FEMTELLE® uPA/PAI-1 - Sekisui Diagnostics

M
Sekisui Diagnostics, LLC
500 West Avenue, Stamford, CT 06902
Tel. (203) 602-7777 Fax (203) 602-2221
VERWENDUNGSZWECK
FEMTELLE® ist ein in vitro Test zur quantitativen Bestimmung von humanem Plasminogen Aktivator vom
Urokinasetyp (uPA) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Typ-1 (PAI-1) in Tumorgewebe-Extrakten. Die
Testergebnisse sind für folgende Indikationen nützlich:
1) Prognose: Abschätzung derjenigen Brustkrebspatienten die nach operativer Entfernung des Tumors, ein
geringes bzw. ein hohes Risiko für einen Rückfall der Krankheit tragen.7,8,13,15,16,20,23 Wenn sowohl die uPA als auch
die PAI-1 Konzentration niedrig ist, d.h. die Werte unter den etablierten cut-off Werten (3 ng uPA/mg
Gesamtprotein und 14 ng PAI-1/mg Gesamtprotein) liegen, gehört der Patient zur Gruppe mit niedrigem
Rezidivrisiko. Liegen die Konzentrationen für uPA und/oder PAI-1 über den entsprechenden cut-off Werten, gehört
der Patient zur Gruppe mit hohem Rezidivrisiko.
FEMTELLE® uPA/PAI-1
uPA und PAI-1 Werte sollten durch klinische oder andere diagnostische Verfahren für das Management von
Brustkrebserkrankungen ergänzt werden.20,23
REF 899
ERKLÄRUNG DES TESTVERFAHRENS
(Beschichtete Mikrotiterstreifen und Reagenzien für 2 x 96 Messungen)
IVD C X42
EC REP
2) Prädiktion: Es wurde beschrieben, dass die uPA/PAI-1 Konzentrationen dazu benutzt werden können, um das
Therapieansprechen des Patienten auf eine adjuvante Chemotherapie vorherzusagen.8,13,20 Klinische
Untersuchungen deuten darauf hin, dass Brustkrebspatienten mit niedrigen uPA und PAI-1 Werten wahrscheinlich
nicht von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren werden, während Patienten mit hohen uPA und PAI-1
Werten wahrscheinlich von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren werden.8,10,13,20 Die relevanten cut-off
Werte sind die gleichen wie für die Prognose.
l
8°C
2°
american diagnostica GmbH
Kaplaneigasse 35, Pfungstadt, D-64319, Germany
Das Plasminogen Aktivator (PA) System besteht aus einem Plasminogen Aktivator vom Urokinasetyp (uPA) einer Serinprotease, einem Plasminogen Aktivator Inhibitor Typ-1 (PAI-1) – ein Serinprotease Inhibitor (Serpin) der
spezifisch uPA und tPA (Tissue-Type Plasminogen Aktivator) inhibiert, und den auf der Zelloberfläche lokalisierten
Urokinase Plasminogen Aktivator Rezeptor (uPAR). Dieses System wurde ausgiebig von verschiedenen
Arbeitsgruppen untersucht.1-24 Es gibt bestätigende Befunde, dass uPA and PAI-1 wichtige biologische
Tumormarker sind und eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, Invasion und Metastasierung
spielen.1,3,20,23
Tumorzellen synthetisieren und sezernieren uPA in einer enzymatisch inaktiven Einzelketten Form (sc-uPA). ScuPA bindet an den uPAR auf der Zelloberfläche, wo es durch verschiedene Serinproteasen (Plasmin, Plasma
Kallikrein, Trypsin), Metalloproteasen oder Cysteinproteasen (Cathepsin B and L) in enzymatisch aktives uPA
umgewandelt wird.1,20,21 An den Rezeptor gebundenes uPA wandelt Zymogen Plasminogen in aktives Plasmin um,
welches direkt und/oder indirekt durch Aktivierung verschiedener Metalloproteasen, die zelluläre Invasion und
Metastasierung der Tumorzellen fördert.1,3 PAI-1 interagiert mit dem uPA-uPAR Komplex unter Bildung eines
ternären Komplexes, der in die Zelle internalisiert wird und damit die Signaltransduktion und die Zellproliferation
auslöst. PAI-1 spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Metastasierung, da es die adhäsiven Eigenschaften von
Vitronektin behindert und damit die Tumormigration erleichtert.14
uPA und PAI-1 sind klinisch validierte unabhängige Prognosefaktoren, die entsprechend des „Tumor Marker Utility
System“11,13,20 das höchste Evidenzniveau (Level of Evidence I, d.h. LOE I) bei Brustkrebs erreicht haben.
