TCC10 - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
LEILA SAWADA
DISTRIBUIÇÃO GENOTÍPICA DO VÍRUS DA HEPATITE C EM
DIFERENTES GRUPOS DE RISCO À INFECÇÃO NO ESTADO DO
PARÁ
BELÉM
2010
LEILA SAWADA
DISTRIBUIÇÃO GENOTÍPICA DO VÍRUS DA HEPATITE C EM
DIFERENTES GRUPOS DE RISCO À INFECÇÃO NO ESTADO DO
PARÁ
Trabalho de Conclusão
de Curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina
da Universidade Federal do
Pará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Msc.Aldemir Branco de Oliveira Filho
BELÉM
2010
LEILA SAWADA
DISTRIBUIÇÃO GENOTÍPICA DO VÍRUS DA HEPATITE C EM
DIFERENTES GRUPOS DE RISCO À INFECÇÃO NO ESTADO DO
PARÁ
Trabalho de Conclusão de
Curso
apresentado
à
Faculdade de Biomedicina da
Universidade Federal do Pará,
como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina, aprovado
com o conceito EXCELENTE
Belém (PA), 17 de Novembro de 2007
Banca examinadora:
__________
Prof.ºMsc. Aldemir Branco de Oliveira-Filho (Campus Marajó-UFPA/Orientador)
______________
Profº. Dr. José Ângelo Barletta Crescente (NMT/UFPA)
________________
Msc. Igor Brasil Costa (GEBIM/HEMOPA)
________________
Profº. Dr. José Alexandre Rodrigues de Lemos – Suplente (ICB/UFPA)
i
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus. Sem ele nada é possível.
Agradeço também aos meus pais, Armando e Mamiko, pelo grande
incentivo e amor.
Aos meus irmãos, Luana e Luis, pela amizade e incentivo.
À minha família, Helena, Shozó, Danielle, Hugo e Karla, pelo amor e
incentivo.
À meus avós, Teruo e Fumika, por serem os principais responsáveis por
essa família maravilhosa.
Aos “seis amigos” (Mariáh, Cristiane, Rafael, Thyago e Daniel), ao
“PEBBA” (Patrícia, Ellen, Bruno, Breno e Alexandre), às “Power Puff” (Laine e Karla),
à Ivy Tsuya e a todos os amigos que compreenderam a minha constante ausência nestes
últimos quatro e incríveis anos. Obrigada pela amizade, companheirismo e carinho!
À turma de Biomedicina 2007, pelos momentos de descontração, grupos
de estudos e companheirismo durante estes quatro anos.
Aos meus queridos amigos e companheiros do laboratório de Biologia
Molecular da Fundação HEMOPA: Aldemir Branco, Andréia Nevis, Carlos Eduardo
(Cadu), Caroline Aquino, Daniele “Pandolim”, Hérika Anijar, Igor Brasil, Jairo Castro,
Laine Pinto, Magaly Lima, Mariana Araújo, Marcos Benchimol, Priscila Rezende,
Tacciany Brito. Muito obrigada pelas conversas agradáveis e ajuda constante em meus
experimentos.
Ao meu “chefe” Professor Doutor José Alexandre Rodrigues de Lemos,
pela oportunidade, amizade e atenção dedicados à mim.
Ao meu também querido “chefe” Professor Mestre Aldemir Branco de
Oliveira Filho, pela amizade, paciência (muita!), carinho e tempo dedicado à mim.
À Professora Doutora Rita de Cássia Mousinho, pelo exemplo de
profissionalismo e pela grande ajuda a mim oferecida durante o curso de Biomedicina.
ii
Aos médicos que contribuíram para este trabalho.
À Universidade Federal do Pará pela oportunidade de conhecimento.
À Fundação Centro de Hematologia e Hemoterapia do Pará (HEMOPA)
pelo apoio logístico e estrutural.
À Secretaria Executiva de Ciência, Tecnologia e Meio Ambiente
(SECTAM) pelo apoio financeiro.
Por fim, agradeço imensamente aos pacientes que concordaram em
participar deste projeto. À vocês, o meu muito obrigada!
iii
Sumário
Página
Agradecimentos
i
Lista de abreviaturas
iv
Resumo
vi
Abstract
vii
1. Introdução
1
1.1 Revisão Bibliográfica
2
1.1.1 O vírus do HCV
2
1.1.2 História natural
3
1.1.3 Genótipos do HCV
4
1.1.4 Epidemiologia
5
1.1.5 Grupos de risco
8
2. Material e métodos
10
2.1 Grupos de risco à infecção pelo HCV
10
2.2 Diagnóstico de genotipagem do HCV
10
2.3 Análise filogenética
11
2.4 Análise estatística
11
2.5 Ética
12
3. Resultados
13
4. Discussão
18
5. Conclusão
22
Referência bibliográfica
23
Anexo 1. Parecer do comitê de ética de pesquisa em seres humanos do projeto de
35
pesquisa ao qual esta tese está vinculada.
Anexo 2. Menção honrosa pela apresentação oral- prêmio Iniciação Científica- no
36
55º Congresso Brasileiro de Genética (Águas de Lindóia, São Paulo, 2009)
Anexo 3. Submissão da tese à Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical.
37
iv
Lista de Abreviaturas, Siglas ou Símbolos
AIC
Critério informativo de Akaike
BD
Doadores de sangue
DU
Usuários de drogas ilícitas
C
Core
CENPREN Centro de prevenção e tratamento em dependência química
ELISA
Imunoensaio Enzimático
EUA
Estados Unidos da América
E1
Glicoproteína estrutural 1
E2
Glicoproteína estrutural 2
HAV
Vírus da Hepatite A
HBV
Vírus da Hepatite B
HEMOPA
Fundação Centro de Hematologia e Hemoterapia do Pará
HCC
Hepatocarcinoma ou carcinoma hepatocelular
HCV
Vírus da Hepatite C
HIV
Vírus da Imunodeficiência humana
HVR
Região hipervariável
IRES
Sítio de entrada ribossomal interno
LiPA
Hibridização reversa
NAT
Teste de amplificação do ácido nucleico
NS1
Proteína Não estrutural 1
NS2
Proteína Não estrutural 2
NS3
Proteína Não estrutural 3
NS4A
Proteína Não estrutural 4A
NS4B
Proteína Não estrutural 4B
NS5A
Proteína Não estrutural 5A
NS5B
Proteína Não estrutural 5B
OMS
Organização Mundial de Saúde
v
ORF
Fase de leitura aberta
pb
Pares de base
PCDH
Portadores de doença renal crônica
PUH
Hemodialisados
RNA
Ácido ribonucléico
RVS
Resposta Virológica Sustentada
UTR
Região não-codificadoras de proteínas
χ2
Qui-quadrado
vi
RESUMO
Introdução. A prevalência dos genótipos do HCV está associada com as vias de transmissão
da infecção. Estudos epidemiológicos sobre a distribuição genotípica do HCV na Amazônia
Brasileira são escassos. Baseado nisso, nós determinamos o padrão de distribuição genotípica
do HCV em diferentes categorias de exposição no Estado do Pará, Amazônia Brasileira.
