Western Blot Durchführung

Western Blot
Eine Einführung zu den
Prinzipien mit hilfreichen
Tipps
22. Januar 2013
Cathrin Zeeck, Dipl. HumBio
Der Western Blot
Was ist
Western
Blotting?
Wie
funktioniert das?
• Auch “Immunoblotting” genannt
• Eine Technik zur Identifizierung eines Proteins aus einer Probe, welche ein Proteingemisch enthält
• Proteine werden anhand ihres Molekulargewichts durch Gelelektrophorese aufgetrennt
• Ein spezifischer Antikörper wird dann zur Detektion des Zielproteins genutzt
• Dadurch erhält man Informationen bezüglich des molekularen Gewichts und dessen
relativen Quantität
Lane 1: Anti-beta Actin antibody Ab8226 at 1/1000 dilution
Lane 2: Ab8226 at 1/10000 dilution
Lane 3-4:Ab8226 at 1/500 dilution
Lane 1: HeLa Cell lysate
Lane 2: HeLa Cell lysate
Lane 3: 293 Cell lysate
Lane 4: 3T3 Mouse Cell lysate
2
Warum Western Blotting?
Existiert das Protein von Interesse in meiner
Probe?
Resultiert die Behandlung meiner Probe mit “X” in
einer erhöhten/ verminderten Proteinexpression
im Vergleich mit einer unbehandelten Probe?
Gibt es einen Unterschied in der
Proteinexpression zwischen Zellen oder Gewebe?
Einsatz als Diagnostisches Werkzeug: WB
detektiert Lyme disease, BSE, HIV, etc.
3
Überblick der Präsentation
Schritte des Western Blotting
• Probenvorbereitung
• Gelelektrophorese
• Transfer vom Gel auf die Membran
• Immundetektion mit spezifischen
Antikörpern
Empfohlene Kontrollen
Antikörperauswahl
Problembehebung und Optimierung
4
Western Blot Durchführung
Schritt 1: Probenvorbereitung
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokol-Bibliothek und Produkte
5
Probenvorbereitung
Lyse – Aufschließen des Gewebes oder Zellen durch Puffer oder
mechanisch
• Zellen – Zellen auf Eis setzen, mit kaltem PBS waschen, dann mit
Lysepuffer versetzen (~ 1 mL pro 106 Zellen) und für 30 Min. bei 4ºC
schütteln
• Gewebe – Gewebe schnell auf Eis zerschneiden, in flüssigem
Stickstoff einfrieren (“flash freeze”), im Lysepuffer homogenisieren
(300 µL pro 5 mg Gewebe), den Homogenisator mit 2x 300 µL
Lysepuffer spülen, und für 2 Stunden bei 4ºC schütteln
• Zentrifugieren bei 4ºC für 20 Min., den Überstand auf Eis lagern
Messung der Proteinkonzentration
Reduzieren und Denaturieren– Versetzen der Proben mit Reagenzien,
um tertiäre oder quartäre Strukturen zu zerstören
• Versetzen der Probe mit 1x Probenpuffer, es folgt Erhitzen für 5 Min.
bei 95-100ºC oder 5-10 Min. bei 70ºC
6
Lyse
Lagern der Proben auf Eis oder bei 4ºC um Proteinabbau zu vermeiden
Puffer sollten eiskalt sein, und frisch aufbereitete Protease-Inhibitoren sollten vor dem
Experiment hinzugefügt werden
Falls das Zielprotein phosphoryliert sein sollte, müssen Phosphatase-Inhibitoren ebenfalls
zum Lysepuffer hinzugefügt werden
Der Lysepuffer sollte entsprechend der zellulären Lokalisation des Proteins gewählt
werden.
