sérgio luiz pereira variabilidade genética em cracídeos e

Transcrição

SÉRGIO LUIZ PEREIRA
VARIABILIDADE GENÉTICA EM CRACÍDEOS E
MONITORAMENTO DE POPULAÇÕES
REINTRODUZIDAS EM ÁREAS REFLORESTADAS
Dissertação
apresentada
ao
Departamento de Biologia do Instituto
de Biociências da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de
MESTRE EM CIÊNCIAS, Área de
Biologia/Genética
São Paulo
1996
SÉRGIO LUIZ PEREIRA
VARIABILIDADE GENÉTICA EM CRACÍDEOS E
MONITORAMENTO DE POPULAÇÕES
REINTRODUZIDAS EM ÁREAS REFLORESTADAS
Dissertação apresentada ao
Departamento de Biologia do
Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo,
para obtenção do título de
MESTRE EM CIÊNCIAS,
Área de Biologia/Genética
Orientador: Dra. Anita Wajntal
São Paulo
1996
Agradecimentos
À Dra. Anita Wajntal, pela orientação, confiança e ensinamentos dispendidos
durante a realização deste trabalho.
À Dra. Célia P. Koiffmann, chefe da Unidade de Aconselhamento Genético deste
Instituto, onde esse trabalho foi realizado.
Aos Drs. Carlos F. M. Menck, Mayana Zatz e Maria Rita de P. Bueno pela
pemissão do uso de seus laboratórios e equipamentos, e a seus técnicos e pósgranduados.
Ao Dr. Paulo A. Otto pela discussão de algumas fórmulas aqui aplicadas.
À Bióloga Cristina Y. Miyaki por me ensinar as técnicas de Biologia Molecular
aqui usadas e pelo apoio constante em todos os momentos.
À CESP pelo permissão dos estudos de suas aves cativas e de vida livre, na
pessoa do Engenheiro Florestal Eduardo Guilherme Santarelli, do Biólogo Wagner T. V.
Santiago e do Zootecnista José Gustavo Tonhasca.
Aos criadores Carlos Keller e Victor Fasano do Criadouro Tropicus, Maurício dos
Santos do Criadouro Científico Chaparral, e aos Parque Zoológico de Sorocaba (Dr.
Adauto L.V. Nunes) e de Americana (Dr. Avelino Estevan Filho), por permitir o estudo
de suas aves.
À médica veterinária Iara Biasia e equipe técnica da CESP (Companhia
Energética de São Paulo) pela coleta de sangue das aves aqui estudadas.
Ao biólogo Luiz F. Sanfilippo, chefe da Secção de Aves da Fundação Parque
Zoológico de São Paulo pelas fotos de cracídeos, algumas usadas aqui como figuras
ilustrativas.
Aos amigos Aldrin, Joca e Porfírio pelo incentivo de sempre.
Aos amigos da Unidade de Aconselhamento Genético (Alessandra, Cíntia (Z),
Claudia Regina, Cris Miyaki, Cristiani, Felipe, Humberto, Luceleni, D. Lurdes, Marcelo,
Maria, Maria Cris, Mônica, Pat, Renato, Rosana, Roseli, Sílvia, e tantos outros que por
aqui passaram), do CRUSP e pós-graduandos do IBUSP.
Ao amigo Paulo C. Maiorka pela leitura e correção gramatical desta dissertação.
Aos meus pais José e Cida por sempre acreditarem em mim.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela concessão da bolsa de Mestrado (processo no: 130017/94-9).
Ao CNPq e à Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo
(FAPESP) pelo financiamento dos projetos de pesquisa da Unidade de Aconselhamento
Genético.
Aos meus irmãos Silvio
José, que me foi tirado pela
Vida, e Marco Antônio, que
me foi tirado pela Morte.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO
1 - Variabilidade Genética e Conservação
2 - Estratégias para se Estabelecer Novas Populações
3 - Exemplos de Estabelecimentos de Novas Populações
4 - Cracídeos
5 - Técnicas de Identificação Individual através do DNA
6 - Origem e Função dos Minissatélites
7 - Aplicações do “DNA Fingerprinting”
8 - “DNA Fingerprinting” em Estudos Populacionais
9 - Identificação Individual Através do DNA e Conservação
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OBJETIVOS
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MATERIAL E MÉTODOS
1 - Caracterização da Amostra Estudada
1.1 - Programa de Reintrodução de Aves da CESP, Paraibuna
1.2 - Aves de Zoológicos e Criadouros Particulares
1.3 - Casuística Estudada
2 - Contenção das Aves e Coleta de Sangue
3 - Técnica de Identificação Individual Através do DNA
3.1 - Extração de DNA
3.2 - Digestão do DNA com Enzimas de Restrição
3.3 - Transferência Capilar
3.4 - Sondas de Minissatélites
3.5 - Hibridação com Sonda Radioativa
3.6 - Lavagem das Membranas e Exposição a Filmes de Raio-X
3.7 - Dehibridação das Membranas
3.8 - Análise dos Padrões de Bandas
4 - Estimativa do Número Mínimo de Locos de Segregação Independente
5 - Estratégias de Comparação dos Padrões Multilocos entre Populações
de Cativeiro e de Vida Livre
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RESULTADOS
1 - Determinação de Padrões Multiloco
2 - Variabilidade Genética de Várias Espécies de Cracídeos
2.1 - Crax blumenbachii
2.2 - Crax fasciolata
2.3 - Nothocrax urumutum
2.4 - Penelope obscura bronzina
2.5 - Penelope superciliaris jacupemba
2.6 - Pipile jacutinga
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3. Determinação de Filiação
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4 - Estudo de Segregação de Bandas
4.1 - Estudo de Segregação em Penelope obscura bronzina
4.2 - Estudo de Segregação em Pipile jacutinga
5 - Estimativa da Heterozigosidade Média em Cracídeos
6 - Orientação Genética para um Programa de Reprodução em Cativeiro
6.1 - Orientação Genética em Crax blumenbachii
6.2 - Orientação Genética em Penelope obscura bronzina
6.3 - Orientação Genética em Penelope superciliaris jacupemba
7 - Programa de Reintrodução de Cracídeos na Natureza
7.1 - Programa de Reintrodução de Penelope obscura bronzina
7.2 - Programa de Reintrodução de Penelope superciliaris jacupemba
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DISCUSSÃO
1 - Técnicas de Identificação Individual Através do DNA em Cracidae e
em Outras Espécies
2 - Estimativa da Variabilidade Genética das Espécies de Cracídeos
Estudadas e sua Distribuição Geográfica Histórica
3 - Aplicação da Técnica de Identificação Individual Através do DNA em
Programas de Criação em Cativeiro
3.1 - Comprovação de Paternidade
3.2 - Orientação de Acasalamentos
Detectados com as Sondas Utilizadas
5 - Programa de Reintrodução na Natureza
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RESUMO
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SUMMARY
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Genética e Conservação de Cracídeos
VARIABILIDADE GENÉTICA EM CRACÍDEOS E MONITORAMENTO DE
POPULAÇÕES REINTRODUZIDAS EM ÁREAS REFLORESTADAS
INTRODUÇÃO
1 - Variabilidade Genética e Conservação
Mudanças climáticas, sucessão ecológica, doenças e vários outros eventos
modificam as populações animais e vegetais, podendo levá-las às extinção.
Atividades humanas, como por exemplo desmatamento de florestas para
consumo madeireiro e desenvolvimento agropecuário e caça indiscriminada de
certos animais para finalidades esportiva ou processamento de produtos para
consumo humano, produzem sobre as populações um efeito devastador maior
que os das catástrofes naturais. As espécies nem sempre conseguem se
recuperar, especialmente as que apresentam maior intervalo de tempo entre duas
gerações e menor número de descendentes produzidos a cada geração.
As
extinções atuais são causadas principalmente devido à ação do homem, e podem
ser comparadas às ocorridas durante a última glaciação. Muitas vezes mudanças
ambientais impõem novas pressões seletivas: uma população que use recursos
limitados para sua sobrevivência, por exemplo, pode não conseguir adaptar-se às
novas condições simplesmente devido à insuficiência de recursos e à perda de
variabilidade genética característica de população de tamanho reduzido. Nestas
condições a evolução de novas espécies fica comprometida e a taxa de extinção
supera em muito o surgimento de novas espécies que venham a ocupar o papel
biológico das que se extinguiram.
Populações maiores têm maior probabilidade de sobrevivência ao longo do
tempo do que populações menores, colonizando habitats desocupados e
formando novas populações. Várias populações de uma mesma espécie que
permutam ao menos alguns indivíduos entre si, fenômeno denominado
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metapopulação, vem diminuindo devido à interferência humana, chegando a um
ponto onde a população não sobrevive por si só. Isso deve se ao fato de que
estas populações se tornam cada vez mais isoladas e a migração de indivíduos
torna-se mais rara. Uma vez que uma população é diminuída a um certo número
de indivíduos por perda, degradação ou fragmentação de habitat ou por
superexploração humana, ela tende rapidamente à extinção.
Pequenas populações estão sujeitas a declínio rápido em números e
extinções locais devido a fatores genéticos (perda de variabilidade genética por
deriva genética e endocruzamento), demográficos (flutuações devido a variações
aleatórias nas taxas de natalidade e mortalidade) e ambientais (flutuações nas
taxas de predação, competição, doenças e suprimento de alimento) e catástrofes
naturais (fogo, inundações, erupções vulcânicas, tempestades e estiagem).
A perda da variabilidade genética em
populações pequenas tende a
ocorrer aleatoriamente, causando mudanças nas freqüências alélicas e
genotípicas, fixando alguns alelos e
eliminando outros, processo este
denominado deriva genética. Isto resulta em falta de flexibilidade evolutiva
e
níveis maiores de endocruzamento, principalmente em populações com número
efetivo pequeno.
Estratégias de conservação ex-situ (manutenção de indivíduos em
condições artificiais sob supervisão humana) são recomendadas para espécies
que não apresentam boas chances de sobreviver ou aumentar em números ao
longo do tempo. Várias espécies consideradas extintas na natureza são mantidas
em cativeiro, como no caso do cervídeo Elaphurus davidianus (Primack, 1993;
Mallinson, 1995), cavalo-de-Przewalski Equus caballus przewalski (Primack,
1993: Mallinson, 1995), mutum-de-Alagoas Mitu mitu (Nardelli, 1993), bisão
europeu Bison bonasu (Mallinson, 1995), oryx árabe Oryx leucoryx (Mallinson,
1995), furão-de-pés-pretos Mustela nigripes (Cohn, 1991; Mallinson, 1995) e
condor-da-Califórnia Gymnogyps californianus (Mallinson, 1995).
Métodos de conservação ex-situ podem ajudar a preservar as espécie de
várias formas:
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a) indivíduos de populações cativas podem ser liberados periodicamente
na natureza para manter o número e a variabilidade genética de populações
naturais;
b) pesquisas sobre a biologia da espécie e novas estratégias de
reprodução podem ser feitas e testadas em populações cativas;
c) reprodução em cativeiro evita a necessidade de se retirar mais animais
da natureza;
d) uma campanha educacional pode ser desenvolvida com o público para
mostrar a necessidade de se proteger a espécie e seu habitat natural.
2 - Estratégias para se Estabelecer Novas Populações
O estabelecimento de novas populações silvestres de animais raros, ou
ameaçados, além do aumento em número de indivíduos em populações silvestres
existentes, fazem parte das estratégias de conservação ex-situ. Sua necessidade
se faz quando existem ameaças geográficas (declínio populacional ocorrido no
passado ou atualmente, tamanho reduzido a níveis críticos, desvio na razão
sexual ou estrutura etária da população) e/ou genéticas (perda de variabilidade
genética potencialmente adaptativa, depressão por endocruzamento).
Catástrofes naturais também podem levar populações à extinção,
especialmente populações de tamanho reduzido. Populações silvestres têm
maiores probabilidade de sobrevivência após catástrofes naturais do que
populações cativas. Isto se deve ao fato de haver maior carga genética em
populações cativas, que não sofrem um efeito seletivo tão forte quanto à carga
genética de população nativas.
Programas de reintrodução, de introdução e de aumento populacional são
as estratégias básicas para estabelecer novas populações animais (Primack,
1993), contudo, diferentes habitats contém uma composição faunística e florística
próprias, e a introdução de animais e vegetais exóticos podem resultar na perda
da diversidade de espécies existentes. Exemplos de extermínio de espécies
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nativas através da introdução antropomórfica de
espécies exóticas são
numerosos e documentados cientificamente. Savidge (1987) relata que em uma
ilha do Pacífico 10 espécies endêmicas de aves chegaram ao ponto de extinção
devido à introdução de Boiga irregularis, uma espécie de cobra arborícola. Os
programas de recuperação de espécies envolvem a soltura de animais em
populações que devem ter aumento no número de indivíduos ou em áreas onde
novas populações podem ser estabelecidas.
Um programa de reintrodução (ou translocação) envolve a liberação de
animais nas áreas de sua distribuição histórica, onde a espécie não mais ocorre.
O principal objetivo destes programas é criar uma população nova no ambiente
original. Freqüentemente os animais são liberados nos locais onde seus
ancestrais foram coletados para garantir sua adaptação genética ao ambiente.
Quando a área de ocorrência da espécie está depauperada a ponto da
espécie não ter mais capacidade de sobreviver, ou se dentro de sua área de
ocorrência a espécie estiver extinta, ou em grande declínio, os programas de
reintrodução podem ser ineficientes se o fator principal do declínio ainda estiver
presente (Conant, 1988). Então a liberação de animais em áreas fora de sua
distribuição histórica pode ser a única solução para se estabelecer uma nova
população. Esse tipo de estratégia é denominada introdução.
Programas de aumento populacional (“restocking”) envolvem a soltura de
animais em populações já existentes com a finalidade de aumentar o número de
indivíduos e a variabilidade genética populacional.
Efeitos negativos podem surgir nos programas que objetivam recuperar
espécies em extinção ou que apresentem declínio populacional:
a) homogeneização da composição genética em uma população se ocorrer
diminuição de diferenças interpopulacionais;
b) perda irrecuperável da informação genética nas histórias evolutivas
intraespecíficas das populações;
c) perda da capacidade de adaptação local através da introdução de
material genético que produz quebra de complexos gênicos co-adaptados;
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d) surgimento de dificuldades reprodutivas se os indivíduos translocados
diferem cariotipicamente dos indivíduos da população receptora ou se
apresentam características genéticas diferentes, diminuindo a aptidão de seus
descendentes;
e) modificação na estrutura social e estabilidade populacional da população
receptora;
f)
espalhamento
subsequente
das
formas
introduzidas
em
áreas
adjacentes onde a população receptora não ocorre;
g) introdução não intencional ou espalhamento de parasitas e vetores de
doenças;
h) criação de um falso senso de manejo monitorado em situações onde
repetidas translocações a partir de uma fonte demograficamente forte são
perdidas numa população receptora que não se auto-sustenta e representa um
sumidouro geográfico (IUCN/SSC/CBSG, 1991).
Manipulações humanas em populações naturais podem ser a principal
fonte de mudanças na freqüência gênica e nos níveis de variabilidade genética
dentro e entre populações. Em poucas gerações os efeitos podem ser
pronunciados especialmente em populações muito pequenas de espécies
ameaçadas, ou após novas populações serem fundadas por reintrodução ou
translocação. Novas populações de ibex alpino Capra ibex ibex estabelecidas na
Europa foram analisadas geneticamente por Scribner & Stüwe (1994), onde
verificou-se que as freqüências alélicas de vários locos divergiram grandemente
em poucas gerações após as translocações ou dispersão natural terem ocorrido a
partir de uma fonte ancestral comum. As populações fundadas por dispersão
natural divergiram em menor grau da população fonte do que as populações
fundadas por translocação o fizeram.
Subespécies que evoluíram recentemente, mas que já se encontram
ameaçadas, podem ser eliminadas pelos programas de translocação se ocorrer
hibridação com outras subespécies, diminuindo as diferenças genéticas entre elas
e revertendo o processo de diferenciação (Arano et al., 1995).
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Aves e mamíferos mantidos em cativeiro podem não ter os requisitos
necessários
para
sobreviver
na
natureza.
Algumas
espécies
requerem
treinamento social e comportamental antes de serem liberadas na natureza, e
freqüentemente algum tipo de monitoramento posterior ainda se faz necessário. O
estabelecimento de novas populações de aves e mamíferos raros é intensificado
quando a soltura ocorre em habitats excelentes dentro de sua área de distribuição
histórica. Populações cativas não manejadas podem apresentar maior coeficiente
de endocruzamento do que as que são manejadas (Frankham, 1995).
Griffith et al. (1989) analisaram detalhadamente 193 programas de
estabelecimento de novas populações de aves e mamíferos conduzidos entre
1973 e 1986. Nesse estudo foi verificado que:
a) espécies menos ameaçadas se recuperam melhor do que espécies mais
ameaçadas;
b) habitat de melhor qualidade suportaram melhor novas populações do
que habitats depauperados;
c) solturas no centro da área de distribuição histórica tiveram maior
sucesso do que solturas realizadas na periferia da área histórica de distribuição
ou fora dela;
d) animais capturados na natureza se adaptaram melhor à nova área do
que animais mantidos em cativeiro;
e) herbívoros se adaptaram melhor ao local de soltura do que carnívoros.
Cade & Temple (1995) analisaram 30 programas de manipulações
intensivas em espécies raras de aves, apresentadas em um Simpósio sobre
Técnicas de Manejo para a Preservação de Aves Ameaçadas realizado em 1977.
Os autores agruparam as técnicas de manejo em sete categorias e
estabeleceram uma escala de quatro categorias para avaliar o grau de sucesso
do programa. Foi verificado neste levantamento que 43% dos programas
contribuíram para melhorar a viabilidade da população, aumentando o número de
nascimentos, 23% ajudaram a estabilizar o número populacional ou diminuir a
taxa de declínio, 17% foram não conclusivos, e outros 17% não obtiveram êxito. A
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manipulação humana tem se mostrado útil para evitar a extinção de espécies
ameaçadas, reintroduzir a espécie em sua área de distribuição histórica e
aumentar o número de indivíduos de populações já existentes.
3 - Exemplos de Estabelecimento de Novas Populações
Diversos programas de recuperação de espécies ameaçadas vem sendo
realizados mundialmente. O Grupo de Especialistas em Reintrodução da IUCN
(“International Union for Conservation of Nature”) publicou um guia para
reintrodução de espécies ameaçadas (IUCN/SSC/RSG, 1992), onde propõe em
linhas gerais os aspectos que devem ser verificados antes que um programa de
reintrodução seja montado, incluindo o planejamento, preparação e estágios de
solturas e atividades pós-solturas.
Uma espécie de mustelídeos, o furão-de-pés-pretos Mustela nigrepes,
sofreu grande declínio populacional na primeira metade deste século,
presumivelmente devido ao desenvolvimento agrícola nas pradarias da América
do Norte onde a espécie ocorria, e devido à redução populacional em sua
principal presa. A espécie foi considerada extinta na natureza (Cohn, 1991;
Mallinson, 1995; Primack, 1993). Recentemente doenças como a cinomose
levaram a espécie a um maior declínio populacional.
Em meados dos anos 70, um programa de reprodução em cativeiro
começou a ser realizado com animais capturados na Dakota do Sul, e em 1981
uma colônia de Mustela nigripes foi descoberta no noroeste do estado de
Wyoming. Entre 1987 e 1991, após várias falhas na tentativa de recuperar a
espécie a população subiu para 311 indivíduos, e 49 animais foram liberados na
natureza em 1991, e mais 90 animais em 1992 quando a população cativa estava
em 347 indivíduos (Primack, 1993).
O condor-da-Califórnia Gymnogyps californianus é outro exemplo bem
estudado de espécie praticamente extinta que vem sendo recuperada (Snyder &
Snyder, 1989). A causa aparente de sua extinção é a perda de habitat (O’Brien,
7
1994). Em 1986 a população de condores consistia de seis aves silvestres e 21
cativas. As aves silvestres foram capturadas na natureza e levadas para cativeiro
para se iniciar um programa de reprodução em cativeiro. Não havia certezas de
que a espécie se reproduziria em cativeiro e várias medidas foram tomadas,
inclusive privação de contato direto com a espécie humana. Em 1992, a
população cativa dobrou seu tamanho, e um casal foi liberado na natureza. Ainda
é necessário monitoramento deste casal para averiguar sua adaptação ao
ambiente (Primack, 1993).
O dano causado aos ovos e embriões do falcão peregrino Falco peregrinus
pelo uso de inseticidas agrícolas é a principal causa de redução das populações
desta espécie. A sua reprodução em cativeiro iniciada no início dos anos 70 foi
um sucesso. O contato com humanos foi minimizado ao máximo e até hoje mais
de 3500 aves já foram liberadas na natureza (Luoma, 1992). Os jovens foram
alimentados até aprenderem a voar e capturar seu próprio alimento. Excluindo-se
as populações mexicanas e canadenses, estima-se que as populações
americanas do falcão peregrino atinjam 1200 pares reprodutores, e o governo
americano está estudando a possibilidade de retirar essa espécie das listas de
espécies ameaçadas uma vez que os objetivos de recuperação foram atingidos.
Atualmente existe apenas uma população de ibis Geronticus eremita
vivendo no noroeste da África, que teve uma redução populacional de 87% em 50
anos, e outra na Turquia e leste da África, onde a redução populacional chegou a
99% num período de 30-35 anos.
As principais causas da diminuição
populacional desta aves são mudanças climáticas, caça e, mais recentemente,
contaminação por inseticidas agrícolas (Akçakaya, 1990).
Um projeto de reprodução destas aves em cativeiro foi iniciado no final dos
anos 70. Em 1981 iniciou-se a reintrodução delas na natureza. Até 1990 67 aves
haviam sido liberadas (Akçakaya, 1990). A falha no aumento da população de
Geronticus eremita pode ser atribuída ao baixo sucesso reprodutivo desta
espécie, principalmente em cativeiro, à não migração dos espécimens
reintroduzidos juntamente com as aves silvestres, e à alta mortalidade durante o
8
inverno (Akçakaya, 1990). Várias possibilidades de soluções para estas falhas de
recuperação da espécie são levantadas nesse estudo.
As tartarugas angonoka Geochelone yniphora e a gigante-de-Aldabra
Geochelone gigantea são duas espécies ameaçadas nas ilhas africanas do
Oceano Índico, apresentando tamanho populacional e história natural diferentes e
então requerem medidas conservacionistas diferentes. Para a primeira espécie a
baixa variabilidade genética e pequeno número populacional são os maiores
problemas a serem resolvidos,
enquanto para a segunda, a distribuição
geográfica limitada é que deve ser ampliada (Primack, 1993). Geochelone
yniphora apresenta menor tamanho populacional que G. gigantea. Cerca de 400
indivíduos
de
G.
yniphora
vivem
na
natureza,
em
Madagascar,
e
aproximadamente 50 em cativeiro. A reprodução em cativeiro não obteve êxito.
Uma colônia de G. gigantea foi estabelecida entre 1978 e 1982, e recenseada em
1986. Menos da metade dos indivíduos reintroduzidos estavam presentes, ao
contrário do que ocorria nos primeiros anos do programa. Colecionadores
continuaram a coletar ambas as espécies na natureza para tê-las como animais
de estimação.
