Protein Microarrays zur Cytokin-Detektion

Industrie-Applikationen
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Protein Microarrays zur Cytokin-Detektion:
Vergleich mit ELISA
John L. Tonkinson, Dan O. Osborn, Debbie English, Brett A. Stillman, Jens Beator* und Weiwen Zhao
R&D, Schleicher & Schuell BioScience, Inc., Keene, NH 03431, USA; *Schleicher & Schuell
BioScience GmbH, Dassel
Vergleich Antikörper Chip mit
ELISA
Plattformen für Protein
Microarrays
Analyse mit dem anti-Cytokin
Antikörper Chip
Für die Herstellung von Protein
Microarrays können prinzipiell
verschiedene Oberflächen eingesetzt werde. In jüngster Zeit
sind unterschiedliche, neue
Konzepte zur Proteomforschung
beschrieben worden. Das Spektrum reicht dabei von Antikörper-gestützten Untersuchungen
multipler Protein-Fraktionen[1]
über „reverse phase protein
microarrays“[2] bis zu Microarrays bakterieller Oberflächenantigene[3]. Die Plattform, die sich
in diesen und anderen Untersuchungen bewährt hat, sind
Nitrozellulose-beschichtete Objektträger (FAST™ Slides,
Schleicher & Schuell BioScience). In dieser Studie wird die
Übertragung von etablierten
Cytokin ELISAs in ein Protein
Microarray Format auf FAST
Slides beschrieben.
Um die Eignung des MicroarrayELISA zu untersuchen, wurde
IL8 und TNFα zu RPMI 1640
mit 10 % fötalem Rinderserum
gegeben und mit dem antiCytokin Antikörper Chip inkubiert. Zur Detektion wurde ein
Cocktail aus 16 biotinylierten
Antikörpern, passend zu den 16
Fänger-Antikörpern des Microarrays, eingesetzt. Als Signalgeber wurde Streptavidin-Cy5 verwendet. Ein typisches Ergebnis
ist in Abbildung 2 dargestellt, bei
dem die Signale vom IL8 und
TNFα deutlich zu erkennen
sind. Eine geringfügige Kreuzreaktivität des biotinylierten An-
Herstellung des anti-Cytokin
Antikörper Chips
Kommerziell erhältliche AntiCytokin Antikörper-Paare und
entsprechende rekombinante
Antigene wurden von R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN,
USA, bezogen. FAST Slides und
FAST PAK Protein Array Puffer
wurden von Schleicher &
Schuell BioScience entwickelt.
Die Antikörper wurden auf
FAST Slides mit einem Cartesian ProSys 5510 oder einem
Packard BioChip Arrayer mit
piezoelektrischer Probenabgabe
aufgetragen. Anschließend wurden die Slides bei Raumtemperatur getrocknet. Die Belegung
des anti-Cytokin Antikörper
Chips ist in Abbildung 1 dargestellt.
tikörper-Cocktails zu antiIL12p70 und anti-IP10 Antikörpern ist zu erkennen. Die Spotzu-Spot Variation liegt bei den
FAST Slides typischerweise im
Bereich von lediglich 1 % bis
max. 5 %.
Abb. 1: Belegung des anti-Cytokin
Antikörper Chips.
Jeder Antikörper wurde dreifach in
3 verschiedenen Konzentrationen
aufgetragen: 0,25, 0,5 und 1 mg/ml.
Von links nach rechts; oben nach
unten: Angiogenin, ICAM, IFNgamma, IL1β , IL2, IL4, IL6, IL8, IL10,
IL12p40, IL12p70, IP10, TGFβ , TNFα ,
TNFr2 und vEGF. Jeder Array enthält
als Positivkontrolle einen
Antikörper, der mit dem
biotinylierten Antikörper-Cocktail
reagiert.
Microarray Prozessierung: Die
Slides wurden in TBS-Tween 20
(0,1% oder 2%) blockiert. Die
Antigene wurden in TBSTween 20 (0,1%) bzw. in RPMI
1640 Medium mit 10% fötalem
Rinderserum verdünnt. Biotinylierte Antikörper wurden einzeln
oder als Cocktail für 1 h in einer
Konzentration von 100ng/ml
oder 200ng/ml verwendet. Streptavidin-Cy5 in TBS-Tween
20 (0,1%) wurde in einer Konzentration von 1µg/ml oder
125ng/ml für 1 h eingesetzt. Alle Inkubationsschritte erfolgten
bei Raumtemperatur, wobei zwischen jedem Schritt mit TBSTween 20 (0,1%) gewaschen
wurde. Für Fluoreszenz-Assays
ist es wichtig, auf Blockierung
mit Protein-Reagenzien zu verzichten. Anschließend wurden
die Slides in einem konfokalen
Laser Imager und einer geeigneten Software analysiert.
Ein wesentlicher Faktor für den
routinemäßigen Einsatz von Protein Microarrays im Labor ist die
Quantifizierbarkeit der Ergebnisse. Zum Vergleich des antiCytokin Antikörper Chips mit
etablierten Methoden zur Quantifizierung, wurden die gleichen
Antikörper-Paare im ELISA wie
auch für den Microarray-ELISA
verwendet. Bei 13 der 16 untersuchten Cytokine waren dabei
die Nachweisempfindlichkeit
und der lineare Detektionsbereich im Microarray-ELISA
deutlich besser im Vergleich
zum üblichen ELISA-Verfahren.
