aula prática 5 Exame do Microcultivo de levedura

IB – UNESP - Rio Claro
CCA - UFSCar – Araras
II CURSO DE MONITORAMENTO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA
PERÍODO: 11 a 15 DE FEVEREIRO DE 2008
ATIVIDADES PRÁTICAS
5° Aula Prática – Exame do Microcultivo de levedura.
Plaqueameno de Açúcar. Ensaio de Óxido-Redução com
Resazurina
1 – OBJETIVO:
1.1 Verificar microscopicamente a organização celular do
crescimento da levedura;
1.2 Verificar a técnica de contagem de bactérias presentes no
açúcar;
1.3 Proceder uma avaliação relativa de prováveis contaminantes
(água de lavagem da cana, caldo de contato, mosto, xarope, mel, antes e
após o trocador de calor).
2 – MATERIAL:
•
Placa com lâmina de microcultivo;
•
Placa de Petri com meio Plate Count Agar (PCA);
•
Tubo com solução de açúcar cristal para verificação da
contaminação;
•
Fósforo;
•
Alça de Drigalsky;
•
Microscópio;
•
Tubo com material contaminado (água ou mel diluído);
•
3 tubos com resazurina (indicador de óxido-redução);
•
Papel absorvente;
•
Becker com etanol;
•
Pipetas esterilizadas de 1 ou 2 mL;
1
•
Bico de Bunsen;
•
Frasco para descarte das pipetas;
•
Material para assepsia da bancada;
•
Caneta de retroprojetor.
•
Material para assepsia;
3 – PROCEDIMENTO:
3.1 Colocar a lâmina de microcultivo no microscópio e começar a
focalizar as culturas com o menor aumento. Cuidar para não quebrar a
lamínula. Passar cuidadosamente para as de maiores aumentos. Verifique se
há formação de células livres ou de pseudomicélio (células reunidas formando
aglomerados ou ramificações).
3.2 Efetuar a verificação de contaminantes presentes no açúcar.
Dada as exigências cada vez maiores da qualidade dos
alimentos, o controle da quantidade de bactérias e fungos/leveduras está
sendo solicitada.
Para fins de treinamento será efetuado um plaqueamento em
meio de cultura de contagem geral, o PCA. Nas indústrias empregam-se
outros meios como o “flat sauer” que contém indicador e permite uma boa
visualização das colônias.
A solução de açúcar ou mel foi efetuada pesando-se
separadamente 225 g do produto que foram dissolvidos em solução salina
estéril.
A seguir estas soluções foram distribuídas em tubos (para
diferentes grupos). O plaqueamento será efetuado pela técnica de superfície
colocando-se 0,1 mL da solução no centro da placa contendo o meio. A seguir
espalhar com a alça de Drigalsky, incubar as placas na posição invertida
durante 24-48 horas. Contar as unidades formadoras de colônias.
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Exemplo de cálculo:
25 g – foram dissolvidos em 225 mL e considerando-se o
volume de açúcar, completa-se 250 mL.
Assim:
25,0 g
250 mL
20,0 g
200 mL
10,0 g
100 mL
1,0 g
10 mL
0,1 g
1 mL
0,01 g
0,1 mL
Se crescerem 10 colônias e foram colocadas 0,1 mL da solução,
pode-se calcular que:
10 colônias estão em 0,1 mL ou em 0,01 g de açúcar ou mel
100 colônias estão em 1,0 mL ou em 0,1 g de açúcar ou mel
1000 colônias estão em 10,0 mL ou em 1,0 g de açúcar ou mel
Cada comprador de açúcar exige um
padrão microbiológico
3.4 Análise de bactérias esporulantes termófilas aeróbias totais e
diferencial para termófilas “flat-sour”
Meio DTA (GTA)
Triptona
10,0 g
Dextrose
5,0 g
Púrpura de Bromocresol 0,04 g
(4 mL de uma solução 1%)
H2O destilada
1000 mL
Ajustar o pH para 6,7
Esterilizar a 1 atm (121 ºC) durante 15 min.
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Preparo de solução de púrpura de bromocresol:
Pesar 0,1 g de púrpura de bromocresol. Dissolver em 1,9 mL de
NaOH 0,1N e completar o volume com água destilada até 10 mL.
Meios equivalentes: Dextrose triptona agar (Difco 0080)
Dextrose triptona agar (oxoide CM75)
Dextrose triptona agar (BBL 11175)
3.5 Meio Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol (DRBC)
Meio seletivo para isolamento de bolores e leveduras.
Peptona
5,0 g
Glicose
10,0 g
KH2PO4
1,0 g
MgSO4
0,5 g
Dicloran
0,002 g
Rosa Bengala
0,025 g
Cloranfenicol
0,001 g
Agar
15,0 g
H2O destilada
1000 mL
pH
5,6
Preparo:
Dissolver os componentes e esterilizar a 121 ºC durante 15 min
incluindo o cloranfenicol (cloranfenicol pode ser substituído por gentamicina 50
mg/L). Proteger o meio contra luz que fotodegrada o rosa bengala, que forma
compostos inibidores de fungos e leveduras.
Existe a marca comercial DRCB- Oxoid
Para análise das bactérias esporuladas (esporos) pode aplicar o
choque térmico; pesa-se 20 g de açúcar (se líquido verificar o peso
equivalente), transfere-se para um erlenmeyer, dissolve-se até o volume de
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100 mL aquece-se até a fervura por 5 minutos. Resfria-se e se necessário
reponha o volume evaporado com água esterilizada.
Após o choque térmico distribuir 10 mL da solução em 5 placas
de Petri esterilizadas (2 mL por placa). Verter cerca de 20 mL d meio DTA
sobre o inóculo, homogeneizando.
Após solidificação incubar a 55 ºC durante 48-72 horas.
Padrão geral: Resolução ANVISA – RDC – 12/02/2001
3.6 Teste da Resazurina
•
Preparar uma solução de NaCl 9 g/L, ajustar o pH a 7,0
com solução de NaOH.
•
Solução de resazurina a 10 mg/L de solução de NaCl
9,0%. A solução não deve ser estocada por muito tempo
(10 dias), e deve ser protegida da luz e de altas
temperaturas.
•
Preparar tubos com 9 mL de solução de resazurina,
tampar com algodão, autoclavar por 10 minutos a 121 ºC.
•
Nos tubos com resazurina, adicionar 1 mL da amostra.
Incubar em estufa ou banho-maria a 37 ºC.
•
Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos (violetaróseo-incolor), estão em relação direta com a atividade
microbiana.
Modificação da cor (horas)
Avaliação da
Tratamento
Infecção
violeta
róseo
Incolor
-
0,5
3,0
Alta
Imediato
0,5
2,0
4,0
Alta
Imediato
1,0
4,0
6,0
Média
Imediato
3,0
5,0
7,0
Fraca
Normal
3,0
5,0
-
desprezível
Preventivo
5
Anotações Pessoais:
6