TCC12 - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
PATRÍCIA DOS SANTOS LOBO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENÓTIPOS G E P DE
ROTAVÍRUS EM CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS NA REGIÃO
AMAZÔNICA BRASILEIRA: IDENTIFICAÇÃO DE GENÓTIPOS
EMERGENTES
BELÉM-PA
2010
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PATRÍCIA DOS SANTOS LOBO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENÓTIPOS G E P DE
ROTAVÍRUS EM CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS NA REGIÃO
AMAZÔNICA BRASILEIRA: IDENTIFICAÇÃO DE GENÓTIPOS
EMERGENTES
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal
do Pará (UFPa) como requisito parcial para
obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Dra. Joana D’Arc Pereira Mascarenhas
BELÉM-PA
2010
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3
PATRÍCIA DOS SANTOS LOBO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENÓTIPOS G E P DE
ROTAVÍRUS EM CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS NA REGIÃO
AMAZÔNICA BRASILEIRA: IDENTIFICAÇÃO DE GENÓTIPOS
EMERGENTES
Este trabalho foi avaliado e aprovado
para obtenção parcial do grau de Bacharel
em Biomedicina, sendo aprovado na sua
forma final com conceito Excelente .
BANCA EXAMINADORA:
_________________________________________
(Drª. Joana D’Arc Pereira Mascarenhas – IEC – Orientadora).
_________________________________________
(MsC. Luana da Silva Soares – IEC – Examinador)
_________________________________________
(Dr. Rodrigo Vellasco Duarte Silvestre – IEC– Examinador)
_________________________________________
(MsC. Alessilva do Socorro Lima de Oliveira – IEC – Suplente)
Belém (PA), 14 de Dezembro de 2010.
BELÉM-PA
2010
iv
4
"Que todos os nossos esforços desafiem as impossibilidades.
Lembrai-vos que as grandes proezas da história
foram conquistas do que parecia impossível".
[Chaplim]
v
5
Dedico este trabalho de conclusão de curso a minha mãe
por enorme amor e força a mim dada.
A minha família e amigos.
E a todos que contribuíram de forma
direta ou indireta com o sucesso deste trabalho.
Patrícia Lobo
vi
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre ao meu lado.
Aos meus pais, Nazaré e José, que sempre me apoiaram e dedicarem sua vida em prol do meu
sucesso.
A minha orientadora, Drª Joana D’Arc Pereira Mascarenhas, minha enorme gratidão pelos
conhecimentos repassados a mim, sempre com paciência e dedicação e pela oportunidade e
confiança a mim dada.
Ao Instituto Evandro Chagas na pessoa de sua diretora Drª. Elizabeth Santos.
A seção de Virologia do IEC, representada pelo seu chefe Dr. Alexandre Linhares, que me
ofereceu uma oportunidade de ingresso na Seção.
Aos meus colegas de curso, Isabel e Edivaldo Costa, que me ajudaram a ingressar na seleção
de bolsistas no IEC.
Aos meus amigos do laboratório de rotavírus e da Seção de Virologia, Sylvia, Alessilva, Tia
Euzeni, Régis, Jane, René, Allan Kaio, James, Rodrigo e em especial a Luana Soares que me
deu a oportunidade de desenvolver este trabalho, me ensinando e me apoiando em tudo que
podia, a Yasmin Farias por sempre dar suporte e apoio no desenvolvimento deste trabalho e
ao Darivaldo Neri, que com muita paciência repassou seus conhecimentos e me deu sua
amizade.
Aos meus amigos da Universidade Federal do Pará, em especial ao Paulo, Bruno, Breno,
Alexandre, Leila, Laine, Karla, Ivy e Ellen, pelo companheirismo durante esses quatro anos
de amizade.
Aos amigos e familiares (avôs, primos e tios) que sempre estiveram comigo nessa jornada, em
especial, a Viviane pela sua amizade e colaboração a este trabalho.
E o meu muito obrigado a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para o sucesso
desse trabalho.
vii
7
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 112
1.1.
O ROTAVÍRUS…........................………………... ..................................... 1414
1.1.1. Estrutura e classificação viral.........................................................................14
1.1.2. Patogênese e ciclo reprodutivo..........................................................................18
1.1.3. Manifestações clínicas e diagnóstico.................................................................20
1.1.4. Tratamento e profilaxia.....................................................................................21
1.1.5. Epidemiologia molecular...................................................................................22
2. OBJETIVOS...................................................................................................................... 25
2.1.
OBJETIVO GERAL…………………………………………………………....... 25
2.2.
OBJETIVO ESPECÍFICO……………………………………………………...... 25
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 26
3.1
MATERIAL...........................................................................................................26
3.1.1 Aspectos Éticos...................................................................................................26
3.1.2. Pacientes e espécimes clínicos...........................................................................26
3.2
MÉTODOS...........................................................................................................27
3.2.1. Preparo da Suspensão Fecal..............................................................................27
3.2.2. Extração do Genoma Viral................................................................................27
3.2.3. Det er minaçã o do s Ele troferotip o s por Elet roforese e m Gel de
Poliacrilamida (EGPA)............................................................................................28
3.2.4. Reação Em Cadeia Mediada pela Polimerase Precedida de Transcrição
Reversa (RT-PCR)...................................................................................................28
3.2.5.
Eletroforese em Gel de Agarose ......................................................................30
3.2.6.
Purificação e Quantificação do produto da RT-PCR...................................31
3.2.7.
Sequenciamento de Nucleotídeos.....................................................................31
3.2.8. Alinhamento e Edição das Sequências para Construção da Árvore
Filogenética...............................................................................................................31
4. RESULTADOS.................................................................................................................33
5.
DISCUSSÃO.....................................................................................................................39
6. CONCLUSÃO................................................................................................................... 42
REFERÊNCIAS......................................................................................................................43
APÊNDICE I.....................................................................................................................56
viii
8
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 −
Micrografia eletrônica da partícula viral do rotavírus.......................................14
Tabela 1 −
Função e localização das proteínas dos RVs-A.................................................15
Figura 2 −
Estrutura da partícula viral do RVs-A...............................................................16
Figura 3 −
Representações esquemática e tridimensional da partícula viral de RV-A símio
(SA11) com segmentação genômica.........................................................................................17
Figura 4 −
Representação de Eletroferotipos em EGPA. A- perfil longo de G1P[8]; B-
perfil curto de G2P[4] e C- perfil longo de G12P[6]................................................................17
Figura 5 −
Ciclo reprodutivo do rotavírus as vias de propostas de entrada do vírus na
célula.........................................................................................................................................19
Tabela 2 −
Sequência dos iniciadores utilizados na RT-PCR para os genes VP7 e VP4 de
RVs-A.......................................................................................................................................29
Tabela 3 −
Tamanho dos fragmentos de amplificação dos tipos G e P de RVs-A..............30
Figura 6 −
Distribuição mensal de amostras coletadas nos LACENS e recebidas no IEC no
período de agosto de 2009 a junho de 2010..............................................................................33
Figura 7 − Frequência dos eletroferotipos de RVs-A no período de agosto de 2009 a junho
de 2010.....................................................................................................................................34
Figura 8 − Distribuição dos genótipos G de rotavírus detectados por Nested-PCR em 36
amostras provenientes da rede de vigilância............................................................................34
Figura 9 −
Distribuição dos Genótipos P de rotavírus detectados por Nested-PCR em 32
amostras provenientes da rede de vigilância.............................................................................35
Figura 10 − Dendrograma das sequências de nucleotídeos do genótipo G12 com as
amostras do LACENS e outras sequências disponíveis no banco de genes.............................36
Figura 11 − Dendrograma das sequências de nucleotídeos do genótipo P[6] com as
amostras do LACENS e outras sequências disponíveis no banco de genes.............................38
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AL – Aglutinação do Látex
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
dsRNA – Dupla fita de Ácido Ribonucléico
EIA ou ELISA – Ensaio Imunoenzimático
EGPA – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
IEC – Instituto Evandro Chagas
Kb – Quilobases
LACENS – Laboratório Central
ME – Microscópio eletrônico
ng – Nanogramas
OMS – Organização Mundial de Saúde
pb – Pares de Bases
RNA– Ácido Ribonucléico
RT-PCR – Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida de Trancrição Reversa
RVs-A – Rotavirus do grupo A
SEVIR – Seção de Virologia
UFPA – Universidade Federal do Pará
9
x
10
RESUMO
Os rotavírus do grupo A (RVs-A) são os mais comuns agentes etiológicos de diarréia grave
em crianças menores de cinco anos, causando um número estimado de 500 mil mortes por ano
mundialmente. A partir da detecção dos sorotipos usuais, outras variedades antigênicas
emergiram ao longo do tempo e passaram a assumir importância epidemiológica, sendo estas
denominadas de genótipos não usuais, e estão presentes em várias partes do mundo. Os RVsA pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, e possuem o genoma dividido em 11
segmentos de RNA de dupla fita (dsRNA). As proteínas VP7 e VP4 são relacionadas aos
genótipos G e P, respectivamente. Este estudo tem como objetivo caracterizar os genótipos G
e P de rotavírus circulantes na região Amazônica Brasileira no período de agosto de 2009 a
junho de 2010. Foram preparadas suspensões fecais, e o dsRNA foi extraído e submetido a
Eletroforese em Gel de Policrilamida (EGPA). Os RNAs foram transcritos com a
Transcriptase Reversa e amplificados pela Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (RTPCR) utilizando os primes 4con2/4con3 (VP4) e End9/Beg9 (VP7), seguido por Nested-PCR.