Proteinlokation
Lysepuffer Empfehlung
Gesammte Zelle
NP-40 or RIPA
Zytoplasmisch (löslich)
Tris-HCl
Zytoskelletal gebunden
Tris-Triton
Membran
NP-40 or RIPA
Zellkern
RIPA
Mitochondrien
RIPA
7
Reduzieren und Denaturieren
Typischer Probenpuffer enthält SDS (“sodium dodecyl sulfate”) und βMercaptoethanol oder DTT (Dithiothreitol)
• SDS denaturiert Proteine in ihre primäre Aminosäuresequenz und versetzt
diese gleichmäßig mit einer negativen Ladung
• β-Mercaptoethanol und DTT sind Reduktionssmittel, die unter anderem
Schwefelbrücken spalten
SDS und DTT/
ß-mercaptoethanol
Achtung: Manche Antikörper erkennen nur das nicht-reduzierte/nicht-denaturierte Protein. Arbeiten Sie daher ohne SDS oder β-Mercaptoethanol oder DTT
8
Western Blot Durchführung
Schritt 1: Probenvorbereitung
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokoll-Bibliothek und Produkte
9
SDS-PAGE
Was ist
das?
Eine Methode, die einzelne Proteine durch ihre elektrophoretische Mobilität
im elektrischen Feld von einander auftrennt.
10
SDS-PAGE
• Ein Gel aus hochvernetztem Polyacrylamid wird in die Kammer eingesetzt und
Laufpuffer zugegeben. Der Laufpuffer besteht meist aus 25mM Tris, 190mM
Glycin, 0.1% SDS, pH 8.3
Wie
funktioniert
die
Methode?
• Die Proteinlysate werden auf das Gel geladen, 20-40 µg pro Bahn auf Mini-Gel
• Durch das Anlegen eines elektr. Feldes wandern die Proteine zum Pluspol
(Kathode)
• Die Proteine tragen relativ zur Masse eine negative Ladung, durch SDSBeladung, die die endogene Proteinladung überlagern
• Die Proteine werden mittels ihrer Größe aufgetrennt (Molekulargewicht)
• Kleine Proteine wandern schneller durch die engmaschige Matrix
Stromfluss
+
Lauffront
11
Die Gele
Bestehen aus Acrylamid, N,N-Methylenbisacrylamide (Bis), Ammoniumpersulfat
(APS) und TEMED
Gelstruktur kann durch den Acrylamid-Prozentsatz beeinflusst werden
Verwenden Sie ein Gel mit einem hohen Acrylamid-Prozentsatz für ein kleines
Protein, und umgekehrt für ein großes Protein
Gradientengele sind eine gute Wahl, wenn die Größe unbekannt ist
Protein Size (kDa)
Gel Prozente
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8
12
Nicht-reduzierende und/oder
denaturierende Elektrophorese
Gewünschter
Proteinzustand
Gelbedingung
Probenpuffer
Laufpuffer
Reduziert- Denaturiert
Reduzierenddenaturierend
ß-Mercaptoethanol
oder DTT und SDS
Mit SDS
Reduziert- Nativ
Reduzierend &
Nichtdenaturierend
Mit ßmercaptoethanol or
DTT, kein SDS
Kein SDS
Oxidiert - Denaturiert
Nichtreduzierend &
denaturierend
Kein ßmercaptoethanol
oder DTT, mit SDS
Mit SDS
Oxidiert – Nativ
Nichtreduzierend &
Nichtdenaturierend
Kein ßmercaptoethanol
oder DTT, kein SDS
Kein SDS
13
Western Blot Durchführung
Schritt 1: Probenpreparation
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokol-Bibliothek und Produkte
14
Zweck des Transferschritts
Nach der Gelelektrophorese soll nun endlich das Protein sichtbar gemacht
werden!
Aber ein Gel eignet sich nicht besonders zur spezifischen Visualisierung
•
•
Antikörper binden keine Proteine im Gel
Gele sind zu instabil, um mit ihnen zu arbeiten
Daher werden Proteine auf eine robustere Oberfläche transferiert
15
Wie funktioniert der Transfer?
Wie die PAGE, nutzt es den elektrischen Strom von der Anode zur Kathode, in
dem die negativ geladenenen Proteine mitgerissen werden
Das Gel und die Membran werden übereinandergeschichtet
Die Proteine werden auf die Membran in dem selben Muster wie im Gel
übertragen
Die Membran besteht entweder aus Nitrozellulose oder aus Polyvinylidenfluorid
(PVDF). PVDF muss mit Methanol vorbehandelt werden!
