Diplomarbeit

Thema:
durchAnwendungmodemer
von Mikromethoden
Optimierung
nalylk von manzenschutzmifteln
zu Rückstandsa
Extnt<tionstechniken
Diplomarbeit
TechnischeUniversitätDresden
Fakultätirathematikund Naturwissenschaften
Chemie
Fachrichtung
lnstitutfür Lebensmittelchemie
vonClaudiaSchädler
eingereicht
in Burg
geb.am 30.09.1971
Gutachter:
Prof.Dr. KarlSpeer
Dr.Joachiml\4oede
Betreuer
Prof.Dr.KarlSPeer
Moede
Dr.Joachim
Dresden,den 01.08.1996
1 Einleitungund Problemstellung
desMenschenSiespielenin der Nahrungskette
sinddie Hauptnahrungsquelle
Pflanzen
der Lebewesen,in der am Ende oft der l\renschsteht, eine große Rolle [,lit der
schnellen Zunahme der Weltbevölkerung wurde es erforderlich, die
zu sichem und zu erhöhen Durch Krankheitseneger'
Nahrungsmittelerzeugung
Schädlingeund die Konkunenzmit Unkräuternkann es iedochzu großenVerlustenvon
kommen.
Emtegütem
auch Pestizide
Erträge können durch die Anwendungvon Pflanzenschutzmitteln'
der
genannt,gesichertoder verbessertwerden Oft ist damit eine Qualitätszunahme
steht [40]'
Erntegüterverbunden,die im SinneeinerbestimmtenVeörauchererwartung
Form' zum Beispielals
Die Anwendungvon Pestizidenerfolgtin verschiedener
Stäubemittel,Streumitteloder Flüssigkeit.UnabdingbareForderungensind dabei die
WartezeitenzwischenletzterAnwendungund
Einhaltungvon Anwendungsvorschriften,
Maß,
der Anwendungauf das unbedingtnotwendige
Erntesowiedie Beschränkung
damitPestizidrÜckständeinLebensmitteInundFuttermitteInsogeringwiemögIich
sinddurchdas Gesetzüber
zum Schutzdes Verbrauchers
Grundlagen
Dierechtlichen
und sonstigen
l\'ilitteln
kosmetischen
Tabakezeugnissen,
den Verkehrmit Lebensmitteln,
vom 8 Juli 1993im
(LMBG)in der Fassungder Eekanntgabe
Bedarfsgegenständen
gegeben Die zur Zeit gesetzlich
mit Höchstmengenverordnungen
Zusammenhang
Pflanzenschutz- und
bindende Verordnung über Höchstmengen an
und sonstigenMitteln in oder auf
Düngemitteln
Schädlingsbekämpfungsmitteln,
- RHmV)
(Rückstands-Höchstmengenverordnung
undTabakerzeugnissen
Lebensmilteln
durchdieAndVOv T lvlätz1996,in Kraft[44]
1994,geändert
tratamI September
liegenim
in Lebensmitteln
undihrenUmwandlungsprodukten
DieGehaltean Pestiziden
von o 01 bis 1 mgikg Bei der RÜckmeist in der Größenordnung
Spurenbereich,
kommt es daher daraufan' äLlßerstgeringeMengenneben einem
standsanalyse
zu
enormen Überschuß natürlicherBestandteiledes UntersLlchungsmateflals
identifizierenund quantitativ zu bestimmen Dafür bestehen optlmierte
Analysenverfahren.
z. B. Extraktion,Flüssiglm Prinzipbeinhaltendiese meistenswenige Arbeitsschritte,
Flüssig-Verteilung,Säulenchromatographie(SC), Gelpermeationschromatographie
(GC),Hochdruckflüssigkeits(GPC)und ldentifizierung
durchz. B. Gaschromatographie
(DC)[40] Dabeihandeltes
(HPLC)oder Dünnschichtchromatographie
chromatographie
einegrößereGruppevon Pestizidenerfaßt
mitdenengleichzeitig
sichum Arbeitsweisen,
sind zum Beispielin
aber auch Einzelmethoden
werdenkann. DerartigeMultimethoden,
beschrieben
oderderAOAC-Methodensammlung
[1, 11].
derDFG-Methodensammlung
nimmt dabei die ProbenDen größten Zeitaufwandin diesen Analysenmethoden
ein Sie sind
und die Probenreanigung,
vorbereitung,spezielldas Extraktionsverfahren
verbunden
auchoft mit einemhohenVerbrauchan organischenLösemitteln
zur
für die organischeSpurenanalytik
Seit kuzer Zeit stehenmodemeExtraktionsgeräte
Verfügung, die eine zeit- und kostensparendeAlternativezu
seinkönnen.
Extraktionsmethoden
klassischen
(engl.:acceleratedsolventextraction- ASE) und
Lösemittele)draktion
Die beschleunigte
Extraktion unter Druck stellen solche modemen
die mikrowellenassistierten
dar. Dabei erfolgtdie Extraktionder Wirkstoffeaus der Matrixin
Extraktionstechniken
Bedingtdurchden apparativen
und Übeldruck.
kurzerZeit durcherhöhteTemperatur
und den dadurchzur VerfÜgungstehendenkleinen
Aufbau der Extraktionsgeräte
zur Extraktion Der
erfolgteine Minimierungdes Lösemittelbedarfs
Extraktionsgefäßen
Formvor als
erhalteneExtraktliegt in konzentrierterer
durchdiese Extraktionsverfahren
oderSoxhletextraktionsverfahrens
desUltraturraxz.B.beiVerwendung
wie die Flüssig-FlüssigAufarbeitungsschritte
Deshalbkönnen sich nachfolgende
auszeichnen
Jedoch
des Lösemittelbedarfs
Verteilung
durcheineweitereVerringerung
durchEinfluß
InhaLtsstoffe
daß ein höhererAnteilpflanzlicher
bestehtdie lvlöglichkeit,
in der
von Temperaturund Druck mitextrahiedwird, was weitere Reinigungsschritte
nach sich ziehen könnte Durchdie automatischeSteuerungbzw
Extraktaufarbeitung
Extraktionvon mehrerenProben kann man einen höheren
durch gleichzeitige
bedeutsamist Bisher wurde in
erreichen.der betriebswirtschaftlich
Probendurchsatz
größtenteilsnur die Extraktionvon
und Applikationsnoten
Literaturveröffentlichungen
beschneben.
in Boden-oderSedimentproben
Rückständen
1 2 ,1 6 ,1 7, 2 6 , 3 3 ,3 4 1
3
Ziel der Arbeitwar es daher,die Eignungin bezug auf Extrahieöarkeit,Präzisionund
Extraktionstechniken
zur Extraktion
von automatisierten
Richtigkejtsowie Praktikabilität,
von Pestizidnickständenin verschiedenenPflanzenmatnzeszu testen. Um die
fesEustellen,wird die UltratunaxWirksamkeitdieser neuen Extraktionsverfahren
(ASE)
Lösemittelextraktion
Extraktionder klassischenlrethodedurchdie beschleunigte
ExtraktionunterDruckersetzt
bzw.durchdie mikrowellenassistierte
Es ist zu untersuchen,ob die zu bestimmendenWirkstoffedurch den Einfluß von
erhöhter Temperaturund Druck und die dadurch auftretendenkinetischenEffekte
verändertwerden können.Dabeisoll die Effizienzder modemenExtraktionstechniken
(Ultratunaxextraktion)
der zu
mit der Effizienzdes klassischenExtraktionsverfahrens
bestimmendenSubstanzenmit Hilfe von aufgestocktenProben (Wiederfindungsrate)
14CradioaktivmarkiertenWirkstoff behandelteGewächshausproben
und durch mit
(Extrahieöarkeit) verglichen werden. Weiterhin ist zu prüfen, inwieweit eine
Verkleinerungder Probengröße,bedingt durch den apparativenAufbau der
Ergebnisseführt. In Abhängigkeitdes durch die
zu reproduzierbare
Extraktionsgeräte,
gewonnenenExtraktessoll eine mÖglicheOptimierungder
neuen Extraktionstechniken
erfolgen.
Aufarbeitungsschritte
'15
2.3 Allgemeiner Übeölick zur Rückstandsanalytik
Ein Analysenverfahrenwird immer nach der Fragestellungder Untersuchung
Eigenschaften
einer Substanzbekannt,
ausgewählt.Sind chemischeund physikalische
zur
auf eine möglichstoptimaleProbenaufaöeitung
so kann die Rückstandsanaiyse
ausgerichtetwerden. Solchen Einzelmethoden
Abtrennung der Matrixbestandteile
gegenüber,
mjt denengleichzeitig
eine
oder Multimethoden
stehenSammelmethoden
größereAnzahlvon Substanzenerfaßtwerdenkönnen.
Aöeitssschrjtten.
Sie
DieseMethodenbestehenim Prinzipausimmerwiederkehrenden
der Menge
wie derWahldes Extraktjonsmittel,
sichoft nurin Einzelheiten
unterscheiden
ln
der Elutionsgemische
oder der Zusammensetzung
und Aktivitätder Säulenfüllung
in schematischstark
einer Rückstansanalyse
Abbildung2-2 ist der Arbeitsablauf
vereinfachter
Formwiedergegeben
1401.
R6iniguns
Abb.2-2 Schema der Rückslandsanalysevon Pflanzenmatedal(aus [40])
2.3.2.4MikrowellenassistierteExtraktionunter Druck
1- Mikrowellenextraldionslechnik
ist vergleichbarmit der Soxhlet-Extraktion,
wobei das
Die lvlikrowellen-Extraktion
Herauslösender Rückständeaus der l\ratrixdurch Erhitzeneines Lösemittelsmit Hilfe
muß über ein permanentesDipolmoment
von Mikrowellenedolgt.Das Extraktionsmittel
eMärmt werden zu können. Soll eine Probe von
verfügen,um durch lvlikrowellen
geringeremWassergehaltmit einem unpolaren Lösemittelwie n-Hexan extrahierl
z.B.AcetonoderWasser,zugesetztwerden.
werden,mußein polaresLösemittel,
richtet sich aber auch danach, inwieweit die zu
Die Wahl des Extraktionsmittels
analysierenden Substanzen mit genngst möglichen Anteilen von störenden
werdenkönnen.
herausgelöst
Matrixbestandteilen
wird in Abhängigkejt des
Durch Einsatz von geschlossenenExtraktionsgefäßen
ezeugt, was eine deutliche
ein Überdruckim Extraktionsgefäß
Lösemitteldampfdruckes
des Extraktionsmittels,
ähnlich der beschleunigten
Siedepunktserhöhung
in flüssigem
zur Folge hat. Das Lösemittelbleibtgrößtenteils
Lösemittelextraktion,
Zustand[8].
zur Extraktion
von organischen
Verbindungen
Überdie NutzungvonMikrowellenenergie
wie Boden,Kom und anderenLebensmitteln
wurdevon
aus festenProbenmatrizes
von 1986berichtet
undSalgoin einerPublikation
Ganzter
[19].
Haushaltmikrowellenofen
die zu extrahierende
Dabeiwurdein einemherkömmlichen
wiederholt
30 Sekundenmit l\rikrowellen
bestrahlt.
Diese
Probe-Lösemittel-Suspension
für polareVerbindungen
effizienter.
l\rethodewar im Vergleichzur Soxhle!Exkaktion
um Organochlor-Pestizide
von
Onuska und Terry nutzten die Mikrowellenenergie,
zu extrahieren.
