Link do Arquivo.

11/06/2014
MARCADORES SOROLÓGICOS PARA O
DIAGNÓSTICO E ACOMPANHAMENTO
DAS HEPATITES POR VÍRUS
41º Congresso Brasileiro de Análises Clínicas
Porto Alegre, 2014
Amadeo Sáez-Alquezar
HEPATITES
Inflamação do fígado - diversas etiologias
Vírus (Tropismo)
Drogas
Álcool
Auto - Imunidade
1
11/06/2014
Hepatites por Vírus
Hepatite por vírus A
Hepatite por vírus B
Hepatite por vírus C
Hepatite por vírus D
Hepatite por vírus E
Hepatites Não AA -E
HAV
HBV
HCV
HDV
HEV
.......
Vírus Epstein Bar, Citomegalovírus , Herpes, outros
Vírus das Hepatites
A
E
B
C
T. Fecal Oral
T. Parenteral
Formas Crônicas
D
Outros
2
11/06/2014
Características dos Virus das Hepatites
Agente
Tamanho nm
A
B
C
D
E
HAV
HBV
HCV
HDV
HEV
27-32
42
55-65
36
27-34
Envelope
Não
Sim
Sim
do HBV
Não
Genoma
RNA
DNA
RNA
RNA
RNA
Formas de Transmissão
Fecal/oral
Sim
Não
Não
Não
Sim
Parenteral
Não
Sim
Sim
Sim
Não
Sexual
Não
Sim
Pouco
frequente
Sim
Não
Sim
Não
Formas Crônicas
Não
5 – 7%
~80%
Triagem em doadores
O laboratório para o Diagnóstico e Seguimento
das Hepatites por Vírus
• Testes sorológicos.
– Marcadores sorológicos (Ac, Ag, Ag/Ac)
• Testes de biologia molecular
– Amplificação de ácidos nucleicos
– Sequenciamento
• Testes bioquímicos
– Enzimas, pigmentos biliares, proteínas.
• Testes de histologia hepática
– Material de biopsia
– Outros
3
11/06/2014
HAV e HEV
• HAV
–
–
–
–
Contato pessoal
Agua e alimentos contaminados
Formas graves: raras (> com a idade)
Vacina
• HEV
– Agua e alimentos contaminados
– Formas graves
• Gestantes (3º trimestre)
• > com a idade
Marcadores Sorológicos
da Hepatite por Vírus A
AntiAnti-VHA
IgM
Fase Aguda
AntiAnti-VHA
IgG
Recuperação
Imunidade
4
11/06/2014
Marcadores Sorológicos
da Hepatite por Vírus E
AntiAnti-VHE
IgM
Fase Aguda
AntiAnti-VHE
IgG
Recuperação
Imunidade
Infecção pelo Vírus da Hepatite B (HBV)
• A prevalência de infecção pelo HBV, no mundo,
está ao redor de
4 – 5% da população total do planeta
– Portadores crónicos assintomáticos
– Hepatite crônica (350 milhões)
– Câncer hepático
• Ocorrem em torno de 50 milhões de novos casos,
por ano, de infecção pelo HBV
5
11/06/2014
Prevalência de HBV no Mudo
Source: CDC and Prevention. MMWR 2008;57(RR-8):1-20.
Formas de Transmissão do HBV
Pessoa a pessoa
Sangue contaminado / Contato sexual
Grupos de risco
Transfusão sanguínea / Transplante de órgãos
(Vertical)
Uso de agulhas e seringas contaminadas
Usuários de drogas, nosocomial
Acidentes de laboratório
Contato sexual com múltiplos parceiros (as)
Homens que fazem sexo com homens
Hemodiálise
Atendentes de saúde/ contato domestico
Tattoos / body piercing
6
11/06/2014
Infecção pelo HBV - Evolução
Adultos
80% Assintomática
5-7%
20% Doença Aguda
Infecção crônica
>1% Hepatite Fulminante
5% a 10%
30%
Câncer
hepático
Cirrose
Crianças
23%
Quase sempre Subclínica
En 5 anos
Falência
hepática
Transplante ou
óbito
Infecção Crônica pelo HBV
Risco de
infecção crônica
Risco para
Câncer hepático
Período
Peri natal
> 90%
25%
Crianças
1 a 5 anos
25 – 50%
25%
Crianças (>5)
Adultos
6 – 10%
15%
Infecção
7
11/06/2014
HBV – DNA circular de dupla hélice parcialmente
fechada e envoltura lipídica
Genoma: 3.200 nucleotídeos
4 Regiões abertas para leitura: S, P, C e X
AgHBs
DNA Polimerase
AgHBc
AgHBe
Marcadores Sorológicos durante a
infecção pelo HBV
AgHBs
AntiAnti-HBs
AntiAnti-HBc IgM
AgHBc
AntiAnti-HBc IgG
AgHBe
AntiAnti-HBe
8
11/06/2014
Infecção pelo HBV
Evolução normal
Infecção
HBV - DNA
Semanas
Anti-HBc Total
AgHBs
Anti-HBe
Forma crônica
AgHBe
AgHBe
6 meses
Tempo
Marcadores Sorológicos durante a infecção
pelo HBV
• AgHBs:
AgHBs:
– 1º marcador sorológico que aparece.
