EP 0514413 B1

Europäisches Patentamt
19 J
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European Patent Office
Office europeen des brevets
EUROPAISCHE
©
© Veröffentlichungstag der Patentschrift :
04.05.94 Patentblatt 94/18
(2i) Anmeldenummer : 91903270.6
© Anmeldetag : 08.02.91
(fi) Veröffentlichungsnummer: 0 5 1 4
413
B1
PATENTSCHRIFT
© int. ci.5: C 0 7 K 7 / 0 0 , C07K 13/00,
G01N 33/569, G01N 3 3 / 6 8 ,
C07K3/18,
C07K3/22,
C07K3/20,
C12N 1 5 / 1 0
(86) Internationale Anmeldenummer :
PCT/DE91/00106
@ Internationale Veröffentlichungsnummer :
WO 91/12269 22.08.91 Gazette 91/19
(54) IMMUNOLOGISCH AKTIVE PEPTIDE BZW. POLYPEPTIDE DES PARVOVIRUS B19.
Die Akte enthält technische Angaben, die nach
dem Eingang der Anmeldung eingereicht
wurden und die nicht in dieser Patentschrift
enthalten sind.
© Priorität : 08.02.90 DE 4003826
(43) Veröffentlichungstag der Anmeldung :
25.11.92 Patentblatt 92/48
©
@ Bekanntmachung des Hinweises auf die
Patenterteilung :
04.05.94 Patentblatt 94/18
© Benannte Vertragsstaaten :
AT BE CH DE DK ES FR GB IT LI LU NL SE
(56) Entgegenhaltungen :
WO-A-88/02026
(56) Entgegenhaltungen :
Chemical Abstracts, vol. 114, No. 3, published
21 January 1991 (21.01.91), (Columbus, Ohio,
USA), F.B. Rayment et al. "The production of
human parvovirus capsid proteins in Escherichia coli and their potential as diagnostic
antigens ", see page 203, right-hand column,
abstract No. 18 831d; J.Gen. Viral. 1990, 71(11),
265-72
Chemical Abstracts, vol. 109, No. 17, published 24 October 1988 (24.10.88) (Columbus,
Ohio, USA), K. Ozawa et al. "Translational
regulation of B19 parvovirus capsid protein
production by multiple upstream AUG triplets ", see page 177, left-hand column, abstract No. 143 557s; J. Biol. Chem. 1988, 263
(22), 10922-6
(73) Patentinhaber : MIKROGEN
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ENTWICKLUNGS-GMBH
Westendstrasse 125/G
D-80339 München (DE)
© Erfinder : SOUTSCHEK, Erwin
Schäftlarnstrasse 126
D-8000 München 70 (DE)
Erfinder : MOTZ, Manfred
Schachnerstrasse 7
D-8000 München 70 (DE)
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© Vertreter : Keller, Günter, Dr. et al
Lederer, Keller & Riederer Patentanwälte
Prinzregentenstrasse 16
D-80538 München (DE)
Anmerkung : Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des
des europäischen Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt
ische Patent Einspruch einlegen. Der Einspruch ist schriftlich einzureichen
erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr entrichtet worden ist (Art.
übereinkommen).
Jouve, 18, rue Saint-Denis, 75001 PARIS
Hinweises auf die Erteilung
gegen das erteilte europäund zu begründen. Er gilt
99(1) Europäisches Patent-
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Beschreibung
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Das humane Parvovirus B1 9 (im folgenden kurz: B1 9) wurde 1975 zufällig in Plasmaproben von Blutspendern (Cossart, Y.E., Field, A.M., Cant, B., Widdows, D.: Parvovirus-like particles in human sera. Lancet I (1975)
72-73) mittels Gegenstromelektrophorese entdeckt. In den letzten Jahren wurde gezeigt, daß B19 bei Patienten mit chronisch-hämolytischer Krise eine aplastische Krise verursachen kann und das ätiologische Agens
des Erythema infectiosum (El) ist.
B1 9 weist elektronenmikroskopisch eine Größe von ca. 20nm auf. Die Partikel haben eine ikosaedrische
Symmetrie. Neben den Viruspartikeln zeigen sich auch "leere" Kapside, die keine DNA enthalten. Die Dichte
in CsCI2 beträgt 1,36 - 1,40g/ml. Das Virusgenom besteht aus einer einzelsträngigen DNA von 5,4kb. Die Nukleotidsequenz des Genoms eines Parvovirus B19 wurde von einem Klon abgeleitet, der beinahe das vollständige virale Genom enthielt (R.O. Shade et al. Journal of Virology (1986) S.921).ln jedes Viruspartikel wird jeweils nur ein DNA-Strang von entweder Plus- oder Minusorientierung verpackt. B19 ist ein autonomes
Parovirus, d.h. es benötigt zur Replikation kein Helfervirus.
Das Kapsid besteht aus zwei Polypeptiden mit Molekulargewichten von 83kDa (VP1) und 58kDa (VP2).
Zusätzlich lassen sich drei Nicht-Strukturproteine von 52, 63 und 71kDa nachweisen.
Die DNA kodiert im 5'-Bereich für die Strukturproteine des Kapsids. Die kodierenden Bereiche dieser
Strukturproteine sind bis auf einen zusätzlichen N-Terminus des VP1 identisch. Verursacht wird dieser Unterschied durch "splicing"-Vorgänge auf der mRNA-Ebene, bei denen im Fall von VP2 der translationelle Start
für VP1 herausgenommen wird und somit die Translation erst mit dem kürzeren VP2 starten kann.
Untersuchungen an verschiedenen, weltweit gefundenen B19-lsolaten zeigten, daß sich diese zum Teil
durch Restriktionsenzym-Muster auf DNA-Ebene unterscheiden. Diese Unterschiede korrelieren allerdings
nicht mit dem klinischen Spektrum der B19- Infektion.
Bisher konnte keine permanente Zellinie gefunden werden, in der sich B1 9 vermehren läßt. Ebensowenig
gelang es bisher, für B1 9 ein Versuchs-Tiermodell zu etablieren. Allerdings läßt sich B19 in primären Knochenmarks-Zellen unter Anwesenheit von Erythropoetin vermehren. So konnte der Replikations-Mechanismus des
Virus geklärt und gezeigt werden, daß Zellen der Erythropoese Zielzellen dieser Infektion sind. Inzwischen
gelang die Inokulation von B19 in fetalen erythropoetischen Zellen und Erythroblasten eines Patienten mit
chronisch myeloischer Leukämie.
B19 verursacht das Erythema infektiosum (Ringelröteln), eine in der Regel benigne verlaufende Infektionserkrankung, die meist zwischen dem Kindes- und frühem Erwachsenenalter auftritt. Außerdem kann die
B19-lnfektion bei Patienten mit chronischhämolytischer Anämie (Sichelzellenanämie usw.) aplastische Krisen
und bei Patienten mit angeborenen oder erworbenen Immunmangelzuständen chronische KnochenmarksAplasien verursachen.
In der Schwangerschaft kann die B19-lnfektion in etwa 10 - 15% zu Hydrops fetalis mit resultierendem
interuterinalem Fruchttod führen. Ferner ist B19 mit dem Auftreten der Purpura Schönlein-Henoch assoziert.
B19 wird in der Regel durch Tröpcheninfektion, aber auch durch antigen-positive Blutkonserven und Gerinnungspräparate übertragen.
Da bisher keine permanente Zellinie bekannt ist, in der sich B19 in großen Mengen gewinnen läßt, fehlt
eine
Quelle zur Gewinnung von Antigen für diagnostische Tests. Bisher behilft man sich mit B1 9- Virus, das
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in Blutkonserven von Spendern, die sich gerade in virämischen Stadium der Infektion befinden, zufällig entdeckt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, immunologisch aktive Polypeptide zur Verfügung zu stellen,
die mit den hier vorgestellten Testsystemen den Nachweis von B1 9-spezif ischen Antikörpern der IgG und IgMKlasse ermöglichen. Damit ergeben sich folgende Anwendungsmöglichkeiten:
- Serumdiagnose akuter bzw. abgelaufener B19-lnfektionen in der Dermatologie, Hämatologie, Gynäkologie, Rheumatologie und Pädiatrie.
- Bestimmung des B19-Immunstatus bei Schwangeren
- Untersuchung von Blutkonserven oder Plasmaspenden zum Ausschluß der Übertragung von B19-Antigen, da durch anti-B19-lgG positives Blut oder Plasma höchstwahrscheinlich kein B19-Virus mehr
übertragen werden kann.
- Selektion von anti-B1 9 positiven Plasmaspendern für die Produktion von B19-Hyperimmunglobulin-Präparaten.
Aufgrund des breiten klinischen Spektrums der durch B1 9 verursachten Erkrankungen sowie der Gefährdung für B19-seronegative Schwangere ist die Einführung von Testreagenzien dringend von Nöten.
Es hat sich herausgestellt, daß brauchbare immunologisch aktive Polypeptide nicht ohne weiteres hergestellt werden können. Die gentechnologische Darstellung von kurzen Peptiden ist ebenso wie die von großen
Polypeptiden nur dann in einer zufriedenstellenden Ausbeute möglich, wenn geeignete Expressionsvektoren
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verwendet werden. Verhältnismäßig kurze Peptide können zwar leicht synthetisch hergestellt werden, erforderlich ist jedoch eine genauere Kenntnis der immunologischen Wirksamkeit.
Gegenstand der Erfindung sind immunologisch aktive Peptide, die einen Teil der Aminosäuresequenz der
Kapsidproteine VP 1 oder VP 2 des Parvovirus B19 aufweisen. Diese Peptide sind dadurch gekennzeichnet,
daß sie frei sind von Verunreinigungen, die den Nachweis von gegen Parvovirus B1 9 gerichteten Antikörpern
stören. Diese Eigenschaft ist von großer Bedeutung, da solche Präparationen von Peptiden nicht brauchbar
sind, die aufgrund der Herstellung Bestandteile enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern reagieren.
Ein Beispiel für eine derart unerwünschte Verunreinigung ist Protein A, das spezifisch mit dem Fc-Anteil von
IgG-Antikörpern reagieren kann. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Peptide ist, daß sie durch die erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren in guter Ausbeute hergestellt werden können. Werden nämlich die für einen diagnostischen Test benötigten Antigene nicht in einer ausreichenden Menge bei den Herstellungsverfahren synthetisiert, kann nicht die erforderliche Ausbeute nach den anschließenden Reinigungsverfahren erhalten werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten weiterhin kurze Peptidsegmente aus dem VP 1, genauer
dem
Bereich von VP 1, der nicht mit VP 2 übereinstimmt, bestimmt werden, deren Epitope zum zuverläsaus
Nachweis
von Antikörpern gegen Parvovirus B1 9 in den Untersuchungsflüssigkeiten, insbesondere Sesigen
sind.
Dieser Bereich wird im folgenden als VP 1-VP 2 bezeichnet. Abb. 3 zeigt beispielhaft die
ren geeignet
Anordnung von einigen Peptiden (PAPEP 1-PAPEP 8) in dem Bereich (VP 1-VP 2). Auch wenn diese Peptide
bevorzugt sind, können ebenso andere Peptide mit 8-50 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 32 Aminosäuren, aus
dem Bereich VP 1-VP 2 eingesetzt werden. Dieser Bereich entspricht etwa dem Polypeptid PAN1, das in Abb.
2-1 dargestellt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dieser kleine, immundominante
und B19-spezifische Bereich im serologischen Test eingesetzt. Besonders bevorzugt wird dabei ein Gemisch
synthetischer Peptide eingesetzt, wobei diese Peptide die in Beispiel 3 gezeigten Aminosäuresequenzen
PAPEP 1 - PAPEP 8 aufweisen.
In eineranderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Abbildung 2 dargestellten Aminosäuresequenzen der gentechnologisch dargestellten immunologisch aktiven Peptide PAN-1 ,
PAN-2, PAN-3, PAN-4, PCE, PANSE UND PAPST eingesetzt. Hierbei ist es in der Regel ausreichend, wenn
ein Peptid in dem Test verwendet wird. In besonderen Fällen können aber auch zwei oder mehr dieser Peptide
eingesetzt werden.
Hergestellt werden können die erfindungsgemäßen Peptide entweder synthetisch oder gentechnologisch.
Bevorzugt werden die kurzen Peptide, die in Beispiel 3 näher erläutert sind, synthetisch hergestellt. Die längeren Peptide jedoch werden bevorzugt gentechnologisch hergestellt.