Prospektiv randomisierte multizentrische Studien und retrospektive Metaanalysen haben gezeigt, dass die
Bestimmung von uPA und PAI-1 in Tumorgewebe Extrakten eine Abschätzung des Rezidivrisikos
erlaubt.5,7,8,9,13,15,16,19,20,23 Außerdem ermöglichen diese Biomarker eine Vorhersage über das Ansprechen auf eine
adjuvante Chemotherapie 8,13,20 und auf eine endokrine Therapie 17 zu machen (Prädiktion). Patienten mit erhöhten
uPA oder PAI-1 Werten im Mammakarzinomgewebe haben ein signifikant verkürztes krankheitsfreies Überleben
(=Disease Free Survival, DFS) und eine reduziertes Gesamtüberleben (=Overall Survival, OS) gegenüber
Patienten mit geringen Werten.8,15,16
Erhöhte uPA und PAI-1 Werte wurden ebenso bei verschiedenen anderen Krebsarten z.B. Eierstockkrebs und
Magenkrebs gefunden.1,18,21 Für Patienten mit erhöhten uPA und/oder PAI-1 Werten besteht eine erhöhte
Wahrscheinlichkeit von einer adjuvanten systemischen Therapie zu profitieren, während Patienten mit niedrigen
Werten die Belastung einer Chemotherapie und den damit verbundenen toxischen Nebeneffekten erspart werden
kann.8 Der HER2 Status und die uPA/PAI-1 Bestimmung stellen unabhängige und ergänzende Informationen bei
Brustkrebs zur Verfügung.24 Deshalb kann die Kenntnis des uPA/PAI-1 Status in Tumorgewebe Extrakten von
Brustkrebspatienten zusammen mit anderen diagnostischen und klinischen Daten (z.B. HER2 Status)dem Arzt
helfen das individuelle Rezidivrisiko abzuschätzen und unterstützt damit individualisierte adjuvante
Therapieentscheidungen.8,9,23,24
1
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TESTPRINZIP
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
FEMTELLE erkennt verschiedene Formen von uPA: sc-uPA, hoch molekulares (HMW) uPA, uPA komplexiert
mit PAI-1 oder mit Plasminogenaktivator Inhibitor Typ-2 (PAI-2), sowie latente und aktive Formen von PAI-1.
Der FEMTELLE Test basiert auf einem hoch spezifischen monoklonalen Maus Fängerantikörper der entweder
gegen humanes uPA oder humanes PAI-1 gerichtet ist. Tumorgewebeextrakte mit bekannter
Gesamtproteinkonzentration werden über Nacht in den Vertiefungen der Mikrotiterstreifen inkubiert, die mit uPA
oder PAI-1 Fängerantikörper beschichtet sind. Nach dem Waschen wird der biotinylierte Detektionsantikörper,
der entweder gegen humanes uPA oder humanes PAI-1 gerichtet ist, zugesetzt. Nach kurzer Inkubationszeit,
wird der biotinylierte Zweitantikörper durch ein Streptavidin – Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat
nachgewiesen.
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Das Substrat 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Perborat (TMB) wird durch die HRP umgesetzt, was zu einer
Blaufärbung führt. Durch Zugabe von Schwefelsäure wird die Reaktion gestoppt und die Färbung schlägt von
blau nach gelb um. Die uPA und PAI-1 Werte werden durch Messung der optischen Dichte bei 450 nm anhand
der mitgeführten Standardkurve ermittelt. Die Bestimmung der Gesamtprotein-konzentration des
Gewebextrakts erfolgt durch einen chromogenen Protein Assay. Die gemessenen Werte werden entweder als
ng uPA/mg Gesamtprotein oder als ng PAI-1/mg Gesamtprotein im Tumorgewebeextrakt angegeben.