Os produtos da RT-PCR foram purificados, quantificados e submetidos ao sequenciamento
automático. A análise filogenética foi realizada utilizando os programas BLAST e MEGA 3.
De agosto de 2009 a junho de 2010, 96 amostras, provenientes dos Laboratórios Centrais,
foram recebidas no IEC para a caracterização molecular dos RVs-A, sendo todas submetidas
ao EGPA e a RT-PCR. Das 45 amostras analisadas por Nested-PCR foram identificados os
genótipos G2 em 27,7%, G9 em 12,8% e G12 em 5,5%. Os genótipos P[4], P[6] e P[8] foram
encontrados em 31,2%, 6,2% e 46,8% dos casos, respectivamente. Vinte e nove por cento
(13/45) dos produtos da RT-PCR foram submetidas ao sequenciamento. As amostras do
genótipo G9 agruparam na linhagem III, as do genótipo G2 na linhagem II e as do genótipo
G12 na linhagem III. O genótipo P[4] reuniu amostras na linhagem V, o genótipo P[8] na
linhagem III e o genótipo P[6] na linhagem I do dendrograma. As inúmeras possibilidades de
combinação binária entre os genótipos G e P de RVs-A pode levar ao aparecimento de novos
genótipos. Portanto, os resultados desse estudo fornecem evidência da grande diversidade de
genótipos usuais e não usuais de rotavirus na região Amazônica, melhorando assim o
conhecimento sobre a epidemiologia molecular de genótipos emergentes de RVs-A em nossa
região.
Palavras – chaves: Genótipos emergentes; VP4 e VP7; e seqüenciamento
xi
11
ABSTRACT
Group A rotaviruses (RVs-A) are the most common etiologic agents of severe diarrhea in
children less than five years, causing an estimated 500.000 deaths annually worldwide. From
the detection of usual serotypes, other antigenic varieties have emerged over time and has
assumed to epidemiological importance, which are named unusual genotypes, and are present
in several parts of the world. Rotavirus genus belongs to the Reoviridae family and its
genome has been divided into 11 segments of double-stranded RNA (dsRNA). VP4 and VP7
proteins define P and G genotypes, respectively. This study aims to characterize G and P of
rotavirus circulating in the Brazilian Amazon region during August 2009 to June 2010. Fecal
suspensions were prepared and dsRNA was extracted and subjected to Polyacrylamide Gel
Electrophoresis (PAGE). RNAs were transcribed with Reverse Transcriptase and amplified by
the Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) using primes 4con2/4con3 (VP4) and End9/Beg9
(VP7), followed by Nested-PCR. The RT-PCR products were purified, quantified and
subjected to automated sequencing. Phylogenetic analysis was performed using the programs
BLAST and MEGA 3. From August 2009 to June 2010, 96 samples were received of IEC
from Central Laboratories for molecular characterization of RVs-A, all being subjected to
EGPA and RT-PCR. Of the 45 samples analyzed by Nested-PCR were identified G2
genotypes in 27.7%, G9 in 12.8% and G12 in 5.5%. The genotypes P[4], P[6] and P[8] were
found in 31.2%, 6.2% and 46.8% of cases, respectively. Twenty nine percent (13/45) of the
RT-PCR products were subjected to sequencing. The samples of G9 genotype grouped into
lineage III, G2 genotype into lineage II and G12 genotype into lineage III. P[4] genotype
grouped into lineage V, P[8] genotype into lineage III and P[6] genotype into lineage I of the
dendrogram. The several possibilities of binary combination between the P and G RVs-A
genotypes can lead to the emergence of new genotypes. Therefore, the finding of this study
provide evidence of great diversity of usual and unusual rotavirus genotypes in the Amazon
region by hence improving our knowledgement on the molecular epidemiology of emergente
genotypes of RVs-A in our region.
Keywords: Emergente genotypes; VP4 and VP7; sequencing
12
1. INTRODUÇÃO
Os rotavírus do grupo A (RVs-A) são os mais comuns agentes etiológicos de
diarréia grave em crianças menores de cinco anos, causando um número estimado de 500 mil
mortes por ano a nível mundial, sendo que aproximadamente 85% destas ocorrem nos países
da África e Ásia (Widdowson et al., 2009). As altas taxas de mortalidade ocorrem
principalmente em países em desenvolvimento, embora a morbidade seja semelhante tanto em
países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. A maioria das infecções primárias são
leves, embora 15-20% necessitem atenção médica e 1-3% das crianças infectadas sejam
hospitalizadas (Castello et al., 2009).
A maioria dos episódios sintomáticos ocorrem em crianças com idades entre três
meses a dois anos. O vírus se dissemina rapidamente por via fecal oral. Os sintomas
costumam aparecer cerca de dois a três dias após a infecção, e incluem vômito e diarréia
aquosa, muitas vezes com febre e dor abdominal (Estes e Kapikian, 2007; OMS, 2009).
Nesses casos, é indicado uma terapia de reidratação oral (TRO) para reposição
hidroeletrolítica; manutenção da dieta, principalmente se o aleitamento for natural pois há
fatores imunes e não imunes presentes no leite materno; em casos mais graves recomenda-se a
reidratação intravenosa (Linhares et al., 2005).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2010), os dados em 2004,
apresentaram que 527.000 crianças menores de cinco anos morreram anualmente de infecções
causadas por rotavírus, a maioria destas crianças viviam em países de baixa renda. No ano de
2009, mais de 50.000 crianças foram internadas para tratamento de gastrenterite aguda
segundo registros da OMS - rede de vigilância rotavírus, apresentando um aumento de 22%
em comparação a 2008.
A OMS (2010) enfatiza que a vacinação contra o rotavírus é uma medida
importante que pode ser usada para reduzir a diarréia grave por rotavírus e a mortalidade
infantil. Foi observado uma redução da mortalidade entre crianças entre crianças com idade
de 3 a 59 meses, sugerindo efeitos diretos do imunizante. Ainda relevante é a totalidade dos
sorotipos de rotavírus circulantes em 2008 foram classificados como G2P[4], fato que
consubstancia a proteção heteróloga conferida pela vacina, demonstrada em estudos de
efetividade em Belém, Pará (Linhares et al., 2010).
O uso de vacinas contra o rotavírus deve ser parte de uma estratégia global de
controle das doenças diarréicas, esta estratégia deve incluir melhorias na higiene e
13
saneamento, e a suplementação com zinco na administração baseada na reidratação oral
(OMS, 2010).
