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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
ANABELLE SILVA CORNACHIONE
Efeitos da aplicação de diferentes protocolos de reabilitação em
músculos esqueléticos de ratas submetidas previamente à
imobilização do membro posterior direito
Ribeirão Preto
2011
ANABELLE SILVA CORNACHIONE
imobilização do membro posterior direito
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências da Saúde Aplicadas ao
Aparelho Locomotor.
Área de Concentração: Reabilitação
Orientadora:
Profa. Dra. Ana Cláudia Mattiello-Sverzut
Ribeirão Preto
2011
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a
fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Cornachione, Anabelle Silva
imobilização do membro posterior direito, 2011.
154 p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Reabilitação.
Orientador: Mattiello-Sverzut, Ana Cláudia.
1. Ratas. 2. Imobilização. 3. Exercício excêntrico. 4.
Alongamento mantido. 5. Morfometria. 6. Morfologia. 7.
Músculo sóleo. 8. Músculo plantar.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome: Anabelle Silva Cornachione
Título da tese: Efeitos da aplicação de
diferentes protocolos de reabilitação em
músculos esqueléticos de ratas submetidas
previamente à imobilização do membro
posterior direito.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em Ciências
da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor.
Área de concentração: Reabilitação
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr._______________________________________________________
Instituição:_______________________Assinatura:_____________________
Prof. Dr._______________________________________________________
Prof. Dr._______________________________________________________
Prof. Dr._______________________________________________________
Prof. Dr._______________________________________________________
DEDICATÓRIA
“Enfrentei muitos desafios para chegar até aqui...uns fáceis outros mais difíceis. Esse
foi mais um deles...talvez o mais difícil e cansativo....” (Fevereiro de 2007).
Engraçado essas foram minhas palavras há 4 anos atrás quando defendi minha
dissertação de mestrado. Eu mal podia imaginar o tamanho do desafio que ainda iria
enfrentar...desafio? ou crescimento? Nossa, foi dessa vez que aprendi o significado das
palavras perseverança, paciência e esperança. Vontade de desistir? Sim , inúmeras
vezes...mas persisti, tive paciência e esperança, pois ao meu redor pessoas queridas
acreditavam em mim. Por isso dedico esse trabalho à todos os que torceram por minha
vitória, em especial meus queridos e amados pais, Reginaldo e Marlene e, meu amigo e
esposo Welber, pois esses acompanharam de perto todos os meus dias de angústias,
tristezas e alegrias.
Obrigada,
AGRADECIMENTOS
Claro, sem dúvida nehuma agradeço a Eles e a Ela...Deus, Jesus Cristo e Nossa
Senhora...obrigada por ouvirem minhas preces, obrigada por me manter em pé e não me
deixar desistir, obrigada por essa maravilhosa e dolorida experiência, pois foi com ela que
amadureci e conheci de verdade as pessoas que me cercavam!!!
Além de dedicar à eles também os agradeço, meus pais e meu esposo. Obrigada meus queridos.
Aos meus pais por sempre me ensinarem a ser humilde e correta. Obrigada pelos incentivos e
conselhos, nunca me deixando desistir. E por fim ao meu esposo, meu querido companheiro
que já esta ao meu lado a longos 12 anos. Também agradeço as palavras de conforto e
incentivo, obrigada por me ouvir chorar e rir durante muitas noites antes de dormir e por
sempre entender os meus sonhos de querer crescer profissionalmente, mesmo que isso custasse
a nossa “separação” temporária!!!
Agradeço minha Orientadora Profa. Dra. Ana Cláudia Mattiello-Sverzut. Muito obrigada
por acreditar em mim. Por não ter desistido frente as dificuldades. Obrigada pelos
ensinamentos durante todos esses anos.
Ao meu querido supervisor Dr. Dilson Rassier que me recebeu na McGill University,
Montreal – Canadá, como orientador e como amigo. Obrigada pelos novos ensinamentos.
Ao Prof. Dr. José Batista Volpon, Chefe do Programa de pós-graduação, o qual faço parte.
Obrigada pela sua honestidade, qualidade esta muito difícil de encontrar nas pessoas hoje em
dia. Obrigada por acreditar no meu potencial e me ajudar tanto quando mais precisei.
Agradeço à FAPESP, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo,
pelos auxílios financeiros nesta pesquisa (processos FAPESP: 07/52506-4, 07/51715-9 e
07/52961-3).
Agradeço,
As minhas queridas irmãs Adriana e Analu, que sempre me apoiaram e se orgulharam de
mim.
Aos meus queridos sobrinhos Ygor, Yuri e agora Octávio, pelos momentos de distração,
diversão e alegrias. Amo vocês!!!
Aos meus queridos avós Joana, Ignácio, Dermina e Adriano (em memória), que mesmo distante,
tenho certeza que sempre rezaram por mim.
A minha grande amiga e “mãe” Deise Lucia Chesca, por todo ensinamento prático, por todos
os conselhos, por todos os dias de oração, pelos choros e risadas. Você é especial!!!
As alunas de Iniciação Científica, Letícia Cação Benedini de Oliveira, Beatriz A. A. Accordi
e Maria Laura R. Pucciarelli que tanto me ajudaram na elaboração desta tese. Também
agradeço os momentos de distração e boas coversas. Ah...Lê muito obrigada pelos conselhos!!
Aos amigos do Laboratório de Neuropatologia, Renata, Patrícia, Priscila, Maikol, Tatiana,
Paula, Eduardo, Keite, Mariana e Ju Polizello por todos os momentos de trabalho e
descontração. Especialmente, agradeço a Renata que nos momentos difíceis sempre me dizia
palavras de conforto e a Patrícia que passava algumas noites me fazendo companhia.
A minha querida Professora e também amiga, Cyntia Rogean, por todos os ensinamentos,
desde a graduação, pelos bons conselhos e pelas orações.
Aos meus mais novos amigos do laboratório Muscle Physiology and Biophysics, McGill
University, Montreal, Fabio, Ivan, Tiby, Albert, Rowan, Sara e Clara, pelos novos
ensinamentos e pela companhia enquanto estive no Canadá.
Aos coordenadores do ponto de apoio da Fapesp, Sra. Marisa de Castro Pereira e Sr. Juliano
Oliveira Marquetti, por toda atenção, amizade, torcida e belas palavras de conforto.
Ao Prof. Dr. Luciano Neder do Departamento de Patologia, pelos ensinamentos e por ceder
seu laboratório para realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Edson Martinez do Departamento da Medicina Social, pelos ensinamentos e
todo apoio na parte estatística deste projeto.
Ao Prof. Paulo Quemelo pela amizade e colaboração nos momentos difíceis.
A técnica da Patologia do Hospital das Clínicas, Ana Anselmi, pelo carinho e por todo
ensinamento em imuno-histoquímica.
A técnica, do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Patologia,
Monica Azevedo de Abreu pelos ensinamentos em microscopia de alta resolução.
Aos funcionários do Laboratório de Bioengenharia de Ribeirão Preto, Teresinha, Francisco
(Chico), Henrique, Moro e Reginaldo, pelos auxílios prestados durante a realização deste
trabalho.
Às secretárias do Departamento de Patologia Rosângela, Camila e Neide, por todo
atendimento e informações prestados a mim.
A chefe administrativa, Silvia Helena Costa, do serviço de pós-graduação pela paciência e
informações prestadas.
Ao Sr. Jorge Ikawa do serviço de pós-graduação pelas informações prestadas.
Às secretárias do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho
Locomotor Fátima e Elisâgela por todo atendimento e informações prestados.
E a todas as pessoas que rezaram e acreditaram em mim!!!
Muito Obrigada a todos!
A vida me ensinou...
A dizer adeus às pessoas que amo, sem tirá-las do meu coração;
Sorrir às pessoas que não gostam de mim,
Para mostrá-las que sou diferente do que elas pensam;
Fazer de conta que tudo está bem quando isso não é verdade, para
que eu possa acreditar que tudo vai mudar;
Calar-me para ouvir; aprender com meus erros.
Afinal eu posso ser sempre melhor.
A lutar contra as injustiças; sorrir quando o que mais desejo é gritar
todas as minhas dores para o mundo...
...Me ensinou e está me ensinando a aproveitar o presente,
como um presente que da vida recebi, e usá-lo como um diamante
que eu mesmo tenha que lapidar, lhe dando forma da maneira que
eu escolher.
Charles Chaplin
ATIVIDADES CIENTÍFICAS DESENVOLVIDAS COM OS DADOS DESTA TESE

Cornachione, A. S.; Benedini-Elias, P. C. O.; Polizello, J. C.; Carvalho, L. C.;
Mattiello-Sverzut, A. C. Characterization of Fiber Types in Different Muscles of
the Hindlimb in Female Weanling and Adult Wistar Rats.
Acta Histochem.
Cytochem. 44 (2): 43-50, 2011(ANEXO A).
 Cornachione A. S.; Accordi B. A. A.; Mattiello-Sverzut A.C. Eccentric training
improves collagen type I and III in rat skeletal muscles after disuse. (Trabalho
apresentado em forma de pôster no 16th International WCPT Congress – World
Physical Therapy, Amsterdam, Holanda, a ser realizado em junho de 2011)
(ANEXO B).
 Cornachione A. S.; Cação-Benedini, L. O.; Martinez, E. Z.; Mattiello-Sverzut
A.C. Rehabilitation using eccentric training and maintained stretching on
capillarization in rat skeletal muscles after immobilization. (Trabalho apresentado
em forma de pôster no 16th International WCPT Congress – World Physical
Therapy, Amsterdam, Holanda, a ser realizado em junho de 2011) (ANEXO C).
 Cornachione A. S.; Martinez, E. Z.; Mattiello-Sverzut A.C. Phasic muscles
respond promptly to eccentric training after immobilization than tonic muscles.
(Trabalho apresentado em forma de pôster no II International Meeting in Exercise
Physiology, São Pedro, Brasil, maio 2011) (Anexo D).
 Pucciarelli, M. L. R.; Cornachione A. S.; Martinez, E. Z.; Mattiello-Sverzut
A.C. Estudo das alterações do tecido conjuntivo perimisial determinadas pelos
protocolos de alongamento e exercício excêntrico em ratas. (Trabalho
apresentado em forma de pôster no 18º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro
2010) (Anexo E).
 Pucciarelli, M. L. R.; Cornachione A. S.; Martinez, E. Z.; Mattiello-Sverzut
A.C. A influência do treinamento excêntrico no tecido conjuntivo perimisial.
(Trabalho apresentado em forma de pôster no XVIII COBRAF, Rio de Janeiro,
outubro 2009) (Anexo F).
 Cornachione A. S.; Cação-Benedini, L. O.; Martinez, E. Z.; Mattiello-Sverzut
A.C. Exercício excêntrico estimula a angiogênese no músculo sóleo após
imobilização de 10 dias. (Trabalho apresentado em forma de pôster no XVIII
COBRAF, Rio de Janeiro, outubro 2009) (ANEXO G).
 Cornachione A. S.; Accordi B. A. A.; Mattiello-Sverzut A.C. Protocolo
excêntrico de reabilitação restabelece colágeno muscular após desuso. (Trabalho
apresentado em forma de pôster no XVIII COBRAF, Rio de Janeiro, outubro
2009) (Anexo H).
 Cornachione A. S.; Cação-Benedini, L. O.; Benedini-Elias, P. C. O.; MattielloSverzut A.C. Twenty-one days of eccentric exercise increment further
capillarization of soleus muscle in adult rats than baby rats afther immobilization.
(Trabalho apresentado em forma de pôster no 45 th International Congress on
Anatomy and 46th Lodja Symposium on Histochemystry, Pilsen, República
Tcheca, setembro 2009) (Anexo I).
 Cação-Benedini, L. O.; Cornachione A. S.; Martinez, E. Z.; Mattiello-Sverzut
A.C. Análise dos efeitos da exercício excêntrico sobre a microcirculação dos
músculos sóleo e plantar de ratas submetidas à imobilização. (Trabalho
apresentado em forma de pôster no 16º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro
2008) (Anexo J).
 Accordi B. A. A.; Cornachione A. S.; Mattiello-Sverzut A.C. Efeitos do
exercício excêntrico na expressão de diferentes tipos de colágeno muscular após
imobilização do membros posterior de ratas (Trabalho apresentado em forma de
pôster no 16º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro 2008) (Anexo K).
RESUMO
CORNACHIONE, A. S. Efeitos da aplicação de diferentes protocolos de
reabilitação em músculos esqueléticos de ratas submetidas previamente à
imobilização do membro posterior direito. 2011. 154F. Tese (Doutorado) –
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2011.
É sabido que o exercício do tipo excêntrico e o alongamento são protocolos
frequentemente aplicados na reabilitação do sistema músculo esquelético. O objetivo
do presente estudo foi analisar as respostas teciduais dos músculos sóleo e plantar,
de ratas adultas imobilizadas por 10 dias e depois submetidas a programas de
reabilitação em dois períodos diferentes (10 e 21 dias). Quarenta e duas ratas Wistar
adultas foram divididas em 9 grupos: Três grupos controles; Imobilizado 10 dias;
Imobilizado e Treinado Excentricamente durante 10 e 21 dias; Imobilizado e
Alongado durante 10 e 21 dias; e Anestesiado. Após os procedimentos os músculos
sóleo e plantar foram removidos e dois fragmentos foram obtidos de cada músculo.
O primeiro fragmento foi congelado e processado sob diferentes métodos
histológicos, histoenzimológico, bioquímico e imuno-histoquímico. O outro fragmento
foi incluído em historesina para realização da técnica de microscopia de alta
resolução. Os resultados foram subdivididos em três experimentos. Experimento 1:
efeitos do exercício excêntrico após procedimento de imobilização. Experimento 2:
efeitos do alongamento mantido após procedimento de imobilização. Experimento 3:
comparação dos dados obtidos com os procedimentos de reabilitação acima. De
acordo com os experimentos 1 e 2 a imobilização determinou anormalidades
morfológicas no músculo sóleo como fibras em alvo, centralização nuclear, redução
do número de fibras do tipo I e aumento das fibras tipo IIC, redução do diâmetro
menor das fibras tipos I, IIA e IIAD, redução do número de capilares por fibra,
redução da expressão da MHCI e aumento da expressão dos colágenos tipos I e III.
O plantar mostrou redução do diâmetro das fibras tipos I, IIC, IIA e IID e aumento da
expressão dos colágenos tipos I e III. Após 10 dias de exercício excêntrico
(experimento 1) foi observado redução das fibras em alvo no sóleo mas aumento da
centralização nuclear e fibras lobuladas. Este mesmo período de treinamento não foi
eficaz para garantir a distribuição proporcional dos diferentes tipos de fibras, relação
capilar/fibras, expressão da MHCI e expressão dos colágenos, como observado no
controle. Contudo, 21 dias de reabilitação melhorou as anormalidades alcançando
valores obtidos no grupo controle. No plantar 10 dias de treinamento excêntrico
aumentou o diâmetro menor das fibras e reduziu a expressão dos colágenos tipos I e
III. Considerando o experimento 2 foi possível observar que 21 dias de alongamento
incrementaram a proporção de fibras e o diâmetro menor, no músculo sóleo. Porém,
este período não foi eficaz para restabelecer os aspectos morfológicos, relação
capilar/fibra e expressão de ambos os tipos de colágenos, como no grupo controle. A
análise comparativa, experimento 3, mostrou que o treinamento excêntrico foi mais
efetivo no restabelecimento das variáveis citoarquiteturais e quantitativas analisadas,
que o alongamento mantido. Nossos dados mostraram que o período para recuperar
o músculo sóleo é maior do que para o músculo plantar, principalmente
considerando que as alterações observadas no primeiro são superiores as
observadas no segundo.
Palavras Chaves: Ratas. Imobilização. Exercício excêntrico. Alongamento mantido.
Morfometria. Morfologia. Músculo sóleo. Músculo plantar.
ABSTRACT
CORNACHIONE, A. S. Effects of different rehabilitation protocols in skeletal
muscles of rats previously submitted to immobilization of the right hindlimb.
2011. 154F. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.
It is known that eccentric exercise and maintained stretching protocols are often used
in rehabilitation of skeletal muscle. The aim purpose of the present study was to
analyze the skeletal muscle responses of the soleus and plantaris muscles in adult
rats previously immobilized and after submitted to rehabilitation program in two
different periods (10 and 21 days).Forty-two adults female Wistar rats were divided
into nine groups: Three control groups; Immobilized during 10 days; Immobilized and
trained eccentrically during 10 and 21 days; Immobilized and stretched during 10 and
21 days; and anesthetized. After the experimental period the soleus and plantaris
muscles were removed and two fragments were obtained of each muscle. The first
fragment was frozen and processed by different methods histological, histochemical,
biochemical and immunohistochemical. The other fragment was included in
historesin to high resolution microscopy technique. The results were subdivided into
three experiments. Experiment 1: effects of eccentric exercise after immobilization
procedure. Experiment 2: effects of maintained stretching after immobilization
procedure. Experiment 3: comparison of the data obtained with the above
rehabilitation procedures. According experiments 1 and 2, the immobilization
procedure determined morphological abnormalities in soleus as target fibers, nuclear
centralization, reduction of the number of type I fibers, increased of the number of
type IIC fibers, decreased lesser diameter of type I fibers, decreased capillary/fiber
ratio, decreased MHCI expression and increased the immunoreactivity of the
collagen types I and III. Plantaris muscle showed reduction in lesser diameter of the
type I, IIC, IIA and IID fibers and increased the immunoreactivity the both collagen.
After 10 days eccentric exercise (experiment 1) was observed reduction of the target
fibers in soleus muscle but increased nuclear centralization and lobulated fibers. This
same protocol was not effective to reestablish the proportional distribution of different
types of fibers, capillary/fibers ratio, MHCI expression and collagen expression, as
observed in control group. However, 21 days of rehabilitation improved the
abnormalities reaching values obtained in the control group. On plantaris muscle, 10
days of eccentric exercise increased lesser diameter and decreased of
immunoreactivity of the collagen type I and III. Considering the Experiment 2, it was
possible to observe increment the fibers proportion and lesser diameter, in soleus
muscle after 21 days of stretching program. Nevertheless, this period was not
effective to restore the morphological aspects, capillary/fibers ratio and collagen
expression as control. The comparative analysis, Experiment 3, showed that
eccentric exercise was more effective in restoration of cytoarchitecture and
quantitative variables analyzed than maintained stretching. Our data showed that the
period to recover the soleus muscle is longer than to plantar muscle mainly
considering that the abnormalities observed in the first are superior that observed in
the second.
Key words: Rats. Immobilization. Eccentric exercise. Maintained stretching.
Morphometry. Morphology. Soleus muscle. Plantaris muscle.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
– Esquema da estrutura de tripla-hélice do colágeno.............................
32
Figura 2
– Esquema da síntese de colágeno........................................................
33
Figura 3
– Imobilização da articulação tíbio-társica em flexão plantar..................
43
Figura 4
– Modelo de imobilização Coutinho et al., (2002)...................................
44
Figura 5