Durch den Einfl!ß der Mikrowellen
wurde keine
Sedimentproben
der Ve.bindungen,
mil denen die Probenaufgestockt
bzw. Veränderung
Zerstörung
warensehrzufriedenstellend
DieWiederfindungsraten
wurden,beobachtet.
[31].
verschiedener
Lösemittel
und verschiedener
Voluminawurdevon
DasAufheizverhaiten
Es zeigtesichdabei,daß beieinemLösemittelvolumen
von
Lopez-Avila
[26]untersucht.
des
wenigerals 30 ml die Aufheizzeitbis zum Erreichender lvlaximaltemperatur
wirken sich
Lösemittelsdeutlichlänger ist. Auch bestimmteLösemittelgemische
aus.
auf dieAufheizzeat
ungünstig
auch zur der Bestimmung
von PCBS
Lopez-Avila
setztedie llikrowellen-Extraktion
(trocken,
Zusammensetzung
naß)ein
Bödenunterschiedlichef
24
der Wiederfindung
von PCBSüberdie Bestimmung
bei
Dabeiwurdeu.a.dasVerhalten
unterschiedlichen Extraktionstemperaturenund -zeiten untersucht 1271. Die
(Aceton/ Hexan1:1)
von Arochlor10'16und 1260wurdeim Lösemittel
Wiederfindung
ohne lratrix bestimmt.Dabeizeigtesich,daß bei niedrigerTemperatur(50 "C) höhere
eneicht werden.Wird die Temperaturauf 145 'C
Werte bei längererExtraktionszeit
erhöht, ist eine küzere Extraktionszeitvorteilhaft. Matrixeffekte können die
Wiederfindungenanhebenoder senken,was durch die Dotierungauf verschiedene
Böden festgestelltwurde. Bei der Extraktionvon realen Bodenprobenwurden gute
vonArochlor1248zwischen
Soxhletund
der Rückstandsergebnisse
Übereinstimmungen
(GC-ECD,
auch bei verschiedenenBestimmungsverfahren
[,ilikrowellen-Extraktion
ELISA)gefunden.
Extraktionwurdeauchauf ihre Eignungfür die Analytikvon
Die mikrowellenunterstülzte
von Soxhletuntersucht.
Zum Vergleich
PCBSund PAKSaus Bodenund Klärschlamm
wurde in den bestehendenLaboNerfahrenlediglichdie
und Mikrowellen-Extraktion
bei
gewechselt.Dabeikonntenmitdem neuenExtraktionsverfahren
Extraktionsmethode
der Lösemittelmenge
auf etwa die
deutlichveningertemZeitaufwandund Reduzierung
vergleichbare
Hälftefür PCBsdeutlichbessereund für PAKsmit der Soxhlet-Extraktion
ezielt werdenI161.
Extraktionsausbeuten
mit der Soxhlet-Extraktion
wurdedie l\,ilikrowellen-Extraktion
ln weiterenLJntersuchungen
polycyclischen
in Boden
Kohlenwasserstoffen
von 16 verschiedenen
zur Bestimmung
Dabeizeigtesich zLlmeinen,
und Effizienzverglichen.
ihrerPraktikabilität
hinsichtlich
eine weitaushöhereEffizienzaufweistals die Soxhle!
daß die Mikrowellen-Extraktion
Dichlormethandurch Aceton
Extraktion.Wird das konventionelleExtraktionsmittel
weiter[10].
ersetzt,so erhöhtsichdie Extraktionsausbeute
daß die mikrowellenassisherte
In anderenVersuchenwurde ebenfallsfestgestellt,
von
z. B. für Rückstandsanalysen
unterDruckfür Routineumweltanalysen,
Extraktion
ist.
PAKsin ft4eeressedimentproben
[9] undBöden[37],geeignet
25
2. MikrowellenextraKionsinstrumentieruno
ssvstemsund dessenBestandteile
Aufbaudes Mikrowellenextnktion
Extraktionunter Druckwurde ein Systemder FirmaCEI/
Für die mikrowellenassistierte
eingeseizt.DiesesSystemaöeitet mit einermaximalenLeistungvon 950 Watt,wobeije
gerbeitet
auch mit einer geringeren lvlikrowellenleistung
nach Extraktjonsproblem
'1%
Abstufungen).
werdenkann(bis100o/oin
aLlsTeflonmil einemmaximalen
könnenbis zu '12Druckbehälter
Auf einemDrehtelier
Aöeitsdruckvon 14 bar und einem Volumenvon 100 ml eingesetztwerden.Die
beträgt 2AO "C. Zur lvlessungder Etraktionspararneter
maximaleArbeitstemperatur
als Referenzgefäß.
dlentein Extraktionsgefäß
steueöar. Zur
Die Extraktion ist über ein Temperatur- / Druckkontrollsystem
Glasfasertemperatursonde,
wird eine mikrowelienunempfindliche
Temperaturmessung
fluoresziert,in den
an deren Spitzesich ein Kristallbefindei,der temperaturabhängig
wird über einenmit
geführt.Der lnnendruck
des Referenzbehälters
Referenzbehäiter
(PFA) an das Druckkontrollsystem
Wasser gefülltenSchlauchaus Perfluoralkoxy
(Abb 2.5)[81.
werrergeleitet
I
LJ
Fibe.opric
eresslre ffiremperarure
Lne
Probe
VesseL
CPU Board
lvlanual
To
Pr nter
or PC
Signall
lnlet Filting
Pressure
Transducer
2-5 SchematischeDarstellungdes TempeRtur / Druckkantrcllsystems(van CEM)
26
bestehtaus einem chemischresistentenInnenextraktionsgefäß
Ein Extraktionsbehälter
in eine
mit einerAbdeckungaus Teflon.Vor der Extraktionwirdjedes Extraktionsgefäß
druckfeste Ummantelung aus Ultem (Polyetherimid)eingesetzt und handfest
verscnlossen.
von mehr
vor UberdrÜcken
aus Teflonschütztdas E;traktlonsgefaß
EineBerstscheibe
als 14 bar. Durch ZeneißendieserBerstscheibewird der Uberdruckabgebautund die
aufgefangen,aus dem sie nach außen geleitet
in ein Sammelgefäß
Lösemitteldämpfe
werden.
und eines ReferenzAbbildung 2-6 stellt den Aufbau eines Extraktionsgefäßes
dar.
extraktionsgefäßes
I
a
b
rolle
Abb.2-6(a) Aufbau eines Extraktiansgefäßesohne Temperatur' und Druckkont
und Druckkantrolle
mit Tempemturlb) Aufb au ei nesL \träkr,onsgeläßes
(ausßl
27
Der ExtraktionsDrozeß
bestehtausfolgendenHauptschritten:
Der Extraktionsprozeß
Probe(max bis zur
mit der zu extrahierenden
Füllendes Exvaktionsgefäßes
1.
Hälfte)und Bedeckender Probemit Lösemittel(max.50 ml)
2.
3
der Zelle,Einsetzenin den Drehteller,Verbindungmit dem
Verschließen
gefäßherstellen
Überlauf
Verbindungmit Temperatur-und
in das Extraktionsgerät,
Einbaudes Drehtellers
herstellen
im Referenzgefäß
Druckkontrollsystem
Aufheizzeit
5.
(timeat paramete0
StatischeExtaktionszeit
6.
Abkühlphase
Die zu extrahierendeProbe wird maximal bis zur Hälfte des Extraktionsgefäßes
solltehöchstens50 ml betragen,dle
eingebracht.Das Volumendes Extraktionsmitttels
der
Probe soll mit Lösemittelbedecktsein Nach dem handfestenVerschließen
Extraktionsgefäßewerden die Behälter in den Drehteller eingesetzt, mit dem
eingebaut'Die
das Mikrowellensystem
ve.bundenund der Drehteller'in
Auffanggefäß
(Abbildung
2-7)'
istheQUstellen
undDruckkontrollsystem
zumTempefaturVerbindung
(
,,I
fr
p6l
12 Extmktiansgefäßen(aus
Abb.2-7 Prabenkarusell
2A
Da Temperatur
und Druckvoneinander
abhängige
Größensind,regeltdie integrierte
Temperatur-und Drucksteuerungautomatischdiejenigeder beiden Größen, deren
Sollwertdas Gerätzuersterreicht.Empfehlenswert
ist die Regelungder Extraktionüber
den Temperaturparameter,
d.h. die Aufheizzeitist bei bei maximalerDruckvorgabe(14
bar)durchdie vorgegebeneExtraktionstemperatur
bestimmt.
Die Zeit bis zum Erreichender Extraktionstemperatur
ist auch abhängig von der
Zusammensetzung
und l\,/tenge
des Extraktionsmittels.
Veöesserte Extraktionsgeräte
verfügenübereineTemperatur-bzw.Druck-Zeit-Steuerung,
dieeine genaueFesflegung
der Aufheizzeitermöglicht[8]. Die statischeExtraktionszeit
entsprichtder tatsächtichen
Extraktionszeit
nachErreichender vorgegebenen
Parameter.
2.3.3 Extraktaufarbeitung
Der nach2.3.2gewonnene
Primärextrakt
enthältzwardie gesuchten
Rückstände,
aber
auch einenenormenÜberschuß
an natürlichen
Inhaltsstoffen
des Probenmaterials,
so
daßsichnachderExtraktion
eineExtraktreinigung
anschließen
rnuß.Oftwirdder Extrakt
oder ein aliquoterTeil davon mit einem UberschußWasserund Kochsalz-Lösung
verdünntund mit Dichlormethan
ausgeschüttelt.
Wie intensivder Extraktim Anschluß
gereinigt
werdenmuß,hängtmeistvomabschließenden
Bestimmungsverfahren
ab. Zur
Abtrennungder Rückständevon den Begleitsubstanzen
gibt es verschiedene
Möglichkeiten Zu den wichtigsten Reinigungsverfahren
gehören die Gel
permeationschromatographie
unddleSäulenchromatographie
2.3.3.1 Säulenchromatographie
Mit Hjlfeder Säulenchromatographie
könnenBegleitsubstanzen
vom zu analysierenden
Rückstandabgetrennt
werden.Die Säulenchromatographie
kann für lrultimethoden
jedochnurzurAnalytik
angewandt
werden,
vonSubstanzen
ähnlicher
Polarität.
Oie Trennungan Adsorbentien
durchSäulenchromatogrcphie
wird beeinflußt
von der
sowieder lvlenge
Qualitätund Teilchengröße
undAktivität
desAdsorbens,
der relativen
Luftfeuchte,
der Polaritätund Zusammensetzung
des Elutionsmittels,
der Aktivierung
bzw Desaktivierung
desAdsorbens
durchdasElutionsmittel,
derTempe.atur
undder Art
der Rückstände
undBegleitsubstanzen
Als Adsorbens kann je nach Trennproblemu.a. Aktivkohle,Magnesrumoxro,
Aluminiumoxid
oderKieselgel
vefwendet
werden
35
3 ExperimentellerTeil
zur Bestimmungvon PestizidZiel dieserArbeitwar es, bestehendeAnalysenverfahren
zu optimieren.Dabei sollte das LaborextraktionsRückständenin Pflanzenmaterial
basierendauf der 51g-Methode[11] durch neue
verfahren (Ultraturrax-Extraktion)
(ASEund l\rikrowellen-Extraktion)
ersetztwerden.