Sendo assim, a vigilância e a caracterização molecular dos genótipos G e P de
RVs-A provenientes de diferentes regiões do mundo é importante para monitorar os genótipos
circulantes e as possíveis novas combinações visando um melhor entendimento da variação
das cepas circulantes capazes de escapar a proteção conferida pelos imunizantes utilizados
(Khananurak et al., 2010; Matthijnssens et al., 2008).
14
1.1. O ROTAVÍRUS
1.1.1. Estrutura e classificação viral
O rotavírus é um gênero pertencente a família Reoviridae que infecta muitas
espécies de aves e mamíferos, dentre elas a espécie humana (Castello et al., 2009). São vírus
não envelopados, medem de 70 a 90 nanômetros de diâmetro, com simetria icosaédrica e
forma arredondada se observado à microscopia eletrônica (Estes e Kapikian, 2007) (Figura 1).
Figura 1: Micrografia eletrônica da partícula viral do rotavírus.
Fonte: Setor de microscopia eletrônica do IEC.
O genoma do RVs-A é formado por 11 segmentos com cadeia dupla de RNA
contendo cerca de 18.500 pares de bases (pb), os quais codificam 12 proteínas específicas
para o ciclo reprodutivo, sendo elas seis estruturais (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e VP7) e seis
não estruturais (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 e NSP6) (Khananurak et al., 2010;
Matthijnssens et al., 2008). A função e localização das proteínas do RVs-A estão presentes na
Tabela 1.
15
Tabela 1: Função e localização das proteínas dos RVs-A
Segmento
genômico
Proteína
Localização
1
VP1
Core
RNA polimerase-RNA dependente
2
VP2
Core
Ligação ao RNA viral
3
VP3
Core
Guanililtransferase
4
VP4
(VP5* e
VP8*)
Capsídeo externo
5
NSP1
Não-estrutural
6
VP6
Capsídeo interno
Antígeno de subgrupo, necessário
para a transcrição
7
NSP3
Não-estrutural
Inibe a tradução de proteínas
celulares, ligação ao terminal 3’ do
mRNA viral
8
NSP2
Não-estrutural
Ligação ao RNA, helicase, NTPase,
forma viroplasmas com NSP5
9
VP7
Capsídeo externo
Glicoprotéina antígeno neutralizante
10
NSP4
Não-estrutural
Glicoproteína, papel na morfogênese,
modula
cálcio
intracelular,
enterotoxina
Não-estrutural
Ligação ao RNA, forma viroplasma
com NSP2, interage com VP2 e
NSP6
NSP5
11
Função
Hemaglutinina, proteína de ligação à
célula, peptídeo de fusão, antígeno
neutralizante
Ligação ao RNA viral
Interage com NSP5, presente no
viroplasma
*Polipeptídeos originados pela clivagem da VP4 pela tripsina.
NSP6
Não-estrutural
Fonte: Adaptada de Santos e Soares, 2008
A partícula viral é composta por três camadas protéicas concêntricas contendo
capsídeo interno, externo e o core viral, qual está intimamente associado ao genoma viral
conforme observado na Figura 2 (Estes e Kapikian, 2007).
16
Figura 2: Estrutura da partícula viral do RVs-A.
Fonte: http://www.liquidarea.com/2009/10/pedriatria-guerra-al-rotavirus
Existem sete grupos de rotavírus classificados de A-G. Os do grupo A são
divididos em quatro subgrupos denominados de I, II, I+II e não-I/não-II. A camada externa é
constituída pelas proteínas VP4 e VP7 relacionadas aos genótipos P (sensível a Protease) e G
(Glicoproteína) que até o presente momento contem 31 e 23 genótipos, respectivamente.
(ABE et al., 2009; Desselberger, 1996; Estes e Kapikian, 2007; Khamrin et al., 2007).
Devido haver diferença nos pesos moleculares entre os 11 segmentos, pode-se
realizar uma análise de seu perfil através da eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA),
classificando-se os perfis eletroforéticos como amostras de “padrão longo”, “padrão curto” e
“supercurto” (Estes e Kapikian, 2007; Taniguchi; Urasawa, 1995) (Figuras 3 e 4).
17
Figura 3: Representações esquemática e tridimensional da partícula
viral de RV-A símio (SA11) com segmentação genômica.
Fonte: Adaptada de Prasad et al., 1996.
A
B
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Figura 4: Representação de Eletroferotipos em EGPA. A- perfil
longo de G1P[8]; B- perfil curto de G2P[4] e C- perfil longo de
G12P[6]
Fonte: Adaptada de Paul et al., 2008.
18
1.1.2. Patogênese e Ciclo reprodutivo
Os rotavírus são transmitidos por via fecal- oral, sendo também sugerida a
transmissão por via respiratória ou por fômites devido ser um vírus com alta taxa de infecção,
sendo que estima-se que a cada evacuação seja liberado cerca de um trilhão de partículas
virais por milímetro cúbico de espécime fecal (Estes e Kapikian, 2007; Gray et al., 2008;
Parashar et al., 1998). Já em estudo conduzido em Belém, Linhares et al. (2002) observaram
que a cada nove neonatos que desenvolveram diarréia por rotavírus, cinco casos foram de
infecções nosocomiais, sugerindo outras formas de contaminação além da fecal-oral.
O período de incubação do vírus varia de dois a quatro dias. Após a ingestão do
vírus, estes têm tropismo por células maduras que recobrem as vilosidades do intestino
delgado chamadas de enterócitos e in vitro ligam-se a várias linhagens celulares, mas
infectam apenas as de origem intestinal e epitelial. (Arias et al., 2002; Gray et al., 2008).
A partícula viral multiplica-se no citoplasma da célula, provocando a descamação
dessas células e impedindo a captação de fluidos e nutrientes. A infecção e descamação dos
enterócitos aceleram a proliferação das células secretoras das criptas, levando para o lúmen
intestinal grande quantidade de fluido e provocando uma perda temporária da capacidade
absortiva. (Gray et al., 2008; Linhares et al., 2005).
A disfunção celular, também pode promover expressão de algumas enzimas
digestivas e ocasionar um aumento no potencial osmótico podendo ocasionar uma má
absorção de glicose no intestino delgado, aumentando a perda de fluido, resultando em uma
manifestação clínica com características má absortivas e secretoras, a diarréia. O mecanismo
pelo qual o RVs-A causa vômito ainda não foi esclarecido (Estes e Kapikian, 2007; Gray et
al., 2008).
O ciclo reprodutivo do rotavírus inicia-se pela entrada do vírus na célula mediada
pelas proteínas do capisídeo externo VP4 e VP7, sendo o processo de penetração do vírus
iniciando pela clivagem da proteína VP4 pela tripsina, gerando os polipeptídeos VP5* e
VP8*, os quais interagem com receptores contendo ácido siálico. Uma vez no interior da
célula, o capsídeo externo é perdido e o cerne permanece intacto como uma partícula ativa
que sintetiza RNA mensageiro viral (mRNA) (Galletos et al., 1989). Posteriormente, as
mesmas adquirem um envelope transitório, o qual é perdido e substituído por uma fina
camada de proteína que constitui o capsídeo externo. Por fim, as partículas virais maduras são
liberadas por meio da lise celular (Ball et al., 2005; Estes e Kapikian, 2007). O ciclo
19
reprodutivo está representado na Figura 5.
Figura 5: Ciclo reprodutivo do rotavírus as vias de propostas de entrada do vírus
na célula.
1 − Adsorção do vírus à superfície celular
2 − Penetração e liberação da partícula viral produzindo “dipas”
3 − Transcrição primária do dsRNA genômico
4 − Síntese das proteínas virais
5 − Síntese primária de fitas negativas de RNA
6 − Montagem da partícula viral
7 − Síntese secundária de fitas negativas de RNA
8 − Montagem das dipas
9 − Brotamento da dipa na membrana do RE
10 − Perda do envoltório transitório e geração de vírions maduros com triplo
capsídeo.
Fonte: Adaptada de Arias et al., 2004.
