,02-m.
Phosphatpuffer pn 6,6 trat fast völlige Entfärbung
ein. Von der leicht trüben Flüssigkeit wurden dann
je 0,05 ml m it C 3 und C 6 2 Stdn. bei 37° inku­
biert und wie üblich papierchromatographisch ge­
testet. Es zeigten sich keinerlei MucopeptidhydrolaseAktivitäten. Die Anwesenheit von Lysozym wurde
nicht geprüft.
6. Aufarbeitung der Zellwand-Fraktion *
Das Zellwand-Sediment wurde zunächst eingefro­
ren und 14 Tage bei —20° aufbewahrt. Nach dem
Auftauen und Resuspendieren in 100 ml Wasser
wurde 1 ml für Enzymtests entnommen und nach
Verdünnung mit 1 ml 0,02-m. Phosphatpuffer pn
6,6 gegen diesen dialysiert.
* Unter Mitarbeit von Herrn D.
M aass.
962
H. P ELZER
Der Rest zeigte nach Extraktion mit verdünntem A l­
kali zur Gewinnung von T 5-Rezeptor **• 8 und der Be­
handlung mit Natrium-Dodecylsulfat9 im Elektro­
nenmikroskop *** die für Detergens-behandelte E.
co/t-Zellwände typische morphologische Struktur. Mit
Lysozym konnten daraus auf die übliche Weise alle be­
kannten Mucopeptide 2 erhalten werden.
0,05 ml der dialysierten und auf 4,0 ml verdünn­
ten Zellwand-Suspension zeigten bei Inkubation mit
C 3 und C 6 die Anwesenheit relativ hoher A ktivi­
täten von Muramylamidase und Muco-Endopeptidase und einer geringen Aktivität von D-Alanin-Carboxypeptidase.
A uf
Acetylglucosaminidase
wurde
nicht geprüft.
C) S ä u l e n c h r o m a t o g r a p h i s c h e T r e n ­
n u n g und R e i n i g u n g der E n z y m e
30 g DEAE-Sephadex wurden nach den Angaben
der Herstellerfirma gereinigt, mit 0,02-m. Phosphat­
puffer pn 6,6 äquilibriert und in ein Chromatogra­
phierohr vom Durchmesser 3.2 cm gefüllt. Die Höhe
der Säule betrug 34 Zentimeter. Die chromatogra­
phische Trennung der Enzyme erfolgte bei 2 °. 50 ml
PS 50 K wurden auf die Säule gegeben und diese
nach Einsickern der Enzymlösung 3-mal mit 20 ml
. 0,02-m. \ 0,025-m. j 0.05-m. NaCL in \ NaCl-Gradient in 0,025-m. Phosphat
Phosphat
Phosphat
0,025-m.Phosphat
-Si ^
20
j
%
60
80
100
jj
120
jjjj
W
160
jy
180
200
Fraktion. 3 15ml
Abb. 2. Säulenchromatographie der Enzym-haltigen Protein­
lösung PS 50 K an DEAE-Sephadex. — o — Muco-Endopeptidase, — • —Acetylglucosaminidase*. — A — D-Alanin-Carboxypeptidase * * , ---- Protein, ------- Spezifische Leit­
fähigkeit (y.) des Eluats bei 0° (proportional der NaCl-Konzentration). I —IV Gesammelte Enzymfraktionen. * Stark
überhöhte Werte, erhalten durch 20-stdg. Inkubation mit C 5
und Bestimmung des abgespaltenen Acetylglucosamins.
** Bei der D-Alanin-Carboxypeptidase betrugen die gemesse­
nen Enzymeinheiten das Vierfache der hier aufgeführten
Werte.
8 W . W e id e l,
G.
K och
u. K .
B obosch.
Z. Naturforschg. 9 b.
573 11954],
H. F r a n k
22. 158 [I960],
9 W . W e id e l.
u.