– Esteira motorizada para ratos da marca Insight - modelo EP-131
com declinação de 16º. Fonte: Cornachione A, 2007..........................
Figura 6
45
– Membro posterior direito em flexão dorsal máxima, mantida por uma
fita adesiva...........................................................................................
46
Figura 7
– Exposição e dissecação do músculo sóleo e plantar...........................
47
Figura 8
– Fotomicrografias do músculo sóleo nas colorações hematoxilinaeosina e azul de toluidina e, na reação histoenzimológica para
mATPase pH 4.6 no experimento 1.....................................................
Figura 9
54
– Fotomicrografias do músculo sóleo na coloração de tricrômico de
gomori-modificado, nas reações histoenzimológicas mATPase pH
4.6,
NADH2-TR,
NASBI-PAS
e
imuno-histoquímica
para
desmina.......
Figura 10
55
– Fotomicrografias do músculo plantar nas colorações hematoxilinaeosina e azul de toluidina e, na reação histoenzimológica para
Figura 11
– Porcentagem das médias de FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD do músculo
sóleo em diferentes grupos analisados do experimento 1...................
Figura 12
59
– Porcentagem das médias de FTI, FTIIC, FTIIA, FTIID e FTIIB do
músculo plantar em diferentes grupos analisados no experimento 1..
Figura 14
58
– Foto do gel de eletroforese e análise quantitativa da expressão das
bandas da MHCI e MHCIIa do músculo sóleo do experimento 1.........
Figura 13
56
60
bandas da MHCI, MHCIIa, MHCIId do músculo plantar do
experimento 1.......................................................................................
Figura 15
– Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo e plantar
demonstrando a expressão do colágeno tipo I do experimento 1........
Figura 16
65
demonstrando a expressão do colágeno tipo III do experimento 1......
Figura 17
61
67
85
Figura 18
– Fotomicrografias do músculo plantar nas colorações hematoxilinaeosina e azul de toluidina e, na reação histoenzimológica para
Figura 19
sóleo em diferentes grupos analisados do Experimento 2...................
Figura 20
experimento 2.......................................................................................
95
Figura 25
91
demonstrando a expressão do colágeno tipo I do experimento 2 .......
Figura 24
90
bandas da MHCI, MHCIIa e MHCIId do músculo plantar do
Figura 23
89
Figura 22
88
Figura 21
86
96
Figura 26
sóleo em diferentes grupos analisados do Experimento 3...................
Figura 27
111
Figura 29
110
Figura 28
108
112
bandas da MHCI, MHCIIa e MHCIId do músculo plantar do
experimento 3.......................................................................................
Figura 30
demonstrando a expressão do colágeno tipo I do experimento 3 .......
Figura 31
113
116
117
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
– Esquema de dias e periodização do treinamento.............................
Tabela 2
– Alterações morfológicas das fibras do músculo sóleo identificadas
45
pelas colorações e reações histoenzimológicas nos diferentes
grupos do experimento 1..................................................................
Tabela 3
53
– Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD com os
respectivos intervalos de confiança de 95% do músculo sóleo dos
diferentes grupos estudados no experimento 1................................
Tabela 4
62
– Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA, FTIID e FTIIB
com os respectivos intervalos de confiança de 95% de o músculo
plantar dos diferentes grupos estudados no experimento 1.............
Tabela 5
63
– Médias da relação capilar/fibra com os respectivos intervalos de
confiança de 95% dos músculos sóleo e plantar dos diferentes
grupos estudados no experimento 1................................................
Tabela 6
64
– Análise semi-quantitativa da imunoreatividade dos colágenos tipos
I e III nos músculos Sóleo e Plantar para os diferentes grupos
analisados no Experimento 1...........................................................
Tabela 7
64
Tabela 8
83
diferentes grupos estudados no experimento 2................................
Tabela 9
92
com os respectivos intervalos de confiança de 95% do músculo
plantar dos diferentes grupos estudados no experimento 2.............
Tabela 10
93
grupos estudados no experimento 2................................
Tabela 11
93
Tabela 12
94
107
Tabela 13
diferentes grupos que compuseramo experimento 3.......................
Tabela 14
114
com os respectivos intervalos de confiança de 95% do músculo
plantar dos diferentes grupos que compuseram o experimento 3....
Tabela 15
114
grupos estudados no experimento 3................................
Tabela 16
115
115
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CETEA
- Comissão de Ética em Experimentação Animal
DAB
- Diamino-Benzidina
FTI
- Fibra Tipo I
FTIIC
- Fibra Tipo IIC
FTIIA
- Fibra Tipo IIA
FTIIAD
- Fibra Tipo IIAD
FTIID
- Fibra Tipo IID
FTIIB
- Fibra Tipo IIB
FGF
- Fator de Crescimento de Fibroblastos
GC(Imob)
- Grupo Controle do Grupo Imobilizado
GI
- Grupo Imobilizado
GC(10)
- Grupo Controle dos Grupos GITE(10) e GIAL(10)
GITE(10)
- Grupo Imobilizado 10 dias e treinado excêntrico 10 dias
GIAL(10)
- Grupo Imobilizado 10 dias e alongado 10 dias
GC(21)
- Grupo Controle dos Grupos GITE(21) e GIAL(21)
GITE(21)
- Grupo Imobilizado 21 dias e treinado excêntrico 21 dias
GIAL(21)
- Grupo Imobilizado 21 dias e alongado 21 dias
GA
- Grupo Anestesiado
GAGs
- Glicosaminoglicanas
GGT
- Galatosil-Lisil-Glucotransferase
HE
- Hematoxilina-Eosina
IGF
- Fator de Crescimento Insulínico
IL-1
- Interleucina - 1
MAPK
- Ativador Mitogênico de Proteína Kinase
mATPase
- Adenosina Trifosfatase Miofibrilar
MEC
- Matriz Extracelular
MHC
- Cadeia Pesada da Miosina
MMP
Matriz Metalloproteinase
MOAR
- Microscopia de Alta Resolução
NADH2-TR
- Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzido Tetrazolium Redutase
NAS-BI.PA
- Naftol AS-BI Fosfatase
PBS
- Tampão Fosfato Salino
P-4-H
- Prolil 4-Hidroxilase
rC/F
- Relação Capilar/Fibra
RE
- Retículo endoplasmático
SDH
- Desidrogenase Succínica
TBST
- Tampão Tris Salino com Tween 20
TGF-β
- Fator de Crescimento Tumoral – β
TIMP
- Tecidos Inibidores de Metaloproteínases
USP
- Universidade de São Paulo
VEGF
- Fator de Crescimento Endotelial Vascular
LISTA DE SÍMBOLOS
m/min
- metros por minuto
cm
- centímetro
mg/kg
- miligramas por kilograma
o
- graus Celsius
mm
- milímetro
m
- metro
g
- grama
s
- segundo
ml
- mililitro
kg
- kilograma
min
- minuto
m
- Micrômetro
C
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO__________________________________________________ 21
2
OBJETIVOS ___________________________________________________ 25
3
REVISÃO DA LITERATURA _______________________________________ 28
3.1 Músculo-Esquelético _________________________________________ 28
3.1.1 Características do músculo esquelético ______________________ 28
3.1.2 Classificação das fibras musculares _________________________ 29
3.1.3 Matriz extracelular do músculo-esquelético ___________________ 31
3.2 Efeitos do desuso e da reabilitação física no músculo-esquelético ___ 34
3.2.1 Desuso por imobilização ___________________________________ 34
3.2.2 Reabilitação física do músculo esquelético ___________________ 36
4
MATERIAIS E MÉTODOS _________________________________________ 41
4.1
Animais ____________________________________________________ 41
4.2
Grupos experimentais ________________________________________ 41
4.3 Procedimentos experimentais _________________________________ 43
4.3.1 Técnica de Imobilização ___________________________________ 43
4.3.2 Técnica de Treinamento em Esteira em Declive – Exercício
Excêntrico ____________________________________________________ 44
4.3.3 Técnica de Alongamento Mantido ___________________________ 45
4.3.4 Processamentos dos Fragmentos musculares _________________ 46
4.3.5 Estudo Morfológico _______________________________________ 49
4.3.6 Estudo Morfométrico ______________________________________ 49
4.3.7 Análise Estatística ________________________________________ 51
5
RESULTADOS EXPERIMENTO 1 __________________________________ 53
5.1
Morfologia _________________________________________________ 53
5.2 Morfometria ________________________________________________ 57
5.2.1 Proporção de Fibras e Expressão dos Diferentes Tipos de MHC __ 57
5.2.2 Diâmetro Menor __________________________________________ 62
5.2.3 Relação Capilar/fibra ______________________________________ 63
5.3
6
Colágenos tipo I e tipo III _____________________________________ 64
DISCUSSÃO EXPERIMENTO 1 ____________________________________ 69
6.1
Morfologia _________________________________________________ 69
6.2 Morfometria ________________________________________________ 71
6.2.1 Alterações na Proporção de Fibras e na MHC __________________ 71
6.2.2 Alterações na Área de Secção Transversa ____________________ 73
6.2.3 Alterações na Relação Capilar/fibra __________________________ 75
6.3
Alterações na Expressão do Colágeno Tipo I e Tipo III _____________ 77
6.4
Limitações do Experimento 1 __________________________________ 79
7
CONCLUSÃO EXPERIMENTO 1 ___________________________________ 81
8
RESULTADOS EXPERIMENTO 2 __________________________________ 83
8.1
Morfologia _________________________________________________ 83
8.2 Morfometria ________________________________________________ 87
8.2.1 Proporção de Fibras e Expressão dos Diferentes Tipos de MHC __ 87
8.2.2 Diâmetro Menor __________________________________________ 92
8.2.3 Relação Capilar/fibra ______________________________________ 93
8.3
9
Colágenos tipos I e tipo III ____________________________________ 94
DISCUSSÃO EXPERIMENTO 2 ____________________________________ 98
9.1
Morfologia _________________________________________________ 98
9.2 Morfometria ________________________________________________ 99
9.2.1 Alterações na Proporção de fibras e na MHC __________________ 99
9.2.2 Alterações na Área de Secção Transversa ___________________ 100
9.2.3 Alterações na Relação Capilar/fibra _________________________ 101
9.3
Alterações na Expressão dos Colágenos Tipo I e Tipo III __________ 102
9.4
Limitações Experimento 2 ___________________________________ 103
10 CONCLUSÃO EXPERIMENTO 2 __________________________________ 105
11 RESULTADOS EXPERIMENTO 3 _________________________________ 107
11.1 Morfologia ________________________________________________ 107
11.2 Morfometria _______________________________________________ 109
11.2.1 Proporção de Fibras e Expressão dos Diferentes Tipos de MHC _ 109
11.2.2 Diâmetro Menor _________________________________________ 114
11.2.3 Relação Capilar/fibra _____________________________________ 115
11.3 Colágenos tipo I e tipo III ____________________________________ 115
12 DISCUSSÃO EXPERIMENTO 3 ___________________________________ 119
13 CONCLUSÃO EXPERIMENTO 3 __________________________________ 123
14 CONCLUSÕES ________________________________________________ 125
15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________ 127
ANEXOS________________________________________________________ 139
Introdução - 21
1
INTRODUÇÃO
Os músculos esqueléticos são constantemente requisitados a gerar um
extenso espectro de força e de movimento. A atitude antigravitacional de
quadrúpedes
favorece
o
constante
recrutamento
do
músculo
sóleo
no
desenvolvimento da postura estática (ROY et al., 1991; GREGOR et al., 2006) ao
contrário do músculo plantar que atua como coadjuvante nos movimentos fásicos
rápidos e rítmicos de flexão plantar durante a marcha. Situações de desuso,
determinadas por procedimentos de imobilização, tem mostrado desencadear
alterações morfológicas, bioquímicas e funcionais mais expressivas em músculos
tônicos, como o sóleo, que em músculos fásicos, como plantar.
As fibras musculares são estruturas dinâmicas capazes de ter seu fenótipo
alterado em diversas condições, desde o desuso até a sobrecarga (TALMADGE,
2000). Redução da transdução de estímulos mecânicos, determinados pelo
procedimento de imobilização, pode desencadear uma cascata de alterações
estruturais no músculo esquelético (PETTE; STARON, 2000). Estudos prévios que
submeteram o músculo sóleo de ratos a situações de hipocinesia, através de
imobilização em posição encurtada (Loughna et al, 1990) ou suspensão (Stevens et
al, 2000; Cornachione et al., 2008) mostraram que o procedimento determina
alterações citoarquiteturais, atrofia e trânsito da isoforma da cadeia pesada da
miosina (MHC) de lenta (tipo I) para rápida (tipo II), proporcionando aumento da
MHCIIa concomitante diminuição da MHCI.
A matriz extracelular (MEC) é uma malha complexa e dinâmica que oferece
suporte e manutenção estrutural para os tecidos (TAKALA; VIRTANEN, 2000).
Composta predominantemente por colágenos, essa estrutura tem apresentado
alterações significativas após situações de desuso. JÄRVINEN e colaboradores
(2002) observaram aumento da expressão dos colágenos dos tipos I e III nos
músculos sóleo e gastrocnêmio após três semanas de imobilização. O aumento da
expressão de colágeno intramuscular pode reduzir o fluxo sanguíneo nos capilares
comprometendo a homeostase do tecido. Estudos recentes também têm mostrado
redução significativa da relação capilar/fibra (rC/F) de músculos de animais adultos
após situações de hipocinesia (CORNACHIONE et al., 2011; DESPLANCHES et al.,
1990; DESPLANCHES et al., 1991). Filamentos intermediários, como a desmina,
responsáveis pela manutenção arquitetural da célula e transdução de estímulos,
Introdução - 22
tanto do meio extra como do meio intrecelular (Kamiñska et al., 1996; Cízková et al.,
2006), também podem ser acometidos pela imobilização (VATER et al., 1992).
Concomitante, essa proteína tem mostrado ser um importante marcador de
regeneração quando o músculo retoma à sobrecarga ou são estimulados por
atividade física.
Dentro da literatura científica, há uma diversidade de programas de atividade
física que são aplicados na reabilitação do músculo esquelético. O exercício
excêntrico tem mostrado ser um potente indutor da regeneração muscular após
períodos de hipocinesia (CORNACHIONE et al., 2008; CORNACHIONE et al., 2011)
ao contrário do que se tem visto em estudos pregressos (EVANS, 1986). Não se
pode deixar de enfatizar a sua característica lesiva devido ao aumento de tensão,
consequência esta determinada pelo menor recrutamento de unidades motoras
(MAYHEW et al., 1995). Paralelamente, este mesmo estímulo que lesa também é
capaz de aumentar o trofismo e o número de capilares após hipocinesia por
suspensão (CORNACHIONE et al., 2011). Dentro do acervo científico são muitos os
estudos que abordam o exercício excêntrico como um fator lesivo do tecido muscular
em fases agudas de treinamento (Sonobe et al., 2010; Liao et al., 2010), porém são
poucos aqueles que o abordam como uma importante ferramenta na reabilitação,
principalmente quando aplicado por períodos mais longos (McBRIAN; GORIN;
CARLSEN, 1995).
Outro programa de reabilitação que merece destaque é o alongamento
mantido. Este recurso é comumente utilizado na prática reabilitadora com intuito de
prevenir a proliferação de tecido conjuntivo (WILLIAMS et al., 1988) e a perda de
sarcômeros em série em músculos imobilizados (GOLDSPINK, 2002). Alguns
estudos também afirmam que o alongamento pode ser um estímulo mecânico
determinante da hipertrofia muscular (COUTINHO et al., 2004; GOMES et al., 2004;
GOLDSPINK et al., 2002). Mas, por outro lado, existem relatos na literatura científica
descrevendo que essa força tensional passiva longitudinal pode acarretar lesões
degenerativas importantes no tecido muscular após imobilização, assim como o
exercício excêntrico (MATTIELLO-SVERZUT et al., 2006; GOMES et al., 2007). De
um modo geral os estudos científicos creditam os benefícios do alongamento, após
desuso, especialmente ao aumento do trofismo, da amplitude de movimento e da
reorganização do tecido conjuntivo, porém são escassos os resultados frente aos
diferentes tipos de fibras, capilares e expressões colagênicas.
Introdução - 23
Dentro da prática fisioterapêutica é sabido que os convênios de saúde,
rotineiramente, elegem 10 sessões terapêuticas como suficientes para reabilitar o
músculo esquelético após período de desuso determinado pelo procedimento
ortopédico de imobilização. Previamente foi mostrado que o desuso desencadeia
alterações histopatológicas significativas no músculo esquelético e que programas
de reabilitação aplicados a este sistema parecem reverter tais disfunções
(TALMADGE, 2000; CORNACHIONE et al., 2008; CORNACHIONE et al., 2011).
Porém, a descrição das capacidades adaptativas de remodelação acompanhadas
por períodos de 10 e 21 dias, sendo este último o tempo que se encerra o processo
de regeneração celular, não foram ainda investigados.
Frente aos fatos aqui levantados, pergunta-se: o período terapêutico de 10
dias é realmente suficiente para restabelecer as características de músculos
funcionalmente similares, porém bioquimicamente distintos? Considerando que 10
dias não completam o período de proliferação, diferenciação e fusão das células
satélites, nossa hipótese é que somente após 21 dias de estímulo terapêutico, o
tecido muscular apresentará características normais e estará preparado para realizar
as funções cotidianas.
Vale ressaltar que ambos os procedimentos experimentais, imobilização e
reabilitação, foram aplicados em ratas e seu metabolismo é expressivamente mais
acelerado quando comparado aos seres humanos.
Objetivos - 25
2 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Para os profissionais da saúde, especialmente para os fisioterapeutas,
estudar a plasticidade do tecido muscular, pode trazer informações adicionais à
aplicação de recursos terapêuticos controversos na literatura, ainda que estes
estudos sejam realizados em ratos e que devam ser cuidadosamente extrapolados
para o âmbito humano.
Em decorrência da realidade observada no nosso sistema de saúde, frente ao
número de sessões de fisioterapia prescritas aos pacientes, o objetivo do presente
estudo foi analisar as respostas teciduais dos músculos sóleo e plantar, de ratas
previamente imobilizadas por 10 dias, submetidos a programas de reabilitação (10 e
21 dias) independentes, exercício excêntrico e alongamento mantido, por 40
minutos.
Objetivos Específicos
Experimento 1 – 40 minutos de Treino Excêntrico Pós-Imobilização
Confrontar
achados histopatológicos,
qualitativos
e
quantitativos,
em
diferentes períodos (10 e 21 dias) de treinamento do tipo excêntrico aplicado em
animais adultos que foram previamente submetidos ao desuso por 10 dias de
imobilização.
Experimento 2 – 40 minutos de Alongamento Mantido Pós-Imobilização
Confrontar
achados histopatológicos,
qualitativos
e
quantitativos,
em
diferentes períodos (10 e 21 dias) de alongamento mantido em animais adultos que
foram previamente submetidos ao desuso por 10 dias de imobilização.
Experimento 3 – Treinamento Excêntrico X Alongamento Mantido
Confrontar achados histopatológicos, qualitativos e quantitativos, dos
protocolos exercício excêntrico e alongamento mantido aplicados em diferentes
períodos, 10 e 21 dias de reabilitação, em animais adultos que foram previamente
submetidos ao desuso por 10 dias de imobilização.
Objetivos - 26
Nos experimentos, as alterações musculares foram avaliadas através:

da análise qualitativa dos aspectos gerais morfológicos;

da análise quantitativa, obtendo dados de diâmetro menor, proporção
dos diferentes tipos de fibras; relação capilar/fibra e expressão das
diferentes isoformas de miosina;