Transfer Stack
16
Nasser vs. Semi-dry Transfer
•
Nass
•
•
•
SemiDry
•
•
Vorteil
Nachteil
Das Gel und die Membran werden
zwischen einen Schwamm und Papier
übereinandergeschichtet und sorgfältig
fixiert
Blotsandwich wird in die mit Transferpuffer
gefüllte Blotkammer eingesetzt und
Stromspannung angelegt
Transferpuffer besteht zumeist aus 25mM
Tris, 190mM Glycin und 20% MeOH
Überlegen bei
großen oder
schwierig zu
transferierenden
Proteins
Transfer kann
länger dauern
Ein Stapel aus Papier-Gel-MembranPapier wird durchnässt
Der Stapel wird zwischen die Kathode and
Anode platziert und Spannung angelegt
Transferpuffer besteht zumeist aus 48mm
Tris, 39mm Glycine, 0,04% SDS und 20%
MeOH
Schneller
Membran kann
austrocknen
17
Transfer der Proteine >100 kDa
Nasser Transfer über Nacht bei 4ºC und geringer Spannung
Zugabe von 0,1% SDS zu dem Transferpuffer, um Ausfällung des Proteins im
Gel zu verringern
Reduzieren des Methanolgehaltes auf 10% oder weniger im Transferpuffer,
sodass durch das Aufquellen des Gels Proteine freigegeben werden
Wenn eine PVDF Membran verwendet wird, kann Methanol komplett
entfernt werden (die Membran muss trotzdem noch aktiviert werden)
18
Western Blot Durchführung
Schritt 1: Probenvorbereitung
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokoll-Bibliothek und Produkte
19
Warum Antikörper?
Färbungen wie Coomassie färben alle
Proteine nach der SDS-PAGE
SDS3
Aber welche Bande ist die von Interesse?
Spezifische Antikörper lösen das Problem
durch Binden und Detektieren des gesuchten
Proteins
ab94303 SDS3 transfeziertes Lysat im
SDS-PAGE (links) und detektiert mit
ab89345 anti-SDS3 Antikörper im WB
(rechts)
20
Ablauf der Immundetektion
Blocken der
Membran
Milch, BSA, etc
Epitop
Inkubieren des
primären
Antikörpers
Protein
Protein
Antikörper
Waschen (TBST)
Inkubieren des
konjugierten Sekundär- Antikörpers
Protein
Protein
Antikörper
Waschen(TBST)
Detektion
Protein
21
Detektion
Chemolumineszenz-Substrate wie ECL reagieren mit dem HRP
gekoppelten Sekundär-Antikörper. Diese Reaktion wird auf einem Film
festgehalten
Chromogene Substrate (4-Chloronaphthol oder DAB) können mit HRP oder
AP reagieren, und bilden ein farbiges Reaktionsprodukt auf der Membran
Fluoreszenz-gekoppelte Sekundär-Antikörper können auch mit einem
speziellen Detektionssystem verwendet werden
22
Schritt 1: Probenvorbereitung
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokoll-Bibliothek und Produkte
23
Ladekontrollen
Ladekontrollen sind Antikörper, die anzeigen, ob ein Gel vor der SDS-PAGE gleichmäßig beladen wurde
Ladekontrollen detektieren ein Haushaltsprotein, welches in allen Proben gleich stark exprimiert sein sollte: Die
Banden der verschiedenen Proben sollten die gleiche Stärke aufweisen
Molekulares
Gewicht
(kDa)
Vorsicht bei….
Ladekontrolle
Probenart
Beta Actin
Volllysat/
zytoplasmisch
GAPDH
Volllysat/
zytoplasmisch
Tubulin
Volllysat/
zytoplasmisch
55 Tubulin expression may vary according to resistance to antimicrobial and
antimitotic drugs (Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000)
VDCA1/Porin
Mitochondrial
31
COXIV
Mitochondrial
16 Viele Proteine laufen auf der gleichen Höhe wie dieses 16 kDa Protein
Lamin B1
Nuklear
66 Nicht brauchbar für Proben bei denen die nukleare Membran entfernt wird.
TATA binding
protein TBP
Nuklear
38 Nicht brauchbar für Proben bei denen die DNA entfernt wird
43 Skelettmuskel-Proben: Changes in cell-growth conditions and interactions
with extracellular matrix components may alter actin protein synthesis
(Farmer et al, 1983)
30-40 Manche physiologischen Faktoren wie Hypoxie und Diabetes erhöhen die
GAPDH Expression in manchen Zelltypen.