Extraktionsverfahren
Exraktion unter Druck und der
Bisherwurde der Einsatzder mikrowellenassistierten
von Boden-Sediment-oder
Schlammproben
in
ASE größtenteilsnur für Umweltanalysen
Deshalbsolltenundie EignungdieserExtraktionstechniken
für
der Literaturbeschrieben.
Pflanzenmaterial
sowie die Einflüssedes
von verschiedenem
die Rückstandsanalyse
sowjedie quantitative
die nachfolgende
Aufarbeitung
Probenmaterials
auf die Extraktion,
werden.
Bestimmunguntersucht
sollte Endosulfan und
Zum Vergleich der verschiedenenExtraktionsmethoden
(Tab.2-l)in der wäßrigenMatrix
Endosulfansulfat
als relativunpolareSubstanzen
werden(vgl.3.1).
von ca. 95 % [39] analysiert
Tomate-Frucht
mit einemWassergehalt
für miftelpolare
Substanzenzu
Um die Eignungder neuen Extraktionsmethoden
überprüfen, wurde ein Gerstensafenerund seine Metaboliten (Tab. 2-2) in
(vgl.3.2).Der
(Sproß,Stroh,Kom)analysiert
verschiedenen
Getreidewachstumsstadien
und Chlorophyllanteil,
Strohenthältkaum
Pflanzensproß
hat einenhohenWassergehalt
aus.
Wasser,Kornzeichnet
sichdurcheinenhohenStärke-undProteinanteil
an realen
Um die Extraktionseffizienzder verschiedenenExtraktionsmethoden
zu können,wurde der jeweilige
Pflanzenproben
ejnfachund schnelluntersuchen
'"C-lsotopenmarkiertMan spricht
Wirkstoffzur Behandlungder Pflanzenzusätzlichmit
oder ,,gealterten"
Rückständen.
bei einemderartigenVerfahrenauchvon ,,gewachsenen"
der spezifischen
und die Einbeziehung
Uber die Bestimmungdef Radioaktivität
(vgl.S. 32) konnteeinerseits
bestimmt
die Höheder Gesamtrückstände
Radioaktivität
werden(vgl.6.4.3.1,
die Extraktionsausbeute
exaktermittelt
werdenund andererseits
Arbeitsvorschrift
V)
währenddes gesamten
der Radioaktivität
Außerdemkann durch die Eilanzierung
der Gesamtanalyse
Analysenganges
eineleichteundschnelle
AussageüberdieQualität
getroffenwerden.Radioaktiv
hezustellen,ist jedoch mit
markiertes
Probenmalerial
einemhohen Kostenaufwand
verbunden,
und daher ist es meistnur in begrenzter
Mengeverfügbar.
zur Uberprüfung
der Analysenmethode
undder eigenenArbeitsweise
(Aufarbeitung,
der Wiederfindung
GC-Bedingungen)
wird deshalbdie Bestimmung
meistensmit unbehandelten
Kontrollproben,
die mlt der jeweiligzu analysierenden
Substanz
dotiertwird,vorgenommen.
bei Einsatz der neuen
Zur Optimierungund Beurteilungder Rückstandsanalyse
die
wurde aus o.g. Gründenzuerst mit dotiertenKontrollproben
Extraktionsverfahren
einschließlich
der Extraktion,bestimmt
für den gesamtenAnalysengang,
Wiederfindung
Probenmaterial(Kontrollprobe)mit
(Doppelbestimmung).
Dazu wird nichtbehandeltes
Substanzen(Wirkstoffund relevantelretabolite),wie in 6.4.2
den zu analysierenden
bzw. 6.5.2 beschrieben,dotiert und nach der Arbeitsvorschriftaufgeaöeitet. Die
Rückstände werden quantitativ bestimmt und mit der tatsächlich dotierten
Rückstandsmengeverglichen.Aus diesen Ergebnissenkonnte ermatteltwerden,
die Qualität der Gesamtanalyse
inwieweitdas jeweilige neue Extraktionsverfahren
zwischen 70 o/o und 120 o/o konnte
beeinflußt.Lagen die Wiederfindungsraten
die mit erhöhterTemperatur
geschlossen
werden,daß die neuenExtraktionstechniken,
und Überdruckarbeiten,zu keinerZerstörungbzw.Veränderungder zu analysierenden
führen.
Substanzen
mit den ermitteltenoptimalenParametemwurde
Die Effizienzder Extraktionsverfahren
das mit 1!CradioaktivmarkiertemWirkstoffbehandelt
nun anhanddes Probenmaterials.
nicht nur in freier Form vor, sondem
wurde,bestimmt.Hier liegendie Rückstände
eingeschlossen
in dieZellmatrix
chemisch
und physikalisch
könnennachrealerAlterung
gebundensein.Daherkönnendiese Rückstände
schlechter
oder an Zellbestandteile
extrahierbar
seinals beiAufstockexpementen[40].
Standardabweichung
spiegeltsichin der errechneten
DieGüteder Rückstandsanalyse
(relativeStandardabVariationskoeffizienten
von n - 1 Probenund des zugehörigen
ist für Doppelbeweichung)wider. Die Berechnungeiner Standardabweichung
stimmungennicht sinnvoll. Deshalb wurde zur Absicherungder optimalen
'"C markierte
Extraklionsparameter,
die auch später zur Extraktionfür gewachsene
genutztwurden,eine mehrmalige
Analysevon dotiertenKontrollproben
Ruckstände
durchgeführtWeiterhin konnte über die Bestimmungder Wiederfindungüberpnift
Finflußauf die Qualität
werden.inwieweit
der Einsatzder neuenExtraktionstechniken
nötig
des erzeugtenEndextrakteshat und ob zusätzlicheProbenaufarbeitungsschritte
sindbzw.optimiert
werdenkönnen
3.1 Bestimmungvon Endosulfanin Tomate
Endosulfan
ist ein breitwirkendesKontakt-und Fraßgift,das in einer Vielzahlvon
wird(vgl.S. 11).
angewendet
Kulturen
zumSchutzvorSchädlingsinsekten
In oder auf der Tomatenfrucht
beträgtdie zugelasseneHöchstmenge1 mg/kg,
alsGesamtEndosulfan
berechnet
[44]
41
3.'1.2.2Mikrowellenassistierte Extraktion unter Druck
mit dem Ultratunaxwurde nun durch den Einsatz
Das klassischeExtraktionsverfahren
ersetzt.LJmeinendirektenVergleichzur Ultratunax-Extraktion
des Mikrowellen-systems
(Aceton)optimiert.
Extraktionsmittel
zu erhalten.wurde zuerstmit dem konventionellen
Die Optimierungder Extraktionerfolgte über Temperatur,Zeit und Lösemittel Der
ist eine abhängigeGröße von der Temperaturund vom eingesetzten
Druckparameter
(ZusammenseEung,
Volumen).
Lösemittel
wurdenlaC radroaktivmarkierte
Zu einer schnellenBeurteilungder Extraktlonseffizienz
das mit radioaktivem
Wirkstoff
Substanzeneingesetzt.Jedochwar das Probenmaterial,
behandeltwurde, nur in begrenztemUmfangverfügbar.Außerdemist das Arbeitenmit
radioaktivenStoffen mit hohen Kostendurch die Synthesedes markiertenWrkstoffs
wurde deshalb vorab mit
veöunden. Zur Optimierungder Extraktionsparameter
dotierten,d.h. vor dem Analysengangmit der jeweils zu analysierendenSubstanz
aufgestocktenKontrollproben,gearbeitet.Über die Bestimmungder Wiederfindung
und ihr Einfluß auf die
konnten die jeweils gewählten Extraktionsparameter
beurteiltwerden.
Gesamtanalyse
Tomatenals Lebensmittelsolltenmit Rückständenvon Endosulfanwenig kontaminiert
sein- Deshalb wurden zur Methodenoptimierungfür die Bestimmung der
Aufstockungender
von Endosulfan und Endosulfansulfat
Wiederfindungsrate
um auchnochsehr
vorgenommen,
im Bereichder Bestimmungsgrenze
Kontrollproben
geringe Kontaminationnachweisenzu können. Man rechnet beim Arbeitennah der
des zu
da hier das Verhältnis
Bestimmungsgrenze
mit den meistenSchwierigkeiten,
am größtenist und sich Verlustein
zum MatrixÜberschuß
Rückstandes
analysierenden
der Extraktaufaöeitungauf die Quantifizierungder in Ultraspurenvorliegenden
für Endosulfan und
Substanzen am stärksten auswirkt. Die Bestimmungsgtenze
beträgt0,01mg/kg.
in Tomate-Frucht
Endosulfansulfat
erfolgtebei einer Dotierhöhevon 0,02 mg/kg Grund dafür
Die Methodenoptimierung
aus verschiedenenFeldversuchen
war, daß zur OptimierungKontrollmaterial
teilweiseStörpeaksbei der
herangezogen
wurde,in dem bei einigenVorversuchen
gaschromatographischen
wurden.Diesesindauf coeluierende
Bestimmung
festgestellt
in der Kontrollprobe
von Endosulfan
aber auch auf Rückstände
Matrixkomponenten,
zurLrckzuführenSolche Rückstände in Konttollproben sind nie grundsätzlich
auf die PflanzedurchWind auf
auszuschließen.
da z.B.der WirkstoffbeimAufbringen
Aufnahme(Wasser/
abdriftenoder durchanderweitige
nebenstehende
Kontrollfelder
gehtmanjedochdavonaus,daß
Boden)in die Pflanzegelangenkann.Grundsätzlich
zu erwartenist.
keinRückstandin der Kontroliorobe
43
Tab.3-2 MittlercWiedeändungnachMWE bei 120 'C20 nin/30 ml Aceton(n = 2)
pEndosulfan Endosulfan
Endosulfansulfat
Mittelwertder Wiederfindungin o/obei Dotierhöhevon0.02mq/kq
98
115
104
in %
GC-Response
103
122
103
(vgl.2.3.4.1)sinddie ermittelten
der GC-Response
Wiederfindungen
UnterBeachtung
für die zu bestimmenden
Substanzenmit denender erstenAnalysevergleichbar.
Es läßt
sich daraus schließen,daß Endosulfanund Endosulfansulfat
auch nach 2o-minütiger
Extraktionbei 120 "C chemischstabilsind bzw.durchkinetischeEffektenichtverändert
werden.
wurde geprüft,ob eineweitereReduzierungdes
In eineranschließenden
Untersuchung
zu erhalten.Daher
Extraktionsmittels
möglichist, um trotdem gute Wiederfindungen
wurden nur noch 20 ml Aceton zur Extraktioneingesetzt.Der Temperatur-und der
da die Extraktionbei 100'C
Zeitparameter
der erstenAnalysewurdenbeibehalten,
schonenderund eine Extraktionszeit
von 15 min ausreichend
ist.Wichtigist nur, daß die
Probevollständigmit Lösemittelbedecktist Aus der Tabelle3-3 ist zu entnehmen,daß
die Extraktionauch mit 20 ml Acetonerschöpfendist d.h. es erfolgtkeineAbsättigung
desgeringeren
Lösemittelvolumens.