Ein typisches Beispiel dafür ist
in Abbildung 3 der Vergleich für
IL1β, für den die Nachweisgrenze im Microarray-ELISA
Abb. 2: Simultaner Cytokin-Nachweis im Microarray-ELISA.
Der Antikörper Array mit 16 verschiedenen Antikörpern (siehe Abb. 1) wurde
mit IL8 und TNFα in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Rinderserum,
inkubiert. Anschließend wurde mit einem Cocktail von 16 passenden
biotinylierten Antikörpern inkubiert. Der Nachweis erfolgte mit
Streptavidin-Cy5 und konfokalem Laser Imager. Von links nach rechts; oben
nach unten: Angiogenin, ICAM, IFN-gamma, IL1β , IL2, IL4, IL6, IL8, IL10,
IL12p40, IL12p70, IP10, TGFβ, TNFα, TNFr2 und vEGF.
BIOspektrum · 4/02 · 8. Jahrgang
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Abb. 4: Vergleich der Proteinstabilität im Microarray.
Ein monoklonaler Antikörper gegen Creatinkinase (0,1 mg/ml) verdünnt in
PBS oder in FAST PAK Puffer, wurde auf FAST Slides aufgetragen. Cy5markierte Creatinkinase wurde zu den angegebenen Zeitpunkten mit den
Microarrays inkubiert und mit einem konfokalen Laser Imager detektiert.
A.) Absolute Signalintensitäten nach verschiedenen Lagerzeiten.
B.) Relatives Signalverhältnis von PBS und FAST PAK Puffer.
Abb. 3: Vergleich der IL1β-Detektion im Microarray-ELISA und ELISA (A.).
Spezifische Microarray Signale wurden durch Subtraktion des lokalen
Hintergrundes ermittelt. Diese Werte wurden gegen die IL1β− sowie die
Antikörper-Konzentrationen aufgetragen (B.). Für den ELISA wurde die
Absorption bei 450 nm bestimmt. Nach Abzug der Absorption der Kontrollen
wurden die Werte gegen die IL1β-Konzentration aufgetragen (C.). Die Daten
der Graphen A. und B. wurden in logarithmischer Skala aufgetragen. Die
Empfindlichkeit im Microarray-ELISA ist ca.10fach erhöht gegenüber dem
ELISA.
bei nur 1 pg/ml, im üblichen
ELISA bei 10 pg/ml liegt.
Lagerfähigkeit von FAST Slide
Antikörper Chips
Von entscheidender Bedeutung
für die Anwendung von Protein
Microarrays ist die Lagerfähigkeit der Arrays. Antigene und
Antikörper behalten auf NitroBIOspektrum · 4/02 · 8. Jahrgang
zellulose über sehr lange
Zeiträume ihre Bindungsfähigkeit[4]. Wir haben einen speziellen Probenauftragspuffer entwickelt, der die Langzeitstabilität und somit Lagerfähigkeit
der FAST Slide Antikörper
Chips (Microarrays) noch weiter
verbessert. In Abbildung 4 ist der
Einfluss des FAST PAK Puffers
im Vergleich zu PBS (Phosphat-
puffer) dargestellt. Bei Verwendung von PBS als Auftragspuffer
sind nach fast 500 Tagen gute
Signale sowie Probendetektionen möglich. Der FAST PAK
Puffer führt darüber hinaus zu
einer deutlichen Erhöhung der
Signalintensität und Zunahme
der Langzeitstabilität.
Fazit
Die 3-dimensionale Nitrozellulose Matrix der FAST Slides ist
die ideale Plattform zur Herstellung von Protein Microarrays.
Diese Oberfläche vereint eine
sehr hohe Nachweisempfindlichkeit sowie quantifizierbare
Ergebnisse über einen weiten
linearen Bereich. Weiterhin
zeichnet sie die Kompatibilität
mit den verschiedensten Nachweismethoden, inklusive der
Fluoreszenzdetektion, und eine
lange Lagerfähigkeit der Protein
Microarrays aus.
Literatur:
[1] Madoz-Gurpide, ... , S.M.
Hanash. Protein based microarrays: A
tool for probing the proteome of cancer
cells and tissues. Proteomics 2001, 1,
1279–1287
[2] C.P. Paweletz, ... , L.A. Liotta. Reverse phase protein microarrays which
capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. Oncogene (2001) 20,
1981 – 1989
[3] D. Wang, ..., A. Wang. Carbohydrate microarrays for the recognition of
cross-reactive molecular markers of microbes and host cells. Nature Biotechnology 20, 275 – 281, 2002
[4] John L. Tonkinson and Brett A.
Stillman. Nitrocellulose: A tried and true
polymer finds utility as a post-genomic
substrate. Frontiers in Bioscience 7, 1–12,
January 2002
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Dr. Jens Beator
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