Zunächst wurden die kodierenden Bereiche derviralen DNAmittels zweier Polymerase-Ketten-Reaktionen
(Polymerase chain reaction, PCR) aus dem Serum eines infizierten Patienten amplifiziert und in Plasmiden
für die weitere Vermehrung in Escherichia (E.) coli kloniert. Nach weiteren Subklonierungsschritten wurden
dann verschiedene Bereiche daraus in E. coli gentechnologisch exprimiert und die dabei entstehenden Antigene auf ihre Verwendung für den Nachweis von Antikörpern gegen das Virus untersucht. Eine direkte HerStellung der erfindungsgemäßen Peptide in Expressionsvektoren ist aufgrund verschiedener Schwierigkeiten
nicht möglich. Erfindungsgemäß wird daher das virale Proteinsegment an ein stabil exprimierbares Protein anfusioniert. Dieses Fusionsprotein kann nach der Aufreinigung direkt als Antigen für den IgG-Nachweis eingesetzt werden. Bevorzugt wird jedoch der Parvovirus spezifische Anteil durch geeignete Methoden abgespalten, weiter aufgereinigt und dann für serologische Tests eingesetzt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Testkits für die Bestimmung von Antikörpern, die
gegen Parvovirus B1 9 gerichtet sind. Die erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Peptide können grundsätzlich in allen diagnostischen Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen Parvovirus B1 9 verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testkits wird die Festphase geeigneter
Mikrotiterplatten oder Polystyrol-Kugeln mit den erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Peptiden beschichtet. Nach Inkubation mit der Untersuchungsflüssigkeit (Serum-Probe) in einer geeigneten Verdünnung
wird nach üblichen Waschschritten Enzym- oder radioaktiv-markiertes anti-human-IgG zugegeben. Das Ausmaß der Substratumsetzung bzw. der gebundenen Radioaktivität zeigt dann an, ob in der Serum-Probe gegen
Parvovirus B19 gerichtete Antikörper vorhanden sind.
Die erfindungsgemäßen Testkits werden üblicherweise an Laboratorien von Ärzten, Krankenhäusern, Untersuchungsanstalten etc. geliefert. Sie enthalten regelmäßig alle zur Testdurchführung benötigten Reagenzien. Übliche Testreagenzien wie Pufferlösungen etc. werden jedoch manchmal nicht mitgeliefert. In der Regel
enthalten die Testkits Mikrotiterplatten oder Polystyrolkugeln, die entweder mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Peptiden, oder mit anti-Antikörpern beschichtet sind. Weiterhin können die Testkits, je nach
Testprinzip, ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide enthalten. Schließlich umfassen die Testkits noch
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eine Anzeigekomponente, die eine Auswertung des Testergebnisses ermöglicht.
Bei anderen bevorzugten Testkits werden die Antigene an die Festphase von Mikrotiterplatten oder Polystyrol-Kugeln gebunden. Nach Inkubation des Testserums, geeigneten Wasch- und Absättigungsschritten wird
ein spezifischer, enzymatisch oder radioaktiv markierter Antikörper gegen die B19-Antigene zugegeben und
dessen Substratumsetzung bzw. die gebundene Radioaktivität gemessen. Da es sich hierbei um einen Inhibitionstest handelt, zeigt eine geringe Substratumsetzung bzw. geringe Radioaktivität das Vorhandensein von
spezifischen Antikörpern an.
Für den Nachweis von IgM-Antiköpern gegen B19 können die an Festphasen gekoppelten erfindungsgemäßen Peptide ebenfalls eingesetzt werden. Bei diesem Nachweisverfahren werden zunächst die IgG-Antikörper durch Zugabe von mit Protein A beschichteten Kugeln zu den Untersuchungsflüssigkeiten eliminiert.
Der Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt dann mit einem anti-human IgM-Antikörper, der enzymatisch oder radioaktiv markiert ist.
Bei einem weiteren bevorzugten Testkit wird das Prinzip des sog. "n-capture assays" verwendet. Mittels
die
feste Phase gebundenen anti-human IgM-Antikörpern wird zuerst das IgM aus der Untersuchungsflüsan
sigkeit (Serum) gebunden. Dann werden die erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Peptide zugegeben.
Das Ausmaß der Bindung der Antigene und somit die Menge an vorhandenem Anti-B19-lgM kann dadurch erfolgen, das entweder die Antigene radioaktiv oder mit anderen Substanzen (Digoxigenin, Avidin) markiert sind
und somit nachweisbar sind, oder daß ein zweiter markierter Antikörper gegen die B1 9-Antigene eingesetzt
und dessen Bindung gemessen wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ganz besonders bevorzugt sind die ELISA-(enzyme linked
immunosorbent assay)-Testkits.
Erfindungsgemäß werden auch DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die für den direkten Nachweis
des Virus in Untersuchungsproben (Seren, Biopsien etc) verwendet werden können. Bevorzugt werden zwei
DNA-Primer verwendet, die sich spezifisch an DNA-Bereiche im VP 1 anlagern. Mittels eines käuflich erhältlichen Polymerase-chain-reaction-Kits kann dann eine Amplif izierung des dazwischen liegenden Bereiches erreicht werden. Nachgewiesen wird die dann in geeigneterweise fixierte amplif izierte DNA durch eine geeignete DNA-Sequenz. Hergestellt wird diese für die Hybridisierung eingesetzte DNA mit Hilfe eines Plasmides,
das den zwischen den beiden Primern liegenden DNA-Bereich enthält.
Selbstverständlich dürfen die Primer Sequenzen nicht in der zur Hybridisierung eingesetzten DNA vorhanden sein. Die Sequenz der verwendeten Primer und deren Anordnung zueinander ist in Abb. 1 dargestellt.
Schließlich werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Impfstoffe gegen Parvovirus B19 zur
Verfügung gestellt. Hierbei werden die erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Peptide zusammen mit geeigneten Adjuvantien den zu schützenden Personen gegebenenfalls mehrmals appliziert. Die dadurch hervorgerufene Produktion von Antikörpern kann einen Schutz vor Infektion mit Parvovirus B19 bewirken.
BEISPIEL 1:
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Gewinnung von Parvovirus B19 VP 1- und VP 2-kodierenden Sequenzen aus Patientenserum
Von einem Patienten mit akuter Infektion (Erythema infectiosum) wurde aus Iml Serum virale DNA durch
Proteinase K-Verdau in 1% SDS, Phenolextraktion und anschließender Alkohol-Fällung isoliert (Diese und
auch alle folgenden Schritte zur Gewinnung, Verarbeitung und Expression von DNA, sowie auch die Darstellung von rekombinanten Proteinen und grundlegende Schritte zu deren Reinigung sind in: Maniatis, T., Fritsch,
E.F., Sambrook, J. (1982) Molecularcloning. Cold Spring Harbor, N.Y. ausführlich dargestellt). Diese DNAwurde in 50jj.I TE-Puffer aufgenommen und jeweils dann
für die Amplif izierung mittels der "Polymerase chain
reaction" und synthetischen Oligodesoxynukleotiden eingesetzt. Für die Amplif izierung der kodierenden Bereiche der Oberflächenproteine wurden zwei Primer-Paare verwendet; eines davon für die Gewinnung des VP
1-Anteils, das zweite Paar für das gesamte VP 2. Die als Primer verwendeten Oligodesoxynukleotide besitzen
an ihren jeweiligen 5'-Enden Sequenzen, die nicht mit der Parvovirus-Sequenz homolog sind, für Restriktionsenzym-Schnittstellen kodieren und deswegen geeignet sind, die aus der PCR entstandenen DNA-Fragmente
in geeignete Vektoren zu klonieren. Es wurden die in Abb. 1 mit 0-1 bis 0-5 bezeichneten Primer verwendet.
Jeweils fünf Ansätze mit je 1 isolierter Parvovirus DNA wurden mit den beiden Primer-Paaren in einem
Volumen von 100^1 amplif iziert. Die Bedingungen dabei waren: 1,5min Denaturierung bei 94°C, 2min Anlagerung der Primer bei 45°C, 4min Synthese bei 72°C; insgesamt 50 Zyklen; Puffer, Substrate und Taq-Polymerase wurden dabei nach Angaben des Herstellers (Cetus/Perkin-Elmer, Überlingen, BRD) eingesetzt.
Die amplif izierten DNA-Fragmente aus den beiden unterschiedlichen Ansätzen (für VP 1 und VP 2) wurden
jeweils vereinigt, mittels Alkohol-Fällung präzipitiert, mit 70% Alkohol gewaschen, getrocknet, in einem Volumen von 200|il TE-Puffer gelöst und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hindill verdaut. Nach elektrophoretischer Auftrennung der Fragmente in einem 1,2%igen Agarose-Gel erfolgte dann die Isolierung der ent4
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sprechenden DNA-Banden (709bp für VP 1, 1704bp für VP 2) und Insertion in die EcoRI und Hindill Stellen
des Vektors PUC12 (Pharmacia, Schweden). Nach Transformation der Plasmide in E.coli JM109 (Pharmacia,
Schweden) wurden Bakterienklone mit Parvovirus-DNA-Inserts durch Restriktionsverdau charakterisiert. Die
entsprechenden Klone erhielten die Namen pUC12PAN für den VP 1-Anteil-kodierenden Bereich und
pUC12VP2 für den VP 2-kodierenden Bereich.
BEISPIEL 2
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Gentechnologische Darstellung von VP 1-Anteil und VP 2 aus E.coli-Zellen
a) VP1 -Anteil:
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1) PAN-1
Aus dem Plasmid pUC12PAN wurde der VP1-kodierende Bereich mit Bell und Hindill (siehe Abb.1,
die Hindlll-Stelle stammt aus dem pUC-Vektor) isoliert und hinter das 3'-Ende eines verkürzten ß-Galactosidase-Gens des Vektors (z.B. pBD2) in die Restriktionsschnitt-Stellen BamHI und Hindill inseriert. E.coli-Zellen mit daraus resultierenden Plasmiden exprimieren nach Induktion mit IPTG in großer Menge ein
B-Gal::VP1 -Fusionsprotein (ca. 67kDA), welches im Immunoblot (Western Blot) sehr stark mit anti-Parvovirus B19-positiven Seren reagiert. Eine Reinigung dieses Proteins kann sehr leicht mit konventionellen
Methoden erreicht werden, indem die Unlöslichkeit des Proteins ausgenutzt wird. Nach Lyse der Zellen
wird die Pelletfraktion mit Detergentien wie Triton-X100 und Octyl-gluco-pyranosid gewaschen, das Fusionsprotein anschließend mit 8M Harnstoff/1% Mercaptoethanol in Lösung gebracht und durch DEAEChromatographie mit einem NaCI-Gradienten von zellulären Verunreinigungen abgetrennt.
Eine Abspaltung des VP1-Anteils aus dem Fusionsprotein kann durch BrCN-Spaltung erreicht werden, da die VP1 -Proteinsequenz mit einem Methionin beginnt und im Fragment selbst diese Aminosäure
nicht mehr auftaucht; im bakteriellen Fusionsanteil dagegen tritt Methionin relativ oft auf, so daß dieser
Anteil in sehr kleine Bruchstücke zerlegt wird. Nach der Spaltung in 35% Ameisensäure und 0,1 mg/ml
BrCN für 4h bei Raumtemperatur wurde die Probe lyophilisiert, in 8M Harnstoff, 2mM DTE (Dithiothreitol)
gelöst und mittels DEAE-Chromatographie in einem NaCI-Gradienten aufgereinigt. Das hieraus resultierende VP1 -Fragment wurde PAN-1 benannt und kann direkt für serologische Bestimmungen verwendet
werden. Die Aminosäure-Sequenz ist in Abb.2-1 angegeben.
Als weitere Konstrukte wurden Plasmide generiert, die für Fusionsproteine bestehend aus der
Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum (Smith, D.B. and Johnson, K.S.:Single step
purif ication of Polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene,
67 (1988) 31-40) und dem VP1-Anteil kodieren. Es kann aber auch ein anderer Fusionspartner verwendet
werden, solange dieser nicht den diagnostischen Test stört.
2) PCE:
Aus pUC12PAN wurde das B19-DNA-Fragment nach Bcll/Pvull Verdau (618bp) isoliert und in pGEX1
in die BamHI und Smal Stellen integriert (pGEXIPAN). Das entstehende 52kDa-Fusionsprotein wurde mittels Glutathion-gekoppelter Agarose aus dem Überstand gereinigt und als Antigen für die serologischen
Teste in Beispiel 4 eingesetzt (Name:PCE). Die Aminosäure-Abfolge dieses Antigens ist in Abb. 2-2 aufgeführt.
3) PAN-2:
Aus pUC12PAN wurde ein 458bp Fragment mit Bcll/Hincll isoliert und nach Zwischenklonierungen in
anderen Vektoren in pGEX2 (pGEX2PAN) inseriert. Die Insertion des Fragments im selben Leserahmen
kann auch durch die Verwendung von synthetischen Oligodesoxynukleotiden erreicht werden. An der
Fusions-Stelle von Glutathion-S-Transferase und dem VP1-Segment ist die Aminosäure-Sequenz, die von
Thrombin erkannt wird, so daß der B19-Anteil durch dieses Enzym vom Fusionspartner abgespalten werden kann. Es kann auch jeder andere Fusionspartner verwendet werden, wenn er diese Protease-Erkennungssequenz besitzt. Die Aminosäure-Sequenz des Antigens, sowie anfusionierte Fremdaminosäuren
(in Fettdruck) ist in Abb. 2-3 angegeben.
4) PAN-3:
Aus pUC12PAN wurde ein 458bp Fragment mit Bcll/Hincll isoliert und nach Zwischenklonierungen in
anderen Vektoren in pGEX3 (pGEX3PAN) inseriert. Die Insertion des Fragments im selben Leserahmen
kann auch durch die Verwendung von synthetischen Oligodesoxynukleotiden erreicht werden. An der
Fusions-Stelle von Glutathion-S-Transferase und dem VP1-Segment ist die Aminosäure-Sequenz, die
vom Protease Faktor Xa erkannt wird, so daß der B19-Anteil durch dieses Enzym vom Fusionspartner abgespalten werden kann. Es kann auch jeder andere Fusionspartner verwendet werden, wenn er diese Pro5
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tease-Erkennungssequenz besitzt. Die Aminosäure-Sequenz des Antigens, sowie anfusionierte Fremdaminosäuren (in Fettdruck) ist in Abb. 2-4 angegeben.