Métodos. Um estudo transversal foi realizado com 312 indivíduos infectados pelo HCV,
pertencentes a diferentes categorias de exposição atendidas pelo HEMOPA, CENPREN e
uma Clínica Privada de Hemodiálise em Belém. Eles foram testados quanto à presença de
anticorpos anti-HCV por teste imunoenzimático, RNA-HCV utilizando PCR em tempo real e
genotipados através de análise filogenética da 5’ UTR. Os grupos de populações foram
caracterizados epidemiologicamente de acordo com dados coletados em breve entrevista ou
consulta de prontuários médicos. Resultados. Em todas as diferentes categorias de exposição
ao HCV foram encontrados predomínio do genótipo 1. A distribuição genotípica do HCV em
doadores de sangue (BD) foi constituída pelos genótipos 1 (94,04%) e 3 (5,96%). Todos os
pacientes com doenças hematológicas crônicas (PCHD) possuíam genótipo 1. A distribuição
genotípica em usuários de drogas ilícitas (DU) foi constituída pelos genótipos 1 (59,6%) e 3
(40,4%). Em pacientes em hemodiálise (PUH) foram detectados os genótipos 1 (90,16%), 2
(3,28%) e 3 (6,56%). Finalmente, a freqüência entre os genótipos 1 e 3 foi significativamente
diferente entre os grupos: BD e DU, PUH e DU, PUH e DU, e PCHD e DU. Conclusão. A
freqüência genotípica e distribuição de HCV em diferentes categorias de exposição no Estado
do Pará mostraram predominância do genótipo 1, independentemente do possível risco de
infecção.
Palavras-chave: HCV, genótipo, grupo de risco, Pará, Amazônia Brasileira
vii
ABSTRACT
Introduction. The prevalence of HCV genotypes is associated with the transmission route of
the infection. Epidemiological studies on HCV genotypic distribution in the Brazilian
Amazon are scarce. Based on this, we determined the patterns of distribution of HCV
genotypes among different exposure categories in the state of Pará, Brazilian Amazon.
Methods. A cross-sectional study was conducted on 312 HCV-infected individuals, belonging
to different categories of exposure, who were seen at the HEMOPA, the CENPREN, and a
private hemodialysis clinic in Belém. They were tested for HCV antibodies using an
immunoenzymatic test, RNA-HCV, using Real-Time PCR and HCV genotyping through
phylogenetic analysis of the 5' UTR. The population groups were epidemiologically
characterized according to data collected in a brief interview or medical consultation. Results.
Genotype 1 predominated in all the different categories of HCV exposure. The HCV
genotypic distribution in blood donors (BD) was comprised of genotypes 1 (94.04%) and 3
(5.96%). All patients with chronic hematologic diseases (PCHD) had HCV genotype 1. The
genotypic distribution in illicit-drug users (DU) was comprised of genotypes 1 (59.6%) and 3
(40.4%). In patients under hemodialysis (PUH), genotypes 1 (90.16%), 2 (3.28%), and 3
(6.56%) were detected. Finally, the frequency of genotypes 1 and 3 was significantly different
between the groups: BD and DU, PUH and DU, PUH and DU, and PCHD and DU.
Conclusion. The genotypic frequency and distribution of HCV in different categories of
exposure in the state of Pará showed a predominance of genotype 1, regardless of the possible
risk of infection.
Keywords: HCV, genotype, risk group, Pará, Brazilian Amazon.
1
1. INTRODUÇÃO
Na década de 70, com o desenvolvimento de diagnósticos específicos pra a
hepatite A (HAV) e hepatite B (HBV), ficou claro que muitos casos de hepatites póstransfusionais eram causados por outros agentes virais (Hernandes, 1983). A patologia em
questão tratava-se de um desafio para estudiosos das hepatites pós-transfusionais não-A nãoB. Estes constataram, entre outras características, um grande número de casos de hepatite póstransfusional com períodos de incubação de sete a oito semanas (intermediário aos períodos
de incubação da hepatite A e B). Dessa maneira, sugeriu-se a existência de um terceiro vírus
para explicar os casos, porém tal microorganismo escapava à identificação pela tecnologia
disponível naquela época (Feinstone et al., 1975; Rács & Candeias, 2004).
Visando a identificação deste agente etiológico até então desconhecido, Bradley et
al. (1985) detectaram a presença de um Agente de Forma Tubular. Este possível causador da
hepatite não-A não-B possuía 50 nm de diâmetro, era revestido de um envoltório lipoproteico
e seu genoma era constituído de acido ribonucléico (RNA). O organismo foi inicialmente
classificado como pertencente à família Togoviridae e era transmissível mediante sangue e
hemoderivados.
Em 1989, Choo e colaboradores identificaram o genoma do agente viral
responsável por 90% das hepatites pós-transfusionais não-A e não-B. Desde então, tal
microorganismo é referido como vírus da hepatite C (HCV), apresentando características
biológicas peculiares que o diferenciam de outros agentes virais hepatotrópicos (Choo et al.,
1989). Desde então, houve uma série de descobertas acerca da biologia do vírus. Em um curto
espaço de tempo, observaram-se diversos avanços significativos no entendimento de sua
epidemiologia, modos de transmissão, patogênese, diagnóstico e terapêutica (Strauss, 2001).
2
1.1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1.1 O vírus do HCV
O HCV possui número limitado de hospedeiros. Este microorganismo infecta
somente homens, chimpanzés e murinos (Rychlowska e Szewczyk, 2007). A partícula do
HCV é constituída por uma fita de RNA viral, circundada pelo capsídeo e envelope derivado
de membranas celulares do hospedeiro. Tais partículas se encontram circulantes no sangue do
infectado e geralmente associam-se a lipoproteínas, contribuindo para a infectividade do HCV
(Thomssen et al., 1993; Andre et al., 2002).
