Terapia Gênica e Nanotecnologia - Marilanda Bellini

Disciplina:
Fundamentos de
Genética e Bio Mol
Turma:
Fisioterapia
(1o Ano)
Terapia Gênica e
Nanotecnologia
E-mail: [email protected]
Blog: http://marilandabellini.wordpress.com
Tratamento Doença Genética
↓
Paliativo
↙
Ameniza Sintoma
↘
Não age na causa gene
Estratégias Terapêuticas
Terapia Gênica
Novo conceito terapêutico
↓
Introdução de material genético para atuar na
causa fundamental da doença
↓
gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos
Processo destinado a tratar ou aliviar doenças pela
modificação genética das células do paciente.
Formas Potenciais de
Terapia Gênica
• Terapia gênica
germinativa
• Terapia gênica
somática
Terapia Gênica em Células
Somáticas
In Vivo
• as células são tratadas
dentro do corpo.
Ex Vivo
Terapia Gênica em Células
Somáticas
In Vivo
Ex Vivo
• as células são tratadas
dentro do corpo.
• as células do paciente são retiradas
e manipuladas fora do corpo.
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Métodos Físicos ou Químicos
Vetores Biológicos
• Microinjeção
• Eletroporação (choque
elétrico)
• Biobalística (gene gun)
• Retrovírus
• Adenovírus
• Adenovírus associado-AAV
(parvovírus)
• Lentivírus (retrovírus →
cels. não dividem)
• Herpes vírus (invadir
neurônios)
• Cromossomo artificial
BAIXA EFICÁCIA
E TRANSITÓRIOS
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Métodos Físicos ou Químicos
• Microinjeção
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Métodos Físicos ou Químicos
• Eletroporação (choque elétrico)
choque elétrico→poros (morte celular)
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Métodos Físicos ou Químicos
• Biobalística (gene gun)
Bombardeio partículas de ouro:
bomba de hélio (morte celular)
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Vetores Biológicos
• Retrovírus
– vetores
ideais
para
a
transferência de genes em
células humanas
– capazes de infectar quase
100% das células-alvo em
divisão→ integra no genoma
hospedeiro
– Carregam
fragmentos
relativamente grandes de
DNA (8kb)
– Desvatagem:
infectam
somente células em divisão
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Vetores Biológicos
• Retrovírus
– A inserção casual do DNA no
genoma das células
hospedeiras pode :
• inativar um gene
importante: morte celular
• ativar um oncogene: alterar
o padrão normal de controle
e divisão celular
• causar mutação
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Vetores Biológicos
• Adenovírus
– Eficiente para células em
divisão e quiescentes;
– Até 30Kb de DNA;
– Expressão transiente alta,
mas decai em 2 semanas;
– Adequado para matar células;
– Quimidirigido por proteinas
de superfície;
– Eficaz em hepatócitos;
– Causam Resposta Imune
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Vetores Biológicos
• Adenovírus associado-AAV
(parvovírus)
– vantagem de integração
estável ao DNA;
– células em/ou não divisão;
– nenhuma associação
conhecida com doença
humana;
– Desvantagem: inserção de
DNA de cerca de 5kb
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Vetores Biológicos
• Herpes vírus
– desativado: capacidade de
invadir neurônios.
– Desvantagem: não se
integram aos cromossomos:
inviabiliza expressão a longo
prazo
Técnicas de Introdução Gênica
em Mamíferos
Vetores Biológicos
• Cromossomo artificial
–
–
–
–
–
5-10 Mb
DNA telomérico humano
DNA centromérico
DNA genômico
Introduzidos em células em
cultivo.
Pré-requisitos para
Terapia Gênica
• escolher a doença apropriada a ser tratada;
• identificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras;
• assegurar que o gene inserido não tenha efeitos prejudiciais;
• determinar as células-alvo certas que tenham duração de vida
adequada;
• verificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução do
gene nas células;
• restringir a transferência do gene às células alvo somáticas;
• documentar e divulgar os resultados obtidos.
Classes de Doenças Passíveis de
Terapia Gênica
•
•
•
•
Doenças Hereditárias (monogênicas);
Neoplasias;
Doenças infecciosas (AIDS);
Outras Doenças: doença arterial coronária;
artrite; doença renal, etc
• Cerca de 650 protocolos aprovados
Tentativas de Terapia Gênica
• Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)
•
•
•
•
•
Imunodeficiência rara
Enzima ADA: via purinas (tóxica)
linfócitos T (células-alvo) são muito acessÍveis
Grande variação no nível de expressão do gene ADA entre
indivíduos normais
1990: Drs. Anderson e Blease
(Ashanti De Silva)
o primeiro protocolo aprovado para
terapia gênica foi para a correção da
deficiência da ADA.