– Presente na fase aguda e crônica
• Anti HBc (IgG)
IgG)
– Presente na fase aguda e crônica
• AntiAnti-HBc (IgM)
IgM)
– Diferenciação entre infecção aguda e crônica
• AgHBe/
AgHBe/antianti-HBe
– Acompanhamento da evolução (aguda e crónica)
– Índice de replicação viral
• AntiAnti-HBs
– Avaliação de cura e resposta à vacina
9
11/06/2014
Perfis Sorológicos em Indivíduos Infectados pelo HBV
PERFIS
Ag HBs
AntiAnti-HBc
(IgM)
IgM)
AntiAnti-HBc
(IgG)
IgG)
AntiAnti-HBs
1
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
2
3
Imunidade por infecção
4
natural
5 vacina
Imunidade por
Hepatite B crônica
6
??
7
PERFIL
Ag HBs
AntiAnti-HBc
(IgM)
IgM)
AntiAnti-HBc
(IgG)
IgG)
AntiAnti-HBs
7
-
-
+
-
1- Infecção anterior pelo HBV (com recuperação).
recuperação).
2- Infecção aguda em vias de recuperação.
recuperação.
3- O AgHBs está em níveis muito baixos:
baixos: Infecção crônica
(Low level chronic infection)
infection)
4- Mutantes do AgHBs:
AgHBs: Mesmo que a maioria dos testes
apresentem alta sensibilidade para detecção do AgHBs,
AgHBs, alguns
testes podem não detectar mutantes.
mutantes.
“Hepatite B Oculta”
5- Resultado falso positivo para o antianti-HBc.
HBc.
10
11/06/2014
Teste confirmatório para o antianti-HBc
Incubação das amostras com antígeno HBc (rHBc Ag) para
Inibição da leitura
% de inibição em amostras anti-HBc positivas (n=55) e anti-HBc
Negativas (n=30). Diferença significativa (p<0,001)
Simple confirmatory assay for anti-HBc reactivity
Huzly D, et al. J Clin Virol (2011)
Abbott Architect i1000 anti-HBc II
DiaSorin LIAISON anti-HB
Siemens ADVIA Centaur HBcT
Variabilidade antigênica e genética do HBV
• Subtipos
• Antígeno de superfície (AgHBs
(AgHBs)
AgHBs)
• Genótipos
• Grupos gnômicos
• Mutantes
• Mutações no genoma viral
11
11/06/2014
Subtipos sorológicos do HBV
Afinidade Ac:
-infecção pelo HBV
-vacinados
-Gama globulinas
-kits diagnósticos
a
d
y
w
r
adw2
adw4
adq+
adq+
adqadq-
Determinantes antigênicos
Determinante “a”
Seus determinantes: d/y ou w/r
w
ayw1
ayw2
ayw3
ayw4
r
ayr
Genótipos do HBV
A–B–C–D–E–F–G–H–I-J
HBV Genótipos
Distribuição Geográfica
A, D
Global
B,C
> Prevalência na Ásia
E
África Ocidental e central
F
Centro América e América do Sul
G
USA, Japão e Europa
H
Centro América e Regiões do Sul e USA
I
Oriente e Sudeste de Ásia
J
Japão
Zhang Y, Li C, Zhang Y, Zhu H, et al. (2013) Comparative Analysis of CpG Islands among HBV Genotypes. PLoS ONE 8(2): e56711.
doi:10.1371/journal.pone.0056711
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0056711
12
11/06/2014
Importância dos Genótipos
• Prever o curso clínico da doença e a resposta
terapêutica
– Genótipo C: pode evoluir para formas mais graves e
com maior risco para câncer hepático.