H. II.
M a r t ix ,
J. gen. Microbiol.
Puffer nachgespült. Nun wurde zuerst schrittweise
mit 360 ml 0,02-m. Phosphat pn 6,6, 500 ml
0,025-m. Phosphat pn 6,6 und 630 ml 0,05-m.
NaCl in 0,025-m. Phosphat pu 6.6 eluiert und an­
schließend die NaCl-Konzentration in Form eines
linearen Konzentrationsgradienten kontinuierlich
von 0,05-m. auf 0,35-m. in 0.025-m. Phosphat er­
höht. Die Fraktionierung des Eluats in 15-ml-Portionen begann zum Zeitpunkt des Aufbringens der
Proteinlösung. Aliquote Teile der gesammelten Frak­
tionen dienten zur Messung der Proteinkonzentra­
tion und zur Ermittlung der Enzymaktivitäten. Die
Kontrolle der NaCl-Konzentration in den Eluatfrak­
tionen geschah konduktometrisch.
Abb. 2 zeigt im Diagramm ein typisches Beispiel
einer solchen säulenchromatographischen Trennung.
Die Werte für Acetylglucosaminidase-Aktivitäten
sind dort nach der Schnellmethode von R e i s s i g
et al. gewonnen worden und können deshalb mit den
quantitativen Angaben in Tab. 2 nicht verglichen
werden.
Die Fraktionen 5 — 20 (I. Muco-Endopeptidase).
33 — 47 (II, Muco-endopedtidase), 89 — 103 ( I II.
Acetylglucosaminidase) und 136 — 153 (IV , D-Alanin-Carboxypeptidase und
Muco-Endopeptidase)
wurden vereinigt, durch Gefriertrocknung auf kleine
Volum ina eingeengt und gegen 0.02-m. Phosphat­
puffer pn 6,6 dialysiert. Die AcetylglucosaminidaseFraktion ist in diesem Versuch nicht quantitativ wei­
ter verarbeitet worden, da sie während der Gefrier­
trocknung den größten Teil ihrer Enzymaktivität
eingebüßt hat. Ein modifiziertes Verfahren zu ihrer
schonenden Gewinnung wird an anderer Stelle p u bli­
ziert werden 10. Die Ausbeuten an Muco-Endopepti­
dase und D-Alanin-Cbaroxypeptidase bezogen auf die
Lösung PS 50 K = 100% und ihre spezifischen
Aktivitäten sind in Tab. 4 zusammengefaßt.
Diskussion
Das beschriebene Verfahren zur quantitativen Be­
stimmung von Mucopeptiden und deren enzymati­
schen Abbauprodukte ist nicht auf Aktivitätsbestim­
mungen von Mucopeptidhydrolasen beschränkt. Es
kann ebenso zur Ermittlung der Konzentration ein­
zelner Komponenten in Mucopeptidgemischen nach
** Isoliert und weiterverarbeitet von Frau Dr. M .- L . Z a r n i t z .
*** Ich danke Herrn Dr. H. F r a n k für die elektronenoptisdie
Kontrolle der Zellwandpräparate.
10 D. M a a s s u. H. P e l z e r , in Vorbereitung.
963
M U C O P EPT ID H YD RO LA SEN IN ESCHERICHIA COLI B II
Alanin-Carboxypeptidase
Protein
[mg]
PS 50 K
1150
Fraktion I
Fraktion I I
Fraktion IV
2 0 .1
3.3
70,5
Einheiten
450
0
0
390
[%]
100
0
0
86,5
Muco-Endopeptidase
Einheiten
pro mg Pr.
Einheiten
0.392
62,0
_
[%]
0,054
100
5,52
25,1
29.4
12,9
2 0 ,8
Summe:
67,4
108,8
—
Einheiten
pro mg Pr.