24
Ladekontrollen
Achtung! Antikörperaffinität variiert zwischen Spezies, rekombinanten vs. nativen Proteinen, usw.
All lanes – Anti-beta Actin antibody - Loading Control
(ab8227) at 1/1000 dilution
Lane 1: HeLa cells (Human) at 20 µg
Lane 2: 3T3 cells (Mouse) at 20 µg
Lane 3: Fish Liver at 20 µg
Lane 4: Rabbit Liver at 20 µg
Lane 5: MDCK cells (Dog) at 20 µg/ml
Lane 6: EBTr cells (Cow) at 20 µg
Lane 7: SL-29 cells (Chicken) at 20 µg/ml
Lane 8: CHO cells (Chinese Hamster) at 20 µg
Lane 9: Xenopus embryo at 20 µg
25
Positiv- und Negativ-Kontrollen
Lassen Sie neben der eigentlichen Probe auch eine Probe mitlaufen, bei
der es sicher ist, dass diese das gesuchte Protein enthält
•
•
•
Rekombinantes Protein
Transfezierte Zellen
Gewebe oder Zelllinien, die das Protein exprimieren
Lassen Sie neben der eigentlichen Probe auch eine Probe mitlaufen, die
das Protein nicht enthält
• Knockout oder siRNA Proben
• Gewebe oder Zelllinien, die das Protein nicht exprimieren
26
Blocking-Peptide
Prä-Inkubation des primären Antikörper mit dem Immunogen-Peptid blockiert die
spezifische Bindungsstelle des Antikörpers
Spezifische Banden werden NICHT auf dem WB erscheinen, da der vorbehandelte
Antikörper nicht mehr das Zielproteine binden kann
Besonders hilfreich, um abzuklären, ob es sich bei den Nebenbanden um Isoformen oder
Spaltprodukte handelt, oder ob diese Banden komplett unspezifisch sind
All lanes: Anti-Histone H3 (phospho S10) antibody [mAbcam 14955] - ChIP Grade
(ab14955) at 1 µg/ml
Lane 1:
Control HeLa Histone Prep 0.5ug
Lane 2:
Colcemid treated HeLa Histone prep 0.5ug
Lane 3:
Control HeLa Histone Prep 0.5ug with Histone H3 peptide - phospho S10, tri methyl
K9 (ab15644) at 1 µg/ml
Lane 4:
Colcemid treated HeLa Histone prep 0.5ug with Histone H3 peptide - phospho S10,
tri methyl K9 (ab15644) at 1 µg/ml
Lane 5:
Control HeLa Histone Prep 0.5ug with Histone H3 peptide - unmodified (ab7228)
at 1 µg/ml
Lane 6:
Colcemid treated HeLa Histone prep 0.5ug with Histone H3 peptide – unmodified
(ab7228) at 1 µg/ml
Lane 7:
Control HeLa Histone Prep 0.5ug with Histone H3 peptide - phospho S10 (ab11477)
at 1 µg/ml
Lane 8:
Colcemid treated HeLa Histone prep 0.5ug with Histone H3 peptide - phospho S10
(ab11477) at 1 µg/ml
Lane 9:
Control HeLa Histone Prep 0.5ug with Histone H3 peptide - phospho S28 (ab14793)
at 1 µg/ml
Lane 10: Colcemid treated HeLa Histone prep 0.5ug with Histone H3 peptide - phospho S28
(ab14793) at 1 µg/ml
27
Schritt 1: Probenvorbereitung
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokoll-Bibliothek und Produkte
28
Eignung für Western Blot
Auswahl eines Antikörpers, der auch für diese Applikation
getestet wurde
Abcam listet alle getesteten Applikationen auf den Datenblättern
auf
29
Immunogene und Spezifizität
Immunogen – Spezifisches Protein oder Aminosäuresequenz eines Proteins wird in ein
Wirtstier injiziert, um eine Immunantwort (Antikörperproduktion) hervorzurufen
Das Immunogen diktiert an welche Region des Proteins der Antikörper bindet (Epitop)
Stellen Sie sicher, dass die Region sich mit dem Zielprotein überschneidet, wenn eine