– Genótipos A-B: Respondem melhor ao tratamento com
intérferon
• Comportamento diferente frente a kits
diagnósticos
Genótipo A, usado como padrão nos “standards”
internacionais e na fabricação de kits AgHBs
Mutantes do HBV
Gerados espontaneamente durante o curso da
infecção natural pelo HBV
Gerados num ambiente de pressão seletiva
Uso de imuno profilaxia ativa
Uso de imuno profilaxia passiva
Tratamento com antivirais
13
11/06/2014
Principais Mutações observadas no HBV
Mutantes prépré-Core
• Encontrados em cepas mais virulentas
• Ex: aa gly, substituído por aa arg [PCR DNA-HBV (+) e AgHBe (-)]
Mutantes no gene P (polimerase)
• Resistência a antivirais
• Lamivudina, Adefovir…
Mutantes no gene X
• Associados ao surgimento de câncer hepático
Mutantes no gene S
• Modificam os epitôpos imuno dominantes do determinante
antigénico “a”
Desempenho de diversos kits AgHBs frente a um
painel de Mutantes AgHBs rec
Performance de kits diagnósticos Ag HBs
Painel de referência: Mutantes Ag HBs rec
Ab : MONO / POLI
Ab: MONO / MONO
Fluorescência
EIA color
Quimiolum
EIA color
Mutantes AgHBs rec
AxSYM
HBsAg (V2)
Thr126-Ser
7,96 (Pos)
Gln129-His
7,02 (Pos
Met133-Leu
7,17 (Pos)
Asp144-Ala
5,56 (Pos)
Gly145-Arg
5,56 (Pos)
Thr126-Ser + Gly145-Arg
4,77 (Pos)
Pro142=Leu + Gly145-Arg
5,80 (Pos)
Pro142-Ser + Gly145-Arg
5,94 (Pos)
Asp144-Ala + Gly145-Arg
5,25 (Pos)
Controle Negativo
1,06 (Neg)
Controle Positivo*
8,69 (Pos)
(*): recombinant Wild-type HBS Ag
VIDAS
HBsAg
(ultra)
9,7
8,5
8,7
5,4
5,8
10,5
4,9
5,8
6,1
0,08
1,3
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Pos)
Hepanostica MONOLISA
HBsAg
HBsAg
Elecsys
Uniform II
(Ultra)
HBsAg I
1,96
1,96
2,00
1,48
1,53
1,36
1,29
1,48
1,58
0,54
2,20
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Pos)
6,19
7,49
6,35
6,33
4,91
4,20
3,74
5,04
4,19
0,57
7,53
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Pos)
9,88
9,70
8,59
7,73
0,46
0,48
0,48
0,46
0,47
0,47
10,1
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Pos)
Vitros
HBsAg
12,9
13,7
11,2
0,15
0,06
0,06
0,06
0,04
0,09
0,08
15,6
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Pos)
Enzygnost
HBsAg
9,35
8,81
9,01
7,61
0.69
0,83
0,61
0,26
0,61
0,39
9,45
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Pos)
Ortho
HBsAg
5,33
6,43
5,65
0,71
0,43
0,47
0,43
0,43
0,47
0,45
7,35
(Pos)
(Pos)
(Pos)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Neg)
(Pos)
Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B
Virus mutation within “a” determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1): 108-114.