Tentativas de Terapia Gênica
• Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)
• expressão do gene ADA detectada por 12 anos nos linfócitos periféricos
• transferência do gene não foi eficiente: receberam PEG-ADA
Tentativas de Terapia Gênica
• Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)
• NOVA TÉCNICA:
• gene ADA transferido para células tronco: sangue do
cordão umbilical;
• 10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normal;
• tratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA) foi
removida progressivamente;
• Células T expressando ADA significantemente.
Tentativas de Terapia Gênica
• Imunodeficiência Combinada Severa Ligada ao X –
SCID
– Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia γ do
receptor IL-2
– Pacientes faltam células T e células B prejudicadas
– França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica:
células da medula óssea retrovírus
– 9/10 crianças apresentaram células T com o gene
transduzido
– Duas crianças desenvolveram leucemia de células T ~ 3
anos após a terapia
Tentativas de Terapia Gênica
• Fibrose Cística
EXEMPLOS CLÍNICOS DE DOENÇASHerança
MONOGÊNICAS
Autossômica Recessiva
AUTOSSÔMICAS RECESSIVAS
Albinismo
Fibrose Cística
Doença pulmonar crônica.
Doença de TAY-SACHS
Distúrbio neurológico
degenerativo;
Homozigose recessiva letalidade.
Aula 03
Tentativas de Terapia Gênica
• Fibrose Cística
-
vetor adenoviral: infecta os pulmões, penetra em células
que não estão em divisão sem integrar no seu DNA,
permitindo que estas expressem o DNA viral, introduzido pelo
nariz com um spray.
- desvantagem:
inflamação com ataque imune que neutraliza as células
contendo gene adenoviral;
efeito da terapia de vida curta, cerca de 6 semanas.
Tentativas de Terapia Gênica
• Hemofilia:
• Mutação no gene do fator VIII (Hemofilia A) e fator IX
(Hemofilia B) de coagulação
• afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)
EXEMPLOS CLÍNICOS DE DOENÇAS MONOGÊNICAS
RECESSIVAS LIGADA AO X
Hemofilia A
É um distúrbio da coagulação
caracterizado por tempo de
sangramento prolongado.
Aula 03
Tentativas de Terapia Gênica
• Hemofilia:
• Mutação no gene do fator VIII Hemofilia A) e fator IX
(Hemofilia B) de coagulação
• afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)
• Sintomas: sangramento espontâneo nas articulações, nos
tecidos moles e órgãos vitais
• Tratamento: injeções regulares de fator VIII ou IX
Tentativas de Terapia Gênica
• Hemofilia (6 pacientes)
– Procedimento:
• extração de células da pele (fibroblastos);
• inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição
pelo organismo);
• clonagem dos fibroblastos
• pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem,
após pequenas incisões
• aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade
de vida dos pacientes)
• benefícios foram temporários: apenas 10 meses
Tentativas de Terapia Gênica
• Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON)
HERANÇA MATERNA DO DNA MITOCONDRIAL
Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON)
Perda visual bilateral, subaguda e indolor;
Adultos Jovens;
Sexo Masculino Afetado;
Não transmite LHON para gerações subsequentes.
Aula 03
Tentativas de Terapia Gênica
• Cegueira
– Abril/2008: Universidade da Pennsylvania , Hospital da Philadelphia
(USA) e Universidade de Londres
– Inserção do gene RPE65 (injeção com vetor viral direto na retina):
codifica a enzima que auxilia na conversão da vitamina A para
rodopsina A (pigmento das células fotorreceptoras que absorvem luz).
– Melhora na visão: maior sensibilidade a luz, detectaram movimentos
manuais e leitura de linhas de um cartaz de exame oftalmológico
• Perspectiva:
terapia em retinoblastoma
Vítimas da Terapia Gênica
• Universidade de Pensilvania:
– rapaz de 18 anos faleceu durante sua participação em uma triagem
de TERAPIA GÊNICA (4 dias após a terapia) ⇒ falência múltipla de
órgãos
• Julho/2007:
– mulher de 36 anos com artrite reumatóide faleceu 22 dias após
receber a segunda dose de um gene terapêutico para artrite.