KITKOMPONENTEN
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R1: anti-human uPA IgG beschichtete Mikrotiterplatten (farblos): 6 Streifen mit je 16 Vertiefungen, mit
Halter und Abdeckung
R2: anti-human PAI-1 IgG beschichtete Mikrotiterplatten (rot markiert): 6 Streifen mit je 16 Vertiefungen,
mit Halter und Abdeckung
6 Fläschchen uPA Standard: R3: 0, R4: 0.1, R5: 0.25, R6: 0.5, R7: 0.75, R8: 1.0 ng/mL (lyophilisiert)
6 Fläschchen PAI-1 Standard: R9: 0, R10: 1.0, R11: 2.5, R12: 5.0, R13: 7.5, R14: 10.0 ng/mL
(lyophilisiert)
R15: 2 Fläschchen uPA Detektionsantikörper, biotinyliertes anti-human uPA (lyophilisiert)
R16: 2 Fläschchen PAI-1 Detektionsantikörper, biotinyliertes anti-human PAI-1 (lyophilisiert)
R17: 1 Fläschchen uPA Enzym Konjugat, Streptavidin – HRP (60 µL)
R18: 1 Fläschchen PAI-1 Enzym Konjugat, Streptavidin – HRP (60 µL)
R19: 2 Fläschchen Enzymkonjugat Verdünner (lyophilisiert)
R20: 4 Packungen PBS Puffer (PBS), pH 7.4
R21: 2 Fläschchen Detergenz, 25% Triton X-100 (12 mL)
R22: 2 Packungen Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), pH 8.5 (lyophilisiert)
R23: 2 Fläschchen Peroxidase Substrat, TMB (11 mL) (REIZEND)
NOTWENDIGE MATERIALIEN, DIE NICHT MITGELIEFERT WERDEN
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0.22 µm gefiltertes deionisiertes H2O (1 Liter)
Achtkanal Multipipette für den Volumenbereich 50-200 µL
Einkanalpipette für den Volumenbereich 10-200 µL
Photometer für Mikrotiterplatten, Meßwellenlänge 450 nm
Kryogefäße - 1mL (Nunc, Wiesbaden, Germany)
Flüssiger Stickstoff
Tank für flüssigen Stickstoff oder -80°C Gefrierschrank mit Aufbewahrungssystem
Ultrazentrifuge mit Rotor für max. Geschwindigkeit von 100 000xg
Ultrazentrifugenröhrchen
Test Röhrchen – 2 mL
Mikro-Dismembrator (zur Pulverisierung von gefrorenem Material, z.B. B. Braun Biotech International,
Germany – Model S or U)
Schüttler für Mikrotiterplatten
Schüttler für Reaktionsgefäße
0.5 M H2SO4
Rinderserum Albumin (BSA, Sigma A-7030)
BCA Protein Bestimmungstest (Pierce Chemical Co. - #23225; Pierce, Rockford, IL, wird empfohlen)
Kontrollproben (Tumorgewebeextrakte aus Nacktmäusen die Transplantate der humanen
Brusttumorzellinie-MDA-MB231 tragen, z.B. American Diagnostica GmbH REF 899C)
2
Keine Komponenten des Testkits nach dem Verfallsdatum verwenden.
Keine Reagenzien aus verschiedenen Kits oder Chargen zusammen verwenden.
Mikrobielle Kontamination der Kit Komponenten vermeiden.
Nicht mit dem Mund pipettieren oder Reagenzien aufnehmen.
Laborschutzkleidung und Einweghandschuhe tragen.
Spritzen oder Augenkontakt vermeiden.
Bei der Arbeit nicht rauchen, essen oder trinken.
R36/R37/R38/S26/S36/S37/S39S45 25
REIZEND
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
A. uPA und PAI-1 Standards
1. Je 1 mL gefiltertes deionisiertes H2O in die 0.10, 0.25, 0.50, 0.75 und 1.0 ng/mL uPA Standard
Fläschchen geben. Je 2 ml gefiltertes deionisiertes H2O in das 0.0 ng/mL uPA Standard Fläschchen
geben.