Iab. 3-3 Mittlee WiedeiindungnachMWEbei 100'C/ 15 nin20 ml Aceton(n = 2)
p-
Endosulfansulfat
Endosulfan Endosulfan
Mittelwertder Wiederfindung in % bei Dotierhöhe von 0.02 mo/ko
90
96
'101
GC-Responsein o/o
101
98
107
lm anschließenden
Versuchsollteuntersucht
werden,wiedie Extraktion
bei Proben,die
(,,gealterte
Rückstände
enthalten
durchpraxjsübliche
Behandlung
Rückstände"),
mitden
für dotierteProbenals optimaleNviesenen
Extraktionsparametern
verläuft.DerWirkstoff,
1!C
mitdemdie Probenbehandelt
radroaltrv
wurden,lag in
markierler
Formvor,so daß
über die Bestimmungder Radioaktivität
durch Veraschungeiner Teilprobeder
Gesamtrückstand
festgelegtund die Extraktionsausbeute
über die Radioaktivität
des
Primärextraktes
ermitteltwerdenkonnte(vol 6.4.31. VorschriftV).
42
Um Fehler bei der Bestimmungder Wiederfindungvon dotiertenSubstanzenauf
geringzu halten,darf der Blindwertin der Kontrollprobe
nichtüber30 %
Kontrollmaterial
der Dotierhöheüberschreiten.DieseVoraussetzungwar nicht grundsätzlichgegeben
Dotierhöhe
von 0,02 mg/kgfür die
(vgl.z.B.Tab.6-6,6-7),so daß eineabschließende
gewähltwurde.
der optimalenExtraktionsparameter
Festlegung
erfolgteeine Uberpnifungder gerätespezifischen
Vor Beginnder l,Iethodenoptimierung
Materialien des lvikrowellensystemsauf Reinheit. Dazu wurden die TefloneinschließlichAbdeckungmit Aceton gespült und bei 200'C im
Extraktionsgefäße
Extraktionsgefäße
wurden
über Nachtgetrocknet.Die so vorbereiteten
Trockenschrank
wurde
mit Acetongefülltund einerExtraktion(100'C/15min) untezogen.Anschließend
auf Störpeaksüberprüft.Es wurde keine
das Lösungsmittelgaschromatographisch
Verunreinigung
festgestellt.
erfolgteauf der Basis einer
Extraktionsparameter
Die Wahl der zunächsteingesetzten
zur
persönlichenl\ritteilungvon Henn Schöner [38] und Literaturveröffentlichungen
(PCKs Gesamtkohlenwasserstoffe
auf Benzinbasis)
in
Analytikvon Rückständen
Pestiziden
in Boden[7, 1B].
sowiechlorierten
Boden,Sedimenten
undSchlamm
Extraklionsparameter:
Temperatur
100'c
StatischeExtraktionszeit:
1 5m i n
Extraktionsmittel:
30 mL Aceton
(vgl.Vorschrift
ll in 64.3.1)wurdenalle drei dotierten
Nachder Extraktaufarbeitung
mit über 90 % in einer
Endosulfansulfat)
Rückstände(&- und 0-Endos'.rlfan,
(vgl.'l.Analyse
in 6.4.4.2).
Doppelbestimmung
wiedergefunden
von der
Da bei höherenTemperaturen
einenoch bessereAblösungdes Rückstandes
Erhöhung
der LösemittelMatrixerfolgenkann(2. B. durchPlatzender Pflanzenzellen,
beiüber100'C
Substanzen
viskosität)
derzu analysierenden
[35],wurdedasVerhalten
auf 120'C unddie Extraktionsuntersucht.
DazuerhöhtemandieExtraktionstemperatur
fü. chloriertePestizide
zeit um weitere5 Minuten.GleicheExtraktionsbedingungen
von chlonerten
wurden in der Applikationsnote
E009 [7] zur Rückstandsanalyse
Pestiziden
ausBodenangewandl
DleE.gebnisse
der Doppelbest'mmung
sindin Tabelle3-2zusammengefaßt.
44
14C markiertemWirkstoff behandelten
Parallel zur Analyse von gewachsenen,mit
Proben wurde eine Wiederfindungzur Absicherungder RÜckstandsanalysenqualität
bestimmtsowie eine unbehandelteKontrollprobeanalysiert.DaeDotierhöheder zu
analysierendenSubstanzen wurde so gewählt, daß sie ungefähr die gleiche
wie in der gewachsenenProbedarstellte(0,1 mg/kg).Die Extraktion
Rückstandshöhe
durchgeführt.
wurdemit20 mlAcetonbei100'Cund15 Minuten
(n:3) war schonbei einmaligerExtraktionmit
Extraktionseffizienz
Die durchschnittliche
Eine Erhöhungder Temperatur
99 % höher als die Effizienzder lJltratunaxextraktion.
(bei eventueller
bei höherer
Sättigungdes Lösemittels
oder des Lösemittelvolumens
Extraktion
war dahernichtnotwendig.
sowieeinenochmalige
Rückstandskonzentration)
nachVorschriftll (vgl.6.4.3.1)aufgearbeitet
Nachder Extraktionwurdeder P.imärextrakt
Die Ergebnisse
sind in Tabelle3-4 dargestellt.
und die Rückständequantifiziert.
-fab.
nachMWE bei 100'C/
in Tomale-Ftucht
Rückstandshöhe
3-4 Durchschnittliche
15 min20 ml Acetonh = 3)
p-
''C markierterRückstandin
mg/kgin gealtertenProben
(lvlittelwert)
Wiede.findung
in % für den
Gesamtanalysengang
Dotierung
der Kontrollprobe:
0,'1mg/ko
Endosulfansulfat
Endosulfan Endosulfan
0,12
0,12
0
a7
s2
a2
nichtsinnvoll.
istbeidreiBestimmungen
DieBerechnung
derStandardabweichung
nochweiterzu optimieren,
des Zeitaufwandes
hinsichtlich
Um die Analysenmethode
Flüssig-Flüssigwurde geprüft, ob auf den an die Extraktionanschließenden
verzichtet
werdenkann.
zur Extraktreinigung
Verteilungsschritt
mit Dichlormethan
eventuellzur Extraktionvon weniger
Auch können unpolarercExtraktionsmittel
führen,waseinewenigeraufwendige
ausdem Probenmaterial
störenden
Bestandteilen
Extraktaufarbeitung
erforderlichmachenwürde.Deshalbwurde die Zusammensetzung
(Aceton/ n-Hexan1:1(v/v))geändert.
des Lösemittels
in Rückstandsanalysen
von chlorieTlen
wurdeebenfalls
DiesesExtraktionsmittelgemisch
Phenolen
und PCBs[28,26] und
Kohlenwasserstoffen,
Pestiziden
[18],polychlorierten
in Boden[7:E001]eingesetzt
Verunreinigungen
zur Eestammung
vonallgemeinen
45
von
bei einer Extraktionstemperatur
Extraktionszeit
Die Wahl der zwanzigminütigen
von Fish [18] und Lopez-Avilla[26]
120"Cerfolgteauf der Grundlageder Erkenntnisse
von chloriertenPestizidenin
E009[7] zur Rückstandsanalyse
sowieder ADplikationsnote
Boden.
ln der weiteren Aufarbeitungwurde das im Extrakt enthalteneMatrixwassermit
entfemt,der Extrakteingeengtund mit n-Hexanauf Volumengebracht.
Natriumsulfat
Mikrowellennacheinerzwanzigminütigen
der Wiederfindung
EineDoppelbestimmung
"C
Extraktionmit 50 ml Aceton/ n-Hexan1:1 (v/v)bei 120 ergabunter Benlcksichtigung
(vgl.Analyse5 in 64.42) Diesesind mit den
der Gc-Responsegute Ergebnisse
mit20 ml Acetonbei 100"Cin 15 Minuten
beider Extraktion
Wiederfindungen
ermittelten
vergleichbar.Die Abbildungen3-2 und 3-3 könnenzur Beurteilungder Extraktqualität
werden.
herangezogen
Aceton/
Es ist erkennbar(Abb.3-2,3-3),daß der Extrakt,der mit dem Lösemittelgemisch
belastetist als der bei
n-Hexanextrahiertwurde, mit mehr Verunreinigungen
der Extraktionmit Aceton Ein Grunddafür kann auchdas Wegfaliendes
Durchführung
sein Da aber die
mit Dichlormethan
durch Ausschütteln
Aufreinigungsschrittes
durch die
Substanzen
der zu analysierenden
gaschromatographische
Quantifizierung
nicht gestörtist, soll diese modifizierteRückstandsanalysenmethode
Verunreinigungen
mit Dichlormethan)
für die weitere
(Extraktionmit Aceton/ Hexan1:1,ohne Reextraktion
Bestimmungvon Endosulfanin Tomate unter Einsatz der l\4ikrowellenextraktion
angewandtwerden.Darüberhinauskommtes zu einererheblichenZeitersparnisdurch
und der damitveöundenen
mit Dichlormethan
Verzichtder Flüssig-Flüssig-Extraktion
nachfolgenden EinengungsschrittendLlrch Einrotieren am
ist ebenfalls
der zwölf möglichenParallelproben
Die Aufarbeitung
Rotationsverdampfe!'.
Verküzung von
jedereinzelnenProbemit anschließender
Ausschütteln
schneller,
da das aufwendige
durch
der Doppelbestimmung
wurdendie Ergebnisse
wegfällt.
Deshalb
Phasentrennung
abgestchert.
einezehnfache
Bestimmung
46
Abb.3-2Gc-Chronatognmmder vorder GCdotiedenExtmktlösung
einer Tomatenkontrcllprobe
nachMWEmit 50 mL Aceton/ n-Hexan1:1bei 120"C,20 min:
ohne Reextraktionmit Dichlomethan
Abb.3-3 Gc-Chromatognmmder vorder GC dotieftenExtmktlösung
einer Tomatenkontrollprobe
nachMWEmit 20 mL Acetonbei 100"C,15 min;mit Reext@ktion
mit Dichlomethan
47
die nach der l,IikrowellenIn Abbildung3-4 sind die Ergebnisseder Wiederfindungen,
Aceton/ Hexan(1.'1)und erfolgterAufarlceitung
Edraktionmit dem Lösemittelgemisch
dargestellt
wurden,als Balkengraphisch
zehnfach
bestimmt
(vgl.Vorschrift
lll,6.4.3.1)
100
90
80
70
60
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
5o
rl0
30
20
10
0
3
4
5
6
't00
90
30
70
60
40
30
20
10
nach MWEmit 50 ml
Abb 3-4 GraphlscheDaßtellungemitteltenWiedeändungen
Aceton/ n-Hexan1:1bei 120 f.20 min
49
7 ab3s DutchschnittticheRückstandshöhein Tomate-Fruchtnach MWE bei120'C,
20 min,50 ml Aceton/ n-Hexan1:1(n = 10)
p14Cmarkierter
Rückstandin
mg/kgin gealtertenProben
(Mittelwert)
Standardabweichung
in mg/kg
Endosulfan Endosulfan
0,12
o,12
002
0,02
17
15
90
94
RSD in o/o
in % für den
Wiederfindung
Gesamtanalysengang
Dotierungder Kontrollprobe:
0.1mo/ka
Endosulfansulfat
0
88
Anhand der graphischen Darstellungund der berechnetenrelativen Standardjedoch liegtdie
stark schwanken,
ist zu erkennen,daß die Ergebnisse
abweichung
(RSD) im zulässigenBereich(< 20 ok) [12' 42l De(
relativeStandardabweichung
aus n = 10 beträgt0,12 mg/kgfür o-Endosulfanund 0,12 mg/kg
enechnetel\redianwert
nachDIXONdurchgeführt
Es wurdeein Ausreißer-Test
für p-Endosulfan.
da
hinzuzuziehen,
desl\4ittelwertes
sindzur Berechnung
undMinimalmeßwerte
Maximaldarstellen.
keineAusreißer
sienachdemDIXON-Test
wurden Rückständevon
Auch mit der modafiziertenRuckstandsanalysenmethode
bei der nlit dem
wie mit der Anaiysenmethode,
in gleicherHöheermittelt
Endosulfan
konventionellen Extraktionsmittel Aceton extrahtert und e\ne Reexlrakt\on mit
ll und lll,6 4 3 1)
wird(vgl.Vorschrift
durchgefühtl
Dichlormethan
wLlrdeaus ZeitgrÜnden
Eine weitereOptimierung(Temperatur-und Zeitverringerung)
nichtmehrvorgenommen.