Características biológicas e genéticas permitem classificar o vírus como
pertencente à família Flaviviridae, gênero Hepacivirus, espécie Hepatitis C virus. O genoma
viral é constituído por uma fita única de polaridade positiva, medindo aproximadamente 9,6
kb. O RNA viral apresenta duas regiões (5’UTR e 3’UTR) que flanqueiam uma longa fase de
leitura aberta (ORF) (Choo et al., 1989; Rychlowska & Szewczyk, 2007).
As regiões 5’UTR e 3’UTR desempenham papel essencial no processo de
replicação e transcrição viral. A região 5’UTR possui o sítio de entrada ribossomal interno
(IRES). Este importante sítio é constituído por elementos estruturais de RNA que interagem
diretamente com a subunidade ribossomal 40S no início da tradução. Tal função é responsável
pela elevada taxa de conservação nucleotídica da 5’ UTR em distintas cepas do HCV
(Bartenschlager & Lohmann, 2000; Drazan, 2000; Simmonds, 2004).
A IRES também desempenha papel essencial no processo de tradução viral. Esta
região está intimamente relacionada com a produção de uma poliproteína codificada pela
ORF. A poliproteína possui aproximadamente 3.000 aminoácidos e sofre ação proteolítica dos
hepatócitos e autoproteolítica, originando três proteínas estruturais e sete não-estruturais
(Bartenschlager & Lohmann, 2000; Penin et al., 2004). As proteínas estruturais,
nucleocapsídeo viral (core) e envelope (E1 e E2), provêm do quarto amino-terminal da
poliproteína, enquanto que as não-estruturais NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, e NS5B
são originadas da parte restante da proteína (Figura 1) (Moriya et al., 1998; Bode et al., 2007).
A proteína C (core) e as glicoproteínas E1 e E2 constituem o grupo de proteínas
estruturais que formam a partícula viral (Drazan, 2000). A proteína E2 consiste em um
receptor de interação com as células do hospedeiro, apresentando uma região hipervariável
(HVR). Na HVR surgem variantes por mutações ao acaso, originando mutantes capazes de
escapar aos anticorpos neutralizantes (Weiner, 1991).
3
Figura 1. Genoma do vírus da hepatite C. UTR (untranslated region) - região não
codificadora; C - core (adaptado de RYCHLOWSKA E SZEWCZYK, 2007).
As proteínas não-estruturais não são inseridas nas partículas virais nascentes.
Supõe-se que a NS3 tem atividade de helicase, enquanto a proteína NS5B possui
características de RNA polimerase. Ambas as enzimas desempenham essencial na replicação
viral (Behrens, 1996; Kim et al., 1995).
Assim como outros vírus que possuem polimerase dependente de RNA, a RNA
polimerase do HCV apresenta significativa taxa de erro nos processos de replicação e
transcrição. Sendo assim, verifica-se uma grande variabilidade genética no HCV, que
apresenta uma taxa de mutação de 1,92x103 sítios/ano (100 vezes maior que o HIV) (Ogata et
al., 1991).
A elevada heterogeneidade não é uniformemente distribuída no genoma viral. As
regiões não codificantes são relativamente conservadas, reflexo da direta ligação dessas
regiões aos processos de transcrição e replicação viral. Tal fato tem sido muito utilizado no
diagnóstico molecular da infecção pelo HCV através da detecção de fragmentos dessas
regiões (5´UTR e 3´UTR). Entretanto, o restante do genoma possui intenso polimorfismo, a
ponto do vírus ser classificado filogeneticamente em seis genótipos e mais de 50 subtipos,
refletindo assim a alta taxa de erro da sua RNA polimerase (Choo, 1980; Gretch, 1997; Scott
& Gretch, 2007; Simmonds, 2004; Simmonds et al., 2005).
1.1.2 História natural
A história natural do vírus é difícil de ser estabelecida. Os primeiros sintomas se
dão de sete à oito semanas após a infecção. O paciente pode apresentar sintomatologia
subclínica como mal-estar, náuseas e raramente icterícia. Tal sintomatologia permanece
4
durante curto período de tempo, dificultando o diagnóstico durante a fase aguda.
Dessa
maneira, na maioria das vezes, o paciente descobre a infecção viral durante a realização de
exames clínicos de rotina ou no processo de doação de sangue (Strauss, 2001).
As aminotransferases séricas podem se encontrar elevadas entre segunda e quinta
semana pós infecção. Seu aumento por um longo período de tempo pode indicar
descompensação hepática. No entanto, tais níveis apresentam flutuações durante o curso da
doença, não se constituindo em indicador de infecção (Poynard et al., 2003).
Cerca de 86% dos pacientes apresentam viremia persistente, levando à
cronicidade da doença. A hepatite crônica pelo HCV também é, em geral, assintomática ou
apresenta sintomas inespecíficos. A fadiga é o sintoma que mais se destaca, podendo ser
muito intensa. Sintomas como parestesias e mialgias também podem ser observados.
(Poynard et al., 2002; Piche et al., 2002).
A evolução da doença hepática crônica costuma ser lenta. Durante esta fase, a
principal complicação observada é a progressão de fibrose hepática para cirrose e carcinoma
hepatocelular. Aproximadamente um terço dos pacientes crônicos apresenta desenvolvimento
de doenças hepáticas graves em um período de 30 anos após a infecção. No entanto, tal
período pode ser encurtado caso o paciente apresente comportamentos como: consumo
excessivo de álcool, coinfecção com vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou o vírus da
hepatite B (HBV) e idade avançada no momento da infecção (Benhamou et al., 1999;
Graham et al., 2001; Harris et al., 2001; Poynard et al., 2001).
O hepatocarcinoma ou carcinoma hepatocelular (HCC) consiste na mais séria
complicação observada em pacientes com hepatite crônica pelo HCV e está relacionado à
cirrose hepática. O risco de desenvolvimento de HCC entre os infectados está associado a
fatores, como: sexo masculino, idade avançada, infecções crônicas com HBV e ingestão
elevada de álcool (>50g/dia) (Harris et al., 2001; Poynard et al., 2001; Zarski et al., 1998).
Segundo um estudo conduzido López-García e colaboradores (2007), a média de sobrevida
observada em pacientes com HCC é de 10 meses.
1.1.3 Genótipos do HCV
Os distintos genótipos do HCV estão associados à resposta a terapia antiviral. O
genótipo 1 é o que apresenta menor resposta, conseqüentemente,
o pior prognóstico.
Particularmente, o subtipo 1b está freqüentemente relacionado à progressão severa da
5
infecção e à elevada probabilidade de desenvolvimento de infecção crônica e carcinoma
hepatocelular (Hadziyannis & Koshina, 2004; Seeff & Hoofnagle, 2002; Zeuzem, 2004).