da análise semi-quantitativa para expressão dos colágenos tipo I e tipo
III.
Revisão da Literatura - 28
3
REVISÃO DA LITERATURA
Os músculos esqueléticos são constantemente requisitados a gerar um
extenso espectro de força e de movimento, muitas vezes acompanhados de
situações de resistência à fadiga. Estas funções, geração de força e movimento,
podem ser comprometidas por situações de desuso, como restrição ao leito, que
conduzem o músculo a um estado de hipocinesia, assim como pela atividade física,
gerando um profundo impacto na atividade morfofuncional do mesmo. Para se
adaptar a estas diferentes situações (desuso e atividade física), fibras musculares
especializadas
desenvolveram-se
com
propriedades
genéticas,
fisiológicas,
bioquímicas e morfológicas diferentes (KELLY; RUBINSTEIN, 1994). Assim, estudos
experimentais utilizando animais, em situações de hipocinesia e programas de
reabilitação, têm sido extensivamente explorados pela literatura científica com o
objetivo de contribuir parcialmente ou integralmente na reestruturação do sistema
músculo-esquelético.
3.1 Músculo-Esquelético
3.1.1 Características do músculo esquelético
O músculo esquelético é constituído por dois grandes conjuntos de células,
um especializado em promover contração, composto pelas miofibrilas e outro
responsável em promover sustentação, composto pelo tecido conjuntivo, que possui
dentre os seus constituintes os fibroblastos (KJÆR et al., 2003).
A organização, o número, o tamanho e o tipo dessas fibras variam de
músculo para músculo (WANG; KERNELL, 2001), mas cada fibra muscular é
envolvida por uma membrana chamada sarcolema. Como as outras células do
organismo, a fibra muscular é composta por citoplasma, denominado de
sarcoplasma. Essas duas regiões, sarcolema e sarcoplasma, estão interligadas por
um conjunto de proteínas. Essas proteínas são responsáveis pela transmissão das
forças geradas pelas miofibrilas à matriz extracelular (MEC), e vice-versa
(HERRMANN et al., 2007).
As miofibras apresentam arquitetura longa, cilíndrica e com vários núcleos em
sua periferia; possuem tipos e subtipos com diferentes propriedades. Cada miofibrila
está envolvida por uma quantidade de tecido conjuntivo denominado endomísio.
Agrupadas em feixes elas encontram-se envolvidas por outra camada de tecido
conjuntivo denominada perimísio, sendo esse conjunto denominado de fascículo. Ao
redor do músculo encontra-se o epimísio, que representa a camada mais externa de
tecido conjuntivo. Esse tecido possui continuidade até os tendões. Adicionalmente,
nervos motores penetram pelo músculo e inervam por meio de axônios terminais,
cada miofibrila. Nervos sensoriais penetram no fuso muscular enviando e recebendo
informações do estado de contração. Além destes constituintes, o músculo
esquelético é altamente vascularizado o que fornece nutrientes essenciais para a
função muscular (KJÆR et al., 2003).
A miofibrila é composta por filamentos finos e grossos chamados
miofilamentos. O miofilamento fino é composto pela proteína actina e o grosso pela
proteína miosina. A interação desses dois miofilamentos é essencial na contração
muscular. O miofilamento fino é formado por dois filamentos de actina, um enrolado
no outro, onde moléculas de proteína globular, chamadas de troponina, são
encontradas nos sítios de ligação entre os dois filamentos, e a proteína tropomiosina
liga-se em cada molécula de troponina. A troponina e tropomiosina possuem
ativação cálcio dependentes, sendo componentes essenciais para regulação da
contração muscular (CLARK et al., 2002).
O miofilamento grosso é composto por grandes moléculas de miosina,
organizadas para formar um filamento longo. Cada molécula tem um alargamento,
chamado de cabeça. As cabeças da miosina são capazes de mover-se e ligar-se
aos sítios da actina, gerando assim a contração ou relaxamento muscular
(LEVITSKY, 2004).
3.1.2 Classificação das fibras musculares
Uma das características únicas dos músculos esqueléticos é a sua
composição de diferentes tipos de fibras musculares que contribuem para uma
variedade de capacidades funcionais. A velocidade da contração muscular está
diretamente relacionada à atividade adenosina trifosfatase miofibrilar (mATPase),
que por sua vez, está intimamente relacionada com as distintas isoformas da
miosina.
Músculos adultos apresentam 4 tipos de fibras representativas, uma
população distinta que expressa específicas isoformas de miosina e, portanto,
considerada pura (MHCIIa, MHCIIb, MHCIId/x (rato/humano) e MHCI). Outra
heterogênia, composta por um amplo espectro de isoformas da miosina, considerada
híbridas, (MHCIIb + MHCIId/x, MHCIId/x + MHCIIa ou MHCIIa + MHCI) (PETTE;
STARON, 1997). Em 1969, Guth e Samatha propuseram um método de coloração
histoquímico do tecido muscular, utilizando diversos meios ácidos e básicos de préincubação. Com base na instabilidade da atividade da miosina, as fibras foram
classificadas em tipos I (FTI) e II (FTII) e subtipos IIA (FTIIA), IID/X (FTIID/X) e IIB
(FTIIB)
(ALLEN
et
al.,
1996;
STARON;
PETTE,
1986;
1993).
A identificação das fibras puras e híbridas está bem estabelecida na literatura,
entretanto as mesmas podem variar em quantidade conforme a espécie estudada,
ou mesmo se concentrarem numa determinada região de um mesmo músculo
(ARMSTRONG; PHELPS, 1984; STARON et al. 1999; WANG; KERNELL, 2001). Um
exemplo claro desses diferentes aspectos enzimáticos foi documentado por Staron
et al. (1999) quando estudaram quatro diferentes músculos dos membros posteriores
de ratos Fischer 344. Cornachione et al., (2011) também desmonstraram, através da
técnica para mATPase, diferentes tipos de fibras que compõe diferentes músculos
de ratas da raça Wistar.
As fibras musculares são estruturas dinâmicas capazes de ter seu fenótipo
alterado em diversas condições, como aumento ou redução da atividade
neuromuscular e/ou carga mecânica (TALMADGE, 2000), alterações hormonais (em
especial hormônios tireoidianos), idade, entre outros fatores (PETTE; STARON,
2000). O esquema abaixo demonstra os possíveis sentidos de transformações
fenotípicas das fibras segundo Pette e Staron (2000):
O
suprimento
sanguíneo
do
músculo
esquelético
esta
diretamente
relacionado com o tipo de fibra e a transição entre os diferentes tipos. As fibras de
contração lenta (FTI) apresentam tipicamente mais capilares que as fibras de
contração rápida (FTII) (ANNEX et al., 1998; CHERWEK et al., 2000). Os capilares
têm a importante função de levar oxigênio e substratos necessários para as fibras
musculares realizarem a contração.
Um exemplo claro desse aspecto histológico é o músculo sóleo e o plantar.
Apesar dos músculos sóleo e plantar apresentarem certa proximidade anatômica, os
mesmos são distintos nas características citoarquiteturais e bioquímicas. O sóleo é,
considerado um músculo postural, composto na sua maioria de FTI e FTIIA, porém,
estudos têm mostrado que outros subtipos, tais como FTIID e FTIIB, estão sendo
identificados no mesmo (SOUKUP et al., 1979; ZURMANOVÁ et al., 2007; 2008).
Chopard et al. (2001) e Schuenke et al. (2008) mostraram que as FTI predominam
proporcionalmente no músculo sóleo de animais adultos. Os autores atribuíram essa
característica a constante ativação deste músculo durante atividades funcionais e,
consequentemente, deste tipo específico e predominante de fibra. Outros autores
também sugerem que a atividade antigravitacional de quadrúpedes favorece a
atividade do músculo sóleo no desenvolvimento da postura estática (ROY et al.,
1991; GREGOR et al., 2006). Diferentemente é o músculo plantar composto
predominantemente, na porção profunda, por FTIID (ROY et al. 1997; FULLER et al.
2006). Esta característica glicolítica pode ser atribuída às contrações intermitentes
recrutadas durante a marcha.
3.1.3 Matriz extracelular do músculo-esquelético
A matriz extracelular (MEC) é uma malha complexa e dinâmica que oferece
suporte e manutenção estrutural para organismos multicelulares e, ajuda na
regulação de diversos processos celulares, tais como: crescimento, proliferação,
diferenciação, migração e adesão celular (TAKALA; VIRTANEN, 2000). As principais
classes
de
macromoléculas
encontradas
na
MEC
são
das
cadeias
de
polissacarídeos, glicosaminoglicanas (GAGs), que estão normalmente ligadas a uma
proteína formando assim, um polissacarídeo e a classe das proteínas fibrosas,
constituída por dois tipos funcionais: estruturais (colágeno e elastina) e adesivas
(fibronectina e laminina).
O colágeno é a proteína mais abundante da matriz extracelular. Sua estrutura
é de tripla-hélice constituída por 3 cadeias-α de polipeptídios. As cadeias-α são
configuradas por repetitivas sequências de aminoácidos (glicina, prolina e
hidroxiprolina) (Figura 1) (ALBERTS et al., 2002).
Figura 1 – Esquema da estrutura de tripla-hélice do colágeno.
Fonte: Molecular Biology of the Cell, Alberts et al. (2002) - Modificado
Até o presente momento foram encontrados cerca de 24 diferentes tipos de
colágeno, geralmente divididos em dois principais grupos, denominados colágeno
fibrilar e não-fibrilar. Em ratos, os colágenos tipos I e III (fibrilar) são distribuídos em
todos os três níveis de tecido muscular (epi-, peri- e endomísio) porém o colágeno
tipo IV (não-fibrilar) está localizado em vasos e membrana basal. O colágeno tipo V
é o menor tipo, e é encontrado também no endomísio (GONDRET et al., 2005).
Os fibroblastos são os principais sintetizadores do colágeno e é dentro do
retículo endoplasmático (RE) desta célula que ocorre a produção (Figura 2). A
biosíntese é caracterizada por extensivos números de modificações pré- e póstransducionais das cadeias polipeptídicas que contribuem na qualidade e na
estabilidade do mesmo (KIVIRIKKO; MYLLYLÄ, 1982). A confecção de uma fibra de
colágeno ocorre tanto no meio intracelular como no extracelular. Após o estímulo
mecânico fatores de crescimento, tais como: fator de crescimento tumoral - β (TGFβ), fator de crescimento insulínico (IGF), interleucina – 1 (IL-1), fator de crescimento
de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),
desempenham importante papel na regulação da ativação do gene do colágeno.
Figura 2 – Esquema da síntese de colágeno.
Fonte: Michael Kjaer, Physiol Rev 84:649-698, 2004 - Modificado
Dentro do núcleo ocorre a transcrição do DNA dando origem ao mRNA. Este
último passa por modificações transducionais formando as cadeias de polipeptídio.
No RE essas cadeias sofreram a ação de enzimas sintetizadoras, Prolil 4-Hidroxilase
(P-4-H) e a Galatosil-Lisil-Glucotransferase (GGT), originando as cadeias-α (KJAER
2003).
Ainda dentro do RE essas cadeias se auto-estruturam dando origem ao
procolágeno com formato de tripla-hélice. Através do aparelho de Golgi o
procolágeno é exocitado para o meio extracelular e sofrerá clivagem dos seus
terminais amino e carboxil, formando uma molécula de colágeno. As moléculas de
colágeno também têm a característica de se auto-estruturarem para formar a fibrila
de colágeno que por fim se agregam e formam a fibra propriamente dita (ALBERTS
et al., 2002). A estabilidade e força tensil do colágeno são dadas por ligações
covalentes de lisina, chamadas de cross-linked.
Por outro lado, o estímulo mecânico também estimula degradação e
remodelação do colágeno. As metaloproteínases da matriz (MMPs) são proteinases
que participam da regulação e degradação da MEC. São classificadas como
colagenases e gelatinases. As gelatinases dos tipos 2 (MMP-2) e 9 (MMP-9) são as
mais encontradas no tecido muscular sendo a MMP-2 responsável pela degradação
dos colágenos tipos I e III. Outra notável função da MMP-2 é a regulação da
proliferação e diferenciação de mioblastos e fibroblastos. Concomitante a ativação
das MMPs os tecidos inibidores de metaloproteínases da matriz (TIMPs) também
são ativados desempenhando o papel de inibição das MMPs conforme o tipo de
estímulo imposto (FASSINA et al., 2000).
As células do tecido conjuntivo desempenham importante papel de distinguir e
transduzir diferentes estímulos mecânicos, como forças compressivas, tenseis e
cisalhantes. Essas forças são propagadas através da mecanotransdução. Esse
mecanismo é responsável pela sobrevivência e crescimento da célula, pois
estímulos mecânicos são transformados em estímulos químicos influenciando
diretamente na morfologia, bioquímica e arquitetura do músculo esquelético. Assim,
o aumento ou a redução da atividade física podem influenciar na síntese e
diferenciação dos componentes da MEC e nas proteínas do costâmero (KJÆR,
2004).
3.2 Efeitos do desuso e da reabilitação física no músculo-esquelético
3.2.1 Desuso por imobilização
A manutenção da citoarquitetura do músculo esquelético requer uma mínima
quantidade de carga repetitiva. Situações de hipocinesia como acamamento ou
imobilização, podem conduzir a musculatura às alterações citoarquiteturais
importantes, tais como: atrofia, redução da extensibilidade, da força e da resistência,
resultando em aumento da fibrose intramuscular (WILLIAMS; GOLDSPINK, 1983;
KANNUS et al., 1998; SILVA et al., 2006), além de transtornos de circulação e
edema, devido a uma redução da densidade capilar (McNULTY et al., 1992; KVIST
et al., 1995), alterações ligamentares e rigidez articular (LOITZ et al., 1989).
Condições de inatividade determinaram alterações importantes, observadas no eixo
longitudinal como: encurtamentos e contraturas; e no eixo transversal como: redução
do volume, devido a degradação de proteínas, aumento do volume, decorrente de
tumefação celular e até mesmo aumento no número de células do músculo
esquelético, provenientes de fragmentações (splitting) (PICQUET et al., 1998;
MATTIELLO-SVERZUT et al., 2006; GOMES et al., 2007). Polizelllo (2009) observou
redução do diâmetro menor de todos os tipos de fibras do músculo sóleo, após
imobilização por 14 dias consecutivos. O mesmo procedimento mostrou reduzir
significativamente o tamanho da área de secção transversa das FTI, FTIIAD e FTIID
na porção medial do músculo gastrocnêmico (CARVALHO, 2009).
Gamrin et al., (1998) e Silva et al., (2006) observaram significativa redução de
força e massa muscular após 48 horas de imobilização. Hebert e Balnave (1993) e
Kannus et al., (1998) relataram que o músculo sóleo imobilizado em posição
encurtada por 7 dias, apresentou uma redução significativa de 37% da massa
muscular. Este fato pode ser justificado pela rápida degradação das miofibrilas e
proteínas musculares (GOLDSPINK, 1991; KASPER et al., 1993; BALDWIN et al.,
1994; OKITA et al., 2001). Ainda, a imobilização em posição encurtada gera
encurtamento dos sarcômeros em série afetando assim, o comprimento funcional
ideal (WILLIAMS et al., 1988; COUTINHO et al., 2004). De forma semelhante, a
imobilização na posição alongada causa redução da massa muscular e aumento do
tecido conjuntivo, porém essa alteração é menos evidente quando comparada à
imobilização em encurtamento, além de apresentar aumento de cerca de 17% do
número de sarcômeros em série (JÓZSA et al., 1990; PATTULLO, et al., 1991;
PETTE; STARON, 2000). Então, a imobilização de músculos em posição encurtada
é seguida de atrofia muscular mais marcante e maior perda das propriedades
elásticas do que aqueles imobilizados em posição de alongamento (JARVINEN et
al., 1992).
Além de proporcionar alterações no volume da fibra muscular, o desuso
determinado pela imobilização também gera mudanças na isoforma da MHC. A
transição da isoforma da MHC, de rápida (tipo II) para lenta (tipo I) ou de lenta para
rápida, depende do tipo e da intensidade do estímulo aplicado (BOTTINELLI et al.,
1994). Essa mudança na expressão da MHC respeita uma seqüência hierárquica
(MHCI  MHCIIa  MHCIId  MHCIIb) conforme a atividade específica da
mATPase e da tensão. Após períodos de imobilização, alterações na configuração
das fibras são observadas na musculatura esquelética (BOOTH; KELSO, 1973;
PETTE; STARON, 2000). Estudos mostraram, no músculo sóleo de ratos, que
situações de desuso, como a imobilização em posição encurtada, determinam atrofia
e trânsito da isoforma da MHC de lenta para rápida, proporcionando aumento da
expressão da MHCIIa concomitante diminuição da MHCI (LOUGHNA et al, 1990;
THOMASON; BOOTH, 1990; STEVENS et al, 2000; CORNACHIONE et al., 2011).
Por
outro
lado,
a
imobilização
realizada
em
músculos
compostos
predominantemente por fibras de contração rápida (FTII), como EDL, mostrou
determinar um trânsito da MHC mais rápida para mais lenta (PATTULLO, et al.,
1992; LOUGHNA et al., 1990; GOLDSPINK, 1999). Contudo, é sabido que músculos
de contração lenta são mais afetados pelo procedimento de imobilização quando
comparados a músculos de contração rápida (THOMASON; BOOTH, 1990;
GOLDSPINK, 1999; PETTE; STARON, 2000; SILVA et al., 2006).
Somada às alterações do tecido muscular, a imobilização gera ainda redução
da densidade capilar. Essa alteração é marcante na primeira semana, porém
continua até a terceira semana, paralelamente ao aumento de tecido conjuntivo
intramuscular (JÓZSA et al., 1990; KANNUS et al., 1998b). Isso ocorre devido à
obliteração da luz dos capilares de forma que, o aumento do tecido intramuscular
contribui para a redução do fluxo sanguíneo nos capilares estimulando aumento na
quantidade deste tecido, iniciando assim, um ciclo vicioso (JÓZSA et al., 1990).
Cornachione et al. (2008) observaram redução significativa da relação capilar/fibra,
no músculo sóleo, após situação de hipocinesia.
Quanto ao colágeno é sabido que a musculatura esquelética é composta por
três formas de colágeno fibrilar, tipo I, III e V, e uma forma não fibrilar, o colágeno do
tipo IV, e que alterações dos níveis de atividade física pode comprometer a
biosíntese dos mesmos (TAKALA; VIRTANEN, 2000). Situações de desuso,
induzidas por procedimento de imobilização, mostraram redução da atividade
enzimática na síntese do colágeno (AHTIKOSKI, et al., 2001). Han et al. (1999)
observaram redução nos níveis de mRNA, nos músculos sóleo e plantar, dos prócolágenos tipos I e III após sete dias de imobilização do membro posterior direito de
ratos. Por outro lado, Järvinen e colaboradores (2002) observaram aumento no
colágeno I e III nos músculos sóleo e gastrocnêmio após três semanas de
imobilização.
3.2.2 Reabilitação física do músculo esquelético
Os efeitos morfofuncionais determinados pelo desuso, relatados acima, são
extensivamente destacados na literatura científica. No entanto, os efeitos
morfofuncionais determinados por diferentes procedimentos de remobilização são
escassos na literatura, mas são infinitamente maiores que os relatos comparativos
entre dois procedimentos.
Na busca da prevenção da atrofia muscular determinada pelo desuso e
redução da proliferação de tecido conjuntivo, modalidades de exercícios terapêuticos
têm sido apresentados pela literatura científica. Programas de exercício excêntrico
têm sido analisados e sugere-se que os músculos, quando assim exercitados,
podem gerar maior nível de tensão que durante a contração concêntrica e isométrica
(DOSS; KARPOVICH, 1965; OLSON et al. 1972; CUCCURULLO, 2010). Alguns
autores argumentam que o estímulo excêntrico aumenta a síntese de proteína,
acarretando maior estímulo para hipertrofia muscular comparado com outros tipos de
contração (ATHA, 1981 apud MAYHEW et al., 1995).
Exercícios de corrida
aplicados em ratos, com freqüência de 3 vezes por semana, restabeleceram as
propriedades musculares e a amplitude de movimento perdidas durante o período de
imobilização (SAKAKIMA et al., 2004). Ratas jovens, submetidas ao treino de corrida
por 8 semanas, apresentaram transição de isoformas de MHCIIb para MHCIId e IIa
no músculo plantar (SULLIVAN et al., 1995). Já no músculo sóleo de ratos adultos,
houve aumento de fibras musculares com características oxidativas-glicolíticas
(FOG) após treinos, estático e dinâmico, com contrações excêntricas (MELICHNA et
al., 1987). Cornachione et al. (2008) observaram que os achados relativos a
proporção de fibras do músculo sóleo, equipararam-se à situação controle após
reabilitação com exercício excêntrico.
Por outro lado, tem sido destacado que a escolha deste tipo de exercício pode
determinar lesão tecidual significativa. Estudos realizados em nosso laboratório,
utilizando a técnica de suspensão caudal de ratas e treinamento excêntrico por 21
dias, mostraram menor incidência de lesão celular que a técnica de treinamento
concêntrico (CORNACHIONE et al., 2008). Além disso, os mesmos autores
observaram restabelecimento da relação capilar/fibra após aplicação deste programa
de reabilitação. Kano e colaboradores (2002) relatam que o exercício físico pode ser
um importante estímulo para a angiogênese no músculo esquelético através do
recrutamento de maior oferta de oxigênio e substratos para o tecido. O fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) e a hipoxia realizam papel importantes na
proliferação capilar em resposta ao exercício (BLOOR, 2005). Muitas situações no
músculo esquelético que exibem a angiogênese envolvem aumento do fluxo
sanguíneo, e muitas evidências apontam que o aumento do fluxo sanguíneo sozinho
é suficiente para induzir o crescimento capilar (BROWN; HUDLICKA, 2003).
Outro procedimento terapêutico de remobilização frequentemente utilizado
para restabelecer a amplitude de movimento e o desempenho funcional do músculo
esquelético após situações de desuso é o alongamento muscular passivo. A meta
geral de um programa de alongamento é restabelecer a amplitude de movimento aos
padrões de normalidade das articulações e a mobilidade dos tecidos moles que as
cercam (KISNER, 1998; WELDON; HILL, 2003). É uma importante técnica capaz de
prevenir a proliferação de tecido conjuntivo e a perda de sarcômeros em série de
músculos imobilizados (JÄRVINEN et al., 1992; COUTINHO et al., 2004), e tem sido
indicada para prevenção de lesões inclusive, em atletas (WELDON; HILL, 2003). No
entanto, alguns estudos sugerem que esta técnica é capaz de determinar hipertrofia
tecidual (OKITA et al., 2001; COUTINHO et al., 2004; COUTINHO et al., 2006).
A freqüência e duração do estímulo mecânico realizado pela técnica de
alongamento são importantes fatores que podem influenciar nas respostas de
síntese ou degradação protéica, além da adaptação do tecido conjuntivo muscular.
Estudos desenvolvidos em nosso laboratório têm demonstrado que uma única
sessão semanal de alongamento não foi suficiente para prevenir a redução da
massa muscular e do número de sarcômeros em série (GOMES et al., 2004). Os
mesmos autores observaram que o alongamento muscular pode causar intenso
dano tecidual quando utilizado numa freqüência igual ou superior a uma vez na
semana por 40 minutos (GOMES et al., 2007). Alterações ultraestruturais
significativas relacionadas ao processo de tumefação celular e alta reatividade
celular foram observadas, representando processos de degeneração e/ou
regeneração desencadeados pelo alongamento (MATTIELLO-SVERZUT et al.,
2006, GOMES et al., 2007).
Mudanças no fenótipo e no trofismo dos tipos de fibras musculares podem ser
influenciada pela aplicação do alongamento. Programa de alongamento diário, após
imobilização, apresentou aumento significativo na quantidade de FTIIC, FTIIAD com
redução expressiva na proporção de FTIIA e FTIID no músculo sóleo de ratas
adultas (POLIZELLO, 2009). Por outro lado, o alongamento 2 vezes ao dia também
reduziu a quantidade de FTIID, enquanto a quantidade de FTIIA apresentou-se
aumentada quando comparada com aos animais submetidos à livre movimentação
(POLIZELLO, 2009). O aumento do diâmetro das FTI em músculos sóleo
previamente imobilizados foi possível com o alongamento mantido por 30 minutos e
aplicado seis vezes por semana durante três semanas consecutivas (OKITA et al.,
2001). Sessões diárias de alongamento pós-imobilização uma ou duas vezes ao dia,
aplicado no músculo sóleo de animais adultos, provocaram hipertrofia dos diferentes
tipos de fibras musculares (COUTINHO et al., 2006; POLIZELLO, 2009).
Há aproximadamente 30 anos, os efeitos do alongamento em músculos
encurtados vêm sendo estudados, porém alguns aspectos citoarquiteturais merecem
ainda melhor detalhamento científico, de forma a subsidiar, a escolha desse recurso
de modo seguro para a prática clínica terapêutica. Ainda, somam-se as dificuldades
encontradas na adoção da periodicidade da aplicação deste programa de
treinamento, quer seja durante a atividade física convencional, quer seja na
reabilitação física (WILLIAMS; GOLDSPINK, 1973; 1983; COUTINHO et al., 2004).
De acordo com os dados acima descritos, fica claro que os programas
terapêuticos do tipo alongamento e exercício excêntrico podem favorecer o
restabelecimento morfofuncional da musculatura esquelética após situações de
desuso. No entanto, até o presente momento, não existem relatos que confrontem
programas de alongamento com programas de exercício excêntrico após
imobilização dos membros posteriores de ratos.
Materiais e Métodos - 41
4
MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram utilizadas 42 ratas Wistar, fornecidas pelo Biotério Central da
Prefeitura do Campus de Ribeirão Preto – USP com 21 dias de idade, divididas em
gaiolas com quatro animais cada, permanecendo nas mesmas até completarem 81
dias de idade para início dos procedimentos. Os animais tiveram livre acesso à água
e à comida e as gaiolas foram higienizadas de acordo com os procedimentos do
laboratório.
4.2 Grupos experimentais
O organograma 1 ilustra os diferentes grupos de animais utilizados no
presente estudo. Todos os procedimentos tiveram início quando os animais
completaram 81 dias de idade. O procedimento de imobilização foi mantido durante
10 dias tanto no grupo somente imobilizado (n=6) quanto nos grupos posteriormente
reabilitados (protocolos de exercício excêntrico e alongamento mantido nos períodos
de 10 e 21 dias) (n=6). Além desses, o estudo contou com 3 grupos de animais
controles (n=3) que respeitaram a idade dos respectivos grupos tratados (GI –
91dias de idade; GITE(10) e GIAL(10) -101 dias de idade e GITE(21) e GIAL(21) 112 dias
de idade). Por fim, também foi incluído o grupo apenas anestesiado (n=3), os quais
receberam as mesmas dosagens de anestesia, nos mesmos, dias do grupo
imobilizado e alongado por 21 dias. Portanto, os grupos utilizados foram: Grupo
Imobilizado (GI); Grupo Controle do grupo imobilizado (GC(Imob)); Grupo Imobilizado
e Treinado Excentricamente por 10 dias (GITE(10)); Grupo Imobilizado e Alongado
por 10 dias (GIAL(10)); Grupo Controle 10 (GC(10)); Grupo Imobilizado e Treinado
Excentricamente por 21 dias (GITE(21)); Grupo Imobilizado e Alongado por 21 dias
(GIAL(21)); Grupo Controle 21 (GC(21)) e Grupo Anestesiado (GA).
Organograma 1 - Diferentes grupos experimentais.
Grupos
Experimentais
Controles
Imobilizado
Imobilizados e
Treinados em
esteira
Imobilizados e
Alongados
Anestesiado
GC(imob)
GI
GITE(10)
GIAL(10)
GA
GITE(21)
GIAL(21)
GC(10)
GC(21)
O organograma 2 representa o peso médio, em gramas, dos diferentes
grupos antes do início dos procedimentos.
Organograma 2 – Peso médio dos diferentes grupos com 81 dias de idade
GC(imob)
317g
GI
299g
GITE(10)
GIAL(10)
300g
294g
GC(10)
323g
GITE(21)
350.5g
GIAL(21)
346g
GC(21)
327g
GA
318g
4.3 Procedimentos experimentais
4.3.1 Técnica de Imobilização
Com os animais previamente anestesiados com Ketamina (95 mg/kg) e
Xylazina (12 mg/kg) intraperitoneal, foi realizado o encurtamento do músculo sóleo e
plantar através da imobilização da articulação tíbio-társica em flexão plantar máxima,
com auxílio de uma fita adesiva (WILLIAMS, 1988) (Figura 3)
Figura 3 - Imobilização da articulação tíbio-társica em flexão plantar
O modelo de imobilização do membro posterior direito dos animais utilizado
seguiu o modelo proposto por Coutinho et al., (2002). Este procedimento é
constituído por duas partes: parte superior, similar a uma camiseta de algodão, que
permite o animal movimentar livremente a cabeça e os membros superiores (Figura
4A) e, uma parte inferior, dividida em anterior e posterior, composta por uma malha
de aço que teve suas bordas envolvidas com fita adesiva para prevenir lesões no
corpo do animal (Figura 4B). Além disso, no compartimento anterior foi preenchida
com algodão para proteger a região anterior do membro. Em seguida, a parte inferior
foi unida à parte superior através de grampos. Após este procedimento, a camiseta
foi vestida no animal e o membro posterior direito foi imobilizado através da união
das partes anterior e posterior, fixadas com fita crepe.
Figura 4A e B - Modelo de imobilização Coutinho et al., (2002). A: Parte
superior, similar a uma camiseta de cotton. B: Parte inferior, dividida em anterior
e posterior.
Os animais permaneceram imobilizados por 10 dias consecutivos e
separados em número de 4 em gaiolas plásticas com livre acesso a água e ração. A
imobilização não impediu a alimentação e locomoção dos animais dentro da gaiola.
No assoalho da gaiola foi colocada serragem para higienização que foi trocada
diariamente.
4.3.2 Técnica de Treinamento em Esteira em Declive – Exercício Excêntrico
Após ficarem imobilizados por 10 dias, os animais do GITE (10) e GITE(21)
passaram por um período de 10 e 21 dias, respectivamente, de treinamento em
esteira em declive (Figura 5), seguindo o protocolo desenvolvido por Norman et al.
(2000). Neste, o período de exercício iniciou com 10 minutos diários de corrida. A
cada dia foi feito um acréscimo de 5 minutos até completar 40 minutos de
treinamento. Este aumento progressivo no período de treinamento é fundamental
para que o animal se adapte ao exercício e também para que não ocorra sobrecarga
nas estruturas óssea e muscular.
Tabela 1 - Esquema de dias e periodização do treinamento.
Norman et al. (2000)
Dias
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Perí
Período de
Treinamento
(minutos)
-
10
15
20
-
25
30
35
-
40
40
40
*
-
40
40
40
-
40
40
40
-
40
*
Último dia
Imobilização
Descanso
* Sacrifício
dos animais
A velocidade média da esteira foi de 17 m/min com inclinação descendente
de 16 graus (TAKEKURA et al., 2001; HAYWARD et al., 1999; LYNN; MORGAN,
1994; ARMSTRONG et al., 1983). Os animais realizaram este protocolo de
treinamento ao longo de 10 e 21 dias, tendo 3 dias consecutivos de treino, seguido
por 1 dia de descanso. Segundo Norman et al. (2000), o objetivo deste intervalo é
para reduzir o estresse dos animais e prevenir o excesso de treinamento,
“overtraining”.
Figura 5 – Esteira motorizada para ratos da marca Insight  modelo EP-131 com declinação de 16º. Fonte: Cornachione A,
2007.
4.3.3 Técnica de Alongamento Mantido
Posterior ao procedimento de imobilização, os animais dos grupos GIAL (10) e
GIAL(21) passaram por um período de 10 e 21 dias, respectivamente, de
alongamento mantido respeitando os dias, o tempo e o intervalo determinados no
treinamento em esteira.
A técnica de alongamento mantido, para os músculos sóleo e plantar, foi
realizada no membro posterior direito das ratas (Figura 6). A articulação do tornozelo
foi fixada em flexão dorsal máxima por uma fita adesiva (GOMES et al., 2007). Para
a realização do alongamento, os animais foram previamente anestesiados com
Ketamina (95 mg/kg) e Xilazina (12 mg/kg) via intraperitonial. Os animais do grupo
GA foram apenas anestesiados paralelamente com os animais do GIAL (21) para
verificar possíveis efeitos do anestésico sobre a musculatura analisada.
Figura 6 - Membro posterior direito em flexão dorsal máxima,
mantida por uma fita adesiva (seta).
4.3.4 Processamentos dos Fragmentos musculares
Obtenção dos Músculos
Após o período de experimento, os animais foram pesados e eutanasiados
com overdose anestésica. Foi realizada uma incisão distal na tíbia do membro
posterior direito, próxima à articulação do tornozelo, de forma a expor os músculos
sóleo e plantar. A partir dessa exposição, foram dissecados os músculos e retirado
os fragmentos para criotomia e microtomia (Figura 7A, B e C). Para realização da
criotomia, os fragmentos foram envolvidos em talco, congelados em nitrogênio
líquido e estocados em um freezer à –80ºC até o processamento do material. Já
para a microtomia, os fragmentos foram fixados em formol a 3,7% em tampão
fosfato salino (PBS) por 24 horas.
Figura 7 A-C – A- Exposição e dissecação do músculo sóleo (seta preta); B- Exposição e
dissecação do músculo plantar (seta branca); C- Retirada de um fragmento da porção média
(ventre muscular) do músculo sóleo.
Processamento Histológico
Os fragmentos musculares de todos os animais dos grupos experimentais
foram seccionados em cortes transversos com Criótomo Leica CM 1850 UV a uma
temperatura de -25ºC. Os cortes tiveram espessura de 5m, colhidos em lamínulas
de 24x32 mm.
O processamento teve a seguinte metodologia: colorações de HematoxilinaEosina (HE) para análise dos aspectos morfológicos gerais, tais como: centralização
nuclear, basofilía, necrose, fibras lobuladas entre outros; Tricrômico de Gomori –
Modificado para identificação de fibras em alvo e alterações do tecido conjuntivo, e
reações histoenzimológicas: Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzido
Tetrazolium Redutase (NADH2-TR) para análise da atividade enzimática e
identificação de fibras em alvo; Naftol AS-BI Fosfatase (NASBI-PA) para
identificação de lesão a nível lisossomal (fosfatase ácida – positividade focal); e
Adenosina Trifosfatase Miofibrilar (mATPase) incubadas em meios ácidos e alcalinos
com os seguintes valores de pH:

Sóleo: valores de pH – 9.4; 4.6; 4.3

Plantar: valores de pH – 10.4; 4.6; 4.3
Esta última reação foi realizada para identificação e mensuração dos diferentes tipos
de fibras.
As reações descritas foram desenvolvidas no Laboratório de Neuropatologia
do Departamento de Patologia da FMRP-USP seguindo a rotina de processamento
de músculo esquelético deste laboratório.
Processamentos Imuno-histoquímicos para Capilares, Colágenos Tipo I e Tipo
III e Desmina
Os fragmentos foram seccionados (para obtenção de cortes transversos) em
Criótomo Leica CM 1850 UV a uma temperatura de –25º C. Foram obtidos cortes
com espessura de 5m que foram colhidos em lâminas 26x76mm. A técnica,
realizada no Laboratório de Neuropatologia do Departamento de Patologia da
FMRP-USP, contou com aplicação dos anticorpos mouse anti-rat CD31 (Serotec),
mouse anti-rat collagen type I e type III (Sigma) e monoclonal mouse anti-human
desmin (Dako). As lâminas foram fixadas em acetona gelada por 10 minutos,
lavadas com PBS e incubadas em solução a 1% H2O2 por 15 minutos para bloqueio
da peroxidase endógena. As lâminas foram novamente lavadas e em seguida foi
realizado o bloqueio de ligações inespecíficas com Soro Albumina Bovina (BSA) 2%
e Soro Normal de Cabra (S-1000 - Vector) por 20 minutos. Os excessos de líquido
foram removidos e as amostras foram incubadas com os anticorpos primários mouse
anti-rat CD31 (1:6000), mouse anti-rat collagen type I (1:18000), mouse anti-rat
collagen type III (1:36000) e monoclonal mouse anti-human desmin (Dako) (1:100) à
4º C “overnight”. Foi feito um controle negativo (blank), onde não foi gotejado o
anticorpo primário no tecido. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas em Tampão
Tris Salino com Tween 20 (TBST) por 9 minutos e incubadas com o anticorpo
secundário do kit LSAB2-HRP durante 30 minutos Seguiu lavagem e incubação com
o link Streptavidina Peroxidase no escuro por 10 minutos, após esse procedimento
foi realizada nova lavagem com TBST e TRIS-HCl para incubação do cromógeno
DAB, durante 5 minutos. Seguiu lavagem em água destilada, contracoração com
Hematoxilina por 10 segundos, desidratação e diafanização e por fim a montagem
em Permount (Fisher).
*O anticorpo para a desmina foi aplicado para confirmar a identificação e
classificação das fibras em alvo.
Processamento para Microscopia Óptica de Alta Resolução (MOAR)
Após 24 horas de fixação em formol 3,7%, os fragmentos dos músculos sóleo
e plantar foram desidratados em soluções crescentes de álcool (70%, 95% e 100%,
2 trocas 1 hora cada), passaram pela solução pré-infiltradora (24 horas) em
geladeira, solução infiltradora “overnight” e incluídos em resina. (Historesin® - Leica
Instruments GmbH, Heidelberg, Alemanha). Os fragmentos foram deixados por pelo
menos 24 horas em estufa a 60°C para o endurecimento da resina. Foram
realizados cortes de 2.5 μm (transversais – grupos controles e longitudinais – grupos
tratados) em micrótomo Sorvall JB4-A (DuPont Company, Newtown, CT, EUA),
estirados em banho-maria à temperatura ambiente. Em seguida foram colocados em
lâminas 26x76mm e secos em platina aquecedora a 55-60ºC. Logo após, os cortes
foram corados com Azul de Toluidina para análise em Microscópio de Luz (Leica DM
2500).
Processamento Bioquímico – Eletroforese para cadeia pesada da miosina
A amostra dos fragmentos para análise bioquímica foi feita a partir da coleta
de 20 a 30 cortes de cada músculo colhidos em eppendorf. Aos cortes foram
acrescentados 450L do seguinte meio: 10% (w/v) glicerol, 5% (v/v) 2
mercaptoetanol e 2,3% (w/v) dodecilsulfato de sódio (SDS) em 62,5 mM de tampão
Tris/HCL (pH 6,8). Os cortes foram agitados durante um minuto e aquecidos por 10
minutos em banho maria a 60ºC. Em seguida pequenas porções do extrato (5-7 l)
foram submetidas à eletroforese em gel (gradiente de 7-10%) de poliacrilamida com
24-30 horas de corrida a 120 V. Ao término do experimento, os géis foram corados
com Coomassie Blue e depois submetidos à descoloração progressiva, mantendo-se
somente a marcação das proteínas.
4.3.5
Estudo Morfológico
A análise qualitativa das lâminas foi feita em Microscópio de Luz Leica DM
2500. Os aspectos morfológicos gerais do tecido muscular foram avaliados através
da coloração H.E., Tricrômico de Gomori-Modificado e Azul de Toluidina e também
pelas reações enzimáticas SDH, NADH2-TR e NAS-BI-PA. Os subtipos específicos
de fibras dos diferentes músculos foram classificados pela reação mATPase.
4.3.6 Estudo Morfométrico
Análise morfométrica foi realizada com auxílio do software QualiView –
Atonus cujas imagens foram capturadas a partir do microscópio óptico Leica DM
2500 pela câmera de vídeo digital Leica DFC 300FX, conectada a um
microcomputador. A análise das diferentes bandas da cadeia pesada da miosina foi
utilizado o software “Kodak Digital Science 1D” para fotografar o gel e visualizar a
expressão das diferentes bandas da cadeia pesada da miosina. A análise
densitométrica das bandas foi realizada usando o software de imagem GeneTools
v3.06 software (Syngene, Cambridge, UK).
Análise de Proporção
Para obter a proporção dos diferentes tipos de fibras dos músculos, sóleo e
plantar, foram colhidas imagens de 3 campos aleatórios (objetiva de 20X) dos cortes
de cada animal, processado pela mATPase. A análise de proporção dos músculos
sóleo e plantar foi realizada principalmente a partir de lâminas incubadas em meio
ácido com valor de pH 4.6, pois neste valor de pH é possível identificar o maior
espectro de cores dos diferentes tipos de fibras. Contudo, para confirmar a
classificação de alguns tipos de fibras foi utilizado os pH nos valores 9.4 e 4.3, para
o músculo sóleo, e 10.4 e 4.3, para o músculo plantar.
Diferentes tipos de fibras analisadas no músculo sóleo
Foram quantificadas, no pH 4.6, as fibras puras - FTI (cor escura); FTIIA (cor
clara) e fibras intermediárias/híbridas - FTIIC (cor intermediária escura) e FTIIAD
(cor intermediária clara). Para confirmar a classificação das fibras FTIIC e FTIIAD, foi
utilizado o valor de pH 4.3 que demonstra de forma clara a marcação deste tipo de
fibra no músculo sóleo, onde as FTIIC apresentam coloração intermediária clara e as
FTIIAD apresentam-se claras.
Diferentes tipos de fibras analisadas na porção profunda do músculo plantar
Foi escolhida a porção profunda do músculo porque nela é possível identificar
todos os tipos de fibras. Foram quantificadas, no pH 4.6, as fibras puras – FTI (cor
escura); FTIIA (cor clara); FTIID (cor intermediária clara); FTIIB (cor intermediária
clara) e fibras intermediárias/híbrida – FTIIC (cor intermediária escura). Para
confirmar a classificação da FTIIC foi utilizado o valor de pH 4.3, enquanto para
confirmar a classificação das FTIID e FTIIB foi utilizado o valor de pH 10.4, no qual
as FTIID apresentam coloração escura e as FTIIB coloração intermediária escura.
Diâmetro Menor
A escolha pela medida do diâmetro menor foi feita para evitar possíveis
distorções conseqüentes ao seccionamento transverso imperfeito da amostra. A
mensuração das fibras foi feita com o mesmo material e software utilizado para a
análise da proporção (mATPase), avaliando-se o diâmetro menor dos diferentes
tipos de fibras, como descrito anteriormente, num total de 200 fibras colhidas em 3
campos aleatórios (mínimo) dos cortes de cada animal.
Relação Capilar/Fibras
Utilizando imunomarcação pelo anticorpo CD31, a partir de imagens colhidas
em 5 campos aleatórios das lâminas dos músculos sóleo e plantar, foram contados
capilares transversais e fibras musculares dos grupos.
Análise semi-quantitativa para os colágenos do tipo I e III
Análise semi-quantitativa da imunomarcação dos colágenos do tipo I e III foi
feita em Microscópio de Luz Leica DM 2500, por dois examinadores independentes,
dos grupos aqui estudados. Na análise foi utilizada a classificação descrita por
Kurose et al. (2006) levando em conta a reatividade dos mesmos: (-) negativo; (±)
ligeiramente positivo; (+) fracamente positivo; (++) moderadamente positivo; (+++)
fortemente positivo.
4.3.7
Análise Estatística
A estatística referente ao diâmetro menor, proporção de fibras e relação
capilar/fibra dos músculos sóleo e plantar de cada animal foi realizada entre os
grupos utilizando o Modelo Linear de Efeitos Mistos, com nível de significância de
5% (α=5%) e um intervalo de confiança de 95% (IC=95%), usando PROC MIXED do
programa SAS versão 9.2.
A seguir, os itens resultados e discussão serão apresentados considerando
os objetivos propostos neste projeto de pesquisa a partir da divisão dos grupos em
experimentos descritos na página 25.
Resultados Experimento 1 - 53
5
RESULTADOS EXPERIMENTO 1
5.1 Morfologia
Histoenzimologia e Histologia Básica
Aos cortes transversais, as fibras dos músculos sóleo e plantar dos grupos
controle apresentaram contornos poligonais e núcleos situados na periferia.
Pela análise detalhada das lâminas do músculo sóleo coradas em HE, foram
observadas fibras lobuladas e fibras com núcleos centralizados (50%) nos animais
do GI. Pôde-se constatar também que 33% dos fragmentos dos animais
apresentaram basofilia e 66% variação no tamanho das fibras (Tabela 2 e Figura
8d). Através da reação NASBI-PA foi observado aumento da fosfatase ácida pela
positividade focal em todos os animais do GI. Em 100% dos animais do grupo
imobilizado também foi observado, nas colorações H.E, Tricrômico de Gomori e
reações histoenzimológicas mATPase, NADH2-TR e NASBI-PAS, alteração do tipo
fibras em alvo (target fibers). Essa alteração também foi identificada e confirmada na
análise qualitativa das lâminas processadas pelo anticorpo desmina (Figura 9a, b, c,
d). Nos alvos das fibras foi possível observar aumento da imunoreatividade para
desmina.
Tabela 2 – Alterações morfológicas das fibras do músculo sóleo identificadas pelas colorações e
reações histoenzimológicas nos diferentes grupos do experimento 1.
Alterações Morfológicas
GI
GC(imob)
GITE(10)
GC(10)
GITE(21)
GC(21)
Centralização Nuclear
50%
66%*
100%
33%*
83%*
-
Fragmentação
17%*
-
50%
-
17%*
-
Variação de Tamanho
66%
-
83%
-
33%*
-
Halo Basofílico
-
-
83%
-
33%*
-
Necrose
33%*
33%*
17%
-
-
-
Fibras Lobuladas
33%
-
83%
-
-
-
Área de rarefação citoplasmática
83%
-
-
-
-
-
Fibras Basofílicas
-
-
33%
-
-
-
Aumento da Fosfatase Ácida
100%
100%*
100%
100%*
50%
17%*
Fibras em alvo
100%
-
100%
-
17%*
-
% Referencia o número de ratas que apresentaram a anomalia no grupo
* Menos de 5% de células
GC(imob)
GI
GITE(10)
GITE(21)
Figura 8 – Fotomicrografias do músculo sóleo nas colorações hematoxilina-eosina (a, d, g, j – cortes
transversais) e azul de toluidina (b - corte transversal, e, h, k – cortes longitudinais) e na reação
histoenzimológica para mATPase pH 4.6 (c, f, i, l – cortes transversais). a,b,c – fibras poliédricas com núcleos
na periferia (Barras: 45,4m); d – variação no tamanho das fibras, fibras lobuladas (seta grossa), centralização
nuclear (seta fina) e fibras em alvo (*) com basofilía no centro (Barra: 28,4m); e – fibras em alvo (*) e perda das
estriações transversais () (Barra: 27,4m); f – fibras em alvo (*) (Barra: 24,8m); g - grande variação no
tamanho das fibras, fibras lobuladas (setas grossas) e muitos núcleos centralizados (setas finas) (Barra: 21,2m);
h – centralização nuclear (seta fina), rarefação citoplasmática (cabeça seta) e fibra com vacuolização (círculo)
(Barra: 23,6m). i – fibras em alvo (*) (Barra: 28,3m); j- fibras poliédricas com núcleos na periferia (Barra:
42,9m); k – áreas de fusão entre duas extremidades “cicatriz” (setas vazias); l - não apresentaram alterações
significativas (Barras: 43,9m).
Figura 9 – Fotomicrografias, do músculo
sóleo, do GI. a - Coloração de Tricrômico de
Gomori-Modificado;
b
–
reação
histoenzimológica para mATPase pH 4.6; c –
reação histoenzimológica NADH2-TR; d –
reação histoenzimológica NASBI-PA; e –
reação imuno-histoquímica para desmina
(Barras: 24,8m – aumento de 40x). Observe
a presença de fibras em alvo nas diferentes
reações (setas).
No músculo plantar, desse mesmo grupo (GI), não foi identificado alterações
relevantes na coloração HE (Figura 10d).
No músculo sóleo do GITE(10), muitas amostras, coradas em HE,
apresentaram variação no tamanho das fibras, fibras lobuladas, centralização
nuclear, halo basofílico e fibras em fragmentação (Figura 8g). Fibras em alvo foram
observadas em 100% dos animais deste grupo, porém o alvo mostrou-se reduzido
quando comparado ao GI (Figuras 8f e 8i). Por outro lado, poucas foram as
alterações observadas para o GITE(21) para este mesmo músculo (Tabela 2 e Figura
8j).
Para o músculo plantar, não foi observado alterações significativas para
ambos os grupos reabilitados (Figura 10g e 10j).
GC(imob)
GI
GITE(10)
GITE(21)
Figura 10 – Fotomicrografias do músculo plantar nas colorações hematoxilina-eosina (a, d, g, j – cortes
transversais) e azul de toluidina (b – corte transversal, e, h, k – cortes longitudinais) e na reação
na periferia (Barras: 36,8m); d – fibras sem alterações (Barra: 26,4m); e – fibras com estriações transvesais
normais e nucleos na periferia (Barra: 26,4m); f – predomínio de FTIID (Barra: 24,8m); g – sem alterações
(Barra: 33,1m); h – citoarquitetura normal da fibras em corte longitudinal (Barra: 32,1m). i – sem alterações
(Barra: 33,4m); j- fibras poliédricas com núcleos na periferia (Barra: 32,8m); k – sem alterações (Barra:
32,7m); l - não apresentaram alterações relevantes (Barras: 35,8m).
Microscopia Óptica de Alta Resolução
As fibras musculares analisadas, referentes aos grupos controles dos
músculos
sóleo
e
plantar,
mostraram
em
cortes
transversais
contornos
arredondados ou poligonais e núcleos situados na periferia, como mostra a Figura
8b e 10b.
Após
o
procedimento
de
desuso
foram
observadas
alterações
citoarquiteturais importantes no músculo sóleo de todos os animais imobilizados. As
mais
relevantes
foram:
centralização
nuclear,
fibras
em
alvo,
rarefação
citoplasmática e perda das estriações transversais (Figura 8e).
O procedimento de remobilização, realizado no período de 10 dias, mostrou
intensificar algumas das alterações previamente determinadas pelo desuso e ainda,
determinou lesões degenerativas do tipo vacuolização no músculo sóleo (Figura 8h).
Com a manutenção do estímulo, exercício excêntrico por 21 dias, o músculo sóleo
mostrou morfologia adequada, com possíveis áreas de fusão entre duas
extremidades de uma mesma fibra “cicatriz” (Figura 8k).
Na analise morfológica realizada a partir da técnica de MOAR, o músculo
plantar não mostrou comprometimentos significativos tanto após o procedimento de
desuso quanto aos de reabilitação (Figura 10e, 10h e 10k).
5.2 Morfometria
5.2.1 Proporção de Fibras e Expressão dos Diferentes Tipos de MHC
Na Figura 11 é possível observar as diferenças entre as médias obtidas para
proporção de fibras entre os diferentes grupos analisados no experimento 1.
A imobilização determinou redução no número das FTI do músculo sóleo (GCI
vs GI, p<0.01) e significativo aumento das FTIIC (GCI vs GI, p<0.01). As fibras do
tipo IIA e IIAD não apresentaram alterações proporcionais significativas frente ao
procedimento de desuso (GCI vs GI, p≥0.05) (Figura 11). Frente à expressão da
MHC a imobilização reduziu tanto a MHCI quanto da MHCIIa no sóleo (Figura 12).
Os dois programas de exercício excêntrico, 10 e 21 dias, aplicados após
período de imobilização determinaram aumento no número das FTI do músculo
sóleo. O treinamento excêntrico realizado durante 10 dias induziu aumento no
número das FTI correspondente ao valor do grupo controle (GC (10) vs GITE(10),
p=0.47), já com a manutenção do estímulo excêntrico durante 21 dias, foi possível
observar aumento proporcional dos valores de FTI superior aos valores de referência
(GC(21) vs GITE(21), p<0.01).
Para as fibras do tipo IIC e IIA o exercício excêntrico realizado durante 10 dias
reduziu significativamente essa proporção quando comparado ao GI (GI vs GITE(10),
p<0.01), sendo que as FTIIA apresentaram valores inferiores ao respectivo controle
(GC(10) vs GITE(10), p<0.01) enquanto as FTIIC não alcançaram os valores de
referência (GC(10) vs GITE(10), p<0.01), apresentando valores superiores ao mesmo.
Já o protocolo aplicado durante 21 dias mostrou reduzir o número das FTIIC e FTIIA
quando comparado ao grupo imobilizado (GI vs GITE(21), p<0.01), onde as FTIIA
mantiveram-se proporcionalmente inferiores ao grupo controle (GC(21) vs GITE(21),
p<0.01) e as FTIIC atingiram os valores de base (GC(21) vs GITE(21), p=0.71).
As FTIIAD não mostram ser afetadas tanto pelo procedimento de desuso
quanto pelos procedimentos de remobilização.
Ambos os programas de exercício excêntrico (10 e 21 dias) aumentaram a
expressão da MHCI e IIa, no músculo sóleo, quando comparado ao GI, porém,
apenas 21 dias de treinamento mostrou valores similares ao grupo controle (Figura
12).
100%
80%
6.13%
1.48%
4.30%
26.83%
21.13%
0.12%
0.94%
20.82%