2. Je 1 mL gefiltertes deionisiertes H2O in die 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 und 10 ng/mL PAI-1 Standard
Fläschchen geben. Je 2 mL gefiltertes deionisiertes H2O in das 0.0 ng/mL PAI-1 Standard Fläschchen
geben.
3. Vorsichtig 3 Minuten mischen. Nicht vortexen!
B. Detektionsantikörper
1. Je 5.5 mL gefiltertes deionisiertes H2O in die uPA und PAI-1 Detektionsantikörper Fläschchen geben.
2. Vorsichtig 3 Minuten mischen.
C. Enzymkonjugat Verdünner
20 mL gefiltertes deionisiertes H2O zugeben und gut durchmischen.
D. Waschpuffer
1. Den Inhalt einer Packung PBS in 900 ml gefiltertem deionisiertem H2O lösen.
2. 4 mL des 25% Triton X-100 Detergenz zugeben.
3. Mit gefiltertem deionisiertem H2O ad 1 Liter auffüllen.
4. Gut mischen.
E. Proben Puffer
BSA zum Waschpuffer in einer Endkonzentration von (1% w/v) zugeben. Ausreichende Menge des
Probenpuffers herstellen (ca. 2 ml Probenpuffer/Probe).
F. 10% Triton X-100
4 mL 25% Triton X-100 zu 6 mL gefiltertem deionisiertem H2O zugeben.
G. Tris-gepufferte Salzlösung, TBS, pH 8,5
1. Den Inhalt einer Packung TBS in 900 mL gefiltertem deionisiertem H2O lösen.
2. Mit gefiltertem deionisiertem H2O ad 1 Liter auffüllen.
3. Gut mischen.
LAGERUNG UND STABILITÄT DER REAGENZIEN
Die unbenutzen Teststreifen, sowie die flüssigen und lyophilisierten Reagenzien sollen bei +2° bis +8°C
gelagert werden. Sie sind bis zu dem auf dem Etikett befindlichen Verfallsdatum zu verwenden. Rekonstituierte
Reagenzien können gelagert werden bei:
2 Wochen
+2° bis +8°C
3
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PROBENVORBEREITUNG
A. Pulverisierung des Gewebes
1. Ca. 50-300 mg des tiefgefrorenen Gewebes entnehmen (z.B. aus flüssigem Stickstoff Tank).
2. Den gefrorenen Gewebeblock in ein vorgekühltes Dismembratorgefäß (in flüssigem Stickstoff gekühlt)
überführen.
3. Das Gewebe 30 sec im Mikro-Dismembrator pulverisieren.
4. Das gefrorene Pulver in ein 2 mL Reaktionsgefäß überführen.
B. Gewebeextraktion
5. 0.2 mL 10% Triton-X 100 in 1.8 mL TBS, pH 8.5 geben um eine 1% Triton-X Lösung zu erhalten.
6. Das Gewebepulver in 2 mL kaltem TBS, pH 8.5 mit 1% Triton X-100 resuspendieren.
7. Die Gewebesuspension vorsichtig für 14 - 16 h bei 4°C schütteln (z.B. Überkopfschüttler).
8. Die Suspension bei 100 000 x g für 1 h bei 4°C zentrifugieren, um Zelltrümmer abzutrennen.
9. Mögliche Lipidreste, die sich in dem Überstand befinden vorsichtig entfernen und den klaren
Überstand (Gewebe Extrakt) in vorbereitete Kryoröhrchen (auf Eis) überführen. Das Pellet bzw. die
Zelltrümmer verwerfen.
10. Den Überstand (Gewebeextrakt) in 100 µL Portionen aliquotieren und aus einem Aliquot die
Gesamtproteinkonzentration des Gewebeextrakts bestimmen (siehe auch PROTEINBESTIMMUNG).
Den Gewebeextrakt in flüssigem Stickstoff oder bei -800C bis zum weiteren Gebrauch lagern.
Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist unbedingt zu vermeiden, da es die Messergebnisse
verfälschen kann.