20
1.1.3. Manifestações Clínicas e Diagnóstico
Os sintomas da infecção por RVs-A manifesta-se em crianças menores de cinco
anos na forma de diarréia aguda leve ou em forma de diarréia com desidratação
potencialmente fatal. A clínica da doença é caracterizada por diarréia, vômito, febre com
temperatura de 37.9°C ou acima, desidratação e dor abdominal. É uma infecção autolimitada,
durando em torno de uma semana a dez dias, podendo o vírus ser eliminado nas fezes por até
57 dias após a infecção (Estes e Kapikian, 2001; Gray et al., 2008; Santos e Soares, 2008).
A infecção secundária é clinicamente leve ou assintomática. Em neonatos essa
infecção é frequentemente assintomática ou apresenta-se por uma diarréia branda,
possivelmente devido a proteção dos anticorpos maternos (Linhares et al., 2005).
O diagnóstico laboratorial de rotavírus pode ser realizado pela detecção do vírus
ou antígeno viral nas fezes, testes sorológicos e moleculares (Estes e Kapikian, 2007).
O diagnóstico é realizado na amostra fecal, o qual deve ser realizado entre os 1° e
4° dias para a detecção do vírus por métodos convencionais como o ELISA, que detecta os
antígenos virais; microscopia eletrônica (ME) ou imunoeletromicroscopia (IME) e
aglutinação do látex (AL) (Estes e Kapikian, 2007, Gray et al., 2008, Linhares et al., 2005).
A microscopia eletrônica (ME) foi a primeira técnica utilizada para diagnóstico e
ainda é muito empregada devido a sua especificidade e rapidez. Nessa técnica é possível
detectar os RVs-A em 80% a 90% das fezes positivas (Brandt et al., 1981). O ELISA ou EIA
é uma das técnicas mais difundidas, pois possui alta sensibilidade na detecção de RVs-A, o
qual não necessita de equipamentos altamente especializados para o teste. (Estes e Kapikian,
2001). O teste de AL permite a detecção de cepas circulantes de RVs-A, possue sensibilidade
semelhante ao EIA e é de rápida e simples execução, geralmente realizados em laboratórios
de análises clínicas (Pietruchinski et al., 2006).
A detecção com mais de três semanas de sintomas ou com amostras fecais
conservadas, pode ser realizado nos testes moleculares para a detecção e caracterização do
RNA viral, utilizando as técnicas do EGPA, hibridização, Reação em Cadeia mediada pela
Polimerase precedida de Transcripitase Reversa (RT-PCR) e sequenciamento automático
(Estes e Kapikian, 2001; Linhares et al., 2005; Santos e Soares, 2008).
A propagação do vírus em cultura de células é possível, utilizando linhagens
celulares como MA-104, LLC-MK2 (células de rim de macaco) e CaCo-2 (células de
carcinoma de cólon humano). A MA-104 tem efeito citopático característico, com aumento na
21
refrigência, seguido de redução do volume citoplasmático, com formação de alguns grumos
celulares e células repuxadas, com distribuição focal (Estes et al., 1979, Svensson et al., 1991,
Londrigan et al., 2000). Contudo, como a propagação do vírus em cultura é bastante lenta, o
método não possui valor prático para diagnóstico, limitando-se à investigação científica
(Linhares et al., 2009).
1.1.4. Tratamento e Profilaxia
O primeiro tratamento a ser feito em uma gastrenterite por rotavírus é a reposição
de fluidos e eletrólitos perdidos no vômito e na diarréia (Estes e Kapikian, 2007). Para a
reposição hidroeletrolítico recomenda-se a Terapia de Reidratação Oral (TRO), utilizando-se
uma fórmula-padrão preconizada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde 1975
(Bass, 2003). Além disso, recomenda-se a manutenção da dieta alimentar, principalmente o
leite materno, a administração de zinco recomendada pela OMS e a utlização de algumas
drogas que podem amenizar os sintomas da infecção, como o uso de antibióticos, probióticos
e drogas antissecretoras (racecadotril) (Linhares et al., 2009).
As práticas higiênicas clássicas como a lavagem das mãos, os cuidados com a
água e os alimentos, bem como a destinação adequada de dejetos humanos e animais,
parecem não exercer impacto no controle e na profilaxia das infecções por RVs-A. Isso é
constatado pelo fato de se repetirem, a cada ano, epidemias nos países desenvolvidos, apesar
dos elevados padrões de saneamento e higiene (Mascarenhas, 2006).
Outra forma de prevenção é o uso de vacinas que possuem o objetivo de oferecer
uma ampla cobertura antigênica para os importantes tipos G e/ou P que circulam globalmente,
ou regionalmente (Mascarenhas, 2006).
A vacina Rotarix, produzida na Bélgica pela GlaxoSmithKline Biologicals (GSK),
é monovalente, de origem humana com especificidade G1P[8], cepa RIX4414. Essa vacina foi
licenciada no mercado internacional em 2004, e no Brasil em 2005 pela ANVISA e
introduzida no calendário vacinal em 2006 (Santos e Soares, 2008). Esta vacina confere
proteção homóloga (G1P[8]) e heteróloga, isto é, produção de anticorpos também contra
outros sorotipos P específicos, G3, G4 e G9, e uma menor proteção contra G2P[4] (Linhares
et al., 2006; O’Ryan e Linhares, 2009).
22
Esta vacina monovalente quando testada em Belém, Pará, apresentou eficácia de
86% e 93% contra gastrenterites graves e hospitalizações por RVs-A, respectivamente, sendo
de grande importância na prevenção e controle da infecção por rotavírus (Linhares et al.,
2006; O’Ryan e Linhares, 2009).
De acordo com Siqueira et al. (2010), após um surto causado por RVs-A ocorrido
em Rio Branco, Acre em 2005, houve a importância de uma prevenção contínua para limitar a
transmissão do rotavírus. A partir de então, o Ministério da Saúde do Brasil incluiu a vacina
monovalente contra o rotavírus, específica para o genótipo G1P[8], no calendário nacional de
vacinação infantil.
Outra vacina disponível no mercado é a Rotateq, produzida nos Estados Unidos
pelo laboratório Merck e Co., é uma vacina pentavalente, preparada a partir de recombinantes
de rotavírus bovino (cepa WC3) e de humanos (G1, G2, G3, G4 e P1A[8] (Linhares et al,
2008; Santos e Soares, 2008). Confere também proteção cruzada contra o genótipo G9,
demonstrando eficácia de até 100% nos episódios diarréicos mais graves e de 68,8% a 76,6%
contra gastrenterites por rotavírus (Clark et al., 2004; Heaton et al., 2005; Vesikari et al.,
2006; 2007).
Em 2009, a OMS recomendou a inclusão das vacinas licenciadas Rotateq e
Rotarix no programa nacional de imunização de países onde demonstrou ter significante
impacto na saúde pública.
1.1.5. Epidemiologia molecular
As combinações binárias dos genótipos de RVs-A podem ser usuais e não-usuais.
As usuais reúnem os genótipos G1P[8], G2P[4], G3P[8] e G4P[8] sendo frequentemente
encontradas e correspondendo a 88,5% a 90% das infecções em várias partes do mundo. O
genótipo G9, associado aos tipos P[8] e P[6], foi detectado em 4,1% dos episódios diarréicos
causados por RVs-A, emergindo como um genótipo usual em escala global (Santos e
Hoshino, 2005)
Segundo Siqueira et al., (2010), a epidemia de gastrenterite aguda associada a
RV-A, principalmente do sorotipo G9P[8], causaram doença generalizada em crianças que
viviam em Rio Branco, Acre, na região amazônica do Brasil ocidental, acometendo mais de
20% das crianças menores de cinco anos. Este genótipo foi descrito pela primeira vez nos
23
EUA em 1995-1996, (Clark et al., 2004) e, posteriormente, em surtos no Brasil, Índia, Itália,
Malásia, Bangladesh, Austrália, França, e o Reino Unido (Cunliffe et al., 2001). A magnitude
da infecção pelo genótipo G9P[8] no surto ocorrido na região metropolitana de Belém (PA),
relatado por Guerra (2010), é semelhante ao relatado durante um surto na Austrália em 2001
(Kirkwood et al., 2004).