40,5
47,5
1.25
8.90
0,18
Tab. 4. Ausbeuten und spezifische Aktivitäten von Alanin-Carboxypeptidase und Muco-Endopeptidase in den Fraktionen der
säulenchromatographischen Trennung an DEAE-Sephadex. PS 50 K = Ausgangslösung.
Lysozymverdauung von Stützmembranen herangezo­
gen werden. Hier läßt sich das Ammoniumacetat vor
der Chromatographie durch Sublimation entfernen,
was dann eine Trennung im System I mit nachfol­
gender kurzer Rechromatographie in System I I er­
möglicht (Abb. 1). Einige interessante Probleme
der Konstitution und des Stoffwechsels von Stütz­
membranen dürften, soweit sie den absoluten oder
relativen Gehalt bestimmter Mucopeptid-Untereinheiten im Mucopolymer betreffen, auf diese Weise
der Bearbeitung zugänglich werden.
Als Anwendungsbeispiel für die quantitative Be­
stimmung von Enzymaktivitäten durch Chromato­
graphie der Mucopeptid-Abbauprodukte im System
IV wurden die spezifischen Aktivitäten von M uco­
peptidhydrolasen über mehrere Reinigungsschritte
hinweg verfolgt. Dabei stellte sich heraus, daß die
Abtrennung der Nucleinsäuren mit Protaminsulfat
und nachfolgender Ammoniumsulfatfällung große
Aktivitätsverluste einschließt, während die Chro­
matographie an DEAE-Sephadex praktisch quanti­
tative Ausbeuten liefert. Neuere Versuche haben ge­
zeigt, daß man mit Nucleinsäure-haltigen Rohextrak­
ten an der DEAE-Sephadexsäule gleichgute Tren­
nungseffekte erzielen und somit auf die verlustreiche
Fällung m it Protaminsulfat verzichten kann 10.
Bei der Säulenchromatographie der Mucopeptid­
hydrolasen wurde die Muco-Endopeptidase in drei
verschiedenen Peaks eluiert, wogegen die Glucosaminidase und die D-Alanin-Carboxypeptidase keine wei­
tere Auftrennung zeigten. Die Ursache für diese In ­
homogenität der Endopeptidase ist noch unbekannt.
A m wenigsten wahrscheinlich dürfte eine „Ver­
schleppung“ des Enzyms an der Austauschersäule als
Folge von unkontrollierten Adsorptionseffekten sein.
11 T h . W
ie l a n d
[1962].
u
.
G.
P
f l e id e r e r ,
Angew. Chem. 74, 261
Eine Erklärung wäre das Vorhandensein von Isozymen, wie sie auch schon in anderen Fällen durch
Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex nachge­
wiesen werden konnten n ’ 12. Die Charakterisierung
der drei Endopeptidase-Fraktionen als Isozyme wird
aber erst möglich sein, wenn mehr über die Identi­
tät der durch sie erhaltenen Mucopeptid-Abbaupro­
dukte und über reaktionskinetische Daten bekannt
ist.
In dem beschriebenen Reinigungs- und Tren­
nungsversuch sind nur vier der in E. coli B nachge­
wiesenen fünf Mucopeptidhydrolasen behandelt wor­
den. Das Lysozym wurde vorerst nicht in Betracht
gezogen, da sein quantitativer Nachweis mit Hilfe
des aus C 4 darstellbaren C 6-Dimeren noch zu kost­
spielig ist. In früheren Versuchen war das Lysozym
qualitativ im Sediment der Fällung mit 50% gesät­
tigtem Amm onium sulfat (S 50) und nach der Säu­
lenchromatographie in der Fraktion I beobachtet
worden. Ob darüber hinaus geringe Lysozym-Ver­
unreinigungen auch in den Fraktionen II — IV vor­
handen waren, konnte bis jetzt nicht einwandfrei
festgestellt werden. Wenn auch quantitativ nicht ins
Gewicht fallend, so sind solche Lysozym-Aktivitäten
u. U. doch nicht zu vernachlässigen, da Untersuchun­
gen über die W irkung der anderen Mucopeptid­
hydrolasen an intakten Stützmembranen schon bei
Spuren von Lysozymbeimengungen sinnlos werden.