58
3.2 Bestimmung von Mefenpyr'ethyl (Gerstensafener in Getreide)
Nachdem das Verhalteneiner relativ unpolarenSubstanz wie Endosulfanin der
wasserhaltigenMatrix Tomate-Frucht,die wenig störende Begleitstoffeenthält, bei
untersuchtwurde, sollte nun die
Einsatz der verschiedenenExtraktionsverfahren
für stärkerpolare Substanzenin Getreide
Eignungder neuen Extraktionstechniken
geprüftwerden.
für die Bestimmungeines
Dazu wurde die bestehendeRückstandsanalysenmethode
mit dem Ultratunaxdurch die
und der bdraktionsschritt
herangezogen
Gerstensafeners
neuenTechnikenersetzt.
entsprechenden
l\refenpyr-ethyl(Gerstensafener)wird zusammen mit einem heöiziden Wirkstoff
eingeselzt,die Substanzselbsthat keineherbizideWirkung.Der SafenerschÜtztdie mit
behandeltenGereideartenRoggen,Weizenoder Gerstevor einer
dem Gräserherbizid
Schädigung,währendSchadgräservernichtetwerden(vgl. 2.22) oer Gerstensafener
der AgrEvoGmbH und hat zur Zeit auf dem
selbstist eine Entwicklungssubstanz
fÜr den
deutschen Markt noch keine Zulassung. Der Höchstmengenvorschlag
seiner relevantenNletabolitenin Getreide-Kombeträgt
Gerstensafenereinschließlich
O,05mg/kg,berechnetals Gesamtgerstensafener.
3.2,1Probenvorber€itung
der
angezogen.
Zum Zeitpunkt
wurdenin Töpfenim Gewächshaus
DieWeizenpflanzen
der Bestockung
und hattenelne
warendie Pflanzenim Wachstumsstadium
Aoolikation
Wirkstoffund dem '4C
mit dem herbiziden
Höhevon ca. 20 - 30 cm. Die Applikation
markiertemSafenererfolgtemanuelldurch Spritzender Formulierungmit Hilfe einer
90 g a.i./ha,wobei beide
Dabeibetrugdie Aufwandmenge
craphiker-Spritzpistole
von grünenPflanzen(Sproß)
1:'1vodagen.Die Probenahme
im Verhältnis
Substanzen
durch
so daß elneAlterungdesWirkstoffes
edolgteam 10.Tag nachder Behandlung,
Metaboliten
zu erwartenwar. Dabeiwurdenaus jedem
zu entsprechenden
Umwandlung
24 Stunden
Diesewurdengemeinsam
entnommen.
Sproßproben
TopfdurchAusdünnen
mit Trockeneiszerkleinert,
tiefgefrorenund dann mit einer Küchenmaschine
wurde
tiefgefroren.
Nachder Homogenisierung
undin ca 40 g- Portionen
homogenisiert
bzw.Substanzmenge
bestimmt.
Dazuwurden
Radioaktivität
diein der Probeenthaltene
(vgl.3.1.1).
verascht
20 Teilmengen
derGesamtprobe
74
3.2.2.3Mikrowellen-Extraktion
durch das Mikrowellenlm weiteren Verlauf wurde nun die Ultraturrax-Extraktion
in Sproßersetzt'
von Gerstensafenerrückständen
zur Aufarbeitung
Extraktionsverfahren
wurden die Erfahrungender
Bei der anfänglichenWahl der Extraktionsparameter
Endosulfan-Analysein Tomate genutzt. Ebenfalls wurde das konventionelle
Extraktionsmittelder bestehendenLabormethode(Aceton / Wasser 2:1 (v/v)) zur
bedeckt 'st,
Extraktionverwendet.Damitdie Probe ausreichendmit Extraktionsmittel
mit40 ml festgelegt.
Lösemittelvolumen
wurdedas einzusetzende
ExtraktionsDarameter:
Temperatur:
StatischeExtraktionszelt:
Extraktionsmittel:
100.c
1 5m r n
2:1(vlv)
/ Wasset
40 mlAceton
Erfahrungen der AsE-Methodenoptimierungstülzend, erfolgte die
sofort mit einer Dotierungan der
für die Mikrowellen-Extraktion
Methodenoptimierung
derWiederfindung
(0,1mg/kg).l\4iteinererstenDoppelbestimmung
Bestimmungsgrenze
Auf
mit den o g. Parametemwurdenzufriedenstellende
nach der l,rikrowellen-Extraktion
m[
Ergebnisse(zwischen67 7o und 88 %) ermittelt,so daß die Extraktionsparameter
verifiziertwerdensollten.
einerl\,4ehdachbestimmung
der
BestimmLlng
det zehnfachen
3-15sinddieErgebnisse
InTabelle3-21undAbbildung
zusammengefaßt
Substanzen
undzu analysierenden
vondendotierten
Wiederfindung
f ah 3-21MitttereWiedeändungnachMWEbei 100 t,15 min,4Aml Extraktionsmittel
h=10)
Safener
1
Metabolit
2
Metabolit
i,letabolit3
in %
Wiederfindung
Dotierung:
0,1 mg/kg
90
B3
60
74
Wiederfindung-in a/o
105
92
72
86
Wiederfindung-.
in a/o
a2
72
8
I
der
lvlittelwert
RSD in %
65
10
I
75
120
100
80
60
a0
20
0
nachMWEbei 100 t' 15 min,
det Einzeleqebnisse
Abb.3-15GnphischeDarstellung
S= Saferet 1= Metabolit 1;2 = Metabolit2; 3= Metabolit3
40 ml ExtnEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE
zu genng
Bestimmung
2 istmit60 % beizehnfacher
für denMetabolit
DieWiederfindung
liegen,aberes
der Extraktion
[12].Ursachenhierfürkönnenz.B.im Temperatureinfluß
die
Extraktaufarbeitung durch veränderte
möglich, daß
auch
ist
gestörtist.
(höhererAnteilan Matrixbegleitstotfen)
Extraktzusammensetzung
Um eine Erhöhungder Wiederfindungfür den lvetabolit2 zu etzielen'wurden daher
durchgeführt'
der Temperaturund Extraktionszeit
weitereVersuchedurchVeränderung
variiert Es wurde die Temperaturjeweils um
Zuerstwurde der Temperaturparameter
Zeit verändert
20"Cnachoben und !nten beigleichbleibender
für den
von 120'C ist die Wiederfindung
einerExtraktionstemperatur
Bei Verwendung
deranderen
als bei100'C, dieWiederfindung
niedriger
2 mrt45 % bedeutend
Metabolit
stiegjedochleichtan (3. Analyse/6 5 4 3) Wurdebei
Substanzen
zu analysierenden
für
Wiederfindungen
lagendie durchschnittlichen
von 80'C exkahiert,
einerTemperatur
im gleichenBereichwie die der Doppelbestimmung
Substanzen
allezu analysierenden
bei der Extraktionmit 100'C.
Deshalb wurde nun die statische Extraktionszeitverändert und wiederum eine
von 100 "C gewählt, um eine möglichen Einfluß der
Extraktionstemperatur
feststellenzu können.Aber auch bei fünf- und zehnminütigen
Extraktionsdauer
Extraktionszeitenwaren die Wiederfindungsratender dotierten Substanzen nicht
qrundsätzlich
vondenender 1. Analyse
verschieden
'oC markiertenRückständendie zu
Daher wurden für die Extraktionvon gealterten
(vgl. S 74) eingesetzt.Die ermittelteniedrige
Anfang gewähltenEtraktionsparameter
2 in der Zehnfachanalyse
ist noch akzeptabel,
Wiederfindungvon60 % des l\,iletaboliten
der EU Abweichungen
von den zulässigen
70 %- bis 120%igen
da auchdie Richtlinie
zuläßt[12].
Wiederfindungen
'4C marktertemWirkstoffbehandeltwurden,
Parallelzur Analyseder Proben,die mrt
wurde eine zusätzlicheBestimmungder Wiederfindungvon dotiertenSubstanzenauf
Zur
Absicherungder ilethode durchgefÜhrt.
zur nochmaligen
eine Kontrollprobe
wurde die Radioaktivitätdes
Bestimmungdet Eftizenz des Extraktionsverfahrens
(nachAbtrennungdes Extraktionsrückstandes)
nachArbeitsvorschrift
lV,
Primärextraktes
nacheinmaliger
Extraktion
wurdemlt 91 %, gemessen
DieAusbeute
6.5.3.1bestimmt.
selbstim
bestimmt.Dabeiwardie Präzisiondes Extraktionsverfahrens
als Radioaktivität,
(vgl.Zusammenfassung
amhöchsten
3.2.3).
Vergleich
zu denanderenTechniken
Der Extraktwurdenach der Vorschriftll aufgeaöeitet,vor der MethylierungdurchHPLC
gaschromatographisch
und nach weitererExtraktreinigung
mit Radioaktivitätsdetektion
bestrmmt.
zusammengefaßt.
3-22und3-23sinddieErgebnisse
ln denTabellen
die mit
von Weizen-Sproßproben,
Tab. g'22 HPLc-Analyserergebnisse
''C markiedem
(n=6)
Wrkstoffbehandeltwutden,nachMWEbei 100'C,15min,40 ml Extraktionsmittel
Safener
'"C markierterRückstand
in
Metabolit
1 Metabolit2
022
0 80-
0,46
0,0s
o,o2
0,04
3
I
mg/kgin gealtertenWeizen(ber.alsSafene0
Sproßproben
Standardabweichung
in mg/kg
RSD in %
'n=5wegenAlsreißer
(Peakregion).
als Peakzuordbar
Metabolit
3 ist nichteindeutig
dargestellt.
den
Auchim Extrakt,
ln Abbildung
3 16 ist ein Radio-HPLC'Chromatogramm
erhält sind keine bedeutend höheren
man durch lvlikrowellen-ExtrakUon
(nichtrelevante
als Radioaktivität)
gegenüber
Substanzen,
sichtbar
der
Verunreinigungen
(vgl.Abb.3-12)
ersichtlich
Ultraturrax-Extraktion
77
--t
I
5-
.J
1 = Metabolit2
2 = l\4etabolit1
3 = Safener
I
2
a.
l l
I
i
I
a . +ül
rl.
!i. riri
i l:1. rü
:'J,
lrLl
:ü.
i]ü.