Para a mesma carga genética e mesmo nível de endocruzamento, a
probabilidade de sobrevivência de um indivíduo em cativeiro é maior do que na
natureza (Frankham, 1995), uma vez que ele fica protegido de acidentes naturais
e predadores além de ser sempre alimentado. Contudo, isso não ajuda a
preservar a espécie, principalmente no caso da angonoka que tem distribuição
mais restrita e quanto menor o número de indivíduos presentes, menor a
probabilidade de encontrar um parceiro para acasalar, uma vez que estas
tartarugas têm hábitos solitários (Primack, 1993).
No Brasil o mico-leão-dourado Leontopithecus rosalia sofreu uma drástica
redução em seu tamanho populacional devido à destruição progressiva da Mata
Atlântica e ao comércio ilegal. Como a espécie reproduz bem em cativeiro, um
programa de reintrodução de animais na natureza foi estabelecido nas últimas
duas décadas. Entretanto, acostumados às condições de cativeiro, os micos são
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incapazes
de sobreviver na natureza e um programa de readaptação às
condições naturais deve ser realizado para se obter sucesso no estabelecimento
de novas populações de mico (Primack, 1993). Essa não é uma tarefa fácil de ser
realizada. Uma série de métodos para promover comportamentos semelhantes
aos naturais foram tentadas. A efetividade desses métodos ainda é incerta nessa
espécie.
Atualmente os micos estão sendo liberados na natureza sem um prétreinamento, mas é dado alimento em estações de alimentação nos 18 primeiros
meses após a soltura. A captura de animais silvestres para acasalar com animais
de cativeiro também é efetiva nas interações sociais. Os micos cativos adquirem
o comportamento dos micos silvestres mais facilmente do que os micos que não
tiveram contato com micos retirados da natureza, podendo sobreviver melhor
quando forem liberados.
Entre 1984 e 1991, 91 micos-leão-dourado foram soltos na Reserva
Biológica de Poço das Antas, e um terço estava sobrevivendo em meados de
1991. Um total de 51 filhotes nasceram de animais liberados, e 38 sobreviviam
em 1991 (Primack, 1993), aparentemente sem problemas etológicos resultantes
da descendência de pais mantidos em cativeiro (Luoma, 1992). A capacidade de
suporte da Reserva Biológica Poço das Antas foi atingida e pretende-se liberar os
micos em áreas adjacentes à Reserva na tentativa de se estabelecer uma
população geneticamente viável para os próximos 50 a 100 anos.
4 - Cracídeos
A ordem Galliformes (Classe Aves) compreende sete famílias, incluindo
Cracidae. Esta família conta com 11 gêneros, 50 espécies e cerca de 60
subespécies. Recentemente Nardelli (1993) revisou a taxonomia dos cracídeos,
verificando que há forte necessidade de se padronizar sistematicamente este
grupo, especialmente devido à condição de ameaça de extinção em que eles se
encontram. Sibley et al., (1988) propõem a separação do grupo em uma ordem
10
diferente dos Galliformes, a ordem Craciformes, composta de duas subordens,
que incluiria os cracídeos (Craci) e os megapodídeos (Megapodii). Entre
ameaçadas de extinção e possivelmente ameaçadas, são incluídas cerca de 20
espécies de cracídeos no livro vermelho de aves ameaçadas de extinção (The
ICBP/IUCN Red Data Book) publicado pelo Smithsonian Institution e pelo
Conselho Internacional de Preservação de Aves (Collar et al., 1992).
Fósseis do Terciário (50 milhões de anos) da América do Norte e
Pleistoceno (20 mil anos) do Brasil indicam que os cracídeos pertencem à
avifauna entre as mais antigas do Hemisfério Sul. Atualmente distribuem-se do
Texas, sul do Estados Unidos da América, ao Uruguai e Norte da Argentina (Sick,
1993). Algumas espécies como o mutum-de-penacho Crax fasciolata, o
jacupemba Penelope superciliaris, apresentam ampla distribuição geográfica,
enquanto outras espécies, como o mutum-do-sudeste Crax blumenmbachii, o
mutum-de-Alagoas Mitu mitu, estão restritas a pequenas áreas. Muitas espécies
de cracídeos apresentam distribuição distinta de outras espécies, mas algumas
espécies de gêneros diferentes coexistem numa mesma região geográfica
(Delacour & Amadon, 1973; Sick, 1993).
De hábito arborícola, as espécies brasileiras podem ser reconhecidas em
quatro biótipos distintos, aracuãs, jacus, jacutingas e mutuns. Alimentam-se
basicamente de folhas e frutos, completando a alimentação com ovos, larvas,
insetos, moluscos, pequenos mamíferos e aves ninhegas. Formam pequenos
grupos de indivíduos, em geral um casal e seus filhotes (Delacour & Amadon,
1973). O grupo é monogâmico e defende seu território, na época da reprodução,
contra a invasão de outros indivíduos da espécie. Constroem ninhos em galhos
de árvores e arbustos, onde depositam, geralmente, dois ovos. O tempo de
eclosão varia entre 21 e 32 dias, dependendo da espécie e os filhotes
acompanham os pais por alguns meses (Sick, 1993).
No Brasil merídio-oriental o desmatamento e a caça indiscriminada
reduziram drasticamente as populações de várias espécies de cracídeos, como o
jacu-guaçu Penelope obscura, a jacutinga Pipile jacutinga, o mutum-de-alagoas
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Mitu mitu, este último considerado extinto na natureza, o mutum-do-sudeste Crax
blumenbachii, e outras. As penas são utilizadas pelos índios como guarnição de
flechas e confecção de tangas. A população rural da Amazônia utiliza algumas
espécies na alimentação (Sick, 1984). A submersão de matas ciliares e várzeas,
causadas pela construção de barragens hidrelétricas provoca a redução ou
desaparecimento do habitat de diversas espécies (CESP, 1992). Medidas de
conservação da biodiversidade das áreas afetadas por esses empreendimentos
devem ser tomadas, como por exemplo, a realização de um programa de
reintrodução de animais na natureza.
Os cracídeos apresentam boa potencialidade de reprodução em cativeiro,
e essa atividade vem sendo realizada desde o início deste século (Nogueira-Neto,
1973). A reprodução intergenérica também vem sendo obtida em cativeiro, como
por exemplo entre Crax fasciolata x Penelope sp e Pipile pipile cumanensis x
Ortalis canicollis. A produção de híbridos apóia a idéia de parentesco próximo dos
cracídeos entre si. Contudo, do ponto de vista da conservação de espécies, a
formação de híbridos não é muito desejada devido a redução na fertilidade dos
descendentes (Sick, 1984). Vários exemplos de populações de diversas aves que
vem sofrendo redução devido à hibridação com espécies congenéricas são
conhecidos (Simberloff, 1995).
A Seção de Animais Silvestres da Companhia Energética de São Paulo
(CESP) tem reproduzido em cativeiro algumas espécies de Cracidae e
Tinamidae, e reintroduzido os descendentes em áreas reflorestadas ou em matas
remanescentes em sua área de influência na Usina Hidrelétrica no município de
Paraibuna, SP.
Este programa conta com um criadouro de aves dispersoras de sementes
em Paraibuna, com 77 viveiros de reprodução, 21 de recria, 5 de quarentena e 5
de
pré-soltura.
Além
da
produção
de
exemplares
para
repovoamento
experimental, outros objetivos deste programa são a formação de banco genético
de aves silvestres ameaçadas, o desenvolvimento e divulgação de técnicas de
conservação ex situ, e a coleta de dados biológicos das espécies (CESP, 1992).
12
Desde 1986 foram reintroduzidos cerca de 812 indivíduos entre cracídeos
(Penelope superciliaris e P. obscura) e tinamídeos (Tinamus solitarius solitarius,
Crypturellus o. obsoletus, C. parvirostris e C. t. tataupa)(CESP, 1992).
5 - Técnicas de Identificação Individual Através do DNA
Jeffreys et al. (1985a) desenvolveram a técnica de identificação individual
através do DNA (ii-DNA ou "DNA fingerprinting multilocus") possibilitando a
comprovação da identidade e da paternidade em seres humanos. O princípio
básico desta técnica é a detecção de seqüências espalhadas pelo genoma,
compostas de repetições em tandem ("VNTR - variable number of tandem
repeats")(Nakamura et al., 1987), também denominadas minissatélites. Estas
repetições possuem uma seqüência básica (“core”), de cerca de 9 a 100 pares de
bases, rica em guanina e citosina. Ao se digerir o genoma de um indivíduo com
uma enzima cujo sítio de restrição não esteja incluído nas regiões minissatélites,
e utilizando-se uma sonda baseada na seqüência "core" da repetição em tandem,
que pode ser marcada por métodos radioativos (Feinberg & Volgestein, 1983) ou
não (Schäfer et al., 1988), o padrão de bandas obtido é altamente polimórfico. O
polimorfismo deve-se à variação existente no número de repetições destas
seqüências entre locos e mesmo entre alelos de um mesmo loco. As bandas
detectadas são herdadas mendelianamente em espécies de reprodução cruzada,
isto é, um indivíduo apresenta cerca de 50% de suas bandas em comum com o
pai e 50% em comum com a mãe; os fragmentos são heterozigotos na maioria
dos locos e, na espécie humana, não são ligados ao sexo. Excluindo-se o caso
de gêmeos monozigóticos e populações de extremo endocruzamento, o padrão
de bandas obtido é específico para cada indivíduo, tanto em humanos (Jeffreys et
al. 1985a, 1985b), quanto em outras espécies (Jeffreys et al. 1987; Vassart et al.
1987; Miyaki et al. 1993) devido à baixa probabilidade de se encontrar entre dois
indivíduos padrões de bandas idênticos (da ordem de 10-6 a 10-30) considerandose as bandas como locos independentes.
13
O estudo de ligação de famílias grandes, usando-se uma combinação de
sondas/endonucleases adequada, pode trazer informações úteis à respeito da
segregação das bandas, conforme já demonstrado em humanos (Jeffreys et al.,
1986; Wayne & Fourney, 1990), Mus (Jeffreys et al., 1987), Prunella modularis
(Burke et al., 1989), Taeniopygia guttata (Birkhead et al., 1990), Amazona
ventralis (Brock & White, 1991), Salmo trutta (Prodöhl et al., 1994) e Aratinga
aurea (Miyaki et al., 1995). É importante se testar a independência das bandas
sempre que houver disponibilidade de famílias grandes. Isso pode ser mais
facilmente
averiguado
em
peixes,
que
apresentam
maior
número
de
descendentes por geração do que em aves e mamíferos. Também pode ser útil
em estudos de paternidade e identificação o uso de um grupo de cerca de 6
“locos de minissatélite” através de sondas loco-específicas (“single-locus”) (Wong
et al., 1986, 1987; Nakamura et al., 1987). Geralmente sondas multilocos
hibridam seqüências de DNA em uma série de espécies além da que a sonda foi
originada, enquanto as sondas de loco único o fazem raramente (Hanotte et al.,
1991a, b, 1992b).
6 - Origem e Função dos Minissatélites
A origem e a função dos minissatélites não foi elucidada. A região repetitiva
do gene da mioglobina apresenta seqüências diretas repetidas (“direct repeats”)
que podem ter surgido através de uma transposição de uma seqüência ancestral.
Porém, a falta dessas seqüências diretas nos minissatélites e o fato de diferentes
famílias repetitivas terem seqüências “core” muito variáveis, descartam esta
hipótese (Jeffreys et al., 1985a). As repetições poderiam surgir:
a) durante a duplicação ao acaso de uma das fitas do DNA, o que levaria
ao aumento do número de repetições através de alinhamento incorreto e permuta
desigual;
b) permuta desigual durante a meiose originando um novo alelo;
14
c) ou ainda, alinhamento incorreto das fitas de DNA durante a replicação
(“DNA replication slippage”) que levaria à uma modificação no número de
repetições (Jeffreys et al., 1985a).
Armour et al. (1989) analisando mutações somáticas em linhagens
celulares normais e tumorais, propuseram que os minissatélites podem advir de
vários mecanismos, incluindo alinhamento incorreto na replicação, conversão
gênica (veja também: Wolff et al., 1991 e Jeffreys et al., 1994), recombinação
mitótica desigual, troca desigual entre cromátides irmãs e recombinação
intramolecular. Este último mecanismo tem como efeito a diminuição do tamanho
dos alelos, então não pode ser considerado como um mecanismo predominante
(Armour et al., 1989).
A sequência “core” presumivelmente parece estar envolvida na geração
dos minissatélites e/ou na manutenção da variabilidade do número de cópias
destas repetições. Krowczynska et al. (1990) sugerem que certas regiões
próximas a oncogenes, que possuem uma sequência octâmérica semelhante à
sequência Chi [GC(A/T)GG(A/T)GG] de Escherichia coli, já conhecida por
favorecer a recombinação, podem ser sítios de translocação preferenciais se elas
forem capazes de ligar-se aos fatores regulatórios transcricionais tecidoespecíficos. Essas seqüências também estão presentes em minissatélites, alguns
dos quais ligados ou próximos aos oncogenes, sugerindo que os minissatélites
possam agir como sítios preferenciais de recombinação (“hotspots”).
Vários autores descobriram diferentes proteínas que, in vitro, se ligam com
alta afinidade às seqüências dos minissatélites repetidas em tandem (Collick &
Jeffreys, 1990; Collick et al., 1991; Wahls et al., 1990; Yamazaki et al., 1992) e
isso poderá ser um passo a mais na compreensão dos processos envolvendo os
minissatélites. Outras evidências sugerem serem as regiões minissatélites locais
preferenciais de recombinação:
a) demonstração, através de hibridação in situ, de maior concentração de
minissatélites em quiasmas ou regiões próximas (Chandley & Mitchel, 1988);
15
b) taxa de troca desigual para manter o nível de variabilidade estimada em
10-4 por kb de minissatélite humanos (Jeffreys et al., 1985a) é maior que a taxa de
recombinação do DNA como um todo (cerca de 10-5 por kb)(Botstein et al., 1980);
c) demonstração de ligação de uma proteína em apenas uma das fitas, em
seqüências ricas em G (guanina) e que poderia agir como estabilizadora para
conformação de fita simples nos minissatélites (Collick et al., 1991);
d) presença de minissatélites próximos a pontos de recombinação no
complexo principal de histocompatibilidade de camundongo (Steinmetz et al.,
1986).
Contudo alguns argumentos de desequilíbrio de ligação entre marcadores
moleculares são contrários a hipótese de que os minissatélites sejam pontos de
recombinação. Higgs et al.(1986) não encontraram evidências concretas de que
houvesse taxas maiores de recombinação numa região altamente variável, o
complexo da α-globina. Cox et al. (1988) também encontraram desequilíbrio de
ligação na região dos genes da insulina e Fator de Crescimento Semelhante à
Insulina, que se estendia para a região hipervariável (HVR). O desequilíbrio entre
HVR e os fragmentos de restrição (RLFPs) de duas endonucleases localizados a
15 kb de cada lado eram similares, não apoiando a idéia de maior freqüência de
recombinação nesta região.
Mais recentemente, foi demonstrado in vitro que um dos primeiros
minissatélites de mamíferos descoberto, a região polimórfica ligada à insulina
(ILPR, “insulin-linked polymorphic region”), pode se ligar e ativar fatores de
transcrição (Kennedy et al., 1995). O loco IDDM2, que promove susceptibilidade
para diabetes mellitus dependente de insulina foi mapeado no interior de um
minissatélite, após outros polimorfismos terem sido excluídos sistematicamente
como determinantes da doença, e o nível de transcrição in vivo está
correlacionado com a variação alélica dentro do minissatélite (Bennett el al.,
1995).
As seqüências repetitivas são agrupadas em famílias de acordo com a
região “core” e as sequências detectadas pelas sondas de Jeffreys estão
16
espalhadas nas regiões teloméricas, em mais de 80 a 90% dos casos (Royle et
al, 1988). Mais evidências surgem demonstrando ser esse o caso dos
minissatélites (Inglehearn & Cooke, 1989). A proposição de que seriam
autossômicos e espalhados pelo genoma deve-se ao fato de que sítios
cromossômicos internos em ou ao redor de genes eram mais estudados do que o
genoma como um todo. Contudo as regiões teloméricas não são igualmente
representadas por sequências minissatélites, como por exemplo o cromossomo 1
humano, que possui minissatélites na banda 1p36.3, mas não no braço longo.
Telômeros
apresentam
aspectos
peculiares
como
taxa
aumentada
de
recombinação, pareamento inicial preferencial na meiose e alta densidade de
minissatélites (Vergnaud
et al., 1993). No entanto, Christmann et al. (1991)
demonstraram que as sequências detectadas pela sonda M13 distribuem-se
aleatoriamente nos cromossomos humanos.
Conforme previsto na teoria do neutralismo, onde um alelo de valor
adaptativo nulo não é selecionado, o polimorfismo em um loco de minissatélite vai
depender da taxa de mutação (Jeffreys et al., 1988). Uma vez que a maioria dos
minissatélites são não-codificantes a seleção natural não vai influenciá-los
significativamente (Burke et al., 1991). Haverá uma dramática mudança no nível
de variação de heterozigosidade em um loco homólogo mesmo entre espécies
proximamente relacionadas, havendo mesmo ganho e perda freqüente de um
loco (Gray & Jeffreys, 1991).
7 - Aplicações do “DNA Fingerprinting”
As primeiras sondas multiloco desenvolvidas são denominadas 33.6 e
33.15 (Jeffreys et al. 1985a,b), e foram empregadas inicialmente em estudos
forenses (Jeffreys et al 1985,a,b,c; Gill et al. 1985). Novas sondas igualmente
17
úteis na detecção de padrões polimórficos foram desenvolvidas (Ali et al, 1986;
Vassart et al., 1987; Fowler et al., 1988; Pena et al., 1990; Benkel & Gavora,
1993). De alguma forma, qualquer sequência baseada numa repetição em
tandem pode detectar um certo grau variável de polimorfismo (Vergnaud, 1989).
Contudo, são raros os estudos que tentam estabelecer em que extensão
há independência do grupo de locos detectados por diferentes sondas multiloco,
embora Armour et al (1990) e Julier et al (1990) demostraram haver sobreposição
significante entre algumas sondas testadas.
As técnicas de identificação individual através do DNA são aplicadas
atualmente em todos os grupos de organismos, dos mais simples aos mais
complexos e sob vários pontos de vista:
- em diagnóstico médico (Schwartz et al., 1991);
- monitoramento nos transplantes de medula óssea (Thein et al., 1986);
- análises de relações de parentesco em humanos (Pena et al, 1993;
Chakraborty & Jin, 1993) e outros seres (Blanchetot, 1991, 1992; Brookfield &
Parkin, 1993; Bischof & Duffield, 1994; Lang et al., 1993);
- programas de reprodução em espécies em extinção (Bruford & Burke,
1991; Brock & White, 1992; Geyer et al., 1993) e de importância econômica
(Kuhnlein et al, 1991);
- detecção de estruturas clonais de corais (Coffroth et al., 1992), afídios
(Carvalho et al., 1991) e peixes (Turner et al., 1990).
- diferenciação populacional em raposas (Gilbert et al, 1990), em
pseudoescorpiões neotropicais (Zeh et al., 1992) e em amoras pretas e
framboesas (Nybom & Schall, 1990);
- determinação de padrões de dispersão populacional em corruíras
(Rabenold et al., 1991b);
- cálculo de distância genética entre populações em humanos (Jin &
Chakraborty, 1994) e em aves domésticas (Kuhnlein et al., 1989);
- mapas de ligação em carneiros (Crawford et al, 1993);
- análise filogenética em crocodilianos (Aggarwal et al., 1994);
18
- determinação de utilização de esperma em fêmeas artrópodas
inseminadas por diferentes machos (Corley et al, 1993);
- estudos do comportamento reprodutivo em primatas não-humanos
(Dixson et al., 1993; Wickings et al., 1993), em roedores, onde se comprovou a
monogamia, condição rara entre os mamíferos (Ribble, 1991), e em várias
espécies de aves comprovando a ocorrência de paternidade extra-casal (Quinn et
al., 1994; Westneat, 1990),
parasitismo intraninhada (Birkhead et al., 1990;
Choudhury et al., 1993), ou ambos, ou comprovando-se a monogamia em alguns
casos (Haig et al., 1993; Decker et al., 1993 ;Warketin et al., 1994);
- sexagem em espécies sem dimorfismo sexual (Rabenold et al., 1991a;
Longmire et al. 1991; Miyaki et al., 1992; Graves et al., 1993);
- controle de tráfico ilegal (Mathé et al., 1993).
8 - “DNA Fingerprinting” em Estudos Populacionais
Estudos de biologia e evolução de populações requerem a quantificação da
variabilidade genética existente dentro, e entre, estas populações. Regiões
minissatélites têm sido utilizadas para esse propósito, através das técnicas de
identificação individual através do DNA, tanto usando-se sondas de multiloco,
quanto de loco único.
Padrões multiloco são úteis na determinação de filiação, análise da
variabilidade genética da população e em estudos de sistemas reprodutivos. Em
estudos de biologia da conservação geralmente se analisam espécies onde os
métodos tradicionais como alozimas, proteínas falharam em encontrar um certo
nível de variabilidade génetica. Nesses casos os padrões multiloco são mais
informativos (Ellegren et al., 1993; Gilbert et al., 1991; Menotti-Raymond &
O’Brien, 1993; Roelke et al., 1993).
Apesar da vantagem da disponibilidade de várias sondas multiloco, e do
fato delas hibridarem com o DNA de espécies pertencentes a diferentes grupos
animais e vegetais, a complexidade dos padrões multiloco e a dificuldade de se
19
obter o mesmo padrão eletreforético de migração entre géis e hibridações
subseqüentes torna difícil a estocagem dos padrões em bancos de dados. Porém,
Kalnin et al. (1995) aplicaram o método de análise de correspondência de fatores
(FCA, “factor correspondence analysis”) em populações humanas asiáticas. Este
método codifica numericamente dados não quantitativos em um matriz binária,
permitindo a comparação entre géis diferentes.
Existem dificuldades técnicas, além das teóricas e estatísticas que tornam
difícil ou inapropriado o uso de padrões multiloco em estudos de sistemas
complexos de acasalamentos ou em algumas tentativas de revelar a estrutura
genética dentro e entre populações como por exemplo, maior tempo de
levantamento de dados em amostras grandes, maiores gastos financeiros,
dificuldade de se comparar indivíduos em posições não adjacentes em um gel e
mais ainda entre géis diferentes (Bruford et al., 1992). Métodos apropriados de
análise estatística são necessários em alguns casos (Tokarskaya et al., 1994) e
análises estatísticas teóricas vem sendo aplicadas nos cálculos de similaridade
obtidos através das técnicas de identificação individual através do DNA (Lynch
1988, 1990, 1991; Groen, 1993; Chakraborty & Jin, 1993; Yassouridis & Epplen,
1993; Jin & Chakraborty, 1994). O uso de sondas de loco único também pode
permitir a solução destes problemas. Padrões multiloco são eficientes na
detecção de relações de parentesco de primeira ordem, mas não em relações
mais distantes, onde sondas que identificam locos únicos também podem ser
mais úteis para esses casos (Brookfield & Parkin, 1993). Mesmo relações de
parentesco de primeira ordem podem não ser detectadas em populações com
baixa variabilidade genética (Rave et al., 1994). A obtenção de sondas de loco
único pode ser feita à partir de:
a) clonagem de minissatélites específicos da espécies em estudo, sendo
este um processo oneroso, e necessita um grande tempo para ser desenvolvido;
b) aplicação de sondas desenvolvidas para espécies relacionadas à
espécie em estudo, que em muitos casos tem revelado resultados satisfatórios
(Gray & Jeffreys, 1991; Benzten et al., 1991; Hanotte et al., 1991a, b, 1992b);
20
c) testes com sondas minissatélites de espécies não relacionadas
(Saccheri & Bruford, 1993; Robinson et al., 1993; Signer et al., 1994; Lambert et
al., 1994; Dixon et al., 1994);
d) identificação de sequências de minissatélites pertencentes a um loco
específico dentro de um padrão multiloco.