28.02%
9.07%
28.99%


3.69%
2.25%
60%
14.12% *
40%
70.32%
20%
4.12%

33.79%
2.83%
1.35%

65.48%
75.39%  

63.82%
63.18%
51.71% *
0%
GI
GCimob
GITE(10)
FTI
FTIIC
GC(10)
FTIIA
GITE(21)
GC(21)
FTIIAD
Figura 11 – Porcentagem das médias de FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD do músculo sóleo em
diferentes grupos analisados do Experimento 1.*p<0.01 comparado com GC(Imob); p< 0.01
comparado com GI; p<0.01 comparado com GC(10);.p<0.01 comparado com GC(21).
A
B
Figura 12 – A – Foto do gel de poliacrilamida apresentando as
diferentes bandas da MHC do músculo sóleo. B – Análise quantitativa
da expressão das bandas da MHCI e MHCIIa em unidade arbitrária do
músculo sóleo do experimento
1.
Para o músculo
plantar a imobilização determinou aumento das FTIID
concomitante à redução do número das fibras do tipo FTIIB (Figura 13). Após o
treinamento de 10 dias foi observado aumento no número das FTI e FTIID (GI vs
GITE(10), p<0.01), onde esta última manteve valores acima aos de referência (GC(10)
vs GITE(10), p<0.01), e redução do número das FTIIA e FTIIB (GI vs GITE(10),
p<0.02), quando comparadas ao grupo imobilizado. Já o treinamento de 21 dias
mostrou aumentar significativamente a proporção de FTI e FTIID apenas comparado
ao grupo imobilizado (Figura 13).
Para a expressão da MHC a imobilização determinou aumento da expressão
da MHCIIa e IId enquanto, os treinamentos excêntricos de 10 e 21 dias reduziram a
expressão dessas bandas, quando comparadas ao GI, apresentando assim, valores
próximos aos grupos controles (Figura 14).
100%
9.66% *
1.02%

2.05%
3.44%
18.76%
80%
60%
57.02%
59.18%
24.37%
23.69%
0.56%
0.07%
2.80%
13.88% 
16.47%
14.24%
GC(10)
GITE(21)
62.92%  
54.98% *