üü
üü
von mit1lC matuieftem
Abb. 3-16 HPLc-Chrcmatogammmit Radioaktivitätsdetektor
nachMWEbei o.g Bedingungen
WirkstoffbehandeltenWeizenprcben
derl'C markiedenPrcben(n = 6)
fab 3-23Gc/Ms-Anatyseneqebnisse
Safener
''C markierterRrlckstandin
Proben
mg/kgin gealterten
Iretabolit1
Metaboiit2
0,20
a,2a
aa2
0,03
9
9
11
23
31
s5
81
Metabolit3
< 0,1
(Mjttelwert)
ber. als Safener
Standardabwerchung
rn mg/Kg
R S Di n %
Wirkstoff- und
3
in %
l\,4etabolitenverhäitnis
(lvlitte lwert)
Wiederfindung
in % für
bei
Gesamtanalysengang
68
Dotierungder KontrollProbe:
0,2 mg/kg
rnwieweir
ore Ergebnisseschwanken st ads AbbildJng3.17 zu erkennen
89
7A
0,15
0,t
0,25
0,2
in d'g{(g
0,15
0,1
0,05
0
S
i
Subst nzen
Z
3
Abb. 3-17 GraphischeDaEtellung der Einzeleeebnisse nach cc/Ms-Bestimmung
aus Tab 3-23;S= Safener,
1= Metabolit
1,2= Metabolit2,3-Metabolit
3
Die Schwankungen
der Einzelergebnisse
liegenim zugelassenen
Bereichund sind
Ausdruck des Gesamtfehlersder Gesamtanalyse(RSD < 20olo)112, 42). Oe(
Gesamtfehler
setztsichaus den Fehlemzusammen,
die aus der Pflanzenbehandlung,
aus der repräsentativen
Probenahmeund Verkleinerung
der Feldprobezur Laborprobe
sowie aus der eigent{ichen
Analysenmethode
resultieren(zufällige,systematische
Fehler).
Die Eignungder l\rikrowellenextraktionstechnik
für andere[,4atrizes
wurde nun durchdie
Bestimmung
der Wiederfindung
in Getreide-Kornund -Strohproben
untersucht.
Dazu
wurden entsprechende
unbehandelte
Konkollproben
vor der Analyse mit den zu
analysierenden
dotiert.l\ritdiesenVersuchen
Substanzen
kannmaneineAussageüber
die Qualitätdes Extraktesund die Reproduzierbarkeit
der Gesamtmethode
bei Einsatz
der l\rikrowellen-Extraktion
treffen. Da aber die zu analysierendenSubstanzenbei
Aufstockexperimenten
der Extraktion
frei verfügbarsind, ist eine Aussageüber die
Effizienzder Extraktionnicht mö9lich,weil in Proben,die gealterteRuckstände
enthalten,
dieseRückstände
stärkeran diel\,4atrix
seinkönnen
aebLlnden
Für dje Extraktionvon an der Bestimmungsgrenze
(0,01 mg/kg) dotjertenKornkontrollproben
ist eine zehnminütige
Ext.aktion
bei 100.C mit 30 ml Extraktionsmittel
ausreichend,
um optimaleWiederfindungsralen
für den relevanten
Rückstand
und den
Safenerzu erreichen.Die Ergebnisseder Doppelbestimmung
wurden durch eine
l\lehrfachextraktion
verifiziert.Die ProbenaLtfarbeitLtng
erfolgtenachArbeitsvorschrift
ll.
DieErgebnisse
derMehrfachbestimmung
sindin Tabelle3-24zusammengefaßt.
79
Tab.3-24MitttereV(iedeändungnachMWEbei 100 t, 10 min,30 ml Extnktionsmiftel
(n=7)
Safener
lretabolit3
der
i,rittelwert
in %
Wiederfindung
0,01mg/kg
Dotierung;
103
88
Wiederfindung,-
113
95
Wiederfindung..
in o/o
93
80
in %
GC-Response
107
1't4
7
8
in o/o
R S Di n %
(RSD),die unlet 20 o/abeträgt,ist zu schließen,
Ar.rsder relativenStandardabweichung
reproduzieöarist [12,
bei Einsatzder N4ikrowellen-Extraktion
daß die Gesamtmethode
421.
beider Kontrollmaterial
desselben
Lösemittelextraktion,
zur beschleunigten
lm Vergleich
kann man keine
eingeselztwurde wie bei der lvlikrowellen-Extraktion,
Feldversuch
desGC/lvls-Totalionenchromatogramms
erkennen,
d.h.die
im Peakmuster
Unterschiede
Extraktionsverfahren
unterscheidensich nicht in ihrer
Extrakteder unterschiedlichen
Die zu analysiefendenSubstanzensind störungsfrei
lVatrixz
usammensetzung.
(vgl.Retentionszeiten
S. 60).
quantif
izierbar
6 0 0 0 0 0 0l
5 5 0 0 0 0 0l
5000000,
t6 00
Komprabenach MWE bei
einerunbehandellen
romalogramm
Abb 3-18 GC,/MS-Ch
100 t,, 10 nin,30 ml Extnktionsmittel
80
bei der Bestimmungvon
Die Untersuchungauf Eignung der lvlikrowellen-Extraktion
nichtabgeschlossen
werden.
in Strohkonnteauszeitgninden
Rückständen
für die Analysevon Sproßprobenwurde die
ln Anlehnungan die lrethodenoptimierung
(Dotierung:
0,05
durchgef0hrt
ebenfallsbei 100'C über 15 lvlinuten
ersteExtraktion
auf mäximal
mg/kg).Allerdingswar die notwendigeErhöhungdes Lösemittelvolumens
um 5 g der eingesetzen
vollständig
Strohprobe
nichtausreichend,
50 ml (vg1.2.3.2.4)
bedeckenzu können.
einer Doppelbestimmung
fallen daher für alle zu
Die ermitteltenWiederfindungsraten
o/o
niedrigaus (30 bis 58 %). Deshalbwurde
entsprechend
Rückstände
bestimmenden
Wiededindungsratender
die Einwaage auf 3 g reduziert. Die durchschnittlichen
von0,05mg/kgsindin Tabelle3-25dargestellt.
beieinerDotierhöhe
Doppelbestimmung
nachMwE bei 100 f ,
Iab. 3-25MittlercWiedeiindungeinerdoliedenStrohprobe
15 min, 50 ml Extraktionsmitlel,3 g Einwaage(n = 2)
Safener
Metabolit1
91
8'1
145
112
Metabolit2
3
Metabolit
MittlereWiederfindung
in a/o
mg/kg
Dotierung:0,05
in %
GC-Response
127
120
sehr niedrig,zumal die
ALrchbei einer Einwaagevon 3 g ist die Wiededindung
angehoben
sind.
durchdieGC-Response
Ergebnisse
da der
in der weiterenExtraktaufarbeitung,
Ursachendafür liegenmöglicherweise
zu anderen Extraktzusammensetzungen
Einsatz des neuen Extraktionsverfahrens
können die anschließende
führen kann VeränderteAnteile von Matrixbegleitstoffen
Extraktauf
arbeitungstören.
85
4 Diskussion und Bewertungder Extraktionsverfahren
das entsprechendder DFG S19-l\rethode
Das Ultraturrax-Extraktionsverfahren,
Extraktionunter Druck
angewandlwird wurdedurchdie ASE und mikrowellenassistierte
ersetzt. Dabei sollte das
in den zu optimierendenRückstandsanalysenmethoden
Matrizesuntersucht
Verhaltenvon verschiedenpolarenSubstanzenin unterschiedlichen
sind hinsichtlichihrer Praktikabilitätund
werden. Die neuen Extraktionsmethoden
undRichtigkeit
zu vergleichen.
sowreihrerEffizrenz
handhabung
des Verfahrensbei
Effizienzund Päzision. Um Aussagenüber die Leistungsfähigkeit
Einsatz der verschiedenen Extraktionsmethodentreffen zu
können. \Murden
anhandvonKontrollproben,
diemitdenzu analysierenden
Substanzen
Wiederfindungen
aufgestocktwurden, ermittelt.Dazu wurdendie Substanzenso aufgestockt,daß ihre
(Tomate: 0,02 mg/kg) bzw. an der
Konzentrationnah der Bestimmungsgrenze
(Getreide-Sproß:
0,1 mg/kg;Getreide-Korn:
0,01mg/kg)lag.Da die
Beslimmungsgrenze
in diesem Bereich ermittelten Wiederlindungen bei Einsatz des jeweiligen
zwischen 70 % und 12O a/a lagen und die relative
Extraktionsverfahrens
der Methode
kleinerodergleich20 o/oist,istdie Leistungsfähigkeit
Standardabweichung
abgesichert.
wurden Proben, die mit r4C
Zur Bestimmungder Effizienzder Extraktionsverfahren
Rückstandüber
markiertem
Wirkstoffbehandeltwurden,extrahiertund der extrahierbare
ermittelt Es wurdendurchden Einsatz
der Radioaktivität
im Primärextrakt
die l\,4essung
größerenMengenvon Rückständen
in
keinesignifikant
der neuenExtraktionstechniken
gewachsenen
diemitraCmarkiertem
Wirkstoff
behandelt
wordensind,extfahiert
Proben,
Die Extraktionseffizienz
und quantifiziertals mit dem Ultraturax-Extraktionsverfahren
deruntersuchten
Verfahren
istdeshalb
als gleichwertig
einzustufen.
Rückstände
Nachder Extraktaufarbeitung
und Quantifizierung
der zu analysierenden
der Extraktionsverfahren
daßdieermittelten
wirdhinsichtlich
derGenauigkeit
festgestellt,
Weizen-Sproßproben,
die mit'"C markiertem
Rückstandsergebnisse
in gewachsenen
Gerstensafenerbehandeltwurden,bei Einsatzder l\rikrowellen-Extraktion
im Vergleich
zu den anderen untersuchtenExtraktionsverfahren
mit der geringsten relativen
nichtgenerell
Standardabweichung
behaftetsind.Allerdings
kanndiese Beobachtung
Effekte im gesamten
angenommenwerden,da auch matrix-und substanzabhängige
die Ergebnisse
beeinflussen
können.Auch eine apparativbedingte
Analysengang
Minimierung
der zur Analyseeingesetzten
Probengröße
kanngrößereSchwankungen
(vgl.3.1 Endosulfananalyse
der Efgebnisse
hervorrufen
in Tomate).
86
Die o.g. Ergebnisseder Extrahierbarkeit
von gealtertenEndosulfan_und Gersten_
safenerrückständen
sind durchweitereAnalysenvon gewachsenemprobenmaterial,
in
dem noch intensiverel\,retabolismusreaktionen
stat$indenkönnen, abzusichem.So
finden z.B. im Wachstumsstadium
Sproß wenigerAb- und Einbaureaktionen
des
Gerstensafenersstatt als bei Korn- oder Skohproben,bei denen das pflanzenbehandlungsmittel
längerin das Stoffwechselgeschehen
der pflanze einbezogenwro
unddaherein höhererAnteilgebundener
Rückstände
vorliegen
kann[6].
tJmgebundeneRückständevon Endosulfanin Tomatezu erhalten,müßteder Zeitraum
zwischen Behandlung und Ernte der Tomatenfrüchteverlängert werden. Dieses
Vorgehenwar aber nicht möglich,da man möglichsthohe Rückständedes
Pflanzenschutzmittels
analysierenwollte. Zumindestkonnten gealterte Rückstände
ezeugtwerden(Emteam 7. Tag nachBehandtung).