As metodologias utilizadas para determinação das variantes genotípicas são a
sorotipagem e a genotipagem. A sorotipagem é realizada através do método indireto do
ELISA, no entanto, apresenta sensibilidade e especificidades baixas. A genotipagem (método
direto) apresenta confiabilidade e pode ser realizada através da hibridização reversa (LiPA),
Taqman ou Seqüenciamento Genômico (padrão ouro) (Sociedade Brasileira de Infectologia,
2008).
Os métodos de seqüenciamento para fins de diagnóstico geralmente utilizam a
5’UTR. Esta região possui significante homologia (≥97%) entre os genótipos (Hans et al.,
1991; Simmonds et al., 2005), porém apresenta diversos polimorfismos que permitem
caracterizar os diversos genótipos e subtipos virais (Okamoto et al., 1990; Simmonds et al.,
1993; Smith et al., 2005).
A genotipagem das cepas infectantes é de extrema importância, uma vez que
implica no direcionamento do tratamento (tipo de droga e duração) a ser empregado no
paciente (Hadziyannis, 2004).
No entanto, a terapia atualmente utilizada (Interferon,
Interferon peguilado e ribavirina) não apresenta resultados esperados para uma parcela
significante de pacientes: somente 50% de pacientes portadores do genótipo 1 apresentam
RVS (resposta virológica sustentada), enquanto que em pacientes portadores de outros
genótipos, a RVS chega até 80 % (Hayashi & Takehara, 2006).
1.1.4 Epidemiologia
Mundialmente, a infecção pelo HCV é um importante problema de saúde pública.
Estima-se que 2,2% (aproximadamente 130 milhões) da população mundial esteja infectada,
sendo a maioria assintomática e desconhecedora do estado de portador do vírus (Shepard et
al., 2005). Segundo a OMS, anualmente ocorrem 4 milhões de novas infecções e 250.000
mortes provocadas pelo HCV (Kim, 2002).
A prevalência do vírus varia de acordo com as regiões demográficas. As menores
taxas de prevalência podem ser encontradas no Nordeste da Europa, em países como o Reino
Unido e Escandinávia (0,01-1%) (Shepard et al., 2005), enquanto que a maiores taxas de
prevalência já relatadas pertencem à África, com destaque para o Egito (20%) (Frank et al.,
2000). Na América do Sul, o Brasil apresenta uma das maiores taxas de soroprevalência
(2,2%), sendo que esta apresenta distribuição variada de acordo com as regiões. A região
6
Norte é a que a apresenta maior soroprevalência (1,6%), sendo que os estados do Pará (2%) e
Acre (5,9%) são os que mais contribuem para esta elevada taxa (GESBH, 1999).
Armstrong et al (2006) verificaram maior soroprevalência em homens na
população dos Estados Unidos. Na região Amazônica, trabalhos recentes fornecem indícios de
que a prevalência é maior em homens (Oliveira-Filho et al., 2010, Torres et al., 2009). Em
relação ao fator idade, é provável que a mesma esteja relacionada com o aumento da
prevalência do vírus: quanto maior a idade, maior a chance de o indivíduo ser infectado pelo
HCV (Patinõ-Sarcineli et al., 1994). Contudo, tal qual o fator sexo, a relação desta variável
com a maior prevalência do HCV ainda é passível de confirmação.
Diversos pesquisadores têm relatado ampla variação na distribuição dos
genótipos. Assim, os genótipos 1, 2 e 3 são mais prevalentes na Europa, Japão e Estados
Unidos, o genótipo 4 na África central, Egito e Oriente Médio, o genótipo 5 na África do Sul
e o genótipo 6 na Ásia (McOmish et al., 1994; . Mellor et al., 1995; Nainan et al., 2006; .
Nguyen et al., 2005). Tais genótipos foram difundidos mundialmente através de intervenções
médicas em larga escala (como a ocorrida na 2ª guerra mundial), transfusões sanguíneas sem
prévia triagem para HCV e utilização de seringas não esterilizadas (como ocorrido no início
do século XX no tratamento da sífilis e, atualmente, ocorre no compartilhamento de drogas
injetáveis entre os usuários) (Simmonds 2001; Smith et al., 1997). Entretanto, regiões
africanas e asiáticas apresentam prevalência e freqüência genotípica distintas, resultado de
hábitos culturais ou intervenções na área de saúde pública. No Egito, Gabão e em países do
Oriente Médio, o genótipo 4 é endêmico. Em particular, no Egito, o genótipo 4 foi
disseminado através da política pública de combate ao Schistossoma mansoni. Nesta
campanha de vacinação, o vírus foi disseminado na população através de procedimentos que
não respeitavam às normas de biosegurança (agulhas contaminadas provenientes da vacinação
em massa) (Abdel-Azis et al., 2000; Hadziyannis & Koshina, 2004; Kuiken et al., 2008;
Pybus et al., 2003; Schreier et al., 1996; Simmonds et al., 2004).
No Brasil, a distribuição genotípica também é heterogênea. O genótipo 1 é o mais
freqüente, seguido pelo 3 e 2. Este quadro epidemiológico é semelhante à distribuição
genotípica da região Norte, na qual se destaca a elevada taxa de infectados pelo genótipo 1
(~71%). No entanto, a distribuição genotípica do HCV no Brasil apresenta algumas variações
regionais. Na região Sul, o genótipo 3 do HCV possui uma freqüência mais acentuada que em
outras regiões brasileiras (Figura 2) (Campioto et al., 2005; GESBH, 1999; Lauer & Walker,
2001; Simmonds et al., 2005).
7
Figura 2. Distribuição genotípica do HCV na população brasileira (Adaptado de Campiotto et
al., 2005.
8
1.1.5 Grupos de risco
O HCV é transmitido preferencialmente pela via parenteral. Após início da
triagem sorológica para HCV em bancos de sangue e, conseqüentemente, redução
significativa de transmissão transfusional do HCV, observou-se grupos de risco à infecção
pelo HCV nitidamente ligados a procedimentos parenterais freqüentes e/ou inadequados,
como: compartilhamento de seringas (usuários de drogas), compartilhamento de linhas e
filtros do hemodialisador (pacientes renais crônicos em hemodiálise), recepção de múltiplas
transfusões de sangue ou hemoderivados (pacientes com doenças hematológicas crônicas),
etc. A transmissão via sexual e vertical já foram relatadas, mas ambas são relativamente
ineficientes, exceto quando o HCV está associado com outros microorganismos (HBV, HIV,
etc.) (Ayola et al., 1991; Bach & Bodenheimer, 2005; Thorpe et al., 2002; Trosi et al., 1993).