14
11/06/2014
DETECÇÃO DE MUTANTES DO AgHBs
AgHBs
Bioelisa colour
65,7
Enzygnost 6.0
75,3
ETI-MAK-4
82,2
Murex V3
84,9
Prism
87,7
Hepanostika Ultra
87,7
Architect
96,9
Monolisa Ultra
97,2
0
20
40
60
80
100
MUTANTES
G145R; P120S/T125M/P127T/S143L; Y100S/T114S/T118V/N131T/K133I/F134N/P142S/T143L/G145K; S113T/T143S
T123N/C124R; P120T; T123N; D144A; M133T/Y161F; Q129R/G130N/A166V; M133T/Y161F; Q129R/G130N/A166V;
M133T; T118A/D144E; T125M/P127T/T143L; S143L; L109P/T127A/S143L; K141E/K160R; C147W; 122NT123;
G119R; P120L; G119R; P120L; G119R/P120L; T126S
DESEMPENHO NA DETECÇÃO DE MUTANTES / AgHBs
ISBT XXth Regional Congress, Nagoya, 2009
15
11/06/2014
Hepatite B Oculta
• Infecção oculta pelo HBV definedefine-se como a
presença de HBVHBV-DNA no sangue ou tecido
hepático em pacientes que são negativos
para o antígeno de superfície (AgHBs
(AgHBs)
AgHBs)
• Esses pacientes poderão ser positivos, ou
não, para anticorpos contra o HBV
Marcadores da Infecção pelo HBV
Perfis observados na triagem de doadores
PERFIL Ag HBs Anti-HBc
4
5
Neg
Neg
Pos
Pos
Anti-HBs
Neg
Pos
Ag HBe Anti-HBe HBV DNA
Pos/Neg
Pos/Neg
Pos
Pos
4 e 5: Hepatite B oculta. (DNA em baixas concentrações: <103 UI/ml)
16
11/06/2014
Testes de Biologia molecular para HBV DNA
• HBV – DNA – PCR (Carga Viral)
– 6,0 UI/mL
UI/mL (0,78 log10) a 1.100.000.000 UI/mL
UI/mL (8,04
log10)
• Com o aumento da sensibilidade do teste
Quantitativo, o teste Qualitativo se torna
desnecessário
TESTES PARA DIAGNÓSTICO E NA TRIAGEM
SOROLÓGICA PARA INTERROMPER A
TRANSMISSÃO DO HBV POR TRANSFUSÃO
PARÂMETRO
CARACTERÍSTICAS
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
Detecção de ≤ 0,13 UI / mL*
Ag HBs
SENSIBILIDADE COM DIVERSIDADE GENÉTICA
Detecção do maior número de mutantes do gene S
Detecção de Genótipos / subtipos
SENSIBILIDADE CLÍNICA
Detecção precoce
ESPECIFICIDADE
≥ 99,6%
(*): 2nd WHO International Standard
BIO-FLASH HBsAg – Sensibilidade analítica: 0,035 UI/mL
17
11/06/2014
TESTES PARA DIAGNÓSTICO E NA TRIAGEM
SOROLÓGICA PARA INTERROMPER A
TRANSMISSÃO DO HBV POR TRANSFUSÃO
PARÂMETRO
CARACTERÍSTICAS
ELIMINAR O RISCO RESIDUAL DE TRANSMISSÃO DO HBV
Anti HBc
1234-
Testes para AgHBs com baixa sensibilidade
Níveis de AgHBs indetectáveis
Mutantes no determinante “a” do HBV
Hepatite B oculta
SENSIBILIDADE RECOMENDADA:
≤ 0,7 PEI / mL
ESPECIFICIDADE RECOMENDADA:
≥ 99,6 %
Testes sorológicos para os marcadores da
Hepatite por Vírus B
• ELISA ou CLIA
– Não se observa diferença, no desempenho, que
dependerá das características de cada kit.
• Para o Ag HBs
– Recomenda-se alta sensibilidade analítica
• ≤ 0,13 UI / mL
– Capazes de detectar o maior número possível de
variantes.
18
11/06/2014
Testes ELISA
HRP
H2O2/TMB
HRP
H2SO4
Positivo
Fase sólida
Leitura da
Intensidade de
cor
Plataformas ELISA
Lavadora
Leitora
Leitora
EVOLIS
HAMILTON
19
11/06/2014
Quimiluminescência CLIA
Produção de luz por uma reação química
–
–
–
–
Reação de óxidoóxido-redução
Sensibilidade: ato mol 10-18 a zeptomol 10-21
Derivados do isoluminol (H2O2 + catalizador) 1976
Ésteres de acridina (NaOH + H2O2) 1978
• H2O2 agente oxidante
• NaOH altera o pH para que ocorra a reação de oxidação
Ester de acridina
Aplicações da Quimiluminescência no
laboratório
•
•
•
•
•
•
•
Marcadores sorológicos
Hormônios
Marcadores tumorais,
Drogas
Imuno globulinas
Vitaminas
Homocisteina…
Homocisteina…
Os testes utilizam anticorpos ligados a um marcador luminescente (cromógeno)
que pode ser o luminol ou derivados de acridina em sistema avidina-biotina.