Ext@Kqualität. Zur
Beurteitung der
Extraktquatität werden die jeweiligen
Chromatogrammeeiner Probe desselben Feldversuchesherangezogen,um
unterschiedliche Matrixbelastungen in
Abhängigkeit des
veMendeten
Extraktionsverfahrens
feststellenzu können.Wird in der Endosulfananalyse
dje bisher
angewandteUltraturrax-Extraktionstechnik
durchdie Mikrowellen-Extraktion
ersetztund
mit dem klassischenE>.traktjonsmiüel
(Aceton)extrahiert,so ist der aufgearbeitete
Extraktwenigermit Störkomponenten
betastet(vgt.6.6.1,Abb. 6-3).Wird die probe
einerhöherenTemperatur
ausgesetzt,
so steigtderAnteilvonStörkomponenren
ausder
Matrixan (vgl.Abb. 6-6 und 6-7).Um den Zeitaufwand
der Rückstandsanalyse
noch
weiterzu minimieren,
wurdeauf den an die Extraktjon
anschließenden
Flüssig_Flüssig_
Verteilungsschritt
mit Dichlormethan
verzichtetund der Extraktnach Aufkonzentrierung
drrektgaschromatographisch
bestimmt.
qes
Dabeiwurdeauch die ZusammenseEung
Extraktionsmittels
(Aceton/ Hexan j:1) verändert.Der erhalteneExtraktist mtt wefaus
mehrVerunreinigungen
belastet.
Jedochist die gaschromatographische
euantifizjerung
von Endosulfanund Endosulfansulfat
nicht gestört(vgl. Abb.6_4),so daß diese
Vorgehensweise
die Methodeder Wahl zur Bestimmungvon Endosulfanin Tomate_
Fruchtist. lm Vergleichzur l\,likrowellen-Extraktjon
mit Acetonbei 1OO.Cist der Extrakt,
dermitderASE beigleicher
lemperaturund Lösemittel
erzeugtwurde,etwasstärkermit
Verunreinigungen
belastet.
In Bezugaufdie Ultratunax-Extraktion
führtdjeASEzu einer
glejchwertigen
Extraktqualität.
Beider Rückstandsanalyse
des Gerstensafeners
in Wejzen_Sproßproben
wltadendurch
die Mikrowellen-Extraktion
wenigerMatrixbestandteile
herausgelöst
als bei den anderen
Extraktionsvedahfen
(vgl.Abb.6-9bis 6-1j) Zwischenden neuenTechnikenfür dae
Extraktion von dotierten Getreide-Komproben
wurden keine eualitätsunterschtede
festgestellt
(vgl.6.6.2.2).
a7
Die Optimierungder Extraktionvon Strohprobenkonnte aus zeitgrÜnden nicht
nach
werden.Ersichtlichist bisher,daß bei erfolgterExtraktaufaöeitung
abgeschlossen
Extraktevorliegenals bei
wenigermatrixbelastete
Einsatzder lvlikrowellen-Extraktion
Einsatzder ASE (vgl. 6.6.2.3).Die U.sache dafür kann aber auch ean nicht
ausreichenderKontaktder voluminösenStrohprobemit dem Lösemittelwährend der
sein, da die Extraktionszellenur mit einem maximalen
Mikrowellen-Extraktaon
von 50 ml gefülltwerdendarf
E{raktionsmittelvolumen
betrachtet,erforderndie durch die neuen Extraktionstechniken
Zusammenfassend
erzeugten Extrakte keine zusätzlichenReinigungsschrittein den bestehenden
Bestimmung,
da die zu
vor der gasch.omatographischen
Rückstandsanalysenmethoden
klar von
analysierendenSubstanzenauch bei veränderterExtraktzusammensetzung
abgetrenntwerden.
Störkomponenten
Untersuchunaauf Praktikabilität.Beim Arbeiten mit dem ASE-System ist die
(o = ca. 1,5 cm),
bedingtdurchdie kleinerenExtraktionszellgrößen
Probenvorbereitung,
zeit- und arbeitsautwendigerals bei den anderen zu untersuchenden
Besondersbeim Arbeiten mit feuchten Proben (Sproß und
Extraktionstechniken.
zu vermischen,
Tomate)war es notwendig,diesevor der Extraktionmit Diatomeenerde
aus der Zellekommenkonnte.Zudemwar
da es sonstzum Auslaufenvon lvlatrixwasser
(Einwaage,
zeitaufwendig
Lrischen
dieserProbenin die Exlraktionszellen
das Einfüllen
ca.5 MinutenproProbe).
undEinfüllen:
mitDiatomeenerde
mit
Das Füllender Zellen mit Stroh war bei Einsatzder neuen Extraktionstechniken
für Stroh,das ein sehr spenigesund
veöunden.Die Probengröße
Schwierigkeiten
stark limitiert.
darstelit,ist durch die Extraktionszellglößen
voluminösesProbenmaterial
Währendman jedoch bei der Extraktionmit dem ASE-System5 g fein gehäckselte
Zelle(33 ml) einfüllenkonnte,
durchdichtesStopfenin die größtmögliche
Strohprobe
die Probengrößenoch weiter
mußte beim Arbeiten mit dem Mikrowellen-System
reduziertwerden(keinStopfenmöglich,da Probenur bis zur Hälfteder Zellgröße
werden
die Probengroße
vonStrohminimiert
inwieweit
eingefüllt
werdendarf).Versuche,
darf, um trotzdem noch repräsentativzu sein, konnten aus Zeitgründen nicht
ist eine repräsentative
abgeschlossenwerden. Voraussetzungfür die l\,4inimierung
Probenahmeund Reduzierungder Feld- zur Laborprobedurch ausreichende
Hornogenisierung.
Reduzierung
fuhrtezu einerbedeutenden
Def Einsatzder neuenExtrakUonstechniken
(biszu 90 o/o),
von großem
was aus Umwel!und Kostengründen
des Lösemittelbeda,is
isl (Ultfaturrax).
Extraktionsmethode
Vorteilgegenübe.
derbisherangewandten
88
Der direkt nachfolgendeProbenaufarbeitungsschritt
(Reextraktionmjt Dichlormethan)
zeichnetsichebenfalls
durcheineMinimierung
des Lösemittels
bis zu 80 % gegenüber
der klassischenl\,ilethode
aus oder konntevollständigeliminiertwerden(vgl. lvlikrowellenExtraktionjn Tomate).
Der zeitaufwendige Aufkonzentrierungsschrittdurch Einengen am VakuumRotationsverdampfer
konnte aufgrund der geringeren Lösemittelvolumina
verküzt
werden Eine konkrete Zeitverküeungdes Extaktionsschrittes
selbst konnte nicht
festgestellt
werden,da die Ultratunax-Extraktion
im Vergleichz.B. zur SoxhlelExtraktion
(v91.2.3.2.1)
ein schonrelativschnelles
Verfahren
darstellt.
DieZeiterspamis
liegtdarin,
daß beim Einsatz des AsE-Systemsdurch die Automatisierungder Extraktiondie
Möglichkeitgegeben ist, mehrere Proben nacheinanderextrahierenzu können.
Vorteilhaitist dje Extraktionüber Nacht,da eanSequenz-und Methodenfahrplan
die
Steuerungdes bdraktionssystems
ermöglicht.Bei der Extraktionmit dem lVikrowellenSystemist ebenfallseine Zeiteinsparung
möglich,da 12 Probengleichzeitig
extrahiert
werdenkönnen.
Ein weitererVorteil der ASE ist. daß ein zusätzlichesTrennen des Extraktsvom
Rückstandnjcht notwendig ist, da der Extrakt während der Extraktion In etnem
gesondertenAuffanggläschengesammeltwird. Ean derartiges Vertahren mit der
Mikrowellen-Extraktion
ist nicht möglich,da Extraktund Rückstandnachfolgenddurch
getrennt
Filtration
werdenmüssen.
(eventuell
Mehrfachextraktionen
auchmit verschiedenen
Extraktionsmitteln)
sinddaher
mit Hilfedes ASE Systemsleichtermöglich,
weil die Extraktionszellen
nichte.neutmit
dem Rückstandgefüllt werden müssen,sondern direkt einer neuen Extraktion
unterzogen
werdenkönnen.
89
5 Zusammenfassung
Füf die Rückstandsanalytik
von pflanzenschutzmitteln
bestehenvielfältigeAnatysen_
methoden,die jedochoft mit einem hohenZeitaufwandund efieblichenVerDraucn
an
oroanischenLösemittelnveöunden sind. Seit kuzer Zeit stehenneue, schnellere
und
_!qs!!9!rn89l
Jpgreldelixtraktionsmethoden wie
die
ASE
und
die
mikrowellenassistierte
Extraktionunter Druck für die organischeSpurenanalytikzul
Verfügung. Allerdings wurden diese lechniken bisher hauptsächlich jn
der
Umweltanalytik
zurAnalysevon Boden-,
Sediment_
oderSchlammproben
veMendet.so
daß es sich anbot, diese auf ihre Eignung für die Rückstandsanatytjk
von
pflanzenmaterial
Pflanzenschutzmifteln
in
zu prüfen.Ziel dieserAöeit war es daher,die
ASE und die mikrowellenassistierten
Extraktion unter Druck mit der in der
Sammelmethode
DFG S19 vorgesehenen
herkömmlichangewandtenUltratunax_
Extraktion zur Analyse von pflanzenmaterjalzu vergleichen.Dabei so ten
die
Extraktionstechniken
präzision
praktikabilität
hinsichflich
ihrerEffizienz,
und
gepruftund
eine möglicheOptjmierung
der Rückstandsmethoden
vorgenommen
werden.Durch
EinsatzeineswäßrigenCfomate)und einestrockenen(Getrejde)pflanzenmatenajs.
das
mit
einem
Pflanzenschutzmittel
polarität behandejtwurde.
leweils
unterschiedlicher
solltenEinflüssedes Pfobenmaterials
auf die Extraktjon,die nachfolgende
Aufaöeitung
sowjedjequantitative
Bestimmung
untersucht
werden.Als unpolare
Substanzen
wurden
Endosulfanund der lvletabolit
Endosulfansulfat
in der stark wasserhaltrgen
Matnx
Tomate-Frucht
analysiert.
Als mittelpolare
Substanzwurde ein Gerstensafener
rnjt
zugehörigen
Metaboliten
in verschiedenen
Getrejdewachstumsstadien
(Sproß,Korn,
Stroh)untersucht.
lm vordergrund
standdie optimierung
des Extraktionsverfahrens.
Es solrteaber
auch
geprüftwerden,inwieweiteine Optimierung
der nachfolgenden
Aufarbeitunqsschntte
möglichist.
zu
ür die neLren
Extraktionstechnikenwurde zunächsl mit aufgestockten Kontrollproben
die
entsprechenden
Wiederfindungen
für den gesamten
Analysengang
bestimmt.
Wichtige
Kriterien
wie Reproduzierbarkeit
und Richtigkeit
der Gesamtmethode
werdenertü||t.da
dre Wiededindungen
für die entsprechenden
optimalenExtraktionsparameter
zwischen
70 o/ound '120% mrteinerrelativenSlandardaDweichung
van .-
20 o/o
Urn eine möglicheErhöhungder Extraktionsausbeute
dLrrchEinsatzder modernen
Extraktionsverfahren
bestimmenzu können,wurden Tomate_Frucht
und Weizen1aC
Sproßproben,
die mit
markiertem
Endosulfan
bzw. Gerstensafener
behandett
und
nacheinergewissen
VerweildaLrer
desWirkstoffes
geerntet
wurden,analysien
90
gemessenals Radioaktivitätim
Es konnte keine Erhöhungder Extraktionsausbeute,
Primärextrakt,
im Vergleichzur bisher angewandtenUltratunax-Extraktion
festgestellt
werden.NachweitererAufaöeitungdes Primärextraktes
erfolgtedie Quantifizierung
der
entsprechendenRückstände.Dabei sind die Rückstandsgehalte,
die nach der ASE
bestimmtwurden,höherals bei der mikrowellenassistierten
Exraktionunter Druckoder
lm Rahmen der Spurenanalytiksind jedoch die ermittelten
Ultraturrax-Extraktion.