57.78%
49.56%
40%
20%
0%
25.56%
21.60%
22.82%
0.44%
9.33%
0.16%
8.68%
GI
GCimob
FTI
GITE(10)
FTIIC
FTIIA
26.71%

FTIID

0.35%
11.70%
GC(21)
FTIIB
Figura 13 – Porcentagem das médias de FTI, FTIIC, FTIIA, FTIID e FTIIB do músculo
plantar em diferentes grupos analisados no experimento 1.* p< 0.01 comparado com
GC(imob); p< 0.02 comparado com GI; p< 0.03 comparado com GC(10).
A
B
diferentes bandas da MHC do músculo plantar. B – Análise quantitativa
da expressão das bandas da MHCI, MHCIIa e MHCIId em unidade
arbitrária do músculo plantar do experimento 1.
5.2.2 Diâmetro Menor
A imobilização determinou redução significativa do diâmetro menor tanto das
FTI, FTIIA e FTIIAD do músculo sóleo como das FTI, FTIIC, FTIIA e FTIID do
músculo plantar (GC(imob) vs GI, p<0.01). As FIIC e as FTIIB mostraram não ser
afetadas pelo procedimento de imobilização no sóleo e no plantar, respectivamente
(GC(imob) vs GI, p=0.07; p=0.22) (Tabela 3 e 4).
Os protocolos de treinamento excêntrico, 10 e 21 dias, mostraram aumentar o
diâmetro menor das FTIIA e FTIIAD após procedimento de desuso, no músculo
sóleo, (GI vs GITE(10); GI vs GITE(21), p<0.03) recuperando assim, os valores de
referência apresentados pelos respectivos controles (GC(10) vs GITE(10); GC(21) vs
GITE(21), p>0.05). As FTI não apresentaram aumento do diâmetro em relação ao
grupo imobilizado após o treinamento excêntrico de 10 dias (GI vs GITE(10), p=0.06).
Por outro lado, o treinamento realizado durante 21 dias aumentou significativamente
o diâmetro das mesmas quando comparado ao grupo imobilizado (GI vs GITE(21),
p=0.01), apresentando valores equitativos ao GC(21) (GC(21) vs GITE(21), p=19)
(Tabela 3).
Tabela 3 - Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD com os respectivos intervalos
de confiança de 95% do músculo sóleo dos diferentes grupos estudados no experimento 1.
GI
GC(Imob)
GITE(10)
GC(10)
GITE(21)
GC(21)
FTI
36.04*
(33 – 39)
47.51
(43 – 52)
40.52
(37 – 44)
46.77
(42 – 51)
41.96
(39 – 45)
45.81
(41 – 50.5)
FTIIC
29.37
(26 – 33)
36.64
(29 – 44)
37.18
(33.5 – 41)
40.53
(34 – 47)
35.96
(32 – 40)
36.97
(31 – 42.5)
FTIIA
30.78*
(27 – 34)
37.97
(33 – 43)
42.20
(39 – 46)
40.43
(36 – 45)
39.52
(36 – 43)
39.06
(34 – 44)
FTIIAD
29.12*
(25 – 33)
39.62
(33 – 46)
39.51
(35 – 43.5)
55.64
(39 – 72)
35.92
(31 – 41)
36.35
(31 – 42)
* p< 0.01 comparado com GC(imob);  p<0.02 comparado com GI;  p<0.03 comparado com GC(10).
Para o músculo plantar, foi observado aumento satisfatório no diâmetro menor
das FTIIC, FTIIA e FTIID após os treinamentos excêntricos de 10 e 21 dias,
alcançando os respectivos valores de referência (GC(imob) vs GITE(10); GC(imob) vs
GITE(21), p>0.05) (Tabela 4). Para as FTI, 10 dias não foram suficientes para retomar
as condições controle (GC(imob) vs GITE(10), p<0.01), por outro lado, 21 dias
alcançaram valores similares ao respectivo controle para este tipo de fibra (GC(imob)
vs GITE(21), p=0.97). Já para as FTIIB, foi observada redução no diâmetro após 10
dias de exercício excêntrico (GC(imob) vs GITE(10), p<0.01). As mesmas não foram
observadas na porção profunda do músculo plantar no GITE(21) (Tabela 4).
Tabela 4 - Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA, FTIID e FTIIB com os respectivos
intervalos de confiança de 95% de o músculo plantar dos diferentes grupos estudados no
experimento 1.
GI
GC(Imob)
GITE(10)
GC(10)
GITE(21)
GC(21)
FTI
26.92*
(24 – 29)
36.22
(33 – 40)
32.29 
(30 – 35)
39.26
(36 – 42.5)
36.78
(34 – 39)
36.70
(33 – 40)
FTIIC
18.75*
(13 – 24)
37.14
(29 – 46)
32.66
(28.5 – 37)
38.57
(27 – 50)
33.46
(31 – 36)
34.24
(26 – 43)
FTIIA
27.22*
(25 – 29.5)
32.55
(29 – 36)
33.85
(31.5 – 36)
34.56
(31 – 38)
34.69
(32 – 37)
33.51
(30 – 37)
FTIID
32.86*
(30.5 – 35)
38.94
(36 – 42)
37.74
(35 – 40)
40.92
(38 – 44)
38.07
(36 – 40)
37.71
(34 – 41)
FTIIB
39.26
(37 – 42)
41.88
(38.5 – 45)
40.93
(38 – 44)
47.52
(43 – 52)
–
40.05
(36 – 44)
5.2.3 Relação Capilar/fibra
O procedimento de imobilização determinou no músculo sóleo acometimento
significativo na rC/F. Na Tabela 5, pode ser observado que o grupo imobilizado
apresentou redução do número de capilares por fibra quando comparado ao GC (Imob)
(GC(Imob) vs GI, p<0.01). O treinamento em esteira em declive durante 21 dias
mostrou aumentar significativamente os valores da rC/F, após o procedimento de
imobilização (GI vs GITE(21), p<0.01), alcançando assim os valores do GC(21) (GC(21)
vs GITE(21), p= 0.76). Por outro lado, o treinamento realizado durante 10 dias não
mostrou recuperar esta relação (GI vs GITE(10), p=0.27), mantendo seus valores
significativamente inferiores ao seu controle (GC(10) vs GITE(10), p= 0.01) (Tabela 5).
Ao considerar a rC/F para o músculo plantar, observou-se que as alterações
resultantes do procedimento de imobilização não foram relevantes. A imobilização
mostrou não afetar diretamente a rC/F (GC(Imob) vs GI, p=0.09). No quesito
reabilitação, o único procedimento que mostrou alterar a rC/F foi o treinamento de 21
dias em esteira em declive. Este grupo apresentou aumento significativo da rC/F
quando comparado ao GI e ao GITE(10) (GI vs GITE(21), p=0.05 e GITE(10) vs GITE(21),
p= 0.03) (Tabela 5).
Tabela 5 - Médias da relação capilar/fibra com os respectivos intervalos de confiança de 95% dos
músculos sóleo e plantar dos diferentes grupos estudados no experimento 1.
Sóleo
Plantar
GI
GC(Imob)
GITE(10)
GC(10)
GITE(21)
GC(21)
2.04*
2.43
2.16
2.49
2.34
2.38
(1.8 – 2)
(2 – 3)
(2 – 2.3)
(2.3 – 2.7)
(2 – 2.5)
(2.2 – 2.6)
1.50
1.72
1.48
1.65
1.72  
1.58
(1.5 – 2)
(1.4 – 2)
(1.5 - 3)
(1.5 – 2)
(1.3 – 2)
(1.3 - 2)
* p< 0.01 comparado com GC(imob); p<0.02 comparado com GI; p<0.03 comparado com GC(10); p<0.03 comparado com
GITE(10).
5.3 Colágenos tipo I e tipo III
Considerando o procedimento imuno-histoquímico adotado nos cortes dos
fragmentos dos músculos sóleo e plantar, foram observadas alterações na
reatividade para os colágenos I e III.
Pela análise detalhada das lâminas dos músculo sóleo e plantar foi
observado, aumento significativo da expressão dos colágenos do tipo I e do tipo III
nos animais submetidos ao procedimento de imobilização quando comparados aos
animais do grupo controle (GC(Imob)) (Tabela 6 e Figuras 15b, 15f, 16b e 16f).
Tabela 6 – Análise semi-quantitativa da expressão dos colágenos tipos I e III nos músculos Sóleo e
Plantar para os diferentes grupos analisados no Experimento 1.
Colágeno Tipo I
Colágeno Tipo III
Grupos
Sóleo
Plantar
Sóleo
Plantar
GI
+++
++
+++
+++
GC(Imob)
+
±
++
++
GITE(10)
+++
±
+++
++
GC(10)
+
±
+
++
GITE(21)
+
+
++
++
GC(21)
+
+
++
++
(-) negativo; (±) ligeiramente positivo; (+) fracamente positivo; (++) moderadamente positivo; (+++) fortemente positivo
GC(imob)
GI
GITE(10)
GITE(21)
Figura 15 – Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo (a-d) e plantar (e-h) demonstrando a
expressão do colágeno tipo I através da imunomarcação pelo método imuno-histoquímico. a, e imunomarcação do colágeno tipo I sem alterações (Barras= 74m); b, f – observe aumento da
expressão do colágeno I (Barras= 65;100m, respectivamente); c, g – aumento da expressão é
observada no músculo sóleo e nenhuma alteração para o plantar (Barras= 65;100m,
respectivamente); d,h – imunomarcação do colágeno tipo I (Barras= 76m).
O programa de corrida em esteira em declive por 10 dias mostrou manter a
expressão aumentada, previamente determinada pela imobilização, em ambos os
tipos de colágenos no músculo sóleo (Tabela 6 e Figuras 15c e 16c). Com a
manutenção do estímulo excêntrico, por 21 dias, a expressão dos colágenos
mostrou-se similares ao GC(21) (Tabela 6 e Figuras 15d e 164d).
Em contrapartida, o músculo plantar mostrou alcançar as características dos
grupos controles, para os dois tipos de colágeno, já no menor período de
treinamento excêntrico (10 dias) (Tabela 6 e Figuras 15g e 16g). Vinte dias
mostraram imunoreatividade adequada para ambos os colágenos neste mesmo
músculo (Tabela 6 e Figuras 15h e 16h).
GC(imob)
GI
GITE(10)
GITE(21)
Figura 16 – Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo (a-d) e plantar (e-h) demonstrando a
expressão do colágeno tipo III através da imunomarcação pelo método imuno-histoquímico. a, e imunomarcação do colágeno tipo III sem alterações (Barras= 88m); b, f – aumento da expressão do
colágeno III Barras= 65; 80m); c, g – observe aumento da expressão do colágeno no músculo sóleo e
nenhuma alteração para o plantar (Barras= 65;100m, respectivamente) d,h – imunomarcação do
colágeno tipo III (Barra= 94; 75m, respectivamente).
Discussão Experimento 1 - 69
6
DISCUSSÃO EXPERIMENTO 1
6.1 Morfologia
O desuso por tempo prolongado induz uma rápida e profunda transformação
na arquitetura e na histoquímica das fibras dos músculos esqueléticos,
principalmente em músculos predominantemente lentos, aqueles classificados como
posturais. Kannus et al. (1998a, b) observaram que essas alterações patológicas
induzidas pela hipocinesia poderiam ser reversíveis com a remobilização associada
ao treinamento físico (corrida esteira).
No presente estudo, alterações de caráter degenerativo/regenerativo como
centralização nuclear e fibras em alvo foram observadas no músculo sóleo dos
animais submetidos à imobilização. A centralização nuclear observada pode
representar maturação de fibras musculares recém reparadas, onde é sabido ocorrer
esse processo através da ativação de células precursoras da miogênese (células
satélites) que irão proliferar-se e diferenciarem-se para depois se fundirem as
miofibras lesadas. Após o processo de fusão, a miofibra regenerada apresentará
núcleos centralizados, oriundos das células satélites, os quais mais tarde migrarão
para periferia da fibra (ITAI; KARIYA; HOSHINO 2004; HAWKE; GARRY, 2001).
As fibras em alvo podem ser facilmente confundidas com lesão tipo central
core, já que ambas apresentam áreas hipocrômicas no centro das células na reação
histoenzimológica
para
mATPase
e
NADH2-TR.
Contudo,
tais
alterações
morfológicas apresentam diferenças marcantes. Os conhecidos cores, comumente
observados na doença de central core, são caracterizados pela ausência de
desmina enquanto as fibras em alvo apresentam aumento na concentração da
mesma sugerindo assim, processo de regeneração das fibras musculares
(FELLENBERG; LIN; BURGUNDER, 2003; KAMIÑSKA; SZYLUK, 1996). Nossos
achados para desmina nas lâminas processadas pela
imuno-histoquímica
mostraram corroborar com os resultados científicos supracitados.
Na literatura científica achados morfológicos, para fibras em alvo, como
“manchas avermelhadas” no centro da célula e padrão de manchas irregulares com
ausência de tingimento central, são observados na reação de coloração Tricrômico
de Gomori-Modificado e na reação para mATPase, respectivamente (FELLENBERG;
LIN; BURGUNDER, 2003). Tais achados foram encontrados no presente estudo.
Outra característica que diferencia cores e fibras em alvo, facilmente
observada em reações enzimáticas como NADH2-TR, é a presença de zonas de
atividade oxidativa (FELLENBERG; LIN; BURGUNDER, 2003). O core apresenta
duas zonas: uma central com ausência total de atividade oxidativa e glicolítica e
outra periférica com atividade normal. Nas fibras em alvo são observadas 3 zonas:
central sem atividades enzimáticas, intermediária que apresenta alta atividade
formando um estreito anel que separa a zona central da zona periférica, onde esta
última é caracterizada pela atividade enzimática normal. Além disso, em um corte
longitudinal é possível observar que o core estende-se de extremidade a
extremidade na fibra muscular apresentando uma zona pálida no centro da fibra
enquanto, nas fibras em alvo esta zona é mais curta.
Contudo, as fibras em alvo podem apresentar variações caracterizando
estágios de evolução ou regressão das mesmas. Dentre essas variações a mais
destacada são fibras em alvo que apresentaram alterações do tipo “roído de traça”
(moth-eaten) evidenciando aumento da atividade oxidativa no centro da fibra
(CARPENTER; KARPATI, 2001). No presente estudo foi observado na reação
NADH2-TR aumento da atividade enzimática no centro da célula. Kamiñska e Szyluk
(1996) observaram alterações similares, no músculo sóleo de ratos tenotomizados,
na mesma reação enzimática.
Fellenberg e colaboradores (2003) atribuem que o complexo fisiopatológico
da formação do alvo nas fibras musculares pode ser decorrente da inibição ou
redução do fluxo aferente de informações vindo dos mecanoreceptores. No
procedimento de desuso é observado redução da mecanotransdução, ou seja,
redução dos estímulos mecânicos aferentes e eferentes, hipótese esta que pode
justificar aqui o achado de fibras em alvo no grupo imobilizado. Baewer et al., (2008)
atribuem a formação de fibras em alvo ao aumento dos níveis de cálcio nas células
musculares. Esses autores observaram no músculo sóleo de ratos submetidos ao
desuso por tenotomia que a concentração de cálcio aumenta gradativamente e
alcança um platô em 4 dias e ainda, acreditam que esse aumento no nível de cálcio
pode ativar a calpaína-3, maior protease responsável pela clivagem de proteínas no
processo de degradação mediada pela ubiquitina.
O programa de reabilitação, realizado em esteira em declive por 10 dias,
intensificou
algumas
das
alterações
morfológicas
pré
determinadas
pelo
procedimento de desuso, no músculo sóleo. Warren et al. (1994) acreditam que as
lesões das fibras musculares determinadas por programas de remobilização, no
caso contrações excêntricas por eletroestimulação, após períodos de desuso podem
estar associadas à diminuição das propriedades contráteis, lesões pré-existentes e
até perda de material miofibrilar induzido pela imobilização. Armand et al. (2003)
após treinarem ratos em esteira em declive, concluíram que o exercício excêntrico
determina acentuado processo de degeneração/regeneração muscular. Esses
achados científicos podem justificar o aumento de algumas alterações morfológicas
aqui observadas, através das diferentes técnicas histológicas e histoenzimológicas,
no músculo sóleo.
Por outro lado, o exercício excêntrico parece estimular o processo de
regeneração do músculo sóleo. Esta afirmação pode ser justificada pela involução
das fibras em alvo desenvolvidas pelo procedimento de desuso. Carpenter e Karpati
(2001) afirmam que uma fibra em alvo uma vez formada pode ser revertida a
qualquer momento. No presente estudo parece que o exercício excêntrico estimulou
progressivamente a remodelação das fibras musculares já que com 10 dias de
treinamento foi possível observar redução do alvo dessas fibras e com a
manutenção
do
estímulo
(21
dias)
essas
alterações
morfológicas
quase
desapareceram por completo. Proske e Morgan (2001) relatam que as alterações de
caráter degenerativo são observadas nos primeiros dias de trabalho excêntrico e que
a manutenção do protocolo minimiza o grau de lesão muscular.
6.2 Morfometria
6.2.1 Alterações na Proporção de Fibras e na MHC
Através da análise de proporção dos diferentes tipos de fibras, o músculo
sóleo do grupo imobilizado apresentou redução significativa no número de FTI e
aumento das FTIIC. Estudo realizado por Sakakima e colaboradores (2004) mostrou
resultados similares aos aqui apresentados, para o músculo sóleo, após 14 dias de
imobilização gessada. Estudos científicos têm mostrado que situações de desuso
desencadeiam acúmulo de Ca+ no citosol (YOSHIOKA et al., 1996; BASTIDE et al.,
2002), seja pelo influxo de cálcio vindo do espaço extracelular através de canais de
cálcio existentes na membrana ou pelo vazamento de cálcio vindo dos canais do
retículo sarcoplasmático (RS) (SHENKMAN; NEMIROVSKAYA, 2008). Esse
acúmulo de Ca2+ nas miofibrilas pode estimular vias responsáveis pela transição dos
diferentes tipos de fibras. A calcineurina-NFAT1 (NFATc1) mostra ser uma das vias
responsáveis pela mudança da MHCI (SHENKMAN; NEMIROVSKAYA, 2008).
Dupont-Versteegden et al. (2002) encontraram NFATc1 no núcleo das fibras do
músculo sóleo após hipocinesia do membro inferior. Allen et al. (2001) observaram
que NFATc1 possuem afinidade em promover MHCIIa. O presente estudo mostrou
redução da expressão da MHCI, no músculo sóleo, após dez dias de imobilização.
Estudos prévios apresentaram resultados similares aos aqui apresentados para o
músculo sóleo de animais submetidos à hipocinesia (STARON et al., 1998;
CORNACHIONE et al., 2011).
Por outro lado, resultados contraditórios aos aqui apresentados também
foram observados na literatura científica. Gomes e colaboradores (2007) utilizaram o
mesmo dispositivo, ao aqui apresentado, e não observaram alterações na proporção
dos diferentes tipos de fibras, do músculo sóleo, após 21 dias de imobilização. Após
10 dias de imobilização gessada Mattiello-Sverzut et al. (2006) e Polizello (2009)
também não observaram alterações significativas na porcentagem dos diferentes
tipos de fibras, do músculo sóleo.
Os dois programas de remobilização realizados após a imobilização
determinaram aumento no número das FTI do músculo sóleo recuperando (GITE (10))
ou até ultrapassando (GITE(21)) os valores obtidos no grupo controle, já o número de
FTIIC reduziu quando comparado ao grupo imobilizado, porém apenas o grupo
treinado durante 21 dias recuperou os valores de referência (GC(21)). Sakakima et al.
(2004) observaram no músculo sóleo de ratas Wistar redução significativa no
número das FTII, aumentadas com imobilização, após diferentes protocolos de
corrida em esteira. Esse achado pode sugerir que o exercício excêntrico deve
recrutar preferencialmente as FTIIC transformando-as em FTI. Estes dados estão de
acordo com os relatos de Nardone e Schieppati (1988) que, durante contrações
excêntricas, as fibras rápidas são preferencialmente recrutadas quando comparadas
às fibras de contração lenta. Estudos conduzidos por Proctor et al., (1995) e Waters
et al., (2004) mostraram que o exercício de endurance converte fibras de contração
rápida (tipo II) em fibras de contração lenta (tipo I). Esses estudos científicos
também podem justificar os achados da análise bioquímica para os diferentes tipos
de bandas da MHC para o músculo sóleo, onde através da técnica de eletroforese
foi possível observar aumento da expressão da MHCI após os dois programas de
treino excêntrico quando comparados ao grupo imobilizado. Contudo, foi necessário
tempo prolongado do estímulo excêntrico (21 dias) para o músculo sóleo apresentar
suas características bioquímicas basais.
Apesar das similaridades na função, o sóleo e o plantar são morfologicamente
distintos. Por ser um músculo dinâmico o plantar atua como coadjuvante nos
movimentos fásicos rápidos e rítmicos de flexão plantar durante a marcha. Sendo
considerado um músculo de contração rápida é possível constatar, na literatura
científica, o predomínio de fibras glicolíticas. Roy et al., (1997) e Fuller et al., (2006)
observaram predomínio de FTIID no plantar de animais adultos, utilizando técnicas
de imuno-histoquímica e de bioquímica. Após os procedimentos de imobilização e
reabilitação o plantar apresentou alterações menos evidentes quando comparadas
com o músculo sóleo. O procedimento de desuso reduziu proporcionalmente FTIIB
concomitante ao aumento das FTIID. Pela análise do gel de eletroforese tanto a
banda da MHCIIa quanto a banda da MHCIId aumentaram enquanto, a banda que
corresponde a MHCIIb não foi expressa. Loughna et al., (1990); Pattullo et al., (1992)
e Goldspink (1999) observaram que a imobilização de um músculo composto
predominantemente por fibras de contração rápida (tipo II), determina um trânsito da
MHC mais rápida (tipo II) para mais lenta (tipo I). Os resultados, deste estudo,
referentes a proporção de fibras e análise da expressão dos diferentes tipos de
MHC, do músculo plantar, podem sugerir que pode estar ocorrendo uma
transformação das FTIIB no sentido das FTIIA. Por outro lado, o treinamento
excêntrico de 10 e 21 dias mostrou reduzir a expressão da MHCIIa e MHCIId sendo
que, no grupo treinado 10 dias foi possível observar também redução da banda
MHCI que apresentava-se mais expressa no grupo controle correspondente (GC(10)).
6.2.2 Alterações na Área de Secção Transversa
O procedimento de imobilização determinou redução no diâmetro das FTI,
FTIIA e FTIIAD no músculo sóleo. Estudos científicos corroboram com os achados
aqui apresentados, para o músculo sóleo, após 14 dias de imobilização gessada
(SAKAKIMA et al., 2004; POLIZELLO, 2009). Cornachione et al., (2008) também
observaram redução significativa do trofismo do músculo sóleo de ratas previamente
submetidas à hipocinesia. O mesmo dispositivo de imobilização usado no presente
estudo foi utilizado em ratos adultos por 3 semanas e foi observado atrofia
significativa de todos os tipos de fibras do sóleo quando comparado ao controle
(GOMES et al., 2007). Os autores sugerem que a atrofia muscular esteja mais
relacionada ao aumento dos mecanismos da proteólise do que à diminuição na
síntese protéica.
Durante o processo de atrofia muscular, a proteólise pode ocorrer através de
três sistemas principais: sistema calpaína (via cálcio-dependente), via catepsina e
sistema ubiquitina-proteossoma. O sistema calpaína é modulado pela proteína
calpastatina que facilita a quebra de moléculas protéicas posteriormente
disponibilizadas para a ubiquitinação (proteólise miofibrilar). A via catepsina também
é ativada durante a atrofia, onde ocorre aumento de mRNA das isoformas de
catepsina, protease responsável pela proteólise lisossomal com eliminação de
proteínas e organelas celulares. O sistema ubiquitina-proteossoma não degrada as
miofibrilas intactas e assim, para exercer a sua função, torna-se dependente dessas
outras vias. Esse sistema envolve três enzimas principais: E1 que ativa a ubiquitina,
E2 com a função de transportá-la e conjugá-la, E3 que faz a ligação específica da
ubiquitina na proteína alvo. A atuação das três enzimas é fundamental para que
ocorra a proteólise já que o proteossoma só conseguirá fazer a degradação protéica
quando as proteínas estiverem poliubiquitinadas (KANDARIAN; JACKMAN, 2006).
Após a aplicação dos protocolos excêntricos, 10 e 21 dias, resultados
satisfatórios foram observados em relação ao trofismo das FTIIA e FTIIAD. Por outro
lado, apenas o protocolo de 21 dias foi capaz de restabelecer as características de
base para as FTI. Cornachione et al., (2008) realizaram o mesmo protocolo de
reabilitação excêntrica durante 21 dias e observaram restabelecimento dos valores
de referência para o diâmetro menor, dos diferentes tipos de fibras do músculo
sóleo, previamente reduzido pelo procedimento de suspensão. Sakakima et al.
(2004) realizou treino de corrida de baixa, média ou alta frequência por 6 semanas
em ratas jovens após período de imobilização gessada. Todos os treinos foram
capazes de aumentar a área das FTI e FTII, porém somente os treinos de média e
alta frequência alcançaram os valores obtidos no membro contralateral, para o
músculo sóleo.
O músculo plantar em situações normais não é tonicamente ativo na
manutenção da postura, porém é o extensor primário do tornozelo de ratos na
corrida (JASMIN; GARDINER, 1987). Estudos científicos têm mostrado que
músculos compostos predominantemente por fibras de contração rápida são menos
afetados perante situações de desuso (OHIRA et al., 1992; LETERME; FALEMPIN
1994; CORNACHIONE et al., 2008). O músculo plantar mostrou requerer menor
período de reabilitação para alcançar resultados satisfatórios para o diâmetro menor
das FTIIC, FTIIA e FTIID, porém para fibras do tipo I foi necessária a manutenção do
mesmo para alcançar valores de referência.
6.2.3 Alterações na Relação Capilar/fibra
Tem sido documentado que vários fatores podem alterar a quantidade capilar
no músculo esquelético, incluindo o envelhecimento e alterações no nível de
atividade muscular como exercício físico ou desuso (KANO et al., 2002).
A
angiogênese no músculo esquelético em resposta ao exercício tem sido atribuída a
estímulos metabólicos e/ou a presença de uma variedade de fatores de crescimento.
Porém, não está identificado qual deles inicia ou mantém o crescimento capilar.
Muitas situações no músculo esquelético que exibem a angiogênese envolvem
aumento do fluxo sanguíneo, e muitas evidências apontam que o aumento do fluxo
sanguíneo sozinho é suficiente para induzir o crescimento capilar (BROWN;
HUDLICKA, 2003).
A variável rC/F apresenta intrínseca analogia com o nível de atividade
muscular (DESPLANCHES 1997). A redução da atividade muscular induzida pela
imobilização influenciou, significativa e negativamente, a rC/F no músculo sóleo
deste estudo. É sabido que fibras de contração lenta apresentam maior número de
capilares do que fibras de contração rápida (ANNEX et al., 1998; CHERWEK et al.,
2000) e que o desuso induz um trânsito das fibras de contração lenta para fibras de
contração mais rápida, como observado no presente estudo. Portanto, a redução da
rC/F aqui documentada pode ser justificada pela redução de FTI. Cornachione et al.
(2008) observaram resultados similares, aos aqui apresentados, para o músculo
sóleo após período de hipocinesia (suspensão).
Após a aplicação dos protocolos excêntricos de reabilitação foi observado que
o período de 10 dias de exercício não restabeleceu as características angiogênicas
do músculo sóleo. Com a manutenção do estímulo (exercício excêntrico) por 21 dias
foi possível observar uma recuperação satisfatória da variável rC/F, equiparando-se
aos valores de referência. Apesar do consumo de oxigênio ser inferior no
treinamento excêntrico quando comparado aos outros tipos de contração, fatores de
crescimento e proteínas sinalizadoras devem ter sido mais expressas durante fases
mais tardias do treinamento.
O processo de angiogênese parece estar relacionado com a adaptação do
tecido muscular esquelético ao exercício. Uma série de fatores são liberados nos
tecidos ao redor dos pequenos vasos envolvidos na atividade física. O fator de
crescimento vascular endotelial (VEGF) é um dos fatores promotores da
angiogênese pois, estimula a proliferação e diferenciação de células endoteliais.
Durante o exercício físico o consumo de oxigênio aumentam em comparação a
situações de repouso e com isso há um aumento do fluxo sanguíneo para
compensar a demanda de oxigênio exigido (BLOMSTRAND et al., 1997). Outros
resultado determinados pelo exercício físico é a hipóxia e a tensão de cisalhamento
na parede dos capilares (MILKIEWICZ et al., 2001). No músculo extensor longo dos
dedos de ratos tanto a hipóxia quanto aumento da tensão de cisalhamento induziram
a angiogênese através da super expressão de VEGF pelos miócitos, após exercício
físico (EGGINTON et al., 2001).
Por outro lado, o músculo plantar, apresentou aumento significativo na rC/F
após a realização do protocolo de 21 dias de exercício excêntrico quando
comparado aos animais do grupo imobilizado e treinado 10 dias. A hipótese mais
sugestiva para esse achado é que este não foi afetado pelo procedimento de
hipocinesia, mas sim, pelo treinamento de 21 dias aqui adotado. Kano et al. (1997) e
Waters et al. (2004), observaram aumento na densidade capilar de músculos
rápidos, em animais normais, após treinamento de corrida. Jensen et al. (2004),
observaram que exercícios de alta intensidade recrutam mais fibras do tipo II,
determinando aumento significativo no número de capilares das mesmas. Gute et al.
(1996) aplicaram treino de corrida em esteira com alta intensidade por 5 dias da
semana durante 14 semanas em ratos adultos saudáveis. Eles observaram melhor
resposta capilar do músculo gastrocnêmio ao treino de alta intensidade, que
demonstrou aumento significativo da rC/F em todas as suas porções. Cornachione et
al. (2011) observaram aumento da rC/F do músculo tibial anterior (músculo
predominantemente rápido) após treinamento excêntrico em esteira durante 21 dias.
Os mesmos observaram ainda, que o músculo tibial anterior não foi afetado pelo
procedimento de desuso.
O tempo necessário para ocorrer a angiogênese em resposta ao exercício
pode variar de acordo com o tipo de fibra, e assim, conforme o predomínio cada tipo
no músculo alvo. Foi observado crescimento capilar precoce em fibras rápidas do
gastrocnêmio quando comparado às fibras lentas do músculo sóleo de ratos jovens
treinados (BROWN; HUDLICKA, 2003). O aumento da área de secção transversa da
fibra em resposta ao exercício também pode induzir a angiongênese para evitar uma
queda no desempenho muscular aeróbico (DEGENS et al., 2006). Dessa forma, a
variação entre a resposta angiogênica dos músculos sóleo e plantar também pode
ser explicada pela diferença no predomínio e tamanho entre os tipos de fibras, que
indicará o perfil de contração muscular.
Poucos são os relatos na literatura científica que correlacionam diferentes
períodos de protocolos exêntricos de reabilitação e rC/F de músculos de animais
previamente submetidos ao desuso por imobilização.
6.3 Alterações na Expressão do Colágeno Tipo I e Tipo III
Estudos prévios têm mostrado que a inatividade, através de várias formas de
desuso, resulta em alterações no músculo esquelético e em suas propriedades. Os
resultados aqui apresentados enfocam importantes modificações e adaptações dos
constituintes da rede de tecido conjuntivo dos músculos sóleo e plantar
principalmente em ratas submetidas à imobilização. Alguns recursos utilizados na
reabilitação, como o treinamento excêntrico, parecem favorecer a reorganização
adequada desse tecido.
O colágeno tipo I compõe fibras em paralelo, confere força tênsil e rigidez ao
tecido (KOVANEN 2002). Esse tipo de colágeno é encontrado principalmente no
epimísio, conforme foi demonstrado bioquimicamente por Light e Champion (1984) e
confirmado por outros estudos (SALONEN et al. 1985; KUROSE et al., 2006). Já o
colágeno tipo III é encontrado no perimísio e no endomísio, sendo mais evidente
neste último e sua principal função é conferir complacência ao tecido (LIGHT;
CHAMPION, 1984; SALONEN et al., 1985; KUROSE, 2006).
No presente estudo foi observado aumento da reatividade dos diferentes tipos
de colágeno em ambos os músculos estudados. Józsa et al. (1990) e Järvinen et al.
(2002) também observaram aumento pronunciado do tecido conjuntivo nas regiões
peri- e endomisial, no músculo sóleo de ratas após 1, 2 e 3 semanas de imobilização
gessada. Sabe-se que o tecido conjuntivo sofre alterações em curtos períodos de
desuso e estudos têm mostrado que em apenas dois dias de imobilização o tecido
conjuntivo aumenta significativamente na região intramuscular.
Inicialmente esta
elevação tem sido identificada no perimísio (após dois dias) e após sete dias de
imobilização, o endomísio sofre mudanças. Alterações enzimáticas também são
observadas. Kovanen (2002) demonstrou, após um dia de imobilização dos
membros posteriores de ratos, redução da atividade da Prolil 4-Hidroxilase (P4H),
enzima que cataliza as primeiras modificações da biossíntese do colágeno. Contudo,
mais estudos serão necessários para entender melhor a biossíntese e a degradação
do colágeno frente situações de desuso.
Com o procedimento de remobilização, treinamento excêntrico, realizado
durante 10 dias foi observado aumento da reatividade do colágeno tipo I e III, no
músculo sóleo. Por outro lado, esse mesmo músculo mostrou redução da expressão
colagênica (colágenos tipos I e III) com 21 dias de treinamento, mostrando
resultados similares ao grupo controle (GC(21)), o que mostra que músculos tônicos
são capazes de retomar suas características colagênicas normais quando
submetidos a períodos mais longos (21 dias) de treinamento excêntrico, após à
imobilização. Kannus et al. (1998a, b) enfocam que alterações causadas pela
imobilização, como acúmulo de tecido conjuntivo intramuscular, podem ser
fenômenos reversíveis especialmente se a remobilização for intensificada por
treinamento físico. Esses mesmos autores observaram que o treinamento em esteira
reduziu o volume percentual do tecido conjuntivo do músculo sóleo de ratas,
previamente imobilizadas.
Diferentemente, o músculo plantar mostrou responder prontamente ao
treinamento de menor período (10 dias) recuperando assim, as características de
base.
Os resultados finais apresentados neste estudo confirmam dados da literatura
de que a imobilização desencadeia alterações importantes na expressão do
colágeno do tecido muscular esquelético. Através de programas de exercício
excêntrico os músculos podem ser reabilitados retornando às suas características
morfofuncionais normais, o que implica em melhora da complacência tecidual e
diminuição da rigidez intrínseca. Contudo, sugerimos que dentro da nossa prática
clínica programas de reabilitação excêntrica, após situações de desuso, possam ser
indicados precocemente com a finalidade de recuperar as características de força,
tensão e rigidez do sistema aqui enfocado.
6.4 Limitações do Experimento 1
Considerando os achados supracitados, para o experimento 1, devemos
considerar que os animais, tanto do grupo treinado 10 dias quanto do grupo treinado
21 dias, foram reabilitados por 40 minutos de corrida descendente em esteira. Após
este período os animais permaneceram livres nas gaiolas até o próximo dia de
treinamento, ou seja, durante aproximadamente 23 horas e meia tiveram retorno da
sobrecarga, nos membros, gerada pelo próprio peso corporal. Em estudo prévio,
nosso grupo de pesquisa analisou alterações morfológicas, proporção dos diferentes
tipos de fibras, diâmetro menor e rC/F dos músculos sóleo e tibial anterior de ratas
submetidas previamente à suspensão caudal por 28 dias e, posteriormente
reabilitadas pelo exercício do tipo excêntrico (21 dias) (Cornachione et. al., 2007). Os
autores também analisaram um grupo de animais que foram suspensos e depois
deixados livres nas gaiolas (21 dias). Frente as variáveis morfológicas e
morfométricas, os autores constataram que o retorno da sobrecarga, determinado
pela livre movimentação, melhorou a distribuição dos diferentes tipos de fibras e a
rC/F para os músculos estudados, porém não incrementou o volume celular. Por
outro lado, os animais reabilitados pelo exercício excêntrico mostraram melhores
resultados em relação ao trofismo além, da proporção de fibras e rC/F. Portanto, no
presente documento optou-se pela não inserção dos grupos livres. Porem, não são
excluídas as possibilidades de que, outros resultados, diferentes dos apresentados
aqui, poderiam ser obtidos e que, tais resultados, suscitam a reflexão desses
autores.
Conclusão Experimento 1 - 81
7 CONCLUSÃO EXPERIMENTO 1
O exercício excêntrico mostrou ser uma ferramenta importante na reabilitação
do músculo esquelético, principalmente tratando-se de músculos tônicos, como o
sóleo que apresentam alterações citoarquiteturais significativas após situações de
desuso, quando comparado a músculos fásicos, como o plantar.
O período de 10 dias de treinamento excêntrico parece estimular o processo
inicial de regeneração muscular, no músculo sóleo, porém não foi suficiente para
alcançar as características qualitativas e quantitativas de base. Somente com a
manutenção do estímulo por um período mais prolongado, 21 dias, esse músculo foi
capaz de determinar modificações satisfatórias, apresentando aspectos morfológicos
e morfométrico equivalentes ao controle.
Por outro lado, o músculo plantar se restabelece em menor período de
treinamento, considerando que este músculo foi menos acometido pela imobilização.
8 RESULTADOS EXPERIMENTO 2
8.1 Morfologia
A análise morfológica dos músculos de animais que compuseram o
Experimento 2 foi realizada da mesma forma como descrita no Experimento 1. A
Tabela 7 demonstra a quantidade das alterações histopatológicas encontradas no
músculo sóleo.
GI
50%
66%*
50%
33%*
33%
-
-
Fragmentação
17%*
-
50%
-
17%
-
-
66%
-
-
-
-
-
-
Halo Basofílico
-
-
50%
-
-
-
-
Necrose
33%*
33%*
33%
-
17%*
-
-
Fibras Lobuladas
33%
-
-
-
-
-
-
83%
-
-
-
-
-
-
Fibras Basofílicas
-
-
-
-
-
-
-
100%
100%*
66%
100%*
17%
17%*
100%*
Fibras em alvo
100%
-
50%*
-
17%*
-
-
Área de rarefação
citoplasmática
GC(imob) GIAL(10) GC(10) GIAL(21) GC(21)
GA
As alterações citoarquiteturais observadas no grupo imobilizado (GI) foram
descritas anteriormente no Experimento 1, contudo a tabela 7 e a figura 17
reapresentam tais alterações.
Pela análise detalhada das lâminas do músculo sóleo coradas com HE, o
grupo alongado 10 dias apresentou centralização nuclear, fragmentação e halo
basofílico em 50% dos animais (Tabela 7 e Figura 17g). Pôde-se constatar também
que 33% dos cortes apresentaram necrose. Através das reações histoenzimológicas
para mATPase (Figura 17i) e NADH2-TR não foram observadas alterações
relevantes. Já para os animais alongados durante 21 dias, poucas foram as
alterações patológicas encontradas, sendo a centralização nuclear foi a mais
evidente, porém observada em apenas 33% dos animais (Tabela 7 e Figura 17j).
Para o músculo plantar não foram observadas alterações significativas nas
reações de coloração e histoenzimológicas aqui aplicadas, para os grupos do
experimento 2 (Figura 18).
GC(imob)
GI
GIAL(10)
GIAL(21)
Figura 17 – Fotomicrografias do músculo sóleo nas colorações hematoxilina-eosina (a, d, g, j – cortes
na periferia (Barras: 45,4m); d – variação no tamanho das fibras, fibras lobuladas (seta grossa), centralização
nuclear (seta fina) e fibras em alvo (*) com basofilía no centro (Barra: 28,4m); e – fibras em alvo (*) e perda das
estriações transversais () (Barra: 27,4m); f – fibras em alvo (*) (Barra: 24,8m); g - variação no tamanho das
fibras, fragmentação (setas pontilhadas) e núcleos centralizados (setas finas) (Barra: 39,6m); h – poucos
nucleos centralizados (seta fina) e rarefação citoplamática (cabeça de seta). i – sem alterações (Barra: 35,6m); jdiscreta centralização nuclear (seta fina) (Barra: 29,7m); k – poucos núcleos centralizados (setas finas); l - não
apresentaram alterações significativas (Barras: 29,7m).
GC(imob)
GI
GIAL(10)
GIAL(21)
Figura 18 - Fotomicrografias do músculo plantar nas colorações hematoxilina-eosina (a, d, g, j – cortes
na periferia (Barras: 36,8m); d – fibras sem alterações (Barra: 26,4m); e – fibras com estriações transvesais
normais e nucleos na periferia (Barra: 26,4m); f – predomínio de FTIID (Barra: 24,8m);g – sem alterações
(Barra: 26,1m); h – poucos núcleos centralizados (setas finas). i – sem alterações (Barra: 22,4m); j- Fibras
poliédricas com núcleos na periferia (Barra: 28,8m); k – sem alterações; l - não apresentaram alterações
relevantes (Barra: 28,8m).
Microscopia Óptica de Alta Resolução
Após
o
procedimento
de
desuso
foram
observadas
alterações
citoarquiteturais importantes, através da MOAR, no músculo sóleo de todos os
animais imobilizados. Tais alterações foram descritas previamente no Experimento
1, porém fotomicrografias do mesmo podem ser observadas na figura 17.
As fibras musculares analisadas do músculo sóleo, referentes ao grupo
alongado durante 10 dias, mostraram corroborar com os achados da coloração HE,
confirmando assim, a centralização nuclear (Figura 17h). Outra alteração
representativa observada neste mesmo grupo foi a rarefação citoplasmática. Já o
músculo sóleo reabilitado durante 21 dias pelo procedimento de alongamento,
mostrou citoarquitetuta normal, porém com raros núcleos centralizados.
Na análise morfológica realizada a partir da técnica de MOAR o músculo
plantar não mostrou comprometimentos significativos tanto após o procedimento de
desuso quanto aos de alongamento (Figura 18).
8.2 Morfometria
Na Figura 19 é possível observar as diferenças entre as médias da proporção
de fibras obtidas nos diferentes grupos analisados no experimento 2.
As alterações determinadas na proporção dos diferentes tipos de fibras, pelo
procedimento de imobilização, no músculo sóleo foram descritas no item 5.2.1 no
experimento 1.
Os dois programas de alongamento, 10 e 21 dias, aplicados após período de
imobilização determinaram aumento no número das FTI do músculo sóleo em
relação aos animais do grupo imobilizado (GI vs GIAL(10), GI vs GIAL(21), p<0.01),
porém apenas o treino de 21 dias foi capaz de aumentar significativamente os
valores proporcionais, ultrapassando os valores de referência (GC (21) vs GIAL(21),
p=0.03) (Figura 19). Por outro lado, as FTIIC mostraram valores satisfatórios após os
dois programas de alongamento (GC(10) vs GIAL(10), GC(21) vs GIAL(21), p>0.05). As
fibras do tipo IIA e IIAD mostraram não ser afetadas pelo procedimento de desuso,
contudo os procedimentos de alongamento, 10 e 21 dias, reduziram as FTIIA (GC (10)
vs GIAL(10), GC(21) vs GIAL(21), p<0.01) e as FTIIAD aumentaram apenas com 10 dias
de alongamento (GC(10) vs GIAL(10), p<0.01). Pela análise do gel de eletroforese foi
observado aumento da expressão da MHCI após os programas de alongamento,
quando comparado ao grupo imobilizado, porém o grupo alongado por 21 dias
mostrou resultados mais satisfatórios em relação ao controle (Figura 20).
100%
80%
1.48%
6.13%
10.42%

26.83%
28.02%
25.47%

0.12%
33.79%
5.74%
14.12% *
20.81%

4.12%

21.79%
4.22%

3.69%
2.25%
40%
70.32%
51.71%
20%
58.34%  
2.09%
28.99%
7.80%
1.35%
60%
2.97%
63.82%
68.34%
GC(10)
GIAL(21)