O isolamento de sondas que detectassem minissatélites de um único loco
foi difícil de se realizar, somente se justificando em estudos com humanos e
organismos de importância econômica, até que Armour et al. (1990)
desenvolveram uma técnica de clonagem mais eficiente para a obtenção de
sondas loco-específicas (Hanotte et al., 1991a, b; Bruford & Burke, 1991).
9 - Identificação Individual Através do DNA e Conservação
As técnicas de identificação individual através DNA (ii-DNA ou “DNA
fingerpriting”) têm contribuído para o monitoramento da variabilidade genética de
espécies ameaçadas de extinção e no estabelecimento de programas para sua
recuperação na natureza.
Através de padrões multilocos produzidos pela sonda M13 (Vassart et al.,
1987), Tokarskaya et al. (1994) desenvolveram um método de análise de
estrutura populacional que possibilitou demonstrar diferenças genéticas entre
várias populações cativas do grou siberiano Grus leucogeranus e entre híbridos
dessa espécie com outra congenérica (G. canadensis pratensis). As técnicas de
identificação individual através do DNA não somente foram capazes de
estabelecer relações diretas entre aves do mesmo grupo, mas também foram
aplicadas na diferenciação de indivíduos e grupos, classificando-os em uma
população ou espécie particular. Esse método permite o uso de pequenas
amostras para se obter a informação necessária da população ou espécie em
interesse. Isso pode ser útil em estudos de populações silvestres de espécies
ameaçadas em que amostras de DNA são limitadas pelo número de indivíduos
21
disponíveis ou pela dificuldade em se obter sondas biológicas úteis (Tokarskaya
et al., 1994).
Rave et al. (1994) analisaram duas populações de ganso havaiano Branta
sandvicensis através das técnicas de identificação individual através do DNA.
Neste trabalho foi demostrado que a população fundada por um número maior de
aves e manipulada para a formação de casais evitando acasalamentos
consangüíneos apresentava maior variabilidade genética que a população
fundada por um número menor de indivíduos, e deixada livre para a formação de
casais. Alelos únicos foram encontrados, e as aves que os possuíam eram
liberadas na natureza para aumentar a variabilidade genética de populações
reintroduzidas após ter-se coletado o sêmen (Rave et al., 1994), embora Miller
(1995) argumenta que este tipo de estratégia pode reduzir ainda mais a
variabilidade genética em uma espécie.
Como uma das finalidades dos programas de reprodução em cativeiro é
manter ou aumentar a variabilidade genética entre os indivíduos, a utilidade das
técnicas de identificação individual através do DNA se tornaram evidente na
tentativa de aumentar o sucesso dos programas de reintrodução e manutenção
de populações silvestres deste ganso havaiano (Rave et al., 1994). A população
reintroduzida possui cerca de 400 a 450 aves atualmente (Cade & Temple, 1995).
Não eram conhecidas as relações de parentesco em uma população
africana cativa de coelhos endêmicos e ameaçados (Bunolagus monticularis) e o
uso do “DNA fingerprinting” para o estabelecimento delas não foi possível
(Dippenaar & Ferguson, 1994). O nível de similaridade encontrado entre os 16
coelhos cativos foi alto (68%), e quatro deles que apresentaram menor índice de
similaridade quando comparados com os demais da amostra podem ser úteis
para iniciar um programa de reprodução em cativeiro com a finalidade de
reintroduzir uma população na natureza. Coelhos capturados na natureza
também podem aumentar a variabilidade do estoque cativo, porém sua
similaridade com os coelhos cativos deve ser estabelecida para avaliar a sua
utilidade em tais programas (Dippenaar & Ferguson, 1994).
22
Uma população cativa de condores-da-Califórnia Gymnogyps californianus
teve sua estrutura de relações inferidas a partir de padrões multilocos produzidos
pela técnica de identificação individual através do DNA. Os resultados estavam de
acordo com o que se conhecia da estrutura geográfica da população antes da
população total estar em cativeiro. A população pode ser subdividida em três
grupos. Aconselha-se acasalamento entre aves de subgrupos diferentes ao invés
de acasalamentos entre aves do mesmo subgrupo (Geyer et al., 1993) na
tentativa de reproduzir a espécie em cativeiro. Este projeto faz parte de uma
grande esforço de restabelecer os condores-da-Califórnia na natureza (Snyder &
Snyder, 1989).
O habitat dos ursos, incluindo o urso marrom de Hokkaido Ursus arctos
yesoensis, vem diminuindo mundialmente, assim como as populações de ursos
vem sofrendo declínio. Tsuruga et al. (1994) estudaram minissatélites de uma
população cativa de ursos marrons de Hokkaido para avaliar a utilidade das
técnicas de identificação individual através do DNA em um futuro programa de
manejo desta espécie. A baixa variabilidade encontrada não permitiu a
comprovação da paternidade em alguns casos, mas pode ser útil para comparar
outras populações desta espécie e estimar o grau de endocruzamento nesta
população.
Fleischer et al (1995) analisaram minissatélites, DNA mitocondrial e
polimorfismos de DNA amplificados aleatoriamente (RAPD do inglês “Random
Amplified Polymorphic DNA”), em várias populações com baixa densidade
demográfica de algumas subespécies de uma ave da família Rallidae, que se
encontram isoladas geograficamente. Os autores verificaram que a variabilidade
genética encontrada é similar àquela de outras populações exocruzadas de aves.
As populações de Rallus longirostris levipes apresentam muita similaridade
genética entre si e translocações de alguns indivíduos a cada geração entre
essas populações podem auxiliar a aumentar a sua variabilidade genética.
Possivelmente não deve ocorrer depressão por endocruzamento devido a alta
similaridade interpopulacional encontrada (Fleischer et al., 1995).
23
Populações de uma tartaruga da costa oeste americana, Clemmis
marmorata, vêm apresentando declínio rápido devido a alteração de seu habitat,
distúrbios humanos, além de doenças e introdução de predadores. Baixa
variabilidade foi encontrada nas regiões minissatélites nas populações mais ao
norte em relação as do sul, indicando divisão genética entre as duas populações,
baixo fluxo gênico em direção ao norte e possível efeito do fundador (Gray, 1995).
Programas de recuperação desta espécie devem considerar estas diferenças
para evitar efeitos de erosão genética por exocruzamento e quebra de
adaptações ecológicas (Gray, 1995).
24
OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho são:
- Determinar as condições ideais de estudo de Cracidae com as técnicas
de identificação individual pelo DNA.
- Comparar a variabilidade genética de regiões minissatélites em diferentes
espécies de cracídeos.
- Comprovar a paternidade e maternidade nos casos alegados, e estudar o
grau de similaridade genética encontrado em parentes de primeiro grau.
- Estudar a segregação de bandas de padrões multilocos em famílias com
pelo menos cinco descendentes de um mesmo casal, para estimar o número de
locos de segregação independente que estão sendo analisados.
- Comparar a variabilidade genética de populações de P. obscura bonzina
e P. superciliaris jacupemba, mantidas em cativeiro e populações reintroduzidas
em matas remanescentes e reflorestadas pela Companhia Energética de São
Paulo - CESP (Reservatório de Paraibuna).
- Avaliar o programa de reintrodução de Penelope obscura e Penelope
superciliaris na natureza, realizada pela CESP, e auxiliar a empresa a melhorar o
programa de manejo destas espécies com base em dados genéticos.
- Analisar a população de Crax blumenbachii, espécie ameaçada de
extinção, mantida em cativeiro, bem como uma de Pipile jacutinga e orientar os
criadores para evitar acasalamentos entre matrizes que possuem os maiores
índices de similaridade genética.
25
MATERIAL E MÉTODOS
1 - Caracterização da Amostra Estudada
1.1 - Programa de Reintrodução de Aves da CESP, Paraibuna
A Companhia Energética de São Paulo - CESP, vem desde 1984
desenvolvendo um programa de reprodução de aves silvestres (cracídeos e
tinamídeos) em cativeiro com a finalidade de reintroduzir os descendentes em
áreas reflorestadas e remanescentes florestais no Reservatório de Paraibuna, SP.
Em relação aos cracídeos, a CESP mantém em cativeiro três espécies:
jacu-guaçu Penelope obscura bronzina (24 aves) (Fig. 1d), jacupemba P.
superciliaris jacupemba (20 aves) (Fig. 1e) ambas com descendentes
reintroduzidos desde 1986, e jacutinga Pipile jacutinga (2 aves) (Fig. 1f), ainda em
fase de formação do plantel. Todas as aves cativas destas três espécies foram
amostradas. A maioria dos indivíduos de cativeiro mantidos pela CESP são
provenientes da Zoobotânica Mário Nardelli, Nilópolis, RJ.
As aves nascidas em cativeiro foram incubadas artificialmente após a
postura até a eclosão, exceto em alguns casos em que foi permitido que o ovo
fosse incubado pela fêmea normalmente. Cada ave recebeu uma anilha da CESP
e foi mantida por alguns meses em viveiros de adaptação, para serem
reintroduzidas na natureza. As anilhas da CESP foram substituídas por anilhas do
CEMAVE (Centro de Pesquisas para a Conservação de Aves Silvestres) antes
das aves serem liberadas nas áreas de soltura.
A equipe técnica da CESP ficou encarregada da captura das aves nos
locais onde haviam sido reintroduzidas anteriormente, assim como também foram
responsáveis pela contenção das aves e coleta de sangue, em trabalho
colaborativo com a Unidade de Aconselhamento Genético do Departamento de
Biologia do IBUSP, a partir de dezembro de 1993. Denomina-se aqui “aves de
vida livre” aquelas que foram capturadas nas áreas de reintrodução pertencentes
26
a CESP. Foram capturadas 56 Penelope obscura bronzina, entre os quais 4
tinham anilha, indicando que estas aves haviam sido reintroduzidas anteriormente
e 9 Penelope superciliaris jacupemba, entre os quais apenas uma ave estava
anilhada.
Foi comunicado pela equipe técnica da CESP que as duas espécies de
cracídeos reintroduzidas são igualmente freqüentes, porém o maior número de
Penelope obscura bronzina capturado deve se à diferenças comportamentais
emtre essas espécies.
Na amostra de P. obscura bronzina mantida em cativeiro havia uma família
com 5 filhotes, e dois casos de aves anilhadas capturadas nos locais de
reintrodução em que a paternidade era atribuída a uma das matrizes de cativeiro.
1.2 - Aves de Zoológicos e Criadouros Particulares
Foram estudadas aves pertencentes aos Parques Zoológicos de
Americana e de Sorocaba, ambos no estado de São Paulo, e de dois criadouros
particulares, Criadouro Chaparral localizado em Recife, PE, e Criadouro Tropicus,
localizado em Pirassununga, SP.
Foi estudada uma população de mutum-do-sudeste ou mutum-de-bicovermelho Crax blumenbachii (Fig. 1a), proveniente do Criadouro Chaparral,
composta de 16 indivíduos, sendo indicado que existia um possível casal com
filhote.
Um dos indivíduos não foi considerado na análise devido a erro de
concentração de DNA digerido,
impedindo a visualização acurada dos
fragmentos; dois indivíduos de mutum-de-penacho Crax fasciolata (Fig. 1b)
provenientes do Zoológico de Sorocaba; 14 jacutingas Pipile jacutinga
provenientes do Criadouro Tropicus localizado em Pirassununga, SP, incluindo
um casal com possíveis sete filhotes, 2 indivíduos pertencentes à CESP de
Paraibuna, SP além de 2 pertencentes ao Zoológico de Sorocaba, SP; um casal
de urumutum Nothocrax urumutum (Fig. 1c) e seu possível filhote e um indivíduo
27
a
b
c
e
d
f
Figura 1. Espécies de Cracidae estudadas. a) Crax blumenbachii; b) Crax
fasciolata; c)Nothocrax urumutum; d)Penelope obscura bronzina; e)
Penelope superciliaris jacupemba; f) Pipile jacutinga.
28
supostamente não relacionado, provenientes do Criadouro Tropicus localizado em
Pirassununga, SP.
1.3 - Casuística Estudada
A tabela 1 indica para cada espécie o número e a procedência das aves
que foram estudadas neste trabalho.
Tabela 1. Número (N) e procedência das aves amostradas para cada uma das seis
espécies de cracídeos estudadas.
Espécie
Crax blumenbachii
Crax fasciolata
Penelope superciliaris
Penelope superciliaris (natureza)
Penelope obscura
Penelope obscura (natureza)
Pipile jacutinga
Pipile jacutinga
Pipile jacutinga
Nothocrax urumutum
N
15
2
20
9
2
24
56
2
14
2
4
Procedência
Criadouro Chaparral, Recife - PE
Parque Zoológico de Americana - SP
CESP, Paraibuna - SP
Parque Zoológico de Americana - SP
Criadouro Tropicus, Pirassununga - SP
Parque Zoológico de Sorocaba - SP
Criadouro Tropicus, Pirassununga - SP
Observação: Quando não especificado, as aves são de cativeiro. N = número de indivíduos amostrados
2 - Contenção das Aves e Coleta de Sangue
As aves de cativeiro foram contidas com uma rede tipo puçá. Para a
captura das aves de vida livre, uma rede foi amarrada em uma árvore e no solo
sob ela foi depositado alimento para atraí-las. Uma pessoa permaneceu
escondida em silêncio em uma cabana montada na mata, e soltava a corda que
segurava a rede presa à árvore sobre as aves quando estas estavam se
alimentando da isca. Após exame, coleta de sangue e anilhamento as aves foram
liberadas no mesmo local em que foram capturadas.
A coleta de sangue foi realizada da seguinte maneira: o pescoço, pés,
cauda e uma das asas eram imobilizados por uma pessoa. Uma segunda pessoa
segurava a outra asa aberta, firmando-a contra a mesa para evitar que essa asa
29
se fraturasse. Essa mesma pessoa fazia um garrote na veia braquial. Uma
terceira pessoa esterilizava com álcool o local onde seria introduzida a agulha e
retirava o excesso de penas. As amostras de sangue (0,1 ml) foram coletadas
com seringa de insulina. Após pressão da região puncionada com algodão e
álcool, para estancar eventual sangramento, as aves foram liberadas.
As amostras de sangue coletadas até abril de 1994 (aves de cativeiro e
algumas de vida livre da CESP, e aves do Criadouro Tropicus) foram colocadas
em frascos eppendorfs contendo uma solução de SSC 20x e EDTA 10 mM e
congeladas ou mantidos em etanol absoluto em temperatura ambiente (demais
amostras) a partir desta data. A preservação em etanol não altera a qualidade do
DNA extraído ou dos padrões de bandas produzidos, mas reduz em cerca de
50% a quantidade de DNA extraído (Zeh et al., 1993), porém como não há
necessidade de refrigeração das amostras de sangue, isso facilita as coletas em
campo, transporte e estocagem das amostras.
3 - Técnicas de Identificação Individual Através DNA
Os procedimentos técnicos utilizados no presente trabalho são descritos
por Sambrook et al. (1989) modificados conforme as necessidades dos
experimentos.
3.1 - Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada após incubação a 37oC durante a noite ou
a 55oC por 4 horas, em uma solução de TNE 1x (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM,
EDTA 6,3 mM, pH 7,5), Tris-HCl 1M pH 7,5, SDS 25% e Proteinase K (0,5 U/ul).
Após a incubação, foi adicionado NaCl 6M ou Fenol:clorofórmio (1:1) e misturado
vigorosamente para separar o DNA dos restos celulares e da proteinase K.
Centrifugou-se por 10 minutos a 9 krpm.
O sobrenadante foi coletado e
adicionou-se 2 volumes de etanol absoluto para precipitar o DNA. Seguiu-se
30
nova centrifugação e o DNA foi lavado em etanol 70% e novamente centrifugado.
O DNA precipitado foi submetido a secagem durante a noite a temperatura
ambiente ou por 2 horas em bomba de vácuo. Acrescentou- se cerca de 300-500
ul de TE para diluir o DNA. A qualidade do DNA foi avaliada em gel de agarose
0,8% cerca de 2 semanas após a extração,assim como também estimou-se a
sua concentração comparando se com DNA de fago λ de concentração
conhecida.
3.2 - Digestão do DNA com Enzimas de Restrição
Uma amostra de 5 a 10 ug de DNA genômico de cada indivíduo foi
digerido por completo a 37oC durante a noite com excesso de MboI (15 a 30 U),
conforme indicação do fabricante. O
DNA digerido foi purificado com fenol,
precipitado em etanol absoluto e lavado em etanol 70%. O DNA digerido
precipitado foi ressuspenso a 37oC por 30 minutos em 21 ul de água milli Q. O
sucesso da digestão foi verificado em gel de agarose 0,8% e a concentração de
DNA digerido foi medida em espectrofotômetro GeneQuant (Pharmacia).
3.3 - Transferência Capilar
Carregou-se cerca de 5 ug de DNA digerido em um gel de agarose
(Pharmacia) 1% de 20x30cm a 40V por cerca de 60-70 horas, com recirculação
do tampão (TBE 1x) na maioria das vezes, juntamente com uma amostra de
marcador de peso molecular de DNA de fago lambda digerido com HindIII. O
fragmento de 2,3 kb do DNA do fago lambda deve estar no final do gel ou mesmo
ter saído dele. A seguir o gel foi preparado para a transferência capilar (Southern
Blotting) para uma membrana de nylon (Hybond-Nfp, Amersham). Tratou-se o gel
com uma solução de HCl 0,25 M por 7 minutos, por 2 vezes, para depurinar o
DNA. A seguir o DNA foi denaturado com uma solução de NaOH 0,5 M, NaCl 1
31
M, por 15 minutos, por 2 vezes e neutralizado em Tris-HCl 1 M, pH 7,4, NaCl 3M,
por 15 minutos, por 2 vezes.
A montagem da transferência capilar foi realizada conforme Southern
(1975) em SSC 20x, durante a noite. Após a transferência, os fragmentos de
DNA foram fixados à membrana por 2 horas a 80oC.
3.4 - Sondas de Minissatélites
As sondas de minissatélites humanos 33.6 e 33.15 de Jeffreys foram
marcadas através do método de “random priming” (Sambrook et al., 1989) , uma
por vez, com nucleotídeo radioativo (α-P32 dCTP) a uma atividade maior que 105
cpm.
3.5 - Hibridação com Sonda Radioativa
A membrana foi pré-hibridada por 1 a 4 horas em Na2HPO4 1M, EDTA 0,5
M, SDS 25%, BSA 1% em tubos de hibridação. Então a sonda marcada é
adicionada à solução de pré-hibridação, agindo por cerca de 16 horas, em forno
de hibridação a 65oC.
3.6 - Lavagem das Membranas e Exposição a Filmes de Raio - X
As membranas são lavadas para se retirar as ligações de menor
homologia em Na2HPO4 0,25 M, SDS 1%, em SSC 2x, SDS 1% e uma lavagem
final em SSC 1x, SDS 0,1% por cerca de 5-10 minutos, até que o monitor de
radiotividade (Mini-Monitor Geiger) indicasse níveis entre 5 e 20 cps (contagens
por segundo). As membranas foram expostas a filmes autorradiográficos (Kodak
X-Omat), permanecendo em cassetes com um ou dois intensificadores, em
freezer a -70oC, ou a -20oC por 1 a 14 dias, caso a radioatividade permanecesse
maior do que 20 cps após as lavagens.
32
3.7 - Dehibridação das Membranas
Efetuou-se a dehibridação das membranas para a hibridação com outra
sonda em NaOH 0,4 M a 45oC por 10 minutos e SSC 0,1%, SDS 1% por 30
minutos. O procedimento de hibridação com a segunda sonda foi repetido da
forma descrita.
3.8 - Análise dos Padrões de Bandas
Para a análise do padrão de bandas, o centro de cada banda na
radiografia é marcado em folha de acetato de retroprojetor, colocado sobre a
autorradiografia, usando-se um transiluminador de luz fluorescente. Apenas a
região de melhor definição da radiografia foi considerada na análise. São
consideradas bandas iguais em diferentes indivíduos quando elas tiveram
migração eletroforética e intensidade semelhantes (considerando uma margem
de menos de 0,5 cm). Somente houve comparação entre indivíduos amostrados
no mesmo gel.
O Coeficiente de Bandas em Comum (CBC) ou índice de similaridade
entre dois indivíduos foi calculado pela fórmula:
x=2Nab / Na + Nb
(Wetton et al., 1987)
onde x é o coeficiente de bandas em comum entre os indivíduos a e b, Nab é o
número de bandas em comum entre a e b e Na e Nb são os totais de bandas em
a e b. Esse índice varia de 0, quando não há nenhum fragmento em comum, a 1,
quando todos os fragmentos detectados estão presentes nos dois indivíduos
analisados. A probabilidade de encontrar, ao acaso, o mesmo padrão de bandas
em comum em dois indivíduos não aparentados é xn onde n é o número médio
de bandas detectadas (Jeffreys et al., 1985a).
A probabilidade (I) de por acaso, as bandas de um indivíduo estarem todas
presentes em um casal com o qual este indivíduo não tem nenhum parentesco foi
estimada por Jeffreys et al. (1985b) como sendo:
33
I=(1-(1-x)2)n onde n é o número de bandas do filho em comum com os pais
atribuídos.
A frequência média de cada banda (q), que reflete a frequência de cada
alelo dos vários locos estudados se relaciona ao CBC pela seguinte fórmula:
x=2q-q2 <-> q=1-(1-x)1/2 (Jeffreys et al., 1985c).
Assumindo que as bandas em comum representam o mesmo alelo e que
todos os alelos tenham frequência média q, o CBC esperado, conforme Jeffreys
et al. (1985b), foi calculado como:
(1+q-q2)/(2-q) entre pais e filhos e;
(4+5q-6q2-q3)/4(2-q) entre irmãos.
A heterozigosidade média (H) das espécies de Cracídeos foi estimada
segundo a fórmula:
H = 2q(1-q)/(2q-q2) = 2(1-q)/(2-q) (Sundt et al., 1994).
4 - Estimativa do Número Mínimo de Locos de Segregação
Independente
Em uma família de Penelope obscura com 5 descendentes e uma de Pipile
jacutinga com 7 descendentes realizou-se o estudo da independência dos
fragmentos detectados para cada uma das sondas de minissatélites. Foi
averiguado para cada par possível de bandas na região considerada do gel se
elas segregavam em repulsão (alelos) ou em atração (ligação). Cada grupo de
bandas que apresentavam co-segregação foi considerado como um único loco
assim como também as bandas que se comportaram como alélicas. Bandas
comuns entre ambos os progenitores e presentes em todos os filhotes foram
consideradas como homozigotas e não informativas. Através dessa informação
pode-se estabelecer o número mínimo de locos independentes detectados para
cada uma das sondas. Os locos em comum detectados por ambas as sondas
foram estimados por sobreposição das bandas nas autorradiografias resultantes
da hibridação da mesma membrana pelas duas sondas utilizadas.