5) PAN-4:
Aus pUC12PAN wurde das gesamte B19-DNA-Insert durch Bell und Pstl Verdau gewonnen und nach
verschiedenen ZwischenklonierungsSchritten in den Vektor pGEX2 inseriert. Erhalten wurde dabei das
Plasmid pGEX2PAN. Die Insertion des Fragments im selben Leserahmen kann auch durch die Verwendung von synthetischen Oligodesoxynukleotiden erreicht werden. An der Fusions-Stelle von GlutathionS-Transferase und dem VP1 -Segment ist die Aminosäure-Sequenz für die Protease Thrombin, so daß der
B19-Anteil durch dieses Enzym vom Fusionspartner abgespalten werden kann. Es kann auch ein geeigneter anderer Fusionspartner verwendet werden, wenn er diese Protease-Erkennungssequenz besitzt.
Die Aminosäure-Sequenz des Antigens, sowie anfusionierte Fremdaminosäuren (in Fettdruck) ist in Abb.
2-5 angegeben.
Eine Reinigung der Antigene kann durch einfache Affinitäts-Chromatographie mit einer Glutathiongekoppelten Gelmatrix erreicht werden.
Zur weiteren Aufreinigung derauf pGEX 2 und 3 beruhenden Fusionsproteine wurde eine Abspaltung des
B19-Anteils durch Verdau mit Trombin bzw Faktor X nach Angaben des Herstellers (Boehringer Mannheim)
durchgeführt. Die Bruchstücke wurden dann nochmals Äff initäts-chromatographisch aufgereinigt. Die S-Glutathion-Transferase kann dabei selektiv herausgefischt werden, der Parvovirus Proteinanteil ist in Durchlauf
zu finden und kann nach einer abschließenden DEAE-chromatographischen Auftrennung in serologischen
Tests eingesetzt werden.
Alternativ hierzu kann aber auch die Protease direkt zu der Glutathion-gekoppelten Gelsuspension mit
dem angebundenen Fusionsprotein gegeben werden. Nach einer Inkubationszeit von ca. 1h läßt sich das abgespaltene VPI-Fragment aus dem Gel waschen, während der Glutathion-S-Transferase-Anteil an die
Gelmatrix gebunden bleibt.
b) VP-2-Anteil:
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1) VP-2
Bedingt durch die Auswahl der PCR-Primer sowie des Vektors ist der kodierende Bereich für VP2 im
Plasmid pUC12VP2 bereits im richtigen Leserahmen und kann nach Induktion mit IPTG aus der unlöslichen
Fraktion des Bakterienlysats, ähnlich wiefürpBD2PAN beschrieben, aufgereinigt werden. Die AminosäureSequenz des rekombinanten Antigens ist in Abb.2-6 gezeigt.
2) PANSE:
Überraschenderweise zeigte sich, daß eine Verkürzung der VP2-kodierenden Sequenz eine erhebliche Steigerung der Proteinausbeute mit sich bringt, daß dieses verkürzte Antigen stabil exprimierbar ist,
auch während der Reinigung nicht degradiert wird sowie auch noch dieselbe Rektivität mit anti-B19 positiven Seren aufweist. Dieses Expressionsplasmid (pUC19PANSE) wurde erhalten, indem der 5'-Bereich
von VP2 um 355bp bis zu einer Nsil-Stelle verkürzt wurde. Dieses Fragment wurde in pUC1 9 (Pharmacia,
Schweden) inseriert, das denselben Leserahmen im lacZ-Peptid aufweist wie die B19 Sequenz. Da aufgrund der PCR Primer am 3'-Ende eine Hindlll-Stelle sitzt, mußte durch Zwischenklonierung noch eine
EcoRI-Stelle geschaffen werden, um das gewünschte Fragment in die Pstl und EcoRI Stellen von pUC19
inserieren zu können.
Das Antigen mit einer Größe von ca. 38kDa (PANSE) kann sehr einfach aus der Pellet-Fraktion des
Bakterien-Lysats nach Lösen in 4M Harnstoff durch DEAE-Chromatographie von Verunreinigungen getrennt werden. Die Aminosäure-Sequenz des Antigens ist in Abb. 2-7 angegeben.
3) PAPST:
Von dem Plasmid pUC12VP2 wurde durch Pstl Verdau ein 716bp großes Fragment isoliert, das den
N-terminalen Bereich von VP-2 kodiert. Nach Insertion des Fragments in den Vektor pUC9 (Pharmacia,
Schweden) in die selbe Orientierung der Leserahmen wie dem lacZ des Vektors (charakterisiert durch Restriktionsenzym-Verdau) wird das B19-Antigen mit einer Größe von ca 33kDa in sehr großer Menge (ca.
10% des Gesamt-E.coli-Proteins) produziert. Eine Aufreinigung kann ähnlich wie bei pBDAN aus den unlöslichen Bestandteilen durch Lösen in 8M Harnstoff und anschließende DEAE-Chromatographie erfolgen. Die Aminosäure-Sequenz ist in Abb.2-8 aufgezeigt.
c) gesamtes VP1/VP2:
Das Plasmid pUC12PAN wurde mit Pstl und Hindill geöffnet und der VP2 kodierende Bereich aus
pUC12VP2 nach Hindill und partiellem Pstl-Verdau als 1,7kb Fragment inseriert (pUC12VP1/2).
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Expression VP1/2-ent haltender Antigene in E. coli:
1) PAV-1-B:
pUC12VP1/2 wurde mit EcoRI und BamHI geschnitten, eine 1466 bp große DNA-Bande isoliert und
dieses anschließend in die EcoRI/BamHI Stellen des Vektors pUC18stop eingesetzt. pUC18 stop gleicht
den oben erwähnten pUC- Vektoren; im Unterschied zu diesen enthält er jedoch zwischen der Pstl und
Hindill Stelle ein Synthetisches Oligodesoxynukleotid, das für Translations-Stop-Signale sowie für den
Stop der Transkription kodiert. Somit hat die Polylinker-Region des Vektor folgende Sequenz:
GGG GAT CCT CTA GAG
ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC
GCC TAA TGA GCG GGC
TCG ACC TGC AGT AAT TAA TTA GAT CTC GAG CCC
TTT TTT AAG CTT
(Die Restriktionsschnittstellen EcoRI - GAATTC, BamHI - GGATCC, Pstl - CTGCAG, Bglll - AGATCT und
Hindill - AACGTT sind durch Fettdruck markiert)
Der so erhaltene Vektor (pUC-V1-B) kodiert das VP-1 -Strukturprotein vom Start bis zur Aminosäure
486 gefolgt von einigen Aminosäuren des pUC-Polylinkers und wird terminiert durch die Stop-Codons des
inserierten Oligodesoxynukleotids. Das exprimierte Antigen (PAV-1-B) wird in sehr guter Ausbeute nach
IPTG-Induktion in den E.coli-Zellen produziert und besitzt eine Größe von 60 kDa. Seine AminosäurenAbfolge ist in Abb. 2-9 dargestellt, durch Fettdruck hervorgehobene Aminosäuren sind nicht B1 9-spezif isch
und werden durch pUC-Sequenzen kodiert. Die Reaktivität mit anit-B19-positiven Seren ist sehr gut und
eine effiziente Aufreinigung läßt sich durch Entfernen löslicher E.coli-Proteine, Lösen in 8M Harnstoff und
konventioneller lonen-Austauscher-Chromatographie (wie beschrieben) erreichen.
2) PAV-1-N:
Der oben beschriebene Vektor pUCVP-1-B wurde mit EcoRI und Nsil verdaut. Die so entstehende
1137bp große Bande wurde in den Vektor pUC18stop in die EcoRI und Pstl Stellen inseriert (siehe oben).
Der entstehende Vektor pUCVP-1-N kodiert das Strukturprotein vom Start bis zur Aminosäure 377; das
Antigen (PAV-1-N) wird nach IPTG-Induktion in den E.coli-Zellen etwas schlechter produziert als das oben
beschriebene Antigen PAV-1-B. Seine Größe ist 45 kDa, die Reaktivität mit anti-B19 Seren gut. Die Aminosäurenabfolge ist in Abb. 2-10 angegeben, Aminosäuren mit Fettdruck werden vom pUC- Vektor kodiert
und sind nicht B19 spezifisch.
Die Aufreinigung des Antigens kann wie bei PAV-1-B erreicht werden.
3) Expression der unter c)1) und c)2) beschriebenen Antigene als GST-Fusionsproteine
Die beiden Vektoren pUCVP-1-B und pUCVP-1-N wurden mit EcoRI/Bglll verdaut und die entstehenden ca. 1480bp bzw. 1150bp großen Banden isoliert, wobei die vom pUC18stop mit eingeführten
Translations-Stop-Signale mit übernommen werden. (Die Bglll-Stelle ist in der oben angeführten pUC18stop-Polylinker-Sequenz angegeben, die Bcll-Stelle (TGATCA) unmittelbar vor dem Start der Translation wurde mit den für die DNA-Amplifikation verwendeten Primern eingeführt -siehe Abb. 1, 0-1). Die beiden Fragmente, die dieselben 5'-Sequenzen, jedoch unterschiedlich lange Bereiche von VP-1 kodieren,
wurden nun in den oben beschriebenen Vektor pGEX-1 eingesetzt. Da pGEX-1 für die Insertion des 3'Endes eines Fragments nurdie Restriktions-Schnitt-Stellen Smal und EcoRI zur Verfügung hat, mußte zuerst noch eine für Smal (blunt end) kompatible Stelle geschaffen werden. Dies erfolgte durch Insertion der
beiden DNA-Fragmente in die Restriktions-Stellen EcoRI und BamHI (kompatibel mit Bglll) des Vektors
plC20H (The pIC plasmid and phage vectors with versatile cloning Sites for recombinant selection by insertional inactivation, J.L. Marsh, M. Erfle and E.J. Wykes, Gene, 32 (1984) 481-485). Von den beiden
entstandenen Vektoren wurden nun die beiden Fragmente mit Bell und Hincll (blunt end - Schnitt) wiederum isoliert und in pGEX-1 in BamHI und Smal inseriert. Da Hincll auch in der B19-Sequenz schneidet,
wurden die beiden Fragmente durch einen partiellen Hincll-Verdau isoliert.
Die beiden pGEX-Vektoren exprimieren nun Fusionsproteine bestehend aus der Glutathion-STransferase gefolgt von den beiden unterschiedlich langen VP-1 Segmenten. Das aus pUCVP-1-B stammende und nun in pGEXVP-1-B sitzende Fragment ergibt ein Fusionsprotein mit ca. 87kDa; das kleinere,
nur bis Aminosäure 377 kodierende Fragment ein Fusionsprotein in der Größe von 72kDa.
Die Aminosäureabfolgen sind in Abb. 2-9 und 2-10 angegeben. Der einzige Unterschied ist, daß die fünf
N-terminalen Aminosäuren wegfallen und statt dessen durch die Glutathion-S-Transferase ersetzt sind.
4) Weitere Expression von VP1/VP2:
Aus dem Plasmid pUC12VP1/2 mit der gesamten VP1 und VP2 kodierenden Region wurde nach
EcoRI- und Hindi II- Verdau ein 2,4kb Fragment isoliert und in den eukaryotischen Expressionsvektor
7
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5
10
15
20
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35
40
pMDIII (Motz, M., Deby, G., Jilg, W., Wolf, H.: Expression of the Epstein-barr virus major membrane proteins in Chinese hamster ovary cells. Gene, 44 (1986) 353-359. (Erhältich bei ATCC)) nach EcoRI und
Hindill Verdau inseriert. Dieses Plasmid wurde anschließend wieder mit Sali linearisiertund noch ein 2,4kb
Sall-Fragment mit einem Dihydrofolat-Reduktase-Gen (DHFR) sowie Regulationssequenzen eingesetzt.
Das so erhaltene Plasmid pMDIIIVP1/2 wurde in DHFR-negative CHO-Zellen transf iziert. Nach Selektion
auf alpha-minus Medium (gibco) wurden entstehende Kolonien isoliert und nachdem Auswachsen mit steigenden Konzentrationen an Methotrexat (MTX) amplifiziert. Von diesen Zellkulturen können Partikel mit
VP1/VP2 aus dem Kulturüberstand gereinigt werden.
Weiterhin wurde das 2,4kb-Fragment aus pUC12VP1/2 nach EcoRI/Hindlll-Verdau in einen Vektor inseriert, der neben der Hindlll-Stelle noch eine BamHI-Stelle besitzt. Von diesem Zwischenkonstrukt wurde
dann der Parvovirus-Anteil als Bell und BamHI-Fragment isoliert und in die BamHI-Stelle eines
Bakulovirus-Expressionsvektors (verwendet werden können verschiedene Konstrukte) inseriert. (Die BcllStelle sitzt unmittelbar vor dem translationellen Start von VP1, sie ist durch die PCR-Primer kodiert, siehe
Abb. 1; der BamHI-Verdau muß partiell durchgeführt werden, da in der Parvovirus-Sequenz sich auch
noch eine solche Stelle befindet.). Nach co-Transfektion des entstandenen Plasmids mit Wildtyp-Bakulovirus-DNA in eine Insekten-Zellkultur-Linie werden Zellen isoliert, die keine sogenannten "inclusion
bodies" aufweisen. Aus solchen Zellen, bei denen das Bakulovirus Polyhedrin-Gen durch das VP1/2-Gen
ersetzt ist, läßt sich das intrazellulär gebildete VP1 in großer Menge aufreinigen.
5) Expression von VP-2:
Weiterhin wurde die Expression des kleineren B19-VP-2 mittels rekombinanter Bakuloviren erhalten.
Hierfür wurde das VP-2-kodierende Plasmid pUC12VP (siehe Beispiel 1) mit EcoRI und Hindill verdaut
und das resultierende 1,7kb Fragment in einen oben erwähnten Vektor inseriert, der neben der HindlllStelle noch eine BamHI-Stelle besitzt. Von diesem Zwischenkonstrukt wurde dann der Parvovirus-Anteil
als Bell und BamHI-Fragment isoliert und in die BamHI-Stelle eines Bakulovirus-Expressionsvektors (verwendet werden können verschiedene Konstrukte) inseriert. (Die Bcll-Stelle sitzt unmittel bar vor dem translationellen Start von VP2, sie ist durch die PCR-Primer kodiert, siehe Abb. 1, 0-3; der BamHI-Verdau muß
partiell durchgeführt wreden, da in der Parvovirus-Sequenz sich auch noch eine solche Stelle befindet).
Nach co-Transfektion des entstandenen Plasmids mit Wildtyp-Bakulovirus-DNA in eine Insekten-Zellkultur-Linie werden Zellen isoliert, die keine sogenannten "inclusion bodies" aufweisen. Aus solchen Zellen,
bei denen das Bakulovirus Polyhedrin-Gen durch das VP2-Gen ersetzt ist, läßt sich das VP2 in großer
Menge als Partikel aufreinigen. Diese Partikel sind besonders für den Einsatz im n-capture-Test geeignet.
BEISPIEL 3
Synthetische Peptide mit immundominanten Epitopen
Aus den Reaktionsmustern der bakteriellen Expressionsprodukte (insbesonders pGEX::VP1Fusionskonstrukte) mit Parvovirus-positiven Seren im Western Blot läßt sich die überraschende Folgerung
ziehen, daß ein kurzes Fragment aus dem VP1 Anteil ausreichend ist, um alle IgG-positiven Parvoseren zu
identifizieren.
Das Fragment läßt sich mit folgenden synthetisch produzierbaren Peptiden abdecken:
PAPEP-1:
45
50
Ser Lys Lys
Ala Val Tyr
Ser
Gly
Lys
Trp
Trp
Glu
Ser
Asp
Asp
Lys
Phe
Ala
Lys
His
Tyr
Asn
Ile
Ser
Leu
Asp
Asn
Pro
Leu Glu
Asn
Pro
PAPEP-2:
Leu
Ser
Lys
Ser
Asp
55
8
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PAPEP-3:
5
10
Ile
Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr
Gin Ser His Gly Gin Leu Ser Asp His Pro His A l a
His
His
Phe
Leu
Ser
Ser
Glu
PAPEP-4:
Ser
15
Ser
Ser
His
Asp Leu His
Ala
Glu
Pro
Arg Gly
Gin
Val
Pro
Gly
Lys
Glu
Asn
Ala
Val
PAPEP-5:
20
Asn
Ala
25
Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gin Ala Gly Pro Pro Gin S e r
Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gin Leu
PAPEP-6:
Pro
30
Tyr Thr His Trp Thr
Lys Asn Glu Thr Gly1 Phe
Val
Ala
Asp
Glu
Glu
Leu
Leu Lys
Asn
Ile
PAPEP-7:
35
40
45
50
55
Asn
Ala
Ala
Ser
Ser
Glu
Lys
Tyr
Pro
Ser
Met
Thr
Ser
Val
Asn
Ser
Ala
Glu
Tyr
Thr
His
Trp
Thr
Val
Ala
Asp
Glu
Glu
Leu
Leu
Lys
His
PAPEP-8:
Asn
Pro
Ile
Lys
Diese Antigene können in großen Mengen synthetisch problemlos hergestellt, aufgereinigt und dann im
ELISA in Konzentrationen zwischen 100 - 200 ng pro Ansatz eingesetzt werden.
Auch wenn bereits mit einem der Peptide gute Ergebnisse ereicht werden können, ist die gemeinsame Verwendung von zwei oder drei Peptiden bevorzugt.
Für den Nachweis von IgG- oder IgM-Antikörpern können zum Teil unterschiedliche Peptide oder Kombinationen davon Verwendung finden.
BEISPIEL 4
a) Bestimmung von Serumantikörpern gegen das Parvovirus B19
Mit den in Beispiel 2 beschriebenen und gereinigten Antigenen wurde eine größere Menge an Seren auf
ihre Reaktivität mit diesen Antigenen getestet. Dabei wurden die verschiedenen rekombinanten Proteine in ei9
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5
10
ner Konzentration von 0,5 - 1 ng/ml in Carbonatpuffer, pH 9,5, in die Näpfe kommerziell erhältlicher ELISAPlatten für 16h zum Anbinden gegeben. Nach dem Abwaschen von nicht-gebundenem Material können diese
Platten dann im getrockneten Zustand bei 4°C gelagert werden.
Die Inkubation mit den Seren für 2h erfolgte in einer Verdünnung von 1:100, die anschließenden Waschprozeduren und der Nachweis gebundener Antikörper mit einem Peroxidase-gekoppelten anti-human-IgG Antikörper erfolgte nach üblichen Testprozeduren.
Getestet wurden verschiedene Serumpanels auf anti-B19-lgG:
1. Seren eines Patienten mit akuter B19-lnfektion wurden konsekutiv ab Auftreten des Erythema infektiosum
bis 19 Wochen nach der Erkrankung untersucht.
Ergebnis:
15
20
Sowohl mit dem Fusionsprotein aus pGEX1 PAN (PCE, siehe Beispiel 2) und mit einem durch BrCN abgespaltenen VP-1 Bereich (PAN-1, siehe Beispiel 2) und auch mit einem durch Thrombin abgespaltenen VP1Anteil (PAN-4) als Antigene wurden alle Seren bereits ab Beginn der klinischen Manifestation als anti-B19-lgG
positiv erkannt und blieben über den Beobachtungszeitraum (19 Wochen) positiv.
2. Auf anti-B19-lgG wurden Serumpaare von Schwangeren (n=21) getestet, denen bei Hospitalisierung und
vier Wochen später eine Serumprobe entnommen wurde. Es wurden für jedes Antigen dieselben Testseren
verwendet.
Ergebnis:
25
30
35
40
45
so
PCE:
Von den 21 Schwangeren waren 15 zum Zeitpunkt der Hospitalisierung anti-B19 negativ, 6 Frauen antiB19-lgG positiv. Das serologische Ergebnis der Zweitserumprobe vier Wochen später ergab ein identisches
Ergebnis.
PAN-2:
Von den 21 Schwangeren waren 14 zum Zeitpunkt der Hospitalisierung anti-B19-lgG negativ, 7 Frauen
anti-B19 positiv. Bei der Retestung von Serumproben, die vier Wochen später diesen Frauen abgenommen
wurden, ließen sich bei einer Frau, die zuvor anti-B19-lgG positiv war, kein IgG mehr nachweisen.
PAN-4:
Von den 21 Schwangeren waren 15 zum Zeitpunkt der Hospitalisierung anti-B19 negativ, 6 Frauen antiB19-lgG positiv. Das serologische Ergebnis der Zweitserumprobe vier Wochen später ergab ein identisches
Ergebnis.
b) Austestung einer definiert B19 IgG/M-positiv/negativen Serum-Sammlung (n=13)
Die verwendeten Seren stammten von klinisch definierten Fällen und waren zuvor in einem IgG/M-Test
überprüft worden, der gereinigtes Virus als Antigen verwendet. Seren 1-6: anti-B19 negativ, 7-9: IgM/lgG-positiv, 10-13; IgM-negativ, IgG-positiv.
Getestet wurden PAN-4 nach der oben beschriebenen Prozedur. Die Bestimmung der IgM-Antikörper erfolgte nach demselben Testprinzip wie bei der IgG-Bestimmung, jedoch wurden als Antigene PANSE und PAV1-B in einer 1:1 Mischung mit einer 10-fach höheren Konzentration an die Platten gebunden, weiterhin erfolgte
eine Elimination der Serum IgG-Antikörper durch Prä-Adsorption mit Protein A-gekoppelten Kugeln.
Folgende Absorptionswerte wurden erhalten:
IgG-Bestimmung mit PAN-4 (ca. 20ng pro Testnapf), IgM mit einer 1:1 Mischung aus PANSE und PAV-1B (ca. 150ng pro Testnapf Gesamtprotein)
55
10
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Serum
10
IgG
IgM
1
0,09
0,07
2
0,05
0,06
3
0,10
0,08
4
0,07
0,06
5
0,07
0,08
6
0,04
0,07
15
20
25
30
35
40
45
50
7
1,82
1,53
8
0,90
0,46
9
0,72
0,56
10
1,10
0,08
11
0,62
0,14
12
0,98
0,11
13
0,87
0,09
Die Ergebnisse zeigen eine klare Diskrimination der positiven/negativen Seren sowohl für den IgG- als
auch für den IgM-Test.
Die verwendeten IgM-positiven Seren stammten von klinisch definierten Fällen und waren zuvor in einem
IgM-Test überprüft worden, der gereinigtes Virus als Antigen verwendet. Ein Testansatz mit rekombinanten
Antigenen aus dem VP1 und VP2 Bereich erkannte auch alle IgM-positiven Seren. Es zeigte sich, daß die VP2Anteile "PAPST, VP2aber besonders PANSE" hier besser reaktiv als im IgG-Testsind. In einem kommerziellen
Testkit für IgM werden deshalb beide Bereiche vertreten sein.
Eine weitere Verbesserung der Sensitivität läßt sich durch selektives Anbinden der Serum-IgM-Antikörper
die
feste Phase mittels monoklonaler Antikörper, Zugabe von rekombinantem Antigen (Baculovirusan
exprimiertes, partikuläres VP-2) sowie der Bestimmung der Anbindung erzielen (n-capture assay).
Diese Versuche belegen die hohe Zuverlässigkeit des unter Verwendung der erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Polypeptide durchgeführten Testes.
DerVP2-Bereich, enthalten indem PANSE, PAPST und VP-2" benannten Antigenen bringt für die Bestimmung von Antikörpern aus Patienten mit lang abgelaufener Infektion keine zusätzliche Steigerung der Sensitivität. Eine gute Reaktion mit diesen Antigenen dagegen ist bei Seren mit erst kurz zurückliegender Infektion
zu finden. Deshalb ist dieses Antigen geeignet, eine Aussage über den Zeitpunkt der Infektion zu machen.
In einem Testkit kann eines oder eine Mischung dieser Antigene entweder zu den gentechnologisch erzeugten VP1-Anteilen bzw. zum synthetischen Peptid zugemischt werden, oder aber in getrennten Ansätzen
verwendet werden, wo die Diskriminierug der Reaktivität gegen diese beiden Bereiche eine zusätzliche Aussage über den Infektionszeitpunkt erlaubt.
Eine weitere Verbesserung der Sensitivität läßt sich durch ein selektives Anbinden der Serum-IgM-Antikörperan die feste Phase mittels monoklonaler Antikörper, Zugabe von rekombinantem Antigen sowie der Bestimmung der Anbindung erzielen (n-capture assay).
Beispiel 5
55
Verwendung B19-spezifischer DNA-Primer für den direkten Erregernachweis
Eventuell vorhandene B19-DNA wurden aus den Untersuchungsproben (Serum, Biopsien) durch Proteinase K-Verdau in Gegenwart von 1% SDS (2h, 37°C), Phenol-Extraktion und Fällung in 70% Ethanol gewonnen. Diese und auch die dann folgende DNA-Amplifizierung wurde analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen
Prozedur durchgeführt. Verwendet wurden Primer 0-5 und 0-2 (Sequenz und Lage auf dem B19-Genom siehe
11
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5
10
Abb. 1); bei B19-positiven Proben besitzt das amplifizierte Fragment eine Größe von 319bp. Der Nachweis
der B19-Spezifität des DNA-Fragments erfolgte nach Auftrennung der PCR-Ansätze durch ein 1,5%iges
Agarose-Gel, Transfer der DNA auf eine Nitrozellulose-Membran (Southern Blot) und Hybridisierung miteinem
dazwischen-liegenden DNA-Stück, das entweder radioaktiv mit 32P oder Digoxygenin mittels konventioneller
Methoden (primer extension) markiert worden war. Das zur Hybridisierung verwendete DNA-Fragment wurde
auf folgende Art gewonnen: Aus dem Plasmid pUC12PAN wurde nach Verdau mit Hincll und Pstl ein 260bp
langes DNA-Fragment isoliert und in pUC12 in die Hincll und Pstl Stellen inseriert. Aus dem resultierenden
Plasmid (pUC12PCRDIA) kann nun das B19-Fragment ohne die zur Amplif izierung verwendeten Sequenzen
durch EcoRI/Pstl-Verdau gewonnen werden und nach Markierung als Hybridisierungsprobe eingesetzt werden.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
15
20
25
30
35
40
45
50
Abb. 1: Schematische Darstellung des VP1/2 kodierenden Bereichs von Parvovirus B19 mit den für die
Amplif izierung verwendeten Primer-Sequenzen
Im oberen Teil ist der Aufbau des einzelsträngigen B19-Genoms mit den inversen Regionen an den Enden
(Doppelstrang) sowie mit kodierenden Bereichen schematisch dargestellt. Im linken Bereich ist die kodierende
Region für die Nicht-Strukturproteine (NS), die als Polypeptid synthetisiert und dann prozessiert werden. Der
rechte Bereich kodiert für die Oberflächenproteine des viralen Kapsids (VP1/2), wobei VP1 bis auf einen zusätzlichen N-terminalen Bereich (schraffierter Balken) identisch mit VP2 (schwarzer Balken) ist. Darunter sind
die Regionen der Oligodesoxynukleotide 0-1 bis 0-4 angegeben, die als Primer für die Amplif izierung (PCR)
der dazwischen liegenden B19-Sequenzen verwendet wurden (0-1 und 0-2 für den VP1-Bereich, bzw 0-3
und 0-4 für VP-2).
Im unteren Teil der Abbildung sind die DNA-Sequenzen der entsprechenden B19-Bereiche sowie der
Oligodesoxynukleotide angegeben. Die Oligodesoxynukleotid-Sequenzenzen sind durch Fettdruck kenntlich
gemacht, nicht-homologe Bereiche, d.h. Sequenzen, die nicht mit B19 hybridisieren, sind durch einen Zeilenabstand abgesetzt. Bei 0-1 stellen diese nichthybridisierenden Sequenzen Restriktionsenzym-Stellen für
EcoRI (GAATTC) und Bell (TGATCA) dar, bei 0-3 für EcoRI, Bell und BspHII (TC-ATGA), bei 0-4 für Hindill
(AAGCT-T). Das amplifizierte VP2 kodierende Fragment (0-3 und 0-4) wurde vordem Einsetzen in pUC- Vektoren mit EcoRI und Hindill verdaut, das VP1 kodierende Fragment mit EcoRI und Pstl, wobei die PstlSchnittstelle in der B19-DNA liegt (ab Position-Nr. 4 der angegebenen Sequenz für 0-2, CTGCAG).
Abb. 2 Aminosäure-Sequenzen der in Beispiel 2 beschriebenen Antigene, die rekombinant in E.coli-Zellen
produziert werden.
Bedingt durch Klonierungsschritte sind an den N-Termini sowie an den C-Termini (bis auf PANSE UND
VP-2) jeweils einige nicht-B19-authentische Fremdaminosäuren mit enthalten, die durch Fettdruck hervorgehoben sind.
Beschrieben werden die Aminosäuresequenzen der in Beispiel 2 beschriebenen Antigene:
Abb. 2-1:
2-1
PAN-1
Abb. 2-2:
2-2
PCE
Abb. 2-3:
2-3
PAN-2
Abb. 2-4:
2-4
PAN-3
Abb. 2-5:
2-5
PAN-4
Abb. 2-6:
2-6
VP2
Abb. 2-7:
2-7
PANSE
Abb. 2-8:
2-8
PAPST
Abb. 2-9:
2-9
PAV-1 B
Abb. 2-10:
PAV-1 N
Abb. 3:
Schematische Darstellung der Anordnung einiger Peptide zueinander
55
12
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O-l 0-5
0-2
10
0-3
ö-i
15
0-1:
55*GTG
',
20
25
30
5
3
ATG AGT AAA AAA AGT GGC AAA TGG3 '
(
AAA GCT TTG TAG ATT ATG AGT AAA AAA AGT GGC AAA TGG TGG3 '
(
TTT CGA AAC ATC TAA TAC TCA TTT TTT TCA CCG TTT ACC ACC5'
0-2 :
'
^ A T T CTG CAG AAG CCA GCA CTG GTG CAG GAG GGG GGG GCA3
'
3 TAA GAC GTC TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC
CCC CCC CGT5
3 C TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC CCC5'
0-3:
5*G
35
AAT TCT GAT CAT
AGG AAT TCT CTG ATC
ATG ACT TCA GTT AAT TCT GCA GAA GCC3 '
M
GAA AAA TAC CCA AGC ATG ACT TCA GTT AAT TCT GCA GAA GCC2'
'
3 T CTT TTT ATG G-T TCG rAC TGA AGT CAA TTA
AGA C(_T c r r CGG5
0-4 :
40
**TTG TAA ACA CTC CCC ACC GTG CCC TCA GCC AGG ATG CGT A3 '
'
3 AAC ATT TGT GAG GGG TCC CAC GGG
AGT CGG TCC TAC GCA T5
3,GAG GGG TGG CAC GGG AGT CGG TCC T
TC GAA GAG5'
45
0-5
50
55
S*G CTA CAA GCT GGG CCC CCG CAA AG3'
* GAG CTA CAA GCT GGG CCC CCG CAA
AGT GCT GTT GAC AGT GCT3 '
3 , CAC GAT GTT CGA CCC GGG GGC GTT TCA CGA CAA
CTG TCA CGA5'
AAB.
13
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Abb.
z
ADD. 2-1
PAN-l:
Met Ser Lys Lys Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Pbe Ala Lys AJa VaJ Tyr Glu Gin Phe Val Glu
Phe Tyr Glu Lys Val Thr Gry Th/ Asp Leu Glu Leu He Gin Uc Lea Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp
Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu VaJ AJa A/g De Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp
Leu Tyr Ser His His Pbe Gin Ser His Gly Gin Leu Ser Asp His Pro His AJa Leu Ser Ser Ser Ser Ser His Ala
Glu Pro A/g Gly Glu Asn AJa VaJ Leu Ser Ser Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gin VaJ Ser VaJ Gin Leu Pro
Gry Th/ Asn Tyr VaJ Gry Pro Gry Asn Glu Leu Gin AJa Gry Pro Pro Gin Ser Ala VaJ Asp Ser AJa AJa A/g
Ile His Asp Phe A/g Tyr Ser Gin Leu Ala Lys Leu Gry Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr VaJ AJa Asp Glu
Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thx Gly Phe Gin AJa Gin VaJ VaJ Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly
AJa AJa AJa Pro VaJ Ala His Phe Gin Glv Ser Leu Pro Glu VaJ Pro AJa Tyr Asn Ala Ser Glu Lys Tyr Pro
Ser
ADO, i-Z
Gluthafjon-S-Transierase -His Met Ser Lys Lys Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ab Lys Ala
VaJ Tyr Gin Gin Phe VaJ Glu Phe Tyr Glu Lys VaJ Thr Gry Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gin de Leu Lys
Asp
His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala A/g Ile Lys Asn
Aso Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser His Gry Gin Leu Scr Asp His Pro His AJa
Leu Ser Ser Ser Ser Ser His AJa Glu Pro A/g Gly Glu Asn AJa VaJ Leu Ser Ser Glu Asp Leu His Lys Pro
Gly Gin Val Ser Val Gin Leu Pro Gry Th/ Asn Tyr VaJ Gry Pro Gry Asn Glu Leu Gin Ala Gry Pro Pro Gin
Ser AJa Val Asp Ser Ala AJa A/g Ile His Asp Phe A/g Tyr Ser Gin Leu Ala Lys Leu Gry Ile Asa Pro Tyr
rhr His Trp Thr VaJ AJa Asp Glu Glu Leu Leu Lys Asn He Lys Asn Glu Th/ Gry Pbe Gin AJa Gla Val Val
Lys Asp Tyr Phe Th/ Leu Lys Gly Ala Gly Glu Phe II« Val Thr Asp
UM. l ' i
Gly Ser Arg Arg Pro Asp His Mel Ser Lys Lys Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala Lys AJa
Val Tyr Gin Gin Phe VaJ Glu Phe Tyr Glu Lys VaJ Thr Gly Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gin Ile Leu Lys Asp
His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val AJa A/g Ile Lys Asn
Kso Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser His Gry Gin Leu Ser Asp His Pro His AJa
m Ser Ser Ser Ser Ser His AJa Glu Pro A/g Gry Glu Asn Ala VaJ Leu Ser Ser Glu Asp Leu His Lys Pro
jty Gin Val Ser Val Gin Leu Pro Gry Thr Asn Tyr VaJ Gry Pro Gry Asn Glu Leu Gin AJa Gry Pro Pro Gin
ler Ala Val Gly Asp Pro Arg Glu Phe Ile Val Thr Asp
4
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Abb. 2 - 4
PAN-3
Gly Ile Leu Ser An Arg Pro Asp HU Me( Ser Lys Lys Ser Gry Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Pbe Ala
Lys AJa VaJ Tyr Gin Gin Phe VaJ Glu Phe Tyr Glu Lys VaJ Thr Gry Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gin Ile Leu
Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu VaJ Ala Arg Ile
Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser His Gry Gin Leu Ser Asp His Pro
His AJa Leu Ser Ser Ser Ser Ser His AJa Glu Pro A/g Gly Glu Asn AJa VaJ Leu Ser Ser Glu Asp Leu His
Lys Pro Gly Gin VaJ Ser Val Gin Leu Pro Gly Thr Asn Tyr Val Gry Pro Gry Asn Glu Leu Gin AJa Gry Pro
Pro Gin Ser AJa Val Gly Asp Pro Leu Glu Asp Pro An Val Pro Ser Ser Asn Ser
Am. 2-5
PAN-1
Gly Ser An An Pro Asp His Met Ser Lys Lys Ser Gry Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala Lys Ala
VaJ Tyr Gin Gin Phe VaJ Glu Phe Tyr Glu Lys VaJ Thr Gry Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gin He Leu Lys Asp
His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala A/g He Lys Asn
Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser Hb Gry Gin Leu Ser Asp His Pro His Ala
Leu Ser Ser Ser Ser Ser His AJa Glu Pro A/g Gry Glu Asn Ala Val Leu Ser Ser Glu Asp Leu His Lys Pro
Gly Gin VaJ Ser VaJ Gin Leu Pro Gry Th/ Asn Tyr Val Gry Pro Gry Asn Glu Leu Gin Ala Gry Pro Pro Gin
Ser AJa VaJ Asp Ser Ala AJa A/g Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gin Leu Ala Lys Leu Gry Ile Asn Pro Tyr
Thx His Trp Thr VaJ Ala Asp Glu Glu Leu Leu Lys Asn He Lys Asn Glu Thr Gry Phe Gin Ala Gin VaJ VaJ
Lys Asp Tyr Pbe Thr Leu Lys Gry Ala AJa Ala Pro VaJ Ala His Phe Gin Gry Ser Leu Pro Glu Val Pro AJa
Tyr Asn Ala Ser Glu Lys Tyr Pro Ser Met Thr Ser VaJ Asn Ser AJa Gry An An Ile Pro Gly Asn Ser Ser
Abb. 24
VT2:
Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Leu Ile Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu AJa Ser Thr Gry AJa Gry Gly Gly
Gly Ser Asn Ser Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gry AJa Thr Phe Ser AJa Asn Ser Val Thr Cys Thr Pbe Ser
Arg Gin Pbe Leu He Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys VaJ Pbe Ser Pro AJa AJa Ser Ser Cys His Asn
AJa Ser Gry Lys Glu Ala Lys VaJ Cys Thr Ile Ser Pro Ile Met Gry Tyr Ser Th/ Pro Trp A/g Tyr Leu Asp Phe
Asn AJa Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gin His Leu Ile Glu Asn Tyr Gry Ser Ile Ala Pro Asp
AJa Leu Thr VaJ Thr Ile Ser Glu Ile AJa VaJ Lys Asp VaJ Th/ Asp Lys Thr Gry Gry Gry VaJ Gin VaJ Thr
Asp Ser Thr Thr Gry A/g Leu Cys Met Leu VaJ Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gin Gly Gin
Asp Thr Leu AJa Pro Glu Leu Pro Ile Trp VaJ Tyr Pbe Pro Pro Gin Tyr Ala Tyr Leu Th/ VaJ Gry Asp Val
Asn Th/ Gin Gry Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr VaJ Leu Glu His Ser
Ser Pbe Gin Leu Leu Gly Thr Gry Gly Thr AJa Ser Met Ser Tyr Lys Pbe Pro Pro VaJ Pro Pro Glu Asn Leu
Glu Gry Cys Ser Gin His Pbe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu Tyr Gry Ser A/g Leu Gry Val Pro Asp Thr Leu
Gly Gly Asp Pro Lys Phe A/g Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gin Pro Gin Asn Pbe Met Pro Gly Pro
Leu VaJ Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu Gry Asp Ser Ser Asn Thr Gry Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gry Leu Ser
Thr Gry Th/ Scr Gin Asn Thr A/g Ile Ser Leu A/g Pro Gry Pro Val Ser Gin Pro Tyr His His Trp Asp Th/
Asp Lys Tyr VaJ Thr Gry Ile Asn AJa De Ser His Gry Gin Thr Thr Tyr Gry Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr
Gin Gin Gry VaJ Gry A/g Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gin Leu Lys Gin Leu Gin Gry Leu Asn Met His Thr
Tyr Phe Pro Asn Lys Gry Thr Gin Gin Tyr TV Asp Gin Ile Ghi An Pro Leu Met Val Gry Ser VaJ Trp Asn
A/g A/g AJa Leu Hb Tyr Glu Ser Gin Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gin Phe
AJa AJa Leu Gry Gry Trp Gry Leu Hb Gin Pro Pro Pro Gin Ile Phe Leu Lys Gin Tyr Ala VaJ Gry De Met
IV VaJ Thr Met Thr Phe Lys Leu Gry Pro A/g Lys Ala Thr Gry An Trp Asn Pro Gin Pro Gry Val Tyr Pro
Pro Hb AJa AJa Gry Hb Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr Ala Thr Asp AJa Lys Gin Hb Hb A/g His
3ly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser An VaJ Hb Pro Leu
15
EP 0 514 413 B1
Abb. 2-7
PANSE:
Mel Thr Mel Ile Thr Pro Ser Leu HJi AJa Cys Met Leu VaJ Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr ViJ Leu Gly
Gla Gly Glu Asp Thr Leu AJa Pro Glu Leu Pro Ile Trp VaJ Tyr Phe Pro Pro Gin Tyr AJa Tyr Leu Thr VaJ
Gry Asp VaJ Asn Thr Gin Gly He Ser Gry Asp Ser Lys Lys Leu AJa Ser Glu Glu Ser AJa Phe Tyr VaJ Leu
Glu His Ser Ser Phe Gin Leu Leu Gry Thr Gry Gly Thr AJa Ser Mel Ser Tyr Lys Phe Pro Pro VaJ Pro Pro
Glu Asn Leu Glu Gry Cys Ser Gin His Pbe Tyr Glu Mel Tyr Asn Pro Leu Tyr Gry Ser A/g Leu Gry VaJ Pro
Asp Thr Leu Gly Gry Asp Pro Lys Pbe A/g Ser Leu Thr His Glu Asp His AJa Ile Gla Pro Gin Asn Pbe Met
Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser VaJ Ser Thr Lys Glu Gry Asp Ser Ser Asn Th/ Gry AJa Gry Lys Ala Leu Thr
Gly Leu Ser Th/ Gry Thr Ser Gin Asn Thr A/g Ile Ser Leu A/g Pro Gry Pro VaJ Ser Gin Pro Tyr His His
Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Th/ Gly Ile Asn Ala Ile Ser His Gry Gin Thr Thr Tyr Gry Asn AJa Glu Asp
Lys Glu Tyr Gin Gin Gry VaJ Gly Arg Pbe Pro Asn Glu Lys Glu Gin Leu Lys Gin Leu Gin Gly Leu Asn
Met His Thr Tyr Pbe Pro Asn Lys Gly Thr Gin Gin Tyr Thr Asp Gin Ile Glu Arg Pro Leu Met VaJ Glv Ser
VaJ Trp Asn A/g A/g AJa Leu His Tyr Glu Ser Gin Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys
Th/ Gin Pbe AJa AJa Leu Gly Gly Trp Gry Leu His Gin Pro Pro Pro Gin Ile Phe Leu Lys Gin TyT Ala VaJ
Gly Ile Met Thr VaJ Thr Met Thr Pbe Lys Leu Gry Pro Arg Lys AJa Thr Gry A/g Trp Asn Pro Gin Pro Glv
VaJ Tyr Pro Pro His Ala AJa Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr AJa Thr Asp Ala Lys Gin His
His A/g His Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu Trp Th/ AJa Lys Ser A/g VaJ His Pro Leu
Abb. 24
PAPST:
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser U\i Ala Ala Glu Ala Ser Tb/ Gry Ala Gry Gry Gry Gry Ser Asn Ser VaJ Lys
Ser Met Trp Ser Glu Gry AJa Thr Pbe Ser Ah Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser A/g Gin Phe Leu Ile Pro
Tyr Asp Pro Glu Hb Hb Tyr Lys Val Pbe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys Hb Asn Ala Ser Gry Lys Glu Ala
Lys VaJ Cys Th/ He Ser Pro Ile Met Gry Tyr Ser Thx Pro Trp A/g Tyr Leu Asp Phe Asn AJa Leu Asn Leu
Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gin Hb Leu He Glu Asn Tyr Gry Ser De Ala Pro Asp AJa Leu Thr Val Thr
Ile Ser Glu Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gry Gry Gry VaJ Gla VaJ Th/ Asp Ser Thr Thr Gry
A/g Leu Cys Met Leu VaJ Asp Hb Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr VaJ Leu Gry Gla Gry Gin Asp Th/ Leu Ala Pro
Glu Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gin Tyr Ala Tyr Leu Thr VaJ Gly Asp VaJ Asn Thr Gin Gry Ile
Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu Ser AJa Phe TyT VaJ Leu Glu Hb Ser Ser Phe Gin Leu Leu
Gly Tb/ Gly Gly Thr AJa Ser Met Ser Tyr Lys Pbe Pro Pro VaJ Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Arg Ser
Thr Asp Pro Arg Glu Pb« Thr Gly Arg Arg Phe Thr Thr Ser
16
EP 0 514 413 B1
Am, 2*9
Met Thr Ile Thr Asn Ser Asp HU Met Ser Lys Lys Ser Gry Lys Trp Trp Ghi Ser Asp Asp Lys Pbe Ali Lys
Ala Val Tyr Gin Gin Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys VaJ Thx Gly Thx Asp Leu Glu Leu Ile Gin He Leu Lys
Asp His Tyr Asn De Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala Arg Ile Lys
Asn Asn Leu Lys Asn Sex Pro Asp Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser Hb Gly Gin Leu Ser Asp His Pro His
AJa Leu Ser Ser Ser Sex Sex Hb AJa Gin Pro Arg Gry Glu Asn Ala Val Leu Ser Sex Glu Asp Leu Hb Lys
Pro Gry Gin Val Ser Val Gin Leu Pro Gly Thr Asn Tyr Val Gry Pro Gly Asn Glu Leu Gb Ala Gly Pro Pro
Gin Ser Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Sex Gin Leu Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro
Tyr Thx Hb Trp Thr VaJ Ala Asp Glu Glu Leu Leu Lys Asn De Lys Asn Glu Thr Gry Phe Gin Ala Gin Val
Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala AJa AJa Pro Val Ala Hb Phe Gin Gry Ser Leu Pro Glu VaJ Pro
Ala Tyr Asn AJa Ser Glu Lys Tyr Pro Sex Met Thx Ser VaJ Asn Ser AJa Glu Ala Ser Thx Gry AJa Gly Gly
Gly Gly Ser Asn Ser VaJ Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thx Phe Ser Ala Asn Ser Val Thx Cys Thx Phe
Ser Arg Gin Phe Leu De Pro Tyr Asp Pro Glu Hb Hb Tyr Lys Val Pbe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys Hb
Asn AJa Ser Gly Lys Glu AJa Lys VaJ Cys Thr Ile Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thx Pro Trp Arg Tyr Leu Asp
Phe Asn Ala Leu Asn Leu Phe Pbe Ser Pro Leu Glu Phe Gin His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly Sex Ile Ala Pro
Asp AJa Leu Thr Val Thx De Ser Glu Ue Ala VaJ Lys Asp VaJ Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gin Val
Thr Asp Ser Thx Thx Gry Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gin Gly
Gin Asp Thx Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile Trp VaJ Tyr Phe Pro Pro Gb Tyr Ala Tyr Leu Thx Val Gly Asp
Val Asn Thr Gin Gly Ile Sex Gry Asp Sex Lys Lys Leu AJa Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu HU
Ser Ser Phe Gb Leu Leu Gry Thx Gly Gly Thx Ala Ser Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu Asn
Leu Glu Gly Cys Ser Gb Hb Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu Tyr Gry Ser Ser Arg Val Asp Leu Gb
Abbild
PAV-l-N
Met Thr De Thr Asn Ser Asp His Met Ser Lys Lys Ser Gry Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Pbe Ala Lys
Ab VaJ Tyr Gb Gb Phe VaJ Glu Phe Tyr Gb Lys Val Thx Gly Thx Asp Leu Glu Leu De Gb ne Leu Lys
Asp Hb Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Ghi Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala Arg De Lys
Asn Asn Leu Lys .Ami Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His Hb Phe Gb Ser Hb Gry Gb Leu Ser Asp Hb Pro His
Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser His Ala Glu Pto Arg Gly Glu Asn AJa Val Leu Ser Ser Glu Asp Leu Hb Lys
Pro Gly Gin Val Ser Val Gb Leu Pro Gly Tax Asn Tyr VaJ Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gb Ala Gly Pro Pro
Gb Ser AJa VaJ Asp Ser Ala Ala Arg Ile Hb Asp Phe Axg Tyr Ser Gb Leu Ala Lys Leu Gry Ile Asn Pro
Tyr Thx Hb Txp Thx VaJ Ala Asp Glu Gb Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thx Gly Phe Gb AJa Gb VaJ
VaJ Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gry AJa Ala Ala Pro VaJ AJa Hb Phe Gb Gly Ser Leu Pro Glu VaJ Pro
AJa Tyr Asn AJa Ser Glu Lys Tyr Pro Sex Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu AJa Ser Thr Gry Ala Gly Gly
Gry Glv Ser Asn Ser Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thx Pbe Ser Ala Asn Ser VaJ Thx Cys Thx Phe
Ser Arg Gb Phe Leu Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His Hb Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala AJa Ser Ser Cys His
Kin AJa Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr ne Ser Pro Ik Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Axg Tyr Leu Asp
Phe Asn AJa Leu Asn Leu Phe Pbe Ser Pro Leu Glu Phe Gin Hb Leu Ile Glu Asn Tyr Gly Ser De AU Pro
\sp AJa Leu Thx Val Thr De Ser Glu Ile AJa VaJ Lys Asp Val Thr Asp Lys Thx Gly Gry Gly VaJ Gb VaJ
rhr Asp Ser Thx Thx GJy Arg Leu Cys Ser Asn
17
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VP-2
VP- l
PAN ]
PCE 1
PAN 2
PAN 3
PAN 4
VP-2
PANSE
PAPST
Ausschnitt
PAPEP2
PAPEP 1
PAPEP3
(vp]-VP2)
PAPEP5
PAPEP4
PAPEP6
PAPEP 8
Abb.
3
18
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Patentansprüche
1.
Immunologisch aktives Peptid oder Polypeptid, das einen Teil der Aminosäuresequenz der Kapsidproteine
VP1 oder VP2 des Parvovirus B1 9 aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von Verunreinigungen, die den Nachweis von Parvovirus B1 9 spezifischen Antikörpern stören können und das Polypeptid,
das eine Teilsequenz von 8 bis 50 Aminosäureresten, insbesondere 10 bis 32 Aminosäureresten des Peptids PAN1, wie in Abb. 2-1 dargestellt, ist, oder die Aminosäuresequenz
His
Trp
Thr
Val
Ala
Asp
Glu
Glu
Leu
Leu
Lys
His
Lys Lys Ser Gly
Ala Val Tyr u n d / o d e r
Lys
Trp
Trp
Glu
Ser
Asp Asp
Lys
Phe
Ala
Lys
Leu Lys Asp His
Ser Ser u n d / o d e r
Asn
Ile
Ser
Leu Asp Asn Pro
Leu
Glu
Asn
Pro
Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His
Gin Ser His Gly Gin Leu Ser Asp His Pro His Ala u n d / o d e r
His
Phe
Arg Gly Glu Asn Ala Val
Gin
Val u n d / o d e r
Asp Leu His Lys Pro Gly
Leu Ser
Ser
Glu
Pro
Pro
Gin
Ser
Tyr
Ser
Gin
Leu
Asn Pro
Ile
Tyr
Thr
Lys u n d / o d e r
Ser
Tyr
Ile
Ser
His
Ser
Asn Tyr
Ala Val
Val
Asp
Ala
Gly
Ser
Glu Pro
Pro
Ala
Gly Asn Glu
Ala Arg Ile
Leu Gin Ala Gly
His Asp Phe Arg
und/oder
Tyr Thr His Trp Thr Val Ala
Lys Asn Glu Thr Gly Phe u n d / o d e r
Asp Glu
Glu Leu
Leu Lys
Asn
ile
Ser
Met Thr
Ser
Val
Asn Ser
Ala
Glu
Pro
Asn Ala
Ala s e r
Ser
Glu
Lys
Tyr
Pro
aufweist und/oder die Aminosäuresequenz
19
EP 0 514 413 B1
His
Met
Ser
Ala
Ala
Lys
Val
Lys
Ser
Gly
Gin
Gin
Glu
Ser
Phe
Tyr
Asp
Leu
Asp Asp Lys Phe
Glu Lys Val T h r
His Tyr Asn I l e
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Asp
Pro
Leu Tyr
His Ala
Leu S e r
Asn
Ala
Val
Leu S e r
Val
Gin
Leu
Pro
Gly
Gly Asn Glu Leu Gin Ala
Ala Arg Ile His Asp Phe
Asn P r o Tyr Thr His Trp
Ile Lys Asn Glu Thr Gly
Thr Leu Lys Gly Ala Gly
Gly
Pro
Pro
Gin
Lys Trp Trp
Phe Val Glu
Tyr
Lys
Glu
Thr
Leu
Leu Ile Gin Ile Leu Lys
Gly
Asp
Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser
Ala Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro
His Phe Gin Ser His Gly Gin Leu Ser Asp His
Ser Ser Ser Ser His Ala Glu P r o Arg Gly Glu
Ser Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gin Val Ser
Thr Asn
Ser
Ala
Leu Ala
Tyr
Val
Val
Gly
Pro
Asp
Leu
Ser
Ala
Gly
Ile
Leu
Lys
Asn
Lys Asp
Thr Asp u n d / o d e r
Tyr
Phe
Gly Ser
Glu Ser
Phe Tyr
Asp His
Phe Ala
Glu
Glu
Val
Val
Lys
Leu
Arg
Arg
Pro
Asp
Glu
Asp
Lys
Lys
Val
Thr
Ile
Met
Lys
Thr
Ser
Ala
Lys
Val
Lys
Gly Lys
Gin Phe
Trp
Val
Trp
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Ile
Leu
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Ser
Ile
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Ser
Ser
Asp
Arg Gly
Gin V a l
Tyr
Leu Val
Ala
Pro
Leu
Ser
His
Leu
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Leu
Gin
Lys
Ser
His
Gin
Lys
Leu
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Ser
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Glu
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His
Arg
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Ser
Ser
Asp
Pro
His
Tyr
Ala
Glu Asn
Ala
Val
Leu
Ser
Ser
Glu
Asp
Leu
His
Ser
Gin
Leu
Pro
Gly
Thr Asn
Tyr
Val
Gly
Pro
Val
Glu Asn
Asp
Pro
Ile
Ile
Phe
Gly
Phe
Glu
Gin
Asn
Gin Ala
Arg Tyr Ser Gin
Thr Val Ala Asp
Phe Gin Ala Gin
Gly
Ser Leu
His
Val
His
Tyr
Glu
Leu
Leu
Asp
Asp Asn Pro Leu
Lys Asp
Ser Leu
His
Ser
Gin
Ser
Gly
Ala
Lys
Pro
Pro
Gly
Gly Asn
Glu
Leu
Gin
Ser
Ala
Val
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Asp Pro
Arg
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Phe
Pro
Asp His
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Met
Ser
Lys
Ser
Lys
Thr
Ala
Gly Lys
Gin Phe
Ile
Val Thr Asp u n d / o d e r
Ile
Leu
Ser
Arg Arg
Trp Trp
Val Glu
Glu
Ser
Phe
Tyr
Asp Asp Lys
Glu Lys Val
His Tyr Asn
Gly
Thr
Ile
Leu
Ile
Pro
Ser
Lys
Ser
Asp
Leu
Asn
Ser
Pro
Ser
Asp
His
Asp
Pro
Phe Asp Leu Val
Leu Tyr Ser His
His Ala Leu Ser
Arg Gly
Gin Val
Glu
Asn
Ala
val
Leu
Ser
Ser
Val
Gin
Leu
Pro
Gly
Gin
Lys
Val
Ile G i n
Gly
Asp Leu
Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn
Ala Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys
His Phe Gin Ser His Gly Gin Leu
Ser Ser Ser Ser His Ala Glu P r o
Ser Glu Asp Leu His Lys Pro Gly
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Glu Leu Gin Ala Gly Pro Pro
Ser Ala Val Gly
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Pro
Ser
Ser
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Tyr Gin
Glu Leu
Gly
Pro
Asp
Pro
Gly Asn
Leu Glu
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Glu Ser
Phe Tyr
Cys Asp
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Pro Asp His Met t>er hys
Asp Asp Lys Phe Ala Lys Ala Val
Glu Lys Val Thr Gly Thr Asp Leu
His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn
Phe Asp Leu Val Ala Arg Ile Lys
Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser
His Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser
Ala val Leu Ser ser Glu Asp Leu
Arg
Gin
Arg
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Tyr Ser Gin
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Leu
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His Ala Glu Pro Arg Gly
His Lys Pro Gly Gin v a l
Thr Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu
Ser Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His
Leu Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr
Glu Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu
Val Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly
His Phe Gin Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro
51n Ala Gly
isp Phe Arg
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la Gly Arg Arg Ile Pro Gly Asn Ser Ser u n d / o d e r
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Leu Ala Ser Glu Glu Ser Ala Phe
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Gly He
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Asp Asp
His Gin
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Phe Pro Pro Gin Tyr
Gly Ile Ser Gly Asp
Tyr Val Leu Glu His
Ser Met Ser
Gly Cys Ser Gin
Arg Leu Gly Val
Leu Thr His Glu
Ala
Leu Val Asn
Gly Ala Gly Lys
Thr Arg Ile Ser
Trp Asp Thr Asp
Gin Thr Thr Tyr
Gly Arg Phe Pro
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Leu Arg Pro Gly
Lys Tyr Val Thr
Gly Asn Ala Glu
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Ser
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Tyr Glu
Phe Ala A l a
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Tyr
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Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala
3er Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg
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ten Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr
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Mir Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu
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hr Gly Arg Arg Phe Thr Thr Ser u n d / o d e r
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Gly
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Lys Ala
Thr
Lys
Val
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Leu Asp Asn
Arg Ile Lys
Phe Gin Ser
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Glu Asp Leu
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Ala Lys Leu
Glu Leu Leu
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Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser
Asn Asn Leu Lys Asn ser Pro
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His Ala Glu Pro Arg Gly Glu
His Lys Pro Gly Gin val Ser
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Ser Ala Ala Arg Ile 1Bis Asp
Gly Ile Asn Pro Tyr 'rhr His
Lys Asn Ile Lys Asn <31u Thr
Lys
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Leu Ile
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Gin Ala Gin Val
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Tyr Asn
Ala
Asn Ala
Val Gin
Ala
Gly
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Val
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Ser
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Glu
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Lys Ala
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Asp Leu
Ser
Val Ala
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Glu Phe
Tyr
Lys
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Leu Glu
Asn
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Ser His
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Lys Asn
Leu S e r
Ser
Ser
Ser
Ser
Glu Asp
Asn Tyr
Asp His
Gly Glu
His
Asn
Ala
Val
Leu
Ser
Val
Ser
val
Gin
Leu
Pro
Leu Gin
Ala
Gly
Pro
Pro
Gly Thr
Gin Ser Ala
His
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Tyr Ser
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Glu
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Trp
Tyr
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Ala
Ser
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Ala
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Lys
Gly Ala
Gly Ala
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Leu
Ser
Cys
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Tyr
Lys
Pro
Leu
Ala
Lys
Ser
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Phe
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Thr
Lys
Leu
Leu Pro
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Lys
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Ser
Val
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Gly Gly
Thr Phe
Gly Gly
Ser Ala
Ser
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Val
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Gly
Phe
Tyr
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Ile
Pro
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Pro
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Ala
Ser
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Lys
Val
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Phe
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Gly
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Ala
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24
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Glu
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Ile
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Pro
Glu
Asn
Val
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Pro
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Gly Gin Asp
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Ser
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Ala
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Val
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Gly Ser
Val
Glu
Gly Gin
Ala Glu
Lys
Gin
Glu
Gin Ala
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Gin Val
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Leu
Ala
Ser
Ser
Asp Ser
Leu Gly
Leu Lys
Leu
Ala
Leu
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Gin
Gin
Gin
Tyr Ser
Ala Leu
Asp
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Tyr
Leu Glu
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Leu
Gly
Gin
Ser
Pro
Ser
Trp
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Asp
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Phe
Lys
Lys
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Lys
Phe
Leu Lys
Ser Ser
His
Ser
Tyr
Arg
Gin
Gly
Phe
Pro
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Val
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Tyr
Ala
Glu
Gly
Cys
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Ser
Arg
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EP 0 514 413 B1
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Trp Glu
Ile
Thr
Asn
Ser
Glu Phe
Tyr
Asp
Glu
Asp Lys
Lys Val
Leu Lys
Ser Ser
Asp
Leu
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Tyr Asn
Asp Leu Val Ala
Phe
Ser
Asp His
Phe Ala
Thr Gly
Ile Ser
Ser
Met Ser
Lys Ala
Thr Asp
Leu Asp Asn Pro
Trp Thr Val Ala Asp Glu
Glu Thr Gly Phe Gin Ala Gin Val
Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His
Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys
Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala
Lys ser Met Trp Ser Glu Gly Ala
Cys Thr Phe Ser Arg Gin Phe Leu
Glu
Asn P r o
Lys Asn Asn Leu Lys Asn
Ser His Gly Gin Leu S e r
Ser Ser His Ala Glu Pro A r g
Asp Leu His Lys Pro Gly Gin
Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu
Val Asp Ser Ala Ala Arg I l e
Lys Leu Gly Ile Asn Pro T y r
Leu
Val
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Ile
Lys Asn
Leu Lys
Glu V a l
Pro
Asp Tyr Phe Thr
Gly Ser Leu Pro
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Gly Gly
Thr Phe
Gly Gly Ser Asn Ser
Ser Ala Asn Ser Val
Lys
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Tyr
Ile
Tyr Lys val
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Phe
Ser
Pro
Ala Ala
Ser
Lys
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Cys
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Ile
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Pro
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Ala
Pro
Glu
Tyr Asp Pro
Cys His Asn Ala
Pro Ile Met Gly Tyr
Leu Asn Leu Phe Phe
Ser
Trp
Arg
Tyr
Leu Asp
Leu Glu
Ala Leu
Phe
Gin
His
Leu
Ile
Glu
Thr
Val
Thr
Ile
Ser
Glu
Asn Tyr
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Gly
Lys
Cys Ser Asn
Gly
Gly
Val
Gin Val
Thr Asp
Thr
Leu Glu
Arg Ile
Phe Gin
Pro Asp Leu Tyr Ser His His
His
Pro His Ala Leu Ser Ser Ser
Asp
Glu
Asn Ala Val Leu Ser Ser Glu
Gly
Val Ser Val Gin Leu Pro Gly Thr Asn
Leu Gin Ala Gly Pro Pro Gin Ser Ala
His Asp Phe Arg Tyr Ser Gin Leu Ala
Thr His
Lys Lys Ser Gly Lys T r p
Val Tyr Gin Gin Phe Val
Leu Glu Leu Ile Gin7 I l e
Gly Ser
Val Lys
Ser Thr
Ile
Ala
Asp Val
Thr Gly
Asn
Val
Thr
His
His
Ser
Ser
Gly
Thr
Ser
Pro
Pro
Asp
Thr Asp
Arg Leu
oder Teilsequenzen davon aufweist die zum Nachweis von Antikörpern gegen Parvovirus B19 in den
Untersuchungsflüssigkeitengeeignet sind.
2.
Immunologisch aktives Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fusionsprotein vorliegt, wobei dieses Fusionsprotein wenigstens einen Teil der ß-Galactosidase oder der
Glutathion-S-Transferase aufweist.
3.
Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen das humane Parvovirus B19, dadurch gekennzeichnet, daß
es wenigstens ein immunologisch aktives Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 1 aufweist, das mit den
in den Untersuchungsflüssigkeiten vorhandenen Antikörpern reagieren kann und, daß es wenigstens eine
Anzeigekomponente aufweist, die den Nachweis von Komplexen aus immunologisch aktivem Peptid und
Antikörper ermöglicht.
4.
Testkit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzeigekomponente ein gegen den nachzuweisenden Antikörper gerichteter Antikörper ist, dereine Markierung aufweist.
5.
Testkit nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung in einem radioaktiven Isotop besteht.
6.
Testkit nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung aus einem Enzym besteht, das
eine Farbreaktion katalysieren kann.
25
EP 0 514 413 B1
7.
Testkit nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, daß das immunologisch aktive Peptid oder Polypeptid
biotinyliert ist und die Anzeigekomponente Avidin oder Streptavidin mit daran kovalent gebundenem
Enyzm, insbesondere Peroxidase, ist.
8.
Testkit nach einem der Ansprüche 4 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, daß es ein ELISA-Kit ist.
9.
Testkit nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein immunologisch aktives Peptid
oder Polypeptid nach Anspruch 1 an Mikrotiterplatten gekoppelt ist und, daß die Anzeigekomponente aus
anti-human IgG- und/oder IgM-Antikörpern besteht, an die ein eine Farbreaktion katalysierendes Enzym
gekoppelt ist.
10. Testkit nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß monoklonale Antikörper gegen Human-IgM-Antikörper an Mikrotiterplatten gekoppelt sind und, daß die Anzeigebomponente ein biotinyliertes immunologisch aktives Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 1 ist, das mit Avidin oder streptavidin mit daran kovalent gebundenem Enzym zusammenwirkt.
11. Verfahren zur Reinigung von immunologisch aktiven Peptiden oder Polypeptiden nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Abtrennung unlöslicher Bestandteile, eine Auf trennung durch eine DEAE-Sephazall-Säule und eine weitere Reinigung mittels einer Anionenaustauscher-Säule im HPLC in 8M
Harnstoff umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch
Chromatographie umfaßt.
11, dadurch
gekennzeichnet,
daß
es
außerdem
eine
Affinitäts-
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitäts-Chromatographie mit einer
Glutathion-gekoppelten Gel-Matrix erfolgt.
14. Verwendung von wenigstens einer DNA-Sequenz ausgewählt unter
0-1:
AAA AGT GGC AAA TGG,
GTG AAT TCT GAT CAT ATG AGT AAA
0-2:
CCC
C TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC
0-3:
GTT AAT TCT GCA GAA GCC
G AGG AAT TCT CTG ATC ATG ACT TCA
0-4:
TTC GAA GAG
GAG GGG TGG CAC GGG AGT CGG TCC
0-5:
G CTA CAA GCT GGG CCC CCG CAA AG
zum direkten Erregernachweis mittels DNA-Amplif izierung, insbesondere mittels Polymerase-chainreaction.
15. Verwendung von immunologisch aktiven Peptiden nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Infektionen mit Parvovirus B19.
Claims
1.
Immunologically active peptide or Polypeptide which has a part of the amino-acid sequence of the capsid
26
EP 0 514 413 B1
proteins VP1 or VP2 of parvovirus B19, characterized in that it is free of impurities which may interfere
with the detection of parvovirus B1 9 specific antibodies, and the Polypeptide which is a partial sequence
of 8 to 50 amino-acid residues, particularly 10 to 32 amino-acid residues of the peptide PAN1 as depicted
in Fig. 2-1, or has the amino-acid sequence
His
Trp
Thr
val
Ala Asp
Glu
Glu
Leu
Leu
Lys
His
Ser Lys Lys Ser Gly
Ala Val Tyr a n d / o r
Lys
Trp
Trp
Glu
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Lys
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Ala
Lys
Ile
Ser
Leu Asp Asn Pro
Leu
Glu
Asn
Pro
Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His
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His
Phe
Ser
Asn Pro
Ile
Tyr Thr
Lys a n d / o r
Leu Lys
Ser Ser
Asp His
and/or
Tyr Asn
Ser
Ile
Ser
His
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Asn Tyr
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Val
Asp
Ala
Glu
Pro
Val
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Glu
Gly
Pro
Pro
Gin
Ser
Phe Arg
Tyr
Ser
Gin
Leu
Leu
Leu
Lys
Asn
Ile
Val
Asn
Ser
Ala
Glu
Arg Gly Glu Asn Ala
Lys Pro Gly Gin Val a n d / o r
Gly
Ser
Pro Gly Asn Glu
Ala Ala Arg Ile
Leu
Gin Ala
His
Asp
and/or
Tyr Thr His Trp Thr Val Ala
Lys Asn Glu Thr Gly Phe a n d / o r
Asp Glu
Pro
Asn Ala
Ala S e r
Ser
Glu
Lys
Tyr
Pro
Ser
and/or the amino-acid sequence
27
Met Thr
Glu
Ser
:P 0 514 413 B1
His Met
Ser
Ala Lys
Gly Thr
Ala
Ser
Ala
His
Ser
Ser
Thr
Ser
His
Glu
Tyr Gin
Glu Leu
Asp
Leu
Leu
Leu
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Asp
Leu
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Glu Lys Val T h r
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Phe
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Phe Gin Ala Gin
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Leu Phe Asp Leu val Ala Arg Ile Lys Asn Asn Leu
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Pro His Ala Leu Ser Ser S e r Ser Ser His Ala Glu
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Trp Trp Glu ser
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Phe
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Pro
Ser
Glu
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Lys
Ser
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Ile Gin Ile Leu Lys
Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser
Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro
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Ser Ser Ser His Ala Glu Pro Arg Gly Glu
Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gin Val Ser
Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gin
Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp
Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His
Leu
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fal
Lys
Val
Ile
Trp Trp
Val Glu
Ile Leu
Pro Ser
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Ser Asp
Arg Gly
Gin Val
Glu Leu
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Gly
Gin
Thr Asn Tyr val
Ser A l a val
Gly
Pro
Gly Asp Pro
Asn
Lys
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Pro Arg Gly
Gly Gin V a l
Gly Asn
Arg Glu
ser Lys Lys ser
Val Tyr Gin
Ala
Ser
Lys
Val Thr Gly Thr Asp Leu Glu Leu
Phe Tyr
Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu
Lys Asp
Leu Val Ala Arg Ile Lys Asn Asn
Ser Leu
Pro Asp Leu Tyr Ser His His Phe Gin Ser His Gly
His Pro His Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser His Ala
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Ser Val Gin Leu Pro Gly Thr Asn Tyr Val Gly Pro
Gin Ala Gly Pro Pro Gin Ser Ala Val Gly Asp Pro
Arg Val Pro Ser Ser Asn Ser a n d / o r
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Glu
Ser
Arg Arg
Asp Asp
Glu Lys
His Tyr
Phe Asp
Pro Asp His
Lys Phe Ala
28
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Gly Asn
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EP 0 514 413 B1
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Glu Ser
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His Pro
Glu Asn
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His Tyr Asn Ile Ser Leu Asp Asn
Phe Asp Leu Val Ala Arg Ile Lys
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Arg
Arg
Lys Ser
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Glu Leu
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Ile Gin Ile Leu
Pro Leu Glu Asn Pro S e r
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His Lys Pro Gly Gin Val
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Arg Tyr Ser Gin Leu Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro
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Ala Gly Arg Arg Ile
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29
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Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala
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Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg
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Glu Tyr Lys Tyr
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Gly Gly
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Leu Ser Thr Gly Thr
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Gly Ile Asn Ala Ile
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Gin Leu Lys Gin Leu
Lys Gly Thr Gin Gin
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Pro Pro Gin Tyr Ala Tyr Leu
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Glu
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Ala Lys Ser Arg val Hia Pro Leu a n d / o r
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Thr
Ile
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Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gin
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Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly
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Gly Ile Asn Pro Tyr Thr
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Leu A l a
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Gly G i n
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EP 0 514 413 B1
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Gly Glu
Pro
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Asp His
Phe Ala
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Lys val
Ala
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Trp Ser Glu
Cys Thr Phe Ser Arg Gin
Tyr Lys val Phe ser Pro
Lys Glu Ala Lys Val Cys
Pro Trp Arg Tyr Leu Asp
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Gly Ala
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Cys His
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Glu Asn Tyr Gly Ser
Ser Glu Ile Ala Val Lys
Gin val Thr Aap Ser Thr
Ile
Asn Ala
Ser
Gly Tyr
Phe Phe
Ser
Gly
Thr
Ser
Pro
Ile
Ala
Asp Val
Thr Gly
Pro Asp
Thr Asp
Arg Leu
or partial sequences thereof which are suitable forthe detection of antibodies against parvovirus B19 in
the liquid samples.
2.
Immunologically active peptide or Polypeptide according to Claim 1, characterized in that it is in the form
of a fusion protein, where this fusion protein has at least a part of ß-galactosidase or of glutathione Stransferase.
3.
Test kit forthe detection of antibodies against human parvovirus B19, characterized in that it has at least
one immunologically active peptide or Polypeptide according to Claim 1, which is able to react with the
antibodies present in the liquid samples, and in that it has at least one indicatorcomponent which makes
it possible to detect complexes of immunologically active peptide and antibody.
4.
Test kit according to Claim 3, characterized in that the indicatorcomponent is an antibody which is directed
against the antibody to be detected and has a label.
5.
Test kit according to Claim 4, characterized in that the label consists of a radioactive isotope.
6.
Test kit according to Claim 4, characterized in that the label consists of an enzyme which is able to catalyze
a colour reaction.
7.
Test kit according to Claim 4, characterized in that the immunologically active peptide or Polypeptide is
biotinylated, and the indicatorcomponent is avidin or streptavidin with an enzyme, especially peroxidase,
33
EP 0 514 413 B1
covalently bonded thereto.
8.
Test kit according to any of Claims 4 to 7, characterized in that it is an ELISA kit.
9.
Test kit according to Claim 8, characterized in that at least one immunologically active peptide or Polypeptide according to Claim 1 is coupled to microtitre plates, and in that the indicator component consists of
anti-human IgG and/or IgM antibodies to which an enzyme catalyzing a colour reaction is coupled.
10. Test kit according to Claim 8, characterized in that monoclonal antibodies against human IgM antibodies
are coupled to microtitre plates, and in that the indicator component is a biotinylated immunologically active peptide or Polypeptide according to Claim 1, which cooperates with avidin or streptavidin with an enzyme covalently bonded thereto.
11. Process forthe purification of immunologically active peptides or Polypeptides according to Claim 1, characterized in that itcomprisesa removal of insoluble constituents, a fractionation by a DEAE-sephazell column and another purification by means of an anion exchanger column in HPLC in 8M urea.
12. Process according to Claim 11, characterized in that it additionally comprises an affin ity chromatography.
13. Process according to Claim 12, characterized in that the affinity chromatography is carried out with a glutathione-coupled gel matrix.
14. Use of at least one DNA sequence selected from
0-1:
GTG AAT TCT GAT CAT ATG AGT AAA AAA AGT GGC AAA TGG,
0-2:
C TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC CCC
0-3:
G AGG AAT TCT CTG ATC ATG ACT TCA GTT AAT TCT GCA GAA
GCC
0-4:
GAG GGG TGG CAC GGG AGT CGG TCC TTC GAA GAG
0-5:
G CTA CAA GCT GGG CCC CCG CAA AG
for the direct detection of pathogen by means of DNA amplif ication, especially by means of Polymerase
chain reaction.
15. Use of immunologically active peptides according to Claim 1 for the preparation of a Vaccine against infections with parvovirus B19.
Revendications
1.
Peptide ou Polypeptide immunologiquement actif , qui presente une partie de la sequence d'acides amines
des proteines de capside VP1 ou VP2 du parvovirus B1 9, caracterise en ce qu'il est exempt d'impuretes,
qui peuvent entraver la caracterisation d'anticorps specifiques du parvovirus B1 9, et qui presente le Polypeptide qui est une sequence partielle de 8 ä 50 restes d'acides amines, en particulierde 10 ä 32 restes
d'acides amines du peptide PAN1 , tel que represente dans Illustration 2-1 , ou la sequence d'acides ami34
EP 0 514 413 B1
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ou des sequences partielles de celles-ci,qui sont appropriees pour une caracterisation d'anticorps contre
le parvovirus B19 dans des fluides d'analyse.
Peptide ou Polypeptide immunologiquement actif selon la revendication 1, caracterise en ce qu'il se presente sous forme d'une proteine de fusion, cette proteine de fusion presentant au moins une partie de la
ß-gnlactosidase ou de la glutathion-S-transferase.
Necessaire d'essai pour la caracterisation d'anticorps contre le parvovirus B19, caracterise en ce qu'il
presente au moins un peptide ou un Polypeptide immunologiquement actif selon la revendication 1, qui
peut reagir avec les anticorps presents dans les fluides d'analyse, et en ce qu'il presente au moins un
constituant indicateurqui permet la caracterisation de complexes de peptide immunologiquement actif et
d'anticorps.
Necessaire d'essai selon la revendication 3, caracterise en ce que le constituant indicateur est un anticorps dirige contre l'anticorps ä caracteriser, qui presente un marquage.
Necessaire d'essai selon la revendication 4, caracterise en ce que le marquage consiste en un isotope
radioactif.
Necessaire d'essai selon la revendication 4, caracterise en ce que le marquage consiste en une enzyme,
41
EP 0 514 413 B1
qui peut catalyser une reaction coloree.
7.
Necessaire d'essai selon la revendication 4, caracterise en ce que le peptide ou le Polypeptide immunologiquement actif est biotinyle et en ce que le constituant indicateurest de l'avidine ou de la streptavidine
en liaison covalente avec une enzyme, en particulier une Peroxydase.
8.
Necessaire d'essai selon l'une quelconque des revendications 4 ä 7, caracterise en ce qu'il est un necessaire d'essai ELISA.
9.
Necessaire d'essai selon la revendication 8, caracterise en ce qu'au moins un peptide ou Polypeptide immunologiquement actif selon la revendication 1 est accouple ä des plaques de microtitrage et en ce que
le constituant indicateur consiste en anticorps anti-IgG humains et/ou IgM, auxquels on accouple une enzyme catalysant une reaction coloree.
10. Necessaire d'essai selon la revendication 8, caracterise en ce que des anticorps monoclonaux contre des
anticorps IgM humains sontaccouplesä des plaques de microtitrage, eten ce que le constituant indicateur
est un peptide ou un Polypeptide immunologiquement actif biotinyle selon la revendication 1, qui coopere
avec l'avidine ou la streptavidine par l'enzyme qui lui est reliee par liaison covalente.
11. Procede de purification de peptides ou Polypeptides immunologiquement actifs selon la revendication 1,
caracterise en ce qu'il comprend une elimination de fractions insolubles, une Separation au moyen d'une
colonne Sephazell diethylaminoethyle, et une purification supplementaire au moyen d'une colonne
d'echangeur d'anions par HPLC dans de l'uree 8M.
12. Procede selon la revendication 11, caracterise en ce qu'il comprend de plus une Chromatographie d'affinite.
13. Procede selon la revendication 12, caracterise en ce que la Chromatographie d'aff inite est effectuee au
moyen d'une matrice de gel accouplee au glutathion.
14. Utilisation d'au moins une sequence d'ADN choisie parmi
0-1:
GTG AAT TCT GAT CAT ATG AGT AAA AAA AGT GGC AAA TGG,
0-2:
C TTC GGT CGT GAC CAC GTC CTC CCC
0-3:
G AGG AAT TCT CTG ATC ATG ACT TCA GTT AAT TCT GCA GAA GCC
0-4:
GAG GGG TGG CAC GGG AGT CGG TCC TTC GAA GAG
0-5:
G CTA CAA GCT GGG CCC CCS CAA AG
pour la caracterisation directe de l'espece excitatrice au moyen d'une amplif ication d'ADN, en particulier
au moyen d'une reaction de Polymerase en chame.
15. Utilisation de peptides immunologiquement actifs selon la revendication 1 pour la preparation d'un inoculant contre des infections par le parvovirus B19.
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