O genótipo G2P[4] mostrou-se em grande variação no continente e subcontinente
quando analisados a partir de 1973 a 2003, como segue: Na América do Sul (23%), África
(2%), Ásia (13%), América do Norte (11%), Europa (9%) e Austrália / Oceania (14%)
(Santos e Hoshino, 2005; Mascarenhas et al., 2010).
No Brasil, esse genótipo foi observado, provavelmente devido a uma seleção
ocasionada após a implantação da vacina ou mesmo a uma periodicidade temporal deste
genótipo que circula a cada dez anos (Leite et al., 2008; Carvalho-Costa et al., 2009; Oliveira
et al., 2008, Guerra, 2010).
Este genótipo foi observado em estudo desenvolvido no sul do Pará nos anos de 2006
e 2008 envolvendo crianças com gastrenterite aguda e foi detectado em 90% das amostras
analisadas, revelando uma periodicidade cíclica do genótipo G2 (Mascarenhas et al., 2010).
A partir da detecção dos sorotipos usuais, outras variedades antigênicas emergiram ao
longo do tempo e que passaram a assumir importância epidemiológica, estas são denominadas
de genótipos não usuais. Mais recentemente o genótipo G12, associado ao tipo P[6] apresentase como um genótipo não usual (Khananurak et al., 2010; Gray et al., 2008). Foi identificado
em estudo realizado em Buenos Aires em 1999-2003 e apresentou 6,7% de positividade em
amostras fecais (Castello, et al., 2006), semelhante a estudo conduzido na Tailândia e Japão
(Pongsuwanna et al., 2002; Shinozaki et al., 2004). A diversidade fenotípica é grande e existe
a possibilidade de mais de 120 diferentes combinações envolvendo os genótipos de G e P de
rotavírus (Estes e Kapikian, 2007).
- GENÓTIPO EMERGENTE G12
O
genótipo
G12,
considerado
incomum,
foi
isolado
e
caracterizado
molecularmente em 1990, entre as cepas causadoras de gastrenterite aguda em crianças em
um surto ocorrido nas Filipinas em 1987 (Taniguchi et al., 1990). Indicando uma propagação
24
global e emergente dessa nova cepa, esse genótipo foi identificado em vários países do mundo
(Freeman et al., 2009, Castello et al., 2009) incluindo a Tailândia (Pongsuwanna et al., 2002),
Argentina (Castello et al., 2006), Índia (Das et al., 2003), Bangladesh (Rahman et al., 2007b),
Japão (Shinozaki et al., 2004), Arabia Saudita (Kheyami et al., 2008), Hungria (Banyai et al.,
2007), Nepal (Uchida et al., 2006), e Brasil (Pietruchinski et al., 2006), sendo encontrado
recentemente na região Amazônica (Soares et al., 2010).
A primeira cepa de G12 era de origem suína (RU 172) isolado de um leitão com
diarréia na Índia (Ghosh et al., 2006). O gene VP7 mostrou-se 93,6-94,5% semelhante ao de
um ser humano ao nível de aminoácidos, aumentando a possibilidade de que cepas humanas e
suínas G12 podiam ter um ancestral comum. A fim de compreender a origem e o surgimento
de G12 nos EUA, os 11 segmentos de uma cepa de G12P[6], G12P[8] e G1P[8] coletadas
durante uma rotina de vigilância (2005-2006), foram sequenciadas e comparadas com G12 e
outras cepas de rotavírus de referência (Freeman et al., 2009). Desta forma é importante a
caracterização dos genótipos emergentes em vários locais, especificamente, na região
Amazônica Brasileira.
25
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Caracterizar molecularmente os genótipos G e P de rotavírus circulantes na região
Amazônica Brasileira nos anos de 2009 e 2010.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Determinar os eletroferotipos de rotavírus;
b) Caracterizar geneticamente os genes VP4 e VP7;
c) Determinar o percentual de infecções mistas e genótipos incomuns;
d) Realizar a análise de dendrograma, comparando as sequências de nucleotídeos dos genes
VP4 e VP7 dos rotavírus detectados com aquelas isoladas em outras partes do Brasil e do
mundo; e
e) Verificar se as crianças acometidas por rotavírus foram vacinadas.
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. MATERIAL
3.1.1. Aspectos Éticos
O estudo não apresentou qualquer risco ou prejuízo para as crianças ou seus
responsáveis. A presente investigação foi avaliada pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Instituto Evandro Chagas n° 0019/2009 em respeito às normas nacionais e internacionais que
regulamentam tal atividade (Apêndice I).
3.1.2. Pacientes e espécimes clínicos
Os espécimes fecais do presente estudo foram provenientes da rede de vigilância
epidemiológica das gastrenterites por RVs-A iniciada em fevereiro de 2006 e envolveu
crianças menores de cinco anos que apresentaram quadros de diarréia aguda. Essa rede
englobou cinco municípios, um de cada região do país, sendo que no Pará, o município de
Marituba vinculado à Secretaria de Saúde de Marituba foi selecionado para participar do
projeto. As Secretarias de Saúde fizeram a seleção dos casos quando o menor foi atendido no
Setor de Reidratação Oral (TRO); os espécimes fecais foram coletados e então enviados para
os Laboratórios Centrais dos Estados do Amapá, Pará, Amazonas (LACENS), os quais
fizeram a triagem dos espécimes fecais para detecção dos casos de infecção por RVs-A pelo
Ensaio Imunoenzimático (ELISA). A rede de vigilância também inclui a Vigilância Ampliada
de Rotavírus que tem por objetivo proceder a elucidação diagnóstica de surtos. O Instituto
Evandro Chagas (IEC/SVS/MS) é o Centro de Referência Nacional para Rotaviroses e
responsável pela realização dos testes referentes à região Amazônica e a caracterização
molecular das amostras positivas recebidas dos LACENS.
27
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Preparo da Suspensão Fecal
A partir dos espécimes fecais selecionados, foram preparadas suspensões fecais a
10% em tampão Tris-Ca++ 0,01M pH 7,2. Em seguida, as suspensões foram homogeneizadas
e clarificadas por centrifugação a 3.000 rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos a 4ºC.
O sobrenadante foi colhido e estocado a -20º C para a realização dos testes.
3.2.2. Extração do Genoma Viral
A extração do genoma viral foi desenvolvida segundo protocolo descrito por
Boom et al. (1990). Primeiramente, pipetou-se em um tubo de 1,5mL 300µL da suspensão
fecal. Adicionou-se 20µL de Proteinase K (20mg/mL) e 800µL de Tampão L6, agitando-se
posteriormente em vortex. O material foi incubado em banho-maria a 56°C por 10 minutos e
logo após, adicionado ao tubo 200µL de Etanol absoluto (4ºC) e 20µL de sílica.
Homogeneizou-se em agitador por 20 minutos à temperatura ambiente e posteriormente
centrifugou-se a 14.000 rpm por 40 segundos.
Descartou-se o sobrenadante em frasco contendo NaOH 10N, adicionando logo
após 500µL de Tampão L2 e homogeneizando em vortex visando centrifugação a 14.000 rpm
por 30 segundos. Descartou-se novamente o sobrenadante em frasco e foi adicionado 500µL
de Etanol 70%. Foi homogeneizado e em vortex e centrifugado a 14.000 rpm por 40 segundos
para posteriormente se descartar o sobrenadante em frasco contendo hipoclorito de sódio.
Secou-se o sedimento em banho-maria a 56°C por 15 minutos e, em seguida,
adicionou-se 60µL de água ultra pura (livre de DNAse e RNAse) e homogeneizou-se em
vortex.
Posteriormente, o material foi incubado em banho-maria a 56°C por 15 minutos e
homogeneizado em vortex. O tubo foi centrifugado à 14.000 rpm por 4 minutos, a fim de
realizar a coleta do sobrenadante (30 a 40µL) o qual foi transferido para um tubo previamente
identificado e armazenado à -20°C para a realização dos testes.
28
Durante o processo de extração todas as medidas de controle de contaminação
foram realizadas, inclusive a utilização de controles positivo (amostra positiva para RVs-A) e
negativo (água ultra pura).