Testes quantitativos que apresentam alta sensibilidade.
Quando se muda um substrato cromogênico por um luminescente,
obtém-se uma sensibilidade 10X maior
20
11/06/2014
Plataformas de CLIA
Abbott - Architect i2000SR
DiaSorin – Liaison XL
Biokit – BIO FLASH
CLIA - ARCHITECT® HIV Ag/Ab Combo Assay
HIV-1 ‘M’ rgp41
HIV-1 ‘O’ rgp41
HIV-2 rgp36
Anti-p24 MAb
+
Ag and/or Ab (Sample)
Coated microparticles
Capture
& Wash
Acrydinylated
recombinant proteins,
peptides, and MAb
+
— Ac
— Ac
— Ac
— Ac
— Ac
Chemiluminescent
signal
Capture
& Wash
Trigger
Devare_Sept. 2009
21
11/06/2014
BIO-FLASH HBsAg
Reaction scheme
ELISA x CLIA
Suporte
ELISA
CLIA
Micro placa
Partícula magnética
Possibilidades
Sensibilidade
Semelhante
Especificidade
Semelhante (?)
Velocidade
Acesso aleatório
+++
++++
Pequeno porte
Grande porte
Pequeno porte
Grande porte
Equipamentos
Abertos / Fechados
Fechados
Tendência nos
próximos anos
Diminuição gradativa,
principalmente em
grandes rotinas
Aumentar
Opções
22
11/06/2014
DESEMPENHO TOTAL
Testes Sorológicos
•Características e Desempenho
Plataformas ELISA/CLIA
•Aplicação e Desempenho
Controle de Qualidade
Aplicação obrigatória de procedimentos de
Controle de Qualidade interno e externo
• Uso de SCI* diariamente em todas as corridas
• Estabelecer um critério para aceitar as corridas
e usausa-lo.
• Avaliação lote a lote dos reagentes (kits)
• Participar de pelo menos um Programa de
Avaliação Externa com avaliações mensais
(*): Soro Controle Interno de baixa reatividade
23
11/06/2014
Vírus da Hepatite Delta (VHD)
Vírus da Hepatite B
Vírus da Hepatite Delta
Envelope
AgHBs
Envelope
AgHBs
DNA
polimerase
RNA
42 nm
DNA
Core (27 nm)
AgHBc
AgHBe
Core (27 nm)
Virus Delta
Vírus Delta
Marcadores Sorológicos
da Hepatite por Vírus Delta
Ag VHD
AntiAnti-VHD
IgM
AntiAnti-VHD
IgG
Fase aguda
Fase aguda
Recuperação
Imunidade
24
11/06/2014
Diagnóstico da infecção por VHD
AgHBs
AntiAnti-HBc
IgM
AntiAnti-VHD
IgM
AntiAnti-VHD
Total
+
+
+
CoCo-infecção
+
Neg
+
Super
Infecção
+
+/ -
Neg
+
Infecção
anterior
+
+/ -
Neg
Neg
Ausência de
infecção
∆
Interpretação
∆
B
B
CoCo-infecção
Super infecção
Hepatite por Vírus C (HCV)
170 milhões de pessoas infectadas no Mundo
(estimativa que não corresponde à realidade)
Hepatite crônica (80% - 85%)
Cirrose hepática (20%)
Câncer hepático (10% - 20%)
25
11/06/2014
Transmissão do HCV
• Principal via: parenteral
– Entre usuários de drogas intravenosas
– Por agulhas e seringas
• Esterilização inadequada ou reutilização
– Transfusão de Sangue
– Transplante de órgãos
• Vertical
• Sexual (pouco eficiente)
• Ocupacional
Historia Natural da Infecção pelo HCV
CDC
26
11/06/2014
Detecção da infecção pelo HCV
Testes Laboratoriais
• Indiretos
• Detectam a presença de anticorpos contra o HCV
• Diretos
• Testes de biologia molecular para RNA – HCV
• Presença do Ag core do HCV
• Combinação
• Detectam a presença de anticorpos contra o HCV e
do Ag core do HCV
Infecção Aguda por HCV com Recuperação
anti-HCV
Título
HCV - RNA
ALT