11. Für die Anwendung im ELISA den Gewebeextrakt 1:20 in Probenpuffer verdünnen.
10. Je 100 µL des verdünnten Enzymkonjugats in die entsprechenden Vertiefungen geben (Beachte: uPA
Enzym Konjugat nur in die mit uPA Antikörper beschichteten Vertiefungen geben. PAI-1 Enzym Konjugat
nur in die mit PAI-1 Antikörper beschichteten Vertiefungen geben.)
11. Abdecken und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (20° – 25°C).
12. Inhalt verwerfen und Teststreifen 4 x mit Waschpuffer waschen.
13. Je 100 µL TMB Substratlösung in die Vertiefungen geben, abdecken und 20 min bei Raumtemperatur
(20°-25°C) inkubieren. Eine blaue Farbentwicklung ist zu beobachten.
14. Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von je 50 µL 0.5 M H2SO4. Kurz mischen (durch Antippen der
Platte) um eine gleichmäßige Verteilung zu bewirken. Die Lösung färbt sich gelb.
15. Die Messung soll innerhalb von 10 min bei einer Meßwellenlänge von 450 nm erfolgen. Der Mittelwert der
Extinktion des Nullwerts (Standard 0 ng/ml) ist von den Standards und den Proben abzuziehen.
GRENZEN DES VERFAHRENS
Da PAI-1 an Wundheilungsprozessen beteiligt ist, kann eine prä-operative Gewebeentnahme (Biopsie) vor
Bestimmung der uPA/PAI-1 Werte bei einem primären Tumor eventuell zu (zumindest zeitweise) erhöhten PAI1 Werten in vivo führen. Dies sollte mit Vorsicht beobachtet werden.
QUALITÄTSKONTROLLE
Aus Qualitätssicherungsgründen sollten Patientenproben immer zusammen mit den Kontrollproben für uPA und
PAI-1 getestet werden. Externe Qualitätskontrollen zu diesem ELISA wurden ebenfalls durchgeführt (REF
899).2,22
PROTEINBESTIMMUNG
REPRÄSENTATIVE STANDARDKURVEN
Die Gesamtproteinkonzentration der Gewebeextrakte sollte mit dem BCA Proteintest von Pierce bestimmt
werden, da dieser Proteintest nicht durch Detergenzien gestört wird und durch Triton X-100 Konzentrationen
bis zu 1% nicht beeinflusst wird. Falls nötig, sollte die Gesamtproteinkonzentration des Gewebeextrakts durch
Zugabe von TBS, pH 8.5 mit 1% Triton X-100 auf 2-3 mg Gesamtprotein/ml eingestellt werden.
Die Standardkurve zur Bestimmung der uPA Konzentrationen wird erstellt, indem man die Mittelwerte der
gemessenen Extinktionswerte jedes einzelnen uPA Standards gegen die entsprechende uPA Konzentration
aufträgt. Die Standardkurve zur Bestimmung der PAI-1 Konzentrationen wird erstellt, indem man die Mittelwerte
der gemessenen Extinktionswerte jedes einzelnen PAI-1 Standards gegen die entsprechende PAI-1
Konzentration aufträgt. Bei jeder Testdurchführung (REF 899) ist eine Standardkurve zu erstellen. Die
untenstehende quadratische Kurvenanpassung (quadratic fit) wird empfohlen, um die uPA und PAI-1
Konzentrationen der verdünnten Proben aus den entsprechenden Mittelwerten der Absorptionswerte zu
interpolieren.
Beachte: Da Triton X-100 andere Proteinbestimmungs-Tests stört wird nur der BCA Protein Assay von Pierce
zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben empfohlen.
uPA/PAI-1 ELISA TESTDURCHFÜHRUNG
ERSTER TAG
2.
3.
4.
Benötigte Anzahl der beschichteten uPA Mikrotiterstreifen aus der Verpackung nehmen und in den Halter
einlegen. Die restlichen Teststreifen gut verschlossen in der Folien Verpackung bei +2° bis +8°C lagern.
Benötigte Anzahl der beschichteten PAI-1 Mikrotiterstreifen aus der Verpackung nehmen und in den
Halter einlegen. Die restlichen Teststreifen gut verschlossen in der Folien Verpackung bei +2° bis +8°C
lagern.