63.18%
71.91%

*
0%
GI
GCimob
GIAL(10)
FTI
FTIIC
FTIIA
GC(21)
GA
FTIIAD
Figura 19 – Porcentagem das médias de FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD do músculo sóleo nos
diferentes grupos analisados do Experimento 2.* p<0.01 comparado com GC(imob);  p< 0.01
comparado com GI; p<0.01 comparado com GC(10); p<0.01 comparado com GC(21).
A
B
Figura 20 – A – Foto do gel de poliacrilamida apresentando as diferentes
bandas da MHC do músculo sóleo. B – Análise quantitativa da expressão das
bandas da MHCI e MHCIIa em unidade arbitrária do músculo sóleo do
experimento 2.
No músculo plantar poucas foram as alterações observadas. O aumento das
FTIID e redução das FTIIB foram acentuados após o procedimento de alongamento
aplicado durante 10 dias (GC(10) vs GIAL(10), p<0.01) (Figura 21). Além disso, foi
observada redução na proporção de FTI e FTIIA (GC(10) vs GIAL(10), p<0.03). Já com
21 dias de alongamento foi observada redução das FTIIA concomitante ao aumento
das FTIID (GC(21) vs GIAL(21), p<0.03).
Para a expressão da MHC os programas de 10 e 21 dias reduziram a
expressão das bandas MHCIIa e MHCIId, quando comparadas ao GI, apresentando
assim, valores próximos aos grupos controles (Figura 22).
100%
9.66% *
0.82%

2.05%
3.21%
3.44%
3.45%
57.02%
61.76%   57.78%
58.22%
20.92%   26.71%
25.11%
16.47%
2.31%
11.79%
0.35%
11.70%
0.08%
13.10%
GC(10)
GIAL(21)
GC(21)
GA

18.76%
80%
60%
54.98%
65.84%  
*
49.56%
40%
24.37%
20%
0%
22.82%
20.32%  
0.44%
9.33%
0.16%
8.68%
1.39%
11.59% 
GI
GCimob
25.56%
GIAL(10)
FTI
FTIIC
0.07%
FTIIA
FTIID
FTIIB
plantar nos diferentes grupos analisados do Experimento 2.* p<0.01 comparado com
GC(imob);  p< 0.01 comparado com GI; p<0.01 comparado com GC(10); p<0.01
comparado com GC(21).
A
B
Figura 22 – A – Foto do gel de poliacrilamida apresentando as diferentes
bandas da MHC do músculo plantar. B – Análise quantitativa da expressão
das bandas da MHCI, MHCIIa e MHCIId em unidade arbitrária do músculo
plantar do experimento 2.
Os dados referentes ao diâmetro menor obtidos no grupo imobilizado foram
descritos no item 5.2.2 do Experimento 1.
O protocolo de 21 dias de alongamento aumentou o diâmetro das FTI, FTIIA e
FTIIAD que foi reduzido previamente pelo procedimento de imobilização para o
músculo sóleo (GC(21) vs GIAL(21), p>0.05) (Tabela 8). Já o protocolo de 10 dias
mostrou aumentar apenas o trofismo das FTIIA (GC(10) vs GIAL(10) p>0.05) (Tabela
8).
Tabela 8 - Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD com os respectivos intervalos
de confiança de 95% do músculo sóleo dos diferentes grupos estudados no experimento 2.
GI
GC(Imob)
GIAL(10)
GC(10)
GIAL(21)
GC(21)
GA
FTI
36.04*
(33 – 39)
47.51
(43 – 52)
40.40
(37 – 44)
46.77
(42 – 51)
41.48
(38 – 45)
45.81
(41 – 50)
42.49
(38 – 47)
FTIIC
29.37
(26 – 33)
36.64
(29 – 44)
35.08
(31 – 39)
40.53
(34 – 47)
34.78
(31 – 38)
36.97
(31 – 42)
34.29
(29 – 40)
FTIIA
30.78*
(27 – 34)
37.97
(33 – 43)
38.56
(35 – 42)
40.43
(36 – 45)
39.61
(36 – 43)
39.06
(34 – 44)
37.30
(32 – 42)
FTIIAD
29.12*
(25 – 33)
39.62
(33 – 46)
38.24 
(35 – 42)
55.64
(39 – 72)
39.33
(35 – 43)
36.35
(31 – 42)
34.04
(28 – 40)
Para o músculo plantar o protocolo de alongamento, realizado durante 21
dias, determinou aumento do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA e FIID atingindo
valores similares aos grupos controles (GC(21) vs GIAL(21), p>0.05) e as FTIIB
ultrapassaram os valores de referência (GC(21) vs GIAL(21), p<0.01) (Tabela 9). Já o
protocolo de 10 dias mostrou aumentar apenas o diâmetro das FTI e FTIIA (GI vs
GIAL(10) p<0.01) em relação aos animais previamente imobilizados, porém apenas
as FTIIA alcançaram os valores de referência (GC(10) vs GIAL(10) p>0.05). Os animais
do grupo anestesiado apresentaram aumento do diâmetro em relação aos animais
do GC(21) (GA vs GC(21), p<0.01).
Tabela 9 - Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA, FTIID e FTIIB com os respectivos
intervalos de confiança de 95% do músculo plantar dos diferentes grupos estudados no experimento
2.
GI
GC(Imob)
GIAL(10)
GC(10)
GIAL(21)
GC(21)
GA
FTI
26.92*
(24 – 29)
36.22
(33 – 40)
32.07 
(27 – 34)
39.26
(36 – 42)
36.08
(34 – 38.5)
36.70
(33 – 40)
37.93
(34–41)
FTIIC
18.75*
(13 – 24)
37.14
(29 – 46)
25.40 
(22 – 28)
38.57
(27 – 50)
28.32
(25 – 31)
34.24
(26 – 43)
–
FTIIA
27.22*
(25 – 29)
32.55
(29 – 36)
31.89
(29.5 – 34)
34.56
(31 – 38)
33.67
(31 – 36)
33.51
(30 – 37)
35.44
(32 – 39)
FTIID
32.86*
(30 – 35)
38.94
(36 – 42)
34.10 
(32 – 36)
40.92
(38 – 44)
38.59
(36 – 41)
37.71
(34 – 41)
40.94
(38 – 44)
39.26
(37 – 42)
41.88
(38.5 – 45)
35.85
(38 – 44)
47.52
(43 – 52)
47.99 
(45 – 51)
40.05
(36 – 44)
48.85
(45 – 53)
FTIIB
* p< 0.01 comparado com GC(imob);  p<0.02 comparado com GI;  p<0.03 comparado com GC(10); p<0.01
significativo na análise da rC/F, como descrito anteriormente no item 5.2.3. Os
procedimentos de alongamento, de 10 e 21 dias, mostraram não recuperar os
valores basais para o músculo sóleo (GC(10) vs GIAL(10); GC(21) vs GIAL(21) p<0.04),
mantendo seus valores inferiores aos respectivos controles (Tabela 10).
Ao considerar a rC/F para o músculo plantar, observou-se que as alterações
resultantes do procedimento de imobilização e remobilização, pelo alongamento,
não foram relevantes (Tabela 10).
Tabela 10 - Médias da relação capilar/fibra com os respectivos intervalos de confiança de 95% dos
GI
GC(Imob)
GIAL(10)
GC(10)
GIAL(21)
GC(21)
GA
Sóleo
2.04*
(1.8–2)
2.43
(2.2 – 2.6)
2.08
(1.9 – 2.2)
2.49
(2.2– 2.7)
2.11
(1.9 – 2.2)
2.38
(2.1– 2.6)
2.45
(2.2-3)
Plantar
1.50
(1.3-2)
1.72
(1.5 – 1.9)
1.52
(1.4 – 1.7)
1.65
(1.5 - 3.2)
1.63
(1.5 – 1.8)
1.58
(1.4–1.8)
1.72
(1.5– 2)
* p< 0.01 comparado com GC(imob);  p<0.02 comparado com GI;  p<0.03 comparado com GC(10);  p<0.03
8.3 Colágenos tipos I e tipo III
Na descrição dos resultados para o colágeno I e III realizada anteriormente,
no experimento 1, foi possível observar que o procedimento de imobilização
determinou, nos músculos sóleo e plantar, aumento significativo da expressão dos
mesmos (Tabela 11).
Os programas de reabilitação, alongamento mantido 10 e 21 dias, realizado
nos músculos sóleo e plantar, mostraram não restabelecer a expressão dos
diferentes tipos de colágeno (Tabela 11 e Figuras 23 e 24).
Tabela 11 - Análise semi-quantitativa da expressão dos colágenos tipos I e III nos músculos Sóleo e
Plantar para os diferentes grupos analisados no Experimento 2.
Grupos
GI
GC(Imob)
GIAL(10)
GC(10)
GIAL(21)
GC(21)
GA
Colágeno Tipo I
Sóleo
Plantar
+++
++
+
±
++
+
+
±
++
++
+
+
+
++
Colágeno Tipo III
Sóleo
Plantar
+++
+++
++
+
++
++
+
+
+++
++
++
+
++
+
GC(imob)
GI
GIAL(10)
GIAL(21)
Figura 23 - Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo (a-d) e plantar (e-h) demonstrando
a expressão do colágeno tipo I através da imunomarcação pelo método imuno-histoquímico. a, e
– imunomarcação do colágeno tipo I sem alterações (Barras= 74m); b, f - observe aumento da
expressão do colágeno I para o músculo sóleo (Barras= 65;74m, respectivamente); c, g –
aumento da expressão observada no músculo sóleo e nenhuma alteração para o plantar (Barras=
65;75m, respectivamente); d,h – imunomarcação do colágeno tipo I mais reativo para o
músculo sóleo (Barras= 76m).
GC(imob)
GI
GIAL(10)
GIAL(21)
Figura 24 - Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo (a-d) e plantar (e-h) demonstrando a
expressão do colágeno tipo III através da imunomarcação pelo método imuno-histoquímico. a, e imunomarcação do colágeno tipo III sem alterações significativas (Barras= 88m); b, f - aumento da
expressão do colágeno III (Barras= 65; 80m); c, g – aumento da expressão é observada no
músculo sóleo e nenhuma alteração para o plantar (Barras= 65;100m, respectivamente); d, h –
aumento da expressão no sóleo (d) e nenhuma alteração no plantar (h) para o colágeno tipo III
(Barra=94;75m, respectivamente).
9
DISCUSSÃO EXPERIMENTO 2
9.1 Morfologia
O músculo sóleo dos animais do grupo alongado 10 dias apresentaram maior
incidência de núcleo centralizado, halo basofílico e fragmentação quando
comparados aos animais do GIAL(21). O alongamento mantido por 40 minutos
aplicado após o procedimento de imobilização foi realizado de forma similar por
Gomes et al. (2007) em ratos adultos. A frequência de 1 ou 3 vezes por semana de
alongamento foi comparada e os autores encontraram alterações morfológicas mais
pronunciadas no músculo sóleo do grupo imobilizado e no grupo imobilizado e
alongado por 3 vezes na semana, durante 40 minutos. Eles apontam que a
reatividade aumentada do músculo pode estar associada a um distúrbio de
tumefação celular relacionado a processos de degeneração celular. O músculo sóleo
de ratas adultas, submetidas à imobilização e alongamento, apresentou alterações
morfológicas moderadas através de fibras em regeneração, núcleo centralizado,
necrose hialina, halo basofílico e fibras lobuladas (MATTIELLO-SVERZUT et al.,
2006). A alta intensidade da resposta muscular frente a diferentes intervenções no
membro posterior do animal indica que o comprimento funcional muscular e a tensão
imposta a ele são importantes para manter a massa e arquitetura muscular (GOMES
et al., 2007).
Núcleos centralizados foram observados no músculo sóleo dos animais
alongados, em maior quantidade nos animais tratados por 10 dias. Sabe-se que o
alongamento mantido pode causar microlesões nas fibras musculares levando a
subsequente regeneração (YANG et al., 1997). Miofibras recentemente regeneradas
podem ser identificadas pela presença de núcleos centralizados, derivados de
células satélites (OUSTANINA et al., 2004), que são células miogênicas precursoras
residentes entre o sarcolema e a lâmina basal da miofibra (KAWANO et al., 2008).
Tem sido mostrado que essas células funcionam como fontes de novos mionúcleos
durante o processo de regeneração após a lesão muscular e durante a sobrecarga
funcional (WANG et al., 2006). E ainda, o alongamento passivo das fibras
musculares pode ser necessário para manter a ativação e proliferação das células
satélites (WANG et al., 2006). Portanto, o aumento no número e/ou função das
células satélites, devido ao estímulo mecânico longitudinal, desempenha importante
papel
na
recuperação
do
número
de
mionúcleos
e,
consequentemente,
restabelecimento do tamanho da fibra muscular (WANG et al., 2006).
Por outro lado, a quantidade de fibras em alvo encontrada no grupo
imobilizado reduziu após a aplicação dos programas de alongamento mantido,
principalmente no grupo alongado 21 dias. Baewer et al., (2008) observaram
redução de targetoid fibers ou fibras com lesão tipo central core, no músculo sóleo
de ratos, tenotomizados e alongados por 20 minutos durante 7 dias. Esses autores
acreditam que vias de degradação proteossomicas mediadas pela ubiquitina,
ativadas pelo acúmulo de cálcio determinado pelo procedimento de desuso
(tenotomia), podem ser inibidas pelo estímulo do alongamento e, vias sintetizadoras
podem ser ativadas, como o ativador mitogênico de proteína kinase (MAPK).
9.2 Morfometria
9.2.1 Alterações na Proporção de fibras e na MHC
Através da análise da proporção dos diferentes tipos de fibras, o músculo
sóleo, mostrou aumento no número de FTI após os dois programas de alongamento
mantido em relação aos animais imobilizados, porém apenas o programa de 21 dias
foi capaz de aumentar significativamente os valores proporcionais, ultrapassando os
valores de referência. A mesma técnica de alongamento mantido foi utilizada por
Gomes et al., (2007) em ratos adultos, durante o período de imobilização. Eles não
observaram nenhuma mudança na proporção entre os diferentes tipos de fibras do
músculo sóleo. Ausência de alterações na proporção também foi demonstrado por
Mattiello-Sverzut et al. (2006) em músculo sóleo de ratas adultas, submetidas ao
alongamento intermitente pós-imobilização. Por outro lado, Polizello (2009) observou
no músculo sóleo de ratas, imobilizadas por 14 dias e posteriormente submetidas ao
alongamento intermitente durante 10 dias, redução significativa no número de fibras
rápidas (FTII) e aumento de fibras lentas (FTI). Esses resultados corroboram aos
aqui apresentados, apesar das técnicas de alongamento serem diferentes, e ainda,
indicam que o alongamento tanto intermitente quanto o mantido podem estimular um
trânsito das fibras de contração mais rápidas para fibras de contração mais lentas.
Na literatura científica, são poucos os relatos que abordam os efeitos da
remobilização, através de alongamento mantido, frente a transição dos diferentes
tipos de fibras e da MHC do músculo esquelético após período de desuso.
9.2.2 Alterações na Área de Secção Transversa
A técnica de alongamento aplicada por 21 dias aumentou o diâmetro menor
das FTI, FTIIA e FTIIAD, do músculo sóleo, que foi reduzido previamente pelo
procedimento de imobilização. Achados similares foram observados por Gomes et
al. (2007) com o alongamento mantido 3 vezes por semana, durante o período de
imobilização no músculo sóleo. Polizello (2009) observou que o alongamento
aplicado 1 ou 2 vezes por dia aumenta o diâmetro menor dos diferentes tipos de
fibras do músculo sóleo. Okita et al. (2001) avaliaram o efeito do alongamento
passivo pós-imobilização mantido por 30 minutos, realizado 6 vezes por semana
durante 3 semanas e observaram aumento do diâmetro das FTI no músculo sóleo.
Coutinho et al. (2006) relatam que, após três semanas de alongamento
passivo, ocorre hipertrofia muscular associado ao aumento no número de
sarcômeros em série, no sóleo após imobilização. Essa hipertrofia tem sido atribuída
aos fatores regulatórios miogênicos (MRFs), um grupo de moléculas que controlam a
transcrição de genes relacionados a hipertrofia muscular (WATANABE, 2001). Os
MRFs se dividem em quatro componentes: miogênico de diferenciação (myo-D),
fator regulador miogênico 5 (MRF-5), miogenina e fator regulatório miogênico 4
(MRF-4) (SABORIN et al., 2000). A ativação desses está condicionada à presença
ou não de estímulo tensional e a imobilização em posição de alongamento mostra
aumentar a expressão de myo-D (ZÁDOR; DUX; WUYTACK, 1999). Outra via que
pode estar relacionada ao aumento do volume celular após o estímulo de
alongamento é a via IGF-1/fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/AKT/proteína alvo da
rapamicina em mamíferos (mTOR) (BAEWER et al., 2008; TEGTBUR; BUSSE;
KUBIS, 2009).
Outros processos estão presentes na cascata de eventos que envolvem as
mudanças de trofismo com alongamento. As células satélites estão envolvidas em
processos de regeneração e reparo tecidual em lesões do tecido muscular
(CHARGE; RUDNICK, 2004). Quando o tecido é alongado, além de sua fase
elástica, microlesões são desencadeadas o que contribui para sequência de eventos
ativadores das células satélites e consequente início de um ciclo reparativo. Quando
essas células se fundem à miofibra lesada é observado um aumento do volume
celular.
Por outro lado, Gomes e colaboradores (2007) demonstraram que o
alongamento realizado 1 vez por semana reduziu ainda mais a área das fibras,
quando comparado ao grupo somente imobilizado. Mattiello-Sverzut et al. (2006)
demonstraram que o alongamento manual por 10 dias consecutivos, sendo 10 séries
de 15 segundos cada, não foi capaz de aumentar o diâmetro de nenhuma das fibras
do músculo sóleo (FTI, FTII e fibras tipo híbridas - FTH), quando comparado ao
grupo somente imobilizado.
Existem muitos estudos controversos aos resultados aqui apresentados. Essa
divergência de dados pode ser atribuída ao tipo de alongamento aplicado,
intermitente ou mantido, a intensidade e a periodização do estímulo.
9.2.3 Alterações na Relação Capilar/fibra
significativo na análise da rC/F, como discutido anteriormente no experimento 1.
As técnicas de alongamento mantido, 10 e 21 dias, não foram eficazes para
modificar os prejuízos da imobilização sobre a rC/F no músculo sóleo, enquanto que,
para o músculo plantar, nenhuma alteração relevante foi observada após o
procedimento de desuso e reabilitação. Estudo realizado por Hellsten e
colaboradores (2008) mostrou aumento no fluxo sanguíneo e dos níveis de VEGF no
músculo vasto lateral de humanos após alongamento passivo. Os mesmos sugerem
que esses fatores estimulantes fisiológicos estão associados ao crescimento de
novos vasos no músculo esquelético. Talvez, o stress longitudinal passivo aqui
aplicado, através do alongamento, ou o tempo de aplicação deste estímulo não
tenham sido suficientes para estimular fatores angiogênicos e incrementar a
proporção de capilares.
Contudo, são escassos os estudos que abordam as alterações vasculares
desencadeadas por recursos de alongamento, seja ele mantido ou intermitente.
9.3 Alterações na Expressão dos Colágenos Tipo I e Tipo III
Após períodos de imobilização em posição encurtada, a atrofia muscular e a
proliferação do tecido conjuntivo são consideradas adaptações importantes no
sistema musculoesquelético. Ambas as alterações são causadas por mudanças na
síntese de proteínas musculares e colagênicas (KARPAKKA et al., 1990). Devido à
redução das proteínas contráteis e proliferação do tecido conjuntivo intramuscular,
alterações na flexibilidade e na elasticidade do músculo têm sido observadas
acometendo a capacidade funcional do mesmo.
O alongamento do musculoesquelético é conhecido como um potente
estímulo para remodelar e reorganizar as fibras de colágeno intramuscular
(WILLIAMS et al., 1988; GOLDSPINK et al., 2002). O presente estudo mostrou que
10 e 21 dias de alongamento passivo não foram suficientes para recuperar a
expressão dos colágenos tipo I e tipo III, dos músculos sóleo e plantar, alteradas
pelo procedimento de imobilização.
A biossíntese do colágeno é caracterizada por um amplo número de
modificações pré- e pós- transducionais das cadeias polipeptídicas. A prolil 4hidroxilase é uma enzima que cataliza as primeiras modificações da biossíntese do
colágeno. O aumento da atividade desta enzima catalizadora e subseqüente
acúmulo de colágeno têm sido observados em músculos submetidos ao trabalho de
hipertrofia (TURTO et al. 1974). Esse estudo pode justificar os achados aqui
apresentados para o protocolo de 21 dias de alongamento, já que o mesmo mostrou
aumento do diâmetro menor para as FTI, FTIIA e FTIIAD no músculo sóleo.
Estudo prévio realizado por Myllylä e colaboradores (1986) também mostrou
uma correlação importante entre o aumento do colágeno muscular e o grau de lesão
determinado por protocolos de remobilização acompanhados á regeneração
musculoesquelética. Esses dados podem subsidiar os achados aqui observados
para os animais submetidos à 10 dias de alongamento mantido, pois esse grupo
apresentou alterações histopatológicas mais significativas concomitantes ao
aumento da reatividade colagênica.
Embora os efeitos do alongamento no músculo esquelético têm sido
amplamente investigados, a influência mecânica do
alongamento passivo,
comumente utilizado na prática reabilitadora para recuperação do trofismo muscular
e reversão de possíveis alterações do tecido conjuntivo intramuscular após períodos
de desuso, ainda continua escassa dentro da literatura científica.
9.4 Limitações Experimento 2
Assim já destacado no item 6.4, grupos experimentais submetidos a
imobilização e posteriormente liberados durante 10 e 21 dias não foram incluídos no
desenho experimental deste estudo. Em 2009, Polizello analisou alterações
morfológicas, expressão dos colágenos tipo I e tipo III, proporção e diâmetro menor
dos diferentes tipos de fibras do músculo sóleo de ratas submetidas à imobilização
gessada por 14 dias. Este mesmo estudo contou com um grupo liberado após a
imobilização e um grupo submetido ao alongamento intermitente, duas vezes ao dia,
por 10 dias consecutivos. Os dados obtidos por Polizello (2009) mostraram que a
imobilização não alterou a proporção dos diferentes tipos de fibras do músculo sóleo
mas reduziu significativamente o diâmetro das mesmas além, de aumentar a
expressão do colágeno tipo I. Após 10 dias de livre movimentação não foi possível
observar melhora dessas variáveis. Já com o procedimento de alongamento o
músculo sóleo mostrou reestabelecer suas características basais frente a expressão
do colágeno tipo I, porém não incrementou o trofismo das fibras. Portanto, por
motivos similares aos apontados anteriormente, não são excluídas as possibilidades
que outros resultados poderiam ser obtidos nestes grupos (imobilizados e livres).
O período de 10 dias de alongamento mantido não foi eficaz para
restabelecer as características qualitativas e quantitativas para o músculo sóleo.
Somente 21 dias mostrou alcançar parcialmente, os valores de referência para as
variáveis aqui analisadas.
Para o músculo plantar o procedimento de alongamento mantido parece ser
mais eficaz, pois recuperou quase que totalmente as variáveis analisadas, exceto a
expressão dos colágenos.
11 RESULTADOS EXPERIMENTO 3
11.1 Morfologia
A análise morfológica no Experimento 3 foi realizada da mesma forma como
descrita nos experimentos supracitados. A partir da comparação entre os grupos
reabilitados por ambos os programas durante 10 dias (GITE(10) e GIAL(10)) foi
possível observar alterações citoarquiteturais mais relevantes, no músculo sóleo, de
animais submetidos ao exercício excêntrico quando comparado aos animais
submetidos ao alongamento (Tabela 12).
Por outro lado, os programas de exercício excêntrico e alongamento mantido,
realizados durante 21 dias, determinaram poucas alterações morfológicas no
músculo sóleo, sendo a centralização nuclear a mais evidente para o GIAL(21) e o
aumento da fosfatase ácida para o GITE(21) (Figura 25).
Para o músculo plantar, não foram observadas alterações significativas para
ambos os grupos sobrescritos.
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
100%
50%
83%*
33%
Fragmentação
50%
50%
17%*
17%
83%
-
33%*
-
Halo Basofílico
83%
50%
33%*
-
Necrose
17%
33%
-
17%*
Fibras Lobuladas
83%
-
-
-
Área de rarefação citoplasmática
-
-
-
-
Fibras Basofílicas
33%
-
-
-
100%
66%
50%
17%
Fibras em alvo
100%
50%*
17%*
17%*
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
Figura 25 - Fotomicrografias do músculo sóleo nas colorações hematoxilina-eosina (a, d, g, j – cortes
histoenzimológica para mATPase pH 4.6 (c, f, i, l – cortes transversais). a – grande variação no tamanho das
fibras, fibras lobuladas (setas grossas) e muitos núcleos centralizados (setas finas) (Barra: 21,2m); b –
centralização nuclear (seta fina), rarefação citoplasmática (cabeça de seta) e fibra com vacuolização (círculo)
(Barra: 23,6m). c – fibras em alvo (*) (Barra: 28,3m); d - variação no tamanho das fibras, fragmentação (setas
pontilhadas) e núcleos centralizados (setas finas) (Barra: 39,6m); e – poucos nucleos centralizados (seta fina) e
rarefação citoplamática (cabeça de seta). f – sem alterações (Barra: 35,6m); g- fibras poliédricas com núcleos
na periferia (Barra: 42,9m); h – áreas de fusão entre duas extremidades “cicatriz” (setas vazias); i - não
apresentaram alterações significativas (Barras: 43,9m); ); j- discreta centralização nuclear (seta fina) (Barra:
29,7m); k – poucos núcleos centralizados (setas finas); l - não apresentaram alterações significativas (Barras:
29,7m).
Microscopia Óptica de Alta Resolução (MOAR)
Os achados morfológicos encontrados através da MOAR também mostraram
alterações mais intensas para o músculo sóleo quando submetido ao treino
excêntrico quando comparado ao alongamento.
Com a manutenção dos estímulos, exercício excêntrico e alongamento por 21
dias,
o
músculo
sóleo
praticamente
retomou
as
características
normais
apresentando pequenos focos de fusão entre as extremidades de uma mesma fibra
e raros núcleos centralizados.
11.2 Morfometria
A comparação entre os protocolos de reabilitação de 10 e 21 dias adotados
pós-imobilização foi avaliada através da proporção entre os diferentes tipos de fibras
do músculo sóleo e plantar.
A análise da proporção do músculo sóleo de animais tratados por 10 dias,
exercício excêntrico e alongamento mantido, mostraram diferenças significativas na
proporção dos diferentes tipos de fibras I, IIA e IIAD. O GITE (10) mostrou maior
proporção para FTI e menor para as FTIIA e FTIIAD quando comparado ao GIAL (10).
Da mesma forma, as FTI apresentaram-se em maior proporção para o grupo
treinado excêntrico durante 21 dias quando comparado ao alongamento. Outro
achado significativo observado na análise de proporção dos animais tratados por 21
dias foi para o de fibra FTIIC, onde a mesma mostrou menores proporções para
GITE(21) quando comparado ao GIAL(21) (Figura 26).
Na análise das diferentes bandas da MHC, no músculo sóleo, foi possível
observar que o GITE(10) apresentou maior valores para MHCI e menores para
MHCIIa quando comparado ao GIAL(10). Enquanto o GITE(21) mostrou valores
superiores aos do GIAL(21) para ambos os tipos de MHC (Figura 27).
100%
4.30% 
0.94%
2.97%
20.82%
20.81%
10.42%
21.13% 
80%
25.47%
2.83%