Normal
0
1
2
3
Meses
4
5
6
1
2
3
4
Mod. CDC, 2002
Anos
Tempo após o inicio da Infecção
27
11/06/2014
HCV - Evolução para Infecção Crônica
anti-HCV
Título
HCV RNA
ALT
Normal
0
1
2
3
Meses
4
5
6
1
2
3
4
Anos
Tempo após o inicio da infecção
ELISA - AntiAnti-HCV de 3ª Geração
Detectam a presença de anticorpos que se ligam a antígenos
recombinantes representativos de 4 Regiões do Vírus C:
core e não estruturais 3, 4 e 5
28
11/06/2014
ELISA - AntiAnti-HCV de 3ª Geração
• Sensibilidade: ~ 98 %
RFN
RFN
• em imunodeprimidos (infecção avançada por HIV ou
transplantados)
• Doença renal crônica / hemodiálise
• Infecção inicial pelo HCV
• Especificidade: > 99 %
RFP
RFP
• Mais frequentes em populações de baixa
prevalência para HCV
CLIA - AntiAnti-HCV de 3ª Geração
• O formato dos testes CLIA e ELISA apresentam
características semelhantes
• A Sensibilidade e a Especificidade dos testes CLIA
são semelhantes à dos testes ELISA
29
11/06/2014
Testes de Biologia molecular para HCV RNA
• HCV – Qualitativo
– Detectam a presença, ou não, do HCV-RNA
• HCV – Quantitativo
– Ensaios recentes ultra sensíveis para HCV-RNA,
permitem detectar até 5 copias/mL
– Permitem informar o nível quantitativo do HCV-RNA
(carga viral), sendo usados para monitorar a resposta ao
tratamento.
– O aumento da sensibilidade faz com que sejam usados
para diagnóstico e confirmação
NAT: Nucleic Acit Test or Nucleic Acid Amplification Test
Ensaios HCV RNA Qualitativos
disponíveis comercialmente
Ensaio
Fabricante
Versant HCV RNA
UltraQual HCV RT-PCR
Limite mínimo de
detecção# (UI/mL
(UI/mL)
mL)
Gene-Probe
10
National Genetics
10
Roche
50
Amplicor HCV v2.0
Bobas Amplicor HCV v2.0
Roche
50
AmpliScreen*
Roche
<50
(*): Triagem em doadores de sangue
(#): LLD
Kamili et al, Cin Infect Diseases; 2012
30
11/06/2014
Ensaios HCV RNA Quantitativos
disponíveis comercialmente
Ensaio
LCx HCV RNA Quanty &
Real Time HCV
HCV Super Quant
Fabricante
LLD (*) UI / Ml
Abbott
25 (25 – 2.630.0000)
Abbott
12 (12 – 100.000.000)
National Genetics
20 (20 – 1.000.000)
Amplicor HCV Monitor
Roche
50 (600 – 700.000)
Cobas Amplicor HCV Monitor
Roche
50 (600 – 700.000)
Cobas Ampliprep/TaqMan
Roche
18 (43 – 69.000.000)
Siemens
615 (615 – 7.700.000)
Versant HCV RNA 3.0
(&): só para screening
(*): Dynamic range
Kamili et al, Cin Infect Diseases; 2012
Testes Rápidos
Point-of-care Rapid Imunoassays
Podem ser usados em situações especiais,
quando não exista a possibilidade de usar Testes
Convencionais.
Sangue: punção venosa ou digital
Resultados rápidos (< 30 min)
Um resultado Reagente com teste rápido deve ser
considerado “preliminar”, e deverá ser submetido
a outro teste complementar para HBV ou HCV.
31
11/06/2014
IMUNOBLOT - HCV
Justifica-se apenas para confirmar resultados reagentes
da triagem em populações com baixa prevalência
Um resultado positivo no IB confirma o resultado
reagente de testes da triagem
Um resultado negativo do IB, em geral, elimina
resultados Falsos Reagentes dos testes de triagem.