Je 100 µL der rekonstituierten uPA Standards, Kontrollen und verdünnten Gewebeextrakt Proben in die
mit uPA Antikörper beschichteten Vertiefungen zur Bestimmung von uPA geben. Je 100 µL der
rekonstituierten PAI-1 Standards, Kontrollen and verdünnten Gewebeextrakt Proben in die mit PAI-1
Antikörper beschichteten Vertiefungen zur Bestimmung von PAI-1 geben. (Immer Doppelbestimmungen
durchführen; Empfohlene Verteilung der Proben siehe nächste Seite).
Abdecken und über Nacht bei +4°C in feuchter Kammer inkubieren.
ZWEITER TAG
5.
6.
7.
8.
9.
Inhalt verwerfen und Teststreifen je 4 x mit Waschpuffer waschen.
Je 100 µL uPA Detektionsantikörper in die uPA beschichteten Vertiefungen geben. Je 100 uL PAI-1
Detektionsantikörper in die PAI-1 beschichteten Vertiefungen geben.
Abdecken und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (20° – 25°C).
Inhalt verwerfen und Teststreifen 4 x mit Waschpuffer waschen.
Für die Messung einer kompletten Platte mit 96 Vertiefungen 12 µL des Enzymkonjugats in 12 mL
Enzymkonjugat Verdünner geben (falls nicht die komplette Platte genutzt wird, 2 µL Enzymkonjugat in 2
mL Verdünnerlösung pro Teststreifen (16 Vertiefungen) geben).
4
Standard Kurve für die uPA Bestimmung
2.5
Extinktion bei 450 nm
1.
Standardeichkurven uPA und PAI-1 ELISA (nur zu Demonstrationszwecken):
2
1.5
1
0.5
0
0
0.25
0.5
0.75
1
uPA Konzentration, ng/mL
5
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Gesamtprotein, und/oder PAI-1 Gewebekonzentrationen über 14 ng/mg Gesamtprotein weisen auf eine hohe
Wahrscheinlichkeit des Ansprechens auf eine adjuvante Chemotherapie hin.
Standard Kurve für die PAI-1 Bestimmung
Extinktion bei 450 nm
2.5
Es wird empfohlen die uPA und PAI-1 Werte zusammen mit weiteren klinischen und pathologischen
Patientendaten zu benutzen, um möglichst genaue Daten für die individuelle Risikoabschätzung und
Festlegung einer adäquaten Therapie zu erhalten.23
2
LEISTUNGSMERKMALE
1.5
Präzision
1
Der Test (REF 899) wurden in einem Qualitätskontroll-Labor mit Gewebeextrakten aus Nacktmäusen, die mit
der humanen Brustkrebs Zellinie MDA-MB231 transplantiert waren, getestet. Hierzu wurden die Proben in 20
Testläufen jeweils doppelt bestimmt (n=40).
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
PAI-1 Konzentration, ng/mL
Für uPA wurden folgende Werte ermittelt: Mittelwert (ng/ml) = 0.34 ng/ml, der entsprechende
Variationskoeffizient (CV) der Intra-Assay Variation = 5.4% und der CV der Inter-Assay Variation = 2.3%.
Für PAI-1 wurden folgende Werte ermittelt: Mittelwert (ng/ml) = 5.1 ng/ml, CV der Intra-Assay Variation = 6.7%
und CV der Inter-Assay Variation = 4.7%.
Sensitivität
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
1. Unter Verwendung des jeweiligen Extinktionsmittelwerts der verdünnten Probe, wird die entsprechende
uPA und PAI-1 Konzentration in ng/ml anhand der Standardkurve abgelesen.
2. Um die uPA und PAI-1 Konzentrationen des Gewebeextrakts zu erhalten, ist der Probenwert mit 20 zu
multiplizieren (Beachte: Der Gewebeextrakt wurde 20 fach verdünnt im Test eingesetzt).