Isolierte Stützmembranen zerfielen z. B. bei Inkuba­
tion m it der Enzymfraktion IV in elektronenoptisch
nicht mehr nachweisbare Bruchstücke (Fußnote ***),
obwohl der Trübungswert der Suspension praktisch
konstant blieb. Auch waren nach der Inkubation
keine Ninhydrin-positiven Verbindungen mit den
chromatographischen und elektrophoretischen Eigen­
12 E. D. W
[1963].
achsm uth
u
.
G.
P
f l e id e r e r
.
Biochem. Z. 336, 545
964
M U C O P E P T ID H Y D R O LA S E N IN ESCHERICHIA COLI B II
schäften eines der bekannten Mucopeptide nachzu­
weisen. Dies läßt den Schluß zu, daß in der Frak­
tion IV ein Enzym enthalten war. das einen Abbau
der Stützmembran in relativ große Bruchstücke be­
wirkt. Die Auflösung der Stützmembran durch eine
lysozymfreie Fraktion IV wäre insofern von grund­
legender Bedeutung, als die in ihr enthaltene MucoEndopeptidase das Mucopolymer in langkettige
Polymere aus C 6-Untereinheiten zerlegen sollte1,
für welche die oben genannten Eigenschaften der
Stützmembran-Bruchstücke durchaus zutreffen könn­
ten.
Die Muramylamidase ist nach allen bisher vorlie­
genden Versuchsergebnissen fest an die Zellwand
der Bakterien gebunden. W ir haben Hinweise da­
für, daß sie dort aus dem ebenfalls unlöslichen
Mucopolymer Tri- und Tetrapeptide von der Art der
Peptidseitenketten in C 5 und C 6 abspalten kann.
Es wäre aber verfrüht, auf Grund dieser Beobachtung
13
P.
Microbiol. 16, 184 [1957].
IV. Intern. Congr. Bio­
chem., Wien 1958. Vol. X III — Colloquia, p. 365.
W . W e i d e g , H. F r a n k u . W . L e u t g e b , J. g e n . Microbiol. 30.
127 [1963],
14 G.
15
M itc h e ll u.
T o e n n ie s
u.
J.
M o y le ,
G . D.
J.
gen.
die Muramylamidase bereits als „Autolysin“ be­
zeichnen zu wollen, weil in isolierten Zellwänden
schon wiederholt strukturgebundene Autolysine ge­
funden worden sind 13_1°.
Die in E. coli B vorhandene Muramylamidase
ist in ihrer biologischen Funktion sicher nicht mit
der von G huysen 16,17 beschriebenen Amidase in
Kulturfiltraten von Streptomyces albus zu verglei­
chen. Bei ihr handelt es sich um ein Ausscheidungs­
produkt der Zellen, während die Muramylamidase
in den E. coli-Zellen vielleicht eine wichtige Aufgabe
im Zellwandstoffwechsel erfüllt und nicht ins K ultur­
medium abgegeben wird.
Fräulein R e n a t e P a c k u l a t hat auch hier durch ihre
fleißige und gewissenhafte Mitarbeit viel zum Gelingen
der Versuche beigetragen. Herrn Professor G. P f l e i d e ­
re r
(Frankfurt) möchte ich an dieser Stelle noch ein­
mal für die mir gewährte Gastfreundschaft in seinem
fnstitut danken, wo ich midi über neuere Methoden zur
Enzymtrennung informieren durfte.
16
Shockm an,
17
J. M. G h u y s e n , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 40,
473 [I960].
J. M. G h u y s e n , M. L e y h - B o u i l l e u . L . D i e r i c k s , Biochim.
biophysica Acta [Amsterdam] 63,286 [1962],