Dentre os grupos de risco, dois grupos chamam a atenção pela sua elevada
prevalência, os hemofílicos (multitransfundidos) e pacientes hemodialisados. A Federação
Mundial de Hemofilia (2003) registrou 36% dos hemofílicos com HCV e no Brasil observamse índices de 60% de infectados (Martins et al., 2000); enquanto que em pacientes
hemodialisados verifica-se uma prevalência entre 19,0% a 47% de infectados (Ayola et al.,
1991; Sheu et al, 1992). Segundo Druwe et al. (1994), há grande transmissibilidade no
ambiente de hemodiálise, logo, a taxa de incidência é significativamente alta, mantendo
correlação com a prevalência.
O grupo de risco de hemodialisados está relacionado ao risco transfusional e
nosocomial. Este último é particularmente importante, uma vez que altas taxas de
soroprevalência geralmente são observadas em clínicas que não possuem sala de diálise
específica para pacientes com hepatite C. Outros comportamentos de risco também estão
relacionados à transmissão nosocomial: compartilhamento do mesmo frasco de heparina, de
filtros, de equipamentos de aferição da pressão venosa, assim como o hábito de não trocar as
luvas ao manusear pacientes (Gilli et al., 1990; Pujol et al., 1996; Sampietro et al, 1994).
O grupo de risco dos usuários de drogas é considerado o principal disseminador
do HCV nos EUA e Austrália durante os últimos 40 anos. Os usuários de drogas são
considerados os responsáveis por aproximadamente 68% das novas infecções (Alter, 2007),
sendo que, pelo menos 50% dos usuários de drogas são portadores do vírus (Aceijas &
Rhodes, 2007).
A maioria das infecções dos grupos de risco são referentes aos genótipos 1, 2 e 3.
Em usuários de drogas, é observada maior freqüência do genótipo 3, quando este grupo é
comparado à outras categorias de risco. Historicamente, o genótipo 3 se originou na Ásia e foi
9
disseminado entre os usuários de drogas (Greene et al., 1995). Este grupo tem recebido
atenção diferenciada por parte de alguns países, tendo em vista que os usuários de drogas são
considerados verdadeiros “reservatórios” que disseminam o vírus entre a população. Dessa
maneira, verifica-se em alguns locais, um aumento na freqüência do genótipo 3 na população
em geral (Ross et al., 2000).
Mundialmente, há uma grande prevalência do genótipo 1 em todas as categorias
de risco. Em hemodialisados, estudos realizados na Grécia e na Indonésia revelaram,
respectivamente, prevalência de 47 % e 61% do genótipo 1 (Soetjipto et al., 1996;
Christofidou et al., 2008). No Brasil, há uma grande variabilidade na distribuição genotípica
do HCV, geralmente sendo encontrados os genótipos 1, 2 e 3 ( Albuquerque et al., 2005;
Silva et al., 2006).
No grupo de multitransfundidos, um estudo conduzido por Christofidou et al
(2008) detectou o genótipo 1 em 32% em portadores da talassemia; também houve a detecção
de 74% pacientes infectados pelo genótipo 1 em hemofílicos no Estado da Bahia (Silva et al.,
2005). No entanto, o genótipo 6 foi o mais freqüente no grupo de multitransfundidos do
Sudeste Asiático (Katsanos et al., 2005).
Na região Norte do Brasil, estudos epidemiológicos acerca da distribuição
genotípica do vírus ainda são escassos. Dois trabalhos recentes envolveram doadores de
sangue no Amazonas e no Pará. Ambos verificaram grande prevalência do genótipo que
possui o pior prognóstico, o genótipo 1 (Oliveira-Filho et al., 2010; Torres et al., 2009).
Os grupos de risco possuem prevalência elevada por estarem ligados à
procedimentos parenterais freqüentes. No entanto, estudos acerca destes grupos ainda são
raros, especialmente na região Amazônica. Dessa maneira, há uma grande necessidade de
estudos epidemiológicos na região com o intuito de disponibilizar informações que
direcionem políticas e estratégias públicas de prevenção e controle na região.
Portanto, o presente estudo objetivou determinar a distribuição genotípica do
HCV em diferentes grupos de risco à infecção na Amazônia Brasileira, assim como verificar
se há variações na distribuição genotípica entre os distintos grupos de risco.
10
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1
GRUPOS DE RISCO À INFECÇÃO PELO HCV
Este estudo selecionou doadores de sangue (representante em potencial da
população geral), pacientes com doença hematológica crônica que receberam múltiplas
transfusões de sangue, ambos os grupos atendidos pela Fundação Centro de Hematologia e
Hemoterapia do Pará (HEMOPA). Além disso, foram selecionados pacientes hemodialisados
e usuários de drogas em atendimento em clínicas especializadas na região metropolitana de
Belém, Estado do Pará, Amazônia Brasileira.
2.2
DIAGNÓSTICO E GENOTIPAGEM DO HCV
Primeiramente,
as
amostras
foram
triadas
sorologicamente
por
teste
imunoenzimático (Murex anti-HCV version 4.0, Murex Biotech SA, Kyalami, South Africa).
Em seguida, as amostras positivas e indeterminadas foram submetidas ao teste confirmatório
por biologia molecular.
O RNA viral foi extraído utilizando kit comercial de extração QIAmp Viral RNA
Mini Kit (Qiagen) seguindo suas instruções. O diagnóstico da infecção pelo HCV foi
realizado por PCR em tempo real (Plataforma ABI Prism 7000, Applied Biosystems). O
diagnóstico molecular foi obtido detectando 67pb da 5’UTR utilizando o kit comercial
TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents (Applied Biosystems), seguindo protocolo do fabricante
acrescido
dos
iniciadores
5’-CGCTCAATGCCTGGAGATTT-3’
e
5’-
TTTCGCGACCCAACACTACTC-3’ e de sonda FAM-TGCCCCCGCAAGACTGCTAGCTAMRA. As condições de amplificação foram: 1 ciclo: 50oC/2min, 60oC/30min e 95oC/5min;
50 ciclos: 94oC/20s e 60oC/1 min.