34
5 - Estratégias de Comparação dos Padrões Multilocos entre
Populações de Cativeiro e de Vida Livre
A análise dos padrões multiloco para Penelope obscura e Penelope
superciliaris foi efetuada da seguinte maneira:
a) Inicialmente todos os indivíduos das duas espécies mantidos em cativeiro
foram comparados quanto ao seu índice de similaridade em um mesmo gel.
b) Tendo conhecimento prévio através de registros das duas espécies de
Penelope fornecidos pela CESP - Paraibuna, escolheu-se os 5 indivíduos cativos
ainda vivos que tiveram maior contribuição para o programa de reintrodução
(72% de todos os descendentes reintroduzidos de Penelope obscura bronzina, e
cerca de 50% de todos os descendentes liberados na natureza para P.
superciliaris jacupemba), isto é, os indivíduos que apresentaram maior número
de descendentes reintroduzidos, denominados aqui de “fundadores”, para que
fossem simultaneamente comparados com indivíduos de vida livre capturados na
área de reintrodução. Como o número de aves de vida livre para P. obscura
bronzina era grande (56) e a capacidade de um gel é de 20 amostras, eles foram
comparados em 4 diferentes géis juntamente com o grupo de fundadores. Cerca
de 13 aves de vida livre foram amostradas em cada gel.
c) Também foi comparado o CBC entre a população de vida livre e cinco
indivíduos de cativeiro que não contribuíram (“não fundadores”) para a
reintrodução em outra série 3 de géis e os cálculos foram efetuados da mesma
forma como nas comparações efetuadas com os “fundadores”.
d) Para Penelope superciliaris jacupemba o número de animais de vida livre
capturados era baixo e foi possível a análise com os “fundadores” e “não
fundadores” em um mesmo gel.
Para as demais espécies de cracídeos estudadas, os CBC referem-se
apenas a comparações feitas entre indivíduos de cativeiro e em um mesmo gel.
35
RESULTADOS
1 - Determinação de Padrões Multiloco
No início do trabalho foi necessário determinar as condições que melhor
evidenciam a variabilidade genética em cracídeos pela técnica de identificação
individual através do DNA (ii-DNA ou “DNA fingerprinting”), uma vez que não era
conhecido nenhum trabalho prévio com este grupo de Aves. Para isto digeriu-se
o DNA de três indivíduos de jacupemba Penelope superciliaris jacupemba
supostamente não relacionados com quatro diferentes enzimas de restrição (AluI,
HaeIII, HinfI e MboI), em que o sítio de restrição não se encontrava internamente
na região minissatélite de interesse, para montar uma membrana “multienzimas”.
Essa membrana foi hibridada com as sondas multiloco de minissatélites humanos
33.6 e 33.15 de Jeffreys et al. (1985) e o padrão produzido pela combinação das
sondas utilizadas com a enzima MboI foi escolhido para a realização das
membranas desta espécie, apresentando um número adequado de bandas
polimórficas de boa resolução. Considerou-se que para as demais espécies a
combinação entre MboI e sondas de minissatélites de Jeffreys também seria
adequada, não sendo realizado membranas multienzimas para elas, uma vez
que a reprodução intergenérica é comum entre os cracídeos, como por exemplo
entre Crax fasciolata e Penelope sp ou Pipile pipile cumanensis e Ortalis
canicollis (Sick, 1984), sugerindo parentesco próximo entre as espécies do grupo.
2 - Variabilidade Genética de Várias Espécies de Cracídeos
O coeficiente de banda em comum (CBC) tem sido utilizado para estimar a
similaridade genética e o coeficiente complementar (1-CBC), como uma medida
da variabilidade genética. Nesse trabalho optou-se pela utilização do CBC, que
tem sido mais utilizado em trabalhos com aves publicados na literatura científica.
36
A tabela 2 resume os dados obtidos para espécimens não aparentados
das seis espécies de Cracidae estudadas. São mostrados o número médio de
bandas detectadas, o coeficiente médio de similaridade, a probabilidade de dois
indivíduos não relacionados apresentarem ao acaso o mesmo padrão de bandas
e a freqüência média dos alelos para as sondas 33.6 e 33.15. São mostrados
também o número de indivíduos analisados em cada grupo e a variação de
tamanho dos fragmentos analisados.
Tabela 2. Resultados da hibridação do DNA de espécimens sem relação de parentesco conhecido em
diferentes espécies de Cracidae, digeridos com MboI, com sondas multilocus de minissatélites humanos.
Espécie
Crax blumenbachii
Crax fasciolata
Nothocrax urumutum
Penelope obscura (1)
Penelope
superciliaris
(1)
Penelope
superciliaris
(2)
Pipile jacutinga
Crax blumenbachii
Crax fasciolata
Nothocrax urumutum
Penelope
superciliaris
(1)
Penelope
superciliaris
(2)
Pipile jacutinga
sonda
33.6
33.6
33.6
33.6
33.6
33.6
N
15
2
3
14
42
22
33.6
8
33.6
33.15
33.15
33.15
33.15
33.15
33.15
11
15
2
3
22
44
19
33.15
33.15
xn
6,09x10-9
2,65x10-21
3,59x10-11
2,50x10-14
5,78x10-10
4,34x10-15
q
0,075
0,081
0,129
0,086
0,178
0,146
kb
5,0-23,0
3,2-18,0
7,0-20,0
4,5-23,0
2,9-23,0*
3,8-23,0
-12
0,191
24,5±2,8 0,347±0,13 5,47x10
4,8-18,0
n±sd
9,80±3.1
25.5
18,0±5,5
17,4±4,5
22,7±6,6
25,4±3,4
x±sd
0,145±0,10
0,156
0,243±0,16
0,165±0,09
0,324±0,09
0,272±0,09
1,05x10-21
4,07x10-14
2,68x10-28
1,49x10-10
5,03x10-14
3,01x10-12
2,93x10-15
0,096
0,088
0,066
0,180
0,145
0,187
0,147
6,2-23,0
2,9-6,0
3,5-17,0
6,5-19,0
6,2-23,0
3,0-23,0*
3,8-21,0
7
-11
0,172
21,4±2,5 0,315±0,10 1,83x10
5,2-15,0
11
-17
0,126
27,1±3,3 0,237±0,07 1,12x10
6,0-19,0
28,4±5,7
17,4±2,8
31,0
20,6±2,5
23,3±3,8
24,9±4,6
24,0±5,2
0,183±0,06
0,170±0,09
0,129
0,328±0,14
0,269±0,09
0,340±0,26
0,273±0,09
N - número de indivíduos analisados; n - número médio de bandas, sd - desvio padrão; x - coeficiente médio de bandas
em comum; xn - probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem o mesmo padrão de bandas; q freqüência média das bandas. kb - Tamanho dos fragmentos considerados na análise, em pares de bases (* - indica a
menor e maior variação dos fragmentos considerados em 4 géis para a sonda 33.6 e 3 géis para a sonda 33.15). Em
Penelope obscura e P. superciliaris, os dados se referem a: (1) - Indivíduos de cativeiro; (2) - Indivíduos de vida livre
capturados no local da reintrodução; Nas demais espécies, todas os dados são de aves mantidas em cativeiro.
Para as seis espécies de cracídeos analisadas, foi verificada a
sobreposição de bandas detectadas pelas sondas 33.6 e 33.15. Encontrou-se
sobreposição de fragmentos de 16,87% para Crax fasciolata, 9,95% para
37
Penelope obscura, 10,00% para P. superciliaris, 14,11% para Pipile jacutinga e
9,03% para Nothocrax urumutum. Para Crax blumenbachii, a região analisável do
gel variou entre 5,0 e 23,0 kb para a sonda 33.6 e entre 2,9 e 6,0 kb para a sonda
33.15, portanto havendo apenas fragmentos entre 5,0 e 6,0 kb que poderiam se
sobrepor. Considerando apenas essa região, houve apenas 0,84% de
sobreposição.
Para indivíduos não relacionados de Crax blumenbachii foram detectados
em média menos fragmentos com a sonda 33.6 (9,80 bandas) (Fig. 2a) do que
com a 33.15 (17,4 bandas) (Fig. 2b). O coeficiente de similaridade foi de 0,145
para a sonda 33.6 e 0,170 para a sonda 33.15. A probabilidade de dois
indivíduos não relacionados apresentarem ao acaso o mesmo padrão de bandas
foi da ordem de 10-9 com a sonda 33.6, e da ordem de 10-14 para a sonda 33.15.
A freqüência média das bandas foi de 0,075 e 0,088, respectivamente para as
sondas 33.6 e 33.15 (Tab. 2). Estimou-se a similaridade esperada entre pais e
filho como sendo de 0,555 para a sonda 33.6 e de 0,564 para a sonda 33.15.
2.2 - Crax fasciolata
O padrão multiloco obtido a partir de dois indivíduos estudados utilizandose sondas de minissatélites humanas 33.6 e 33.15 mostrou-se polimórfico.
Detectou-se 25,5 bandas com a sonda 33.6 e 31,0 bandas com a sonda 33.15.
As aves apresentaram coeficiente de similaridade de 0,156 e 0,129,
respectivamente para as sondas 33.6 e 33.15 (Tab. 2). Para a sonda 33.6, a
probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem o mesmo
padrão multiloco foi da ordem de 10-21 e a freqüência média dos alelos foi de
0,081. Com a sonda 33.15, a probabilidade de aves não relacionadas
38
apresentarem o mesmo padrão de fragmentos ao acaso foi da ordem de 10-28 e a
freqüência média dos alelos foi igual a 0,066.
39
a
b
119 120 121 122 123 124 133 125 126 127 128 129 130
c
118 119 120 121 122 123 124 133 125 126 127 128 129 130 131
d
26
25
30 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113
47 45 46 48 49 59 57 50 51 53 54 55 52 56 58 99 100 86 47
Figura 2. Exemplos de hibridações do DNA de algumas espécies de Cracidae com
sondas de minissatélites 33.6 (a e c) e 33.15 (b e d). a) Crax blumenbachii: 119-130 são
aves não relacionadas. A ave 133 não teve filiação comprovada como filhote do casal
124 e 125. b) Crax blumenbachii: 119-131 são aves não relacionadas. A ave 133 não
teve filiação comprovada para o casal 124 e 125. c) Penelope obscura bronzina: 25, 26 e
30 são aves de cativeiro. As aves 104-113 são de vida livre. d) Pipile jacutinga: aves 4549 e 59 são descendentes de 50 e 51. Demais são aves não relacionadas.
40
Utilizando a sonda 33.6, 3 indivíduos não relacionados apresentaram 18,0
fragmentos em média e o índice de similaridade médio foi de 0,243, resultando
em uma probabilidade da ordem de 10-11 de dois indivíduos não relacionados
apresentarem o mesmo padrão de bandas ao acaso (Tab. 2). Para a sonda
33.15, 20,6 fragmentos em média foram detectados e o índice médio de
similaridade foi de 0,328. A probabilidade de dois indivíduos não relacionados
apresentarem o mesmo padrão multiloco foi da ordem de 10-10. A freqüência
média dos alelos foi de 0,129 e de 0,180, respectivamente para as sondas 33.6 e
33.15, originando índices de similaridade esperado entre pais e filhos de 0,594
(33.6) e 0,630 (33.15).
A população cativa de Penelope obscura bronzina apresentou em média
17,4 fragmentos com a sonda 33.6 (Fig. 2c) e 23,3 fragmentos com a sonda
33.15. A sonda 33.6 revelou um índice médio de similaridade de 0,165 e a 33.15,
0,269. A probabilidade de dois indivíduos apresentarem ao acaso o mesmo
padrão multibandas foi menor que 10-14 para ambas as sondas. A freqüência
média dos fragmentos foi de 0,086 para a sonda 33.6 e de 0,145 para a sonda
33.15 (Tab. 2). A similaridade esperada entre pais e filhos foi estimada para as
sondas 33.6 (0,563) e 33.15 (0,605). Entre irmãos os valores esperados para a
sonda 33.6 foi igual a 0,572 e para a sonda 33.15 foi igual a 0,619.
A população de vida livre analisada apresentou, para a sonda 33.6, 22,7
fragmentos em média e índice médio de similaridade de 0,324, resultando em
uma probabilidade da ordem de 10-10 de dois indivíduos não relacionados
apresentarem o mesmo padrão de bandas ao acaso. Para a sonda 33.15, foram
detectados 24,9 bandas em média e índice médio de similaridade de 0,340,
fornecendo uma probabilidade da ordem de 10-12 de ao acaso dois indivíduos
41
apresentarem o mesmo padrão multibandas. Os fragmentos tiveram freqüência
média de 0,178 e de 0,187, respectivamente para as sondas 33.6 e 33.15 (Tab.
2).
2.5 - Penelope superciliaris jacupemba
Para os 20 indivíduos mantidos em cativeiro detectou-se, em média, 25,4
bandas para a sonda 33.6 e 24,0 bandas para a sonda 33.15. O índice de
similaridade médio encontrado foi de 0,272 e 0,273 para as sondas 33.6 e 33.15,
respectivamente. Para cada uma das sondas utilizadas, a probabilidade de dois
indivíduos apresentarem ao acaso o mesmo padrão de bandas foi da ordem de
10-15 e a freqüência média dos fragmentos foi de 0,14 (Tab. 2).
A população de vida livre de Penelope superciliaris jacupemba apresentou
em média, 24,5 fragmentos e índice de similaridade médio entre indivíduos não
relacionados igual 0,347, com a sonda 33.6. Então, para esta mesma sonda, a
probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem ao acaso o
mesmo padrão multiloco foi da ordem de 10-12 e a freqüência média dos alelos foi
estimada em 0,191. Para a sonda 33.15, foram detectados 21,4 fragmentos em
média. A similaridade média desta população foi de 0,315, resultando numa
probabilidade da ordem de 10-11 de dois indivíduos não relacionados
apresentarem o mesmo padrão de bandas ao acaso. A freqüência média dos
alelos para a sonda 33.15 foi de 0,172.
Para os 11 indivíduos não relacionados de Pipile jacutinga os dados são
apresentados na tabela 2. Detectou-se, em média, 28,4 e 27,1 fragmentos,
respectivamente com as sondas 33.6 e 33.15 (Fig. 2d). O índice de similaridade
foi menor para a sonda 33.6 (0,183) do que para a sonda 33.15 (0,237). Com a
sonda 33.6 a probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem o
mesmo padrão multibandas foi da ordem de 10-21. Para a sonda 33.15, esse valor
42
foi
estimado
em
10-17,
assumindo-se
que
as
bandas
se
segregam
independentemente. A freqüência média dos fragmentos foi da ordem de 0,096
para a sonda 33.6 e de 0,126 para a sonda 33.15. Com essas freqüência médias
pode-se estimar os valores esperados de similaridade entre pais e filhos como
sendo de 0,567 para a sonda 33.6 e de 0,593 para a sonda 33.15, assumindo
que bandas de mesma migração representam alelos idênticos, e que todas as
bandas tenham a mesma freqüência. Entre irmãos o índice de similaridade
esperado foi estimado em 0,580 e 0,605, respectivamente, para as sondas 33.6 e
33.15.
3 - Determinação de Filiação
A partir dos dados de similaridade obtidos entre indivíduos supostamente
não relacionados, foi estimado as similaridades esperadas entre pais-filhos e
entre irmãos. Com base nos padrões de bandas dos filhotes e dos pais e nos
cálculos da similaridade esperada, a filiação em alguns casos constantes da
amostra de cracídeos deste estudo foi testada.
Não foi possível a confirmação da paternidade indicada na amostra de
mutum-do-sudeste Crax blumenbachii. A fêmea número C133 que foi dada como
filha das aves C124 e C125 e que deveria ter herdado todas as suas bandas de
um ou outro progenitor não apresentou nenhuma banda em comum com seus
supostos progenitores na hibridação com a sonda 33.6. Para a sonda 33.15,
algumas bandas eram compartilhadas, resultando em índices de similaridade de
0,074 com C124 e 0,068 com C125. Nenhum dos outros animais em nossa
amostra teve índice de similaridade próximo ao esperado para relações de
primeiro grau (>0,550) estimados para essa espécie, indicando que nenhum
outro casal entre os estudados poderia ser o casal progenitor do filhote C133.
43
Desta forma esse filhote foi considerado na análise como sendo um indivíduo não
relacionado a todos os demais indivíduos da amostra.
A paternidade foi confirmada com ambas as sondas para o filhote de
urumutum Nothocrax urumutum, apresentando com a sonda 33.6 índice de
similaridade igual a 0,538 comparado com o macho e 0,545 com a fêmea. Para a
sonda 33.15 esses valores foram de 0,700 comparado com o macho e 0,756 com
a fêmea. Todas as bandas do filhote puderam ser atribuídas a um dos pais, tanto
para a sonda 33.6, quanto para a sonda 33.15.
Em Penelope obscura, dois indivíduos anilhados e capturados nas áreas
de soltura da CESP foram testados como possíveis filhotes de dois machos ainda
mantidos em cativeiro (Tab. 3). A ave C64 teve similaridade próxima à esperada
para a relação pais-filhos estimada para esta espécie com cada uma das sonda e
cerca de 50% de suas bandas puderam ser atribuídas ao seu progenitor. A
paternidade não foi confirmada com nenhuma das sondas para a ave C65, que
não apresentou aproximadamente 50% de suas bandas em comum com seu
possível pai e ainda apresentou índice de similaridade com seu suposto
progenitor de 0,382 com a sonda 33.6 (índice de similaridade esperado foi de
0,563) e de 0,292 com a sonda 33.15 (similaridade esperada igual a 0,605).
Tabela 3. Averiguação da paternidade
em Penelope obscura bronzina.
Filhote
Pai Similaridade Sonda
C64
C33
0,512
33.6
C65
C34
0,382
33.6
C64
C33
0,470
33.15
C65
C34
0,292
33.15
44
Em uma família de Penelope obscura analisada, composta dos dois
progenitores e cinco descendentes, proveniente do criadouro da CESP de
Paraibuna, a paternidade e a maternidade foram comprovadas em todos os
casos. Todas as bandas presentes nos cinco filhotes puderam ser atribuídas a
um dos progenitores, não sendo encontradas bandas nos filhotes que pudessem
ter surgido devido à mutação. O índice médio de similaridade entre pais e filhos
foi igual a 0,603 e entre irmãos, de 0,598 para a sonda 33.6 (Tab. 4). Para a
sonda 33.15 a similaridade média entre pais e filhos foi de 0,631 e entre irmãos,
de 0,643. As bandas foram herdadas de forma mendeliana: cerca de 54% delas
são de origem paterna e 46% de origem materna, segundo dados obtidos a partir
da hibridação com a sonda 33.6 (χ2=0,42; P>0,50); a sonda 33.15 detectou cerca
de 47% de bandas de origem paterna e 53% de origem materna (χ2=0,36;
P>0,50). Os irmãos compartilharam entre si 11,20 fragmentos em média com a
sonda 33.6 e 15.30 com a sonda 33.15.
Tabela 4. Número médio de fragmentos paternos e maternos, coeficiente médio
de bandas em comum (índice de similaridade) entre pais-filhos e entre irmãos
em Penelope obscura bronzina obtidos a partir da hibridação com sondas
multilocus de minissatélites humanas 33.6 e 33.15.
Sonda
33.6
Xp-o ±sd
0,603±0,12
33.15
0,631±0,10
nf±sd
12,00±3,93
(53,57%)
13,60±1,81
(46,57%)
nm±sd
10,40±2,30
(46,43%)
15,60±2,19
(53,43%)
Xs±sd
0,598±0,10
ns±sd
11,20±2,53
0,643±0,08
15,30±3,30
Xp-o - índice médio de similaridade entre pais e filhos, sd - desvio padrão; nf- número médio de
bandas paternas; nm - número médio de bandas maternas; Xs - índice médio de similaridade entre
irmãos; ns - número médio de bandas compartilhadas entre os irmãos.
A filiação dos setes filhotes de jacutinga Pipile jacutinga provenientes do
Criadouro Tropicus foi confirmada e os dados são resumidos na tabela 5. Todas
as bandas de cada filhote puderam ser atribuída a um dos pais e nenhum
fragmento novo surgido devido a mutação foi detectado. Para a sonda 33.6, o
índice de similaridade médio observado entre pais e filho foi de 0,594 e entre
45
irmãos, 0,542, próximo ao esperado (0,567 para pais-filhos e 0,580 para irmãos).
A sonda 33.15 revelou um índice médio de similaridade entre pais e filhos igual a
0,485 e de 0,625 entre irmãos, também próximo aos valores esperados (0,583
entre pais e filhos e 0,605 entre irmãos). Detectou-se 55% de fragmentos
paternos e 45% maternos em média entre os irmãos com a sonda 33.6 e 44% de
bandas paternas e 56% maternas para a sonda 33.15, indicando que os
fragmentos são herdados de forma mendeliana (χ2=0,42 para a sonda 33.6 e
χ2=0,36 para a sonda 33.15, ambas com P>0,50). Considerando os valores para
as sondas 33.6 e 33.15 usadas nesse estudo, os irmãos compartilharam 22 e 23
bandas, respectivamente.
Tabela 5. Número médio de fragmentos paternos e maternos, coeficiente
médio de bandas em comum (índice de similaridade) entre pais-filhos e entre
irmãos em Pipile jacutinga obtidos a partir da hibridação com sondas
multilocus de minissatélites humanas 33.6 e 33.15.
Sonda
33.6
Xp-o ±sd
0.594±0.10
33.15
0.485±0.08
nf±sd
25,00±6,19
(55.38%)
15.71±2,28
(43.65%)
nm±sd
20.14±2,47
(44.62%)
20.28±2,92
(56.35%)
Xs±sd
0.542±0.09
ns±sd
22.29±5,13
0.625±0.09
23.28±4,45
Xp-o - índice médio de similaridade entre pais e filhos, sd - desvio padrão; nf- número médio de
bandas paternas; nm - número médio de bandas maternas; Xs - índice médio de similaridade
entre irmãos; ns - número médio de bandas compartilhadas entre os irmãos.
4 - Estudo de Segregação de Bandas
Na amostra da família de Penelope obscura bronzina e de Pipile jacutinga
estudada, foi possível determinar o número de locos de segregação
independente para cada uma das sondas.
4.1 - Estudo de Segregação em Penelope obscura bronzina
Os fragmentos paternos e maternos detectados em uma família de
Penelope obscura bronzina composta pelo casal e cinco descendentes são
46
esquematizados na tabela 6, onde são indicados também os grupos de ligação e
os fragmentos alélicos detectados por cada uma das sondas usadas neste
estudo.
Três fragmentos detectados com a sonda 33.6 e cinco fragmentos
detectados com a sonda 33.15 eram comuns a ambos os pais e estavam
presentes em todos os filhotes e portanto não foram considerados neste estudo
por não serem informativos quanto ao número de locos independentes
envolvidos.
Tabela 6. Bandas paternas e maternas detectadas com sondas
multilocos de minissatélites 33.6 e 33.15 em cinco irmãos de Penelope
obscura bronzina*.