– Após investigação pela FDA (Food and Drug Administration) não foi
possível atribuir a morte da paciente a terapia
Vítimas da Terapia Gênica
Terapia Gênica do Câncer
• Cerca de 420 protocolos:
• 2/3 dos protocolos de terapia gênica em estudo envolvem
cânceres não herdados
• introdução de genes supressores de tumor para restaurar a
função perdida.
• Ex.: inserção do gene
– TP53 normal em
tumores de pulmão ⇒
bloquear a progressão
tumoral e apoptose
Dificuldades da Terapia Gênica
• Obtenção da alta eficiência na transferência gênica
• Dificuldades de atingir o tecido alvo. Ex. neurônios (distúrbios
do SNC)
• Expressão adequada do gene
transitória e de baixo nível (<1%)
transferido:
expressão
• Necessidade de regulação precisa da atividade gênica. Ex.
Talassemia
• Resposta imune e inflamatória
• Ocorrência de inserção casual no genoma da célula
hospedeira
Terapia Gênica no Brasil
-
Em 2004 foi criada a Rede de
Terapia Gênica
- 14 grupos de pesquisa dos estados
do Rio de Janeiro, São Paulo e Rio
Grande do Sul, financiados pelo
Institutos do Milênio do
CNPq/MCT.
- Pesquisas: introdução de genes
com efeito terapêutico
Qual o alvo do Brasil?
- terapia gênica em câncer
- doenças graves do metabolismo
- doenças degenerativas e
cardiovasculares
- vacinas de DNA profiláticas para
doenças infecciosas e vacinas de
DNA terapêuticas para HPV
Nanotecnologia
Nanotecnologia
• Tamanho: 10-100nm (um bilionésimo de metro)
- minúsculas partículas: variadas formas → tubos, conchas, espirais
• Composição: moléculas funcionais como: drogas, peptídeos, proteínas,
ácidos nucléicos
• materiais: polímeros, dendrímeros, nanotubos de carbono, e metais
(ouro e óxido de ferro)
• Polímeros: avaliar a toxicidade (ativação do complemento,
imunogenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade) → devem ser
não tóxicos e biodegradáveis → evitar acúmulo no organismo (fígado,
baço e medula óssea)
-partículas esféricas (25nm-10um),
Nanotecnolgia
membrana bicamada fosfolipídica
-limitações: curto tempo de
Nanopartícula - Polímero
circulação sangue→
→ rápido
clearance pelos macrófagos
-2a. geração de lipossomos: tempo
de circulação sangue maior (3 dias)
Formação: duas partes
-núcleo hidrofóbico → recipiente p/droga
-Concha hidrofílica → estabilização em ambiente aquoso
Nanotecnologia
• Nanoconchas - esferas microscópicas – núcleo de sílica, recoberto com uma finíssima camada de ouro
– destroem células tumorais quando aquecidas com a luz de um
raio laser interagem com a luz de forma específica
"configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de
onda específicos
• Nanoconchas e câncer de cólon de ratos
– Nanoconchas na corrente sangüínea de camundongos se
acumulam preferencialmente nos tumores irradiação dos
tumores com fonte de laser
82% dos camundongos sobreviveram
Nanotecnologia no Câncer
• Nanopartícula multifuncional
– a entrega da droga, eficácia do tratamento e
toxicidade podem ser monitoradas usando
agentes de imagem.
Annu Rev Biomed Eng, 2007
NANOTECNOLOGIA
Nanotubos de carbono: de parede única com anticorpos
monoclonais adsorvidos → detectam células do câncer de
mama
•Os anticorpos eram específicos para os receptores do fator
crescimento 1 (IGF1R) → comuns em células cancerosas.
•A técnica poderá ser utilizada para detecção de células
tumorais recorrentes ou micrometástases remanescentes de
um tumor já tratado
•estudos em animais, analisando a sensibilidade do sistema
anticorpo-nanotubo na detecção de células cancerosas no
sangue e para detectar tipos específicos de células
cancerosas lançadas na corrente sangüínea pelos tumores
Referências
• NUSSBAUM, RL; MCINNES, RR; WILLARD, HF. Thompson e
Thompson - Genética Médica. 7ª ed. Elsevier, 2008.
• WEINBERG, RA. A Biologia do Câncer. Porto Alegre, Artmed Editora,
2007.
• LEWIS, B. Genes VII. 7a ed. Artmed Editora, 2001.
• SNUSTAD, P.; SIMMONS, M.J. Fundamentos de Genética. 2ª ed., Rio
de Janeiro, Guanabara Koogan, 2001.
• ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 3a. ed., Porto
Alegre, Artmed Editora, 1997.