IB positivo e teste de triagem reagente, com PCR
negativa: repetição e orientação
Atualmente se da preferência aos testes de biologia
molecular para confirmar os resultados da sorologia
Desvantagens: Alto % de INDETERMINADOS
Algoritmo de confirmação para HCV
AntiAnti-HCV (ELISA ou CLIA)
Não Reagente
Repetidamente
Reagente
PCR
Negativo
Imunoblot
Negativo
Indeterminado
PCR
Confirmação
Positivo
Positivo
Ou repetir a
PCR em outra
amostra meses
mais tarde
PCR
Genótipo
32
11/06/2014
Algoritmo de confirmação para HCV
CDC (2013)
Interpretação dos testes para diagnóstico da
infecção por HCV
AntiAnti-HCV
HCV – RNA*
Interpretação
Negativo
Negativo
Ausência de infecção por HCV
Reagente
Negativo
Infecção por HCV resolvida
Verificar flutuações do HCV – RNA
Negativo
Positivo
Infecção inicial
Infecção em indivíduos imunodeprimidos
Reagente
Positivo
Infecção aguda ou crônica
(*) Sensibilidade < 50 UI/mL
33
11/06/2014
Nomenclatura dos Diferentes Genótipos do
Vírus da Hepatite C
Genótipos
Subtipos
1
1a, 1b, 1c
2
2a, 2b, 2c
3
3a, 3b, 3c
4
4a
5
5a
6
6a
Stuyver & Simmonds
Identificação de genótipos
– A maioria dos métodos genotípicos comercializados se baseia
na análise da região 5´UTR que contem suficientes
polimorfismos para discriminar corretamente entre os
genótipos do VHC mais prevalentes.
– Dificuldade para diferenciar subtipos (1a/1b , 4a/4b)
– Hibridização inversa Kit Inno-Lipa / Sequenciamento Direto TRUGENE
• O método de referência para a determinação, tanto do
genótipo quanto do subtipo do VHC, é o sequenciamento
direto do genoma completo do vírus e a posterior
análise filogenética comparando a sequencia obtida com
outras prototípicas
• Sequenciamento da região polimórfica do NS5B
34
11/06/2014
O laboratório no tratamento e a
prevenção das hepatites B & C
Hepatite por Vírus B (HVB): PREVENÇÃO
• Imunização passiva
– Imune globulina: Proteção curta (2(2-3 meses)
• Imunização ativa
– Vacina: Proteção longa (anos)
– Esquema: Três doses (0(0-1-6 meses)
– Eficácia
• Resposta adequada: antianti-HBs > 10 UI/ml
– Proteção (> 15 anos)
• 1ª dose: 3030-50% - 2ª dose: 75% - 3ª dose: 96%
• Menor em imuno comprometidos e em idosos
• Não se recomendam reforços
35
11/06/2014
Hepatite B Crônica: Tratamento
• O tratamento tem como objetivo reduzir a
replicação viral para diminuir a lesão
hepática, prevenindo a evolução para cirrose
y câncer hepático.
–
–
–
–
–
–
–
Interferon-α-1b
Interferon peguilado
Lamivudina
Adefovir
Análogos de Nucleosídeos
Entecavir
Telbivudin
Tenofovir.
Hepatite B Crônica: Tratamento
• Objetivos do tratamento:
SoroSoro-conversão do AgHBe para antianti-HBe
Diminuição ou desaparecimento do HBV–DNA em
soro (carga viral)
Normalização dos níveis séricos de ALT e AST
Melhora da histologia hepática
• Biopsia hepática
• Elastografía
• Fibrotest
36
11/06/2014
Escore METAVIR:
Para avaliar o grau de fibrose nas hepatites
crônicas B e C
F0: sem fibrose
F1: fibrose portal e peri portal sem septos
F2: fibrose portal e peri portal com raros septos
F3: fibrose portal e peri portal com muitos septos
F4: Cirrose
Para avaliar o grau de lesões inflamatórias portais e necrose
hepatocelular
A0: sem atividade
A1: leve
A2: moderada
A3: grave
Testes para o FibroMax
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Alfa-2-macroglobulina
Haptoglobina
Apolipoproteína A1
GGT
Bilirrubina total
ALT
AST
Colesterol total
Triglicérides
Glicemia em jejum
idade, sexo, peso e altura
Fibrose
Atividade
37
11/06/2014
Resultados observados na evolução da
fibrose na infecção crônica pelo HCV
Diagnóstico da hepatite C aguda
• Depois da fase aguda existem duas
possibilidades:
–Clearence
Clearence espontâneo
• 20% - 25%
–Evolução
Evolução para infecção cônica
persistente
38
11/06/2014
Clearance espontâneo do HCV
• Baixos níveis de HCV RNA e rápido declino
• Níveis elevados de ALT d presença de
icterícia
• Sexo, raça, idade
• Co-infecção com HBV
• IL28B (homozigoto cc)
Evolução para a cura
39
11/06/2014
Evolução para a forma crônica
Tratamento da Hepatite crônica por Vírus C
• Não existe vacina profilática para a HVC
• Tratamento padrão para a HVC
– Combinação de IntérferonIntérferon-α peguilado e Ribavirina
– Índice de cura variando de 43% para o genótipo 1 até
80% para o genótipo 2
• Novos antivirais: Telaprevir e Boceprevir
– Usados em associação com o tratamento padrão
• Novos antivirais em fase de avaliação
40
11/06/2014
Drogas para tratamento da Hepatite C
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ribavirina (1998)
Peginterferon alfaalfa-2a
Peginterferon alfa 2b
Boceprevir (2011)
Telaprevir (2011)
Simeprevir (2013)
Sofosbuvir (2013)
Sofosbuvir + Ledispasvir
Assunapravir + Daclastavir
Tratamento
12 semanas
USD 80.000,00
Polimorfismo do gene ILIL-28B
• Para prognosticar a resposta de indivíduos
infectados pelo HCV genótipo 1.