______Sonda 33.6 __ _____ _ ________
Pai 33.6
Mãe 33.6
Pai 33.15
01111
00100
01110
01100
11110
01000
10000
11110
00011
10001
10000
01111
00011
11010
11111
00011
11001
10100
01011
11001
01110
00011
10001
11110
01010
00111
10100
01011
11000
11011
10011
10001
11101
10011
01111
01101
01101
10001
11001
11011
11110
11011
11111
10001
01111
10000
11000
01001
11011
00001
01110
00001
10011
11110
Sonda 33.15______________
Mãe 33.15
01100
10101
01100
10000
10010
01011
01011
01101
01011
11000
10011
01011
10100
11001
01110
11111
00011
* - Presença ou ausência de cada uma das bandas nos cinco filhotes são dadas pelos
números 1 e 0 respectivamente. Barras cheias indicam grupos de co-segregação e
barras pontilhadas, pares de alelos.
47
Nenhum dos cinco descendentes nesta família apresentou banda que não
fosse atribuída a um dos pais. A tabela 7 resume os dados do estudo de
segregação. Para a sonda 33.6 detectou-se três pares de alelos de origem
paterna, dos quais apenas um não estava envolvido com um grupo de bandas
co-segregantes, e dois pares de alelos de origem materna, envolvidos em grupos
de co-segregação. Para a sonda 33.6 foi encontrado o mesmo número de grupos
co-segregantes de origem paterna (três grupos envolvendo 7 bandas) e materna
(três grupos envolvendo 10 bandas). A partir da análise da hibridação com a
sonda 33.15 não foram detectados pares de alelos de origem paterna e
encontrou-se três pares de origem materna, sendo dois deles envolvidos com
grupos co-segregantes. Os quatro grupos co-segregantes paternos detectados
envolviam 9 bandas e os dois grupos co-segregantes maternos envolviam 5
bandas.
Tabela 7. Sumário do estudo de segregação dos diferentes
fragmentos dos 5 filhotes de Penelope obscura *.
Sonda
Número de fragmentos detectados
Número de pares alélicos
Número de grupos co-segregantes
Número de bandas homozigotas
Número de locos independentes
Pai
33.6 33.15
19
18
3
0
3
4
1
1
12
13
Mãe
33.6 33.15
17
17
2
3
3
2
0
1
9
11
* - Dois dos pares alélicos de origem paterna e os dois de origem materna
detectados pela sonda de minissatélite 33.6 era composto de um grupo de bandas
co-segregantes e uma única banda. Para a sonda 33.15, os grupos co-segregantes
detectados eram alélicos a uma outra bandas.
Apenas uma banda de origem paterna se mostrou homozigota na
hibridação com a sonda 33.6. Para a sonda 33.15, uma banda paterna e uma
materna eram homozigotas. Excluíndo-se os grupos de co-segregação, os pares
de alelos e as bandas homozigotas detectadas, pode-se estimar o número
mínimo de locos independentes detectados.
Para a sonda 33.6, 12 locos
paternos e 9 maternos eram independentes e para a sonda 33.15 encontrou-se
48
13 locos paternos e 11 locos maternos de segregação independente. As sondas
33.6 e 33.15 apresentam então número equivalente de locos de segregação
independente. Com base no cálculo do número de locos de segregação
independente, a probabilidade de que dois indivíduos não relacionados
apresentem ao acaso o mesmo padrão de bandas foi estimado em 3,69x10-17
(sonda 33.6) e 2,06x10-14 (sonda 33.15).
4.2 - Estudo de Segregação em Pipile jacutinga
A tabela 8 demonstra esquematicamente os fragmentos paternos e
maternos detectados em uma família de Pipile jacutinga composta pelo casal e
sete filhotes, com cada uma das sondas humanas de minissatélites estudadas,
sendo indicado os alelos e os grupos de co-segregação. Esses dados são
resumidos numericamente na tabela 9.
Seis fragmentos detectados com a sonda 33.6 e cinco detectados com a
sonda 33.15 que eram comuns entre os pais e que estavam presentes em todos
os filhotes não foram considerados na determinação do número de locos de
segregação independente.
Fragmentos mutantes não foram detectados em nenhum dos filhos e
encontrou-se apenas um par de bandas alélicas paternos, para cada uma das
sondas. Com a sonda 33.6, um grupo de 3 bandas co-segregantes mostrou-se
alélico a uma outra banda. Com a sonda 33.15 não foi detectado nenhum par de
fragmentos alélicos maternos. Detectou-se mais fragmentos paternos herdados
em atração (4 grupos envolvendo 12 bandas) do que maternos (2 grupos
incluindo 6 bandas) a partir da hibridação com a sonda 33.6. Para a sonda 33.15,
detectou-se um único grupo de co-segregação de origem paterna, composto por
dois fragmentos, e três maternos, cada um incluindo duas bandas.
49
Tabela 8. Bandas paternas e maternas detectadas com sondas multilocos de
minissatélites 33.6 e 33.15 em sete irmãos de Pipile jacutinga*.
_______Sonda 33.6 ____ _______ _ ____ ______ Sonda
33.15___________
Pai
Mãe
Pai
Mãe
1001110
0011110
0101010
1010100
1101011
0100001
0101010
1010001
0011100
0000101
1111111
1111111
1101011
1010110
1111111
1111111
0011110
0110101
1011110
0011111
1100011
1010100
0010110
1001101
1101010
1111111
0000101
1000010
1101010
1011110
0010001
0000001
0101010
1111111
0010100
1111111
1111111
1101010
1111010
0001011
1111111
0010100
1000010
1111100
1101011
1101110
1111111
1011110
1101011
1111111
0011111
0011010
1011001
0010000
1110110
1110110
0000110
0010111
1010110
0101000
1001000
0001101
0100101
1111111
1001011
1111111
1001110
1111010
1110100
1011110
1111111
0111010
1101010
1101010
0101000
1001110
1101000
0000010
0010000
1111111
1111111
1010101
0011011
1111111
1111111
0000110
1001010
0001011
1101011
0011011
1111111
1101100
1011110
1101010
0101110
0010101
0101010
1011110
1010100
0011110
0010001
1111111
0100011
1111111
1000001
1011111
0001110
1001101
1001011
1011110
1111111
1010110
1010000
1111111
* - Presença ou ausência de cada uma das bandas nos sete filhotes são dadas pelos números 1 e
0 respectivamente. Barras cheias indicam grupos de co-segregação e barras pontilhadas, pares
de alelos.
50
Tabela 9. Sumário do estudo de segregação em uma família de
Pipile jacutinga com 7 filhotes.
Sonda
Número de fragmentos detectados
Número de pares alélicos
Número de grupos co-segregantes
Número de homozigotas
Número de loci independentes
33.6
32
1
4
6
17
Pai
33.15
26
1
1
5
19
Mãe
33.6 33.15
26
30
1*
0
2
3
5
7
16
20
* - O par alélico de origem materna detectado pela sonda de minissatélite 33.6 era
composto de um grupo de bandas co-segregantes e uma única banda.
Seis diferentes fragmentos paternos e cinco maternos mostraram se
homozigotos na hibridação com a sonda 33.6, e cinco paternos e sete maternos,
para a sonda 33.15. Considerando cada um dos grupos de ligação e cada um
dos pares de alelos como um loco e desprezando-se as bandas homozigotas, o
número de locos independentes detectados com a sonda 33.6 foi de 17 locos
paternos e 16 maternos. Para a sonda 33.15 encontrou-se 19 locos paternos e
20 maternos de segregação independente. A probabilidade de que dois
indivíduos não relacionados apresentem ao acaso o mesmo padrão multibandas
é de7,40x10-13 para a sonda 33.6 e de 6,97x10-13 para a sonda 33.15.
5 - Estimativa da Heterozigosidade Média em Cracídeos
A heterozigosidade média das seis espécies de cracídeos estudadas foi
estimada e os resultados para ambas as sondas são demonstrados na tabela 10.
Com a sonda 33.6, a população cativa de Crax blumenbachii apresentou a
maior heterozigosidade média (96,10%) e a população de Penelope superciliaris
de vida livre da CESP a menor (89,44%). Crax fasciolata apresentou o maior
índice de heterozigosidade com a sonda 33.15 (98,59%), mas na amostra havia
apenas dois indivíduos não relacionados, e portanto esta estimativa deve ser
vista com reserva. A segunda maior heterozigosidade detectada com a sonda
33.15 foi de 95,40% para Crax blumenbachii. A menor heterozigosidade
51
detectada com a sonda de minissatélites 33.15 foi de 89,69% para a população
de Penelope obscura bronzina de vida livre da CESP.
Tabela 10. Estimativa da Heterozigosidade média (H%) em seis
espécies de Cracídeos estimada a partir da freqüência média das
bandas (q).
Espécie
Crax blumenbachii
Crax fasciolata
Nothocrax urumutum
Penelope superciliaris (1)
Pipile jacutinga
Crax blumenbachii
Crax fasciolata
Nothocrax urumutum
Pipile jacutinga
sonda
33.6
33.6
33.6
33.6
33.6
33.6
33.6
33.6
33.15
33.15
33.15
33.15
33.15
33.15
33.15
33.15
N
15
2
3
14
42
22
8
11
15
2
3
22
44
19
7
11
q
0,075
0,081
0,129
0,086
0,178
0,146
0,191
0,096
0,088
0,066
0,180
0,145
0,187
0,147
0,172
0,126
H%
96,10
95,78
93,10
95,51
90,23
92,13
89,44
94,96
95,40
96,59
90,10
92,18
89,69
92,07
90,59
93,28
N - número de indivíduos analisados; q - freqüência média das bandas;
H% - heterozigosidade média percentual, (1) Indivíduos de cativeiro; (2)
Indivíduos de vida livre. Demais dados referem-se a indivíduos de
cativeiro.
6 - Orientação Genética para um Programa de Reprodução em Cativeiro
Realizou-se a comparação dos índices de similaridade para todos os
possíveis casais do mutum-de-bico-vermelho Crax blumenbachii. Um programa
de criação em cativeiro para essa espécie pode ser sugerido a partir dos dados
indicados na tabela 11, considerando-se 0,400 como limite máximo de
similaridade para a formação de um possível casal, eliminando assim a formação
de casais com índices de similaridade próximos as relações de parentesco de
primeiro grau. Os resultados práticos desta orientação deverão ser avaliados
posteriormente.
Através das técnicas de identificação individual pelo DNA, pode-se
monitorar a variabilidade genética da população cativa de Penelope obscura
bronzina, composta por 12 casais, e de Penelope superciliaris jacupemba,
52
composta por 10 casais, mantidos pela CESP e cujos descendentes são usados
em um programa de reintrodução na natureza.
6.1 - Orientação Genética em Crax blumenbachii
A variabilidade genética encontrada na amostra de Crax blumenbachii é
grande e há um número alto de casais com pouca similaridade (Tab. 11). Nove
possíveis combinações de casais não possuem nenhum fragmento em comum
(0,000) e apenas quatro possíveis combinações apresentam similaridade maior
do que 0,300, segundo informações obtidas com a sonda 33.6. A hibridação com
a sonda 33.15 revelou apenas seis possíveis acasalamentos com similaridade
maior do que 0,300. Esses dados podem se revelar importantes no planejamento
de um programa de reprodução em cativeiro para o mutum-do-bico-vermelho
Crax blumenbachii.
Tabela 11. Índices de similaridade entre os possíveis casais de Crax
blumenbachii mantidos em cativeiro no Criadouro Chaparral, Recife,
PE, obtidos com as sondas de minissatélites 33.6 e 33.15.
Sonda 33.6
f\m
C118
C119 0,400
C121 0,083
C122 0,074
C124 0,091
C127 0,174
C129 0,160
C131 0,000
C133 0,250
C120
0,000
0,235
0,100
0,133
0,250
0,111
0,125
0,000
C123
0,095
0,320
0,429
0,348
0,167
0,154
0,167
0,160
C125
0,000
0,133
0,111
0,154
0,143
0,250
0,000
0,000
C126
0,000
0,273
0,160
0,154
0,190
0,174
0,095
0,000
C128
0,267
0,105
0,091
0,118
0,174
0,100
0,111
0,105
Sonda 33.15
f\m
C118
C119 0,250
C121 0,162
C122 0,108
C124 0,352
C127 0,108
C129 0,157
C131 0,157
C133 0,129
C120
0,129
0,062
0,166
0,181
0,167
0,162
0,054
0,133
C123
0,363
0,157
0,210
0,285
0,105
0,205
0,153
0,125
C125
0,133
0,114
0,171
0,187
0,057
0,388
0,167
0,068
C126
0,114
0,150
0,050
0,000
0,015
0,243
0,048
0,352
C128
0,222
0,250
0,250
0,137
0,125
0,121
0,303
0,384
C130
0,000
0,100
0,261
0,000
0,167
0,286
0,316
0,200
C130
0,060
0,263
0,157
0,171
0,052
0,256
0,263
0,129
53
6.2 - Orientação Genética em Penelope obscura bronzina
Para cada possível casal de jacu-guaçu Penelope obscura bronzina
mantido em cativeiro pela CESP, é apresentado o índice de similaridade na
tabela 12 para a sonda 33.6 e tabela 13 para a sonda 33.15. Casais que
apresentam menor índice de similaridade são supostamente menos aparentados
e portanto são indicados para evitar endogamia da população. Com bases nos
resultados destas tabelas, sugeriu-se à equipe técnica da CESP que procurasse
formar casais que apresentassem os menores índices possíveis com estas
sondas, considerando-se 0,400 como um valor limite para a formação de casais.
Os resultados desta orientação ainda não estão disponíveis. Com as sondas 33.6
e 33.15, encontrou-se, respectivamente, um e 12 possíveis casais com índices
maiores do que 0,400 (Tab. 14). Na maioria dos casos, ambos as aves são
provenientes da Zoobotânica Mário Nardelli. Conforme indica a tabela 15, casais
que vem reproduzindo bem apresentam uma grande variação de índices de
similaridades (entre 0,100 e 0,400) para sonda 33.15.
Tabela 12. Índices de similaridade entre os
possíveis casais de Penelope obscura mantidos
em cativeiro na CESP de Paraibuna, obtidos com a
sonda de minissatélites humana 33.6*.
f\m
C27
C30
C33
C36
C39
C41
C31
0,068
0,062 0,000 0,250
C35
0,250
0,074 0,090 0,222 0,129 0,000
C37
0,105
0,145 0,222 0,243 0,222 0,192
C38
0,250
0,171 0,133 0,400 0,205 0,064
C40
0,057
0,210 0,242 0,263 0,238 0,171
C42
0,114
0,315 0,121 0,210 0,238 0,235
C44
0,205
0,142 0,000 0,238 0,260 0,157
0,277 0,142
* - Os indivíduos C21, C22, C23, C24, C25, C26, C28, C29,
C32, C34, C43 não foram considerados nesta análise devido
ao fraco padrão de bandas produzido com esta sonda.
54
Tabela 13. Índices de similaridade entre os possíveis casais de Penelope obscura
mantidos em cativeiro na CESP de Paraibuna, obtidos com a sonda de minissatélites
humana 33.15*.
f\m
C23
C25
C27
C29
C30
C33
C34
C36
C39
C41
C43
C22
0,243
0,243 0,208 0,142 0,311 0,250 0,212 0,326 0,377 0,352 0,153
C26
0,190
0,142 0,408 0,232 0,478 0,367 0,458 0,440 0,296 0,269 0,127
C28
0,296
0,054 0,227 0,052 0,195 0,318 0,372 0,133 0,204 0,340 0,238
C31
0,210
0,315 0,133 0,153 0,238 0,311 0,363 0,260 0,320 0,416 0,279
C32
0,250
0,250 0,425 0,341 0,318 0,170 0,304 0,208 0,307 0,280 0,222
C35
0,102
0,256 0,347 0,250 0,325 0,391 0,622 0,382 0,235 0,163 0,136
C37
0,217
0,260 0,415 0,297 0,400 0,339 0,230 0,185 0,344 0,178 0,352
C38
0,114
0,171 0,285 0,222 0,512 0,375 0,390 0,418 0,085 0,266 0,150
C40
0,083
0,333 0,327 0,285 0,346 0,363 0,222 0,250 0,334 0,241 0,339
C42
0,133
0,177 0,192 0,260 0,244 0,192 0,196 0,415 0,385 0,254 0,240
C44
0,238
0,142 0,367 0,232 0,217 0,244 0,208 0,320 0,173 0,269 0,340
* - Os indivíduos C21 e C24 não foram considerados nesta análise devido ao fraco padrão de bandas
produzidos.
Tabela 14. Casais com índices de similaridade aumentados (>0,400) em Penelope
obscura com as sondas 33.6 e 33.5.
Sonda 33.6
Macho
Procedência
C36
Rio de Janeiro
Sonda 33.15
Macho
Procedência
C27
Pindamonhangaba, SP
C27
Pindamonhangaba, SP
C27
Pindamonhangaba, SP
C30
Rio de Janeiro
C30
Rio de Janeiro
C30
Rio de Janeiro
C34
Rio de Janeiro
C34
Rio de Janeiro
C36
Rio de Janeiro
C36
Rio de Janeiro
C36
Rio de Janeiro
C41
Paraibuna, SP
Fêmea
C38
Fêmea
C26
C32
C37
C26
C37
C38
C26
C35
C26
C38
C42
C31
Procedência
Setor - Pais RJ
Procedência
Rio de Janeiro
Pindamonhangaba, SP
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Setor - Pais RJ
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Setor - Pais RJ
Ubatuba, SP
Paraibuna, SP
CBC
0,400
CBC
0,408
0,425
0,415
0,478
0,400
0,512
0,458
0,622
0,440
0,418
0,415
0,416
Setor - Pais RJ: indica que as aves nasceram na Seção de Animais Silvestres da CESP, porém, seus pais
são de procedência do Rio de Janeiro.
55
Tabela 15. Coeficientes de Bandas em Comum (CBC) de
casais de Penelope obscura com sucesso reprodutivo,
obtidos com as sondas 33.6 e 33.15.
Sonda 33.6
Casal
CBC
C30xC37
0,145
Sonda 33.15
Casal
CBC
C22xC36
0,326
C26xC25
0,140
C29xC35
0,250
C30xC37
0,400
6.3 - Orientação Genética em Penelope superciliaris jacupemba
Também para os jacupembas Penelope superciliaris jacupemba cativos da
CESP realizou-se o cálculo do índice de similaridade para cada possível casal
(Tab. 16 e 17) para cada uma das sondas, com a finalidade de verificar se os
indivíduos com menor índice de similaridade apresentam um bom desempenho
reprodutivo. Admitindo o mesmo valor limite para o índice de similaridade (0,400)
que para Penelope obscura bronzina, 10 possíveis formações de casais foram
desaconselhadas baseados nos dados da sonda de minissatélites 33.6 e 6
possíveis casais com a sonda 33.15 (Tab. 18). Para a sonda 33.6, casais com
sucesso reprodutivo tiveram índices de similaridade entre 0,100 e 0,450 (Tab.
19). Contudo para a sonda 33.15, não encontrou-se casal com sucesso
reprodutivo com índice menor do que 0,250 (Tab. 19).
Tabela 16. Índices de similaridade entre os possíveis casais de Penelope superciliaris
mantidos em cativeiro na CESP de Paraibuna, obtidos com a sonda de minissatélite
humano 33.6.
C01
C04
C05
C07
C09
C11
C14
C16
C17
C20
f\m
C02 0,290 0,285 0,266 0,385 0,339 0,363 0,354 0,269 0,235 0,113
C03 0,208 0,204 0,217 0,160 0,086 0,208 0,145 0,044 0,136 0,173
C06 0,510 0,166 0,133 0,489 0,134 0,255 0,344 0,181 0,139 0,250
C08 0,285 0,140 0,259 0,172 0,334 0,285 0,190 0,301 0,269 0,370
C10 0,250 0,244 0,304 0,320 0,217 0,250 0,334 0,400 0,454 0,260
C12 0,150 0,259 0,392 0,363 0,117 0,264 0,400 0,340 0,122 0,274
C13 0,188 0,333 0,509 0,436 0,196 0,226 0,334 0,360 0,285 0,196
C18 0,214 0,350 0,333 0,310 0,222 0,392 0,444 0,226 0,346 0,370
C15 0,156 0,230 0,367 0,226 0,285 0,431 0,241 0,208 0,340 0,285
C19 0,088 0,260 0,558 0,212 0,232 0,266 0,192 0,333 0,097 0,046
56
Tabela 17. Índices de similaridade entre os possíveis casais de Penelope
superciliaris mantidos em cativeiro na CESP de Paraibuna, obtidos com a
sonda de minissatélite humana 33.15*.
f\m
C02
C03
C06
C08
C10
C12
C13
C15
C18
C01
0,244
0,113
0,334
0,230
0,146
0,291
0,174
0,143
0,296
C04
0,226
0,350
0,174
0,259
0,177
0,346
0,360
0,434
0,379
C05
0,275
0,322
0,235
0,524
0,240
0,280
0,218
0,274
0,444
C07
0,315
0,459
0,280
0,310
0,326
0,357
0,407
0,280
0,354
C09
0,272
0,208
0,108
0,340
0,111
0,372
0,146
0,216
0,367
C11
0,182
0,250
0,162
0,297
0,166
0,232
0,195
0,324
0,244
C14
0,222
0,367
0,052
0,334
0,162
0,227
0,333
0,105
0,280
C16
0,208
0,346
0,146
0,431
0,300
0,212
0,311
0,292
0,301
* - Os indivíduos C17, C19 e C20 não foram considerados na análise devido ao fraco padrão
de bandas produzidas.
Tabela 18. Casais com índices de similaridade aumentados
(>0,400) em Penelope superciliaris, demonstrados com a sonda
33.6 e 33.15.
Sonda 33.6
Macho
Procedência
C01
Agudos, SP
C05
Setor - Pais RJ
C07
Rio de Janeiro
C07
Rio de Janeiro
C11
Rio de Janeiro
C14
Setor - Pais RJ
C15
Setor - Pais RJ
C16
Setor - Pais RJ
C17
Setor - Pais RJ
C14
Setor - Pais RJ
Fêmea
C06
C19
C06
C13
C15
C12
C10
C10
C10
C18
Procedência
Agudos, SP
Setor - Pais RJ
Agudos, SP
Setor - Pais RJ
Setor - Pais RJ
Rio de Janeiro
Setor - Pais RJ
Setor - Pais RJ
Setor - Pais RJ
Setor - Pais RJ
CBC
0,510
0,558
0,489
0,436
0,431
0,400
0,400
0,400
0,454
0,444
Sonda 33.15
Macho
Procedência
C04
Setor- pais RJ
C05
Setor- pais RJ
C05
Setor- pais RJ
C07
Rio de Janeiro
C07
Rio de Janeiro
C16
Setor- pais RJ
Fêmea
C15
C08
C18
C03
C13
C08
Procedência
Setor- Pais RJ
Ilha Solteira, SP
Setor- pais RJ*
Agudos, SP
Setor- pais RJ
Ilha Solteira, SP
CBC
0,434
0,524
0,444
0,459
0,407
0,431
Setor - Pais RJ: indica que as aves nasceram na Seção de Animais Silvestres
da CESP, porém, seus pais são de procedência do Rio de Janeiro.
57
Tabela 19. Coeficientes de Bandas em
Comum (CBC) de casais de Penelope
superciliaris com sucesso reprodutivo,
obtidos com as sondas 33.6 e 33.15.