bestimmte Isoform, das unreife Vorläuferprotein oder das reife Protein erkannt werden soll
NERTCRCDKP
NERTCRCDKP
30
Schritt 1: Probenvorbereitung
Schritt 2: Gelelektrophorese
Schritt 3: Proteintransfer
Schritt 4: Immundetektion
Kontrollen im Western Blot
Antikörperauswahl
Fehlerbehebung: Tipps und Beispiele
Protokoll-Bibliothek und Produkte
31
Keine oder Schwache Bande
Ursache
Lösung
Inkompatibler Sekundär- Antikörper
Sekundär- Antikörper muss mit der Wirtsspezies
sowie dem Isotyp des primären Antikörpers
reagieren (z.B. anti-Maus IgM mit Maus IgM des
primären Antikörpers)
Nicht genug Protein oder Antikörper
Verwenden Sie mehr Lysat, Primär,- oder SekundärAntikörper (eine Kombination aus diesen Faktoren
möglich)
Inkubation war nicht lange genug
Inkubation der Membran über Nacht bei 4ºC mit
primärem Antikörper
Membran ist nicht korrekt geblockt
Dauer des Blockens verringern, oder Wechsel des
Blockmittels. Tween 20 kann eine Kreuzreaktion des
Antikörpers mit dem Blockmittel verringern.
Protein wurde nicht transferiert
Überprüfen Sie den Transfer mit Ponceau.
Optimieren Sie den Transferzeitraum besonders
wenn es sich um sehr leichte/schwere Proteine
handelt.
Hydrophobe Proteine sind schwierig PVDF ist in diesem Fall der Nitrozellulose Membran
zu transferieren
vorzuziehen
Probe enthält das Zielprotein nicht
Nachschlagen in der Literatur oder anderer Quellen
Antikörper detektiert das Zielprotein
nicht
Überprüfen, ob das Immunogen des Antikörpers mit
dem Protein übereinstimmt
32
Hoher Hintergrund
Ursache
Lösung
Zu viel Protein oder Antikörper
verursachen unspezifische Banden
Reduzieren der Proteinladung und/oder der
Antikörper (Primär- als auch Sekundär- Antikörper)
Primär- Antikörper bei zu hoher
Temperatur inkubiert
Inkubieren über Nacht bei 4ºC
Membran ist nicht korrekt geblockt
Verlängern der Waschperiode und Zugabe von
Detergenzien wie Tween 20. Wechsel des
Blockmittels.
Wahl der Membran
Nitrozellulose gibt weniger Hintergrund als PVDF
Proteinabbau
Optimierung der Probenvorbereitung.
Zwischenlagern der Probe auf Eis, sofortiges
Zugabe von frischen Proteaseinhibitoren.
Langzeitlagerung kann Proteine zersetzen
Verschiedene Isoformen oder
Spaltprodukte
Nachschlagen in der Literatur oder anderer Quellen
Multimere
Kochen der Probe für 10 Min. bei 60C vor der SDSPAGE
33
Zu viel Protein und Antikörper
Probe und
Antikörper
verdünnen
34
Optimaler Blockierungspuffer
5% Milch
5% BSA
5% BSA 5% Milch
Anti-GAPDH Antikörper [mAbcam 9484] Loading Control (ab9484) Verdünnung 1/1000
Blockierungspuffer sind optimiert für verschiedene Antikörper
35
Luftblasen, ungenügendes Waschen,
unvollständiger Geltransfer
Unvollständiger
Kontakt zwischen Gel
und Membran
während des
Transfers
Luftblasen zwischen
Gel und Membran
während des
Transfers
Unzureichendes
Waschen
36
Unvollständiger Transfer von
Proteinen mit großem MW
Große Proteine wurden nicht auf die
Membran übertragen, wohingegen die
kleineren Proteine auf der Membran
erkennbar sind
Folgen Sie den Tipps zum Transfer großer
Proteine
Das Umgekehrte gilt, falls die kleinen
Proteine durch die Membran
hindurchwandern, dann verkürzen Sie
einfach die Transferzeit.