75.39%

7.80%
9.07%
5.74%
60%
40%
65.48% 
68.34%
58.34%
20%
0%
GITE(10)
GIAL(10)
FTI
FTIIC
GITE(21)
FTIIA
GIAL(21)
FTIIAD
Figura 26 – Porcentagem das médias de FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD do músculo sóleo
nos diferentes grupos analisados do Experimento 3. p<0.01 comparado com GIAL(10);

p< 0.01 comparado com GIAL(21).
A análise da proporção do músculo plantar tanto dos animais submetidos ao
protocolo de exercício excêntrico quanto ao de alongamento, nos diferentes
períodos, 10 e 21 dias, não mostraram diferenças proporcionais significativas dentre
os tipos de fibra (Figura 28). Por outro lado, os grupos treinados pelo exercício, 10 e
21 dias, destacaram-se frente a expressão das bandas da MHCIIa e MHCIId
apresentando valores superiores os grupos alongados 10 e 21 dias, respectivamente
(figura 29).
A
B
diferentes bandas da MHC do músculo sóleo. B – Análise
quantitativa da expressão das bandas da MHCI e MHCIIa em
unidade arbitrária do músculo sóleo do experimento 3.
100%
1.02%
0.82%
62.92%
65.84%
21.60%
20.32%
0.56%
13.88%
1.39%
11.59%
14.24%
2.31%
11.79%
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
3.21%
80%
59.18%
61.76%
60%
40%
23.69%
20%
2.80%
20.92%
0%
FTI
FTIIC
FTIIA
FTIID
FTIIB
plantar nos diferentes grupos analisados do Experimento 3.
A
B
diferentes bandas da MHC do músculo plantar. B – Análise
quantitativa da expressão das bandas da MHCI, MHCIIa e MHCIId
em unidade arbitrária do músculo plantar do experimento 3.
Para análise do diâmetro menor do músculo sóleo não foram observadas
diferenças entre os grupos que compuseram os distintos protocolos de reabilitação
do experimento 3 (Tabela 13). Do mesmo modo o músculo plantar não mostrou
resultados relevantes, já que o mesmo apresentou apenas aumento do diâmetro
das FTIIC dos grupos treinado excentricamente (Tabela 14).
Tabela 13 – Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA e FTIIAD com os respectivos intervalos
de confiança de 95% do músculo sóleo dos diferentes grupos que compuseram o experimento 3.
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
FTI
40.52
(37– 44)
40.40
(37 – 44)
41.96
(39 – 45)
41.48
(38 – 45)
FTIIC
37.18
(33– 41)
35.08
(31 – 39)
35.96
(32 – 40)
34.78
(31 – 38)
FTIIA
42.20
(39 – 46)
38.56
(35 – 42)
39.52
(36 – 43)
39.61
(36 – 43)
FTIIAD
39.51
(35 – 43.5)
38.24
(35 – 42)
35.92
(31 – 41)
39.33
(35 – 43)
Tabela 14 – Médias do diâmetro menor das FTI, FTIIC, FTIIA, FTIID e FTIIB com os respectivos
intervalos de confiança de 95% do músculo plantar dos diferentes grupos que compuseram o
experimento 3.

GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
FTI
32.29
(30 – 35)
32.07
(27 – 34)
36.78
(34 – 39)
36.08
(34 – 38)
FTIIC
32.66
(28 – 37)
25.40
(22 – 28)
33.46
(31 – 36)
28.32
(25 – 31)
FTIIA
33.85
(31.5 – 36)
31.89
(29.5 – 34)
34.69
(32 – 37)
33.67
(31 – 36)
FTIID
37.74
(35 – 40)
34.10
(32 – 36)
38.07
(36 – 40)
38.59
(36 – 41)
FTIIB
40.93
(38 – 44)
35.85
(38 – 44)
–
47.99
(45 – 51)
p<0.01 comparado com GIAL(10);  p< 0.01 comparado com GIAL(21).
A análise da rC/F mostrou aumento desta variável apenas no grupo
submetido ao treinamento excêntrico durante 21 dias (Tabela 15) quando
comparado ao alongamento de 21 dias. Enquanto para o plantar não foram
observadas alterações significativas.
Tabela 15 – Médias da relação capilar/fibra com os respectivos intervalos de confiança de 95% dos

GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
Sóleo
2.16
(2– 2.3)
2.08
(1.9 – 2.2)
2.34
(2 – 2.5)
2.11
(1.9 – 2.2)
Plantar
1.48
(1.4 – 2)
1.52
(1.4 – 1.7)
1.72
(1.5 – 2)
1.63
(1.5 – 1.8)
p< 0.03 comparado com GIAL(21).
11.3 Colágenos tipo I e tipo III
Na comparação entre os grupos submetidos a 10 dias de reabilitação, no
músculo sóleo, os colágenos dos tipos I e III mostram maior expressão no GITE(10)
quando comparado ao GIAL(10). Por outro lado essa relação mostrou características
inversas para os protocolos de 21 dias, onde o GIAL(21) apresentou maior
imunoreatividade para os colágenos quando comparado ao GITE(21) (Tabela 16 e
Figuras 30 e 31).
Tabela 16 – Análise semi-quantitativa da imunoreatividade dos colágenos tipos I e III nos músculos
Sóleo e Plantar para os diferentes grupos analisados no Experimento 3.
Grupos
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
Colágeno Tipo I
Sóleo
Plantar
+++
±
++
+
+
++
-
Colágeno Tipo III
Sóleo
Plantar
+++
++
++
++
++
++
+++
++
Para o músculo plantar os protocolos de reabilitação não apresentaram
diferenças significativas entre si (Tabela 16 e Figuras 30 e 31).
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
Figura 30 - Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo (a-d) e plantar (e-h)
demonstrando a expressão do colágeno tipo I através da imunomarcação pelo método imunohistoquímico. a, b – Observe no GITE(10) intensa reatividade para músculo sóleo quando
comparado ao GIAL(10) (Barras= 65m), c, d – Observe menor expressão do colágeno I no
GITE(21) quando comparado ao GIAL(21) (Barras=76; 94m, respectivamente); e, f, g, h imunomarcação normal do colágeno tipo I para o músculo plantar (Barras=100, 75m,
respectivamente).
GITE(10)
GIAL(10)
GITE(21)
GIAL(21)
Figura 31 - Fotomicrografias das lâminas dos músculos sóleo (a-d) e plantar (e-h)
demonstrando a expressão do colágeno tipo I através da imunomarcação pelo método imunohistoquímico. a, b - intensa reatividade é observada no GITE(10) no músculo sóleo quando
comparado ao GIAL(10) (Barras= 65m), c, d – Observe menor expressão do colágeno III no
GITE(21):quando comparado ao GIAL(21) (Barra=94m); e, f, g, h - imunomarcação normal do
colágeno tipo III para o músculo plantar (Barras=100, 75m, respectivamente).
12 DISCUSSÃO EXPERIMENTO 3
O treinamento excêntrico realizado durante 10 dias mostrou alterações
citoarquiteturais mais intensas, para o músculo sóleo, quando comparado ao
alongamento neste mesmo período. Esses achados podem ser justificados pelas
diferentes cargas tensionais impostas em uma fase mais aguda após a imobilização.
O exercício excêntrico desencadeia forças de cisalhamento nos constituintes do
músculo esquelético enquanto o alongamento gera forças longitudinais. Essas
diferenças vetoriais para a força podem favorecer a presença de maiores alterações
durante a fase inicial da resposta do tecido muscular para o exercício excêntrico
quando comparado ao alongamento. Os músculos sóleos dos animais do GITE(21) e
GIAL(21) não apresentaram alterações significativas quando comparados entre si. Por
outro lado, quando comparados aos grupos submetidos a reabilitação durante 10
dias foi possível observar características citoarquiteturais mais condizentes ao
normal. Supõe-se que o tecido muscular é capaz de se adaptar aos estímulos
mecânicos quando exposto a períodos mais longos de treinamentos. Sakakima et
al., (2004) observaram que músculo sóleo é capaz finalizar o processo de reparação
tecidual quanto treinado por maior período de tempo, pelo exercício excêntrico.
Mais uma vez o músculo sóleo mostrou maior destaque frente aos diferentes
estímulos aplicados. Na análise proporcional dos diferentes tipos de fibras, os
programas de exercício excêntrico aplicados mostraram reduzir fibras de caráter
mais glicolítico, FTIIAD e FTIIA após 10 dias e FTIIC após 21 dias de treinamento, e
aumentar significativamente a proporção das FTI, quando comparados com os
grupos de alongamento, nos respectivos períodos. Esses achados sugerem e
corroboram com estudos científicos, já citados anteriormente no corpo do presente
estudo, que o exercício excêntrico têm maior poder para desencadear o trânsito de
fibras rápidas para lentas quando comparados ao alongamento passivo. Por outro
lado, o trofismo dos diferentes tipos de fibras do músculo sóleo não mostraram
diferenças significativas quando comparamos os distintos programas de reabilitação,
exercício excêntrico e alongamento passivo, aqui apresentados. Já o músculo
plantar apresentou um sutil aumento no número das FTIIC nos grupos treinados
excentricamente.
As tensões longitudinal e de cisalhamento impostas por 10 dias, pelo
alongamento e exercício excêntrico, mostraram não estimular a síntese de novos
capilares no músculo sóleo quando comparados os grupos entre si. Já o treinamento
excêntrico aplicado por um maior período (21 dias) mostrou incrementar a rC/F, pois
o mesmo apresentou valores superiores ao grupo alongado. Apesar do baixo
consumo de oxigênio imposto pelo treinamento excêntrico, fatores estimulantes da
angiogênese, como a hipóxia, podem ter induzido eficazmente a formação de novos
capilares. O aumento do número de capilares está intimamente relacionado à
manutenção adequada de oxigenação do tecido para permitir o desempenho
muscular ideal (DEGENS et al. 2006; KANO et al. 2002; RIPOLL; SILLAU
BANCHERO, 1979).
A pressão de oxigênio local regula a resposta angiogênica do tecido. Degens
et al. (2001) demonstraram que animais colocados em situação de hipóxia
apresentaram aumento da rC/F dos músculos sóleo e diafragma. Acredita-se que o
exercício excêntrico requer maior aporte sanguíneo local e, devido a essa
necessidade pode ocorrer aumento do stress de cisalhamento no tecido vascular.
Fator esse que não parecem ser tão requisitado pelo procedimento de alongamento
mantido. Assim, a exigência metabólica dada pelo exercício excêntrico pode ser
maior do que aquela observada no alongamento mantido e talvez, seria a
responsável pelo maior estímulo angiogênico no tecido muscular.
As características colagênicas observadas, no músculo sóleo, para os
colágenos dos tipos I e III mostraram estar mais expressas no GITE(10) quando
comparado com o GIAL(10). Estudos científicos têm relatado que o exercício do tipo
excêntrico determina sérios danos ao músculo esquelético e ao tecido conjuntivo,
incluindo o colágeno (XIAO-YAN et al., 1999). Aceleração da síntese e acúmulo de
colágeno foi observada no músculo de roedores durante o reparo de lesões
induzidas pelo exercício (MYLLYLÄ et al., 1986). Com a manutenção do estímulo
mecânico foi observado que a expressão de ambos os tipos de colágeno reduziram
no grupo treinado 21 dias em esteira enquanto o grupo alongado neste mesmo
período parece ter estimulado a síntese de colágeno. Uma hipótese sugestiva, para
os achados do grupo treinado excêntrico, é a plasticidade muscular onde, o músculo
pode ter se adaptado ao estímulo e tornando-se mais resistente as lesões. Como
estudo realizado por Sakakima e colaboradores (2004) que apresentou resultados
satisfatórios de adaptação muscular após maior tempo de treinamento.
Diferenças nas características contrátil, estrutural e funcional do músculo alvo
podem interferir no perfil muscular e, consequentemente, na sua resposta frente ao
desuso e ao tipo/intensidade dos protocolos de reabilitação. Dentro da literatura
científica são escassos os estudos que confrontam métodos de força passiva e força
ativa frente a reabilitação de músculos com a mesma função e características
contráteis distintas.
Face ao confronto entre os protocolos, o treinamento excêntrico foi mais
efetivo no restabelecimento do conjunto de variáveis analisadas, citoarquiteturais,
quantitativas e semi-quantitativas, que o alongamento mantido.
Conclusões - 125
14 CONCLUSÕES
Os resultados aqui apresentados, nos experimentos 1, 2 e 3, parecem indicar
alterações citoarquiteturais mais significativas, frente à hipocinesia, para o músculo
sóleo do que para o plantar.
Ao retomar o questionamento do início deste estudo, concluímos que o período
terapêutico de 10 dias não é suficiente para restabelecer as características de
músculos funcionalmente similares, porém bioquimicamente distintos. O músculo
sóleo necessita de período mais prolongado de reabilitação do que o plantar.
Referências Bibliográficas - 127
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Anexos - 139
ANEXOS
ANEXO A – Cópia do artigo Characterization of Fiber Types in Different Muscles of
the Hindlimb in Female Weanling and Adult Wistar Rats aceito para publicação na
revista Acta Histochemica et Cytochemica. 44 (1): 000–000, 2011.
ANEXO B – Cópia da aceitação do resumo, Eccentric training improves collagen
type I and III in rat skeletal muscles after disuse, no 16th International WCPT
Congress – World Physical Therapy, Amsterdam, Holanda, a ser realizado em junho
de 2011.
ANEXO C – Cópia da aceitação do resumo, Rehabilitation using eccentric training
and maintained stretching on capillarization in rat skeletal muscles after, no 16th
International WCPT Congress – World Physical Therapy, Amsterdam, Holanda, a ser
realizado em junho de 2011.
ANEXO D – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Phasic muscles
respond promptly to eccentric training after immobilization than tonic muscles, no II
International Meeting in Exercise Physiology, São Pedro, Brasil, maio 2011.
ANEXO E – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Estudo das
alterações do tecido conjuntivo perimisial determinadas pelos protocolos de
alongamento e exercício excêntrico, no 18º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro
2010.
ANEXO F – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, A influência do
treinamento excêntrico no tecido conjuntivo perimisial, no XVIII COBRAF, Rio de
Janeiro, outubro 2009.
ANEXO G – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Exercício excêntrico
estimula a angiogênese no músculo sóleo após imobilização de 10 dias, no XVIII
COBRAF, Rio de Janeiro, outubro 2009.
ANEXO H – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Protocolo excêntrico
de reabilitação restabelece colágeno muscular após desuso, no XVIII COBRAF, Rio
de Janeiro, outubro 2009.
ANEXO I – Cópia resumo publicado do trabalho, Twenty-one days of eccentric
exercise increment further capillarization of soleus muscle in adult rats than baby rats
afther immobilization, publicado nos anais. E cópia do certificado de participação do
45th International Congress on Anatomy and 46th Lodja Symposium on
Histochemystry, Pilsen, República Tcheca, setembro 2009, para apresentação do
poster.
ANEXO J – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Análise dos efeitos do
exercício excêntrico sobre a microcirculação dos músculos sóleo e plantar de ratas
submetidas à imobilização, no 16º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro 2008.
ANEXO K – Cópia do certificado de apresentação do trabalho. Efeitos do exercício
excêntrico na expressão de diferentes tipos de colágeno muscular após imobilização
do membros posterior de ratas, no 16º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro 2008.
Anexos - 140
ANEXO L – Protocolo de aprovação do trabalho pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal (CETEA) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo.
Anexos - 141
ANEXO A – Cópia do artigo Characterization of Fiber Types in Different
Muscles of the Hindlimb in Female Weanling and Adult Wistar Rats aceito para
publicação na revista Acta Histochemica et Cytochemica. 44 (1): 000–000, 2011.
Anexos - 142
ANEXO B – Cópia do certificado de apresentação do trabalho Eccentric
training improves collagen type I and III in rat skeletal muscles after disuse, no
16th International WCPT Congress – World Physical Therapy, Amsterdam,
Holanda, a ser realizado em junho de 2011.
Anexos - 143
ANEXO C – Cópia do certificado de apresentação do trabalho Rehabilitation
using eccentric training and maintained stretching on capillarization in rat
skeletal muscles after, no 16th International WCPT Congress – World Physical
Therapy, Amsterdam, Holanda, a ser realizado em junho de 2011.
Anexos - 144
ANEXO D – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Phasic muscles
respond promptly to eccentric training after immobilization than tonic muscles,
no II International Meeting in Exercise Physiology, São Pedro, Brasil, maio
2011.
Anexos - 145
ANEXO E – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Estudo das
alterações do tecido conjuntivo perimisial determinadas pelos protocolos de
alongamento e exercício excêntrico, no 18º SIICUSP, Ribeirão Preto, novembro
2010.
Anexos - 146
ANEXO F – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, A influência do
treinamento excêntrico no tecido conjuntivo perimisial, no XVIII COBRAF, Rio
de Janeiro, outubro 2009.
Anexos - 147
ANEXO G – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Exercício
excêntrico estimula a angiogênese no músculo sóleo após imobilização de 10
dias, no XVIII COBRAF, Rio de Janeiro, outubro 2009.
Anexos - 148
ANEXO H – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Protocolo
excêntrico de reabilitação restabelece colágeno muscular após desuso, no
XVIII COBRAF, Rio de Janeiro, outubro 2009.
Anexos - 149
ANEXO I – Cópia resumo publicado do trabalho, Twenty-one days of eccentric
exercise increment further capillarization of soleus muscle in adult rats than
baby rats afther immobilization, publicado nos anais. E cópia do certificado de
participação do 45th International Congress on Anatomy and 46th Lodja
Symposium on Histochemystry, Pilsen, República Tcheca, setembro 2009, para
apresentação do poster.
Anexos - 150
ANEXO J – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, Análise dos
efeitos da exercício excêntrico sobre a microcirculação dos músculos sóleo e
plantar de ratas submetidas à imobilização, no 16º SIICUSP, Ribeirão Preto,
novembro 2008.
Anexos - 151
ANEXO K – Cópia do certificado de apresentação do trabalho, . Efeitos do
exercício excêntrico na expressão de diferentes tipos de colágeno muscular
após imobilização do membros posterior de ratas, no 16º SIICUSP, Ribeirão
Preto, novembro 2008.
Anexos - 152
ANEXO L – Protocolo de aprovação do trabalho pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal (CETEA) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo.

universidade de são paulo - Pós

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