Sonda 33.6
Casal
CBC
C08xC11 0,285
C10xC05 0,304
C12xC09 0,117
C13xC07 0,436
Sonda 33.15
Casal
CBC
C08xC11 0,297
C10xC07 0,407
C12xC09 0,372
C13xC07 0,436
7 - Programa de Reintrodução de Cracídeos na Natureza
Desde o início do programa de reprodução de jacu-guaçu Penelope
obscura e jacupemba Penelope superciliaris em cativeiro e reintrodução em
áreas reflorestadas, realizado pela CESP, em Paraibuna, foram soltos 118
indivíduos da primeira espécie (Tab. 20) e 148 da última (Tab. 23). Pela análise
das tabelas 20 e 23, verifica-se que a contribuição de cada casal para a
reintrodução de indivíduos é muito diferente em termos numéricos, em ambas as
espécies. Isto permitiu que se construísse uma estratégia para averiguar se as
aves reintroduzidas foram responsáveis pela formação da população de vida livre
na região, estabelecendo uma população local com capacidades reprodutivas ou
se as aves encontradas na região estavam sendo atraídas para os locais de
reintrodução devido às condições de reflorestamento e proteção.
7.1 - Programa de Reintrodução de Penelope obscura bronzina
Para Penelope obscura bronzina, os cinco indivíduos escolhidos para
compor o grupo de fundadores foram responsáveis pela geração de 85 indivíduos
dos que foram liberados em Paraibuna, SP (Tab. 20). Essa amostra
compreendeu 72% de todos os indivíduos liberados.
58
Tabela 20. Casais que contribuíram efetivamente com o programa de
solturas de Penelope obscura nas áreas de reflorestamento da CESP
de Paraibuna. É indicada a procedência dos casais.
Macho
C36
C34
C30*
C33*
C25*
C29
C36
Procedência
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Paraibuna
Rio de Janeiro
Fêmea
C22
C44
C37*
007**
C26*
C35
C37
Procedência
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Total
Descendentes
17
12
42
26
17
02
02
118
* - Indivíduos escolhidos para a comparação entre os que mais contribuíram para a
reintrodução e os de vida livre. ** - Fêmea falecida antes da coleta de sangue ser
realizada.
O grupo de fundadores de Penelope obscura bronzina apresentou índice
médio de similaridade de 0,183 para a sonda 33.6 e de 0,312 para a sonda
33.15. O índice de similaridade médio para o grupo de não fundadores foi de
0,195 para a sonda 33.6 e de 0,256 para a sonda 33.15 (Tab. 21).
Tabela 21. Índice médio de similaridade no grupo de fundadores e
de não fundadores para cada uma das espécies de Penelope
mantidas em cativeiro pelo CESP de Paraibuna.
Espécie
Penelope obscura
Grupo
x±sd
33.6
33.15
Fundadores
0,183±0,04 0,312±0,11
Não Fundadores 0,195±0,05 0,256±0,09
Fundadores
0,295±0,10 0,299±0.12
Não Fundadores 0,247±0.10 0,266±0.13
x = índice médio de similaridade; sd = desvio padrão
Para a sonda 33.6, a população de vida livre comparada com os
fundadores apresentou índice de similaridade médio de 0,248 (Tab. 22). Quando
59
comparados com o grupo de não fundadores, a população de vida livre
apresentou índice de similaridade médio de 0,194 (Tab. 22).
Também nos dados obtidos com a sonda 33.15 o índice de similaridade
médio foi maior quando a população de vida livre é comparada com os
fundadores (0,299) do que com os não fundadores (0,179) (Tab. 22).
Tabela 22. Comparação entre aves recapturadas na natureza com indivíduos que
contribuíram efetivamente para o programa de reintrodução na natureza (1) e com
indivíduos que não contribuíram para o programa (2) em Penelope obscura bronzina e P.
superciliaris jacupemba.
Espécie
sonda
33,6
33,6
33,15
33,15
33,6
33,6
33,15
33,15
N
48
43
50
42
12
13
11
12
n±sd
20,0±2,4
22,0±3,0
25,5±4,0
23,2±2,8
24,5±2,5
24,8±2,9
21,5±2,2
22,5±2,6
x±sd
0,248±0,09
0,194±0,05
0,299±0,09
0,179±0,07
0,297±0,08
0,188±0,06
0,328±0,08
0,209±0,09
xn
7,74x10-13
2,14x10-16
5,89x10-14
4,25x10-18
1,20x10-13
9,97x10-19
3,90x10-11
5,05x10-16
q
0,132
0,102
0,162
0,093
0,161
0,098
0,180
0,110
kb
2,9-23,0*
2,7-19,0*
3,0-23,0*
3,5-21,0*
4,8-18,0
4,8-18,0
5,2-15,0
5,2-15,0
N - número de indivíduos analisados; n - número médio de bandas, sd - desvio padrão; x - coeficiente médio
de bandas em comum; xn - probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem o mesmo padrão
de bandas; q - freqüência média das bandas (Jeffreys et al, 1985a). kb - Tamanho dos fragmentos
considerados na análise, em pares de bases (* - indica a menor e maior variação dos fragmentos
considerados em 4 géis para a sonda 33.6 e 3 géis para a sonda 33.15).
7.2 - Programa de Reintrodução de Penelope superciliaris jacupemba
As cinco aves cativas que formaram o grupo de fundadores de Penelope
superciliaris jacupemba foram progenitoras de 85 animais (57%) dos que foram
liberados nas áreas de reflorestamento da CESP (Tab. 23).
Entre si, os fundadores apresentaram índice médio de similaridade de
0,195 (sonda 33.6) e de 0,256 (sonda 33.15). Os não fundadores apresentaram
menor índice de similaridade para a sonda 33.6 (0,247) do que para a sonda
33.15 ( 0,266)(Tab. 21).
Comparados com os fundadores, os indivíduos de vida livre apresentaram
índice de similaridade de 0,297 (Tab. 22) para a sonda 33.6, e para a sonda
60
33.15, de 0,328. A comparação dos indivíduos de vida livre com os não
fundadores revelou índice médio de similaridade de 0,188 para a sonda 33.6 e de
0,209 para a sonda 33.15.
Tabela 23. Casais que contribuíram efetivamente com o programa e
solturas de Penelope superciliaris nas áreas de reflorestamento da
CESP de Paraibuna. É indicada a procedência dos casais.
Macho
485
013**
C11*
C09*
C07
C17
1640**
001**
004**
C07
Procedência
Paraibuna
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Paraibuna
Paraibuna
Rio de Janeiro
Ilha Solteira
Rio de Janeiro
Fêmea
C02
014**
C08*
C12*
C13*
011**
1586
C02
007**
C08
Procedência
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Ilha Solteira
Rio de Janeiro
Paraibuna
Paraibuna
Paraibuna
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Ilha Solteira
Total
Descendentes
15
28
27
21
21
13
16
02
04
01
148
* - Indivíduos escolhidos para a comparação entre os que mais contribuíram para a
reintrodução e os de vida livre. ** - Indivíduos falecidos antes da coleta de sangue ser
realizada.
61
DISCUSSÃO
1 - Técnicas de Identificação Individual Através do DNA em Cracidae e em
Outras Espécies
As técnicas de identificação individual através do DNA (ii-DNA ou “DNA
Fingerpriting”) foram aqui padronizadas e aplicadas em Cracidae na identificação
individual das aves, comprovação de filiação e monitoramento da variabilidade
genética dos indivíduos cativos e de vida livre. A digestão do DNA genômico das
espécies aqui estudadas com a enzima MboI mostrou os melhores padrões
polimórficos de hibridação com as sondas humanas de minissatélites 33.6 e 33.15
de Jeffreys. Hanotte et al. (1992) mostrou a importância da escolha da enzima de
restrição utilizada em diversas espécies de galiformes naturais e mantidas em
cativeiro, por uma única geração. Os valores de similaridade variaram, por
exemplo, de 0,06 a 0,29 no galo-selvagem-vermelho Lagopus lagopus e de 0,11 a
0,73 no faisão Phasianus colchicus, dependendo da sonda e da enzima utilizadas
(Tab. 24). Os autores concluíram que a escolha da enzima de restrição influencia
grandemente o número de bandas e o índice de similaridade. Por esse motivo é
desejável que sempre sejam realizados testes de escolha da combinação
sonda/enzima que forneça um número razoável de bandas, e que detecte o
máximo de variabilidade entre os indivíduos.
Para o mutum-do-sudeste Crax blumenbachii, o urumutum Nothocrax
urumutum, o jacu-guaçu Penelope obscura bronzina e a jacutinga Pipile jacutinga,
a sonda 33.6 revelou maior variabilidade do que a 33.15, enquanto que no
jacupemba Penelope superciliaris jacupemba e no mutum-de-penacho Crax
fasciolata, os resultados de ambas as sondas são equivalentes. O perfil de
bandas produzidos nas espécies estudadas de Cracidae é polimórfico,
apresentando, em média, entre 9,80 e 28,4 bandas, e índices de similaridade
média entre 0,145 e 0,347, semelhante aos produzidos em outros vertebrados e
em humanos (Tabs. 25 e 26).
62
Tabela 24. Resultados de várias hibridações feitas em várias
espécies de galiformes por Hanotte et al. (1992a), utilizando
as sondas 33.6 e 33.15 e quatro diferentes enzimas de
restrição.
Espécie
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Lagopus lagopus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Phasianus colchicus
Gallus gallus
Gallus gallus
Gallus gallus
Gallus gallus
Pavo cristatus
Pavo cristatus
Pavo cristatus
Pavo cristatus
Sonda/Enzima
33.6/AluI
33.6/DdeI
33.6/HaeIII
33.6/HinfI
33.15/AluI
33.15/DdeI
33.15/HaeIII
33.15/HinfI
33.6/AluI
33.6/DdeI
33.6/HaeIII
33.6/HinfI
33.15/AluI
33.15/DdeI
33.15/HaeIII
33.15/HinfI
33.6/AluI
33.6/DdeI
33.6/HaeIII
33.6/HinfI
33.15/AluI
33.15/DdeI
33.15/HaeIII
33.15/HinfI
n±sd
12,2±1,7
12,0±1,4
14,2±3,2
11,0±2,4
34,2±3,6
35,0±2,2
30,7±2,1
32,2±2,2
19,0±3,5
25,3±2,1
12,3±2,5
24,6±3,0
34,6±2,1
24,7±0,6
33,7±4,0
31,3±5,5
14,7±3,2
11,3±2,5
15,0±2,0
29,3±0,5
34,0±1,0
33,0±2,6
33,7±1,5
38,7±3,5
x±sd
0,06±0,04
0,17±0,11
0,21±0,09
0,16±0,08
0,28±0,04
0,29±0,04
0,22±0,07
0,26±0,08
0,11±0,06
0,13±0,09
0,25±0,14
0,23±0,10
0,63±0,03
0,73±0,06
0,73±0,06
0,71±0,10
0,29±0,07
0,29±0,03
0,15±0,07
0,21±0,05
0,48±0,10
0,39±0,05
0,34±0,04
0,42±0,02
n - número de bandas detectadas; sd - desvio padrão. x - índice de
similaridade.
A técnica se mostrou útil na identificação individual das aves analisadas. A
probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem, ao acaso, o
mesmo padrão de bandas variou entre 10-9 a 10-21, semelhante à encontrada para
outras espécies de galiformes (Hanotte et al., 1992a) e pistacídeos (Miyaki et al.,
1993, 1995). Degnan (1993) encontrou valores superiores aos observados em
cracídeos (da ordem de 10-3) em diversas populações naturais de Zosterops
lateralis, uma espécie não ameaçada. Algumas de suas populações amostradas
colonizaram ilhas em um período recente. Isto pode explicar a ocorrência de
63
baixa variabilidade genética. As menores variações foram encontradas em ilhas
mais isoladas, onde a taxa de imigração é mais limitada. No entanto, é possível
que a combinação de sonda M13 com a enzima HaeIII usada por Degnan et al.
(1993) não seja a mais apropriada, visto que uma de suas populações, conhecida
por ser grande e exocruzada, apresentou índice médio de similaridade de 0,31.
Tabela 25. Dados obtidos da hibridação de várias sondas minissatélites com o DNA
de diferentes espécies ou populações de aves**.
Espécie
Zosterops lateralis (1)
Loxioides bailleui (1)*
Sturnus vulgaris
Sturnus vulgaris
Falco columbarius
Falco columbarius
Guira guira
Ara ararauna
Ara chloroptera*
Ara macao*
Ara nobilis
Parus atricullus
Merops apiaster
Merops apiaster
Merops apiaster
sonda/enzima
M13/HaeIII
M13/HaeIII
M13/HaeIII
M13/HaeIII
M13/HaeIII
M13/HaeIII
M13/HaeIII
33.15/HaeIII
33.15/HaeIII
33.6/AluI
33.15/AluI
33.6/HaeIII
33.15/HaeIII
33.6 e 15 /HaeIII
33.6/HaeIII
33.6/HaeIII
33.6/HaeIII
33.6/HaeIII
Per/HaeIII
33.15/HaeIII
33.6/HaeIII
M13/HaeIII
n±sd
6,3±1,2
6,3±1,1
6,5±1,5
6,0±1,8
6,9±1,5
12,2±2,9
12,2±2,9
17,9±5,1
17,9±5,1
31,6±4,4
30,9±5,8
19,4±0,5
17,2±0,6
43,2±1,0
28,3±4,2
27,7±3,6
25,2±4,5
21,5±2,9
20,3±0,4
23,7±2,8
24,2±0,8
18,9±1,1
x±sd
0,52±0,15
0,53±0,21
0,48±0,14
0,67±0,13
0,31±0,15
0,17±0,10
0,25±0,11
0,26±0,10
0,30±0,11
0,11±0,05
0,13±0,05
0,38±0,03
0,26±0,03
0,27±0,06
0,21±0,06
0,19±0,07
0,25±0,06
0,16±0,07
0,10±0,02
0,19±0,07
0,20±0,07
0,16±0,08
Referência
Degnan et al., 1993
Degnan et al., 1993
Degnan et al., 1993
Degnan et al., 1993
Degnan et al., 1993
Fleischer et al., 1994
Pinxten et al., 1993
Pinxten et al., 1993
Warketin et al., 1994
Warketin et al., 1994
Quinn et al., 1994
Miyaki et al., 1993
Miyaki et al., 1993
Miyaki et al., 1993
Miyaki et al., 1993
Otter et al., 1994
Jones et al., 1991
Jones et al., 1991
Jones et al., 1991
n - número de bandas detectadas; sd - desvio padrão. x - índice de similaridade. * - Representa espécie
ameaçada ou em extinção. ** - Os números entre parêntesis indicam populações de localidades
diferentes. Os valores de similaridade correspondem a indivíduos supostamente não relacionados.
Apenas as espécies analisadas por Miyaki et al. (1993) são de cativeiro; as demais correspondem a
animais da natureza.
Em algumas espécies de mamíferos e répteis estudadas pela técnica de
identificação individual através do DNA, os valores do índice de similaridade são
semelhantes aos encontrados em aves. Foram encontradas índices menores que
0,19 nos roedores Microtus montanus e Peromyscus maniculatus (Cummings &
Hallet, 1991) e na serpente Vipera berus (Tegelström & Höggren, 1994), e índices
64
elevados (>0,74) em muitos dos casos relatados, como na foca Phoca vitulina
(Kappe et al., 1995) e no urso Phascolarctos cinereus (Timms et al., 1993), sendo
estas duas espécies ameaçadas de extinção. Também em grupos de leões
africanos Panthera leo leo e em populações da pantera-da-Flórida Felis concolor
coryi menos do que 50% de heterozigosidade foi detectada nos minissatélites
(Gilbert et al., 1991; Roelke et al., 1993), sendo estas duas espécies também
ameaçadas.
Tabela 26. Dados obtidos da hibridação de sondas minissatélites com o DNA de algumas
espécies de mamíferos, répteis e no Homem**.
Espécie
Helogale parvula
sonda/enzima
33.6/AluI
Helogale parvula
33.15/AluI
Pipistrellus pipistrellus
33.6/HaeIII
Pipistrellus pipistrellus
33.15/HaeIII
Phascolarctos cinereus*
Canis lupus (matilha 1)
Canis lupus (matilha 2)
Microtus montanus
Microtus montanus
Perognathus parvus
Peromyscus maniculatus
Phoca vitulina (1)*
Phoca vitulina (2)*
Phoca vitulina (1x2)*
Phoca vitulina (1)*
Phoca vitulina (2)*
Phoca vitulina (1x2)*
Halichoerus grypus
Halichoerus grypus
Chelydra serpentina
Chelydra serpentina
Vipera berus
Homo sapiens
Homo sapiens
M13/MspI
33.6/HinfI
33.6/HinfI
Mouse/HaeIII
(CAC)5/HaeIII
SNAP/HaeIII
SNAP/HaeIII
33.6/HinfI
33.6/HinfI
33.6/HinfI
33.15/HinfI
33.15/HinfI
33.15/HinfI
33.6/HinfI
33.15/HinfI
33.6/HaeIII
33.15/HaeIII
(TG)n/AluI
33.6/HinfI
F10/BspRI
n±sd
16,5±3,
9
16,1±4,
0
27,3±2,
8
36,5±5,
1
24,7
6
17
14
22
25
25
25
40
40
40
28
39
26,4
30,6
20,5
15
17,6
x±sd
0,36±0,08
Referência
Keane et al., 1994
0,37±0,08
Keane et al., 1994
0,30±0,04
Bishop et al., 1992
0,30±0,05
Bishop et al., 1992
0,74±0,06
0,36±0,12
0,55±0,12
0,17±0,10
0,31±0,08
0,38±0,07
0,19±0,05
0,82±0,02
0,83±0,01
0,80±0,05
0,87±0,01
0,79±0,01
0,81±0,04
0,49±0,01
0,50±0,01
0,324
0,506
0,18±0,07
0,25
0,26
Timms et al., 1993
Lehman et al., 1992
Lehman et al., 1992
Cummings & Hallet, 1991
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Kappe et al., 1995
Galbraith et al., 1993
Galbraith et al., 1993
Tegelström & Höggren, 1994
Jeffreys et al., 1985c
Pena et al., 1993
n - número de bandas detectadas; sd - desvio padrão. x - índice de similaridade. * - Representa espécie
ameaçada ou em extinção. ** - Os números entre parêntesis indicam populações de localidades diferentes. Os
valores de similaridade correspondem a indivíduos supostamente não relacionados. Todas os espécimens
analisados são da natureza, exceto para Microtus montanus que são originados de uma população cativa.
65
Populações naturais do estorninho europeu Sturnus vulgaris (Pinxten et al.,
1993), do chapim Parus atricullus (Otter et al., 1994) e do abelhuraco Merops
apiaster (Jones et al., 1991), apresentaram índices de similaridade menores que
0,200. No entanto, em populações naturais da cambacica ameaçada Loxioides
bailleui do Hawai (Fleischer et al., 1994), do anu-branco Guira guira do Brasil
Central (Quinn et al., 1994) e do falconiforme canadense Falco columbarius
(Warketin et al., 1994) foram detectados índices de similaridade maiores que os
encontrados neste estudo com cracídeos. A população do anu-branco, amostrada
por Quinn et al. (1994) numa área de estudo de 3000 hectares consistia de cerca
de 120-170 aves e mais da metade da população foi amostrada. Os autores
concluíram que muitos indivíduos podem ser relacionados a outros da população,
explicando a baixa variabilidade genética encontrada. Fleischer et al. (1994)
concluíram que as populações de Loxioides bailleui por eles estudadas
provavelmente não se mantiveram fragmentadas por muito tempo e/ou pode ter
ocorrido um intenso fluxo gênico, reduzindo os efeitos da deriva genética, tendo
em vista que as populações apresentaram estrutura genética típica de
populações exocruzadas, como nos estudos feitos por Burke & Bruford (1987),
Westneat (1990) e Brock & White (1992).
Em populações naturais da cambacica havaiana, Loxioides bailleui,
ameaçada de extinção (Fleischer et al., 1994), no trigueirão Miliaria calandra
(Hartley et al., 1993), em psitacídeos (Miyaki et al., 1995) e na foca cinza
Halichoerus grypus (Amos et al., 1995), o índice médio de similaridade foi maior
entre indivíduos relacionados (>0,590) do que entre não relacionados (<0,270).
Desta forma, o índice de bandas em comum tem se revelado um bom indicador
de parentesco entre indivíduos de uma população. Nas amostras analisadas de
cracídeos, o índice de similaridade médio entre pais-filhos foi maior do que 0,480
e entre irmãos, maior do que 0,540. Entre indivíduos sem informação sobre
relações de parentesco este parâmetro foi menor do que 0,340.
Cerca de 10% das bandas detectadas com a sonda 33.6 também são
detectadas com a sonda 33.15, nas espécies de cracídeos analisadas, com
66
exceção de Crax blumenbachii, onde a sonda 33.6 detectou fragmentos de peso
molecular maior do que para a sonda 33.15. Nesta espécie apenas os fragmentos
aproximadamente entre 5 e 6 kb são detectados por ambas as sondas. Não foi
possível determinar se as sobreposições encontradas entre os fragmentos
detectados pelas duas sondas correspondem a um mesmo fragmento, sendo
hibridado com ambas as sondas, ou se fragmentos específicos para a sonda 33.6
migraram para a mesma posição eletroforética que fragmentos específicos para a
sonda 33.15. Em humanos Jeffreys et al. (1986, 1991) demostraram haver muito
pouca sobreposição entre essas duas sondas (<1%), mas em cães cerca de 23%
dos fragmentos detectados pela sonda 33.6 também são detectados pela sonda
33.15 (Jeffreys & Morton, 1987).
Considerando a alta taxa de sobreposição de bandas entre os padrões
detectados pelas sondas 33.6 e 33.15 nos cracídeos estudados, e o número
suficiente de locos independentes estimado para cada uma das sondas
estudadas em duas irmandades, cada qual pertencente a um gênero diferente
(Penelope obscura bronzina e Pipile jacutinga), concluíu-se que não seria
adequado considerar as informações das duas sondas em conjunto como
realizado por Jeffreys et al. (1991) em humanos, Bruford & Burke (1994) em
galinhas, Choudhury et al. (1993) em gansos, Pinxten et al. (1993) em
estorninhos europeus, Baker et al. (1993) em baleias e Galbraith et al. (1993) em
tartarugas.
Desta
forma
preferiu-se
considerar
cada
uma
das
sondas
independentemente. Os dados mostram que tanto a sonda 33.6, quanto a sonda
33.15 podem ser utilizadas para estudos de variabilidade de cracídeos, embora a
sonda 33.6 detecte maior variabilidade em algumas das espécies estudadas, e
por este motivo seria mais adequada.
2 - Estimativa da Variabilidade Genética das Espécies de Cracídeos
Estudadas e Sua Distribuição Geográfica Histórica
67
Diversos estudos têm mostrado que há maior variabilidade genética em
minissatélites do que em proteínas. Por serem seletivamente neutras (Burke et
al., 1991) e por apresentarem taxas elevadas de mutação, as regiões
minissatélites diferem mais entre si ao longo do tempo do que as proteínas o
fazem. Portanto em espécies onde os sistemas protéicos analisados se
mostraram monomórficos ou apresentaram baixa heterozigosidade (Barrowclough
& Gutiérrez, 1990; Ellegren et al., 1993; Roelke et al., 1993; Sundt et al., 1994)
estudos com sondas que detectam um padrão de multiloco ou com as de loco
único podem ser úteis na obtenção de dados relativos à variabilidade genética da
espécie (Gilbert et al., 1991; Ellegren et al., 1993; Menotti-Raymond & O’Brien,
1993; Roelke et al., 1993; Sundt et al., 1994).