• Variantes específicas estão associadas com uma
taxa cerca de 2 – 3 vezes maior de resposta viral
sustentada (RVS) como resposta ao tratamento em
pacientes infectados com o genótipo 1.
• Genótipo C/C do nucleotídeo rs12979860
41
11/06/2014
Polimorfismo no gene da Inter
leucina 28B humana (IL-28B)
Thomas DT, et al. Nature 2009; 461: 798-802
Consumo de álcool e desenvolvimento
de cirrose hepática
42
11/06/2014
Recomendações no uso de testes diagnósticos
para detectar a infecção pelo HCV (Anti
(AntiAnti-HCV)
HCV) :
• Usuários de drogas ilícitas injetáveis
• Quem recebeu fatores de coagulação antes de 1987, ou
transfusão de sangue ou transplante de órgãos antes de
1992
• Pacientes em hemodiálise
• Suspeita de doença hepática
• Profissionais da área de saúde quando houver suspeita de
exposição a sangue contaminado com VHC)
• Crianças nascidas de mães VHC positivas
TODOS DEVERIAM FAZER UM TESTE Anti-VHC
43
11/06/2014
Hepatite C
• Pessoas com Hepatite C
• Em general não tem sintomas
• Podem viver por décadas sem que se sintam
doentes
• Podem ser tratadas com sucesso com os
medicamentos disponíveis atualmente.
• Recomendação do CDC
– Todas as pessoas nascidas entre 1945 e 1965
(também conhecidas como “baby boomer”)
boomer”) devem fazer
um teste para Hepatite C.
Testes AntiAnti-HCV em Baby boomer:
boomer: Justificativas
5 vezes
• Adultos nascidos entre 1945 e 1965 são
mais propensos a estar infectados pelo VHC.
• Três em cada quatro (75%) dos adultos com
HCV nasceram nesses anos.
• O diagnóstico precoce e o tratamento
podem ajudar na prevenção do dano hepático (cirrose e
CHC)
• Novos antivirais com maior eficácia para obter a
SVR
44
11/06/2014
Hemoterapia
importância da triagem sorológica
de doadores de sangue
Usar
Usar testes sorológicos sensíveis , capazes de
identificar o maior número possível de mutantes e que
diminuam o período da janela imunológica
Realizar,
Realizar, em paralelo, NAT (mini pool – amostras
individuais)
TRIAGEM EM DOADORES DE SANGUE
AntiAnti-HIV 1+2+”O”
Ac / Ag p24
AntiAnti-HTLV 1+2
Ag HBs
Anti--HBc
Anti
Anti – HCV
HCV Ag / Ac
Anti – T.pallidum
VDRL / RPR
AntiAnti- T.cruzi
45
11/06/2014
Janelas de Soro conversão
Redução da Janela
Risco residual
por Milhão
RNA - PCR
11 dias
1.01
HBV
DNA - PCR
25 dias
8.33
HCV
RNA - PCR
59 dias
2.72
VÍRUS
TESTE
HIV
REDS, NHLBI Retrovirus Epidemiology Study
Busch, Kleinman, Korelitz, Schreiber
Muito Obrigado
[email protected]
46