Rückstandsgehalte
unterBeachtungder Standardabweichung
für allezu analysierenden
zu betrachten.
Substanzenals gleichwertig
lm Vergleichzur Ultraturrax-Extraktion
bedeutendie neuen Extraktionstechniken
eine
erheblicheEinsparungdes organischenLösemittelbedarfs.
Dadurchkommtes auch zu
einer Verringerungdes Zeitaufwandesin der anschließendenExtraktaufarbeitung,
da
durchEntfemendes LösemittelsverkürztwerdenkOnnen.
Aufkonzentrierungsschritte
Vorteilhaftund zur Zeiteinsparungnutzbarist die automatischeExtraktiondes ASESystems,was die Durchfrihrung
der Extraktionüber Nachtermöglicht.BeimArbeitenrnit
dem l\rikrowellensystem
ist die Zeitersparnisdurch die gleichzeitigeExtraktionvon
maximal
12 Probengegeben.
lm Falle der untersuchtenSubstanzenund tulatrizeskonnten die Extrakte ohne
wesentliche Anderungen der Aufreinigungssschritteaufgeaöeitet und die zu
analysierendenStoffe ohne Störungenquantifiziertwerden. Teilweisewurde in der
Endosulfananalyse
von Tomate-Frucht
auf den Flüssig-Flüssig-Verteilungsschritt
vezichtet.DieseVerkürzungder llethodetrug auch zur l\,4inimierung
des Zeitaufwandes
bei.
Diemikrowellenassistierte
Extraktion
unterDruckund die ASE sindfür die Bestimmung
der Rückstände
von Endosulfanin der MatrixTomateund der Rückständeeines
Gerstensafeners
in Getreide-Sproß
und-Komgeeignet.
ExtraktionunterDruck)
Arbeitsvorschrift
ll (Mikrowellenunterstützte
a) Extrcl<tion
5 g angetauteSproß-oder Kornprobe,3 g Strohprobe(unterVorbehalt,da Optimierung
(Vorbereitung:
vgl 3.2.1) wird in ein Extraktionsgefäß
noch nicht abgeschlossen)
eingewogen.N4angibt ein bestimmtesVolumen(vgl. jeweiligeExtraktionsparameter)
angesäuert
wird (pHeinesGemisches
Aceton/ Wasser2:1 (v/v),das mit Essigsäure
Wert 3 - 4), hinzu verschließtdas Gefäß,setzt es in den Drehtellerund baut diesenin
und
wird mit dem Temperaturein. Das Kontrollreferenzgefäß
das Mikrowellensystem
Druck-Kontrolisystem
verbunden.
-Vedeilung
b) Flüssig-Flüssig
Nach der Extraktionund dem Abkühlendes Extraktesaus a) wird dieser über eine
(100ml)abgesaugt.
Mansättigt
in einenScheidetrichter
Glasfritte
mitfe'nemFilterboden
30
hinzuund läßtnach Entlüften
mit 3 g Natriumchlorid
ab, gibt 20 ml Dichlormethan
unterVermischunq
der Phasenschütteln.
Minutenauf einerSchüttelmaschine
135
Zur Phasentrcnnungläßt man den Scheidetrichter10 Minuten stehen. Die untere,
wäßrigePhasewird verworfen.Die organischePhasefiltriertman durch einen Trichter
(A = 7 cm), der claswolle und eine 3 cm hohe Schichtan Natriumsulfat
enthält.Das
Filtratwird in einem250 ml Rundkolbenaufgefangen.Scheidetrichter
und Filterwerden
zweimalmitje 20 ml Essigsäureethylester
nachgespült.
DieweitereExtraktaufaöeitung
erfolgtnachArbeitsvorschrift
L
6.5.3Genaue Arbeitsbedingungen
6.5.3.1Arbeitsvorschriften
Arbeitsvorschrift
I (ExtraktionmitUltraturrax)
a) Extnktion
Das Probenmaterial
wird nach Entnahmeaus dem Tiefkühlschrank
ca eine halbe
Stundeangetaut.Danachwird 1O g einer,wie in 33.1 beschrieben,
vorberetteten
Kornprcbebzw_5 g ejnerStroh-oderSproßprobein ein 8OOml Becherglaserngewogen,
mit 150 ml Trinkwasserund 1 ml Essigsäure(pH 3 _ 4) versetzt.Das probenmateriat
/
Wasser-Gemisch
wird ca. 2 Stundeneingeweicht.Nachdem Ejnweichengibt man 3OO
ml Acetonund 2 LöffelCelitezu und extrahiertmit einemUltraturrax
ca. 3 min bei 2.lOOO
Umdrehungen/min.
-Vefteitung
b) Flü ssig-Flüssig
Der Wasser/ Aceton-Extrakt
aus a) wjrd über eine Glasfrittemit feinem Filterbodenln
elnenScheidetrichter
(500mt)abgesaugtt\ransättigtmit Natriumchtorid
ab (Zugabevon
ca.40 g), gibt 150ml Dichlormethan
hinzuund läßtnachEnflüften
30 Minutenaut etner
Schüttelmaschine
phasen
unterVerrnischung
der
schütteln.
'10 rvrinuten
zur Phasentrennung
räßt man den scheidetrichtef
stehen Die untere.
wäßrigePhase wird verworfen.Die organischephase filkiertnan durch
einen 10 cm
Trichter,
der Glaswolle
undeine5 cm hoheSchichtan Natriumsulfat
enthält
133
Das Filtratwird in einem 5OOml Rundkolben
aufgefangen Scheidetrichter
und Fitter
werden zweimarmit je 20 mr Essigsäureethyrester
nachgespürt.Das Firtrar".rd am
Rotationsverdampfer
tast bis zur Tro
Essissäu.eethyrester
wird
soranse
":ln :ffi#J.j,,";:X1TJ:"r:::il:,,:
und die
Dichlormethanphase
vollstäl
abgezogen sind (kein Essigsäuregeruchl)
Anschrießend
wird der Rr.rckstano
mitcn
a. 20 mlAcetonnocheinmaleingeengt.
c) Methylierungmit Diazomelhan
Der Rückstandvon b) wird für die Anajysevon
Komprobenquantitatjvmit AceronIn etn
Methylierungsgefäß
übergespült
und auf 5 ml aufgefüllt.
Rückständevon Stroh-oder Sproßproben
werdenquantitativmit Acetonin einen
10 mt
l\,leßkolbenübergespült und aufgefüllt.
Ejn Aliquot von 2 ml wtro In etn
Methyljerungsgefäß
übergeführt
und auf 5 ml aufgefüllt.
lm Reaktionsgefäß
tegtman ca. iO ml Diethylengtycot
/ Katilauge
vor und eMarmtdie
Lösung auf 40 - 50.C. Nun wird Stickstoff
durch die Apparaturgeleiter und das
Methylierungsgefäß
probe
mit der
ar
5 bis 1o rropfen N-Methyi-N-nitroso-pjdrösunn*"ro"n ,nn"rntn"nängt
toruorsurfonam
uon 10 sekundenin die Kaliiaugegegeben.
Nach einerMinuteReaktionszeit
js;"::THil:::ffil]'r",:,T::":::#:l
*,r1"'o
soransewiederhortbisimrvethyrierun
(Gelbfäöungim anschließenden
Aceton_Gefäß)
Nach der Methyjierung
wrrd die
Probenlösung
"C
im Stjckstoffstrom
beica. 40 fast bis zur Trockneabgeblasen
uno tn
5 ml n-HexanaufgenommenDie Abbildung
6_1 zeigt den den Aufbau einer
Methylierungsapparatur.
Abb. 6-1 Apparatur zu Methylierungmit Diazomethan
ilb*-*---
134
d) Minikie selgeIreinigung
Für die Minikieselgelreinigung
wird desaktiviertes
Kieselgel(Wassergehatt
1,5 o/o(w/w))
eingeseEt.Dazuwird ca. 120 g Kieselget
über Nachtbei .130.C im Trockenschrank
gelagert.
NachAbkühlen
im Exsikkatorwird
98,5g Kieselget
und1,5g Leitungswasser
in
einen 500 ml Noppenkolben
(Noppen:zur Vergrößerungder Oberfläche)erngewogen.
Dieserwird 5 Stundenan einem Rotor(2.8. Rotationsvakuumverdampfer)
mit kleinstel
umdrehungbewegt( zur gleichmäßigen
Ver-teilungdes Wassers).
Die Minichromatographiesäule
wi.d mit etwas Glaswattegestopft und mit n-Hexan
gefüllt.Dannläßtman langsam1 g des desaktivierten
(Wassergehall
Kleselgels
1,5 o/o
w/w) in die Säule rieselnund bedecktdie luftblasenfreie
Füllungmit einer 1 cm hohen
Schichtan Natriumsulfat.
N4anwäscht die Säule mit dem in der Säule befindlichenn-Hexan.Mit ejner
Pasteuerpipettewird die Lösung von c) auf die Säule gespült und bis zur
Natriumsulfatschicht
abgelassen.
Anschließend
spültmandie Säulefünfmalmitje 1 ml
n-Hexannachundeluiertalle4 Komponenten
mit20 ml einerMischung
aus95 o/oToluol
und 5 % Aceton(v/v).Das Eluatwird am Rotationsverdampfer
eingeengt,mit Toluolauf
'10m|-Meßkolben,
Volumen (Korn: in
Sproß: in l0mlMeßkotben.Stroh. in 5mtMeßkolben)gebracht.Vor der gaschromatographischen
Bestimmungist so zu
verdünnen,
daß das Injektionsvolumen
von 1 pl mind.je j0 pg der zu analysierenden
Substanzen
enthält.
Arbeitsvorschrift
ll (lvlikrowellenunterstützte
ExtraktionunterDruck)
a) Extraktion
5 g angetauteSproß-oder Kornprobe,3 g Strohprobe(unterVoöehalt, da Optimierung
noch nicht abgeschlossen)
(Vorbereitung:
vgl.3.2.'l) wird in ein Extraktionsgefäß
eingewogen-l,4angibt ein bestimmtesVolumen(vgl. jeweiligeExtraktionsparameter)
einesGemisches
Aceton/ Wasser2:1 (v/v),das mit Essigsäure
angesäuert
wird (pHWert 3 4), hinzuverschließt
das Gefäß,setztes in den Drehteller
und bautdjesenin
das Mikrowellensystem
ein. Das Kontrollreferenzgefäß
wird mit dem Temperatur-und
Druck-Kontrollsystem
verbunden.
b) Flü ssig-Flüssig-Ve
fteilung
Nach der Extraktion
und dem Abkühlendes ExtraktesaLtsa) wird dieserüber eine
Glasfritte
mitfeinemFiltetuoden
in einenScheidetrichter
(1OO
ml)abgesaugt.
Mansättigt
mit 3 g Natriumchlorid
ab, gibt 20 mt Dichtormethan
hinzuund läßt nach Enflüften
30
Minutenauf einerSchüttelmaschine
untefVermischung
der phasenschütteln.