Após diagnóstico molecular da infecção viral, as amostras de RNA-HCV foram
selecionadas para amplificação da 5’UTR do HCV utilizando Nested-PCR. A primeira reação
será constituída da síntese e da amplificação de cDNA em único passo utilizando
termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) e kit comercial SuperScript
One-Step RT-PCR with Platinum Taq (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante,
acrescido de 1,0 μl EAP1 (10 μM) e 1,0 μl EAP2 (10 μM). As condições de amplificação
11
forma: 1 ciclo: 50oC/15min e 95oC/2min; 40 ciclos: 94oC/15s e 60oC/30s; 1 ciclo:
60oC/10min. A segunda reação foi constituída de 16,8 μl água ultrapura, 2,5 μl 10x PCR
buffer, 1,0 μl MgCl2 (3 mM); 1,0 μl mix dntps (10 mM), 0,2 μl Taq Polimerase (5U/μl), 3,0
μl de produto da primeira PCR, 0,5 μl IAP1 (10μM) e 0,5 μl IAP2 (10 μM). O produto da 2ª
amplificação foi submetido à eletroforese em gel de agarose (2%) com brometo de etídio e
visualizado
em
transluminador
ultravioleta.
O
fragmento
amplificado
possuía
aproximadamente 130 pb e foi seqüenciado nos dois sentidos pelo método de
didesoxinucleotídeo terminalizador de cadeia utilizando aparelho ABI Prism 377 e kit
comercial Big Dye Cycle Sequencing Standard, ambos da Applied Biosystems.
2.3 ANÁLISE FILOGENÉTICA
As seqüências obtidas foram editadas e alinhadas utilizando o programa BioEdit
versão 7.0.9 (Hall, 1999) e Clustal W versão 1.81 (Thompson et al., 1994), respectivamente.
Este alinhamento será submetido ao programa DnaSP versão 5.10 (Librado & Rozas, 2009 )
para a identificação de seqüências idênticas.
Estas foram submetidas ao programa
Modelgenerator (Keane et al., 2006) para selecionar, de acordo com o critério informativo de
Akaike (AIC), o melhor modelo a ser aplicado durante as análises filogenéticas. Tais
parâmetros foram utilizados no programa PHYML versão 2.4.4 (Guindon & Gascuel, 2003)
para a construção de árvores de acordo com o método de máxima verossimilhança. O nível
de confiança dos agrupamentos foi avaliado pelo método não-paramétrico de bootstrap com
1.000 réplicas. A árvore filogenética final foi construída diante do consenso das árvores
obtidas e será editada utilizando os recursos gráficos disponibilizados pelo programa FigTree.
Seqüências nucleotídicas foram obtidas junto ao National Center of Biotechnology
Information e adicionadas ao alinhamento e usadas na construção da árvore filogenética para
identificar os genótipos do HCV.
2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Análises univariadas (qui-quadrado e exato de Fisher), comparando a
distribuição dos genótipos do HCV entre as diferentes categorias de exposição, foram
realizadas utilizando o programa BioEstat versão 5.0. Os resultados foram considerados
estatisticamente distintos caso p ≤ 0.05.
12
2.5 ÉTICA
Este estudo integra o projeto de pesquisa “Distribuição de freqüência dos
genótipos do vírus C da hepatite e seu significado em diferentes grupos de risco”
(Nº041/2004-CEP/NMT), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Núcleo de
Medicina Tropical, UFPA, Belém, Pará, Brasil (Anexo 1).
13
3. RESULTADOS
O presente estudo realizou a triagem por ELISA de 298.259 doadores de sangue
originários da Fundação HEMOPA, 98 pacientes com doença hematológica crônica atendidos
pela Fundação HEMOPA. Além disso, 271 pacientes de clínicas de hemodiálise privadas da
região de Belém e 94 indivíduos do CENPREN foram diretamente triados por PCR em tempo
real. Assim, o HCV RNA foi detectado em 151 doadores de sangue, 53 portadores de doença
renal crônica, 61 hemodialisados e 47 usuários de drogas, caracterizando, dessa maneira, as
diferentes categorias de exposição (Tabela 1).
Ao total, foram isoladas 312 seqüências nucleotídicas referentes à região 5'UTR
do HCV. No entanto, 293 seqüências eram idênticas, logo, somente aquelas representativas
para o alinhamento foram mantidas. Assim, o alinhamento final consistiu em 19 seqüências
nucleotídicas (5 isolados de doadores de sangue, 5 isolados de usuários de drogas, 3 isolados
de pacientes portadores de doença crônica hematológica e 6 isolados de hemodialisados).
O programa Modelgenerator apontou o Tamura-Nei como modelo evolutivo mais
apropriado a ser utilizado. Este foi ajustado pelos parâmetros proporção de sítios invariáveis
(0,451) e taxa de distribuição gama (0,327). As freqüências de base (A = 0.22459, C =
0.27331, G = 0.27534, T = 0.22677), taxa de transição/transversão por purinas (3,923) e taxa
de transição/transversão por pirimidinas (4,885) foram estimadas pelo programa PHYML.
A análise filogenética revelou o genótipo 1 como o mais predominante em todas
as categorias de exposição (Tabela 1). Também houve a provável detecção do subtipo 1b em
todos os grupos. Assim, é necessária a análise de outras regiões do genoma viral, uma vez que
baixos valores de grupamento para a subtipagem foram observados.
O grupo de doadores de sangue HCV RNA positivos foi constituído em sua
maioria pelo sexo masculino (66%), com uma significante freqüência de infecção em
indivíduos de 30 à 49 anos (30-39 anos: 27%; 40 a 49 anos: 39%). Houve detecção dos
genótipos 1 (94,04%) e 3 (5,96%) (Figura 3, Tabelas 1 e 2).
O grupo dos usuários de drogas portadores do HCV consumia preferencialmente
drogas não injetáveis (82,1%), dentre elas: maconha, craque e cocaína. A maioria dos usuários
foi representada pelo sexo masculino (62,3%), com uma média de idade de 28 anos (18-52
anos). A distribuição genotípica foi constituída pelos genótipos 1 (59,57%) e 3 (40,43%)
(Figura 3, Tabelas 1 e 2).
O grupo de multitransfundidos infectados possuía as seguintes doenças
hematológicas crônicas: hemofilia A (52,04%), hemofilia B (12,25%), anemia falciforme
(20,41%), deficiência dos fatores de coagulação (8,16%) e outros (7,14%). A maioria dos
14
pacientes pertencia ao sexo masculino. A média do número de transfusões sanguíneas
recebidas foi de 45 (Mín-Máx: 6-352) e a idade média dos pacientes infectados foi de 36 anos
(23 - 56 anos). Todos os pacientes eram portadores do genótipo 1 (Figura 3, Tabelas 1 e 2).
Os pacientes hemodialisados portadores do vírus realizavam diálise em média há
1,5 ano (Mín-Máx: 0.25-5.5 anos). A maioria pertencia ao sexo masculino (66,6%) com a
média de idade de 47 anos (25-65 anos), sendo observados os genótipos: 1 (90,16%), 2
(3.28%) e 3 (6.56%) (Figura 3, Tabelas 1 e 2).