3.2.3. Determinação dos Eletroferotipos por Eletroforese em Gel de
Poliacrilamida (EGPA)
O dsRNA extraído foi submetido à EGPA, para determinação dos eletroferotipos
de RVs-A segundo procedimento descrito por Pereira et al. (1983). Foram aplicados 10µL
dos dsRNAs extraídos no gel de poliacrilamida a 5% juntamente com 2µL de Loading buffer.
Este gel foi submetido a eletroforese vertical, sob as condições 100 volts (V), 100 Watts (W)
e 21 milli-Ámperes (mA)
por 2 horas e 30 minutos. Posteriormente, o gel foi fixado
utilizando-se etanol e ácido acético, seguido de coloração com nitrato de prata (AgNO3),
revelação do gel com hidróxido de sódio 10M e formaldeído a 37% e posterior visualização
do perfil eletroforético dos RVs-A em negatoscópio de luz branca (Herring et al., 1982).
3.2.4. Reação Em Cadeia Mediada pela Polimerase Precedida de Transcrição
Reversa (RT-PCR)
A RT-PCR foi desenvolvida em duas etapas e realizada segundo protocolo
descrito por Das et al. (1994), Gentsch et al. (1992) e Gouvea et al. (1990).
A primeira etapa iniciou-se com a formação do DNA complementar (cDNA), que
foi acrescido dos pares de iniciadores 4con3/4con2 (VP4) e Beg9/End9 (VP7) e desnaturado a
97ºC em termociclador por 7 minutos, seguido de imersão em banho de gelo (0ºC) por 5
minutos. Esses iniciadores amplificaram fragmentos de 875 pb e 1062 pb para os genes VP4 e
VP7, respectivamente, conforme demonstrado na Tabela 2.
29
Tabela 2: Sequência dos iniciadores utilizados na RT-PCR para os genes VP7 e VP4 de RVsA
Amplicon
em
Iniciado
Sequência
r
Gene
pares de
Referência
bases
(pb)
Beg9 (+)
End9 (-)
GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC
CGT CTG G
GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA
TCT AAG
VP7
-
VP7
1062
4con3(+)
TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A
VP4
-
4con2 (-)
ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
VP4
875
Gouvea et al.,
1990
Gouvea et al.,
1990
Gentsch et al.,
1992
Gentsch et al.,
1992
Após desnaturação, foi realizada a transcrição reversa visando à obtenção do
cDNA, durante 1 hora a 42°C, utilizando uma mistura de 22µL água RNase/DNase free,
dNTP 25mM (Mistura dos quatro desoxirribonucleotídeos trifosfato: dATP, dCTP, dGTP e
dTTP), Tampão 10X, MgCl2 50mM e RT 20U; 2µL de RNA e 1µL de iniciadores (Beg9/End9
e 4con2/4con3).
Após a obtenção do cDNA, iniciou-se a segunda etapa, a qual consistiu na
amplificação dos genes pela PCR. Adicionou-se uma segunda mistura 25µL de água
RNase/DNase free, dNTP 25mM (Mistura dos quatro desoxirribonucleotídeos trifosfato:
dATP, dCTP, dGTP e dTTP), Tampão 10X, MgCl2 50mM e Taq DNA Polimerase, com as
seguintes condições: 1 ciclo de 94ºC por 2 minutos (desnaturação prévia), seguido de 35
ciclos de 94ºC por 30 segundos (desnaturação), 42ºC por 30 segundos (hibridização) e 72ºC
por 1 minuto (extensão), finalizando com um ciclo de 72ºC por 7 minutos de extensão final. A
seguir, os produtos da RT-PCR foram armazenados a -20ºC.
Para caracterização dos genes VP7 e VP4, os cDNAs produzidos foram reamplificados, utilizando-se um grupo de iniciadores específicos para cada tipo de rotavírus,
30
pela técnica de Nested-PCR. Foram usadas misturas de iniciadores desenvolvidos para os
tipos G (G1, G2, G3, G4, G9 e G12) e P (P[4], P[6] e P[8]) (Tabela 3).
Tabela 3: Tamanho dos fragmentos de amplificação dos tipos G e P de RVs-A.
Tipo
Gene
Amplicon em pares de bases (pb)
G1
VP7
749
G2
VP7
652
G3
VP7
374
G4
VP7
583
G9
VP7
306
G12
VP7
515
P[4]
VP4
483
P[6]
VP4
267
P[8]
VP4
345
3.2.5. Eletroforese em Gel de Agarose
Os produtos obtidos na RT-PCR foram submetidos à eletroforese horizontal em
gel de agarose a 1,5% em Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 1x. Tais produtos foram
aplicados com Loading buffer e GelRed (BIOTIUM) juntamente com o marcador de peso
molecular de 123 pb diluído em TBE 1x e submetidos a condições de 120 V e 400 mA por 25
a 35 minutos.
Os produtos da RT-PCR em que foram visualizados o amplicon, submeteram-se à
purificação e posterior sequenciamento; e nas que não amplificaram, a RT-PCR foi repetida.
31
3.2.6 . Purificação e Quantificação do Produto da RT-PCR
Os produtos obtidos a partir da RT-PCR foram purificados utilizando-se o kit
disponível comercialmente, QIAQuick PCR purification (QIAGEN), que purifica o DNA
diretamente do produto da PCR.
A quantificação do DNA, expressa em nanogramas (ng), foi realizada com o
marcador de peso molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen), servindo de parâmetro para
a reação de sequenciamento.
3.2.7. Reação de Sequenciamento de Nucleotídeos
A reação de sequenciamento foi conduzida segundo o protocolo descrito pelo
fabricante do kit Big Dye Terminator V.3.0 (Applied Biosystems), utilizando-se uma mistura
de 10µL: iniciadores (Beg9/End9 ou 4con2/4con3), tampão, Big Dye Terminator, DNA
(dependente da concentração com máximo de 4µL), água RNase/DNase free (dependente da
quantidade de DNA com máximo de 3µL). A mistura foi adicionada a placa, juntamente com
o DNA purificado e colocada no temociclador nas seguintes condições: 25 ciclos de 96°C por
30 segundos (desnaturação), 50°C por 15 segundos (hibridização) e 60°C por 3 minutos
(extensão).
3.2.8. Alinhamento e Edição das Sequências para Construção da Árvore
Filogenética.
As sequências obtidas para os genes VP7 e VP4 foram alinhadas e editadas
utilizando-se o programa BioEdit (Versão 7.0.5.2) e comparadas com sequências de outros
vírus isolados e disponíveis no banco de genes “Genbank” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), a
partir do programa BLAST. Os dendrogramas foram construídos empregando-se o programa
MEGA 3 (v.3.0.0.41), pelo método de “Neighbor-Joining” e “UPGMA” (Unweighted Pair
32
Group Method with Arithmetic means), baseado nos parâmetros de Kimura (1980), utilizando
o teste de confiabilidade não paramétrico de “bootstrap” de 2000 réplicas.
33
4. RESULTADOS
Foram recebidas no IEC no período de agosto de 2009 a junho de 2010, 96
amostras fecais provenientes de crianças com gastrenterite aguda com diagnóstico de RVs-A
pelos LACENS para caracterização dos genótipos envolvidos na infecção (Figura 6). Trinta e
seis espécimes (37,5%) eram relativas a crianças vacinadas contra RVs-A, 10 (10,4%)
pertenciam a crianças que não haviam recebido a vacina contra RVs-A, e 50 (52,1%) a
crianças em que não foram identificados o seu estado vacinal.
30
26
26
25
20
18
17
15 15
15
12
Meses de recebimento
10
10
Meses de coleta
LACENs
8
6
6
4
5
66
4
3
3
2
2
0 1
0
2009
Ab
ril
M
ai
o
Ju
nh
o
Ag
o
Se sto
te
m
br
o
O
ut
ub
N
ov ro
em
De bro
ze
m
br
o
Ja
ne
Fe iro
ve
re
iro
M
ar
ço
0
2010
Figura 6: Distribuição mensal de amostras coletadas nos LACENS e recebidas no IEC no
período de 2009 a junho de 2010.