3. Um die uPA und PAI-1 Konzentrationen in ng/mg Gesamtprotein zu erhalten, sind die uPA und PAI-1
Werte (ng/ml) durch die Gesamtproteinkonzentration (mg/mL) des Gewebeextrakts (siehe oben) zu teilen,
ERWARTETE WERTE
Für uPA ist der cut-off Wert in Extrakten aus Brustkrebsgewebe zur Abschätzung eines geringen bzw. eines
hohen Rezidivrisikos und des Ansprechens auf eine Chemotherapie 3 nglmg Gesamtprotein. Für PAI-1 ist der
cut-off Wert in Extrakten aus Brustkrebsgewebe 14 ng/mg Gesamtprotein zur Abschätzung eines geringen bzw.
eines hohen Rezidivrisikos und des Ansprechens auf eine Chemotherapie.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE (siehe Schaubild unten)
PROGNOSE
Eine Abschätzung des prospektiven Krankheitsverlaufs, d.h. das Risiko eines Rezidivs kann bei nodalnegativen
Brustkrebspatienten aus den Ergebnissen der uPA und PAI-1 Bestimmung ermittelt
werden.7,8,13,15,16,19,23
Die untere Nachweisgrenze des uPA Tests beträgt 25 pg uPA/ml Probe.26 Die untere Nachweisgrenze des PAI1 Tests beträgt 125 pg PAI-1/ml Probe.26
Spezifität
Der uPA ELISA (REF 899) erkennt sowohl hochmolekulares uPA als auch uPA komplexiert mit PAI-1 oder PAI2. Der Test wurde auf Interferenzen untersucht. Die Testergebnisse werden nicht beeinflusst durch tPA, PAI-1,
tPA Komplexen und PAI-2.26
Der PAI-1 ELISA (REF 899) erkennt sowohl latente als auch aktive Formen von PAI-1 und PAI-1 Komplexen.
Der Test wurde auf Interferenzen getestet, die Testergebnisse werden nicht beeinflusst durch PAI-2, PAI-2
Komplexe, tPA, and HMW-uPA Formen.26
RÜCKFÜHRBARKEIT DES STANDARD MATERIALS
Informationen zur Rückführbarkeit des „Standard Materials“ in diesem Kit sind bei Sekisui Diagnostics auf
Anfrage erhältlich.26
GRENZEN DES VERFAHRENS
FEMTELLE® (REF 899) ist nicht für die Bestimmung in Serum oder Plasma geeignet und kann nicht an Proben
aus formalin-fixiertem Gewebe angewendet werden.
Für Gewebeextrakte die mit einem detergenzhaltigem Puffer hergestellt wurden, weisen uPA Konzentrationen
unter 3 ng/mg Gesamtprotein und PAI-1 Konzentrationen unter 14 ng/mg Gesamtprotein auf ein geringes
Rezidivrisiko und ein verlängertes krankheitsfreies Überleben und ein verlängertes Gesamtüberleben hin. uPA
Konzentrationen über 3 ng/mg Gesamtprotein und/oder PAI-1 Konzentrationen über 14 ng/mg Gesamtprotein
weisen auf ein hohes Rezidivrisko hin.
BEACHTE: Durch Gewebeverletzungen und Heilungsprozesse, die durch Biopsien hervorgerufen wurden kann
PAI-1 zumindest in denjenigen Tumorarealen, die direkt an eine Biopsiestelle grenzen, artifiziell erhöht sein.
Aus diesem Grund sollten erhöhte PAI-1 Werte (z.B. über 14 ng/mg) in den entnommenen Proben mit Vorsicht
betrachtet werden, wenn die Möglichkeit besteht das die Werte durch eine prä-operative Biopsie beeinflusst
wurden.
PRÄDIKTION
Vorhersagen über das voraussichtliche Ansprechen auf eine adjuvante Chemotherapie kann bei
Brustkrebspatienten aus den Ergebnissen der uPA und PAI-1 Bestimmung der entsprechenden
Tumorgewebeextrakte ermittelt werden.8,13 uPA Gewebekonzentrationen unter 3 ng/mg Gesamtprotein und
PAI-1 Gewebekonzentrationen unter 14 ng/mg Gesamtprotein, weisen auf eine geringe Wahrscheinlichkeit des
Ansprechens auf eine adjuvante Chemotherapie hin. uPA Gewebekonzentrationen über 3 ng/mg