37
Native Proteine
Einige Antikörper haben eine deutlich höhere Affinität für native Proteinstrukturen
Das Bild zeigt ein WB mit gereinigtem Collagen III, links reduziert und denaturiert
und rechts die native Form
Die starke Bindung an der nativen 3D Struktur geht nach der Reduzierung und
Denaturierung verloren.
Reduziert,
denaturiert
Nativ
Humanes gereinigtes Collagen III (Ab7535) bei 5 µg pro Bahn mit
dem Anti-Collagen III Antikörper AB6310
Bahn 1: Reduziertes, denaturiertes Protein
Bahn 2: Natives (nicht-reduziertes, nicht-denaturiertes) Protein
Bild zur Verfügung gestellt von Abreview, eingereicht von Michaela
Leyh
38
Kennen Sie Ihr Protein?
Proteine können auch mehrere Banden aufweisen
Mögliche Gründe: Proteinspaltung, Post-translationale
Modifikationen, ungleiche Exprimierung der Isoform, isoelektrische
Eigenschaften
10-15% Unterschied zwischen Isoformexprimierung ist möglich
Schlagen Sie auf SwissProt und in der
Literatur nach
39
Reagenzien für Western Blotting
Optiblot
• Vorgegossene Gele und Puffer für einen optimalen Western Blot
• Zusätzliche Reagenzien (z.B. Gelfarbstoffe und Bradford-Reagenz)
• www.abcam.com/Optiblot
Prism
Proteingröß
enmarker
• Mehrfarbige vorgefärbte Proteingrößenmarker
• www.abcam.com/prismproteinladders
EasyLink
Antikörper
Konjugatio
ns-Kits
• 25 Konjugate erhältlich, darunter AP und HRP
• www.abcam.com/EasyLink
Kontrollen
und Lysate
ECL Kits
• Mehr als 2.100 Produkte für eine Vielzahl von Gewebetypen, Spezies und
Pathogenen
• www.abcam.com/controls
• Hochsensitive ECL Western Blotting-Substrate
• 50 Tests (Katalog-Nr: ab65623) or 500 Tests (Katalog-Nr : ab65628)
40
Semi-quantitative Alternativen
PhosphoTracer ELISA
In-Cell ELISA
•
•
•
Schnellste Detektierung von Phosphoproteinen
Ergebnisse schon nach ca. 70 min.
Detektierung von einem oder mehrerer Targets auf
der selben Platte
•
Messung der relativen Proteinmenge in kultivierten
Zelllinien
Bestimmung des Einflusses mehrerer Faktoren in
einem Experiment
•
•
Membran
AntikörperArray
•
•
Zytokine, Wachstumsfaktoren, sowie
phosphoryliertes EGFR
Kit enthält Puffer, Detektionsantikörper und
Nitrozellulosemembranen mit Capture-Antikörper
Brauchen kein spezielles Gerät
41
Webinar-Angebot für alle
Teilnehmer
Sparen Sie 20% auf die folgenden Produkte
•
•
•
ELISA-Kits
In-Cell ELISA-Kits
Antikörper-Arrays
Rabatt-Code: WBWEB-XBAP2
42
ELISA Kits
•
ELISA
•
•
•
Mehr als 600 Zielproteine, darunter auch
• Zytokine & Wachstumsfaktoren
• Kardiovaskulär-spezif. Proteine
• Krebsmetabolismus
• DNA-Reparatur Proteine
• BrdU
• Pathogen-spezifische Immunglobuline
ELISA-Arten
• Sandwich, indirekt, kompetitiv
Probentypen
• Zellkulturüberstand, Plasma, Serum,
Gewebeextrakt, Urin etc.
Detektionsmethoden
• kolorimetrisch, mittels Fluorogen, Infrarot
43
Einfache und zuverlässige Western
Blotting-Reagenzien
Einfache Handhabung
Bis zu 10x fester als
herkömmliche Gele
– farbige Wells für
einfache Beladung
– keine gerissenen Gele mehr
Wells mit mehr Volumen und
kein Kamm mehr – Laden Sie
Ihre Proben ohne Stress
Einfaches Öffnen
Haltbar für 12 Monate
– Nie mehr Gele wegwerfen
Kompatibel mit den
meisten Tanksystemen
– Ohne Spatel oder Messer
•
Optimierte Puffer – Schnellere und einfachere Experimente, ein
Puffer genügt
•
Optiblot Blue (ab119211) für schnelle Gelfärbung–Proteinbanden
schon in 15 Minuten, kein Wasch-, Mikrowelle- oder Entfärbeschritt
notwendig
•
Optiblot Bradford Reagenz (ab119216) – Kompatibel mit
Detergenzien für einfachere Experimente
•
•
Reagenzien-Paket– Spart Zeit und Geld
www.abcam.com/optiblot und www.abcam.com/optiblotfaqs
44
AbExcel Sekundärantikörper
Was macht AbExcel Sekundärantikörper so besonders?