34
Desse total, 45 (46,9%) foram selecionados para a caracterização molecular,
resultando em 27 amostras positivas na EGPA, com predominância do eletroferotipo longo
(18/27-66,7%) em relação ao curto (9/27-33,3%) (Figura 7). Vale ressaltar que embora
algumas amostras tenham sido negativas para rotavírus pela EGPA, todas as amostras foram
submetidas a RT-PCR.
9( 33,3% )
longo
Curto
18( 66,7% )
Figura 7: Frequência dos eletroferotipos de RVs-A no período de agosto de
2009 a junho de 2010.
A RT-PCR foi realizada nas 45 amostras, sendo 22 (48,9%) provenientes do
estado do Amazonas, 18 (40%) do estado Pará e cinco (11,1%) do estado do Amapá.
Foi possível identificar o genótipo G em 36/45 (80%) amostras, sendo 12
genótipo G1, 10 genótipo G2, 5 genótipo G9 e 2 genótipo G12. As infecções mistas
envolvendo G foram detectadas em 19,4% (7/36) dos casos: G1+G2 (3/36), G1+G2+G12
(2/36), G1+G9 (1/36) e G2+G12 (1/36), conforme demonstrado na Figura 8.
1 (2,8%)
2 (5,5%)
1 (2,8%)
3 (8,3%)
12 (33,3%)
2 (5,5%)
G1
G2
G9
G12
G1+G2
5 (13,9%)
G1+G9
10 (27,8%)
G1+G2+G12
G2+G12
Figura 8: Distribuição dos genótipos G de rotavírus detectados por Nested-PCR em
36 amostras provenientes da rede de vigilância.
35
Para o gene VP4, o genótipo P pode ser identificado em 32/45 (71,1%) das
amostras, dentre estas, 15 reagiram com o P[8], 10 apresentaram genótipo P[4] e dois com o
P[6]. A infecção mista apresentou os tipos P[4]+P[6] em 15,6% (5/32) das situações de
acordo com os dados apresentados na Figura 9.
5 (15,6%)
10 (31,3%)
P[4]
P[6]
P[8]
P[4]+P[8]
2 (6,2%)
15 (46,9%)
Figura 9: Distribuição dos Genótipos P de rotavírus detectados por Nested-PCR
em 32 amostras provenientes da rede de vigilância
A combinação binária envolvendo os genótipos G e P foi determinada em 33,3%
(15/45) dos casos. Destas, 13 (86,7%) amostras foram associadas aos genótipos usuais G1P[8],
G2P[4], G9P[8] e duas (13,3%) ao genótipo não usual G12P[6].
Das 45 amostras genotipadas, 13 (28,9%) foram selecionadas aleatoriamente para
serem sequenciadas e a seguir comparadas com tipos virais usuais e não usuais circulantes em
outras partes do mundo, sendo os genótipos G2, G9, G12, P[4], P[6] e P[8] analisados. Das 13
amostras sequenciadas: quatro receberam a vacina, quatro não receberam a vacina e cinco o
quadro vacinal não foi identificado.
A análise filogenética do genótipo G2, demonstrou que quatro amostras do Pará
(RV 102271, 102289, 102292, 102276) que circularam em 2009 agruparam na linhagem II
(sublinhagem IIc) de acordo com a classificação proposta por Arista et al., (2005),
apresentando-se coesas em um mesmo ramo, com bootstrap de 99 e similaridade de 100%
entre si (dados não apresentados).
Para o genótipo G9, de acordo com classificação de Martinez-Laso et al. (2009),
as cinco amostras sequenciadas, RV 109719, 102145, 102143, 101103 e 102149 provenientes
do Amazonas que circularam nos anos de 2009 e 2010, agruparam na linhagem III com
similaridade de 99,5% a 100%. O teste de bootstrap gerou confiabilidade de 98 a esse
36
grupamento (dados não mostrados). Essas amostras estão juntas com amostras
contemporâneas provenientes de várias regiões do mundo, incluindo o Brasil.
Foram sequenciadas quatro amostras, RV 109724 e 108217 circulantes no
Amazonas no ano de 2010; o RV 105659 circulante no Pará e RV 101449 circulante no
Amapá no ano de 2009, para o genótipo não usual G12, agrupando-as na linhagem III de
acordo com Castello et al. (2009) com similaridade 99,8% a 99,9%, sendo estatisticamente
consubstanciada por teste de bootstrap gerando confiabilidade de 77 a esse grupamento
(Figura 10).
99 rv109724
62
rv108217
GU250828 RV98670
85
73 GU250829 RV98660
62
rv105659
78
64
FJ152121 US6597/G12P6/USA 2009
EF059916/Hu/CAU195/G12P6/South Korea(III
86 EF625825/Hu/031461/P6/20006/Taiwan
83
AB269689/Hu/MD844/P8/Saudi Arabia 2004
34
Linhagem III
75
rv101449
DQ146643/Hu/B4633-03/P8/Belgium 2003(
DQ490556/RV176-00/P6/Bangladesh 2000(
78
55
81
AJ311741/Hu/Se585/P6/USA (III)
DQ146654/Hu/Dhaka2502/P8 2002(III)
82 AY206861/Hu/ISO 1/India(III)
100
EU284722/Hu/SA3291JHB/P6/2004/Africa sul
64 AB071404/Hu/T152/P9/Thailand 2002(
AB125852/Hu/CP727/P9/Japan 2004
99
DQ111868/Hu/Arg 720/P9/Argentina 1999
69 AY855065/Hu/HC91/P9 2003 Brz
M58290/Hu/L26/P4/Philippinas 1987/(I)
74
DQ204743/Po/Ru172/P7/India(IV)
G1/Hu/Wa/K02033
0.05
Figura 10: Dendrograma das sequências de nucleotídeos do genótipo G12 com as amostras
do LACENS e outras sequências disponíveis no banco de genes.
37
Na análise do dendrograma para as sequências de nucleotídeo do gene VP4, as
cinco amostras, RV 109719, 102145, 102143, 101103 e 102149 provenientes do Amazonas
que circularam nos anos de 2009 e 2010, com genótipo P[8] do presente estudo, agruparam na
linhagem III,de acordo com Paul et al. (2008), com similaridade de nucleotídeo, entre as
mesmas, variando de 98,1% a 99,8%, e o valor de confiabilidade do agrupamento inferido por
bootstrap de 91 (dados não mostrados). Os genótipos P[8] apresentaram-se no mesmo grupo
de amostras do Rio de Janeiro (rj8224), Rio grande do Sul (rs11126), Bahia (ba12537) e
Dhaka (Dhaka25-02).
Para o genótipo P[4], quatro amostras foram sequenciadas, RV 102271, 102289,
102292, 102276 circulantes no Pará no ano de 2009, agruparam-se, de forma bem coesa em
um mesmo braço de árvore, com similaridade, entre as mesmas de 99,8% a 100%, e valor de
confiabilidade da árvore inferido por “bootstrap” de 99. De acordo com a classificação de
Espínola et al., (2008) essas amostras agruparam na linhagem V junto com o protótipo
H676/2004 da Rússia e de Bangladesh (2005), e divergiram 5,8% da amostra do Rio de
Janeiro (dados não apresentados).
Foram sequenciadas cinco amostras para o genótipo P[6], RV 109724 e 108217
circulantes no amazonas no ano de 2010; RV 105659 circulante no Pará e RV 101449
circulante no Amapá no ano de 2009, de acordo a classificação de Martela et al. (2006) estas
foram agrupadas na linhagem I (sublinhagem Ia) de forma coesa em um mesmo braço de
árvore, com similaridade, entre as mesmas de 99,1% a 99,9%, e valor de confiabilidade da
árvore inferido por “bootstrap” de 100. As amostras, deste estudo, agruparam com amostras
dos Estados Unidos (US1205), Bangladesh (EU839948) e Pará (HST368). A amostra do Pará
(HST368) apresentou similaridade de 97,9% quando comparada com as amostras da rede de
vigilância (Figura 11).