Uma vez que a taxa de mutação de minissatélites é cerca de 100 a 1000
vezes maior do que a taxa de outros locos genômicos, esta técnica tem se
mostrado útil para revelar histórias evolutivas recentes em mamíferos e aves,
principalmente em casos de perda de habitat ocorridos nos últimos 100 anos,
como mostram os exemplos a seguir.
Gilbert et al. (1990) avaliando a variabilidade genética através da utilização
de minissatélites de uma espécie de raposa, Urocyon litoralis, verificaram o
padrão de colonização de várias ilhas californianas na região de Los Angeles. Os
dados obtidos com os padrões de minissatélites são concordantes com o registro
fóssil e com a história geológica da separação das ilhas. Os dados indicam que a
colonização iniciou cerca de 16500 anos atrás, partindo do continente para as
ilhas mais ao norte, e ocorreu a cerca de 3800 a 800 anos nas ilhas mais ao sul,
geograficamente mais distantes do continente.
Uma população de 100 leões africanos foi fundada por oito indivíduos
sobreviventes de uma epidemia ocorrida em 1962 e sete outros leões
provenientes de outra população. O nível de variação em minissatélites
encontrado nesta população foi baixo (CBC=0,48), mas maior do que o
encontrado em uma população asiática (CBC=0,96) que atualmente é composta
por 250 indivíduos, descendentes de uma população fundada na última virada de
68
século por menos de 20 leões, e de uma população africana exocruzada
(CBC=0,51) com cerca de 3000 indivíduos (Gilbert et al., 1991).
A cheetah africana Acinonyx jubatus, conhecida como o animal terrestre
mais rápido do mundo, está em risco de extinção devido a perda de habitat e
caça. Esta espécie apresenta níveis altos de erosão genética de locos
codificantes. O gargalo evolutivo por que passou foi estimado em ter ocorrido a
cerca de 12 mil anos atrás, sendo apoiado por dados de minissatélites e de DNA
mitocondrial (Menotti-Raymond & O’Brien, 1993). Os resultados obtidos pelos
autores indicaram ainda que a redução da variabilidade genética verificada na
cheetah não foi completa e permanente. Um nível moderado de variação ocorreu
ao longo do tempo, e alguma variação genética adaptativa residual permanece
nas cheetahs atuais. A variabilidade detectada pela utilização de sondas de
minissatélites é importante para a escolha dos casais em programas de
recuperação desta espécie em cativeiro.
Comparando algumas populações de gansos de três espécies diferentes,
Tegelström & Sjöberg (1995) estabeleceram que índices de similaridade próximos
de 0,200, estimados a partir de minissatélites, podem ser típicos de população
não afetadas por gargalos evolutivos. Uma população canadense de Branta
canadensis apresentou índices de similaridades menores que 0,17, similar ao de
populações exocruzadas. Outra população desta espécie, fundada por apenas
cinco aves na década de 30, e introduzida na Suécia, Finlândia e Noruega na
década de 60, teve índices de 0,76. Atualmente a população conta com cerca de
30 a 50 mil indivíduos. Duas outras espécies, Branta leucopis mantidos em
cativeiro e Anser erythropus, de vida livre, apresentaram índice de similaridade
entre 0,32 e 0,38. A população desta última espécie contém mais de 1000 pares
reprodutores. O nível de variabilidade encontrado neste caso foi atribuído ao
rápido aumento populacional e ao fluxo gênico ocorrido com outras duas grandes
populações asiáticas.
Triggs et al. (1992) analisaram a estrutura populacional de uma espécie de
patos neozelandeses, Hymenolaimus malacorhynchos, através das regiões
69
minissatélites, e verificaram um certo grau de endocruzamento. Além da baixa
taxa de dispersão geográfica que esta espécie apresenta, os níveis de
endocruzamento também foram atribuídos à recente perda de habitat devido ao
desenvolvimento agrícola e aproveitamento dos rios.
A perda de habitat e caça esportiva ou alimentar são as maiores causas da
redução das populações de cracídeos. A distribuição histórica no Brasil das seis
espécies estudadas pode ser vista na figura 3. Crax blumenbachii apresenta a
menor área de distribuição, restrita ao Sudeste brasileiro. Crax fasciolata era
encontrado do sul do Brasil Central até região Norte e Nordeste. Nothocrax
urumutum era restrito à Floresta Amazônica, ao oeste da Região Norte. Penelope
obscura bronzina distribuía-se em áreas de Mata Atlântica, na região Sudeste do
Brasil, sobrepondo-se nessa região com Penelope superciliaris jacupemba, que
apresentava ampla distribuição, presente na região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e
área ocidental da região Nordeste. Pipile jacutinga ocupava áreas de Mata
Atlântica do Sudeste e Sul do Brasil. Atualmente estas espécies se encontram
distribuídas, em maior ou menor grau, em pequenos isolados.
Figura 3. Distribuição geográfica histórica das seis espécies de Cracidae
estudadas aqui. 1 - Nothocrax urumutum. 2 - Crax fasciolata. 3 - Crax
blumenbachii. 4 - Pipile jacutinga. 5 e 6 - Penelope superciliaris jacupemba. 6
- Penelope obscura bronzina. Segundo Sick (1993) e Delacour & Amadon
(1973).
70
O desmatamento da Floresta Amazônica no estado de Rondônia chegou a
um total de 13% (Fearnside, 1991) e a Amazônia Legal a 5,12% segundo dados
de sensoriamento remoto obtidos até 1988 (INPE, 1989). A cobertura vegetal dos
estados de Espírito Santo, Minas Gerais, São Paulo e Santa Catarina foram
estimadas em percentuais de 8,34, 1,49, 7,16 e 15,96 até 1990 (INPE, 1993).
Sick (1993) relata que existem fotografias das décadas de 30 e 40 que
mostram caçadores ao lado de “pirâmides” de jacutingas mortas na região de
Londrina, PR. Nesta mesma época esta espécie era encontrada à venda em
mercados de Porto Alegre, RS. Em uma carta a Charles Darwin, Fritz Müller conta
que chegou a ver meia dúzia de jacutingas serem mortas em uma mesma árvore
e relata ainda que durante o inverno de 1866, aproximadamente 50000 delas
foram mortas nas várzeas do rio Itajaí, estado de Santa Catarina (Sick, 1993).
Das espécies aqui analisadas, Crax blumenbachii e Pipile jacutinga são as
mais ameaçadas, especialmente a primeira espécie, que sempre teve uma
pequena área de distribuição. As espécies de Penelope aqui estudadas ainda não
se encontram tão ameaçadas quanto as duas espécies de cracídeos citadas
anteriormente, porém Penelope obscura bronzina é considerada pelo IBAMA
(Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis) como
uma subespécie ameaçada (Portaria no 1522 publicada no Diário Oficial da União
em 19 de dezembro de 1989).
A variabilidade genética estimada através do índice de similaridade (CBC)
nas espécies aqui estudadas variou de 0,145 no mutum-do-sudeste Crax
blumenbachii (sonda 33.6) a 0,347 na população de jacupemba Penelope
superciliaris jacupemba (sonda 33.6) que se estabeleceu após reintrodução em
Paraibuna.
As
estimativas
da
variabilidade
encontradas
através
da
heterozigosidade média (H%) revelaram uma variação de 96,10% em Crax
blumenbachii (sonda 33.6) a 89,44% para Penelope superciliaris jacupemba
(sonda 33.6). Os valores da H% e do CBC estão evidentemente correlacionados
71
uma vez que o valor da H% é estimado através da freqüência média das bandas
que por sua vez é estimado a partir do coeficiente de bandas em comum.
As espécies de cracídeos estudadas não são representativas de nenhuma
população natural uma vez que as amostras de sangue foram coletadas em aves
de cativeiro e em populações que se estabeleceram após reintrodução. Por este
motivo não é possível saber se são informativas sobre a variabilidade de
populações naturais, uma vez que não estão disponíveis os dados relativos à
procedência das matrizes das aves aqui estudadas.
Para as espécies onde encontrou-se uma variabilidade elevada, tais como
em Crax blumenbachii, Crax fasciolata, Penelope obscura bronzina e em Pipile
jacutinga mantidos em cativeiro, isso tanto pode representar a alta variabilidade
presente em alguma população ancestral,
quanto a variabilidade global da
espécie representada por matrizes originárias de diferentes subpopulações
isoladas, cada qual com uma variabilidade diminuída e com fixação de diferentes
alelos. A quebra do isolamento aumenta a freqüência de heterozigotos (Wahlund,
1928), e a criação em cativeiro a partir de matrizes provenientes de diferentes
populações isoladas poderia resultar em uma prole com variabilidade equivalente
à uma quebra de isolados. Da mesma forma, nas espécies com menor
variabilidade genética entre os indivíduos estudados, como os três espécimens de
Nothocrax urumutum considerados como não relacionados e em Penelope
superciliaris jacupemba, a variabilidade encontrada pode estar reduzida por
parentesco entre os indivíduos estudados, por deriva genética ocorrida em
cativeiro ou por matrizes originadas de uma população natural com pouca
variabilidade.
De modo geral, os índices médios de similaridade obtidos a partir da
hibridação com a sonda humana de minissatélite 33.6 apresentaram valores
menores do que os obtidos com a sonda 33.15, possivelmente indicando maior
número de fragmentos ligados detectados com esta última sonda.
Fragmentos ligados ao cromossomo W de aves já foram detectados para
as sondas 33.6 (Graves et al., 1993) e 33.15 (Miyaki et al., 1992; Rabenold et al.,
72
1991a), assim como também para uma outra sonda de minissatélite (Longmire et
al., 1991). Nesses casos seus tamanhos são constantes para cada espécie
estudada (Miyaki et al., 1992, 1993, 1995; Graves et al., 1993; Rabenold et al.,
1991; Longmire et al., 1991). Não foi possível identificar fragmentos sexoespecíficos em cracídeos uma vez que nem sempre havia um número suficiente
de machos e fêmeas conhecidos que permitisse uma investigação mais acurada
deste tipo de fragmentos. Pode haver também polimorfismo de tamanho destes
fragmentos, o que torna ainda mais difícil sua detecção. Como a maior parte das
espécies de cracídeos apresenta dimorfismo sexual, a identificação de
fragmentos sexo-específicos não foi objetivo do presente trabalho.
Os índices médios de similaridade nos cracídeos aqui analisados podem
ser considerados relativamente altos, levantando a suspeita de que várias aves
possam ser aparentadas. De fato não há informações o bastante acuradas da
procedência e relações de parentesco dos animais estudados, a não ser seu
criadouro de origem. Por exemplo, muitos dos jacus mantidos em cativeiro pela
CESP de Paraibuna são provenientes de um mesmo criadouro particular no Rio
de Janeiro (Pedro Nardelli). A maior parte dos criadores de jacus no Brasil tem
recebido as suas matrizes de dois ou três criadores tradicionais que têm
conseguido um alto desempenho reprodutivo e, então, espécimens provenientes
de diversos criadores podem ser aparentados. Então, a menor variabilidade
genética encontrada em Penelope obscura bronzina poderia ser atribuída a esse
fato. Como se trata ainda de uma espécie ameaçada de extinção ela pode ter
perdido grande parte da variabilidade ancestral. No entanto, os índices de
similaridade encontrados para cracídeos são menores que de algumas
populações naturais.
Dada a pequena amostra de Nothocrax urumutum (3 indivíduos) não
relacionados deste estudo e principalmente pelo fato de as fêmeas supostamente
não relacionadas apresentarem índice de similaridade de 0,428 com a sonda
33.6, próximo ao da relação pai-filho (0,538) e mãe-filho (0,545), os dados
referentes a esta espécie devem ser considerados com cautela até que se tenha
73
a possibilidade de estudar mais espécimens. Contudo, Hanotte et al. (1992)
analisaram apenas 3 ou 4 espécimens não relacionados em cada espécie de
galiformes estudada. De fato, em populações com heterozigosidade média alta, o
estudo de poucos indivíduos não relacionados é suficiente para demonstrar a alta
variabilidade entre os indivíduos. No caso do mutum-de-penacho Crax fasciolata
com apenas duas aves estudadas, detectou-se uma grande variabilidade que
tanto pode representar uma variabilidade da espécie como um todo, uma vez que
trata-se de espécie não ameaçada, ou alternativamente, os dois indivíduos são
originados de populações diferentes, cada uma delas com variabilidade menor.
Nas espécies aqui analisadas, Crax blumenbachii apresentou a maior
probabilidade de dois indivíduos não relacionados apresentarem, ao acaso, o
mesmo padrão de bandas (da ordem de 10-9 para a sonda 33.6) devido ao fato de
ter apresentado menor número médio de bandas. Quanto maior o número de
bandas detectadas, menor será a probabilidade de que dois indivíduos tenham,
ao acaso, o mesmo padrão de bandas. Apesar de terem sido detectadas apenas
9 bandas em média nessa espécie, o polimorfismo detectado pela sonda 33.6 foi
dos mais altos (CBC=0,14±0,10; q=0,075). Isto é um aspecto notável, uma vez
que esta espécie é ameaçada de extinção (Collar et al., 1992; Sick, 1993).
Possivelmente a alta variabilidade genética encontrada nesta espécie deve se ao
fato de que os animais analisados neste estudo descendem de aves da natureza
em uma época em que a espécie não era ameaçada, refletindo a variabilidade
genética característica de uma população grande e que ainda não havia sofrido
declínio rápido. Alternativamente, a alta variabilidade pode refletir aves retiradas
de diversas populações isoladas, onde cada população apresentava uma baixa
variabilidade, mas que no conjunto da espécie, indicam a variabilidade existente
no passado. Esta interpretação da variabilidade aqui constatada é compatível
com a distribuição atual desta espécie, restrita a pequenos grupos em quatro
reservas florestais (Monte Pascal, BA; Rio Doce, MG; Sooretama e Linhares, ES)
(Collar et al., 1992).
74
O bom desempenho reprodutivo em cativeiro obtido por criadores como por
exemplo Roberto Azeredo da Fundação Crax (Azeredo, 1996, comunicação
pessoal), que vem acompanhando o desenvolvimento dos filhotes há mais de 30
anos, mostra que apesar de ter iniciado a criação com sete aves fundadoras, a
população cativa mantida atualmente não apresenta nenhuma depressão por
endocruzamento. Esta situação pode ser devida à alta variabilidade genética das
aves fundadoras ou alternativamente à domesticação por seleção, caso em que
se esperaria uma variabilidade diminuída. Não há informação a respeito da
origem dos espécimens de Crax blumenbachii aqui estudados, a não ser que
alguns foram doados ao Criadouro Chaparral pela Fundação Crax.
3 - Aplicação da Técnica de Identificação Individual Através do DNA em
Programas de Criação em Cativeiro
3.1 - Comprovação de Paternidade
As técnicas de identificação individual através do DNA vêm sendo
utilizadas com sucesso em casos de simples determinação de filiação ou estudos
de comportamento reprodutivo em diversas espécies (Pena et al., 1993;
Westneat, 1990; Birkhead et al., 1990; Haig et al., 1993; Warketin et al., 1994;
Wickings et al., 1993; Bischoff & Duffield, 1994). No entanto, um nível mínimo de
variabilidade é necessária para que se possa obter resultados confiáveis. Em
populações com baixa variabilidade genética a técnica pode falhar na
determinação de filiação. Em uma população européia silvestre de gansos,
fundada por apenas cinco indivíduos, o índice médio de similaridade obtido entre
indivíduos não relacionados foi de 0,76, não sendo possível a determinação
segura da paternidade (Tegelström & Sjöberg, 1995). Em outro estudo realizado
em coalas australianos Phascolarctus cinereus, a variabilidade genética
encontrada utilizando diversas sondas de minissatélites foi muito baixa
(similaridade entre 75 e 100% dependendo da combinação sonda/enzima
75
utilizada)(Taylor et al., 1991), o que também não permitiria a definição da
paternidade suspeita.
Esse não é caso das populações de Cracidae estudadas, em que os
valores esperados de similaridade entre pais e filhos e entre irmãos são maiores
que os encontrados para indivíduos não relacionados. A confirmação de filiação
foi dada como certa se os prováveis progenitores e seus descendentes
apresentassem índices de similaridade próximo ao esperado, e se não houvesse
mais do que duas bandas não atribuíveis aos progenitores. As menores
variabilidades
encontradas
(CBC>0,340)
foram
para
as
populações
reintroduzidas de jacu-guaçu Penelope obscura bronzina e de jacupemba
Penelope superciliaris jacupemba, amostradas nas áreas de reflorestamento da
CESP, porém suficiente para se realizar a determinação segura da paternidade
nos casos alegados.
No filhote de mutum-do-sudeste Crax blumenbachii várias bandas não
puderam ser atribuídas aos supostos progenitores, não sendo confirmada a
paternidade e a maternidade. Conseqüentemente os coeficientes de bandas em
comum também se revelaram menores do que o esperado para pais e filhos. Em
um dos dois casos de paternidade alegados para o jacu-guaçu Penelope obscura
capturado na região de reintrodução pela CESP e portador de anilha, não foi
possível a confirmação da paternidade. A ave em questão não teve índice de
similaridade próximo ao esperado para a relação pai-filho estimada para cada
uma das sondas de minissatélites usadas e a análise das bandas mostrou que
muitas bandas do filhote não eram atribuídas a esse suposto progenitor.
Possivelmente houve algum engano nas anotações relativas aos pais em relação
a estas aves.
Nas famílias de jacu-guaçu Penelope obscura composta pelo casal e cinco
filhotes, e de jacutinga Pipile jacutinga composta pelo casal e sete descendentes,
todos os fragmentos presentes nos filhos puderam ser atribuídos a um dos pais e
nenhuma nova mutação foi detectada. Para ambas as sondas, a similaridade
média observada entre pais-filhos e entre irmãos foi muito próxima ao esperado.
76
Esse também foi o caso do urumutum Nothocrax urumutum para a sonda 33.6.
No entanto, os índices observados com a sonda 33.15 foram superiores ao
esperado.
Possivelmente
locos
ligados
que
não
se
segregam
independentemente ou ainda um grande loco com sítios de restrição internos
podem ser responsáveis pelo aumento dos índices de similaridade observados
entre pais e filhos. Não foi possível estudar o padrão de segregação das bandas
nesta espécie por falta de disponibilidade de famílias com diversos filhos.
Maior similaridade com um dos progenitores pode ocorrer se esse
progenitor apresentar maior número de bandas ligadas que o outro. Esse parece
ser o caso encontrado nas famílias Penelope obscura bronzina e de Pipile
jacutinga, onde alguns filhotes apresentaram índices mais elevados para o
esperado entre pais-filhos. Contudo, a maior similaridade com um dos pais
mostrou-se independente do número de bandas detectadas em cada um dos
progenitores. Com a sonda 33.6 em Nothocrax urumutum, a fêmea apresentou
19 bandas, e o macho apenas 12, mas os índices de similaridade entre mãe-filho
e pai-filho foram semelhantes entre si e próximo ao esperado. Contudo, para a
sonda 33.15, os coeficientes de bandas em comum encontrados entre cada
progenitor e seu filho foram superiores ao esperado, embora o número de
bandas de cada progenitor seja semelhante.
3.2 - Orientação de Acasalamentos
A formação de casais com baixos índices de similaridade pode ser útil para
a manutenção do patrimônio genético da espécie. Evitando se o endocruzamento
impede-se que genes deletérios em heterosigosidade, presentes em populações
que não estão adaptadas à condição de consangüinidade, venham a se tornar
homozigotos, aumentando as taxas de mortalidade na fase juvenil e infertilidade,
além de problemas de malformações congênitas. Efeitos do endocruzamento já
foram analisados em diversas espécies silvestres em cativeiro, naturais, ou de
laboratório (DeBois et al., 1990; Roelke et al., 1993; Backus et al., 1995;
77
Frankham, 1995). Em espécie não endocruzadas os índices de similaridade
estimados pelas técnicas de identificação individual através do DNA podem ser
úteis para se inferir a existência de consanguinidade entre dois indivíduos, uma
vez que estas técnicas são úteis na determinação de relações de parentesco de
primeira ordem (Burke & Bruford, 1987; Wetton et al., 1987; Morton et al., 1990;
Westneat, 1990; Kempenaers et al., 1992; Brock & White, 1992; Piper &
Rabenold, 1992; Miyaki et al., 1995). A escolha de casais com menores índices
de similaridade evita o endocruzamento, aumenta a variabilidade genética da
progênie, e possibilita a manutenção da variabilidade existente nos fundadores.
O estabelecimento de populações cativas pode produzir uma série de
efeitos genéticos. Se o tamanho populacional tiver número efetivo reduzido, o
conjunto gênico da população cativa irá diferir da população silvestre da qual foi
originada. Nesse caso, alelos raros podem ser perdidos aleatoriamente devido à
deriva genética. A redução na heterozigosidade e variação alélica resulta, em
geral, na diminuição da aptidão média dos indivíduos e no potencial evolutivo da
população a longo termo (Lande, 1988).
Características comportamentais, fisiológicas e de desenvolvimento
parecem ser muito sensíveis às condições de cativeiro e muitas delas podem
apresentar alta herdabilidade e ser selecionadas facilmente em cativeiro. A
população pode, então, tornar se cada vez menos adaptada a voltar à condição
de vida silvestre (Derrickson & Snyder, 1992). Devido à sua complexidade, as
características comportamentais estão sujeitas a perda ou rápida alteração a não
ser que o ambiente de cativeiro contenha alguns requisitos básicos que permita
que os animais tenham experiências físicas e sociais durante período críticos de
seu
desenvolvimento.
Tais
modificações
comportamentais
podem
afetar
posteriormente a reprodução em cativeiro e a sobrevivência na natureza.
Exemplos da utilização de minissatélites em programas de recuperação em
catveiro de espécies ameaçadas são dados a seguir.
Butler et al. (1994) analisaram duas amostra cativas (uma de um zoológico
norte-americano e outra de um criador particular no Qatar) da gazela de Speke
78
Gazella spekei, uma espécie africana altamente ameaçada. Duas fêmeas da
população de Qatar foram doadas ao Zoológico de Saint Louis. Para testar a
possível contribuição destas fêmeas para o plantel norte-americano, os autores
aplicaram as técnicas de identificação individual através do DNA e verificaram
que elas representavam uma fonte de variação genética
distinta daquela
presente na amostra norte-americana. Foi sugerido também pelos autores que os
genomas dos fundadores devem ser representados igualmente na população
fundada, para que o máximo de variabilidade genética esteja presente na
descendência, contribuindo para a sobrevivência da população a longo tempo.
Rave et al. (1994) propõe que indivíduos que possuem alelos raros devem
ser favorecidos em programas de reprodução na tentativa de manter esses alelos,
estratégia esta conhecida como “manejo de parentesco raro”. No entanto, Miller
(1995) usando informações do pedigree do cavalo-de-Przewalski Equus
przewalski,
considerado
extinto
na
natureza,
e
do
condor-da-Califórnia
Gymnogyps californianus, uma espécie altamente ameaçada de extinção,
demonstrou que a estratégia de manejo do parentesco raro pode, em alguns
casos, reduzir ainda mais a variabilidade genética do restante do genoma e
aumentar a relação média de parentesco em populações pequenas, tendo pouco
efeito em populações grandes.