•
Alle AbExcel Sekundärantikörper sind umfassend
getested
•
Basierend auf einer 1/5000 Verdünnung in 3ml
Milch/BSA, können Sie über 1500 Blots mit einem Vial
Alkalischer Phosphatase (AP) konjugierten AbExcel
Antikörper durchführen
•
Basierend auf einer 1/5000 Verdünnung in 3ml
Milch/BSA, können Sie über 600 Blots mit einem Vial
Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugierten AbExcel
Antikörper durchführen
Mehr AbExcel Info: http://www.abcam.com/AbExcel
45
Protokolle und Ressourcen
Detaillierte Western Blotting-Protokolle
www.abcam.com/protocols
Unsere Western Blotting-Anleitung herunterladen:
www.abcam.com/wbguide
Fragen und Antworten zu unserem Optiblot -Sortiment:
www.abcam.com/optiblotfaqs
46
Allergy and Asthma 2013
Datum: 23.-24. Mai 2013
Tagungsort: Brügge, Belgien
Konferenzthemen
•
•
•
•
Angeborene Immunantwort bei Asthma
Epithelbiologie und Asthma
Einreichungsfrist Vorträge:
22. Februar 2013
Einreichungsfrist Poster:
25. März 2013
Adaptive Immunantwort bei Asthma
Umweltfaktoren und Asthma
Bestätigte Sprecher
•
•
•
David Artis (University of Pennsylvania)
•
Carla Ribeiro (University of North Carolina)
und viele mehr....
John Fahy (University of California)
Darryl Knight (University of British
Columbia)
Konferenzwebseite:
www.abcam.com/AA2013
47
Chromatin, Replication and
Chromosomal Stability 2013
Datum: 17.-19. Juni 2013
Tagungsort : Kopenhagen, Dänemark
Konferenzthemen
•
•
•
•
Chromosomarchitektur
Einreichungsfrist Vorträge:
11. März 2013
Einreichungsfrist Poster:
22 . April 2013
Chromosomstabilität
Replikationsstruktur und Elongation
Chromatininstandhaltung und Zellgedächtnis
Hauptredner:
•
Susan Gasser und Adrian Bird
Redner
•
Karlene Cimprich, Michelle Debatisse, Job
Dekker, Steve Jacobsen, Kim Nasmyth,
Angela Taddei, Bing Zhu und viele mehr....
Konferenzwebseite:
www.abcam.com/copenhagen2013
48
Ubiquitin and Autophagy
Datum: 26.-27. Juni 2013
Tagungsort: Amsterdam, Niederlande
Konferenzthemen
•
Ubiquitinmodifikationen, - Konjugation,
Erkennung und Hydrolyse
•
Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche
Modifikatoren bei selektiver Autophagie
•
Räumlich-zeitliche Regulation von
Ubiquitinierung und Autophagie
Einreichungsfrist Vorträge:
18. März 2013
Einreichungsfrist Poster:
29 . April 2013
Hauptredner:
•
Vishva Dixit (Genentech, US)
Konferenzleiter:
•
•
Ivan Dikic (Goethe Universität Frankfurt)
David Komander (MRC, UK)
Konferenzwebseite:
www.abcam.com/amsterdam2013
49
Kontaktieren Sie uns
Abcams Wissenschaftlicher Dienst
Deutschland - Österreich - Schweiz
•
•
Email: [email protected]
Tel: DE: 030 896 779 154
•
•
AT: 019 288 259
CH: 043 501 64 24 – dt. Linie
•
•
061 500 05 30 – frz. Linie
Montag bis Freitag 8.00h-18.00h
Website: www.abcam.com
50
Fragen?
51