6
7
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LITERATURSTELLEN
1. Andreasen, P. A., et al. International Journal of Cancer 1997; 72: 1-22. Review.
2. Benraad, T. J., et al. European Journal Cancer 1996; 32A(8): 1371-1381.
3. Duffy, M., et al. Clinical Chemistry 2002; 48:8: 1194-1197.
4. Foekens, J. A., et al. Journal of Clinical Oncology 1994; 12: 1648-1658.
5. Foekens, J. A., et al. Cancer Research 2000; 60: 636-643.
6. Harbeck, N., et al. Breast Cancer Research and Treatment 1999; 54: 147-157.
7. Harbeck, N., et al. Journal of Clinical Oncology 2002; 20 (4): 1000-1007.
8. Harbeck, N., et al. Cancer Research 2002; 62: 4617-4622.
9. Harbeck, N., et al. Clinical Breast Cancer 2002; 3(3): 196-200. Review.
10. Harbeck, N. et al. Thrombosis and Haemostasis 2004; 91(3): 450-456. Review.
11. Hayes, D. F., et al. Journal of Cancer Institute 1996; 88: 1456-1466.
12. Janicke, F., et al. Cancer Research 1994; 54: 2527-2530.
13. Janicke, F., et al. Journal of National Cancer Institute 2001; 93 (12): 913-920.
14. Kanse, S. M., et al. Experimental Cell Research 1996; 224: 344-353.
15. Look, M., et al. Journal of National Cancer Institute 2002; 94 (2): 116-128.
16. Look, M., et al. Thrombosis and Haemostasis 2003; 90: 538-548.
17. Meijer Van Gelder, M., et al. Cancer Research 2004; 64 (13): 4563-4568.
18. Nekarda, H., et al. Cancer Research 1994; 54: 2900-2907.
19. Prechtl, A., et al. International Journal of Biological Markers 2000; 15(1): 73-78.
20. Schmit, M., et al. Expert Rev Mol Diagn 2011, 11: 617-634.
21. Schmitt, M., et al. Thrombosis and Haemostasis, 1997; 78: 285-296.
22. Sweep, C. G. J., et al. British Journal of Cancer 1998; 78:1434-1441.
23. Thomssen, C., et al. Onkologie 2003; 26: 438-445. Review Article.
24. Zemzoum, I., et al. Journal of Clinical Oncology 2003; 21(6): 1022-1028.
25. EG Richtlinie 1999/45/EC (Europäsche Richtlinie zur Klassifizierung, Abpackung und Etikettierung
von gefährlichen Zubereitungen:
R36/R37/R38 = Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut.
S45 = Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich Etikett vorzeigen).
S26 = Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich abspülen und den Arzt konsultieren.
S36/S37/S39 = Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und
Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
26. Daten liegen bei Sekisui Diagnostics, LLC, Stamford, Connecticut 06902.
Empfohlenen Verteilung der Proben bei
Verwendung eines Teststreifens mit 16 Vertiefungen
1
2
A
S1
S1
B
S2
S2
C
S3
S3
D
S4
S4
E
S5
S5
F
S6
S6
G
T1
T1
H
T2
T2
Algorithmus© zur
Interpretation der Ergebnisse aus dem
FEMTELLE® Test (REF 899)
Operative Entfernung des Mammkarzinom Gewebes
Herstellung des Mammkarzinomgewebe
Extrakts aus tiefgefrorenem Frischgewebe
Durchführung des Proteinbestimmungs Tests
Und des FEMTELLE® Tests
PROGNOSE
PRÄDIKTION*
uPA und PAI-1
unter dem
cut-off Wert
uPA und/oder
PAI-1 über dem
cut-off Wert
uPA und PAI-1
unter dem
cut-off Wert
uPA und/oder
PAI-1 über dem
cut-off Wert
Geringes
Rezidivrisiko
Hohes
Rezidivrisiko
Geringe
Wahrscheinlichkeit
Von Einer
Adjuvanten
Chemotherapie Zu
Profitieren
Hohe
Wahrscheinlichkeit
Von Einer
Adjuvanten
Chemotherapie Zu
Profitieren
*) Entsprechend Literatur Nr. 8,13,20
S = Standard
T = Testprobe oder Kontrolle
8
9
899G_G©SD20131013