Lacy (1987) desenvolveu um programa de simulação populacional
computadorizada para estimar a perda da variabilidade genética com base no
tamanho efetivo de uma população e outras variáveis estocásticas. Quanto maior
o tamanho efetivo de uma população, menor a perda da variabilidade genética a
cada geração. A deriva genética é um dos fatores que mais atuam sobre as
populações de tamanho efetivo reduzido. Contudo, a deriva é um fenômeno de
amostragem e seus efeitos podem ser sobrepostos por outros fatores,
demográficos e ambientais, que sob condições adversas penalizam populações
naturais ou de cativeiro. Desta forma a manutenção de populações com tamanho
efetivo grande é desejável em programas de reprodução em cativeiro. Como esta
situação é difícil de ser realizada na prática e diante da possibilidade do programa
79
fracassar por exemplo por alguma epidemia afetando grande parte dos
indivíduos, existe a necessidade da interação entre diversas instituições que em
conjunto abrigam o número máximo possível de fundadores que são
eventualmente intercambiados.
Para o mutum-do-sudeste Crax blumenbachii, a variabilidade genética
estimada entre indivíduos não relacionados foi alta, sendo isto de grande
importância para programas de reprodução em cativeiro. Se os indivíduos
nascidos em cativeiro serão usados em programas de conservação da espécie,
então a variabilidade genética presente em animais cativos deve ser maximizada
para garantir que os animais reintroduzidos na natureza possam ser
heterogêneos, aumentando as possibilidades de recuperação da espécie. Crax
blumenbachii é uma espécie citada como rara desde 1969 (Sick, 1969), estando
incluída no Livro Vermelho das Espécies Ameaçadas de Extinção (Collar et al.,
1992). Sua caça já era proibida no estado do Espírito Santo em 1947 (Sick, 1969)
e atualmente está protegida sob a lei federal no 5197 de 03 de janeiro de 1967
(Portaria no 1522 publicada no Diário Oficial da União de 19 de dezembro de
1989). Entre os possíveis casais que podem ser formados a partir do plantel
estudado, cada uma das sondas humanas de minissatélites usadas neste
trabalho demonstrou haver várias possibilidades de formação de casais com
baixos índices de similaridade. Casais que apresentaram baixos índices de
similaridade são mais indicados para serem mantidos juntos, na tentativa de
evitar associações entre machos e fêmeas que tenham relações de parentesco
de primeiro grau. No entanto a eficiência reprodutiva dos casais assim
constituídos necessita de comprovação.
A CESP vem reproduzindo Penelope obscura bronzina e P. superciliaris
jacupemba em cativeiro desde 1986. Dados reprodutivos fornecidos pela CESP
aliados com os dados de minissatélites aqui obtidos indicam que os reais
significados dos índices de similaridade não estão claros. Casais que vêm
reproduzindo bem em cativeiro tiveram índices de similaridade de 0,100 a 0,400.
80
Em Penelope obscura e P. superciliaris, altos índices de similaridades aliados
com bom potencial reprodutivo em cativeiro não indica necessariamente melhor
sobrevivência de seus descendentes, após reintrodução na natureza. Essas aves
têm um alto potencial de adaptação às condições de cativeiro e a domesticação
permite maior viabilidade das espécies, mesmo em linhagens com alto
endocruzamento. É bem conhecido que as condições presentes em cativeiro são
bem diferentes das encontradas em vida silvestre, e dessa forma indivíduos que
seriam inviáveis quando em vida livre facilmente se mantém e podem chegar a se
reproduzir quando em cativeiro. Na maioria dos casos as aves destas espécies
são provenientes da Zoobotânica Mário Nardelli, Rio de Janeiro, ou nasceram no
Setor de Aves Silvestres da CESP em Paraibuna, porém com pais oriundos da
Zoobotânica Mário Nardelli.
Com a intenção de aumentar o número de casais reprodutores que
efetivamente contribuem para as solturas, e desta forma uniformizar a
contribuição de cada fundador, foram estimados os índices de similaridade entre
todos os possíveis casais de ambas as espécies de Penelope (alguns indivíduos
não foram considerados na análise por não apresentarem padrões de bandas
bem definidos, devido à problemas técnicos). Ainda serão avaliados os resultados
da orientação genética feita por este estudo.
Brock & White (1992) analisaram dados de similaridade genética e dados
reprodutivos de um grupo cativo de Amazona vittata, resultante de uma
população silvestre que sofreu vários declínios populacionais desde o século
XVIII e encontraram as maiores taxas reprodutivas em casais com menores
índices de similaridade. Os autores sugerem ainda que a falta de sucesso
reprodutivo em alguns casais com similaridade menor do que 0,400 pode ser
devido à incompatibilidade comportamental. Delacour & Amadon (1973) relatam
que em cracídeos é difícil induzir um macho ou uma fêmea a aceitar um novo
parceiro, sendo necessário algumas vezes colocá-los em compartimentos
separados e adjacentes, até que demonstrem sinais de aceitação. Segundo
informações fornecidas pela equipe técnica da CESP, alguns casais de Penelope
81
com baixos índices de similaridade foram formados por dados indicados neste
estudo e foi verificado que houve casos de incompatibilidade entre alguns casais,
chegando a haver agressões físicas entre eles; os dados numéricos referentes a
tais tentativas não foram fornecidos.
Detectados com as Sondas Utilizadas
Famílias com diversos descendentes são úteis em estudos de segregação
de bandas, conforme já demonstrado em humanos (Jeffreys et al., 1986; Wayne
& Fourney, 1990), camundongos Mus (Jeffreys et al., 1987), Prunella modularis
(Burke et al., 1989), no fringilídeo Taeniopygia guttata (Birkhead et al., 1990), em
papagaios Amazona ventralis (Brock & White, 1991), em trutas Salmo trutta
(Prodöhl et al., 1994) e em Aratinga (Miyaki et al., 1995). Através deste estudo é
possível verificar se as bandas são herdadas em atração (grupos cosegregantes), em repulsão (alelos) ou independentemente e estimar o número
mínimo de locos de segregação independente. Na falta deste tipo de análise para
uma dada espécie, considera-se que todos os fragmentos segregam-se
independentemente e que todas as bandas apresentam a mesma frequência de
transmissão, e os diferentes parâmetros são estimados com base nessa hipótese.
Na questão de independência de bandas cabe esclarecer que o termo
“ligação” vem sendo usado de maneira ampla de modo a englobar uma série de
associações entre as bandas. Além da possibilidade destas associações
ocorrerem ao acaso, elas também podem resultar de dois fenômenos distintos:
ligação devido a dois ou mais locos estarem localizados no mesmo cromossomo,
havendo influência da distância entre eles na frequência de genótipos
recombinante; e desequilíbrio de ligação, onde há associação permanente ou
transiente entre alelos de locos diferentes, devido a vários fatores como seleção,
endocruzamento, subdivisão populacional, efeito de fundador e acasalamento
preferencial (Amos et al., 1992).
82
Sítios internos de restrição em um minissatélite também podem resultar em
uma série de sub-fragmentos que se comportam como alelos ligados, produzindo
sub-fragmentos de baixo peso molecular que migram para uma região não
analisável do gel. Um efeito ao contrário pode ocorrer: sítios internos de restrição
podem resultar em fragmentos de tamanho adequado para a análise,
aumentando os índices de similaridade
A hipótese de desequilíbrio de ligação é extremamente difícil de ser
analisada diretamente devido à dificuldade de se comparar os padrões
polimórficos de géis diferentes e de se saber exatamente que locos estão sendo
analisados.
O estudo de segregação de bandas foi realizado em uma família de jacuguaçu Penelope obscura bronzina composta pelo casal e cinco descendentes e
em uma família de jacutingas Pipile jacutinga composta de um casal e sete
descendentes. Foi demostrado que os fragmentos são herdados em padrão
mendeliano, isto é, cerca de 50% das bandas são de origem paternas e 50%,
materna. Nenhum fragmento novo, surgido devido a mutação foi detectado nas
duas famílias estudadas. O número de grupos de ligação e de pares de alelos foi
estimado e, para ambas as sondas, o número de locos independentes paternos e
maternos foi semelhante. Na família de Penelope obscura bronzina estudada, o
número mínimo de locos de segregação independente estimado foi de pelo
menos 9 e na de Pipile jacutinga, de pelo menos 16. Esses valores são uma
subestimativa já que a probabilidade de encontrar dois fragmentos que cosegregam ao acaso é de 0,26 para um total de 23 bandas em uma família com
cinco descendentes e de 0,02 para um total de 28 bandas em uma família com
sete descendentes. Os números de locos de segregação independente
encontrados são semelhantes aos estimados em humanos (de 16 a 43)(Jeffreys
et al., 1986), cães (13 locos) (Jeffreys & Morton, 1987), gatos (10 locos)(Jeffreys
& Morton, 1987), pardais domésticos (de 7 a 21 locos)(Burke & Bruford, 1987),
tilápias (12 locos)(Brookfield et al., 1993) e psitacídeos (14 locos)(Miyaki et al.,
1995). Contudo, Brock & White (1991) estimaram que a sonda 33.15 detecta
83
apenas de 2 a 6 locos de segregação independentes em Amazona ventralis.
Jeffreys & Morton (1987), Burke & Bruford (1987) e Brock & White (1991)
consideram que os grupos de
ligação encontrados nas famílias por eles
estudadas correspondem na verdade a um único bloco de minissatélite que
apresenta sítios internos de restrição. Os grupos de co-segregação encontrados
aqui também podem representar um único bloco de minissatélites que possuem
sítios internos de restrição. Brock & White (1991) encontraram em 18 espécimens
de Amazona ventralis cativos, compondo 3 gerações, os mais complexos padrões
de ligação entre os fragmentos. Para um dos locos, 11 bandas co-segregantes
foram detectadas e um outro loco apresentou 19 bandas co-segregantes.
No jacu-guaçu Penelope obscura bronzina e na jacutinga Pipile jacutinga,
as sondas humanas de minissatélites 33.6 e 33.15 detectam um número
equivalente de locos independentes, conforme demonstrado também em cães e
gatos (Jeffreys & Morton, 1987), e no fringilídeo Taeniopygia guttata (Birkhead et
al., 1990), mas ao contrário de psitacídeos do gênero Aratinga (Miyaki et al.,
1995), onde um número menor de fragmentos independentes é detectado para a
sonda 33.15 e fragmentos ligados ao cromossomo W estão presentes. O
pequeno número de pares de alelos encontrados em ambas as espécies aqui
analisadas indica que eles variam muito em tamanho e provavelmente se
encontravam na região não considerada do gel (>25,0 e <3,0 kb) da mesma
forma como encontrado nos diferentes trabalhos sobre padrões de segregação
com sondas de minissatélites.
5 - Programa de Reintrodução na Natureza
A literatura científica é relativamente pobre em trabalhos que analisam
programas de reintrodução desde a implantação do plantel até o monitoramento
intensivo em populações que foram estabelecidas a partir de reintroduções
realizadas por intervenção humana, especialmente em relação ao monitoramento
genético.
84
Métodos de conservação em cativeiro também apresentam vantagens,
especialmente para espécies com populações pequenas e fragmentadas que
apresentam alta probabilidade de se extinguir. Para espécies que se reproduzem
facilmente em cativeiro o aumento da taxa de reprodução pode ser significativo,
permitindo que os animais possam ser usados em programas de soltura na
natureza, aumentando a densidade demográfica das populações silvestres ainda
existentes, corrigindo desbalanceamento de razões sexuais, aumentando a
variabilidade genética, restabelecendo populações extirpadas e estabelecendo
novas populações em habitats naturais ou alterados.
Métodos de criação e reprodução em cativeiro devem ser iniciados
preferencialmente quando a espécie ainda retém muito de sua variabilidade
genética para assegurar que a falta de variação não vai ser uma das principais
causas do insucesso a que tais programas podem estar sujeitos. Contudo, iniciar
precocemente um programa de recuperação para uma espécie que não está
ameaçada pode representar gastos financeiros desnecessários.
A necessidade de se iniciar um programa de criação e reprodução em
cativeiro é decorrente de dados coletados em campo. Estas investigações podem
dar idéia do grau de degradação ambiental e/ou demográfica a que a espécie
está submetida, e a partir dos dados obtidos pode-se estabelecer que tipo de
atitude deve ser tomada. Em outras palavras, dados obtidos em campo podem
auxiliar a decidir se medidas de criação e reprodução em cativeiro devem ser
tomadas paralelamente às medidas como preservação de habitats, através do
estabelecimento de uma reserva, manejo através de suplementação de
alimentos, aumento de disponibilidades de ninhos e modificação da legislação.
Recentemente a reintrodução de animais nascidos em cativeiro tem sido
efetuada mundialmente em uma série de grupos animais e pode ser útil em
muitas situações. As causas que levam uma determinada população à extinção
são muitas vezes especulativas mas mesmo assim esforços conservacionistas
devem ser realizados evitando que a possível causa da extinção volte a atuar
sobre as populações reintroduzidas (Bunin & Jamieson, 1995). A rápida perda e
85
degradação de habitat pode levar as populações a níveis demográficos críticos ao
ponto da espécie não mais se auto-sustentar, ou tornar-se vulnerável à
catástrofes. Tentativas de reintroduções podem suprir essas deficiências
demográficas, e até mesmo genéticas, desde que elas ocorram em áreas
protegidas que tenham uma capacidade de suporte para o estabelecimento de
uma nova população ou em uma área que possua uma população pequena mas
que pode ser aumentada. Contudo a introdução de espécies exóticas fora de seu
habitat natural pode ter efeitos negativos sobre as populações locais (Bertram,
1995; Bunin & Jamieson, 1995; Houston & Schreiner, 1995). Arano et al. (1995)
discutem o efeito da hibridogênese em espécies do complexo Rana esculenta e
atentam para o problema de redução de diversidade de espécies que os
programas de translocação podem causar. Também pode ocorrer a depressão
por exocruzamento quando os indivíduos introduzidos estão adaptados a uma
situação diferente da que ocorre na população residente.
Pelo estudo de minissatélites, as populações de jacus Penelope obscura
bronzina e P. superciliaris jacupemba de vida livre, resultantes das reintroduções
realizadas pela CESP, apresentaram menor variabilidade genética que as
populações mantidas em cativeiro. Essas aves de vida livre supostamente se
estabeleceram na região a partir das solturas realizadas pela CESP e a menor
variabilidade encontrada reflete o pequeno número de fundadores e a
contribuição desigual destes para as solturas. Poucos casais são responsáveis
pela maior contribuição para o programa e alguns casais não contribuíram para a
reintrodução desde o início do programa. No jacu-guaçu Penelope obscura
bronzina, 75% dos indivíduos liberados são descendentes de 3 dos 12 casais
cativos, e no jacupemba P. superciliaris jacupemba, 57% dos animais liberados
são descendentes de 3 dos 10 casais mantidos em cativeiro. Vale a pena
ressaltar que a similaridade genética avaliada com a sonda mais informativa
(33.6) foi menor entre os fundadores para Penelope obscura bronzina do que
entre os não fundadores. No caso de Penelope superciliaris jacupemba ocorreu o
86
oposto. Infelizmente não existem informações precisas a respeito do desempenho
reprodutivo destas espécies após reintrodução.
Como a maioria das aves capturadas nas áreas de solturas não
apresentavam anilha, duas hipóteses alternativas foram levantadas: essas aves
são descendentes das aves liberadas, ou essas aves estão sendo atraídas para a
região do Reservatório de Paraibuna, advindas de regiões adjacentes ao
reservatório. Para averiguar essas hipóteses, as populações de vida livre das
duas espécies de Penelope foram comparadas a cinco indivíduos da população
cativa que efetivamente contribuíram para as solturas (denominados fundadores)
e à cinco aves que não contribuíram para as solturas (não-fundadores). Verificouse que a população de vida livre das duas espécies de Penelope apresentaram
maior similaridade quando comparada com os fundadores do que com os não
fundadores. Esse fato, aliado também à informação de que a grande maioria das
aves capturadas nas áreas de reintrodução não apresentavam anilha também são
indicativos de que a população das duas espécies de Penelope que se
estabeleceram na região do Reservatório de Paraibuna é descendente das aves
reintroduzidas pela CESP. No total foram liberados 266 aves de ambas as
espécies.
Apesar dos responsáveis pelo programa não terem se preocupado em
igualar a contribuição dos diferentes indivíduos existentes em cativeiro, o
programa pode ser considerado um sucesso uma vez que a população que se
estabeleceu está se reproduzindo normalmente, como pode ser observado na
região da reintrodução pela presença de ninhos e nascimentos de filhotes. É
interessante lembrar que a população de gansos que se estabeleceu na Suécia,
Finlândia e Noruega, que hoje conta com 30 a 50 mil aves, foi estabelecida a
partir de cinco fundadores (Tegelström & Sjöberg, 1995).
As espécies liberadas na natureza na região do reservatório de Paraibuna,
SP, são importantes para a manutenção do ecossistema, uma vez que são
grande dispersoras de sementes. Desta forma essas aves podem auxiliar a
recuperar o ecossitema que foi degrado durante a construção da barragem do
87
Reservatório de Paraibuna. Essa região é protegida e é difícil o acesso de
pessoas que poderiam representar uma ameaça à recuperação das espécies
reintroduzidas e ao ecossistema como um todo.
Antes da liberação das aves na natureza, elas passam por um processo de
readaptação ao ambiente, sendo treinadas a procurar seu próprio alimento. A
alimentação fornecida às aves cativas do programa da CESP de reintrodução na
natureza é composta de alimentos nativos da região, que constitui a base
alimentar das populações silvestres aí estabelecidas. O sucesso deste programa
pode estar associado também ao fato de que as áreas de soltura correpondem a
áreas de distribuição histórica destas espécies.
Um projeto semelhante a este vem sendo realizado na região do Vale do
Aço, Minas Gerais, com Crax blumembachii. Neste projeto, as aves nascidas em
cativeiro vem sendo reintroduzidas numa reserva florestal de Mata Atlântica
pertencente à uma companhia particular, permanecendo protegida de distúrbios
causados por humanos. O projeto está sendo executado com financiamento de
duas entidades privadas, a Fundação Crax e a CENIBRA (Celulose Nipo
Brasileira), mostrando a potencial importância de entidades privadas que podem
ser envolvidas com programas de recuperação das espécies ameaçadas.
Para as demais espécies de cracídeos, incluindo também as não
analisadas aqui, a reprodução em cativeiro com finalidades de recuperação da
espécie pode ser facilmente atingida, visto que este grupo apresenta bom
potencial reprodutivo em cativeiro (Nogueira-Neto, 1973), e que não requerem
recursos de sobrevivência muito específicos, aumentando as possibilidades de se
obter sucesso em programas de repovoamento.
As técnicas de DNA como as utilizadas no presente trabalho podem
contribuir no monitoramento de programas de criação em cativeiro e
monitoramento de populações naturais e introduzidas.
88
RESUMO
No presente trabalho, foi estudada a variabilidade genética de seis espécies de
cracídeos (Crax blumenbachii, C. fasciolata, Nothocrax urumutum, Penelope obscura
bronzina, P. superciliaris jacupemba e Pipile jacutinga) utilizando sondas de
minissatélites humanos 33.6 e 33.15 desenvolvidas por Jeffreys et al. (1985a).
As amostras de sangue foram coletadas de espécimens em cativeiro e de
populações de Penelope sp que se estabeleceram em áreas reflorestadas em Paraibuna,
SP, onde houve reintrodução destas espécies a partir de 1986 pela CESP.
A variabilidade genética foi estimada a partir dos coeficientes de bandas em
comum (CBC) e através da heterozigosidade média detectada.
Os padrões obtidos mostraram-se altamente variáveis e específicos para cada
indivíduos em todas as espécies estudadas com qualquer uma das sondas utilizadas,
porém a sonda 33.6 revelou maior variabilidade para quatro das espécies.
Duas das espécies estudadas (Crax blumenbachii e Pipile jacutinga) são
consideradas como ameaçadas de extinção. A variabilidade genética estimada a partir de
indivíduos não aparentados em cativeiro revelou-se semelhante à encontrada em
populações naturais de aves não ameaçadas.
Em cinco das espécies estudadas, cerca de 10% das bandas detectadas por uma
das sondas também foi detectada pela segunda e por este motivo a análise foi realizada
separadamente para cada uma das sondas.
O coeficiente de bandas em comum foi maior entre indivíduos com parentesco
conhecido do que entre indivíduos considerados como não aparentados, conforme
esperado.
O estudo de segregação de bandas paternas e maternas em irmandades de cinco
(Penelope obscura bronzina) e sete filhotes (Pipile jacutinga) revelou que cada uma das
sondas detectou pelo menos nove locos de segregação independente, número este
considerado como adequado para estudos populacionais e de identificação individual.
Houve possibilidade de confirmar a filiação alegada de 14 filhotes e rejeitar a
filiação em dois casos nos quais provavelmente houve um engano de registros.
Para a análise das populações que se estabeleceram na área reflorestada pela
CESP comparou-se os índices de similaridade genética dos indivíduos de vida livre com
cinco matrizes que contribuíram com mais de 50% dos descendentes que foram
liberados e com cinco indivíduos que não tiveram nenhuma contribuição para estas
solturas. Os índices estimados revelaram que as populações das aves reflorestadas das
duas espécies são resultantes das reintroduções realizadas. Apesar da menor
variabilidade genética detectada nestas populações, atribuída ao pequeno número de
fundadores, estas populações vem se estabelecendo e repovoando a região, indicando
até o momento, o sucesso do programa de reintrodução realizado.
Os resultados deste trabalho mostraram que as técnicas utilizadas são
apropriadas para o monitoramento da variabilidade genética de programas de criação em
cativeiro e de populações que se estabeleceram após solturas. São também apropriadas
para estimar a variabilidade genética de populações ameaçadas da natureza.
89
SUMMARY
We analysed the genetic variability of six cracidae species (Crax
blumenbachii, C. fasciolata, Nothocrax urumutum, Penelope obscura bronzina, P.
superciliaris jacupemba e Pipile jacutinga) using human minisatellite probes 33.6
and 33.15 developed by Jeffreys et al (1985a).
Blood samples were obtained from captive birds and from Penelope sp
populations reintroduced in reforested areas in Paraibuna, SP, by CESP.
The genetic variability was estimated using the band-sharing coefficient and
mean heterozigosity.
The profiles obtained were highly polymorphic and individual-specific in all
six species for both probes, and probe 33.6 revealed a higher variability in four of
the species.
Two of the species studied (Crax blumenbachii and Pipile jacutinga) are
considered as endangered. The genetic variability estimated for captive, unrelated
birds was similar to that of natural, non-threatened species of birds.
The analysis was done separately for each probe because we detected
around 10% of band overlap between both probes in five of the species.
Mean band-sharing coefficient was higher for known related birds than for
birds believed to be unrelated, as expected.
Segregation analysis of paternal and maternal fragments in sibships with
five (Penelope obscura bronzina) and seven descendents (Pipile jacutinga)
revealed that each probe detected at least nine independent loci, a number
considered useful for population studies and for individual indentification.
Parenthood was confirmed for 14 birds and rejected in two cases where
there was probably a mistake in the studbooks.
To analyse the populations that were settled in the CESP’s reforested
areas, we compared their genetic similarity indexes with five captive birds that are
the parents of more than 50% of all reintroduced youngs and with five captive
birds that didn’t contribute to the reintroduction program. The similarity indexes
revealed that the populations of the reforested areas are descendents of the
released birds, and showed until now the success of the program, in spite of the
low genetic variability.
Our results showed that the techniques here applied are useful for genetic
variability management of captive programs and reintroduced populations. They
are also useful to estimate genetic variability of endangered populations in the
wild.
90
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