38
78 rv101449
100
rv105659
rv108217
96
96 rv109724
HST368/Hu/1999/Diarrheic
53
73
SK277/Hu/G12P6/Bangladesh/2005 EU839948
NB162/Hu/1997/Diarrheic
100
96
MW23/Hu/G8P6 AJ278253
1076/Hu/G2P6
M37/Hu/G1P6
54
75
ST3/Hu/G4P6
96
59
97
RV3/Hu/G3P6
221/04-7/Po/Italy/P6 AY955303
96
134/04-8/Po/P6 AY955301
57
51/03/Po/P6 AY955305
100
51/04/Po/P6 AY955306
134/04-10/Po/P6 AY955299
98
100 134/04-11/Po/P6 AY955300
100
76
BP1338-00/Hu/G4P6
BP271-00/Hu/P6 AJ621502
AU19/Hu AB017917
221-04-21/Po/P6 AY955309
62
134/04-7/Po/P6 AY955310
99
BP1227-02/Hu/G4P6
100
73
BP720-93/Hu/P6 AJ621503
Gottfried/Po/G4P6
DS-1/Hu/G2P4
100
Wa/Hu L34161
0.05
Figura 11: Dendrograma das sequências de nucleotídeos do genótipo P[6] com as
amostras do LACENS e outras sequências disponíveis no banco de genes.
Linhagem I (Ia)
US1205/Hu/G9P6
99
39
5. DISCUSSÃO
O presente estudo mostrou a importância da genotipagem dos genes VP7 e VP4
de RVs-A circulantes na região Amazônica no período de agosto de 2009 a junho de 2010.
Não foi observado um padrão de sazonalidade na distribuição das rotaviroses
entre as regiões estudadas devido o estudo ter ocorrido em um curto período de tempo,
contudo, observou-se uma freqüência maior de RVs-A nos meses de janeiro, fevereiro de
2010 e agosto de 2009.
Os RVs-A se caracterizam por sua ocorrência universal, sendo notória a diferença
quanto à distribuição temporal, se comparadas as regiões de clima temperado onde se observa
um padrão tipicamente sazonal, caracterizado pela ocorrência de extensas epidemias durante
os meses mais frios do ano com as regiões de clima tropical, onde os RVs-A ocorrem ao
longo de todo o ano, apresenta-se incidência elevada nos meses mais secos e com menor
precipitação pluviométrica (Kapikian et al., 2001, Linhares et al., 2009).
No Brasil, Pereira et al. (1993) observaram perfis tipicamente sazonais nas
regiões centro-oeste, sudeste e sul, o que não se registrou no Norte e Nordeste do país. Tal
padrão foi observado em estudo conduzido na Comunidade quilombola do Abacatal (PA),
onde os casos para RVs-A foram detectados na época mais seca do ano (Kaiano et al., 2009).
Em Belém, Pará, especificamente, estudos anteriores também não apontaram para o padrão
sazonal, quanto à ocorrência da diarreias por rotavírus. No entanto, observações mais recentes,
oriundas de intensiva vigilância dos episódios diarreicos sugerem predominância das diarreias
por RVs-A ao longo dos meses mais secos do ano (Linhares et al., 2009).
As infecções mistas podem resultar em combinações não usuais entre os
genotipos P e G (Iturriza-Gómara et al., 2001; Gouvêa & Brantly, 1995). Estas infecções
foram detectadas no presente estudo em 15,6% para o genótipo P e 19,5% para o genótipo G,
que corroboram com estudos conduzidos no Brasil, no qual a prevalência das infecções mistas
é bastante elevada, e assim como a Índia, contribuem com um percentual bastante expressivo
dessa diversidade, onde tipos incomuns são encontrados frequentemente (Mascarenhas, 2006).
Leite et al. (1996) demonstraram casos de infecção mista em 12% das situações
envolvendo 130 espécimes positivos para RVs-A, oriundos de nove Estados brasileiros, e
também apresentou um percentual elevado (21%) de infecções mistas envolvendo sorotipos G,
enquanto Santos et al. (1998) detectaram em 16% dos casos estudados no Brasil.
40
No presente estudo, a partir da análise filogenética do genótipo G2, pôde-se
agrupar quatro amostras (RV102271; 102289; 102292 e 102276) na linhagem II, sublinhagem IIc. Foi apresentado um índice de similaridade de 99% em relação a amostras de
origem asiáticas (Strain258 e PAK458). As amostras analisadas foram associadas ao tipo P[4],
as quais se agruparam na linhagem cinco deste genótipo, e esse genótipo G2P[4] apresentou
um eletroferotipo curto. Tais dados corroboram com os resultados obtidos por Oliveira (2010),
que apresentou amostras circulantes nos períodos de 1993 a 1994 e 2006 a 2008 na região
Amazônica, e por Mascarenhas et al. (2010) em estudo conduzido na cidade de Parauapebas,
PA (2006-2008), apresentando-se neste mesmo grupamento.
Na análise do genótipo G9, cinco amostras (RV102145; 102143; 102149; 101103
e 109719) demonstraram índice de similaridade de 98% em relação a amostras brasileiras
oriundas de Recife (R293) e Bahia (BA201/01). Outros estudos conduzidos na Hungria,
Tailândia, Bangladesh, Índia e Brasil também apresentaram elevada similaridade deste
genótipo ao longo do tempo, agrupando as amostras na linhagem III (Ahmed et al., 2010;
Araujo et al., 2007; Bányai et al., 2004;; Samajdar et al., 2008; Theamboonlers et al., 2008).
As amostras analisadas para G9 do presente estudo estavam associadas ao tipo P[8], e
corroboram com os estudos conduzidos no período de 1990 a 2004, em que o genótipo G9
estava associado ao tipo P[8] e foi responsável por cerca de 5% das infecções por RVs-A em
escala global, estando 15% destes casos na América do Sul (Genstsch et al., 2005). O
genótipo G9P[8] do presente estudo apresentou eletroferotipo longo que corroboram com o
estudo realizado por Paul et al. (2008).
O genótipo não usual G12 é relatado como sendo emergente e relacionado a P[4],
P[6] e P[8] (Rahman et al., 2007a). No presente estudo, foi detectada a combinação binária
G12P[6] em quatro amostras (RV101449; 105659; 108217 e 109724). Estas foram agrupadas
na linhagem III do genótipo G12 e na linhagem I do genótipo P[6].
No presente estudo as quatro amostras foram proveniente de crianças idade
variando de um mês a um ano e sete meses, circulantes nos estados do Amapá e Pará no ano
de 2009 e no Amazonas no ano de 2010. Apenas uma das quatro amostras apresentou
eletroferotipo longo e que corroboram com o estudo de Paul et al. (2008) em Bangladesh em
que as amostras apresentaram este mesmo eletroferotipo. As demais amostras não foi possível
vizualizar o eletroferotipo.
Estudos realizados na Amazônia são escassos em relação a este genótipo, no
entanto, já foram detectadas duas amostras de crianças com gastrenterite aguda com 16 meses
e 3 anos de idade com esta especificidade antigênica na região Amazônica (GU250828 e
41
GU250829) (Soares et al., 2010). Estas amostras foram relacionadas com as do presente
estudo e apresentaram índice de similaridade de 99,2 a 99,8%.
Em estudos conduzidos por Freeman et al. (2009) nos EUA, apresentou a
combinação binária G12P[6] em uma amostra de uma criança com diarréia da cidade de
Kansas, onde o protótipo US6597 apresentou-se, também, na linhagem III com similaridade
de 98,9% a 99,7% em relação as amostras do presente estudo.
42
6. CONCLUSÃO
 Os genótipos usuais encontrados no estudo através do seqüenciamento de
nucleotídeos foram G2P[6] e G9P[8].
 O genótipo emergente G12P[6] apresentou-se em quatro amostras da rede de
vigilância.
 Há necessidade de investigações mais apuradas sobre o aparecimento de
genótipos emergentes e associados a possíveis implicações clínicas.
 Os achados detectados no presente estudo revelam a grande diversidade de
genótipos usuais e não usuais de rotavírus na região Amazônica.
43
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