Por fim, a distribuição dos genótipos 1 e 3 foi significativa entre os grupos:
doadores de sangue e usuários de drogas ilícitas (χ2=35.07, valor-p<0.001), hemodialisados e
usuários de drogas ilícitas (χ2= 17,43; p<0.001) e entre multitransfundidos e usuários de
drogas ilícitas (χ2=26.45, p<0.001). A distribuição do genótipo 2 e 3 também foi significativa
(exato de Fisher) entre usuários de drogas ilícitas e hemodialisados (p=0,05). Tais resultados
refletem
as
diferentes
rotas
de
transmissão
viral.
15
Tabela 1. Distribuição genotípica do HCV em diferentes grupos de risco à infecção na Amazônia Brasileira
Triagem molecular
Grupos de risco
Idade
N*
ELISA**
Positivo
Negativo
Doadores de sangue
40-49
298.259
1.112
151 (0,05%)
298.108(99,95%)
Usuários de drogas ilícitas
18-52
94
-
47(50%)
47(50%)
Multitransfundidos
23-56
98
-
53 (54,08%)
45(45,92%)
Hemodialisados
25-65
271
89
61 (22,51%)
10(77,49%)
*- N amostral
**- Triagem sorológica: ELISA positivo e inconclusivo, exceto para os grupos de pacientes multitransfundidos e de usuários de drogas ilícitas,
nos quais se utilizou somente a triagem molecular.
16
Tabela 2. Distribuição genotípica do HCV em categorias de risco.
Genótipos
Grupos de risco
1
2
3
n
Doadores de sangue
142 (94,04%)
-
9 (5,96%)
151
Multitransfundidos
53 (100%)
-
-
53
Usuários de drogas ilícitas
28 (59,57%)
-
19 (40,43%)
47
Hemodialisados
55 (90,16%)
2 (3,28%)
4(6,56%)
61
N
312
17
Figura 3. Árvore filogenética obtida pelo método de máxima verossimilhança, sendo a
consistência dos agrupamentos analisada pelo teste não - paramétrico de bootstrap utilizando
1.000 réplicas. BD: doadores de sangue, DU: usuários de drogas ilícitas, PUH:
hemodialisados e PCHD: portadores de doença renal crônica.
18
4. DISCUSSÃO
Diversos pesquisadores têm relatado ampla variação na distribuição dos genótipos
do HCV. De maneira geral, os genótipos 1, 2 e 3 possuem distribuição mundial, sendo
freqüentemente encontrados em pacientes infectados provenientes da Europa, Japão e Estados
Unidos. Entretanto, algumas regiões africanas e asiáticas apresentam prevalência e freqüência
genotípica distintas, resultado de diferentes hábitos culturais ou intervenções na área de saúde
pública. Por exemplo, o genótipo 4 é freqüentemente encontrado na África Setentrional e no
Oriente Médio, enquanto que o genótipo 5 pode ser encontrado no Sul da África e o genótipo
6 no Sudeste da Ásia (Kuiken et al., 2008; Simmonds et al, 2004).
A distribuição do vírus no Brasil é similar à mundial. O genótipo 1 e o 3 são os
mais freqüentes, observando-se alguns casos do genótipo 2. Além disso, podem ser
encontrados casos esporádicos dos genótipos 4 e 5 (Bassit et al., 1999; Campiotto et al., 2005;
Oliveira et al., 1999, Zarife et al., 2006).
O presente estudo verificou uma distribuição genotípica similar à encontrada em
outras regiões do Brasil. Houve predominância do genótipo 1, seguido pelos genótipos 3 e 2.
Os genótipos 4 e 5 não foram detectados. Dessa maneira, este resultado provavelmente reflete
a elevada freqüência dos genótipos 1 e 3 na Amazônia brasileira, corroborando com outros
estudos realizados na região (Busek & Oliveira, 2003; Campiotto et al., 2005; Paraná et al.,
2007; Oliveira-Filho et al., 2010; Torres et al., 2009).
Na região Norte do Brasil, dois trabalhos recentes envolveram doadores de sangue
provenientes do estado do Amazonas e do Pará. Ambos os estudos verificaram elevada
freqüência do genótipo que possui o pior prognóstico, o genótipo 1 (Oliveira-Filho et al.,
2010; Torres et al., 2009).
No presente estudo, a elevada freqüência do genótipo 1 verificada em doadores de
sangue influenciou a completa dominância deste genótipo em pacientes multitransfundidos,
provavelmente através da transfusão de produtos sanguíneos. Na Holanda, a transfusão destes
produtos foi responsável pela infecção de 17,5% dos pacientes portadores do genótipo 1 (De
Vries et al., 2008). Um estudo conduzido na Grécia detectou o genótipo 1 em 32% dos
portadores de talassemia (Katsanos et al., 2005), também houve a detecção de 74% de
infecções pelo genótipo 1 em hemofílicos no Estado da Bahia (Silva et al., 2005). Contudo, o
genótipo 6 foi o mais freqüente no grupo de multitransfundidos do Sudeste Asiático
(Katsanos et al., 2005). Portanto, provavelmente, este grupo segue a distribuição genotípica
19
do HCV, de acordo com a distribuição do vírus na população de doadores de sangue de seu
país (Wong et al., 1998).
O HCV é transmitido preferencialmente pela via parenteral. Logo, o
compartilhamento da maquinaria de abuso (agulhas, papelote, etc.) por usuário de drogas,
principalmente as intravenosas, constitui-se em uma das rotas mais eficientes de transmissão
do HCV. Este é mais rapidamente adquirido quando comparado a outras infecções que os
usuários de drogas estão freqüentemente expostos (Sutton et al., 2006). Em um estudo
realizado nos Estados Unidos, após um período de 5 anos, 50-90% dos usuários já haviam
sido expostos ao HCV (Villano et al., 1997)
Nossos achados apontam para a predominância do genótipo 1 e uma elevada
freqüência do genótipo 3 no grupo de usuários de drogas, corroborando com outros estudos
realizados no Brasil e no mundo (Martins et al., 2006; Mathei et al., 2005; Oliveira et al.,
1999; Sy & Jamal, 2006). Ao que parece, não há associação entre o uso de drogas ilícitas e o
genótipo do HCV, mas sim a propagação do genótipo circulante, facilitada pelo
compartilhamento de equipamentos para o consumo de drogas e, em menor grau, por práticas
sexuais de risco (Van Austen et al., 2004).
No grupo de pacientes em hemodiálise, o maior tempo de exposição (maior média
de idade) aos possíveis fatores de risco pode ser apontado como responsável pela maior
diversidade genotípica do HCV. Estes resultados corroboram com alguns estudos previamente
realizados em Minas Gerais, Recife e Salvador (Albuquerque et al., 2005; Busek et al., 2002;
Silva et al., 2005 ).
Alguns fatores podem alterar o padrão de distribuição genotípica do vírus. Eles
são apontados como responsáveis pela mudança no quadro epidemiológico de países
desenvolvidos, como os EUA e Espanha. A redução da transmissão por transfusão sanguínea,
comportamento de alto risco de usuários de drogas e a imigração são responsáveis por esta
mudança (Esteban et al., 2008).
Desde a implementação do screening anti-HCV em bancos de sangue, o risco
residual de transfusão associado à hepatite C foi limitado a unidades doadas durante o período
de janela imunológica (Tobler et al., 2003). Este risco transfusional é diminuído com a
implementação dos testes de triagem de doação de sangue através do NAT (teste de
amplificação do ácido nucléico) (Coste et al., 2005; Reesink et al., 1998). Na Europa, depois
do NAT ter sido implementado, o risco transfusional reduziu de 1/276 mil para 1/milhão de
doações (Busch & Kleiman, 2000; Jackson et al., 2003), diminuindo consideravelmente o
risco de infecção pelo genótipo mais freqüente em sua população, o genótipo 1. No entanto,
20
raros casos de transfusão ainda podem ocorrer a partir de doadores recentemente infectados e,
portanto, com o HCV RNA abaixo dos limites de detecção (Schuttler et al., 2000). No Brasil,
a portaria Nº112/2004 declara que todos os bancos de sangue devem implementar o NAT
como triagem. Dessa maneira, espera-se que no Brasil, o mesmo fenômeno ocorrido na
Europa e nos países desenvolvidos venha a ser observado na população em geral e nos grupos
de risco.
Em alguns países da Europa, a freqüência dos subtipos 1a, 3a e o genótipo 4
(relacionados aos usuários de droga) está aumentado, enquanto que a freqüência do subtipo 1b
e o genótipo 2 está diminuindo em doadores de sangue e em pacientes jovens (Payan et al.,
2005; Katsoulidou et al., 2006; van de Laar et al., 2005). Estudos apontam também para um
número crescente de jovens usuários de drogas infectados pelo subtipo 3a. Este quadro
provavelmente reflete a alta prevalência dos genótipos 1 e 3 em usuários de drogas
intravenosas, que atuam como verdadeiro “reservatórios” que afetam a população em geral
(Ross et al., 2000). Tais resultados indicam que mudanças no comportamento social afetam as
tendências epidemiológicas de doenças infecciosas a um contexto significativo (Cantaloube et
al., 2005; Kovalev et al., 2003). No presente estudo, estas características podem ser
observadas no grupo de usuários de drogas ilícitas através da elevada freqüência do genótipo
3 e da baixa média de idade entre os pacientes infectados.
A imigração também pode provocar alterações na distribuição genotípica do vírus.
No estado da Bahia verificou-se a presença de um paciente do genótipo 4 que provavelmente
adquiriu o vírus na Europa através do compartilhamento de maquinaria de abuso. Vários
casos envolvendo os genótipos 4 e 5 também foram identificados em São Paulo, sendo
algumas destas infecções adquiridas no Oriente Médio. Em nossos resultados, não houve
constatação do genótipo 4 e 5, indicando que as cepas circulantes no Estado do Pará,
provavelmente, não são provenientes de locais como África e Oriente Médio (Levi et al.,
2002; Murphy et al., 2007; Paraná et al., 2000; Zarife et al., 2006).
Por fim, este estudo exemplificou que a 5'UTR é limitada na sua habilidade de
discriminar os subtipos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 (Hraber et al., 2006; Murphy et al., 2005). Algumas
das características específicas identificadas na região 5'UTR não são mais conservadas. Por
exemplo, a base "G" na posição 243 da 5'UTR era originalmente representativa do subtipo 1b.
No entanto, atualmente, ela pode ser encontrada em subtipos 1a. Além disso, um grande
número de subtipos que apresentam a mesma seqüência da 5'UTR tem sido descritos
(Cantaloube et al., 2006; Tamalet et al., 2003; Chen & Weck., 2002). No entanto, a 5'UTR
contém variações suficientes para a genotipagem (Cantaloube et al., 2006). Em suma, este
21
estudo demonstrou a necessidade do seqüenciamento de outras regiões do genoma do HCV
para a melhor descrição dos subtipos virais.
22
5. CONCLUSÃO
As conclusões deste estudo foram:
1. O genótipo 1 foi o genótipo mais freqüente em todas as categorias de risco,
assim como em doadores de sangue. Neste último grupo, foi detectada a
freqüência de 94,04% do genótipo 1 e 5,96% do genótipo 3. Em pacientes
multitransfundidos, 100% dos pacientes foram infectados pelo genótipo 1,
enquanto que em usuários de drogas ilícitas, 59,57% das infecções foram
ocasionadas pelo genótipo 1 e 40,43% dos infectados possuíam o genótipo 3.
O grupo de hemodialisados foi o único que apresentou o genótipo 2 (3,28%).
Neste grupo também foram verificados os genótipo 1 (90,16%) e o 3(6,56%).
2. A distribuição dos genótipos 1 e 3 foi significativa entre os grupos: doadores
de sangue e usuários de drogas ilícitas, hemodialisados e usuários de drogas
ilícitas e entre multitransfundidos e usuários de drogas ilícitas. A distribuição
do genótipo 2 e 3 também foi significativa entre usuários de drogas ilícitas e
hemodialisados. Estes resultados foram provavelmente observados devido à
elevada freqüência do genótipo 3 em usuários de drogas.
3. O sexo masculino foi o mais freqüente em todas as categorias de risco à
infecção pelo HCV.
4. É necessária a análise de outras regiões do genoma viral, uma vez que baixos
valores de grupamento para a subtipagem foram observados ao se utilizar a
5’UTR.
23
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Anexo 1. Parecer do comitê de ética de pesquisa em seres humanos do projeto de pesquisa ao
qual esta tese está vinculada.
36
Anexo 2. Menção honrosa pela apresentação oral- prêmio Iniciação Científica- no 55º
Congresso Brasileiro de Genética (Águas de Lindóia, São Paulo, 2009)
37
Anexo 3. Submissão da tese à Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical.